JP6173298B2 - 治療薬としての肝細胞増殖因子模倣体 - Google Patents
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Description
本発明は、NIHの認可番号第MH086032号に基づき、部分的に政府支援を受けてなされたものである。政府は本発明に特定の権限を有する。
配列リスト
本出願は「配列リスト」として、2012年4月2日に作成された1022バイトの添付テキストファイル「Sequence.txt」の全内容を包含しており、これは参照することにより本明細書に含まれる。
本発明は概括的には、模倣薬(アゴニスト)またはアンタゴニストとして作用し得る肝細胞増殖因子(HGF)模倣体の開発に関するものである。模倣薬は、認知機能を促進するために;一般的な神経保護/神経再生薬として;創傷修復を容易にするために;インスリン感受性およびグルコース輸送を改善するために;ならびに神経変性疾患を予防または改善し、神経系への外傷の修復を容易にし、組織および器官の血管新生を増強させ、傷害された創傷の治癒を向上し、心臓、肺、腎臓および肝臓などの器官において線維性変化を減少または改善させるために認知症の徴候を予防または改善する目的で組織または器官の線維症を減少させるために、作用する。アンタゴニストは例えば、抗血管新生剤および抗癌剤として;血管過多に関連する黄斑変性症および糖尿病性網膜症などの多様な悪性病変および疾患を治療するために作用する。
認知症:認知症と診断された患者は米国だけでも約1千万人存在し、その数は老年人口になるにつれ毎年増加し続けている。これらの患者の治療およびケアにかかる費用は年間700億ドルを越え、急速に増加している。不運にも現在、認知症の管理のための治療選択肢は非常に限定的であり、ほとんど効果がない。健康上の問題がこの規模で急激に増加していることに対して治療選択肢が不足している状況では、新たな革新的治療アプローチをできるかぎり早急に開発することが必要である。
神経保護/神経再生:HGFおよびcMetは成長期および成人期の脳および神経の両方で活発に発現する。Met系は中枢神経系および末梢神経系の両方を適切に機能させるために必須である。認知に重要な領域である前頭皮質、上衣、視床、小脳皮質、深部灰白質および海馬を含む脳の複数の領域でHGFおよびc‐Metが発現することは多数の研究で示されている。
上述の生物学的活性はまた、HGF/c‐Metシグナル伝達が神経栄養性であり(Hondaら、1995年)保護的である(Zhangら、2000年;Takeoら、2007年;TyndallおよびWalikonis、2007年;Takeuchiら、2008年)脳内Met機能を特徴づける。他の組織におけるその活性と同様に、脳内Metは発生に関与し、分化、運動性および神経突起生成中の誘導要素として作用する(Ebensら、1996年;Sunら、2002年;TyndallおよびWalikonis、2007年)。HGF/c‐Metシグナル伝達はまた、特に虚血脳損傷後の(Takeoら、2007年)ニューロン損傷の治癒を促進することが分かっている(Trappら、2008年)。HGFはまた、筋萎縮性側索硬化症(ALS)などの神経変性疾患の動物モデルに対して神経保護効果を示した。HGFの多様な機能に、非常に高い神経栄養活性を加えると、神経系の多様な疾患を治療するための可能性ある治療薬としてHGFが促進される。
パーキンソン病:パーキンソン病(PD)などの多くの神経変性疾患のために以前から考えられてきた治療選択肢は、疾患の進行を停止させ、機能不全を修復し、あるいは運良くその両方を行うことを意図する増殖因子の応用であった(Rangasamyら、2010年のレビュー)。しかしこの夢は、脳内送達や費用の限界から臨床医学レベルでは十分に果たされていない。増殖因子は一般的に、代謝的に変化しやすく、かつ巨大なため血液‐脳関門(BBB)を通過できない巨大タンパク質である。このように、増殖因子が適正な位置で、十分に高い濃度で、また臨床的緩和をもたらす十分に長い期間発現することを期待し、ほとんどの送達アプローチが遺伝子療法を利用してきた。GDNFのような増殖因子を脳へ送達させるため、動物モデルにおける多数の創造的かつ良好なアプローチが採用されてきたが(Wangら、2011年)、これらの方法は多くの患者に実行するには技術的に複雑であり、非常に困難である。
外傷性脳損傷/脊髄損傷:TBIはしばしば認知機能に悪影響を与え、知能の一時的低下を伴う軽度から長期化した衰退認知機能不全を伴う重度まで影響が及び得る(Kaneら、2011年)。不安、攻撃性、抑うつ:など他の神経学的障害を伴う認知困難は結果として生活の質が大幅に低下することになる(MaselおよびDeWitt、2010年)。イラクに続いてアフガニスタンにも及んだ軍事行動により、TBIは全戦闘犠牲者の28%を占める主要な戦闘傷害となっている(Okie、2005年;米国、Medicine、2006年5月、第42号)。2001年から2010年の間にTBIになった軍人の総推定人数は180,000から320,000人である(米国、防衛・退役軍人脳外傷センター調べ)。
抗線維化薬としてのHGF:線維症は多様な形態をとり、心筋梗塞、糖尿病およびアルコール依存症などの多くの病態に続発する心臓、腎臓および肝臓の機能不全の主な要因である。肝細胞増殖因子(HGF)は広範な動物モデルにおいて組織線維症を改善する際に著しい有効性をもって強力な抗線維症効果を示している。HGFは広範な動物モデルおよび組織において組織線維症を改善する注目に値する強力な抗線維症効果を発揮する(LiuおよびYang、2006年)。根拠として、慢性炎症および進行性組織瘢痕のモデルである慢性同種移植腎障害ラットにおいて外因性HGFの治療効果を実証してきた。ヒトHGF遺伝子の筋肉内投与により、死亡率が減少し、炎症および浸潤が抑制され、腎線維症が減少した(LiuおよびYang、2006年)。
これらの障害は、本明細書に記載された小分子HGF模倣薬の広範なライブラリーの中の1種以上を使用して克服することが可能であり、このうちの数種は経口で有効であり、深い認識促進/抗認知症/神経保護活性を示し、低価格で合成される。
癌におけるc‐Met活性化:癌は遺伝子変異の蓄積に起因する疾患の異種群である。これらの変異は癌原遺伝子の機能を改変し、DNA修復の異常調節、増殖およびアポトーシスシグナル伝達を引き起こす(Tannock、2005年)。細胞群内のシグナルの異常調節は非制御増殖をまねき、浸潤は隣接組織に直接侵入して破壊するか、あるいは転移してリンパ系もしくは血流を経て体の他の部分に広がる。
癌におけるMetの活性化はリガンドの自己分泌またはパラ分泌の活性化を経て起こることが最も多い。c‐MetおよびHGFの両方を発現する骨肉腫および神経膠芽細胞腫多形性は機能不全の自己分泌制御の例である。パラ分泌制御が卓越している他の例では、ヒト原発腫瘍でc‐Metが過剰発現することが報告されており、一方HGFは腫瘍自体ではなく間質細胞により提供される(Houldsworthら、1990年;Kuniyasuら、1992年;Haraら、1998年;Tongら、2004年、Millerら、2006年;Beanら、2007年)。
黄斑変性症/糖尿病性網膜症:加齢に伴う黄斑変性症(ARMD)は60歳を超える米国人の不可逆的失明の最も多い原因である。退職後に、ある程度の加齢に伴う視覚損傷を患う米国人が1千万人になることが予想される。正常かつ健常な眼では、網膜色素上皮(RPE)細胞は光受容体に隣接した偏光単層を形成し、網膜恒常性および視覚機能に必須の多様な活性を含む。黄斑変性症の場合、不都合にも、炎症があるためにRPE細胞間の結合および伝達が喪失している。炎症が起こると、RPE細胞はHGF/SFを含む多くの増殖因子を分泌し、これはRPEの分裂および遊走、ならびに既存の血管からの新たな血管の形成(血管新生)を刺激するものである。HGFは他の増殖因子(例えばVEGF)の産生も刺激し、近隣間質に侵入する新血管の形成をさらに促進する(Junら、2007年)。したがって、HGFブロッカーは、予防的に使用するか、または疾患の進行およびそれに続く失明を遅らせる治療として使用することが可能である。
