CN103845737B - 基于mim蛋白环肽抑制剂的靶向长循环脂质体及其制备方法与应用 - Google Patents
基于mim蛋白环肽抑制剂的靶向长循环脂质体及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
发明提供的基于MIM蛋白环肽抑制剂的靶向长循环脂质体，其结构式如（I）所示；本发明还提供了上述基于MIM蛋白环肽抑制剂的靶向长循环脂质体的制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。该脂质体选择性强、安全性高，可以实现肿瘤细胞靶向给药，降低肿瘤药物的毒副作用，且小分子环肽抑制剂S3‑a02可以与该脂质体包覆的其它抗肿瘤药物发挥双重药效，极大的提高肿瘤治疗效果。
Description
技术领域
本发明属于药用高分子辅料领域，具体涉及一种基于MIM蛋白环肽抑制剂的靶向长循环脂质体，该脂质体为以基于MIM蛋白I-BAR二聚体的环肽抑制剂S3-a02为靶向配体的聚乙二醇修饰磷脂衍生物，还涉及该脂质体在抗肿瘤药物制备中的应用。
背景技术
脂质体是由磷脂依靠疏水缔合作用在水中自发形成的一种分子有序组合体，为多层囊泡结构，每层均为类脂双分子层，层间和脂质体核内为水相，双分子膜间为油相。其性质与细胞膜相似，因此具有很好的生物相容性。然而当脂质体进入血液循环系统后，很容易被网状内皮系统（Reticulo-endothelial Systems,RES）识别而快速离开血流。因此，“长循环”是脂质体作为给药系统必须具备的基本性质。大量研究表明，在载体表面用亲水性的聚合物如聚乙二醇（PEG）进行化学修饰是达到这一特性的最佳方法，在体外，起立体屏障作用的聚合物可以保护脂质体不与各种溶剂产生作用；在生物学水平，用PEG修饰的脂质体不容易被血浆蛋白吸附，减少与调理素的相互作用，稳定性提高，同时可以有效地避免网状内皮系统的识别，从而大大延长在血液循环系统的停留时间，为其进入组织创造有利条件。
脂质体对肿瘤组织的靶向一般通过被动靶向和主动靶向的设计来实现，其中被动靶向的设计主要通过调控脂质体粒径的大小。肿瘤组织等病变部位的毛细血管壁内含亚微米孔道，其对亚微米粒子的截流尺寸大约在380nm到780nm之间。因此与正常组织（其毛细血管壁的通道仅为几纳米）相比，尺寸在100-200nm之间的纳米粒子透过肿瘤组织的毛细血管壁要相对容易。另一方面，与正常组织相比，由于肿瘤的淋巴毛细管也要少许多，因此通过淋巴系统排除纳米粒子的可能性也要小得多。这两方面的作用，使粒径在100nm左右的纳米粒子更容易进入并保留在肿瘤组织中，这一现象被称为“增强渗透与滞留效应”。因此，粒径在100nm左右的脂质体药物粒子对肿瘤有被动靶向的作用。1995年美国FDA批准阿霉素长循环脂质体(Doxil)上市用于治疗AIDS相关的卡波济肉瘤和卵巢癌，其成功上市即得益于脂质体表面的PEG外套和脂质体粒径的控制（100nm）。STEALTH是Doxil的脂质体载体，使其具有长循环特性的成分为甲氧基聚乙二醇－二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（MPEG-DSPE），结构如下：
甲氧基聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺MPEG-DSPE
其结构是甲氧基聚乙二醇（MPEG，分子量约为2000）与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）通过羰基相联的产物。研究表明，与普通的阿霉素相比，该阿霉素长循环脂质体对肿瘤细胞的靶向性好，心脏毒性大大减少，抗肿瘤疗效增强。
