ES2453540T3 - Peptidomiméticos de horquilla beta fijados a patrón con actividad inhibitoria de proteasa - Google Patents

Abstract

Compuesto de fórmula **Fórmula** en la que es un residuo de dipéptido compuesto por dos bloques de construcción de aminoácidos diferentes, siendo el dipéptido DPro-LPro, y Z es una cadena de undecapéptido compuesta de once residuos de aminoácidos, en el que el residuo P1 es el residuo de Nle, Ile, Aoc, hLeu, Chg, OctG, hPhe, 4AmPhe, Cha, Phe, Tyr, 2Cl-Phe, Trp, 1-Nal, o Leu; el residuo P2 es el residuo de Cys, Glu, Nle, Thr, o Gln; el residuo P3 es el residuo de Thr, Ala o Abu; el residuo P4 es el residuo de Lys, Nle, Ala, Abu, o Thr; el residuo P5 es el residuo de Ser, AlloThr, o Dpr; el residuo P6 es el residuo de Ile, C5al, Leu, Nle, Aoc, OctG, Cha, hLeu, hPhe, Chg, t-BuA, Glu o Asp; el residuo P7 es el residuo de Pro; el residuo P8 es el residuo de Pro, Ala o Pro(4NHCOFe); el residuo P9 es el residuo de Tyr, Phe, Ile, Nle, Cha, Gln, Arg, Lys, His, o Thr; el residuo P10 es el residuo de Cys, Arg, Nle, Gln, Lys, Met, Thr, o Ser, y el residuo P11 es el residuo de Tyr, Gln, Arg, Ser, Nle, 2-Nal, 2Cl-Phe, Cha, Phg, Phe, Asp, Asn, o Thr, dos residuos de Cys, que están presentes como los residuos P2 y P10, están enlazados mediante un puente bisulfuro formado por la sustitución de los dos grupos -SH en los dos residuos de Cys por un grupo -S-S-, en forma libre o en forma de una sal aceptable farmacéuticamente.

Description

Peptidomiméticos de horquilla beta fijados a patrón con actividad inhibitoria de proteasa

La presente invención da a conocer peptidomiméticos de horquilla beta fijados a patrón que incorporan una cadena fijada patrón de 11 residuos de aminoácidos que, en función de su posición en la cadena, son tal como se definen a continuación. Estos peptidomiméticos de horquilla beta fijados a patrón son útiles como inhibidores de enzimas proteasa. Son especialmente valiosos como inhibidores de diversas proteasas de serina, tales como la catepsina G, elastasa, o triptasa humanas. Además, la presente invención da a conocer un procedimiento eficiente, por el que estos compuestos pueden, si se desea, construirse en formato de biblioteca.

Los peptidomiméticos de horquilla beta de la presente invención muestran una eficacia y biodisponibilidad oral mejoradas, mejora de la vida media y, lo más importante, una elevada proporción de selectividad entre las diferentes proteasas de serina, que depende de la elección adecuada de ciertos tipos de residuos de aminoácidos y su posición en dicha cadena. Además, estos peptidomiméticos de horquilla beta presentan una hemólisis baja en las células rojas de la sangre y una baja citotoxicidad.

Compuestos con estructuras que muestran alguna similitud con las estructuras de los peptidomiméticos de horquilla beta de la presente invención se dan a conocer a partir del documento WO-A-2002070547, que da a conocer compuestos con actividad antimicrobiana y anticancerígena; del documento WO-A-2003054000, que da a conocer compuestos útiles como inhibidores de enzimas de proteasa; del documento WO-A-2004018503 y del documento WO-A-2004033489, que dan a conocer compuestos con actividad antimicrobiana y del documento WO-A2004096838 y del documento WO-A-2004096839, que dan a conocer compuestos útiles como antagonistas del receptor de quimiocinas CXCR4.

Están surgiendo inhibidores de proteasas con utilizaciones terapéuticas prometedoras en el tratamiento de enfermedades, tales como cánceres (R. P. Beckett y otros, Drug Disc. Today 1996, 1, 16-26; L. L. Johnson y otros, Curr. Opin. Chem. Biol. 1998, 2; 466-71; D. Leung y otros, J. Med. Chem. 2000, 43, 305-341; T. Rockway, Expert Opin. Ther. Patents 2003, 13, 773-786), infecciones parasitarias, fúngicas, y virales [por ejemplo, esquistosomiasis

(M. M. Becker y otros, J. Biol. Chem. 1995, 270, 24496-501); C. albicans (C. Abad-Zapetero y otros, Protein Sci. 1996, 5, 640-52), VIH (A. Wlodawer y otros, Annu. Rev. Biochem. 1993, 62, 543-85; P. L. Darke y otros, Adv. Pharmacol. 1994, 5, 399-454), hepatitis (J. L. Kim y otros, Cell 1996, 87, 343-55; R. A. Love y otros, Cell 1996, 87, 331-342), herpes (W. Gibson y otros, Drug Des. Discov. 1997, 15, 39-47)], y defectos inflamatorios, inmunológicos, respiratorios (P. R. Bernstein y otros, Prog. Med. Chem. 1994, 31, 59-120; T. E. Hugli, Trends Biotechnol. 1996, 14, 409-12), cardiovasculares (M. T. Stubbs y otros, Thromb. Res. 1993, 69, 1-58; H. Fukami y otros, Current Pharmaceutical Design 1998, 4, 439-453), y neurodegenerativos, entre los que se incluyen la enfermedad de Alzheimer (R. Vassar y otros, Science 1999, 286, 735-41), la angiogénesis (M. Kaatinen y otros, Atherosklerosis 1996, 123, 1-2, 123-131), y la esclerosis múltiple (M. Z. Ibrahim y otros, J. Neuroimmunol. 1996, 70, 131-138).

Dado que la mayoría de las proteasas se unen a sus sustratos en conformaciones extendidas o de cadena beta, los buenos inhibidores deben ser capaces de mimetizar una conformación de este tipo. De este modo, los miméticos de horquilla beta son ideales para bloquear secuencias de péptidos en una conformación extendida.

Entre las proteasas, las proteasas de serina constituyen dianas terapéuticas importantes. Las proteasas de serina se clasifican por su especificidad por el sustrato, sobre todo por el tipo de residuos que se encuentran en P1, ya sea de tipo tripsina (residuos Lys/Arg de carga positiva preferentemente en P1), de tipo elastasa (residuos Ala/Val pequeños hidrófobos en P1), o de tipo quimotripsina (residuos Fe/Tyr/Leu grandes hidrofóbos en P1). Entre las proteasas de serina, para las cuales se dispone de datos de cristalografía de rayos X de los inhibidores de proteasa en la base de datos PDB (PDB: www.rcsb.org/pdb), se incluyen tripsina, alfa-quimotripsina, gamma-quimotripsina, elastasa de neutrófilos humanos, trombina, subtilisina, citomegalovirus humano, proteinasa A, achromobacter, catepsina G humana, proteasa específica de ácido glutámico, carbopeptidasa D, factor VIIa de coagulación de la sangre, factor porcino 1XA, mesentericopeptidasa, proteasa del VHC, y termitasa. Entre otras proteasas de serina, que son de interés terapéutico, se incluyen triptasa, convertasa complemento, y proteasa de la hepatitis C-NS3. Los inhibidores de trombina (por ejemplo, J. L. Metha y otros, J. Cardiovasc. Pharmacol. 1998, 31, 345-51; C. Lila y otros, Synth. Comm. 1998, 28, 4419-29) y el factor Xa (por ejemplo, J. P. Vacca, Annu. Rep. Med. Chem. 1998, 33, 81-90) están en evaluación clínica como antitrombóticos, los inhibidores de la elastasa (J. R. Williams y otros, Am. Rev. Respir. Dis. 1991, 144, 875-83) se encuentran en ensayos clínicos contra el enfisema y otras enfermedades pulmonares, mientras que los inhibidores de triptasa se encuentran actualmente en fase II de ensayos clínicos contra el asma (C. Seife, Science 1997, 277, 1602-3), inhibidores de la uroquinasa contra el cáncer de mama, e inhibidores de quimasa contra las enfermedades relacionadas con el corazón. Por último, la catepsina G y elastasa están íntimamente implicadas en la modulación de las actividades de las citoquinas y sus receptores. Particularmente, en sitios de inflamación se liberan concentraciones elevadas de catepsina G, elastasa y proteinasa 3 desde las células de infiltración polimorfonucleares en una correlación temporal cercana con los niveles elevados de citoquinas inflamatorias, lo que indica claramente que estas proteasas están implicadas en el control de la bioactividad y la disponibilidad de citoquinas y (U. Bank y otros, J. Leukoc. Biol. 2001, 69, 177-90). De este modo, los inhibidores de

la elastasa y la catepsina G constituyen objetivos valiosos para nuevos candidatos a fármacos, particularmente para la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (H. Ohbayashi, Expert Opin. Investig. Drugs 2002, 11, 965-980).

De los muchos inhibidores de la proteasa de serina proteináceos que existen, uno es un péptido cíclico de 14 aminoácidos procedente de semillas de girasol, denominado inhibidor de la tripsina de girasol (SFTI-1; S. Luckett y otros, J. Mol. Biol. 1999, 290, 525-533; Y.-Q. Long y otros, Biorg. & Med. Chem. Lett. 2001, 11, 2515-2519), que muestra similitud tanto secuencial como conformacional con el bucle reactivo a tripsina de la familia de los inhibidores de la proteasa de serina de Bowman-Birk. El inhibidor adopta una conformación de horquilla beta, cuando se une al sitio activo de la beta tripsina bovina. SFTI-1 inhibe la beta tripsina (Ki < 0,1 nM), catepsina G (Ki ~ 0,15 nM), elastasa (Ki ~ 105 microM), quimotripsina (Ki ~ 7,4 microM) y la trombina (Ki ~ 136 mM).

Los presentes inventores muestran a continuación un enfoque para el diseño de inhibidores, que comprende trasplantar el bucle de horquilla beta del péptido de origen natural a un patrón inductor de horquilla. Sobre la base de la estructura 3D bien definida de los miméticos de horquilla beta, se pueden diseñar bibliotecas de compuestos, que en última instancia pueden conducir a nuevos inhibidores que muestran diferentes perfiles de especificidad frente a varias clases de proteasas.

Se han descrito en la literatura péptidos miméticos de horquilla fijados a patrón (D. Obrecht y otros, Adv. Med. Chem. 1999, 4, 1-68; J. A. Robinson, Syn. Lett. 2000, 4, 429-441), y se han descrito en la solicitud de patente internacional WO 2003/054000 A1 y en A. Descours y otros, ChemBioChem 2002, 3, 318-323, peptidomiméticos fijados a patrón que inhiben la proteasa de serina y métodos para su síntesis, pero las moléculas anteriormente descritas no muestran una elevada selectividad ni, particularmente, elevada potencia. Sin embargo, se ha establecido ahora la capacidad de generar peptidomiméticos de horquilla beta utilizando métodos de síntesis combinatoria y paralela (L. Jiang y otros, Helv. Chim. Acta 2000, 83, 3097-3112).

Estos métodos permiten la síntesis y cribado de grandes bibliotecas de miméticos de horquilla, que a su vez facilitan considerablemente los estudios de estructura frente a actividad y, por lo tanto, el descubrimiento de nuevas moléculas con actividad inhibitoria de la proteasa de serina de potencia y selectividad elevadas, biodisponibilidad oral, baja actividad hemolítica para células de sangre roja humana y baja citotoxicidad.

Los peptidomiméticos de horquilla beta de la presente invención, que puede estar presentes en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable, se definen a continuación, por ejemplo, en la reivindicación 1, y se pueden preparar de acuerdo con la presente invención por un procedimiento definido más adelante, por ejemplo, en la reivindicación 40 o la reivindicación 41.

Los peptidomiméticos de la presente invención también pueden estar presentes en forma enantiomérica, que se puede preparar por un procedimiento definido más adelante, por ejemplo, en la reivindicación 42.

El residuo de dipéptido mencionado en la reivindicación 1 (designado en la presente memoria descriptiva a continuación como "patrón") tiene extremos N-terminal y C-terminal orientados en el espacio de tal manera, que la distancia entre los dos puede estar entre 4,0 y 5,5 A. La cadena de undecapéptido Z que se menciona en la reivindicación 1 está unida a los extremos C-terminal y N-terminal del patrón a través de sus correspondientes extremos N- y C-terminales, de manera que el patrón y la cadena Z forman una estructura cíclica, tal como la representada en la fórmula I mostrada en la reivindicación 1. En un caso como en el presente, en el que la distancia entre los extremos N- y C-terminales del patrón se encuentra entre 4,0 y 5,5 A, el patrón inducirá una red de enlaces de hidrógeno necesaria para la formación de una conformación de horquilla beta en la cadena Z. Por lo tanto, el patrón y la cadena Z forman un mimético de horquilla beta.

