CN106699868B

CN106699868B - 一种蛋白质及编码其的核苷酸序列

Info

Publication number: CN106699868B
Application number: CN201710116813.0A
Authority: CN
Inventors: 刘海峰; 初彦辉; 王小花; 袁晓环
Original assignee: Mudanjiang Medical University
Current assignee: Mudanjiang Medical University
Priority date: 2017-03-01
Filing date: 2017-03-01
Publication date: 2019-11-15
Anticipated expiration: 2037-03-01
Also published as: CN106699868A

Abstract

本申请公开了一种蛋白质及编码其的核苷酸序列。所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.1和/或如SEQ ID No.3所示；或者，所述蛋白质的氨基酸序列为如SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且具有与如SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.3所示的序列相同功能的序列。本申请还提供了一种编码如上蛋白质的核苷酸序列。本申请所提供的蛋白质对活化的肝星状细胞中纤维化相关的胶原蛋白(ColI)和α‑平滑肌球蛋白(α‑SMA)具有明显的抑制效应。

Description

一种蛋白质及编码其的核苷酸序列

技术领域

本申请涉及一种蛋白质及编码其的核苷酸序列。

背景技术

肝纤维化疾病严重危害人类健康，因此预防或治疗纤维化迫在眉睫。肝纤维化主要是由于在肝损伤的过程，活化的肝星状细胞产生大量转化生长因子β1(TGF-β1)，进一步激活肝星状细胞，产生大量的细胞外基质(以胶原蛋白和α-平滑肌动蛋白为主)，同时伴随着基质重塑和肝组织结构的改变，最终造成肝功能衰竭。肝细胞生长因子(HGF)是一种多功能的抗纤维化的细胞因子，不仅参与组织修复和再生，而且调控组织器官纤维化。HGF的生物学功能是通过与其细胞膜上的受体c-Met结合，使其发生磷酸化，激活该受体的酪氨酸激酶活性来实现的，但由于HGF的结构复杂含有N-末端发夹结构、4个纤溶酶样Kringle结构和丝氨酸蛋白酶样折叠区而限制重组蛋白的应用。

豚鼠作为一种重要的实验动物模型，其损伤引起的纤维化严重影响其应用，因此预防或治疗纤维化显得十分重要。但关于豚鼠的HGF基因的研究在整个国内外还处于完全空白状态。

发明内容

为此，本申请之一提供了一种如(I)或(II)的蛋白质，(I)所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，和/或如SEQ ID No.3所示；(II)所述蛋白质的氨基酸序列为如SEQID No.1或SEQ ID No.3所示的序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且具有与如SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.3所示的序列相同功能的序列。

本申请之二提供了如本申请之一的蛋白质的单克隆抗体。

本申请之三提供了一种编码如本申请之一所述的蛋白质的核苷酸序列。

在一个具体实施方式中，所述核苷酸序列为如SEQ ID No.2，和/或SEQ ID No.4所示的序列。

本申请之四提供了一种载体，如本申请之三所述的核苷酸序列被克隆到第二载体之上，所述第二载体选自原核表达载体和/或真核表达载体。

所述第二载体可以是现有技术中的表达载体和/或从商业获得的表达载体。

因此，在一个具体实施方式中，所述第二载体选自pET28a、pET28b、pET21a、pET21b和pET43.1a中的至少一种。

在一个具体实施方式中，所述第二载体选自pCDNA3.1、pCDNA3.0、pEGFP-N1和pDsRed2-N1中的至少一种。

本申请之五提供了一种用于如本申请之三所述的核苷酸序列或本申请之四的载体的引物序列，所述引物序列如SEQ ID Nos.5-10所示。其中，SEQ ID Nos.5-10所示序列中的任意一条上游序列(SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9)和任意一条下游序列(SEQID No.6、SEQ ID No.8、SEQ ID No.10)组合，并且这些组合均可用于SEQ ID No.2序列(例如鉴定和/或克隆SEQ ID No.2序列)；SEQ ID No.7与SEQ ID No.8或SEQ ID No.10中的组合可以用于SEQ ID No.4序列(例如鉴定和/或克隆SEQ ID No.4序列)；SEQ ID No.9与SEQID No.10的组合可以用于SEQ ID No.4序列(例如鉴定和/或克隆SEQ ID No.4序列)。