包封于长循环脂质体中的抗癌药通过被动靶向可以显著地增加抗癌药物的治疗效果，但选择性地靶向到体内作用部位将比被动靶向进一步增加药物的治疗指数。实现脂质体药物对肿瘤器官、肿瘤或肿瘤细胞的主动靶向性能的常用方法有以下几种：(1)阳离子脂质体，靶向肿瘤细胞质膜上的负电荷；(2)磁性脂质体，在足够的体外磁场引导下，随血流运行，选择性地到达并定位于肿瘤靶区；(3)细胞渗透性多肽，用于增强肿瘤细胞对脂质体的内摄作用；(4)生物对，靶向在肿瘤细胞表面过表达的特异性分子；（5）配体-受体作用，靶向肿瘤细胞外或细胞内的特异性受体；（6）免疫脂质体，在脂质体外层连接肿瘤细胞特应性的抗体或抗体片段。
这些方法中研究最多的是将相应的靶向配体（抗体、叶酸、多肽、多糖片段等）连接到脂质体表面，为同时保留脂质体的长循环特性，这些配体通常与脂质体PEG外套的远端相连。
肿瘤的发生、发展和肿瘤细胞间或肿瘤细胞与周围基质细胞间的生物信号传导异常密切相关，其中相关信号通路之一即Hedgehog通路，相关的靶向药物研究也是分子肿瘤学的热点。MIM(Missing in metastasis，也称MTSS1或BEG4)蛋白是Hedgehog通路的重要响应蛋白，能够促进Gli蛋白转录功能，并调控cillia发生。蛋白-脂质双分子膜相互作用是当前脂质体调控和载药研究的前沿。I-BAR家族是一类能够结合并影响脂质双分子膜的蛋白，不仅能对细胞膜形态变化做出调节，对人工磷脂膜也产生类似作用。Hedgehog通路相关的MIM基因是I-BAR家族的重要成员，它在转移性细胞中表达异常，与许多晚期癌症相关。我们在前期研究中首次发现了靶向MIM蛋白二聚体的多肽以及小分子环肽抑制剂，并用于MIM蛋白功能研究，发现其对MIM介导的膜运动、细胞内吞均有显著的干扰。同时发现MIM蛋白能够增加脂质体的稳定性，延长释药时间，而 MIM抑制剂则可以干扰这些作用，由此推测MIM-抑制剂共同使用将有助于建立一种新型脂质体载药控释系统。
小分子环肽抑制剂S3-a02（见图3）能够显著抑制MIM二聚化，IC50达到95nM，很有可能是首次发现的MIM蛋白靶向小分子抑制剂，S3-a02对MIM-I-BAR-GFP/293A细胞的紫杉醇高敏感性抑制，其机理是培养液中的S3-a02抑制了MIM I-BAR蛋白表达造成的细胞内吞增加，这对于后续研究很有帮助，而对于MIM蛋白的分子肿瘤学研究甚至药物研发也有深远的意义。
如果将基于MIM蛋白I-BAR二聚体的环肽抑制剂S3-a02作为靶向配体，通过PEG链偶联在脂质体上制备长循环脂质体，有望成为一种对肿瘤细胞具有主动靶向功能的新型抗肿瘤药物的载体。
发明内容
发明目的：为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于MIM蛋白环肽抑制剂的靶向长循环脂质体，利用肿瘤有高特异性的小分子环肽抑制剂S3-a02作为脂质体的靶向配体来实现脂质体的肿瘤靶向，从而填补了现有技术的空白，提供了一种对肿瘤细胞具有主动靶向功能的新型抗肿瘤药物的载体。
技术方案：本发明提供的基于MIM蛋白环肽抑制剂的靶向长循环脂质体，其结构式如（I）所示：
x为3～20的整数，y为3～20的整数，n为10-150的整数。
优选地，其中，x为16，y为16，n为45。
本发明还提供了上述基于MIM蛋白环肽抑制剂的靶向长循环脂质体的制备方法，包括以下步骤：以聚乙二醇（PEG）为起始原料，用对硝基苯基氯甲酸酯将PEG两端活化后，在碱性条件下将对硝基苯基氯甲酸酯活化后的PEG分别与带有伯胺基的磷脂（DSPE）和环肽（S3-a02）成酰胺键，即得基于MIM蛋白I-BAR二聚体的环肽抑制剂S3-a02为靶向配体的聚乙二醇修饰磷脂衍生物（DSPE-PEG-S3-a02）。
所述制备方法，具体包括以下步骤：
1）双对硝基苯基碳酸酯聚乙二醇（pNP-PEG-pNP）的合成：在三乙胺的催化下，聚乙二醇（PEG）与过量的对硝基苯基氯甲酸酯室温下反应10-15h，过滤，滤液蒸干，依次用乙醚、乙酸乙酯重结晶，得双对硝基苯基碳酸酯聚乙二醇，其反应式如下：