La conformación de horquilla beta es altamente relevante para la actividad inhibidora de la proteasa de serina de los miméticos de horquilla beta de la presente invención. Las propiedades de estabilización de la conformación de horquilla beta del patrón juegan un papel clave no sólo para la actividad inhibitoria selectiva, sino también para el procedimiento de síntesis definido anteriormente en la presente memoria descriptiva, dado que la incorporación del patrón al comienzo de los precursores peptídicos lineales protegidos o cerca de la parte media de los mismos aumenta significativamente los rendimientos de ciclación.

Las cadenas laterales de los L-aminoácidos en las posiciones opuestas de la región de cadena beta pueden formar un enlace intercatenario. El enlace más ampliamente conocido es el puente bisulfuro formado por cisteínas situadas en posiciones opuestas de la cadena beta. Se conocen diversos métodos para formar enlaces bisulfuro, incluyendo los descritos por J. P. Tam y otros, Synthesis 1979, 955-957; Stewart y otros, Síntesis de péptidos en fase sólida “Solid Phase Peptide Synthesis”, 2ª edición, Pierce Chemical Company, III, 1984; Ahmed y otros, J. Biol. Chem. 1975, 250, 8477-8482, y Pennington y otros, Peptides, páginas 164-166, Giralt y Andreu, editores, ESCOM Leiden, Países Bajos, 1990. De formas más ventajosa, a efectos del alcance de la presente invención, los enlaces bisulfuro pueden prepararse utilizando grupos protectores acetamidometilo (ACM) para la cisteína. Un enlace intercatenario bien establecido además comprende el enlace de un residuo de lisina con un residuo de ácido glutámico, que se encuentran en las posiciones opuestas de la cadena beta, por medio de la formación de un enlace amida. Un grupo

protector preferente para el grupo amino de cadena lateral de la lisina es el grupo aliloxicarbonilo (Alloc), y el grupo carboxi de la cadena lateral de ácido glutámico se protege preferentemente como éster de alilo.

Las posiciones para un enlace intercatenario son P2 y P10, tomadas conjuntamente. Es conocido que estos enlaces intercatenarios estabilizan conformaciones de horquilla beta y, por lo tanto, constituyen un importante elemento estructural para el diseño de miméticos de horquilla beta.

A continuación, se indican los aminoácidos cuyos residuos que constituyen la cadena Z, siendo las abreviaturas y códigos los utilizados de forma general.

Los residuos de aminoácidos preferentes en la cadena Z son los derivadas de los siguientes alfa-aminoácidos

naturales:

Código de tres letras

Nombre Código de 1 letra

Ala

L-Alanina A

Arg

L-Arginina R

Asn Asp

L-Asparagina Ácido L-aspártico N D

Cys

L-Cisteína C

Gln Glu

L-Glutamina Ácido L-glutámico Q E

His

L-Histidina H

Ile

L-Isoleucina I

Leu

L-Leucina L

Lys

L-Lisina K

Met

L-Metionina M

Phe

L-Fenilalanina F

Pro

L-Prolina P

Ser

L-Serina S

Thr

L-Treonina T

Trp

L-Triptófano W

Tyr

L-Tirosina Y

Otros residuos de aminoácidos en la cadena Z son aquellos derivados de los siguientes aminoácidos:

Abreviatura Nombre Abu Ácido gamma-aminobutírico (GABA) AlloThr Alotreonina 4Am Fe L-para-Aminofenilalanina Aoc Ácido (2S)-Aminooctanoico C5al L-3-Ciclopentilalanina Cha L-Ciclohexilalanina 2Cl-Phe L-2-clorofenilalanina Dpr Ácido 2,3-diaminopropiónico hPhe L-Homo-fenilalanina 1-Nal L-1-Naftilalanina 2-Nal L-2-Naftilalanina Nle L-Norleucina OctG L-Octilglicina PHG L-Fenilglicina Pro(4NHCOFe) Ácido (2S)-4-benzamidino-pirrolidina-2-carboxílico t-BuA L-t-Butilalanina

La posiciones P1 a P11 de cada uno de los 11 residuos de aminoácidos en la cadena Z se definen de forma inequívoca tal como se decribe a continuación: P1 representa el primer residuo de aminoácido en la cadena Z, que está enlazado por su extremo N-terminal al extremo C-terminal del patrón, y P11 representa el último residuo de aminoácido en la cadena Z, que está enlazado por su extremo C-terminal al N-terminal del patrón.

Para inhibidores de la catepsina G, los residuos de aminoácidos en la cadena Z son preferentemente los que se definen en cualquiera de las reivindicaciones 2 y 5 a 10.

Para inhibidores de la elastasa, los residuos de aminoácidos en la cadena Z son preferentemente aquellos que se definen en cualquiera de las reivindicaciones 3 y 11 a 22.

Para inhibidores de la triptasa, los residuos de aminoácidos en la cadena Z son preferentemente los que se definen en cualquiera de las reivindicaciones 4 y 23 a 25.

Los aminoácidos elementos constructivos, que componen el patrón, son los derivados de los siguientes aminoácidos, siendo las abreviaturas las utilizadas de forma general (el aminoácido LPro es idéntico que el aminoácido Pro):

Abreviatura Nombre DPro D-prolina LPro L-prolina

Entre los peptidomiméticos de horquilla beta particularmente preferentes de la presente invención se incluyen los descritos en los ejemplos 5, 19, 20, 22, 23, 38, 39 y 40 como inhibidores de la catepsina G; en los ejemplos 91, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160 y 161 como inhibidores de la elastasa, y en los ejemplos 193, 194 y 195 como inhibidores de triptasa.

Los procedimientos de la presente invención se pueden llevar a cabo de forma ventajosa como síntesis de matriz paralela para producir bibliotecas de peptidomiméticos de horquilla beta fijados patrón de la presente invención. Estas síntesis paralelas permiten obtener matrices de numerosos (normalmente de 24 a 192, típicamente 96) compuestos de la presente invención con rendimientos elevados y purezas definidas, minimizando la formación de subproductos diméricos y poliméricos. Por consiguiente, la elección adecuada del soporte sólido funcionalizado (es decir, soporte sólido más la molécula enlazadora), el patrón y el sitio de ciclación tiene un papel clave.

El soporte sólido funcionalizado se deriva convenientemente a partir de poliestireno reticulado con, preferentemente 1 a 5% de divinilbenceno; poliestireno recubierto con espaciadores de polietilenglicol (Tentagel®), y resinas de poliacrilamida (véase también D. Obrecht y otros, Síntesis combinatoria y paralela en fase sólida de bibliotecas de compuestos de bajo peso molecular, (“Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-Molecular-Weight Compound Libraries”) Series de Tetrahedron Organic Chemistry, 17, Pergamon, Elsevier Science, 1998).

El soporte sólido se funcionaliza por medio de un enlazador, es decir, una molécula espaciadora bifuncional, que contiene en un extremo un grupo de anclaje para la fijación al soporte sólido y en el otro extremo un grupo funcional escindible selectivamente utilizado para las transformaciones químicas y procedimientos de escisión posteriores. A los propósitos de la presente invención, se utilizan dos tipos de enlazadores:

Los enlazadores de tipo 1 están diseñados para liberar el grupo amida en condiciones ácidas (H. Rink, Tetrahedron Lett. 1987, 28, 3.783-3.790). Los enlazadores de este tipo forman amidas con el grupo carboxilo del aminoácido; Entre los ejemplos de resinas funcionalizadas mediante este tipo de estructuras de enlace se incluyen resina de PS 4-(((2,4-dimetoxifenil)Fmoc-aminometil)-fenoxiacetamido)aminometilo, resina de PS 4-[(((2,4-dimetoxifenil)-Fmocaminometil)fenoxiacetamido)aminometil]-4-metilbencihidrilamina (resina de PS MBHA de la amida de Rink) y resina de PS 4-[(((2,4-dimetoxifenil)-Fmoc-aminometil)fenoxiacetamido)aminometil]-bencihidrilamina (resina de PS BHA de la amida de Rink). Preferentemente, el soporte deriva de poliestireno reticulado con, más preferentemente 1 a 5% de divinilbenceno y se funcionaliza por medio del enlazador 4-(((2,4-dimetoxifenil)Fmoc-aminometil)fenoxi-acetamido).

Los enlazadores de tipo 2 están diseñados para liberar eventualmente el grupo carboxilo en condiciones ácidas. Los enlazadores de este tipo forman ésteres lábiles en medio ácido con el grupo carboxilo del aminoácido, por lo general ésteres de bencilo, bencihidrilo y tritilo lábiles en medio ácido; entre los ejemplos de estas estructuras de enlace se incluyen 3-metoxi-4-hidroximetilfenoxi (enlazador Sasrin®), 4-(2,4-dimetoxifenil-hidroximetil)-fenoxi (enlazador de Rink), ácido 4-(4-hidroximetil-3-metoxifenoxi) butírico (enlazador HMPB), tritilo y 2-clorotritilo. Preferentemente, el soporte deriva de poliestireno reticulado con, más preferentemente, 1 a 5% de divinilbenceno y se funcionaliza mediante el espaciador 2-clorotritilo.

Cuando se lleva a cabo como síntesis matriciales paralelas, los procedimientos de la presente invención se pueden llevar a cabo de forma ventajosa tal como se describe a continuación en la presente memoria descriptiva, pero se hará evidente de forma inmediata a los expertos en la técnica, cómo estos procedimientos tendrán que ser modificados en caso de que se desee sintetizar un solo compuesto de la presente invención.

Varios recipientes de reacción (normalmente de 24 a 192, típicamente 96) igual al número total de compuestos que se sintetizan mediante el método paralelo, se cargan con 25 a 1000 mg, preferentemente 100 mg, del soporte sólido funcionalizado apropiado, que es preferentemente un derivado de poliestireno reticulado con 1 a 3% de divinilbenceno, o resina de Tentagel®.

Los disolventes a utilizar deben ser capaces de hinchar la resina e incluyen, pero sin que constituyan limitación, diclorometano (DCM), dimetilformamida (DMF), N-metilpirrolidona (NMP), dioxano, tolueno, tetrahidrofurano (THF), etanol (EtOH), trifluoroetanol (TFE), alcohol isopropílico y similares. Las mezclas de disolventes que contienen como mínimo, un componente disolvente polar (por ejemplo, 20% TFE/DCM, 35% THF/NMP) son beneficiosas para

asegurar la alta reactividad y la solvatación de las cadenas de péptido unidas a resina (G. B. Fields y otros, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 4202-4207).

Con el desarrollo de diversos enlazadores, que liberan el grupo ácido carboxílico C-terminal en condiciones ácidas suaves que no afectan a los grupos lábiles en medio ácido, que protegen a los grupos funcionales en la cadena o cadenas laterales, se han realizado progresos considerables en la síntesis de fragmentos peptídicos protegidos. El enlazador derivado de 2-metoxi-4-hidroxi-bencilalcohol (enlazador Sasrin®, Mergler y otros, Tetrahedron Lett. 1988, 29, 4005-4008) es escindible con ácido trifluoroacético diluido (de 0,5 a 1% de TFA en DCM) y es estable en las condiciones de desprotección de Fmoc durante la síntesis de péptidos, siendo compatibles con este esquema de protección grupos protectores adicionales basados en tBu/Boc. Entre otros enlazadores adecuados para los procedimientos de la presente invención se incluyen el enlazador lábil en medio super ácido 4-((2,4-dimetoxifenilhidroximetil)-fenoxi (enlazador de Rink, Rink, H. Tetrahedron Lett 1987, 28, 3787-3790), en el que la eliminación del péptido requiere ácido acético al 10% en DCM o ácido trifluoroacético al 0,2% en DCM; el enlazador derivado del ácido 4-(4-hidroximetil-3-metoxifenoxi)butírico (enlazador HMPB, Flörsheimer y otros, Peptides 1991, 1990, 131), que también se escinde con 1% de TFA/DCM, a efectos de proporcionar un fragmento de péptido que contiene todos los grupos protectores de cadena lateral lábiles en medio ácido, y el enlazador 2-clorotritilo (Barlos y otros, Tetrahedron Lett. 1989, 30, 3943-3946), que permite la separación de péptidos utilizando una mezcla de ácido acético glacial/trifluoroetanol/DCM (1:2:7) durante 30 min.