本申请之六提供了如本申请之一所述的蛋白质在制备预防和/或治疗与纤维化有关的疾病，和/或用于创伤修复的药物中的应用。

本申请之七提供了本申请之三所述的核苷酸序列在制备预防和/或治疗与纤维化有关的疾病，和/或用于创伤修复的药物中的应用。

在本申请中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

本申请能产生的有益效果包括：

本申请所提供的蛋白质对活化的肝星状细胞中纤维化相关的胶原蛋白(Col I)和α-平滑肌球蛋白(α-SMA)具有明显的抑制效应。通过基因工程方法，利用本申请的核苷酸序列生产的具有活性的截短型豚鼠肝细胞生长因子变体gmNK1蛋白，可作为豚鼠纤维化相关疾病的拮抗剂。另外，本申请所提供的蛋白质和/或核苷酸序列为进一步研究纤维化和创伤修复提供理论基础。

附图说明

图1显示了构建pET28a/gmNK1原核表达及具有活性的截短型豚鼠肝细胞生长因子变体gmNK1蛋白在BL21(DE3)中的诱导表达和纯化，Ni²⁺柱纯化的SGS-PAGE鉴定和鼠抗His⁶-tag的western blot鉴定结果。其中，A图显示了构建pET28a/gmNK1原核表达策略；B图中泳道1是未经IPTG诱导的全菌蛋白，泳道2是经IPTG诱导的全菌蛋白，泳道3是超声裂解后上清，泳道4是超声裂解后沉淀；C图中泳道1-6：经过不同的咪唑浓度纯化后的目的蛋白，泳道7-8是经洗涤缓冲液洗脱的杂蛋白，泳道9是超声破碎上清流经Ni²⁺柱、未结合的杂蛋白；D图泳道是经Ni²⁺-NTA纯化后目的蛋白的western blot。

图2显示了重组gmNK1对c-Met磷酸化水平以及对活化的肝星状细胞中纤维化相关的胶原蛋白(Col I)和α-平滑肌球蛋白(α-SMA)的影响。在图A中，泳道1：未加药；泳道2：5ng/ml TGF-β1；泳道3：5ng/ml TGF-β1+40ng/ml gmNK1；泳道4：5ng/ml TGF-β1+60ng/mlgmNK1。图2-B中的c-Met磷酸化水平为图2-A中相应的p-c-Met/c-Met的值；图A和B说明不同浓度的gmNK1作用于活化的肝星状细胞，gmNK1能激活其受体c-Met，使其磷酸化。在图C中，泳道1：未加药；泳道2：5ng/ml TGF-β1；泳道3：5ng/ml TGF-β1+40ng/ml gmNK1；泳道4：5ng/ml TGF-β1+60ng/ml gmNK1。图C、D和E说明不同浓度的gmNK1作用于活化的肝星状细胞，抑制肝星状细胞中纤维化相关的胶原蛋白(Col I)和α-平滑肌球蛋白(α-SMA)蛋白表达，且呈剂量依赖效应。

具体实施方式

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。

豚鼠(Cavia porcellus)，常规人工饲养。

实施例1

豚鼠gHGF cDNA的克隆

(1)引物设计：设计豚鼠gHGF基因的正义寡核苷酸引物F1：5’-ATGTGGGNNANCAAACTCCNGNCCTG-3’，其中，N＝A、T、C或G；与反义寡核苷酸引物R1：5’-GCGCTTCACTTATGACTGTGGTANCTTNTACG-3’，其中，N＝A、T、C或G。

(2)提取总RNA：应用RNA抽提试剂盒E.Z.N.A.^TM HP total RNA Kit(Omega,USA)提取出约1μg豚鼠肝脏组织中的总RNA，并通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其质量和纯度，紫外分光光度计测定其浓度。

(3)应用RT-PCR方法，以上述F1和R1为特异性引物，扩增出gHGF cDNA的一段序列，全长为2190bp，克隆入pMD18-T载体，并对其碱基序列进行测定。

RT-PCR的反应条件为：以步骤(2)提取的总RNA为模板，在50μl反应体系中，加入5×RT-PCR反应缓冲液10μl、25mM MgSO₄ 2μl、10mM dNTP混合物1μl、20μM的上下游引物各2.5μl、AMV逆转录酶(Takara公司)1μl、pfu高保真DNA聚合酶1μl及RNA模板2μl，补水至50μl。RT-PCR循环参数为：48℃逆转录45min，94℃变性2min，再进行29个PCR循环(94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸150s)，最后于72℃延伸7min。RT-PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，用胶回收试剂盒回收约2000bp的DNA条带，克隆入pMD18-T载体，经含Amp抗生素(50mg/ml)的琼脂糖平板筛选转化子，挑取出8个阳性克隆送往上海生工测序公司进行碱基序列测定。获得的豚鼠肝细胞生长因子gHGF的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，SEQ ID No.2所示序列编码的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