2）二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-对硝基苯基碳酸酯（DSPE-PEG-pNP）的合成：在三乙胺的催化下，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）和过量的双对硝基苯基碳酸酯聚乙二醇（pNP-PEG-pNP）40-50℃下反应5-10h，加入乙酸和乙腈，过滤，滤液蒸干，加入碳酸氢钠水溶液溶解，超滤，冻干，得二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-对硝基苯基碳酸酯，其反应式如下：
3）二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环肽（S3-a02）（DSPE-PEG-S3-a02）的合成：将二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-对硝基苯基碳酸酯（DSPE-PEG-pNP）溶于氯仿中，减压蒸馏除去溶剂形成脂膜；将环肽S3-a02溶于稀盐酸中，加入脂膜并轻摇使脂膜充分分散；再加入pH为9.0的Tris缓冲液混匀，0-10℃反应10-16h；产物在以水为介质、 分子量为3.5KD的透析袋透析2-3天，冻干，即得，反应式如下：
其中，步骤1）中，溶剂为二氯甲烷，所述聚乙二醇为PEG2000、PEG4000或者PEG6000。
其中，步骤2）中，溶剂为氯仿，溶剂、乙酸和乙腈的体积比为20：（2-4）：（4-6），碳酸氢钠水溶液的质量百分比浓度为15-25%。
其中，步骤3）中，稀盐酸的浓度为1-3mol/L。
本发明还提供了上述基于MIM蛋白环肽抑制剂的靶向长循环脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。
其中，所述抗肿瘤药物中包括上述的基于MIM蛋白环肽抑制剂的靶向长循环脂质体、脂质体基质和抗肿瘤药物。
其中，所述抗肿瘤药物选自紫杉醇、表阿霉素、藤黄酸、多西紫杉醇、环孢素A、长春酰胺或柔红霉素中的任意一种或几种的组合；所述脂质体基质选自蛋黄卵磷脂EPC、二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC或胆固醇Chol中的一种或几种的组合，其中二棕榈酰磷脂酰胆碱DPPC和二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC均为饱和卵磷脂脂质体基质。
其中，所述脂质体基质为蛋黄卵磷脂EPC和胆固醇，所述抗肿瘤药物为阿霉素；其中，蛋黄卵磷脂EPC、胆固醇Chol、阿霉素、基于MIM蛋白环肽抑制剂的靶向长循环脂质体的摩尔比为20:2:2:1。
其中，所述基于MIM蛋白环肽抑制剂的靶向长循环脂质体的平均粒径为75-170纳米，从而能使抗肿瘤药物在肿瘤部位主动靶向浓集。
有益效果：本发明提供的基于MIM蛋白环肽抑制剂的靶向长循环脂质体选择性强、安全性高，可以实现肿瘤细胞靶向给药，降低肿瘤药物的毒副作用，且小分子环肽抑制剂S3-a02可以与该脂质体包覆的其它抗肿瘤药物发挥双重药效，极大的提高肿瘤治疗效果。
目前唯一已用于临床的长循环脂质体抗肿瘤药物Doxil（甲氧基聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺（MPEG-DSPE）包覆阿霉素），存在血液循环时间过长在高剂量使用时引起皮肤毒性的缺陷，且在中国的售价非常昂贵，大大限制了中国肿瘤患者的使用。本发明的DSPE-PEG-S3-a02的脂质体制剂可以实现肿瘤细胞靶向给药，降低肿瘤药物的毒副作用，提高药效。此外，小分子环肽抑制剂S3-a02本身可以抑制MIM蛋白I-BAR二聚体的二聚化，从而可以抑制Hedgehog通路，这条通道与肿瘤的发生、发展和肿瘤细胞间或肿瘤细胞与周围基质细胞间的生物信号传导异常密切相关，可以与脂质体包覆的其它抗肿瘤药物发挥双重药效，极大的提高肿瘤治疗效果。
附图说明
图1为阿霉素普通脂质体对七种人肿瘤细胞及WI-38生长抑制活性图。
图2为本发明基于MIM蛋白环肽抑制剂的靶向长循环脂质体对七种人肿瘤细胞及WI-38生长抑制活性。