式中、
R1は、例えばヘキサノイル、ヘプタノイル、ペンタノイル、ブタノイル、プロパノイル、アセタノイル(acetanoyl)またはベンゾイルなどのN‐アシル基、
置換または非置換フェニル、
DまたはL型ノルロイシン、
例えばリジン、アルギニン、ノルバリン、オルニチンまたはS‐ベンジルシステインアミノ酸残基などのアミノ酸(DまたはL型)であり;
R2は例えばチロシン、システイン、フェニアラニン(phenyalanine)、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、トリプトファン、リジン、ホモシステイン、ホモセリン、ホモフェニルアラニンなどのアミノ酸(DまたはL型)であり;
R3はDまたはLイソロイシン、ロイシンまたはバリンアミノ酸残基であり;
nは3〜6の範囲にあり;
また式中、共有結合1、2および3はペプチド結合(例えば、−CO−NH−、または還元ペプチド結合(CH2−NH2)のいずれかである。
Fmoc保護アミノ酸を使用して、AAPPTEC Endeavor90ペプチド合成装置により固相法で全化合物を合成した。 すべてのペプチドアミドをRink樹脂上で合成した。樹脂はジメチルホルムアミド(DMF)中で事前に発泡させ、20%ピペリジン/DMFで30分間脱保護した。その後、ピペリジン/DMFをろ過により除去した。脱保護後、N‐αFmoc保護アミノ酸を乾燥粉末として反応器に添加した(3当量)。次いで、DMFを容器の2/3まで入れ、乾燥ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA;3.5〜4当量)を添加した。次に、N‐[(1H‐ベンゾトリアゾール‐1‐イル)(ジメチルアミノ)メチレン]‐N‐メチル‐メタンアミニウムヘキサフルオロリン酸N‐オキシド(HBTU;2.9当量)を添加し、懸濁液を30分間混合した。その後、溶液をろ過により除去した。次いで、樹脂をDMFで2回、メタノールで2回、ジクロロメタンで2回洗浄し、最後にDMFでさらに2回洗浄した。各洗浄後、溶液をろ過により除去した。遊離アミンについてKaiserテストを行いカップリング効率をモニターした。試験が陽性であれば、アミノ酸を樹脂または増殖ペプチド鎖に再カップリングさせた。試験が良好な結合を示したなら、樹脂をDMFでもう1度洗浄し、上記のように20%ピペリジン/DMFで30分間脱保護し、再度DMFで洗浄した。その後、上記のようにカップリングを進めた。
最終の脱保護後、20%の適当なアシル無水物を含むDMFおよびDIPEA(1.5当量)と共に、ペプチド樹脂を30分間室温でインキュベートする。次に樹脂をDMFで2回、メタノールで2回、ジクロロメタンで2回洗浄し、最後にDMFでさらに2回洗浄した。溶液をろ過により除去し、Kaiserテストを行いキャッピングの完全性を検証した。遊離アミンが検出されたら、キャッピング手順を繰り返した。
脱保護後、ヘキサナール(3当量)DMFを樹脂に添加し、5分間混合した。次に、3当量のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、さらに2時間、懸濁液を混合した。標準的洗浄手順(上記参照)を行った後、Kaiserテストを再度行い、反応の完全性を検証した。カップリングが不完全と見なされれば、手順を繰り返した。
最後のアミノ酸を脱保護し、洗浄した後、樹脂を焼結ガラス漏斗(有孔度4)に移し、DMFを真空除去した。その後、スカベンジャーとして2.5%トリイソプロピル‐シランを含む20%トリフルオロ酢酸(TFA)に半乾燥樹脂を懸濁し、室温で15分、インキュベートし、ろ過した。樹脂をさらにDMFで3回洗浄し、ろ過した。10容量の氷冷ジエチルエーテルを混合ろ過物に添加し、混合物を4℃で一晩、硬化させた。沈殿したペプチドをろ過で回収し、氷冷エーテルで3回洗浄した。強い疎水性のペプチド用に、混合エーテル洗浄液をDMFで再抽出し、ペプチドを沈殿させ、ろ過し、さらにペプチドを回収した。
初めに、C18カラムを使用して勾配溶離により、粗ペプチドを逆相HPLCで精製した。典型的な勾配は、10%〜40%の成分Bにおいて37℃で30分間、流速1ml/分であり、ここでは成分AはpH3.0の80mMのリン酸トリエチアミンであり、成分Bはアセトニトリル(ACN)であった。全ての例で、215nmでの吸光の単一ピークのみを検出し、回収した。回収した化合物を凍結乾燥し、20%メタノール中に再溶解し、第2のC18カラムに投入した。使用のHPLC/MS系はShimadzu(日本国、京都)社製であり、CBM‐20A伝達手段、バスモジュール、LC‐20ADポンプ、SIL‐20AC自動サンプラー、SPD‐M20Aダイオードアレイ検出器およびLCMS‐2010EV質量分析計から構成されている。データ収集および統合はShimadzu LCMSソリューションソフトウェアを使用して行った。使用した分析カラムはGrace Davison Discovery Science社(米国、イリノイ州、ディアフィールド)製のEconosphere C18(100mm×2.1mm)であった。移動相はHPLCグレードのメタノール、およびトリフルオロ酢酸0.1%水溶液から構成されていた。非イソクラティック法(20%〜50%メタノール、30分間)により37℃、0.3mL/分の流速で分離を行った。MS分析では、陽性イオンモード(Scan社)を利用し、予測したm/zでピークを分析した。一般的なピーク純度分析によりピーク純度指数が>0.95であることが明らかになった。ダイオードアレイ検出器での波長比演算によりピーク純度がさらに確認された。
ファミリー1(模倣薬)およびファミリー2〜5(アンタゴニスト)の一般構造
矢印1〜3はpb=ペプチド結合を意味する;Ψ=還元ペプチド結合(CH2−NH2)n=5
HGF模倣薬活性の評価:
ウエスタンブロッティング.HEK293細胞を6ウェルの組織培養プレートに播種し、FBSを10%含有するDMEM中で95%集密になるまで増殖させた。治療前の24時間、細胞を血清欠乏させ、ホスホ‐Metの基礎レベルを低下させた。血清を欠乏させた後、賦形剤およびHGF(2.5ng/ml)から成り、試験化合物を含有する/含有しない反応混液を調製し、室温で30分間、事前にインキュベートした。その後、反応混液を細胞に添加し、10分間、Met受容体および下流タンパク質を刺激した。リン酸塩阻害剤反応混液1および2(Sigma‐Aldrich社;ミズーリ州、セントルイス)で強化されたRIPA溶解緩衝液(Upstate社)を使用して細胞を回収した。15,000gで15分間遠心分離し、溶解物を清澄にして、BCA総タンパク質アッセイによりタンパク質濃度を測定し、次いで、適度な量の溶解物を2×還元レムリ緩衝液で希釈し、95℃で10分間加熱した。同一量のタンパク質を含む試料を、SDS‐PAGE(Criterion、BioRad Laboratories社)により溶解し、ニトロセルロースに転写し、ミルクを5%含有するトリス緩衝生理食塩水(TBS)中、室温で1時間ブロックした。ホスホ‐Met抗体をブロッキング緩衝液に、最終濃度が1:1000になるように添加し、弱めに攪拌しながら4℃で一晩インキュベートした。その後、水およびTBS(PBS、0.05%TweeN‐20)で膜を数回洗浄し、1:5000希釈したセイヨウワサビ過酸化酵素結合型ヤギ抗ウサギ抗血清を添加し、膜をさらに、室温で1時間インキュベートした。タンパク質をSupersignal West Pico Chemiluminescent Substrateシステム(Pierce社、ミズーリ州、フェントン)を使用して可視化し、分子量をタンパク質ラダー(BenchMark、Invitrogen社;およびKaleidoscope、BioRad社)との比較によって測定した。画像をデジタル化し、UVPホスホイメージャーを使用して分析した。