同源检索：向http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/提交克隆得到的如SEQ IDNo.2的cDNA序列(GenBank登录号KY463237)，在GenBank、EMBL和DDBJ国际三大主要核酸序列数据库进行相似性搜索及同源性分析，发现与已知的人(Homo sapiens)(GenBank登录号NM_000601.5)、小鼠(Mus musculus)(GenBank登录号NM_001289458.1)、大鼠(Rattusnorvegicus)(GenBank登录号NM_017017.2)、鸡(Gallus gallus)(GenBank登录号NM_001030370.3)的HGF核苷酸序列相似性最高，分别是83.99％、82.9％、82.36％、72.62％，可以确定该序列是豚鼠肝细胞生长因子HGF的ORF。

实施例2：

具有活性的截短型豚鼠肝细胞生长因子变体gmNK1重组载体的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达

在该实施例中，将SEQ ID No.1序列中的第132位的Lys突变为Glu；将第134位的Gly突变为Glu，获得新的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

以实施例1得到的豚鼠gHGF开放阅读框的cDNA(SEQ ID No.2)为模板，设计引物gmNK1F(5’-GGGAATTCCATATGCAGAAGAAAAGAAGAAATACCCT-3’)，mut R1(5’-ACCGTGCCCTTGTAGCTTTCCCCTTCTCCAATG-3’)，mut F1(5’-CAACTGCATCATTGGAGAAGGGGAAAGCTACA-3’)和gmNK1R(5’-CGCGGATCCTTACACTGAGGAATGTCACAG-3’)扩增出gmHGF cDNA的基因片段(如SEQID No.4所示)，经突变引物扩增获得具有活性的截短型豚鼠肝细胞生长因子变体gmNK1，引物分别引入酶切位点NdeⅠ及BamHI，亚克隆入pET-28a载体，构建成重组载体pET28a/gmNK1。将此重组载体转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，诱导表达出目的蛋白gmNK1。

重组目的蛋白的gmNK1诱导表达和纯化

将BL21(DE3)/pET28a-gNK1菌经37℃，201rpm振荡培养12h，按照1:100的比例重新接菌37℃，201rpm振荡培养至OD₆₀₀≈0.6，添加IPTG，使其终浓度为0.8mmol/L，转至20℃，培养18h。4℃12000g离心10min收菌。将收集的菌体溶于结合缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.9，150mM NaCl，5mM咪唑)超声破碎至澄清，4℃12000g离心30min，弃沉淀，收集上清上样于Ni² ⁺-NTA柱，经洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.9，150mM NaCl，15mM咪唑)洗涤，最后经含不同浓度的咪唑的洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.9，150mM NaCl)，在4℃透析过夜，再SDS-PAGE检测纯化的目的蛋白和用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。见图1。蛋白质印迹分析

蛋白质印迹分析(western-blot)中所用一抗为羊抗His⁶单抗，二抗为辣根过氧化酶标记的兔抗羊IgG。其简要步骤是：将诱导的产物先行SGS-PAGE，然后以湿转法将蛋白电转移至PVDF膜上，用记号笔标记蛋白分子量参照物(marker)各条带，然而依次经5％脱脂奶粉室温封闭1h，与一抗孵育12h，与HRP标记的二抗IgG孵育2h，每步完成后均严格洗膜，最后加HRB显色。见图1。

对比例1

hmNK1的克隆与表达

hmNK1的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示；hmNK1的DNA序列如SEQ ID No.12所示。