图3为小分子环肽S3-a02的结构图。
具体实施方式
实施例1
基于MIM蛋白环肽抑制剂的靶向长循环脂质体的制备，包括以下步骤：
（1）双对硝基苯基碳酸酯聚乙二醇2000（pNP-PEG2000-pNP）的制备
将5g聚乙二醇2000（PEG2000）溶于50mL二氯甲烷中，再加入1mL三乙胺和1g对硝基苯基氯甲酸酯于室温下搅拌反应12h，待完全反应，将体系中生成的三乙胺盐酸盐沉淀过滤，滤液减压蒸干，所得粗品分别用乙醚和乙酸乙酯重结晶，最终得到白色粉末状产品3.6g，即为双对硝基苯基碳酸酯聚乙二醇2000。
1H-NMR(500MHZ,CDCl3)δ(ppm):3.59-3.68(m,multi H,back bone–OCH2CH2O-),4.43(t,4H,-CH2OCO),7.35(d,4H,J=7.8Hz,Ar-H),8.19(d,4H,J=7.8Hz,Ar-H).IR(KBr,cm-1):2879,1630,1591,1468,1352,1271,1243.
（2）二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-对硝基苯基碳酸酯（DSPE-PEG2000-pNP）制备
将步骤（1）制得的双对硝基苯基碳酸酯聚乙二醇2000（pNP-PEG2000-pNP）1g，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（0.08g）和三乙胺0.5mL加入到20mL氯仿中，控温45℃反应6h，然后加入乙酸2mL、乙腈5mL，搅拌过滤、浓缩，溶于质量百分比浓度为20%碳酸氢钠水溶液，超滤，冻干得产品0.7g，即为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-对硝基苯基碳酸酯。
1H-NMR(500MHZ,CDCl3)δ(ppm):0.85-0.89(m,6H,-CH3),1.23-1.29(m,multi H,back bone,-CH2-),2.81-2.89(m,5H,-CH2),3.61-3.70(m,multi H,back bone–OCH2CH2O-),4.42(t,4H,-CH2OCO),7.36(d,2H,J=7.8Hz,Ar-H),8.19(d,2H,J=7.8Hz,Ar-H).IR(KBr,cm-1):3357,2861,1632,1468,1385,1252.
（3）二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-环肽（S3-a02）（DSPE-PEG2000-S3-a02）的 制备：
将步骤（2）制得的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-对硝基苯基碳酸酯（DSPE-PEG-pNP）100mg溶于氯仿中，然后减压蒸馏除去溶剂形成脂膜。将40mg环肽S3-a02溶于2mol/L稀盐酸中，加入脂膜并轻摇使脂膜充分分散。于上述混悬液中加入10mmol/L的Tris缓冲液（PH9.0）80mL并混匀，5℃反应12h。以水为介质，分子量为3.5KD的透析袋透析2天，冻干制得目标产物110mg，即为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-环肽（S3-a02）。
1H-NMR(500MHZ,CDCl3)δ(ppm):0.84-0.90(m,6H,-CH3),0.92-0.95(m,4H,-CH3),1.23-1.29(m,multi H,back bone,-CH2-),2.80-3.12(m,14H,-CH2),3.61-3.70(m,multiH,back bone–OCH2CH2O-),3.83-3.91(m,4H,-CH-),4.38-4.45(m,4H,-CH2OCO),6.85-6.97(m,10H,-CONH-).IR(KBr,cm-1):3355,2858,1643,1461,1390,1256.