散乱アッセイ.MDCK細胞を6ウェルプレートのカバースリップ上で100%集密になるまで培養し、PBSで2回洗浄した。その後、集密になっているカバースリップを無菌状態で、900μlの無血清DMEMを含む新たな6ウェルプレートに移した。ノルレウアル、Hingeペプチド、および/またはHGF(2.5ng/ml)を適当なウェルに添加した。対照ウェルにPBS賦形剤を添加した。プレートを5%CO2下、37℃で48時間インキュベートした。培地を除去し、細胞をメタノールで固定した。細胞をDiff‐Quik Wright‐Giemsa(Dade‐Behring社、デラウェア州、ニューアーク)で染色し、デジタル画像を得た。カバースリップをピンセットで取り除き、さらなるデジタル画像を得た。画像の画素をImage Jを用いて定量し、Prism5およびInStat v.3.05を用いて統計を行った。
表3
一般構造:
矢印1〜3はpb=ペプチド結合を意味する;Ψ=還元ペプチド結合(CH2−NH2)
13〜16 R2=Sであるファミリー1〜4と同様のパターン
17〜20 R2=Tであるファミリー1〜4と同様のパターン
21〜24 R2=Dであるファミリー1〜4と同様のパターン
25〜28 R2=Eであるファミリー1〜4と同様のパターン
29〜32 R2=Y、R3=Vであるファミリー1〜4と同様のパターン
33〜36 R2=F、R3=Vであるファミリー1〜4と同様のパターン
37〜40 R2=C、R3=Vであるファミリー1〜4と同様のパターン
41〜44 R2=S、R3=Vであるファミリー1〜4と同様のパターン
45〜48 R2=T、R3=Vであるファミリー1〜4と同様のパターン
49〜52 R2=D、R3=Vであるファミリー1〜4と同様のパターン
53〜56 R2=E、R3=Vであるファミリー1〜4と同様のパターン
57〜85 R3=Lであるファミリー29〜56と同様のパターン
86〜170 n=3であるファミリー1〜85と同様のパターン
171〜256 n=4であるファミリー1〜85と同様のパターン
257〜341 n=6であるファミリー1〜85と同様のパターン
346〜349 R3=Vであるファミリー342〜345と同様のパターン
350〜353 R3=Lであるファミリー342〜345と同様のパターン
354〜365 R1=Dノルバリンであるファミリー342〜353と同様のパターン
366〜377 R3=D‐リジンであるファミリー342〜345と同様のパターン
378〜389 R3=D‐アルギニンであるファミリー342〜345と同様のパターン
390〜401 R3=D S‐メチルシステインであるファミリー342〜345と同様のパターン
402〜457 n=3であるファミリー342〜401と同様のパターン
458〜513 n=4であるファミリー342〜401と同様のパターン
514〜569 n=6であるファミリー342〜401と同様のパターン
I‐II‐III‐IV
式中、
I=ヘプタン酸、ヘキサン酸、ペンタン酸、酪酸、プロピオン酸、酢酸、安息香酸もしくは置換安息香酸、およびこれらのイソ型;あるいはDまたはL型ノルロイシン、リジン、アルギニン、ノルバリン、オルニチンまたはS‐ベンジルシステインなどの酸
II=DまたはL型システイン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、チロシン、グリシン、ホモシステイン、ホモセリンまたはホモフェニルアラニンアミノ酸残基;
III=DまたはL型イソロイシン、ロイシンまたはバリンアミノ酸残基;および
IV=アミノヘキサン酸、アミノペンタン酸、またはアミノ酪酸;式中、構成要素I、II、IIIおよびIVはペプチドまたは還元ペプチド結合により結合される。
AngIVのNle1‐AngIV類似体のテトラペプチド(Nle1‐YIH)およびトリペプチド(Nle1‐YI)フラグメントは、空間学習演習中のスコポラミン誘導型認知機能不全を解決し得る最小の活性フラグメントであることが事前に分かった。新たなテンプレートとしてトリペプチドを使用し、代謝安定性、血液脳関門透過性および経口有効性を向上させて付加的な活性類似体を合成した。本実施例では、新規かつ経口投与で有効なアンジオテンシンIV類似体であるジヘキサの特徴を示す。
材料と方法
動物と手術.体重390〜450gの雄SpraGue‐Dawleyラット(TaConiC社)を、自由に摂水および摂食(Harland Tekland社、F6齧歯類食餌、ウィスコンシン州、マディソン)できるようにしながら飼育した。ただし手術前夜には給餌しなかった。各動物を塩酸ケタミンおよびキシラジン(それぞれ100および2mg/kgを筋肉内注射;Phoenix Scientific社;ミズーリ州、セントジョゼフ、およびMoby社;カンザス州、ショーニー)で麻酔した。脳室内(icv)ガイドカニューレ(PE‐60、Clay Adams社;ニューヨーク州、Parsippany)を、後部1.0mmおよび側部1.5mmから前頂部という平面的頭蓋座標で右脳半球に定位的に設置した(モデル900、David Koph Instruments社;カリフォルニア州、タハンガ)(Wrightら、1985年を参照)。ガイドカニューレは全長2.5cmであり、傾斜した先端から2.5mmの場所に設置したヒートバルジで調節し、よって貫通深さを調節するための止め具として働いた。いったん適切な位置に、2つのステンレス鋼スクリューおよび歯科用セメントで頭蓋にカニューレを固定した。術後、22±1℃に維持した米国認定Laboratory Animal Care承認の飼育器にて動物を個別に収容し、12時間交代の明暗周期を06:00時に開始した。術後回復期の5〜6日間、全動物に1日につき5分間、穏和に手に載せた。行動試験の完了後、ガイドカニューレを介して、5μlのファストグリ‐ン染色を注射してカニューレ設置の組織学的検証を行った。本試験で使用したラットすべてにおいて明らかにカニューレは正しく設置されていた。
行動試験.水迷路は黒く塗られた循環タンク(直径1.6m;高さ:0.6m)から構成され、26〜28℃の水で満たし、深さ26cmにした。黒色循環プラットホーム(直径:12cm;高さ:24cm)を壁から30cmの場所に設置し、水面から下2cmの場所に沈めた。迷路を、操作上、4等分に4つに区切り、NW、NE、SWおよびSEとした。各ラットに対してプラットホームの設置を無作為に4分の1に割り振り、訓練期間を通して固定したままにした。入口部を4つのコーナー(すなわちN、S、EおよびW)に設置し、前回の試験とは異なる入口部で各試験を開始するように疑似的に無作為に割り振った。4つの試験室の壁のうち3つを、異なる形(円、四角、三角)および色から成る付加的な迷路空間記号で覆った。コンピュータビデオ追跡システム(Chromotrack;San Diego Instruments社、カリフォルニア州)を使用して動物の水泳経路を記録した。コンピュータには総水泳時間および水泳距離が表示された。水泳速度をこれらの値から求めた。
形質移入.メーカーのプロトコルにしたがって、インビトロ6日目(DIV6)にLipofectAMINE(商標)2000(Invitrogen社)を使用し、mRFP‐β‐アクチンをニューロンに形質移入した。このプロトコルでは望ましい3〜5%の形質移入効率が生じ、したがって個々のニューロンの可視化が可能となった。さらに高い効率は個々のニューロンの樹状枝を不明瞭にした。樹状突起スパインはアクチン内で豊富であることから、蛍光タグ化アクチンの発現により樹状突起スパインの可視化が明瞭になった。DIV7に、賦形剤(H2O)または(本文書に記載の)ペプチドが添加された培地で細胞を処理した。DIV12に、ニューロンを室温で20分間固定し(4%のパラホルムアルデヒド、3%のスクロース、60mMのPIPES、25mMのHEPES、5mMのEGTA、1mMのMgCl2、pH7.4)、設置した。4℃で少なくとも20時間スライドを乾燥し、NA1.4で解像度0.280μmの60X油浸レンズを持つOlympusIX81倒立共焦点顕微鏡を作動するSlidebook4.2 Digital Microscopy Softwareにより蛍光画像を得て、体細胞から少なくとも150μm離れた1次および2次樹状突起上の樹状突起スパイン密度を測定した。1つのデータ点当たり少なくとも10ニューロンから、50μm長の5つの樹状突起断片を、各データ点について分析し、報告した。個々の培養調製物を使用して、各実験を少なくとも3回反復した。National Institutes of Health’s Image J 1.4loプログラム(NIH社、メリーランド州、ベセスダ)および神経突起追跡プログラムNeuron J(Meijering社、Jocobら、2004年)を使用して樹状突起長を測定した。スパインを手動で計数した。