Los grupos protectores adecuados para los aminoácidos y, respectivamente, para sus residuos son, por ejemplo:

-

Para el grupo amino (tal como está presente también, por ejemplo, en la cadena lateral de lisina):

Cbz benciloxicarbonilo Boc terc-butiloxicarbonilo Fmoc 9-fluorenilmetoxicarbonilo Alloc aliloxicarbonilo Teoc trimetilsililetoxicarbonilo Tcc tricloroetoxicarbonilo Nps o-nitrofenilsulfonilo Trt trifenilmetilo o tritilo

-

Para el grupo carboxilo (tal como está presente también, por ejemplo, en las cadenas laterales de ácido aspártico y ácido glutámico) por conversión en ésteres con los componentes alcohol:

tBu terc-butilo Bn bencilo Me metilo Ph fenilo Pac fenacilo alilo Tse trimetilsililetilo Tec tricloroetilo

-

Para el grupo guanidino (tal como está presente, por ejemplo, en la cadena lateral de la arginina):

Pmc 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo Ts tosilo (es decir, p-toluenosulfonilo) Cbz benciloxicarbonilo Pbf pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo

-

Para el grupo hidroxi (tal como está presente, por ejemplo, en las cadenas laterales de treonina y serina):

tBu terc-butilo Bn bencilo Trt tritilo

-

Para el grupo mercapto (tal como está presente, por ejemplo, en la cadena lateral de la cisteína):

Acm acetamidometilo tBu terc-butilo Bn bencilo Trt tritilo Mtr 4-metoxitritilo Los derivados de aminoácidos protegidos con Fmoc se utilizan preferentemente como los bloques de construcción para la construcción de los miméticos de horquilla beta fijados a patrón de la presente invención. Para la desprotección, es decir, la escisión del grupo Fmoc, se puede utilizar 20% de piperidina en DMF o 2% DBU/2% piperidina en DMF.

5 La cantidad del reactivo, es decir, de derivado de aminoácido, es normalmente de 1 a 20 equivalentes en base a la carga en miliequivalentes por gramo (meq./g) del soporte sólido funcionalizado (típicamente de 0,1 a 2,85 meq./g para resinas de poliestireno) colocado originalmente por pesada en el tubo de reacción. Se pueden utilizar, si es necesario, equivalentes adicionales de reactivo para llevar la reacción hasta su terminación en un tiempo razonable.

10 Los tubos de reacción, en combinación con el bloque de soporte y el colector, se reinsertan en el bloque de depósito, y el aparato se fija conjuntamente. Se inicia el flujo de gas a través del colector para proporcionar un entorno controlado, por ejemplo, nitrógeno, argón, aire y similares. El flujo de gas también se puede calentar o se puede enfriar antes de fluir a través del colector. La calefacción o refrigeración de los pocillos de reacción se consigue calentando el bloque de reacción o enfriando externamente con isopropanol/hielo seco y similares para

15 llevar a cabo las reacciones sintéticas deseadas. La agitación se consigue orbitalmente o mediante agitación magnética (dentro del tubo de reacción). Las estaciones de trabajo preferentes (que, sin embargo, no constituyen limitación) son la estación Combi-chem de Labsource y el sintetizador Syro de MultiSyn Tech.

La formación del enlace amida requiere de la activación del grupo alfa-carboxilo para la etapa de acilación. Cuando

20 esta activación se lleva a cabo por medio de las carbodiimidas de utilización común, tales como diciclohexilcarbodiimida (DCC, Sheehan y otros, J. Am. Chem. Soc. 1955, 77, 1067-1068) o diisopropilcarbodiimida (DIC, Sarantakis y otros, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976, 73, 336-342), la diciclohexilurea y diisopropilurea resultantes son, respectivamente, insoluble y soluble en los disolventes utilizados de forma general. En una variación del método de la carbodiimida, se incluye 1-hidroxibenzotriazol (HOBt, König y otros, Chem. Ber. 1970, 103, 788

25 798) como aditivo a la mezcla de acoplamiento. El HOBt impide la deshidratación, inhibe la racemización de los aminoácidos activados y actúa como catalizador para mejorar las reacciones de acoplamiento lentas. Algunos reactivos de fosfonio han sido utilizados como reactivos de acoplamiento directo, tal como hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-(dimetilamino)-fosfonio (BOP, Castro y otros, Tetrahedron Lett. 1975, 14, 1219-1222; Synthesis, 1976, 751-752), hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio (Py-BOP, Coste y otros,

30 Tetrahedron Lett. 1990, 31, 205-208) o tetrafluoroborato (TBTU) o hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU, Knorr y otros, Tetrahedron Lett. 1989, 30, 1927-1930); estos reactivos de fosfonio son adecuados además para la formación in situ de ésteres de HOBt con los derivados de aminoácidos protegidos. Más recientemente, se han utilizado además difenoxifosforil azida (DPPA), O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'tetrametiluronio (TATU) o bien O-(7-aza-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-hexafluorofosfato de tetrametiluronio (HATU)/7

35 aza-1-hidroxibenzotriazol (HOAt, Carpino y otros, Tetrahedron Lett. 1994, 35, 2279-2281) como reactivos de acoplamiento.

Debido al hecho de que son esenciales reacciones de acoplamiento prácticamente cuantitativas, es deseable tener una demostración experimental de la finalización de las reacciones. El ensayo de ninhidrina (Kaiser y otros, Anal.

40 Biochemistry 1970, 34, 595), en el que una respuesta colorimétrica positiva a una alícuota de péptido unido a resina indica cualitativamente la presencia de la amina primaria, se puede realizar de forma fácil y rápida después de cada etapa de acoplamiento. La química de Fmoc permite la detección espectrofotométrica del cromóforo de Fmoc, cuando se libera con la base (Meienhofer y otros, Int. J. Peptide Protein Res. 1979, 13, 35-42).

45 El intermedio unido a la resina dentro de cada tubo de reacción se lava para liberarlo del exceso de reactivos retenidos, de disolventes y de los subproductos por exposición repetitiva a disolvente o disolventes puros mediante uno de los dos métodos siguientes:

1) Los pocillos de reacción se llenan con disolvente (preferentemente 5 ml), los tubos de reacción, en

50 combinación con el bloque de soporte y el colector se sumergen, se agitan durante 5 a 300 minutos, preferentemente 15 minutos, y se drenan por gravedad seguido de gas a presión aplicado a través del colector de entrada (mientras se cierra la salida) para expulsar el disolvente.

2) El colector se retira del bloque de soporte, partes alícuotas de disolvente (preferentemente 5 ml) se 55 dispensan a través de la parte superior de los tubos de reacción y se drenan por gravedad a través de un filtro en un recipiente receptor, tal como un tubo o vial de ensayo.

Ambos procedimientos de lavado anteriores se repiten hasta 50 veces, aproximadamente (preferentemente, 10 veces aproximadamente), realizando el seguimiento de la eficiencia de la eliminación de reactivos, disolvente, y

60 subproductos mediante métodos tales como TLC, GC o la inspección de las aguas de lavado.

El procedimiento descrito anteriormente de hacer reaccionar el compuesto unido a resina con reactivos dentro de los pocillos de reacción, seguido de la eliminación de los reactivos en exceso, los subproductos y disolventes, se repite con cada transformación sucesiva, hasta que se ha obtenido el péptido lineal completamente protegido unido a la

65 resina final.

Antes de que este péptido lineal completamente protegido se separe del soporte sólido es posible, si se desea, desproteger selectivamente uno o varios grupos funcionales protegidos presentes en la molécula y sustituir apropiadamente el o los grupos reactivos liberados de este modo. A este efecto, el grupo o grupos funcionales en cuestión deben estar inicialmente protegidos con un grupo protector, que se puede eliminar selectivamente sin afectar a los grupos protectores restantes presentes. Alloc (aliloxicarbonilo) es un ejemplo de un grupo protector de este tipo para amino, que se puede eliminar selectivamente, por ejemplo, por medio de Pd0 y fenilsilano en CH2Cl2, sin afectar a los grupos protectores restantes, tales como Fmoc, presentes en la molécula. A continuación, el grupo reactivo liberado de este modo puede ser tratado con un agente adecuado para introducir el sustituyente deseado. De este modo, por ejemplo, se puede acilar un grupo amino mediante un agente acilante correspondiente al sustituyente acilo a introducir.

Antes de que este péptido lineal completamente protegido se separe del soporte sólido, es posible además, si se desea, formar un enlace intercatenario entre las cadenas laterales de residuos de aminoácidos apropiados en las posiciones 2 y 10.

Los enlaces intercatenarios, tal como se ha explicado anteriormente, pueden ser puentes de bisulfuro, formados entre residuos de cisteína en las posiciones opuestas de la cadena beta, o enlaces lactama, formados entre un residuo de ácido glutámico y un residuo de lisina localizados en las posiciones opuestas de la cadena beta. La formación de dichos enlaces intercatenarios se puede efectuar por métodos bien conocidos en la técnica.

Para la formación de puentes bisulfuro, preferentemente se aplica una solución de 10 equivalentes de yodo en DMF

o una mezcla de CH2Cl2/MeOH durante 1,5 h y, a continuación, durante otras 3 h una solución de yodo nuevo después de la filtración de la solución de yodo, o una mezcla de DMSO y solución de ácido acético, tamponada con 5% de NaHCO3 a pH 5-6, durante 4 h, o agua, ajustada a pH 8 con una solución de hidróxido de amonio, con agitación durante 24 h, o solución tampón de acetato de amonio, ajustada a pH 8, en presencia de aire, o una solución de NMP y tri-n-butilfosfina (preferentemente 50 equivalentes).

La separación del soporte sólido del péptido lineal completamente protegido se consigue por inmersión de los tubos de reacción, en combinación con el bloque de soporte y el colector, en pocillos de reacción que contienen una solución del reactivo de escisión (preferentemente de 3 a 5 ml). Se implementan flujo de gas, control de la temperatura, agitación y la monitorización de la reacción tal como se ha descrito anteriormente y tal como se desee para llevar a cabo la reacción de separación. Los tubos de reacción, en combinación con el bloque de soporte y el colector, se desmontan del bloque de depósito y se elevan por encima del nivel de la solución, pero por debajo del labio superior de los pocillos de reacción, y se aplica gas a presión a través del colector de entrada (mientras se cierra el de salida) para expulsar de manera eficiente la solución de producto final a los pocillos de depósito. A continuación, la resina restante en los tubos de reacción se lava de 2 a 5 veces tal como se ha realizado anteriormente, con 3 a 5 ml de un disolvente apropiado para extraer (lavar) la mayor cantidad posible de producto separado. Las soluciones de producto obtenidas de este modo se combinan, procurando evitar mezclas cruzadas. A continuación, las soluciones/extractos individuales se manipulan según sea necesario para aislar los compuestos finales. Entre las manipulaciones típicas se incluyen, pero sin que constituyan limitación, evaporación, concentración, extracción líquido/líquido, acidificación, basificación, neutralización o reacciones adicionales en solución.

Las soluciones que contienen los derivados de péptidos lineales totalmente protegidos, que han sido escindidos del soporte sólido y neutralizados con una base, se evaporan. A continuación se lleva a cabo la ciclación, en solución, utilizando disolventes, tales como DCM, DMF, dioxano, THF y similares. Se pueden utilizar para la ciclación varios reactivos de acoplamiento, que se han mencionado anteriormente. La duración de la ciclación es de aproximadamente 6-48 horas, preferentemente 16 horas, aproximadamente. El progreso de la reacción se sigue, por ejemplo mediante RP-HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa). A continuación, el disolvente se elimina por evaporación, el derivado peptídico cíclico completamente protegido se disuelve en un disolvente no miscible con agua, tal como DCM, y la solución se extrae con agua o una mezcla de disolventes miscibles en agua, con el fin de eliminar cualquier exceso de reactivo de acoplamiento.

Finalmente, el derivado peptídico totalmente protegido se trata con 95% de TFA, 2,5% de H2O y 2,5% de TIS u otra combinación de eliminadores para llevar a cabo a la escisión de los grupos protectores. El tiempo de reacción de la escisión es, de forma habitual, de 30 minutos a 12 horas, preferentemente, 2,5 horas aproximadamente. Los compuestos volátiles se evaporan hasta sequedad, y el péptido crudo se disuelve en 20% de AcOH en agua, que se extrae con éter isopropílico u otros disolventes adecuados para ello. La capa acuosa se recoge y se evapora hasta sequedad, y se obtiene el derivado peptídico cíclico totalmente desprotegido de fórmula I como producto final.

Alternativamente, la separación del soporte sólido, la ciclación y la desprotección completa del péptido totalmente protegido se puede conseguir manualmente en recipientes de vidrio.

Dependiendo de su pureza, el derivado peptídico puede ser utilizado directamente para ensayos biológicos, o tiene que ser purificado adicionalmente mediante, por ejemplo, HPLC preparativa.