实施例2
基于MIM蛋白环肽抑制剂的靶向长循环脂质体的制备，包括以下步骤：
（1）双对硝基苯基碳酸酯聚乙二醇4000（pNP-PEG4000-pNP）的制备
将5g聚乙二醇4000（PEG4000）溶于50mL二氯甲烷中，再加入1mL三乙胺和2g对硝基苯基氯甲酸酯于室温下搅拌反应10h，待完全反应，将体系中生成的三乙胺盐酸盐沉淀过滤，滤液减压蒸干，所得粗品分别用乙醚和乙酸乙酯重结晶，最终得到白色粉末状产品3.6g，即为双对硝基苯基碳酸酯聚乙二醇4000。
（2）二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇4000-对硝基苯基碳酸酯（DSPE-PEG4000-pNP）制备
将步骤（1）制得的双对硝基苯基碳酸酯聚乙二醇4000（pNP-PEG4000-pNP）1g，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（0.08g）和三乙胺0.5mL加入到20mL氯仿中，控温40℃反应10h，然后加入乙酸4mL、乙腈6mL，搅拌过滤、浓缩，溶于质量百分比浓度为15%的碳酸氢钠水溶液，超滤，冻干得产品0.7g，即为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇4000-对硝基苯基碳酸酯。
（3）二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇4000-环肽（S3-a02）（DSPE-PEG4000-S3-a02）的制备：
将步骤（2）制得的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-对硝基苯基碳酸酯（DSPE-PEG-pNP）100mg溶于氯仿中，然后减压蒸馏除去溶剂形成脂膜。将40mg环肽S3-a02溶于3mol/L稀盐酸中，加入脂膜并轻摇使脂膜充分分散。于上述混悬液中加入10mmol/L的Tris缓冲液（PH9.0）80mL并混匀，0℃反应16h。以水为介质，分子量为3.5KD的透析袋透析2天，冻干制得目标产物110mg，即为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇4000-环肽（S3-a02）。
实施例3
基于MIM蛋白环肽抑制剂的靶向长循环脂质体的制备，包括以下步骤：
（1）双对硝基苯基碳酸酯聚乙二醇6000（pNP-PEG6000-pNP）的制备
将5g聚乙二醇6000（PEG6000）溶于50mL二氯甲烷中，再加入1mL三乙胺和3g对硝基苯基氯甲酸酯于室温下搅拌反应15h，待完全反应，将体系中生成的三乙胺盐酸盐沉淀过滤，滤液减压蒸干，所得粗品分别用乙醚和乙酸乙酯重结晶，最终得到白色粉末状产品3.6g，即为双对硝基苯基碳酸酯聚乙二醇6000。
（2）二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇6000-对硝基苯基碳酸酯（DSPE-PEG6000-pNP）制备
将步骤（1）制得的双对硝基苯基碳酸酯聚乙二醇6000（pNP-PEG6000-pNP）1g，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（0.08g）和三乙胺0.5mL加入到20mL氯仿中，控温50℃反应5h，然后加入乙酸3mL、乙腈4mL，搅拌过滤、浓缩，溶于质量百分比浓度为25%的碳酸氢钠水溶液，超滤，冻干得产品0.7g，即为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇6000-对硝基苯基碳酸酯。
（3）二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇6000-环肽（S3-a02）（DSPE-PEG6000-S3-a02）的制备：
将步骤（2）制得的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-对硝基苯基碳酸酯（DSPE-PEG-pNP）100mg溶于氯仿中，然后减压蒸馏除去溶剂形成脂膜。将40mg环肽S3-a02溶于1mol/L稀盐酸中，加入脂膜并轻摇使脂膜充分分散。于上述混悬液中加入10mmol/L的Tris缓冲液（PH9.0）80mL并混匀，10℃反应10h。以水为介质，分子量为3.5KD的透析袋透析3天，冻干制得目标产物110mg，即为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇6000-环肽（S3-a02）。