器官型海馬スライス培養物調製および形質移入.上述のようにP4 Sprague Dawleyラット由来海馬を培養した(Wayman、Impeyら、2006年)。つまり、400μmのスライスを(Milipore社、マサチュセッツ州、ビルリカ)上で3日間培養し、その後、樹状枝を可視化するため、メーカーのプロトコルにしたがって、Helios Gen Gun(BioRad社、カリフォルニア州、ヘラクレス)を使用してtomato蛍光タンパク質(TFP)で微粒子銃により形質移入した。24時間の修復期間後に、賦形剤(H2O)、1pMのNle‐AngIVまたはジヘキサで2日間、スライスを刺激した。スライスを固定し、設置した。海馬CA1ニューロン過程を画像化し、上述のように測定した。
免疫細胞化学.形質移入したニューロンを処理し、固定し、染色した。つまり、0.1%のTritonX‐100洗浄剤(Bio‐RaD社;カリフォルニア州、ヘラクレス)で10分間透過処理した。8%のウシ血清アルブミン(Intergen社;マサチュセッツ州、バーリントン)を含むPBSを使用し、室温で1時間、非特異的結合を抑制した;一次抗体のインキュベーションは1%BSAを含むPBS中、1:2500希釈(下記参照)で、4℃で一晩行った。二次抗体、1:3000のAlexafluor488ヤギ抗マウス(Invitrogen社:カリフォルニア州、カールズバッド)を使用し、室温で2時間置いた。ProLong Gold抗フェード試薬(Invitrogen社;カリフォルニア州、カールズバッド)と共にカバースリップを設置し、洗浄はすべてPBSで行った。画像および分析を上述と同様に行った。シナプス前興奮性伝達には、VGLUT1(Synaptic Systems社、ドイツ、ゲッティンゲン)マーカーを使用し(Balschun、Moecharsら)、通常のシナプス前伝達には、シナプシン1(Synaptic Systems社、ドイツ、ゲッティンゲン)(FerreiraおよびRapoport、2002年)を使用した。PSD‐95(Milipore社、マサチュセッツ州、ビルリカ)によりシナプス後機能を確立した(El‐Husseini、Schnellら、2000年)。各事例において、投与群、対照、Nle1‐AngIVおよびジヘキサについてスパインの総数を計数し、活性的表現型を確実にした。VGLUT1またはシナプシンに隣接する富アクチンスパインの総数を計数し、百分率に変換した。何故ならシナプス前マーカーに対する投与誘発性スパインの割合相関は興奮シグナルの伝達能の強い指標になるからである。本出願では、相関の数値は、緑色PSD‐95免疫陽性染色点に対する赤色蛍光タグ化アクチンスパインから構成されており、これらが融合するとオレンジ色のスパインになる。
全細胞記録.5日間の前処理としてmRFP‐β‐アクチンを形質移入した培養海馬ニューロン(賦形剤対照)、および1pMのNle1‐AngIVまたはジヘキサで形質移入した海馬ニューロンでパッチクランプ実験を行った。形状が錐体様(〜20μmの細胞体、および非対称樹状突起分布)のニューロンから記録をとった。形質移入後の時間は6日間であった。培地は(mMで)140のNaCl、2.5のKCl、1のMgCl2,3のCaCl2、25のグルコース、および5のHEPESを含む細胞外溶液;pHはKOHで7.3に調整した;オスモル濃度は310mOSmに調整した:と交換した。倒立顕微鏡(IX‐71;Olympus optical社、東京)を備えた記録チャンバ中で記録前に30分間、培養液を平衡化した。形質移入細胞を蛍光で可視化した(Olympus optical社)。フィラメントのない標準的壁ホウケイ酸ガラス(OD=1.5mm;Sutter Instrument社)から記録ピペットを引き抜いた(P‐97 Flaming/Brownマイクロピペットプラー;Sutter Instrument社、カリフォルニア州、ナヴァト)。ピペットから槽へのパッチ電極のDC抵抗は4.0〜5.2MΩの範囲であり、以下の組成の内部溶液を充填した(単位はmM):25のCsCl、100のCsCH3O3S、10のクレアチンリン酸、0.4のEGTA、10のHEPES、2のMgCl2、0.4のMg‐ATP、および0.04のNa‐GTP;pHはCsOHで7.2に調整した;オスモル濃度は296〜300mOsmに調整した。ピクロトキシン(100μM;Sigma社)を含むGABA受容体塩化物チャンネルを遮断し、ストリキニーネ(1μM;Sigma社)でグリシン受容体を遮断し、テトロドトキシン(TTX、500nM;Tocris社)で活動電位生成を遮断することで薬理学的に微小EPSC(mEPSC)を単離した。Multiclamp700B増幅器(Molecular Devices社、カリフォルニア州、サニーベール)を使用して記録を得た。アナログ信号は2kHzで低域のベッセルフィルターにかけ、Digidatal440Aインターフェース(Molecular Devices社)を介して10kHzでデジタル化し、Clampex10.2ソフトウェア(Molecular Devices社)を使用してコンピュータに保存した。インキュベーターから培養物を取り出してから0.5〜2時間、膜電位を室温(25℃)で−70mVで保持した。液界電位は修正しなかった。Clampfit10.2ソフトウェア(Molecular Devices社)およびMini‐Analysis6.0ソフトウェア(Synaptosoft社;ニュージャージー州、フォートリー)を使用してデ−タ分析を行った。記録を良好にするために、基準には記録ピペットの外面と付着細胞との間のシールの電気抵抗>2GΩ、ニューロン入力抵抗>240MΩが含まれた。mEPSCの記録時間は5分であった。
結果
ジヘキサおよびNle1‐AngIV媒介シナプス形成
各投与群のスパインの総数は50μm樹状突起長当たりのスパイン数で示している。シナプス前マーカーのシナプシン、グルタミン酸作動性シナプス前マーカーVGLUT1またはシナプス後化合物PSD‐95の割合相関性は直接下記に報告している。各投与群ではN=25。
考察
本実施例は、新規なアンジオテンシンIVリガンドであるジヘキサおよびその親分子のNle1‐AngIVがHGF/c‐Met受容体系を経て作用することを説明するものである。
材料と方法
動物と手術
行動試験
統計学的分析
散乱アッセイ.MDCK細胞を6ウェルプレートのカバースリップ上で100%集密になるまで培養し、PBSで2回洗浄した。その後、集密になっているカバースリップを無菌状態で、900μlの無血清DMEMを含む新たな6ウェルプレートに移した。ノルレウアル、Hingeペプチド、および/またはHGF(20)を適当なウェルに添加した。対照ウェルにPBS賦形剤を添加した。プレ‐トを5%CO2下、37℃で48時間インキュベートした。培地を除去し、細胞をメタノールで固定した。細胞をDiff‐Quik Wright‐Giemsa(Dade‐Behring社、デラウェア州、ニューアーク)で染色し、デジタル画像を得た。カバースリップをピンセットで取り除き、さらなるデジタル画像を得た。画像の画素をImage Jを用いて定量し、Prism5およびInStat v.3.05を用いて統計を行った。
解離海馬神経細胞培養物調製
解離海馬ニューロン細胞培養物の形質移入
器官型海馬スライス培養物調製および形質移入.