Si se desea, es posible convertir un producto completamente desprotegido de fórmula I en forma libre obtenido de este modo en una sal farmacéuticamente aceptable o convertir una sal farmacéuticamente aceptable, o inaceptable, obtenida de este modo en el correspondiente compuesto de fórmula I en forma libre o en una sal diferente farmacéuticamente aceptable. Cualquiera de estas operaciones puede llevarse a cabo por métodos bien conocidos en la técnica.

Los materiales de partida de la fórmula II mostrados en las reivindicaciones 40 y 41, los materiales previos al inicio para la misma, y la preparación de estos materiales de partida y previos al inicio se describen en el documento WOA-2002070547.

Los peptidomiméticos de horquilla beta de la presente invención se pueden utilizar en una amplia gama de aplicaciones, en las que el cáncer, enfermedades inflamatorias, enfermedades pulmonares, infecciones, enfermedades inmunológicas, enfermedades cardiovasculares o enfermedades neurodegenerativas están mediados por la actividad de la proteasa de serina o son resultantes de la actividad de la misma. Para el control o la prevención de una enfermedad o trastorno dados susceptibles de tratamiento con inhibidores de la proteasa, los peptidomiméticos de horquilla beta se pueden administrar per se o se pueden aplicar como formulación apropiada junto con portadores, diluyentes o excipientes bien conocidos en la técnica.

Cuando se utilizan para tratar o prevenir enfermedades, tales como enfisema pulmonar, artritis reumatoide, osteoartritis, aterosclerosis, psoriasis, fibrosis quística, esclerosis múltiple, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, pancreatitis, asma, rinitis alérgica, dermatosis inflamatorias, reestenosis postangioplastia, hipertrofia cardiaca, fallo cardíaco o cáncer, tal como, pero sin que constituya limitación, cáncer de mama o cáncer relacionado con la angiogénesis o metástasis, los peptidomiméticos de horquilla beta pueden ser administrados individualmente, como mezclas de varios peptidomiméticos de horquilla beta, en combinación con otro antiinflamatorio, antimicrobiano o agente anticancerígeno y/o en combinación con otros agentes farmacéuticamente activos. Los peptidomiméticos de horquilla beta se pueden administrar per se o en forma de composiciones farmacéuticas.

Composiciones farmacéuticas que comprenden peptidomiméticos de horquilla beta de la presente invención se pueden fabricar mediante procedimientos convencionales de mezcla, disolución, granulación, preparación de tabletas recubiertas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse de manera convencional utilizando uno o más vehículos diluyentes, excipientes o auxiliares fisiológicamente aceptables, que facilitan el procesamiento de los peptidomiméticos de horquilla beta activos en preparaciones que se pueden utilizar farmacéuticamente. La formulación adecuada depende del método de administración elegido.

Para la administración tópica, los peptidomiméticos de horquilla beta de la presente invención se pueden formular como soluciones, geles, pomadas, cremas, suspensiones, etc., tal como es bien conocido en la técnica.

Entre las formulaciones sistémicas se incluyen las diseñadas para la administración por inyección, por ejemplo subcutánea, intravenosa, intramuscular, inyección intratecal o intraperitoneal, de este modo como las diseñadas para la administración transdérmica, transmucosa, oral o la administración pulmonar.

Para las inyecciones, los peptidomiméticos de horquilla beta de la presente invención se pueden formular en soluciones adecuadas, preferentemente en soluciones tampón fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hink, solución de Ringer, o tampón de solución salina fisiológica. Las soluciones pueden contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, los peptidomiméticos de horquilla beta de la presente invención pueden estar en forma de polvo para la combinación con un vehículo adecuado, por ejemplo agua estéril libre de pirógenos, antes de su utilización.

Para la administración transmucosa, se utilizan los penetrantes apropiados para la barrera a ser permeada en la formulación tal como se conoce en la técnica.

Para la administración oral, los peptidomiméticos de horquilla beta de la presente invención se pueden formular fácilmente combinándose con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Estos vehículos permiten que los peptidomiméticos de horquilla beta de la presente invención se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones, etc. para la ingestión oral por el paciente que va a ser tratado. Para las formulaciones orales, tales como polvos, cápsulas y comprimidos, entre los excipientes adecuados se incluyen cargas, tales como azúcares, por ejemplo lactosa, sacarosa, manitol y sorbitol; preparaciones de celulosa, tales como almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metil celulosa, hidroxipropilmetil celulosa, carboximetil celulosa sódica o polivinilpirrolidona (PVP); agentes de granulación y agentes aglutinantes. Si se desea, se pueden añadir agentes desintegrantes, tales como polivinilpirrolidonas reticuladas, agar o ácido algínico o una sal del mismo, tal como alginato de sodio. Si se desea, las formas de dosificación sólidas pueden estar recubiertas con azúcar o con recubrimiento entérico utilizando las técnicas estándar.

Para las preparaciones líquidas orales, tales como suspensiones, elixires y soluciones, entre los vehículos adecuados, excipientes o diluyentes se incluyen agua, glicoles, aceites, alcoholes, etc. Además, se pueden añadir agentes aromatizantes, conservantes, agentes colorantes y similares.

Para la administración bucal, las composiciones pueden adoptar la forma de comprimidos, pastillas, etc., formulados tal como habitualmente.

Para la administración por inhalación, los peptidomiméticos de horquilla beta de la presente invención se suministran de forma conveniente en la forma de una pulverización de aerosol desde envases presurizados o un nebulizador, con la utilización de un propulsor adecuado, por ejemplo diclorodifluorometano, triclorofluorometano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosis puede determinarse proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para su utilización en un inhalador o insuflador se pueden formular conteniendo una mezcla en polvo del peptidomimético de horquilla beta de la presente invención y una base polvo adecuada, tal como lactosa o almidón.

Los compuestos se pueden formular además en composiciones rectales o vaginales, tales como supositorios, junto con bases de supositorio adecuadas, tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Además de las formulaciones descritas anteriormente, los peptidomiméticos de horquilla beta de la presente invención se pueden formular además como preparaciones de depósito. Estas formulaciones de acción prolongada se pueden administrar mediante implantación (por ejemplo subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. Para la fabricación de tales preparaciones de depósito, los peptidomiméticos de horquilla beta de la presente invención se pueden formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, tal como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como sales de baja solubilidad.

Además, se pueden utilizar otros sistemas de administración farmacéuticos bien conocidos en la técnica, tales como liposomas y emulsiones. También se pueden utilizar ciertos disolventes orgánicos, tales como dimetilsulfóxido. Adicionalmente, los peptidomiméticos de horquilla beta de la presente invención pueden administrarse utilizando un sistema de liberación sostenida, tal como matrices semipermeables de polímeros sólidos que contienen el agente terapéutico. Varios materiales de liberación sostenida se han establecido y son bien conocidos en la técnica. Las cápsulas de liberación sostenida pueden, dependiendo de su naturaleza química, liberar el compuesto por unas semanas o hasta más de 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y la estabilidad biológica del agente terapéutico, se pueden utilizar estrategias adicionales para la estabilización de proteínas.

Dado que los pepdidomimeticos de horquilla beta de la presente invención pueden contener residuos cargados, pueden ser incluidos en cualquiera de las formulaciones descritas anteriormente como tales o como sales farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables tienden a ser más solubles en disolventes acuosos y otros disolventes próticos que las correspondientes formas libres.

Los peptidomiméticos de horquilla beta de la presente invención, o composiciones de los mismos, se utilizarán de forma general en una cantidad eficaz para conseguir el objetivo pretendido. Se debe entender que la cantidad utilizada dependerá de la aplicación particular.

Para la administración tópica, para tratar o prevenir enfermedades tratables con miméticos de horquilla beta, se puede determinar una dosis terapéuticamente eficaz utilizando, por ejemplo, los ensayos in vitro dados a conocer en los ejemplos. El tratamiento puede ser aplicado, mientras que la enfermedad es visible o incluso cuando no es visible. Un experto ordinario en la materia será capaz de determinar cantidades terapéuticamente eficaces para tratar tópicamente enfermedades sin experimentación excesiva.

Para la administración sistémica, una dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos in vitro. Por ejemplo, una dosis puede formularse en modelos animales para conseguir un intervalo de concentración circulante de peptidomimético de horquilla beta, que incluye la IC50 tal como se determina en el cultivo celular. Dicha información se puede utilizar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en seres humanos.

Las dosis iniciales también se pueden determinar a partir de datos in vivo, por ejemplo, a partir de modelos animales, utilizando metodologías bien conocidas en la técnica. Un experto en la técnica podría optimizar fácilmente la administración a seres humanos basándose en los datos en animales.

Las cantidades de dosificación para aplicación como agentes inhibidores de la proteasa de serina se pueden ajustar individualmente para proporcionar los niveles en plasma de los peptidomiméticos de horquilla beta de la presente invención que sean suficientes para mantener el efecto terapéutico. Los niveles en suero terapéuticamente eficaces se pueden conseguir mediante la administración de múltiples dosis cada día.

En los casos de administración local o absorción selectiva, la concentración local eficaz de los peptidomiméticos de horquilla beta de la presente invención puede no estar relacionada con la concentración plasmática. Un experto en la técnica será capaz de optimizar las dosificaciones locales terapéuticamente eficaces sin experimentación excesiva.

Por supuesto, la cantidad de peptidomiméticos de horquilla beta administrada dependerá del sujeto a tratar, del peso del sujeto, de la gravedad de la dolencia, la manera de administración y del juicio del médico que la prescribe.

Normalmente, una dosis terapéuticamente eficaz de los peptidomiméticos de horquilla beta descritos en la presente proporcionará un beneficio terapéutico sin causar toxicidad sustancial.

La toxicidad de los peptidomiméticos de horquilla beta de la presente invención se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, determinando la LD50 (dosis letal para el 50% de la población) o la LD100 (la dosis letal para el 100% de la población). La relación de dosis entre el efecto tóxico y terapéutico es el índice terapéutico. Son preferentes los compuestos que muestran elevados índices terapéuticos. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden utilizarse para formular un intervalo de dosificación, que no es tóxico para su utilización en seres humanos. La dosificación de los peptidomiméticos de horquilla beta de la presente invención se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes, que incluyen la dosis efectiva con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro del intervalo, dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. La formulación exacta, la vía de administración y dosis pueden ser elegidas por el médico individual en vista del estado del paciente (véase, por ejemplo, Fingl y otros, 1975, La base farmacológica de la terapéutica “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, cap. 1, pág. 1).

Los siguientes ejemplos explican con más detalle la presente invención, pero no pretenden constituir limitación de su alcance en modo alguno.

Ejemplos

Las siguientes abreviaturas se utilizan en los ejemplos:

HBTU hexafluorofosfato de 1-benzotriazol-1-il-tetrametiluronio (Knorr y otros, Tetrahedron. Lett. 1989, 30, 1927

1930) HOBt 1-hidroxibenzotriazol DIEA diisopropiletilamina HATU O-(7-aza-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-hexafluorofosfato de tetrametiluronio (Carpino y otros, Tetrahedron

Lett. 1994, 35, 2279-2281)

1. Síntesis de péptidos

Acoplamiento del primer residuo aminoácido protegido a la resina

Se introdujeron en un frasco seco 0,5 g de resina de cloruro de 2-clorotritilo (Barlos y otros, Tetrahedron Lett. 1989, 30, 3943-3946) (0,83 mmol/g, 0,415 mmol). La resina se suspendió en CH2Cl2 (2,5 ml) y se dejó hinchar a temperatura ambiente con agitación constante durante 30 min. La resina se trató con 0,415 mmol (1 eq.) del primer aminoácido adecuadamente protegido (véase a continuación) y 284 microlitros (4 eq.) de DIEA en CH2Cl2 (2,5 ml), y la mezcla se agitó a 25°C durante 4 h. El color de l a resina cambió a púrpura, mientras que la solución permaneció amarillenta. La resina se agitó (CH2Cl2/MeOH/DIEA, 17:2:1; 30 ml) durante 30 min, después se lavó con CH2Cl2 (1x), DMF (1x), CH2Cl2 (1x), MeOH (1x), CH2Cl2 (1x), MeOH (1x), CH2Cl2 (2x) y Et2O (2x) y se secó a vacío durante 6 h. La carga era típicamente de 0,6 a 0,7 mmol/g.

Se prepararon las resinas precargadas resina Fmoc-Pro-2-clorotritilo, resina Fmoc-Asp(OtBu)-2-chlorotritilo, resina Fmoc-Leu-2-clorotritilo, resina Fmoc-Glu(OtBu)-2-clorotritilo, resina Fmoc-Ser(OtBu)-2-clorotritilo y resina Fmoc-Ile-2clorotritilo.