实施例4阿霉素靶向长循环脂质体的制备
利用薄膜水化—超声法制备阿霉素靶向长循环脂质体，具体制备过程如下：
取干燥实施例1制得的基于MIM蛋白环肽抑制剂的靶向长循环脂质体（DSPE-PEG2000-S3-a02）、卵磷脂、胆固醇以及阿霉素（EPC:Chol:DSPE-PEG2000-S3-a02:阿霉素的摩尔比为20:2:1:2，其中，其中卵磷脂浓度为20mM）于圆底烧瓶中，加入适量氯仿溶解。制备空白脂质体则不加入阿霉素。30℃旋转蒸发干燥，残留物出现后，再继续此干燥操作过程10min。将圆底烧瓶置于干燥器内过夜除去痕量溶剂。加入适量磷酸盐缓冲液，置于空气浴振荡仪中震荡30min-1h，水化干燥脂质膜，所形成的乳状混悬液主要是极不均匀的大多室脂质体（multilamellar large vesicle，MLV）。
取MLV分散体置于锥形离心管中，之后放在冰浴中。将超声波细胞破碎仪的探头浸入样品中，超声10-60min，有效时间为50%，直至分散体从乳状转变成乳光状。12000rpm离心15min，除去较大粒子（小于3%）和探头上脱落的金属屑，即得阿霉素靶向长循环脂质体和空白长循环脂质体。
（1）阿霉素靶向长循环脂质体包封率的测定
取阿霉素靶向长循环脂质体混悬液2mL平均分成两份：一份上已用空白脂质体预处理的Spehadex G-50凝胶柱，以pH7.4的PBS为洗脱液分离脂质体和游离阿霉素。收集脂质体组分，加入1%Triton X-100破乳，于360nm处测定吸光度Ae，计算阿霉素浓度Ce；另一份阿霉素靶向长循环脂质体稀释到与上柱后脂质体组分相同体积，加入1%Triton X-100破乳，于同样条件下测定吸光度At，计算阿霉素浓度Ct。
包封率是指包封在脂质体内的药物量占总药量的百分比，更准确的说法是插入脂质 双分子层的阿霉素占脂质体混悬液中阿霉素总量的百分比。以EE%=Ce/Ct×100%计算包封率。
根据该处方制备的长循环脂质体，阿霉素包封率高达93%以上。
（2）空白长循环脂质体和阿霉素长循环脂质体的平均粒度的测定
取新鲜制备的空白长循环脂质体和阿霉素长循环脂质体0.1ml，用去离子水稀释至1.0ml，用Zetasizer Nano-zs90激光粒度仪于室温下测定粒度。
粒度及分布是评价脂质体的另一重要指标，按照最佳处方制备的空白长循环脂质体和阿霉素长循环脂质体的平均粒度分别为81.12±0.59nm(n=3)和96.72±1.01nm(n=3)，分布均匀，范围窄。阿霉素脂质体因磷脂双分子层中镶嵌了阿霉素，粒度稍大于空白脂质体，符合规律。因粒度小于100nm，阿霉素脂质体在体内可以发挥其对肿瘤组织的被动靶向性。同时因粒度小于1μm，可安全用于静脉给药，符合制剂的要求。
实施例5
阿霉素普通脂质体和本发明的阿霉素靶向长循环脂质体的体外抗肿瘤细胞活性实验（1）化合物溶液配制
精确称取一定质量的阿霉素普通脂质体和本发明的阿霉素靶向长循环脂质体，用DMSO溶解配制成20mM的储存液，于4℃保存，保存时间不超过一星期，使用时用培养基稀释至所需浓度。
（2）细胞株培养
人胰腺癌细胞株Miapaca2,Panc1，人前列腺癌细胞DU145,PC3，人肺癌细胞A549,NCI-H661，人乳腺癌细胞MDA-MB-23以及正常肺成纤维细胞株WI-38生长在含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基中，37℃、5%CO2恒温箱中培养。
（3）细胞活力测定实验（WST-8法）
取对数生长期的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，接种于96孔细胞培养板中，每孔5000细胞/0.1ml。加入化合物浓度3倍梯度稀释的培养基0.1ml，共5个浓度。于37℃、5%CO2恒温箱中培养72-96hh后，弃原培养液，加入0.1ml WST-8试剂（1：10稀释）于37℃孵育1-2h后，多道酶标仪检测OD450nm和650nm的吸光度值。结果用处理组占对应空白对照组百分率表示，半数抑制浓度（IC50）用GraphPad Prism5.0软件拟合Sigmoid曲线计算得到。