急性海馬スライス
shRNA
ゲル電気泳動およびウエスタンブロッティング
免疫細胞化学
全細胞記録.
結果
肝細胞増殖因子は樹状構造を増強し、シナプス形成を支持する
考察
アンジオテンシンIV類似体の6‐AHファミリー[D‐Nle‐X‐Ile‐NH‐(CH2)5‐CONH2;式中X=様々なアミノ酸]は肝細胞増殖因子(HGF)に直接結合し、機能的二量体を形成するHGFの能力を阻害する。代謝的に安定した6‐AHファミリーメンバー、D‐Nle‐Tyr‐Ile‐NH‐(CH2)5‐CONH2は、血中t1/2が<5分である親化合物ノルレウアル(Nle‐Tyr‐Leu‐Ψ‐(CH2‐NH2)3‐4‐His‐Pro‐Phe、配列番号:1)と比較して、80分の血中t1/2であった。6‐AHファミリーメンバーはHGF(ヒンジ領域)の二量体化ドメインの模倣体として作用し、その受容体Metを活性化するHGFの能力を減弱させる3H‐ヒンジ領域ペプチドとのHGF分子の相互作用を阻害することが分かった。この干渉は、低いピコモル範囲に減少した濃度で、多種の細胞においてHGF依存シグナル伝達、増殖および散乱の阻害に変わった。本発明者らはまた、HGF二量体化をブロックする6‐AHファミリーメンバーの能力と細胞活性の阻害との有意な相関性も特記しておく。さらに、2位にシトシンを有する6‐AHファミリーメンバーはHGF依存細胞活性の特に有効なアンタゴニストであった。この化合物は、過剰活性HGF/Met系により特徴づけられたB16‐F10マウスメラノーマ細胞により肺定着を抑制した。これらをまとめると、AngIV類似体の6‐AHファミリーはHGF/Met系の活性を変更することでその生物活性を発揮し、HGF/Met系の過剰活性に依存しているか、あるいはその活性を有している障害の治療薬としての可能性を提供することがデータから示されている。
緒言
材料と方法
IV薬物動態学.
外科的手技.本発明者らのAAALAC公認動物使節において雄Sprague‐Dawleyラット(250+g)を自由に摂食(Harlan Teklad社、ラット食餌)および摂水できるようにした。12時間の明暗周期の温度管理された室内にラットを収容した。ケタミン(Fort Dodge Animal Health社、米国、アイオワ州、フォートドッジ)およびイソフルラン(Vet One(商標)、MWI社、米国、アイダホ州、メリディアン)麻酔下で、ラットの右頸静脈に滅菌ポリウレタンHydrocoat(商標)カテーテル(Access Technologies社、米国、イリノイ州、スコーキー)をカテーテル挿入した。背部皮膚からカテーテルを露出させた。採血の前後にヘパリン処理した生理食塩水でカテーテルを洗い流し、8時間以上使用しない場合はヘパリン‐グリセロールのロック液(6mLのグリセロール、3mLの生理食塩水、0.5mLのゲンタマイシン(100mg/mL)、0.5mLのヘパリン(10,000u/mL))で満たしておいた。何らかの実験に使用する前には、動物を数日間外科処置から解放し、薬物動態実験の前の一晩、絶食させた。
各血液試料を採取した後、カテーテルを生理食塩溶液で洗い流し、採取した血液と同量の生理食塩水を注射した(総血液量を維持した)。
結果
インビトロでの血液安定性データから予想されるように、D‐Nle‐Tyr‐Ile‐NH‐(CH2)5‐CONH2では、ラットへのIV注射後、インビボ排出半減期が1012分に延長していることが示された。D‐Nle‐Tyr‐Ile‐NH‐(CH2)5‐CONH2の単回IVボーラス投与後の他の関連する薬物動態パラメータを表5にまとめてある。WinNonlin(登録商標)ソフトウェアを使用して血清データをモデル化し、非区画分析を実行した。その分布容積(Vd)が大きいことで裏付けられるように、D‐Nle‐Tyr‐Ile‐NH‐(CH2)5‐CONH2は、組織内の中心血液隔壁および/または境界の外部に広く分布していることが明らかになった。定量的構造‐活性相関(QSAR)モデリング(下記に記載)にしたがえば、また血清からの総回収率が35%超であったことから、D‐Nle‐Tyr‐Ile‐NH‐(CH2)5‐CONH2が血漿タンパク質に高度に結合することは期待できない。D‐Nle‐Tyr‐Ile‐NH‐(CH2)5‐CONH2が比較的疎水性である可能性が高いことを示唆するこれらの結果は、D‐Nle‐Tyr‐Ile‐NH‐(CH2)5‐CONH2ではオクタノール:水分配係数が28.18と算出されたADMET Predictor(登録商標)によるQSARモデリングの推定結果と一致している(表6)。
HGFへの3H‐Hingeの結合に対して競合する能力について、6‐AHファミリー、D‐Nle‐X‐Ile‐NH‐(CH2)5‐CONH2のいくつかのメンバーを分析した。下記で根拠となっているように、6‐AHファミリーのメンバーは、HGFの生物学的作用をブロックする多様な能力を示している。このように、多様な生物学的活性を有する類似体の選択に関わるHGF結合特性を評価し、HGFに対する阻害活性と親和性との間に関連性があるかどうかを判定した。類似体はHGFに直接結合し、不活性形態でHGFの隔離に影響を与えるという仮説が浮上した。この考えの評価の初めに、本発明者らはプローブとして3H‐Hingeペプチドを使用し、ペプチドの直接的HGF結合を評価した。その相互作用を調べるための3H‐Hingeの使用は高親和性をもってHGFに特異的に結合する3H‐Hingeの能力に基づいていた(Kawasら、2011年)。競合試験はD‐Nle‐X‐Ile‐NH‐(CH2)5‐CONH2ファミリーのいくつかの誘導体を用いて開始した。本試験から、様々な類似体が多様なHGF結合能を有し、HGFに拮抗作用を示す類似体はHinge模倣体として作用することが明らかになった。D‐Nle‐X‐Ile‐NH‐(CH2)5‐CONH2誘導体はHGF結合でHingeと競合することが分かり、1.37×10−7〜1.33×10−10MのKisでHGFへの親和性の範囲が示された(図23)。予想通り、HGFへ結合する化合物の能力と、二量体化をブロックしてHGF依存活性を阻害するその能力との間に関連性があることが分かる(図25、26および27参照)。
6‐AHファミリーメンバーは広範なHGF結合および二量体化阻害プロファイルを示すことを確立した後、本発明者らは次に、これらの特性が化合物のMetシグナル伝達阻害能に対応しているか否かを判定した。Metのようなチロシンキナーゼ関連増殖因子受容体の特徴は必須のチロシン残基自己リン酸化過程であり、これは様々なSH2ドメインシグナル伝達タンパク質の最終的な動員に不可欠なものである。よって、本発明者らはいくつかの6‐AH類似体のMetチロシンリン酸化誘導能を評価した。予想通り、図25のデータから、高親和性でHGFに結合し(図23)、その二量体化を効果的にブロックする(図24)D‐Nle‐Cys‐Ile‐NH‐(CH2)5‐CONH2およびD‐Nle‐Tyr‐Ile‐NH‐(CH2)5‐CONH2はMet自己リン酸化をブロックし得ることが明らかになっている。D‐Nle‐Trp‐Ile‐NH‐(CH2)5‐CONH2類似体は中間体阻害活性を有し、D‐Nle‐Met‐Ile‐NH‐(CH2)5‐CONH2類似体はMet活性化に効果的な能力を示さなかった。まとめると、これらのデータから、HGF依存Met活性化を阻害する6‐AH類似体の能力はそのHGF結合親和性および二量体化をブロックする能力に対応していることが示されている。
Met活性化は増殖および運動性の増加、生存の促進および分化など複数の細胞応答を開始する(ZhangおよびVande Woude、2003年)。HGF依存細胞活性を変える6‐AHファミリーメンバーの能力に関する初期試験として、本発明者らは、HGF/Met系を研究するための標準的細胞モデルMadin‐Darbyイヌ腎臓(MDCK)細胞の増殖活性を改変するいくつかのファミリーメンバーの能力を評価した(StellaおよびComoglio、1999年)。図26に見られるように、HGF依存細胞増殖への広範囲な阻害活性がある。結合および二量体化実験の結果と同様に、Cys2およびTyr2類似体は顕著な阻害活性を示した。初期の研究では評価されてこなかったAsp2類似体も明白な阻害活性を示した。最も強力な類似体で観察されたものよりは低いが、Trp2、Phe2およびSer2類似体はすべて阻害活性を示した。数種の化合物でHGF‐依存MDCK増殖の低下が基準レベル以下になることは驚くに当たらない。何故なら実験は一定量のHGFを含む可能性のある2%血清中で行われたからである。HGFの二量体化ドメインの代表としてHingeペプチド(KDYIRN)を陽性対照とした。近年の研究から、Hingeは高親和性でHGFに結合し、その二量体化をブロックし、MDCK増殖などのHGF依存細胞活性の強力な阻害剤として作用することが明らかになっている(Kawasら、2011年)。