Síntesis del fragmento peptídico completamente protegido

La síntesis se llevó a cabo con un sintetizador de péptidos Syro (MultiSyn Tech) utilizando de 24 a 96 recipientes de reacción. En cada recipiente se colocaron 60 mg (peso de la resina antes de la carga) de la resina anterior. Los siguientes ciclos de reacción se programaron y se llevaron a cabo:

Etapa

Reactivo Tiempo

1

CH2Cl2, lavado e hinchamiento (manual) 3 x 1 min

2

DMF, lavado e hinchamiento 1 × 5 min

3 4

piperidina al 40% /DMF DMF, lavado 1 × 5 min 5 × 2 min

5

5 eq. aminoácido Fmoc /DMF

+ 5 eq. HBTU

+ 5 eq. HOBt

+ 5 eq. DIEA

1 × 120 min

11

60 6 DMF, lavado 4 × 2 min 7 CH2Cl2, lavado (al final de la síntesis) 3 x 2 min

Las etapas 3 a 6 se repitieron para añadir cada aminoácido.

Después de la síntesis del fragmento de péptido totalmente protegido, se adoptó bien el Procedimiento A o el Procedimiento B, dependiendo de si un enlace bisulfuro intercatenario iba a ser formado o no.

Procedimiento A: Ciclación, seguido de procesamiento del péptido de cadena principal ciclada

Escisión del fragmento de péptido totalmente protegido

Después de la finalización de la síntesis, la resina se suspendió en 1 ml (0,39 mmoles) de TFA al 1% en CH2Cl2 (VLV) durante 3 min y se filtró. El filtrado se neutralizó con 1 ml (1,17 mmol, 3 eq.) de DIEA al 20% en CH2Cl2 (v/v). Este procedimiento se repitió dos veces para asegurar la terminación de la escisión.

Una parte alícuota (200 microlitros) del filtrado se desprotegió totalmente con 0,5 ml de una mezcla que contiene 95% de TFA, 2,5% de agua y 2,5% de triisopropilsilano (TIS) y se analizó mediante CL/EM de fase inversa para controlar la eficiencia de la síntesis de péptidos lineales.

Ciclación del péptido lineal

El péptido lineal completamente protegido se disolvió en DMF (8 ml; concentración de 10 mg/ml). Se añadieron 2 eq. de HATU (0,72 mmol) en 1 ml de DMF y 4 eq. de DIEA (1,44 mmol) en 1 ml de DMF, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. Los volátiles se evaporaron a sequedad. El péptido ciclado crudo se disolvió en 7 ml de CH2Cl2 y se extrajo con acetonitrilo al 10% en agua (4,5 ml) tres veces. La fase de CH2Cl2 se evaporó a sequedad.

Desprotección y purificación del péptido cíclico

El péptido cíclico obtenido se disolvió en 3 ml de una mezcla que contiene 95% de TFA, 2,5% de agua y 2,5% de triisopropilsilano (TIS). La mezcla se dejó reposar a 20°C durante 2,5 h y después se concentró en vací o. El péptido crudo se disolvió en AcOH al 20% en agua (7 ml) y se extrajo tres veces con diisopropil éter (4 ml). La fase acuosa se recogió y se evaporó hasta sequedad, y el residuo se purificó mediante CL/EM preparativa de fase inversa. Después de la liofilización, se obtuvo el producto como un polvo blanco y se analizó por CL/EM. Los datos analíticos, que comprenden la pureza después de HPLC preparativa y EM-ES se muestran en la tabla 1. Los tiempos de retención de HPLC analítica (TR; min) se determinaron utilizando un Jupiter Proteo 90A, 150 x 2,0 mm (cod. 00F4396-B0-Phenomenex), con los disolventes A (H2O + 0,1% de TFA) y B (CH3CN + 0,1% de TFA) y el siguiente gradiente 0 min: 95% A, 5% B; 20 min: 40% A, 60% B; 21-23 min: 0% A, 100% B; 23,1-30 min: 95 % A, 5% B.

Procedimiento B: La ciclación, seguida de procesamiento del péptido de cadena principal ciclada que tiene un enlace bisulfuro intercatenario

Formación del enlace bisulfuro intercatenario

Después de la finalización de la síntesis, la resina se hinchó en 3 ml de DMF seco durante 1 h. Posteriomente, se añadió al reactor una solución de 10 equivalentes de yodo en DMF (6 ml), seguido de agitación durante 1,5 h. La resina se filtró, y se añadió una solución fresca de yodo (10 eq.) en DMF (6 ml), seguido de agitación durante otras 3

h. La resina se filtró y se lavó con DMF (3x) y CH2Cl2 (3x).

Ciclación de la cadena principal, escisión y purificación del péptido

Después de la formación del enlace bisulfuro intercatenario, la resina se suspendió en 1 ml (0,39 mmoles) de TFA al 1% en CH2Cl2 (v/v) durante 3 min y se separó por filtración. El filtrado se neutralizó con 1 ml (1,17 mmol, 3 eq.) de DIEA al 20% en CH2Cl2 (v/v). Este procedimiento se repitió dos veces para asegurar la terminación de la escisión. La resina se lavó con 2 ml de CH2Cl2. La fase de CH2Cl2 se evaporó a sequedad. El péptido lineal completamente protegido se disolvió en 8 ml de DMF seca. A continuación, se añadieron 2 eq. de HATU en DMF seco (1 ml) y 4 eq. de DIEA en DMF seco (1 ml), seguido de agitación durante 16 h. Los volátiles se evaporaron a sequedad. El péptido ciclado crudo se disolvió en 7 ml de CH2Cl2 y se extrajo con acetonitrilo 10% en agua (4,5 ml) tres veces. La fase de CH2Cl2 se evaporó a sequedad. Para desproteger completamente el péptido, se añadieron 3 ml de TFA/TIS/H2O, y la mezcla se mantuvo durante 2,5 h (95: 2,5: 2,5). Los volátiles se evaporaron a sequedad, y el péptido crudo se disolvió en AcOH al 20% en agua (7 ml) y se extrajo tres veces con diisopropil éter (4 ml). La fase acuosa se recogió y se evaporó hasta sequedad, y el residuo se purificó mediante CL/EM preparativa de fase inversa. Después de la liofilización, se obtuvo el producto como un polvo blanco y se analizó mediante EM-ES tal como se ha descrito anteriormente. Los datos analíticos que comprenden la pureza después de HPLC preparativa EM-ES se muestran en la tabla 1.

Ejemplos 1 a 6, 9 a 45, 52 a 63, 65 a 67, 70, 71, 76 a 114, 129, 131 a 162, 179 a 182, 184 a 189 y 191 a 195

Los péptidos de estos ejemplos, que se enumeran en la tabla 1, se sintetizaron comenzando por el aminoácido Pro, que se fijó a la resina. La resina de partida fue la resina Fmoc-Pro-2-clorotritilo preparada tal como se ha descrito anteriormente. Los péptidos lineales se sintetizaron sobre el soporte sólido de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente en la siguiente secuencia: Resina-Pro-DPro-P11-P10-P9-P8-P7-P6-P5-P4-P3-P2-P1.

En los ejemplos 1 a 6, 9 a 45, 52 a 63, 65 a 67, 70, 71, 76 a 81, de 83 a 103, 112 a 114, 129, 131, 133, 136 a 138, 140, 141, 143 a 146, 148, 150 a 153, 155, 157, 158, 160, 162, 179 a 182, 184 a 189 y 191 a 195, el péptido se escindió de la resina, se sometió a la formación de puentes bisulfuro, se cicló, se desprotegió y se purificó tal como se indica en el Procedimiento B.

En los ejemplos 82, 149, 159 y 161, el péptido se escindió de la resina tal como se indica en el Procedimiento B. A continuación, el producto crudo se solubilizó en solución tampón de acetato de amonio (0,1 M; pH se ajustó a 8; concentración de 1 mg de producto crudo por ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente en presencia de aire. La reacción se controló por CL/EM de fase inversa. Después de la finalización de la reacción, la mezcla se evaporó hasta sequedad, y el residuo se purificó mediante CL/EM preparativa de fase inversa. Se realizó la ciclación de la cadena principal tal como se indica en el Procedimiento A. Para desproteger completamente el péptido, se añadieron 5 ml de TFA/H2O/fenol/tioanisol/etanoditiol (82,5:5:5:5:2,5), y la mezcla se mantuvo durante 5 horas a temperatura ambiente. El péptido se precipitó por la adición de éter dietílico frío (10 ml). Después de la centrifugación, se eliminó la fase sobrenadante. El precipitado se lavó tres veces con 5 ml de éter dietílico y se purificó mediante preparativa de fase inversa CL/EM. Después de la liofilización, se obtuvo el producto como un polvo blanco y se analizó mediante EM-ES tal como se ha descrito anteriormente.

En los ejemplos 104 a 111, 132, 134, 135, 139, 142, 147, 154 y 156, el péptido se escindió de la resina, se cicló, se desprotegió y se purificó tal como se indica en el Procedimiento A.

Los siguientes tiempos de retención de HPLC (min) se determinaron utilizando el método analítico descrito anteriormente (Ej. = ejemplo):

Ej. 1 (15,37), Ej. 2 (11,54), Ej. 3 (7,82), Ej. 4 (8,62), Ej. 5 (16,51), Ej. 6 (13,67), Ej. 9 (5,82), Ej. 10 (7,98), Ej. 11 (8,38), Ej. 12 (6,80), Ej. 13 (7,41), Ej. 14 (6,20), Ej. 15 (8,68), Ej. 16 (9,82), Ej. 17 (5,59), Ej. 20 (7,32), Ej. 21 (8,66), Ej. 22 (8,68), Ej. 23 (12,66), Ej. 24 (8,67), Ej. 25 (7,53), Ej. 26 (9,02), Ej. 27 (8,06), Ej. 28 (9,62), Ej. 29 (8,78), Ej. 30 (10,49), Ej. 31 (5,50), Ej. 32 (7,45), Ej. 33 (8,39), Ej. 34 (10,16), Ej. 35 (9,04), Ej. 36 (10,98), Ej. 37 (7,56), Ej. 38 (9,29), Ej. 39 (8,32), Ej. 40 (10,11), Ej. 41 (7,23), Ej. 42 (8,83), Ej. 43 (7,92), Ej. 44 (9,87), Ej. 45 (8,26), Ej. 52 (6,20), Ej. 53 (8,68), Ex 54 (9,82), Ej. 55 (5,59), Ej. 56 (6,06), Ej. 57 (6,47), Ej. 58 (7,32), Ej. 59 (8,68), Ej. 60 (10,66), Ej. 61 (8,54), Ej. 62 (9,83), Ej. 63 (16,54), Ej. 65 (15,71), Ej. 66 (17,50), Ej. 67 (15,87), Ej. 70 (12,87), Ej. 71 (13,48), Ej. 76 (4,47), Ej. 77 (5,15), Ej. 78 (10,93), Ej. 79 (10,70), Ej. 80 (12,09), Ej. 81 (11,63), Ej. 82 (5,71), Ej. 83 (5,45), Ej. 84 (11,14), Ej. 85 (10,90), Ej. 86 (13,78), Ej. 87 (13,98), Ej. 88 (14,35), Ej. 89 (15,21), Ej. 90 (14,72), Ej. 91 (11,97), Ej. 92 (11,77), Ej. 93 (15,25), Ej. 94 (14,61), Ej. 95 (20,46), Ej. 96 (15,08), Ej. 97 (20,78), Ej. 98 (18,28), Ej. 99 (14,62), Ej. 100 (13,90), Ej. 101 (13,76), Ej. 102 (20,53), Ej. 103 (14,14), Ej. 104 (11,60), Ej. 105 (11,90), Ej. 106 (11,63), Ej. 107 (11,78), Ej. 108 (13,03), Ej. 109 (15,22), Ej. 110 (12,40), Ej. 111 (12,10), Ej. 112 (5,49), Ej. 113 (5,67), Ej. 114 (5,55), Ej. 129 (17,22), Ej. 131 (11,97), Ej. 132 (13,56), Ej. 133 (14,57), Ej. 134 (14,72), Ej. 135 (17,53), Ej. 136 (18,28), Ej. 137 (14,72), Ej. 138 (14,35), Ej. 139 (15,40), Ej. 140 (11,14), Ej. 141 (5,71), Ej. 142 (13,97), Ej. 143 (13,94), Ej. 144 (15,08), Ej. 145 (20,87), Ej. 146 (17,91), Ej. 147 (17,11), Ej. 148 (7,83), Ej. 149 (16,22), Ej. 150 (20,09), Ej. 151 (20,72), Ej. 152 (21,38), Ej. 153 (17,97), Ej. 154 (16,58), Ej. 155 (19,46), Ej. 156 (15,66), Ej. 157 (22,04), Ej. 158 (15,65), Ej. 159 (17,89), Ej. 160 (18,72), Ej. 161 (19,91), Ej. 162 (17,79), Ej. 179 (4,25), Ej. 180 (11,43), Ej. 181 (12,30), Ej. 182 (12,83), Ej. 184 (12,12), Ej. 185 (10,14), Ej. 186 (10,09), Ej. 187 (10,14), Ej. 188 (10,65), Ej. 189 (10,73), Ej. 191 (10,17), Ej. 192 (10,19), Ej. 193 (11,02), Ej. 194 (9,92), Ej. 195 (10,74).