用RNA抽提试剂盒E.Z.N.A.TM HP total RNAKit(Omega，USA)提取出约1μg人肝脏组织中的总RNA，并通过其获得人源hHGF的cDNA。以人源hHGF开放阅读框的cDNA为模板，设计引物HGF-F5’-GCCGCATATGCAAAGGAAAAGAAGAAATACAATTC-3’，Mut HGF-R5’-TCCCTTGTAGCTCTCTCCTTCACCAATGATGCAGTTTCTAAT-3’，HGF-R 5’-GAGGATCCTTAACACTGAGGAATGTCACAGA-3’和Mut HGF-F 5’-ATTAGAAACTGCATCATTGGTGAAGGAGAGAGCTACAAGGGA-3’经突变引物扩增获得截短型人源肝细胞生长因子变体hmNK1，引物分别引入酶切位点NdeⅠ及BamHI，亚克隆入pET-28a载体，构建成重组载体pET28a/hmNK1。将此重组载体转入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，诱导表达出目的蛋白hmNK1。

将BL21(DE3)/pET28a-hmNK1菌经37℃，201rpm振荡培养12h，按照1:100的比例重新接菌37℃，201rpm振荡培养至OD₆₀₀≈0.6，添加IPTG，使其终浓度为0.5mmol/L，转至20℃，培养12h。4℃12000g离心10min收菌。将收集的菌体溶于结合缓冲液(20mM Tris-HCl,pH7.9,150mM NaCl,5mM咪唑)超声破碎至澄清，4℃12000g离心30min，弃沉淀，收集上清上样于Ni²⁺-NTA柱，经洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl,pH 7.9,150mM NaCl,15mM咪唑)洗脱，最后经含不同浓度的咪唑的洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl,pH 7.9,150mM NaCl)，在4℃透析过夜，再SDS-PAGE检测纯化的目的蛋白和用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。

实施例3

对活化肝星状细胞中c-Met的磷酸化表达影响

将培养的肝星状细胞HSC-T6种于6孔板，经5ng/ml的TGF-β1和40ng/ml或60ng/ml的gmNK1在37℃、5％CO₂浓度条件下培养24h体外通过Western blot检测gmNK1对c-Met的磷酸化表达情况，结果如图2所示。根据图2可知本申请克隆得到的重组gmNK1以剂量依赖的方式激活c-Met，使其磷酸化，因此，重组gmNK1能够激活其下游的c-Met，使其磷酸化。

实施例4

对胶原蛋白(Col I)和α-平滑肌球蛋白(α-SMA)表达影响

将培养的肝星状细胞HSC-T6种于6孔板，经5ng/ml的TGF-β1和40ng/ml或60ng/ml的gmNK1在37℃、5％CO₂浓度条件下培养24h，在体外通过western blot检测gmNK1对Col I和α-SMA表达情况，结果如图2所示。根据图2可知本申请克隆得到的重组gmNK1以剂量依赖的方式抑制Col I和α-SMA在蛋白水平的表达，因此，重组gmNK1能够抑制纤维化相关基因Col I和α-SMA表达，进而抑制纤维化。

另外，利用上述条件，测定并对比了重组gmNK1和重组hmNK1对α-平滑肌球蛋白(α-SMA)表达影响。结果表明，gmNK1抑制活性达到约45％[其根据图2-D中的数值计算得出，即(5ng/ml TGF-β1对应的α-SMA蛋白的相对表达水平-5ng/ml TGF-β1+60ng/ml gmNK1对应的α-SMA蛋白的相对表达水平)/5ng/ml TGF-β1对应的α-SMA蛋白的相对表达水平]，而hmNK1抑制活性约为35％[(5ng/ml TGF-β1对应的α-SMA蛋白的相对表达水平-5ng/ml TGF-β1+60ng/ml hmNK1对应的α-SMA蛋白的相对表达水平)/5ng/ml TGF-β1对应的α-SMA蛋白的相对表达水平]，因此gmNK1的抗纤维化活性显著优于hmNK1。

实施例5

单克隆抗体的制备

1)动物免疫

用纯化的gmNK1蛋白按60μg/只小鼠的量，皮下初次免疫4只SPF BALB/c雌性小鼠，编号为：1、2、3、4。皮下第一次加强免疫，蛋白的免疫量为30μg/只；皮下第二次加强免疫，蛋白的免疫量为30μg/只；皮下第三次加强免疫，蛋白的免疫量为30μg/只；皮下第四次加强免疫，蛋白的免疫量为30μg/只；眼眶取血，测血清效价。

2)免疫效价检测

步骤：将纯化的gmNK1蛋白用包被液，2μg/ml，4℃包被过夜；2％脱脂牛奶，37℃封闭2h；血清从200倍开始2倍梯度稀释，空白对照(blank)为PBS，阴性对照(negative)为阴性血清200倍稀释。结果：选取免疫效价最高3号小鼠做腹腔冲击细胞融合实验。