細胞散乱はHGF/Metシグナル伝達;細胞接着低下、運動性増加、および増殖増加が特徴的な過程;の顕著な効果である。HGFをMDCK細胞に投与すると、2段階で起こる散乱応答が開始される。第1に、細胞が細胞間接着を喪失し、偏光する。第2に、細胞らは完全に分離し、互いに離れて遊走する。6‐AHファミリーメンバーがHGF/Met系を阻害できるのであれば、それらはHGF依存MDCK細胞散乱を改変できる可能性が高いことが予想される。
可能性のある治療法として6‐AHファミリーメンバーの有望な用途を評価するため、HGF依存Met活性化に対する強力な阻害プロファイルを示しB16‐F10マウスメラノーマ細胞の移動および肺コロニー形成能を抑制する類似体である[D‐Nle‐Cys‐Ile‐NH‐(CH2)5‐CONH2]の能力を本発明者らは試験した。B16メラノーマ細胞はMetを過剰発現するものであり(Ferraroら、2006年)、Metシグナル伝達はその遊走、侵入および転移に重要であることからB16メラノーマ細胞をこれらの研究のために選択した。Met依存細胞の治療成績に関する6‐AHファミリー封鎖の生理学的有意性についての最終試験として、本発明者らはマウスの尾静脈注射後のB16‐F10細胞による肺コロニー形成を阻害するD‐Nle‐Cys‐Ile‐NH‐(CH2)5‐CONH2の能力を評価した。図29aは[D‐Nle‐Cys‐Ile‐NH‐(CH2)5‐CONH2]の2種の用量(10μg/kg/日および100μg/kg/日)で毎日腹腔内注射しながら観察した阻害応答を説明している。図29bはメラノーマ定着のレベルを反映するメラニン量を測定することで肺定着の定量的評価を提供している。これらをまとめると、データから、D‐Nle‐Cys‐Ile‐NH‐(CH2)5‐CONH2のメラノーマ細胞への投与は肺定着を根本的に防止し、抗癌剤として6‐AH類似体の用途を際立たせていることが分かる。
考察:
表6.D‐Nle‐Tyr‐Ile‐NH‐(CH2)5‐CONH2の予測される生理化学特性。D‐Nle‐Tyr‐Ile‐NH‐(CH2)5‐CONH2の生理化学特性をADMET Predictor(登録商標)ソフトウェアによるモデリングにしたがって評価した。LogPはオクタノール:水分配係数である。Peffは予測される有効ヒト空腸透過性である。Pavgはヒト全腸管に沿ったおよその平均腸透過性である。PrUnbndは血漿タンパク質に結合していない割合である。
(図1)
Figure 1A 図1A
(1) Latency (sec) 時間(秒)
(2) CSF CSF
(3) Scopolamine スコポラミン
(4) Dihexa-low ジヘキサ‐低量
(5) Dihexa-high ジヘキサ‐高量
(6) Acquisition (days) 習得(日)
Figure 1B 図1B
(1) Latency (sec) 時間(秒)
(2) CSF CSF
(3) Scopolamine スコポラミン
(4) Dihexa-low ジヘキサ‐低量
(5) Dihexa-high ジヘキサ‐高量
(6) Acquisition (days) 習得(日)
Figure 1C 図1C
(1) Latency (sec) 時間(秒)
(2) Non-treated 投与なし
(3) Dihexa ジヘキサ
(4) Acquisition (days) 習得(日)
(図2)
Figure 2A 図2A
(1) # of Spines/50 mm スパイン数/50μm
(2) Control 対照
(3) Dihixa ジヘキサ
Figure 2B 図2B
(1) # of Spines/50 mm スパイン数/50μm
(2) Control 対照
(3) 10-10M Nle1-AngIV 10−10M のNle1‐AngIV
(4) 10-12M Nle1-AngIV 10−12M のNle1‐AngIV
(5) 10-13M Nle1-AngIV 10−13M のNle1‐AngIV
(図3)
Figure 3D 図3D
(1) # of Spines/50 mm スパイン数/50μm
(2) Control 対照
(3) Nle1-AngIV Nle1‐AngIV
(4) Dihexa ジヘキサ
(5) 5 day stimulation 5日間の刺激
Figure 3E 図3E
(1) # of Spines/50 mm スパイン数/50μm
(2) Control 対照
(3) Nle1-AngIV Nle1‐AngIV
(4) Dihexa ジヘキサ
(5) 30 day stimulation 30日間の刺激
(図4)
Figure 4 図4
(1) Control 対照
(2) Nle1-AngIV Nle1‐AngIV
(3) Dihexa ジヘキサ
(図5)
Figure 5A 図5A
(1) MRFP-b-Actin MRFP‐β‐アクチン
(2) VGLUT1 VGLUT1
(3) Merged 融合後
(4) Control 対照
(5) Nle1-AngIV Nle1‐AngIV
(6) Dihexa ジヘキサ
(7) Synapsin シナプシン
(8) PSD-95 PSD‐95
Figure 5B 図5B
(1) Percent Correlation 割合相関性
(2) Percent パーセント
(3) Control 対照
(4) Nle1-AngIV Nle1‐AngIV
(5) Dihexa ジヘキサ
(6) Synapsin シナプシン
Figure 5C 図5C
(1) Number of Spines スパイン数
(2) # of Spines/50 mm スパイン数/50μm
(3) Control 対照
(4) Nle1-AngIV Nle1‐AngIV
(5) Dihexa ジヘキサ
(6) Synapsin シナプシン
Figure 5D 図5D
(1) Percent Correlation 割合相関性
(2) Percent パーセント
(3) Control 対照
(4) Nle1-AngIV Nle1‐AngIV
(5) Dihexa ジヘキサ
(6) VGLUT1 VGLUT1
Figure 5E 図5E
(1) Number of Spines スパイン数
(2) # of Spines/50 mm スパイン数/50μm
(3) Control 対照
(4) Nle1-AngIV Nle1‐AngIV
(5) Dihexa ジヘキサ
(6) VGLUT1 VGLUT1
Figure 5F 図5F
(1) Percent Correlation 割合相関性
(2) Percent パーセント
(3) Control 対照
(4) Nle1-AngIV Nle1‐AngIV
(5) Dihexa ジヘキサ
(6) PSD-95 PSD‐95
Figure 5G 図5G
(1) Number of Spines スパイン数
(2) # of Spines/50 mm スパイン数/50μm
(3) Control 対照
(4) Nle1-AngIV Nle1‐AngIV
(5) Dihexa ジヘキサ
(6) PSD-95 PSD‐95
(図6)
Figure 6A 図6A
(1) Frequency of mEPSC (pA) mEPSC(pA)の周波数
(2) Control 対照
(3) Nle1-AngIV Nle1‐AngIV
(4) Dihexa ジヘキサ
Figure 6B 図6B
(1) Control 対照
(2) 250 msec 250m秒
(3) Nle1-AngIV Nle1‐AngIV
(4) 100 msec 100μ秒
(5) Dihexa ジヘキサ
(図7)
Figure 7A 図7A
(1) Control 対照
(2) Nle1-AngIV Nle1‐AngIV
(3) Dihexa ジヘキサ
Figure 7B 図7B
(1) # of Spines/50 mm スパイン数/50μm