2. Métodos biológicos

2.1. Preparación de la muestra de péptido

5 El péptido liofilizado se pesó en una microbalanza (Mettler MT5) y se disolvió en agua estéril hasta una concentración final de 1 mM, a menos que se indique lo contrario. Las soluciones madre se mantuvieron a 4°C, protegidas de la luz.

2.2. Métodos enzimáticos

10 Las condiciones de enzimas y sustratos se indican en la tabla 2. Las mediciones cinéticas se realizaron en un volumen de reacción total de 100 microlitros en placas de 96 pocillos de fondo plano (Greiner) en un lector de placas Genios (Tecan). La enzima se combinó con el péptido (inhibidor) en una solución tampón que contiene 100 mM de HEPES (pH 7,5), 50 mM de CaCl2, 0,025% de Tween-20, 5% de DMSO y 1 mM del sustrato. La velocidad de

15 hidrólisis del sustrato se midió mediante la monitorización del cambio en la absorbancia a 405 nm durante 30 min para verificar la linealidad de la curva de reacción. Se utilizó para todos los cálculos la velocidad media desde el minuto 1 hasta el minuto 10. Los cálculos iniciales de la resta del fondo, la velocidad media, promedio por duplicado y el % de inhibición se realizaron utilizando el software de Magellan (versión 5) de Tecan. Los cálculos de IC50 se realizaron utilizando GraFit (versión 5.0.10) del Erithacus Software ajustando los datos de inhibición de 6

20 concentraciones de inhibidor diferentes a la siguiente ecuación de 4 parámetros (s = factor de pendiente; x = concentración de inhibidor, y =% de inhibición a una determinada concentración del inhibidor):

25 El valor Km para el sustrato de la proteasa de serina se determinó a partir de una representación de Lineweaver-Burke (GraFit v5). El valor de Ki para el inhibidor se calculó utilizando la fórmula Ki = IC50/(1 + ([sustrato]/Km)). Se hicieron reaccionar con la enzima concentraciones crecientes de sustrato, y la velocidad de cada reacción (ABS/mseg) se representó frente a la concentración de sustrato. Se representó también la gráfica de reciprocidad (Lineweaver-Burke) para dar Km y Vmax (recuadro) (A. J. Barrtt, Métodos en enzimología “Methods in Enzimology”

30 1981, 80, 561-565; R. J. Leatherbarrow, 1992, GraFit, Erithacus Software Ltd., Staines, Reino Unido).

Tabla 2 5

Enzima/Proveedor

Concentración de la enzima en el ensayo Sustrato/Proveedor Concentración de sustrato en el ensayo (mM)

Elastasa de neutrófilos humanos / Serva

0,6 mU/reacción N-Met-Ala-Pro-Val-pnitroanilida / Sigma 1

Catepsina G de neutrófilos humanos (CAS RN 107200-920) / Calbiochem

1 mU/reacción N-succinil-Ala-Pro-Fe-pnitroanilida / Sigma 1

Tripsina, grado de yodación, de páncreas humano (CAS RN 9002-07-7) / Calbiochem

1 mU/reacción N-benzoil-Arg-pnitroanilida / Sigma 0,32

Quimasa de la piel humana / Calbiochem

9 mU/reacción N-succinil-Ala-Pro-Fe-pnitroanilida / Sigma 1,5

Trombina de plasma humano, de alta actividad (CAS RN 900204-4) / Calbiochem

100 mU/reacción Benzoil-Fe-Val-Arg-pnitroanilida / Calbiochem 0,5

Quimotripsina de páncreas humano (CAS RN 9004-07-3) / Calbiochem

1,6 microM/reacción N-succinil-Ala-Pro-Fe-pnitroanilida/Sigma 1

Factor de coagulación Xa de plasma humano (CAS RN 900205-5) / Calbiochem

0,4 mU/reacción Metoxicarbonil-D-NLE-GlyArg-p-nitroanilida / Roche 2

Triptasa de pulmón humano / Calbiochem

12,5 mU/reacción N-benzoil-Arg-pnitroanilida/Sigma 1,28

Uroquinasa de orina humana (CAS RN 9039-53-6) / Sigma Aldrich

250 mU/reacción PiroGlu-Gly-Arg-pnitroanilida x HCl / Endotell 0,5

Enzima/Proveedor

Concentración de la enzima en el ensayo Sustrato/Proveedor Concentración de sustrato en el ensayo (mM)

Calicreína de plasma humano (CAS RN 9001-01-8) / Calbiochem

0,34 microgramos/reacción N-benzoil-Pro-Fe-Arg-pnitroanilida/Sigma 1

Plasmina de plasma humano (CAS RN 9001-90-5) / Sigma-Aldrich

2 mU/reacción D-Val-Leu-Lys-pnitroanilida / Sigma 5

2.3. Ensayo de citotoxicidad

La citotoxicidad del péptido frente a células HELA (Acc57) y células COS-7 (CRL-1651) se determinó utilizando el ensayo de reducción de MTT (Mossman T., J. Immunol. Meth. 1983, 65, 55-63; M. V. Berridge y otros, Arch. Biochem. Biophys. 1993, 303, 474-482). Se sembraron células HELA y células COS-7, respectivamente, a 7,0 x 103 y 4,5 x 103, células por pocillo y se cultivaron en placas de microtitulación de 96 pocillos durante 24 horas a 37°C y 5% de CO2. En este punto, el tiempo cero (Tc) se determinó por reducción de MTT (véase a continuación). El sobrenadante de los pocillos restantes se descartó, y se pipetearon en los pocillos medio fresco y el péptido en diluciones en serie de 12,5, 25 y 50 microM. Cada concentración de péptido se ensayó por triplicado. Se continuó la incubación de las células durante 48 h a 37°C y 5% de CO2. A continuación, los pocillos se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS), y posteriormente se añadieron a los pocillos 100 microlitros de reactivo MTT (0,5 mg/ml en medio RPMI1640 y, respectivamente, DMEM). Se incubó a 37°C durante 2 h, y posteriormente se aspiró el medio, y se añadieron a cada pocillo 100 microlitros de isopropanol. Se midió la absorbancia a 595 nm del producto solubilizado (OD595péptido). Para cada concentración, se calculó un promedio a partir de triplicados. El porcentaje de crecimiento se calculó utilizando la fórmula (OD595péptido - OD595Tc -OD595pocillo vacío)/(OD595Tc - OD595pocillo vacío) x 100% y se representó para cada concentración de péptido. El valor de LC50 (la concentración, que mata al 50% de las células) se determinó para cada péptido utilizando la función de línea de tendencia de EXCEL (Microsoft Office 2000) para las concentraciones (50, 25, 12,5 y 0 microM), el porcentaje de crecimiento correspondiente y el valor -50 (= TENDENCIA (C50: C0,% 50:% 0,-50)). La concentración GI50 (inhibición del crecimiento) se calculó de cada péptido utilizando la función de línea de tendencia para las concentraciones (50, 25, 12,5 y 0 µg/ml), los porcentajes correspondientes y el valor 50 (= TREND (C50: C0, 50%: 0,50%)).

2.4. Hemólisis

Los péptidos se ensayaron para determinar su actividad hemolítica contra glóbulos rojos humanos (hRBCs). Se lavaron HRBCs frescos tres veces con PBS por centrifugación durante 10 min a 2000 x g. El péptido, a una concentración de 100 microM, se incubó con 20% (v/v) hRBCs durante 1 h a 37ºC. La concentración de los eritrocitos final fue aproximadamente 0,9 x 109 células por ml. Un valor de 0% y, respectivamente, 100% de lisis celular se determinó por incubación de las hRBCs en presencia de PBS solo y, respectivamente, Triton X-100 al 0,1% en H2O. La muestra se centrifugó, el sobrenadante se diluyó 20 veces en PBS, y se midió la densidad óptica (DO) de la muestra a 540 nm. El valor de lisis del 100% (OD540H2O) dio un OD540 de aproximadamente 1,3-1,8. El porcentaje de hemólisis se calculó utilizando la fórmula (OD540 de péptido / OD540 H2O) x 100%.

2.5. Estabilidad en plasma

Se colocaron 405 microlitros de solución de plasma/albúmina en un tubo de polipropileno (PP) y se trataron con 45 microlitros de una solución 100 mM de B, derivada de 135 microlitros de PBS y 15 microlitros de péptido 1 mM en PBS, pH 7,4. Se transfirieron alícuotas de 150 microlitros a pocillos individuales de una placa de filtro de 10 KDa (Millipore MAPPB 1010 membrana Biomax). Para los "controles de minuto 0", se colocaron 270 microlitros de PBS en un tubo de PP, y se añadieron 30 microlitros de la solución B y se agitaron con vórtex. Se colocaron 150 microlitros de la solución de control en un pocillo de la placa de filtro y sirvieron como "control filtrado". Se colocaron 150 microlitros de una solución de control adicional directamente en un pocillo receptor (reservado para el filtrado) y sirvieron como "control no filtrado". La placa entera, incluyendo la tapa de evaporación, se incubó durante 60 min a 37°C. Las muestras de plasma (plasma de rata: Harla n Sera lab Reino Unido; plasma humano: Blutspendezentrum Zürich) se centrifugaron como mínimo 2 h a 4.300 rpm (3.500 g) y 15°C, con el fin de producir 100 micr olitros de filtrado. Para las muestras de "albúmina de suero" (albúmina humana recién preparada: Sigma A-4327; albúmina de rata: Sigma A-6272, todas a una concentración de 40 mg/ml en PBS), aproximadamente 1 h de centrifugación fue suficiente. Los filtrados en la placa receptora se analizaron por CL/EM [columna: Jupiter C18 (Fenomenex); fases móviles: (A) 0,1% de ácido fórmico en agua, (B) acetonitrilo; gradiente: de 5% a 100% (B) en 2 min; ionización por electrospray, detección MRM (triple cuadrupolo)]. Las áreas de los picos se determinaron y se promediaron los valores triplicados. La unión se expresó en porcentaje de los controles 1 y 2 (filtrado y no filtrado en el punto temporal 0 min) por 100 - (100 x T60/T0). Se calculó a continuación el promedio de estos valores.