3)细胞融合实验

用纯化的gmNK1蛋白免疫原50μg，腹腔冲击3号小鼠。取小鼠脾细胞与SP2/0细胞，采用PEG法进行融合。融合完细胞用半固体培养基(含HAT)进行筛选培养。

实验器材

灭菌的手术器械：三把剪刀、三把镊子、一个细胞筛、一个注射器的内芯、一个平皿、湿盒、2个500ml烧杯、2个50ml离心管、3个15ml离心管。

实验试剂

IMDM培养基

IMDM完全培养基(含15％血清)

2.2％甲基纤维素：厂家：SIGMA；货号：M0262-100G

新生牛血清：10ml

PEG1500：厂家：Roche；货号：78364

HAT：厂家：Sigma；货号：H0262-10VL

HT：厂家：Sigma；货号：H0137-10VL

融合实验步骤

i.将状态良好的sp2/0细胞轻柔的从培养瓶壁上吹打下来，吸入到50ml离心管中。

ii.小鼠摘眼球取血，然后拉颈处死，放入75％的酒精中浸泡5min。

iii.在平皿中倒入少量无血清的IMDM培养基，将细胞筛及注射器内芯放入平皿中。用剪刀和镊子取下小鼠的脾脏，放到细胞筛上。用注射器的内芯轻轻地将脾充分碾碎，将碾好的细胞吸入到装sp2/0的离心管中，离心1500rad/min，5min。

iv.用剪刀和镊子取下小鼠的胸腺，碾碎。将碾好的胸腺细胞到15ml离心管中，再加入2ml的HAT，2ml的HT放在孵箱中备用。

v.将离心好的细胞，倒掉上清，用无血清的IMDM培养基将细胞小心轻柔地吹匀，离心(1500rad/min，5min)。

vi.将离心好的细胞上清尽量倒掉。拍打离心管底充分悬浮细胞，将离心管放入37℃温水中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG，加完后，在温水中静置1min。然后2min内缓慢加入2ml的无血清的IMDM培养基，接着2min内缓慢加入8ml无血清的IMDM培养基。离心1000rad/min，5min。

vii.倒掉上清，加入10ml的血清，小心的将细胞吹匀，倒入前面准备好的胸腺细胞。再加入25ml灭过菌的半固体培养基，充分混匀。然后均匀倒入30个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入湿盒中，然后放入孵箱中培养。

4)筛选杂交瘤细胞

待融合的细胞培养至第7天时，即细胞培养至覆盖10％孔底时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用间接ELISA法检测抗体含量，经有限稀释进行二次亚克隆筛选，依抗体的分泌情况筛选出高效价、高特异性的细胞株，扩大培养，并将高效价、高特异性的细胞株冻存。最终筛选出一株杂交瘤细胞，命名为小鼠骨髓杂交瘤细胞株MCANTi，其产生的单克隆抗体命名为gmNK1MCANTi。

以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

核苷酸和氨基酸序列表

<110>牡丹江医学院

<120>一种蛋白质及编码其的核苷酸序列

<130> DD170010I

<160>16

<170>PatentIn version 3.5

<210> 1

<211>729

<212>PRT

<213>豚鼠（Cavia porcellus）

<223>gHGF

<400> 1

MWASKLLPALLFQHILLHLLLLPIAVPSAEGQKKRRNTLHEFKKSAKTTLIKEDPLLKSKSKKMSSADQCASRCTRNKGLPFTCKAFVFDKARKRCLWLPFNSMSSGVKKEFGHEFDLYEKKDYIRNCIIGKGGSYKGTVSVTKSGIKCQPWSSMIPHEHSFLPSSYRGKDLQENYCRNPRGEEGGPWCFTSNPEVRHEVCDIPQCSEVECVTCNGETYRGPMDHTESGKICQRWDQQTPHRHKFLPERYPDKGFDDNYCRNPDGKLRPWCFTLDPDTPWEYCAIKMCAHSLMNDTDVPVETTECLQGQGEGYRGTVNTIWNGVLCQRWDSQYPHQHDITPENFKCKDLRENYCRNPDGAESPWCFTTDPNIRVGYCSQIPKCDVSGGQDCYRGNGKNYMGSLSKTRSGLTCSMWDKNMEDLHRHIFWEPDASKLNKNYCRNPDDDAHGPWCYTGNPLIPWDYCPISHCEGDTTPTINLDHPVISCAKTKQLRVVNGIPTRTNVGWMVSLKYRNKHICGGSLIKESWILTARQCFPARNKDLKDYEAWLGIHDVHGRGEEKRRQVRNVSQLVYGPEGSDLVLLKLARPAVLDDFVSTIDLPNYGCTIPEKTTCSVYGWGYTGLINADGLLRVAHLYIMGNERCAQHHQGKVTLSESEICAGAEKIRSGPCEGDYGGPLVCEQHKMQMVLGVIVPGRGCAIPNRPGIFVRVAYYAKWIHKIILTYKVPQS；