(2) Control 対照
(3) Nle1-AngIV Nle1‐AngIV
(4) Dihexa ジヘキサ
(図8)
Figure 8 図8
(1) # of Spines/50 mm スパイン数/50μm
(2) Control 対照
(図9)
Figure 9A 図9A
(1) Control 対照
(2) Nle1-AngIV Nle1‐AngIV
(3) Dihexa ジヘキサ
Figure 9B 図9B
(1) # of Spines/50 mm スパイン数/50μm
(2) Control 対照
(3) Nle1-AngIV Nle1‐AngIV
(4) Dihexa ジヘキサ
(図10)
Figure 10A 図10A
(1) Percent Correlation 割合相関性
(2) Control 対照
(3) Synapsin シナプシン
Figure 10B 図10B
(1) Percent Correlation 割合相関性
(2) Control 対照
(3) VGLUT1 VGLUT1
Figure 10C 図10C
(1) Number of spines/50 mm スパイン数/50μm
(2) Control 対照
(3) Number 数
Figure 10D 図10D
(1) Control 対照
(2) Synapsin シナプシン
(3) VGLUT1 VGLUT1
(図11)
Figure 11 図11
(1) Frequency of mEPSC (Hz) mEPSCの周波数(Hz)
(2) Control 対照
(3) Dihexa ジヘキサ
(図12)
Figure 12A 図12A
(1) # of Spines/50 mm スパイン数/50μm
(2) Control 対照
(3) 10-13M Dihexa 10−13Mのジヘキサ
(4) 10-12M Dihexa 10−12Mのジヘキサ
(5) # Dihexa + HGF$ #ジヘキサ+HGF$
Figure 12B 図12B
(1) # of Spines/50 mm スパイン数/50μm
(2) Control 対照
(3) Nle-1-AngIV 10-13M Nle‐1‐AngIV 10−13M
(4) Nle-1-AngIV 10-12M Nle‐1‐AngIV 10−12M
(5) Nle-1-AngIV# +
HGF$ Nle‐1‐AngIV#+HGF$
(図13)
Figure 13A 図13A
(1) # of Spines/50 mm スパイン数/50μm
(2) Control 対照
(3) 10-8M Hinge 10−8MのHinge
(4) 10-10M Hinge 10−10MのHinge
(5) 10-12M Hinge 10−12MのHinge
(6) 10-12M Dihexa 10−12Mのジヘキサ
Figure 13B 図13B
(1) # of Spines/50 mm スパイン数/50μm
(2) Control 対照
(3) 10-12M Hinge 10−12MのHinge
(4) Hinge # + HGF$ Hinge#+HGF$
Figure 13C 図13C
(1) # of Spines/50 mm スパイン数/50μm
(2) Control 対照
(3) 10-12M Hinge 10−12MのHinge
(4) Hinge + Nle1-AngIV # Hinge+Nle1‐AngIV#
(5) 10-12M Nle1-AngIV 10−12MのNle1‐AngIV
Figure 13D 図13D
(1) # of Spines/50 mm スパイン数/50μm
(2) Control 対照
(3) 10-12M Hinge 10−12MのHinge
(4) 10-12M Hinge + Dihexa 10−12MのHinge+ジヘキサ
(5) 10-12M Dihexa 10−12Mのジヘキサ
(図14)
Figure 14A 図14A
(1) Frequency of mEPSC (Hz) mEPSCの周波数(Hz)
(2) Control 対照
(3) Hinge Hinge
(4) HGF + Hinge HGF+Hinge
Figure 14B 図14B
(1) Frequency of mEPSC (Hz) mEPSCの周波数(Hz)
(2) Control 対照
(3) Dihexa ジヘキサ
(4) Hinge Hinge
(5) Dihexa + Hinge ジヘキサ+Hinge
Figure 14C 図14C
(1) Hinge Hinge
(2) 1 Sec 1秒
(3) 5 msec 5m秒
Figure 14D 図14D
(1) Control 対照
(2) 1 Sec 1秒
(3) 5 msec 5m秒
(図15)
Figure 15 図15
(1) Met
140 kDa Met 140kDa
(2) Actin
43 kDa アクチン43kDa
(3) Total area density 総面密度
(図16)
Figure 16 図16
(1) % phosphorylatlon %リン酸化
(2) Control 対照
(3) Dehexa 10-12M ジヘキサ 10−12M
(4) HGF 50ng/ml + Dihexa 10-12M HGF50ng/ml+ジヘキサ10−12M
(5) Dihexa 10-10M ジヘキサ 10−10M
(6) Treatment Groups 投与群
(図17)
Figure 17 図17
(1) Dihexa 10-12M ジヘキサ 10−12M
(2) Dihexa 10-10M ジヘキサ 10−10M
(図18)
Figure 18 図18
(1) Coverslip Edge カバースリップ縁
(2) Control 対照
(図19)
Figure 19 図19
(1) Non-transfected 非形質移入
(図20)
Figure 20 図20
(1) # of Spines/50 mm スパイン数/50μm
(2) Control 対照
(3) Dihexa ジヘキサ
(4) Nle1-AngIV Nle1‐AngIV
(5) shMet Control shMet 対照
(6) shMet HGF Spines shMet HGF スパイン
(7) shMet Dihexa Spines shMet ジヘキサ スパイン
(8) shMet Nle1-AngIV Spines shMet Nle1‐AngIV スパイン
(図21)
Figure 21 図21
(1) Latency to find platform (sec) プラットホームを見つけ出すまでの時間(秒)
(2) Scopolamine > aCSF スコポラミン→aCSF
(3) Scopolamine > Dihexa スコポラミン→ジヘキサ
(4) Scopolamine/Hinge > Dihexa スコポラミン/Hinge→ジヘキサ
(5) aCSF > Dihexa aCSF→ジヘキサ
(6) Hinge > aCSF Hinge→aCSF
(7) Acquisition (days) 習得(日)
(図22)
Figure 22 図22
(1) Recovery (% zero time) 回収率(0時点に対する%)
(2) Time (min) 時間(分)
(図23)
Figure 23 図23
(1) Total binding (DPM) 総結合量(DPM)
(2) Log [M] Log[M]
(図24)
Figure 24A 図24A
(1) Dimer 二量体
(2) Monomer 単量体
(3) Nle-X-I-6AHA Nle‐X‐I‐6AHA
Figure 24B 図24B
(1) % HGF Dimerization % HGF二量体化
(2) [compound] [化合物]
(図25)
Figure 25 図25
(1) Control 対照
(2) Met Phosphorylation (%HGF) Metリン酸化(%HGF)
(3) [compound] [化合物]
(図26)
Figure 26 図26
(1) % HGF-dependent proliferation % HGF依存増殖
(2) negative control 陰性対照
(3) Hinge 10-10 M Hinge 10−10M
(4) Treatment groups 投与群