结果表明，阿霉素普通脂质体可以明显提高所包载药物进入肿瘤细胞的能力（如人胰腺癌细胞Miapaca2,Panc1，人前列腺癌细胞DU145,PC3，人肺癌细胞A549,NCI-H661，以及人乳腺癌细胞MDA-MB-231），并对肿瘤细胞的抑制能力较普通脂质体明显增强。如图1和图2所示，阿霉素普通脂质体(Lip-doxorubicin)对七种人肿瘤细胞的IC50值在1.897-5.082μM范围内，而本发明的靶向长循环脂质体（S3-a02-Lip-doxorubicin）对七种人肿瘤细胞的IC50值在0.985-2.565μM范围内，本发明的靶向脂质体对于肿瘤细胞的抑制能力要明显强于普通脂质体。而本发明的靶向脂质体对正常细胞的IC50值是对肿瘤细胞的IC50值的10倍以上，这些结果表明本发明的靶向脂质体对肿瘤细胞的选择性更强，安全性更高。
实施例6
细胞粘附实验
采用PH敏感荧光探针BCECF-AM用于研究肿瘤细胞与普通阿霉素脂质体和本发明的靶向长循环脂质体之间的粘附。人胰腺癌细胞Panc1，人肺癌细胞A549和人前列腺癌细胞DU145（1×106cells/mL）与3μM的BCECF-AM在37℃水浴中孵育0.5h，使用PBS缓冲液洗三次除去游离的BCECF-AM，标记过的细胞混悬在细胞培养液中备用。然后将阿霉素普通脂质体（Lip-doxorubicine）和阿霉素靶向长循环脂质体（DSPE-PEG2000-S3-a02-Lip-doxorubicine）分别溶于二氯甲烷中，滴加到盖玻片上，铺平，待二氯甲烷挥发后，在盖玻片上形成薄膜。将上述盖玻片分别置于8孔细胞培养板中，用PBS缓冲液冲洗三次，加入含5%BSA的磷酸盐缓冲液于5℃孵育2h封板，加入上述已标记好的肿瘤细胞，将培养板置于二氧化碳培养箱中，37℃孵育15min。孵育结束后，用PBS缓冲液洗去未粘附的细胞，粘附在盖玻片上的细胞用DMSO溶解，荧光分光光度法测定吸收度，计算细胞的吸附百分比。
采用PH敏感荧光探针BCECF-AM用于研究人胰腺癌细胞Panc1，人肺癌细胞A549和人前列腺癌细胞DU145与普通阿霉素脂质体和本发明的靶向长循环脂质体之间的粘附。结果显示，本发明的靶向长循环脂质体对三种人肿瘤细胞的粘附率要明显高于阿霉素普通脂质体，如表1所示。
表1三种人肿瘤细胞的粘附结果（%）
Claims (1)
1.基于MIM蛋白环肽抑制剂的靶向长循环脂质体的制备方法，所述基于MIM蛋白环
肽抑制剂的靶向长循环脂质体其结构式如(I)所示：
其中，S3-a02为
x为3～20的整数，y为3～20的整数，n为10-150的整数；其特征在于：包括以下步骤：
1)双对硝基苯基碳酸酯聚乙二醇的合成：在三乙胺的催化下，聚乙二醇与过量的对硝基苯基氯甲酸酯室温下反应10-15h，过滤，滤液蒸干，依次用乙醚、乙酸乙酯重结晶，得双对硝基苯基碳酸酯聚乙二醇；
2)二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-对硝基苯基碳酸酯的合成：在三乙胺的催化下，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和过量的双对硝基苯基碳酸酯聚乙二醇40-50℃下反应5-10h，加入乙酸和乙腈，过滤，滤液蒸干，加入碳酸氢钠水溶液溶解，超滤，冻干，得二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-对硝基苯基碳酸酯；
3)二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-环肽的合成：将二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-对硝基苯基碳酸酯溶于氯仿中，减压蒸馏除去溶剂形成脂膜；将环肽S3-a02溶于稀盐酸中，加入脂膜并轻摇使脂膜充分分散；再加入pH为9.0的Tris缓冲液混匀，0-10℃反应10-16h；产物在以水为介质、分子量为3.5KD的透析袋透析2-3天，冻干，即得；步骤1)中，溶剂为二氯甲烷，所述聚乙二醇为PEG2000、PEG4000或者PEG6000；步骤2)中，溶剂为氯仿，溶剂、乙酸和乙腈的体积比为20：(2-4)：(4-6)，碳酸氢钠水溶液的质量百分比浓度为15-25％；步骤3)中，稀盐酸的浓度为1-3mol/L。
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