<210>2

<211>2190

<212>cDNA

<213>豚鼠（Cavia porcellus）

<223>gHGF

<400>2

ATGTGGGCCAGCAAACTCCTGCCAGCCCTGCTGTTCCAGCACATCCTCCTGCACCTCCTGCTGCTCCCCATCGCCGTCCCCTCCGCAGAAGGACAGAAGAAAAGAAGAAATACCCTTCATGAATTCAAAAAGTCAGCCAAGACTACGCTCATCAAAGAAGACCCGTTACTGAAGAGTAAGAGCAAGAAGATGAGCAGCGCAGACCAGTGCGCCAGCCGCTGCACCAGGAACAAGGGGCTCCCGTTCACCTGCAAGGCCTTTGTTTTTGATAAAGCAAGAAAAAGATGCCTGTGGCTCCCTTTCAACAGCATGTCAAGTGGGGTGAAGAAGGAGTTCGGCCACGAGTTCGACCTGTACGAGAAAAAAGACTATATCCGCAACTGCATCATTGGAAAAGGGGGCAGCTACAAGGGCACGGTCTCGGTCACCAAGAGCGGGATCAAGTGCCAGCCCTGGAGCTCCATGATCCCCCATGAGCACAGCTTTTTGCCTTCGAGCTATCGGGGTAAAGACCTACAGGAAAACTACTGTCGAAACCCTCGAGGGGAAGAAGGGGGACCGTGGTGTTTCACGAGCAATCCCGAGGTACGCCACGAAGTCTGTGACATTCCTCAGTGTTCAGAAGTGGAGTGCGTGACCTGCAATGGAGAAACCTATCGAGGGCCCATGGATCACACAGAATCAGGCAAGATCTGTCAGCGCTGGGACCAGCAGACGCCTCACCGGCACAAATTCCTGCCCGAAAGATACCCCGACAAAGGCTTTGATGATAATTACTGCCGCAACCCCGATGGCAAGCTGAGGCCGTGGTGCTTTACTCTTGACCCTGACACCCCTTGGGAGTACTGTGCAATTAAAATGTGCGCTCACAGTCTGATGAATGACACTGATGTCCCCGTGGAAACAACTGAATGTCTTCAAGGTCAGGGAGAAGGATACAGGGGGACCGTCAACACCATTTGGAATGGAGTTCTGTGCCAGCGCTGGGATTCCCAGTATCCCCACCAGCACGACATAACTCCTGAGAATTTTAAGTGCAAGGACCTGCGGGAGAATTACTGCCGAAACCCAGACGGCGCTGAGTCGCCCTGGTGCTTCACCACCGACCCGAACATCCGAGTTGGCTACTGCTCCCAGATCCCCAAGTGCGACGTGTCAGGTGGACAAGATTGTTATCGTGGGAATGGAAAAAATTATATGGGTAGTTTATCCAAAACAAGATCTGGGCTAACGTGTTCCATGTGGGACAAGAACATGGAAGACTTGCACCGTCACATCTTCTGGGAGCCGGATGCCAGTAAGCTGAACAAGAATTACTGCCGGAATCCAGACGACGATGCCCACGGACCCTGGTGTTACACGGGGAACCCTCTCATCCCCTGGGATTACTGCCCCATTTCCCACTGTGAAGGGGATACCACGCCTACAATCAATTTAGACCATCCTGTAATATCTTGTGCCAAAACAAAGCAACTACGAGTAGTTAATGGGATTCCAACACGAACAAACGTAGGATGGATGGTTAGTCTGAAGTACAGAAATAAACATATCTGCGGAGGATCGTTGATTAAGGAAAGTTGGATCCTTACTGCAAGACAATGTTTTCCTGCTAGAAACAAAGACCTGAAAGATTATGAAGCTTGGCTTGGAATCCACGATGTCCACGGTCGAGGCGAGGAGAAGCGCAGACAGGTTCGCAATGTGTCCCAGCTGGTGTACGGGCCCGAAGGCTCGGATCTGGTGTTACTGAAGCTCGCCAGACCTGCTGTCCTGGATGACTTTGTCAGCACCATCGATCTGCCTAATTACGGGTGCACAATTCCTGAGAAGACCACCTGCAGTGTTTACGGCTGGGGCTACACCGGATTGATCAACGCGGATGGCCTGCTGCGCGTGGCGCACCTCTACATCATGGGCAACGAGAGGTGCGCCCAGCATCACCAAGGCAAGGTGACACTGAGCGAGTCTGAGATATGCGCCGGGGCCGAGAAGATCCGCTCGGGGCCATGCGAGGGGGACTATGGTGGCCCACTCGTCTGTGAGCAGCACAAAATGCAGATGGTCCTCGGTGTCATCGTGCCAGGTCGCGGGTGCGCCATCCCCAACCGCCCTGGCATCTTTGTCCGAGTAGCCTATTACGCAAAGTGGATACACAAGATAATTCTAACGTATAAGGTACCACAGTCATAG；