(図27)
Figure 27A 図27A
(1) Tretment Group 投与群
(2) Control 対照
(3) Cell Scattering (%HGF) 細胞散乱(%HGF)
Figure 27B 図27B
(1) Control 対照
(図28)
Figure 28 図28
(1) % HGF Dimerization %HGF二量体化
(2) Binding Affinity Ki 結合親和性Ki
(3) Cell Scattering
(%HGF) 細胞散乱(%HGF)
(図29)
Figure 29A 図29A
(1) Control 対照
Figure 29B 図29B
(1) Lung colonization (% B16F10) 肺定着(%B16F10)
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Claims (12)
- I.構造式(i)N−X−Tyr−Ile−(6)−アミノヘキサンアミド(式中、Xはヘキサノイル、ヘプタノイル、ペンタノイル、ブタノイル、プロパノイル、アセタノイルまたはベンゾイルである)、または
構造式(ii)N−ヘキサノイル−Ψ(CH2−NH2)−Tyr−Ile−(6)−アミノヘキサンアミド(式中、Ψは還元ペプチド結合である)を有する模倣薬、および
II.構造式(iii)D−Nle−X−Ile−NH−(CH2)5−CONH2(式中、XはTyr、Cys、Trp、Asp、PheまたはSerである)を有するアンタゴニスト
を含む肝細胞増殖因子(HGF)模倣体。 - I.構造式(i)N−X−Tyr−Ile−(6)−アミノヘキサンアミド(式中、Xはヘキサノイル、ヘプタノイル、ペンタノイル、ブタノイル、プロパノイル、アセタノイルまたはベンゾイルである)、または
構造式(ii)N−ヘキサノイル−Ψ(CH2−NH2)−Tyr−Ile−(6)−アミノヘキサンアミド(式中、Ψは還元ペプチド結合である)、または
構造式(iii)D−Nle−X−Ile−NH−(CH2)5−CONH2(式中、XはTyr、Cys、Trp、Asp、PheまたはSerである)
を有する肝細胞増殖因子(HGF)模倣体と、
II.担体と
を有し、前記HGF模倣体が前記担体に溶解または分散している
組成物。 - 必要とする被験体においてシナプス接続を拡張し、および/またはニューロン置換をもたらすための薬物の製剤における一種以上の治療に有効な量の肝細胞増殖因子(HGF)模倣体の使用であって、前記HGF模倣体が
構造式(i)N−X−Tyr−Ile−(6)−アミノヘキサンアミド(式中、Xはヘキサノイル、ヘプタノイル、ペンタノイル、ブタノイル、プロパノイル、アセタノイルまたはベンゾイルである)、または
構造式(ii)N−ヘキサノイル−Ψ(CH2−NH2)−Tyr−Ile−(6)−アミノヘキサンアミド(式中、Ψは還元ペプチド結合である)
を有する
HGF模倣体の使用。 - 必要とする被験体において認知症を治療するための薬物の製剤における一種以上の治療に有効な量の肝細胞増殖因子(HGF)模倣体の使用であって、前記HGF模倣体が
構造式(i)N−X−Tyr−Ile−(6)−アミノヘキサンアミド(式中、Xはヘキサノイル、ヘプタノイル、ペンタノイル、ブタノイル、プロパノイル、アセタノイルまたはベンゾイルである)、または
構造式(ii)N−ヘキサノイル−Ψ(CH2−NH2)−Tyr−Ile−(6)−アミノヘキサンアミド(式中、Ψは還元ペプチド結合である)
を有する
HGF模倣体の使用。 - 必要とする被験体において神経保護をもたらすか、または神経再生を誘導するための薬物の製剤における一種以上の治療に有効な量の肝細胞増殖因子(HGF)模倣体の使用であって、前記HGF模倣体が
構造式(i)N−X−Tyr−Ile−(6)−アミノヘキサンアミド(式中、Xはヘキサノイル、ヘプタノイル、ペンタノイル、ブタノイル、プロパノイル、アセタノイルまたはベンゾイルである)、または
構造式(ii)N−ヘキサノイル−Ψ(CH2−NH2)−Tyr−Ile−(6)−アミノヘキサンアミド(式中、Ψは還元ペプチド結合である)
を有する
HGF模倣体の使用。 - 正常な認知能力を持つ個体において認知機能を向上させるための促進的量の一種以上の薬物の製剤における肝細胞増殖因子(HGF)模倣体の使用であって、前記HGF模倣体が
構造式(i)N−X−Tyr−Ile−(6)−アミノヘキサンアミド(式中、Xはヘキサノイル、ヘプタノイル、ペンタノイル、ブタノイル、プロパノイル、アセタノイルまたはベンゾイルである)、または
構造式(ii)N−ヘキサノイル−Ψ(CH2−NH2)−Tyr−Ile−(6)−アミノヘキサンアミド(式中、Ψは還元ペプチド結合である)
を有する
HGF模倣体の使用。 - 必要とする被験体において癌を治療するための薬物の製剤における一種以上の治療に有効な量の肝細胞増殖因子(HGF)アンタゴニストの使用であって、前記HGFアンタゴニストが構造式D−Nle−X−Ile−NH−(CH2)5−CONH2(式中、XはTyr、Cys、Trp、Asp、PheまたはSerである)
を有する
HGFアンタゴニストの使用。 - 必要とする被験体において糖尿病を治療するための薬物の製剤における一種以上の治療に有効な量の肝細胞増殖因子(HGF)模倣体の使用であって、前記HGF模倣体が
構造式(i)N−X−Tyr−Ile−(6)−アミノヘキサンアミド(式中、Xはヘキサノイル、ヘプタノイル、ペンタノイル、ブタノイル、プロパノイル、アセタノイルまたはベンゾイルである)、または
構造式(ii)N−ヘキサノイル−Ψ(CH2−NH2)−Tyr−Ile−(6)−アミノヘキサンアミド(式中、Ψは還元ペプチド結合である)
を有する
HGF模倣体の使用。 - 必要とする被験体において心線維症、肺線維症、腎線維症および肝線維症のいずれかの線維症を治療するための薬物の製剤における一種以上の治療に有効な量の肝細胞増殖因子(HGF)模倣体の使用であって、前記HGF模倣体が
構造式(i)N−X−Tyr−Ile−(6)−アミノヘキサンアミド(式中、Xはヘキサノイル、ヘプタノイル、ペンタノイル、ブタノイル、プロパノイル、アセタノイルまたはベンゾイルである)、または
構造式(ii)N−ヘキサノイル−Ψ(CH2−NH2)−Tyr−Ile−(6)−アミノヘキサンアミド(式中、Ψは還元ペプチド結合である)
を有する
HGF模倣体の使用。 - 必要とする被験体において深遠静脈血栓、冠状動脈血栓のいずれかの血管不全を治療するための薬物の製剤における一種以上の治療に有効な量の肝細胞増殖因子(HGF)模倣体の使用であって、前記HGF模倣体が
構造式(i)N−X−Tyr−Ile−(6)−アミノヘキサンアミド(式中、Xはヘキサノイル、ヘプタノイル、ペンタノイル、ブタノイル、プロパノイル、アセタノイルまたはベンゾイルである)、または
構造式(ii)N−ヘキサノイル−Ψ(CH2−NH2)−Tyr−Ile−(6)−アミノヘキサンアミド(式中、Ψは還元ペプチド結合である)
を有する
HGF模倣体の使用。 - 必要とする被験体において創傷治療を促進するための薬物の製剤における一種以上の治療に有効な量の肝細胞増殖因子(HGF)模倣体の使用であって、前記HGF模倣体が
構造式(i)N−X−Tyr−Ile−(6)−アミノヘキサンアミド(式中、Xはヘキサノイル、ヘプタノイル、ペンタノイル、ブタノイル、プロパノイル、アセタノイルまたはベンゾイルである)、または
構造式(ii)N−ヘキサノイル−Ψ(CH2−NH2)−Tyr−Ile−(6)−アミノヘキサンアミド(式中、Ψは還元ペプチド結合である)
を有する
HGF模倣体の使用。 - 必要とする被験体において糖尿病性網膜症、黄斑変性症のいずれかの疾患での眼血管過多を遅延または改善するための薬物の製剤における一種以上の治療に有効な量の肝細胞増殖因子(HGF)模倣体の使用であって、前記HGF模倣体が
構造式(i)N−X−Tyr−Ile−(6)−アミノヘキサンアミド(式中、Xはヘキサノイル、ヘプタノイル、ペンタノイル、ブタノイル、プロパノイル、アセタノイルまたはベンゾイルである)、または
構造式(ii)N−ヘキサノイル−Ψ(CH2−NH2)−Tyr−Ile−(6)−アミノヘキサンアミド(式中、Ψは還元ペプチド結合である)
を有する
HGF模倣体の使用。
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