2.6. Resultados Los resultados de los experimentos descritos en las secciones 2.2. a 2,4. se indican en la tabla 3.

Los resultados de los experimentos descritos en la sección 2.5. se indican en la tabla 4. Tabla 4

Ejemplo

Estabilidad en plasma humano t1/2 (min) Estabilidad en plasma de rata t1/2 (min)

22

300 300

23

300 300

158

300 300

Claims (36)

1. REIVINDICACIONES

   1. Compuesto de fórmula

   en la que

   10 es un residuo de dipéptido compuesto por dos bloques de construcción de aminoácidos diferentes, siendo el dipéptido DPro-LPro, y Z es una cadena de undecapéptido compuesta de once residuos de aminoácidos, en el que el residuo P1 es el residuo de Nle, Ile, Aoc, hLeu, Chg, OctG, hPhe, 4AmPhe, Cha, Phe, Tyr, 2Cl-Phe, Trp, 1-Nal, o Leu;

   15 el residuo P2 es el residuo de Cys, Glu, Nle, Thr, o Gln; el residuo P3 es el residuo de Thr, Ala o Abu; el residuo P4 es el residuo de Lys, Nle, Ala, Abu, o Thr; el residuo P5 es el residuo de Ser, AlloThr, o Dpr; el residuo P6 es el residuo de Ile, C5al, Leu, Nle, Aoc, OctG, Cha, hLeu, hPhe, Chg, t-BuA, Glu o Asp;

   20 el residuo P7 es el residuo de Pro; el residuo P8 es el residuo de Pro, Ala o Pro(4NHCOFe); el residuo P9 es el residuo de Tyr, Phe, Ile, Nle, Cha, Gln, Arg, Lys, His, o Thr; el residuo P10 es el residuo de Cys, Arg, Nle, Gln, Lys, Met, Thr, o Ser, y el residuo P11 es el residuo de Tyr, Gln, Arg, Ser, Nle, 2-Nal, 2Cl-Phe, Cha, Phg, Phe, Asp, Asn, o Thr,

   25 dos residuos de Cys, que están presentes como los residuos P2 y P10, están enlazados mediante un puente bisulfuro formado por la sustitución de los dos grupos -SH en los dos residuos de Cys por un grupo –S-S-, en forma libre o en forma de una sal aceptable farmacéuticamente.
2. 2. Compuesto, según la reivindicación 1 de la fórmula I, en el que, en dicha cadena de undecapéptido,

   30 el residuo P1 es el residuo de Phe, hPhe, 4AmPhe, Nle, Chg, Ile, Tyr, Trp, 2Cl-Phe, 1-Nal, o Cha; el residuo P2 es el residuo de Cys, Glu, o Nle; el residuo P3 es el residuo de Thr; el residuo P4 es el residuo de Lys, o Nle;

   35 el residuo P5 es el residuo de Ser, AlloThr, o Dpr; el residuo P6 es el residuo de Asp, o Glu; el residuo P8 es el residuo de Pro; el residuo P9 es el residuo de Ile, Nle, Cha, Gln, o Tyr; el residuo P10 es el residuo de Cys, Arg, o Nle, y

   40 el residuo P11 es el residuo de Thr, Asp, Ser, Tyr, Phe, Asn, o Arg.
3. 3. Compuesto, según la reivindicación 1 de la fórmula I, en el que en dicha cadena de undecapéptido,

   el residuo P1 es el residuo de Ile, Nle, Aoc, hLeu, Chg, OctG, o hPhe;

   45 el residuo P2 es el residuo de Cys, Glu, Thr, o Gln; el residuo P3 es el residuo de Thr, Ala o Abu; el residuo P4 es el residuo de Ala, Thr, o Abu; el residuo P5 es el residuo de Ser; el residuo P6 es el residuos de OctG, Ile, Cha, Leu, C5al, Nle, Aoc, Chg, t-BuA o hLeu;

   50 el residuo P8 es el residuo de Pro o Pro(4NHCOFe); el residuo P9 es el residuo de Gln, Tyr, Ile, o Fe;

   el residuo P10 es el residuo de Cys, Lys, Gln, Thr, Met, o Arg, y el residuo P11 es el residuo de Tyr, Ser, Arg, Gln, Nle, 2-Nal, 2Cl-Phe, Phe, Cha, o Phg.
4. 4. Compuesto, según la reivindicación 1 de la fórmula I, en el que, en dicha cadena de undecapéptido,

   5 el residuo P1 es el residuo de Cha, Tyr, o Trp; el residuo P2 es el residuo de Cys; el residuo P3 es el residuo de Thr; el residuo P4 es el residuo de Lys; el residuo P5 es el residuo de Ser; el residuo P6 es el residuo de Leu; el residuo P8 es el residuo de Pro; el residuo P9 es el residuo de Lys; el residuo P10 es el residuo de Cys, y

   15 el residuo P11 es el residuo de Arg.
5. 5. Compuesto, según la reivindicación 1 de la fórmula I, en el que, en dicha cadena de undecapéptido,

   el residuo P1 es el residuo de Phe; el residuo P2 es el residuo de Cys; el residuo P3 es el residuo de Thr; el residuo P4 es el residuo de Lys; el residuo P5 es el residuo de Ser; el residuo P6 es el residuo de Asp;

   25 el residuo P8 es el residuo de Pro; el residuo P9 es el residuo de Ile; el residuo P10 es el residuo de Cys, y el residuo P11 es el residuo de Tyr.
6. 6. Compuesto, según la reivindicación 1 de la fórmula I, en el que, en dicha cadena de undecapéptido,

   el residuo P1 es el residuo de Ile; el residuo P2 es el residuo de Cys; el residuo P3 es el residuo de Thr;

   35 el residuo P4 es el residuo de Lys; el residuo P5 es el residuo de Ser; el residuo P6 es el residuo de Asp; el residuo P8 es el residuo de Pro; el residuo P9 es el residuo de Nle; el residuo P10 es el residuo de Cys, y el residuo P11 es el residuo de Arg.
7. 7. Compuesto, según la reivindicación 1 de la fórmula I, en el que, en dicha cadena de undecapéptido,

   45 el residuo P1 es el residuo de Ile; el residuo P2 es el residuo de Cys; el residuo P3 es el residuo de Thr; el residuo P4 es el residuo de Lys; el residuo P5 es el residuo de Ser; el residuo P6 es el residuo de Asp; el residuo P8 es el residuo de Pro; el residuo P9 es el residuo de Cha; el residuo P10 es el residuo de Cys, y el residuo P11 es el residuo de Arg.
8. 8. Compuesto, según la reivindicación 1 de la fórmula I, en el que, en dicha cadena de undecapéptido,

   el residuo P1 es el residuo de Ile; el residuo P2 es el residuo de Cys; el residuo P3 es el residuo de Thr; el residuo P4 es el residuo de Nle; el residuo P5 es el residuo de Ser; el residuo P6 es el residuo de Asp; el residuo P8 es el residuo de Pro;

   65 el residuo P9 es el residuo de Ile; el residuo P10 es el residuo de Cys, y el residuo P11 es el residuo de Arg.
9. 9. Compuesto, según la reivindicación 1 de la fórmula I, en el que, en dicha cadena de undecapéptido,

   5 el residuo P1 es el residuo de Phe; el residuo P2 es el residuo de Cys; el residuo P3 es el residuo de Thr; el residuo P4 es el residuo de Nle; el residuo P5 es el residuo de Ser; el residuo P6 es el residuo de Asp; el residuo P8 es el residuo de Pro; el residuo P9 es el residuo de Ile; el residuo P10 es el residuo de Cys, y el residuo P11 es el residuo de Tyr.
10. 10. Compuesto, según la reivindicación 1 de la fórmula I, en el que, en dicha cadena de undecapéptido,

    el residuo P1 es el residuo de Chg; el residuo P2 es el residuo de Cys; el residuo P3 es el residuo de Thr; el residuo P4 es el residuo de Lys; el residuo P5 es el residuo de Ser; el residuo P6 es el residuo de Asp; el residuo P8 es el residuo de Pro;

    25 el residuo P9 es el residuo de Ile; el residuo P10 es el residuo de Cys, y el residuo P11 es el residuo de Tyr.
11. 11. Compuesto, según la reivindicación 1 de la fórmula I, en el que, en dicha cadena de undecapéptido,

    el residuo P1 es el residuo de Nle; el residuo P2 es el residuo de Cys; el residuo P3 es el residuo de Thr; el residuo P4 es el residuo de Ala;

    35 el residuo P5 es el residuo de Ser; el residuo P6 es el residuo de Ile; el residuo P8 es el residuo de Pro; el residuo P9 es el residuo de Gln; el residuo P10 es el residuo de Cys, y el residuo P11 es el residuo de Gln.
12. 12. Compuesto, según la reivindicación 1 de la fórmula I, en el que, en dicha cadena de undecapéptido,

    el residuo P1 es el residuo de Nle;

    45 el residuo P2 es el residuo de Cys; el residuo P3 es el residuo de Thr; el residuo P4 es el residuo de Ala; el residuo P5 es el residuo de Ser; el residuo P6 es el residuo de Ile; el residuo P8 es el residuo de Pro; el residuo P9 es el residuo de Gln; el residuo P10 es el residuo de Cys, y el residuo P11 es el residuo de Tyr.

    55 13. Compuesto, según la reivindicación 1 de la fórmula I, en el que, en dicha cadena de undecapéptido,

    el residuo P1 es el residuo de hPhe; el residuo P2 es el residuo de Cys; el residuo P3 es el residuo de Thr; el residuo P4 es el residuo de Ala; el residuo P5 es el residuo de Ser; el residuo P6 es el residuo de OctG; el residuo P8 es el residuo de Pro; el residuo P9 es el residuo de Gln;

    65 el residuo P10 es el residuo de Cys, y el residuo P11 es el residuo de Gln.
13. 14. Compuesto, según la reivindicación 1 de la fórmula I, en el que en dicha cadena de undecapétido,

    el residuo P1 es el residuo de OctG;

    5 el residuo P2 es el residuo de Gln; el residuo P3 es el residuo de Thr; el residuo P4 es el residuo de Ala; el residuo P5 es el residuo de Ser; el residuo P6 es el residuo de Ile;

    10 el residuo P8 es el residuo de Pro; el residuo P9 es el residuo de Gln; el residuo P10 es el residuo de Thr, y el residuo P11 es el residuo de Tyr.

    15 15. Compuesto, según la reivindicación 1 de la fórmula I, en el que en dicha cadena de undecapétido,

    el residuo P1 es el residuo de hPhe; el residuo P2 es el residuo de Cys; el residuo P3 es el residuo de Thr;

    20 el residuo P4 es el residuo de Ala; el residuo P5 es el residuo de Ser; el residuo P6 es el residuo de Cha; el residuo P8 es el residuo de Pro; el residuo P9 es el residuo de Gln;

    25 el residuo P10 es el residuo de Cys, y el residuo P11 es el residuo de Fe.
14. 16. Compuesto, según la reivindicación 1 de la fórmula I, en el que en dicha cadena de undecapétido,

    30 el residuo P1 es el residuo de OctG; el residuo P2 es el residuo de Glu; el residuo P3 es el residuo de Thr; el residuo P4 es el residuo de Ala; el residuo P5 es el residuo de Ser;

    35 el residuo P6 es el residuo de Ile; el residuo P8 es el residuo de Pro; el residuo P9 es el residuo de Gln; el residuo P10 es el residuo de Lys, y el residuo P11 es el residuo de Tyr.
15. 17. Compuesto, según la reivindicación 1 de la fórmula I, en el que en dicha cadena de undecapétido,

    el residuo P1 es el residuo de OctG; el residuo P2 es el residuo de Cys;

    45 el residuo P3 es el residuo de Thr; el residuo P4 es el residuo de Ala; el residuo P5 es el residuo de Ser; el residuo P6 es el residuo de Cha; el residuo P8 es el residuo de Pro;

    50 el residuo P9 es el residuo de Gln; el residuo P10 es el residuo de Cys, y el residuo P11 es el residuo de Phe.
16. 18. Compuesto, según la reivindicación 1 de la fórmula I, en el que en dicha cadena de undecapétido,

    55 el residuo P1 es el residuo de hPhe; el residuo P2 es el residuo de Cys; el residuo P3 es el residuo de Thr; el residuo P4 es el residuo de Ala;

    60 el residuo P5 es el residuo de Ser; el residuo P6 es el residuo de Cha; el residuo P8 es el residuo de Pro; el residuo P9 es el residuo de Gln; el residuo P10 es el residuo de Cys, y

    65 el residuo P11 es el residuo de Gln.
17. 19. Compuesto, según la reivindicación 1 de la fórmula I, en el que en dicha cadena de undecapétido,

    el residuo P1 es el residuo de OctG; el residuo P2 es el residuo de Cys;

    5 el residuo P3 es el residuo de Thr; el residuo P4 es el residuo de Ala; el residuo P5 es el residuo de Ser; el residuo P6 es el residuo de Cha; el residuo P8 es el residuo de Pro (4NHCOFe); el residuo P9 es el residuo de Gln; el residuo P10 es el residuo de Cys, y el residuo P11 es el residuo de Gln.
18. 20. Compuesto, según la reivindicación 1 de la fórmula I, en el que en dicha cadena de undecapétido,

    15 el residuo P1 es el residuo de hPhe; el residuo P2 es el residuo de Cys; el residuo P3 es el residuo de Thr; el residuo P4 es el residuo de Ala; el residuo P5 es el residuo de Ser; el residuo P6 es el residuo de OctG; el residuo P8 es el residuo de Pro; el residuo P9 es el residuo de Gln; el residuo P10 es el residuo de Cys, y

    25 el residuo P11 es el residuo de Tyr.
19. 21. Compuesto, según la reivindicación 1 de la fórmula I, en el que en dicha cadena de undecapétido,

    el residuo P1 es el residuo de Chg; el residuo P2 es el residuo de Cys; el residuo P3 es el residuo de Thr; el residuo P4 es el residuo de Lys; el residuo P5 es el residuo de Ser; el residuo P6 es el residuo de Asp;

    35 el residuo P8 es el residuo de Pro; el residuo P9 es el residuo de Ile; el residuo P10 es el residuo de Cys, y el residuo P11 es el residuo de Thr.
20. 22. Compuesto, según la reivindicación 1 de la fórmula I, en el que en dicha cadena de undecapétido,

    el residuo P1 es el residuo de Chg; el residuo P2 es el residuo de Cys; el residuo P3 es el residuo de Thr;

    45 el residuo P4 es el residuo de Lys; el residuo P5 es el residuo de Ser; el residuo P6 es el residuo de Asp; el residuo P8 es el residuo de Pro; el residuo P9 es el residuo de Ile; el residuo P10 es el residuo de Cys, y el residuo P11 es el residuo de Asp.
21. 23. Compuesto, según la reivindicación 1 de la fórmula I, en el que en dicha cadena de undecapétido,

    55 el residuo P1 es el residuo de OctG; el residuo P2 es el residuo de Cys; el residuo P3 es el residuo de Thr; el residuo P4 es el residuo de Ala; el residuo P5 es el residuo de Ser; el residuo P6 es el residuo de Cha; el residuo P8 es el residuo de Pro; el residuo P9 es el residuo de Gln; el residuo P10 es el residuo de Cys, y el residuo P11 es el residuo de Gin.
22. 24. Compuesto, según la reivindicación 1 de la fórmula I, en el que en dicha cadena de undecapétido,

    el residuo P1 es el residuo de OctG; el residuo P2 es el residuo de Cys; el residuo P3 es el residuo de Thr;

    5 el residuo P4 es el residuo de Ala; el residuo P5 es el residuo de Ser; el residuo P6 es el residuo de Ile; el residuo P8 es el residuo de Pro; el residuo P9 es el residuo de Gln; el residuo P10 es el residuo de Cys, y el residuo P11 es el residuo de Tyr.
23. 25. Compuesto, según la reivindicación 1 de la fórmula I, en el que en dicha cadena de undecapétido,

    15 el residuo P1 es el residuo de OctG; el residuo P2 es el residuo de Cys; el residuo P3 es el residuo de Thr; el residuo P4 es el residuo de Ala; el residuo P5 es el residuo de Ser; el residuo P6 es el residuo de OctG; el residuo P8 es el residuo de Pro; el residuo P9 es el residuo de Gln; el residuo P10 es el residuo de Cys, y el residuo P11 es el residuo de Gln.
24. 26. Compuesto, según la reivindicación 1 de la fórmula I, en el que en dicha cadena de undecapétido,

    el residuo P1 es el residuo de Cha; el residuo P2 es el residuo de Cys; el residuo P3 es el residuo de Thr; el residuo P4 es el residuo de Lys; el residuo P5 es el residuo de Ser; el residuo P6 es el residuo de Leu; el residuo P8 es el residuo de Pro;

    35 el residuo P9 es el residuo de Lys; el residuo P10 es el residuo de Cys, y el residuo P11 es el residuo de Arg.
25. 27. Compuesto, según la reivindicación 1 de la fórmula I, en el que en dicha cadena de undecapétido,

    el residuo P1 es el residuo de Tyr; el residuo P2 es el residuo de Cys; el residuo P3 es el residuo de Thr; el residuo P4 es el residuo de Lys;

    45 el residuo P5 es el residuo de Ser; el residuo P6 es el residuo de Leu; el residuo P8 es el residuo de Pro; el residuo P9 es el residuo de Lys; el residuo P10 es el residuo de Cys, y el residuo P11 es el residuo de Arg.
26. 28. Compuesto, según la reivindicación 1 de la fórmula I, en el que en dicha cadena de undecapétido,

    el residuo P1 es el residuo de Trp;

    55 el residuo P2 es el residuo de Cys; el residuo P3 es el residuo de Thr; el residuo P4 es el residuo de Lys; el residuo P5 es el residuo de Ser; el residuo P6 es el residuo de Leu; el residuo P8 es el residuo de Pro; el residuo P9 es el residuo de Lys; el residuo P10 es el residuo de Cys, y el residuo P11 es el residuo de Arg.

    65 29. Compuesto, según la reivindicación 1 de la fórmula I, en forma de un enantiómero.

27. 30.

    Compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29 de la fórmula I, para su utilización como una sustancia terapéuticamente activa.

28. 31.

    Compuesto, según la reivindicación 30 de la fórmula I, con actividad selectiva inhibidora de proteasa, en

    5 particular contra la catepsina G, la elastasa o la triptasa; y/o con actividad contra el cáncer; y/o con actividad antiinflamatoria; y/o con actividad antiinfecciosa; y/o con actividad frente a una enfermedad cardiovascular; y/o con actividad contra una enfermedad inmunológica; y/o con actividad antineurodegenerativa; y/o con actividad contra una enfermedad pulmonar.

    10 32. Composición farmacéutica que comprende un compuesto, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29 de la fórmula I, como ingrediente activo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
29. 33. Composición, según la reivindicación 32, caracterizada porque está presente en una forma adecuada para su

    administración oral, bucal, rectal, vaginal, tópica, transdérmica, transmucosa, pulmonar, por inyección, inhalación o 15 implantación.
30. 34. Composición, según la reivindicación 32 o la reivindicación 33, caracterizada porque está presente en forma de una tableta, una gragea, una cápsula, una pastilla, una píldora, un polvo, un líquido, una solución, un jarabe, un elixir, una dispersión, una suspensión, una emulsión, un gel, una crema, una pomada, un emplasto, un aerosol, un

    20 nebulizador, un inhalador, un insuflador, un supositorio, un sistema de liberación sostenida, una formulación de acción prolongada, una preparación de depósito o un liposoma.
31. 35. Utilización de un compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29 de la fórmula I, para la fabricación

    de un medicamento para la inhibición de una enzima proteasa. 25
32. 36. Utilización, según la reivindicación 35, caracterizada porque dicho medicamento está destinado a ser utilizado para la prevención de una infección en un individuo sano o para retrasar una infección en un paciente infectado, o en la que el cáncer está mediado por la actividad de la proteasa; o es resultante de la actividad de la misma, o en la que una enfermedad inmunológica está mediada por la actividad de la proteasa; o es el resultado de la actividad de la

    30 misma o en la que la inflamación está mediada por la actividad de la proteasa; o es el resultado de la actividad de la misma, o en la que una reacción inmunológica está mediada por la actividad de la proteasa o es el resultado de la actividad de la misma.
33. 37. Utilización de un compuesto, según una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 5 a 10 de la fórmula I, para la 35 fabricación de un medicamento para la inhibición de la catepsina G.
34. 38. Utilización de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 3 y 11 a 22 de la fórmula I, para la fabricación de un medicamento para inhibir la elastasa.

    40 39. Utilización de un compuesto, según una cualquiera de las reivindicaciones 4 y 23 a 25 de la fórmula I, para la fabricación de un medicamento para la inhibición de la triptasa.
35. 40. Procedimiento para la fabricación de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 de la fórmula I, que comprende 45

    a) acoplar a un soporte sólido apropiadamente funcionalizado un derivado apropiadamente protegido en N del aminoácido, que en el producto final deseado está en la posición 5, 6 ó 7, y cualquier grupo funcional, que pueda estar presente en dicho derivado de aminoácido protegido en N, estando de la misma manera protegido apropiadamente;

    50 b) eliminar el grupo N-protector del producto obtenido de este modo; c) acoplar el producto obtenido de este modo con un derivado apropiadamente protegido en N del aminoácido, que en el producto final deseado está una posición más cercana al residuo de aminoácido N-terminal, y cualquier grupo funcional, que pueda estar presente en dicho derivado de aminoácido protegido en N, estando de la misma manera protegido apropiadamente;

    55 d) eliminar el grupo N-protector del producto obtenido de este modo; e) repetir las etapas (c) y (d), hasta que el residuo de aminoácido N-terminal ha sido introducido; f) acoplar el producto obtenido de este modo con un compuesto de fórmula en el que

    es como se define en la reivindicación 1 y X es un grupo protector de N, o, alternativamente,

    (fa) acoplar el producto obtenido en la etapa (e) con un derivado protegido apropiadamente en N del

    10 aminoácido L-prolina; (fb) eliminar el grupo N-protector del producto obtenido de este modo, y (fc) acoplar el producto obtenido de este modo con un derivado protegido apropiadamente en N del amino ácido D-prolina;

    g) eliminar el grupo protector de N del producto obtenido en la etapa (f) o en la etapa (fc);

    15 h) acoplar el producto obtenido de este modo con un derivado de aminoácido protegido apropiadamente en N, que en el producto final deseado se encuentra en la posición 11, y cualquier grupo funcional, que pueda estar presente en dicho derivado de aminoácido protegido en N, estando igualmente protegido adecuadamente; i) eliminar el grupo N-protector del producto obtenido de este modo;

    20 j) acoplar el producto obtenido de este modo con un derivado de aminoácido protegido apropiadamente en N, que en el producto final deseado está una posición más lejana de la posición 11, y cualquier grupo funcional, que pueda estar presente en dicho derivado de aminoácido protegido en N, estando de la misma manera protegido apropiadamente;

    k) eliminar el grupo N-protector del producto obtenido de este modo; 25 l) repetir las etapas (j) y (k), hasta que se hayan introducido todos los residuos de aminoácidos; m) si se desea, desproteger selectivamente uno o varios grupos funcionales protegidos presentes en la molécula y sustituir apropiadamente el o los grupos reactivos liberados de este modo; n) si se desea, formar un enlace intercatenario entre las cadenas laterales de los residuos de aminoácidos apropiados en las posiciones 2 y 10;

    30 o) separar el producto obtenido de este modo del soporte sólido; p) ciclar el producto escindido del soporte sólido; q) eliminar cualquier grupo protector presente en un grupo funcional de cualquier residuo de aminoácido en el producto cíclico obtenido de este modo y, si se desea, cualquier grupo protector, que puede estar presente además en la molécula obtenida de este modo; y

    35 r) si se desea, convertir un compuesto de la fórmula I en forma libre obtenido de este modo en una sal farmacéuticamente aceptable, o convertir una sal farmacéuticamente aceptable, o inaceptable, sal obtenida de este modo en el correspondiente compuesto de la fórmula I en forma libre o en una sal farmacéuticamente aceptable diferente.

    40 41. Procedimiento para la fabricación de un compuesto, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 de la fórmula I, procedimiento que comprende

    a') acoplar un soporte sólido apropiadamente funcionalizado con un compuesto de la fórmula en la que

    5 es tal como se define en la reivindicación 1 y X es un grupo protector de N, o, alternativamente,

    (a'a) de acoplamiento dicho soporte sólido apropiadamente funcionalizado con un derivado protegido apropiadamente en N del aminoácido L-prolina; (a'b) eliminar el grupo N-protector del producto obtenido de este modo; y

    10 (a'c) acoplar el producto obtenido de este modo con un derivado protegido apropiadamente en N del aminoácido D-prolina;

    b') eliminar el grupo protector de N del producto obtenido en la etapa (a') o la etapa (a'c); c') acoplar el producto obtenido de este modo con un derivado protegido apropiadamente en N del aminoácido,

    15 que en el producto final deseado se encuentra en la posición 11, y cualquier grupo funcional, que pueda estar presente en dicho derivado de aminoácido protegido en N, estando de la misma manera protegido adecuadamente;

    d') eliminar el grupo N-protector del producto obtenido de este modo; e') acoplar el producto obtenido de este modo con un derivado de aminoácido apropiadamente protegido en N,

    20 que en el producto final deseado está una posición más lejana de la posición 11, cualquier grupo funcional, que pueda estar presente en dicho derivado de aminoácido protegido en N, estando de la misma manera protegido apropiadamente;

    f') eliminar el grupo protector en N del producto obtenido de este modo; g') repetir las etapas (e') y (f), hasta que todos los residuos de aminoácidos se han introducido; 25 h') si se desea, desproteger selectivamente uno o varios grupos funcionales protegidos presentes en la molécula y sustituir apropiadamente el o los grupos reactivos liberados de este modo; i') si se desea, formar un enlace intercatenario entre las cadenas laterales de los residuos de aminoácidos apropiados en las posiciones 2 y 10; j') separar el producto obtenido de este modo del soporte sólido; 30 k') ciclar el producto escindido del soporte sólido;

    l') retirar cualquier grupo protector presente en un grupo funcional de cualquier residuo de aminoácido en el producto cíclico obtenido de este modo y, si se desea, cualquier grupo protector, que pueda además estar presente en la molécula obtenida de este modo, y

    m') si se desea, convertir un compuesto de la fórmula I en forma libre obtenido de este modo en una sal

    35 farmacéuticamente aceptable, o convertir una sal farmacéuticamente aceptable, o inaceptable, sal obtenida de este modo en el correspondiente compuesto de la fórmula I en forma libre o en una sal farmacéuticamente aceptable diferente.
36. 42. Procedimiento, según la reivindicación 40 o la reivindicación 41, para la fabricación de un compuesto tal como se

    40 define en la reivindicación 29 de la fórmula I, procedimiento que comprende la utilización de cualquier material de partida quiral en forma de un enantiómero.