<210>3

<211>175

<212>PRT

<213>人工序列

<223> gmNK1

<400>3

QKKRRNTLHEFKKSAKTTLIKEDPLLKSKSKKMSSADQCASRCTRNKGLPFTCKAFVFDKARKRCLWLPFNSMSSGVKKEFGHEFDLYEKKDYIRNCIIGEGESYKGTVSVTKSGIKCQPWSSMIPHEHSFLPSSYRGKDLQENYCRNPRGEEGGPWCFTSNPEVRHEVCDIPQC；

<210>4

<211>525

<212>DNA

<213>人工序列

<223> gmNK1

<400>4

CAGAAGAAAAGAAGAAATACCCTTCATGAATTCAAAAAGTCAGCCAAGACTACGCTCATCAAAGAAGACCCGTTACTGAAGAGTAAGAGCAAGAAGATGAGCAGCGCAGACCAGTGCGCCAGCCGCTGCACCAGGAACAAGGGGCTCCCGTTCACCTGCAAGGCCTTTGTTTTTGATAAAGCAAGAAAAAGATGCCTGTGGCTCCCTTTCAACAGCATGTCAAGTGGGGTGAAGAAGGAGTTCGGCCACGAGTTCGACCTGTACGAGAAAAAAGACTATATCCGCAACTGCATCATTGGAGAAGGGGAAAGCTACAAGGGCACGGTCTCGGTCACCAAGAGCGGGATCAAGTGCCAGCCCTGGAGCTCCATGATCCCCCATGAGCACAGCTTTTTGCCTTCGAGCTATCGGGGTAAAGACCTACAGGAAAACTACTGTCGAAACCCTCGAGGGGAAGAAGGGGGACCGTGGTGTTTCACGAGCAATCCCGAGGTACGCCACGAAGTCTGTGACATTCCTCAGTGT；

<210>5

<211> 26

<212> DNA

<213>人工序列

<223> F1

<400>5

ATGTGGGNNANCAAACTCCNGNCCTG；

<210>6

<211> 32

<212> DNA

<213>人工序列

<223> R1

<400>6

GCGCTTCACTTATGACTGTGGTANCTTNTACG；

<210>7

<211> 37

<212> DNA

<213>人工序列

<223> gmNK1 F

<400>7

GGGAATTCCATATGCAGAAGAAAAGAAGAAATACCCT；

<210>8

<211> 33

<212> DNA

<213>人工序列

<223>mut R1

<400>8

ACCGTGCCCTTGTAGCTTTCCCCTTCTCCAATG；

<210>9

<211> 32

<212> DNA

<213>人工序列

<223> mut F1

<400>9

CAACTGCATCATTGGAGAAGGGGAAAGCTACA；

<210>10

<211> 30

<212> DNA

<213>人工序列

<223> gmNK1 R

<400>10

CGCGGATCCTTACACTGAGGAATGTCACAG；

<210>11

<211>175

<212>PRT

<213>人工序列

<223>hmHGF

<400>11

QRKRRNTIHEFKKSAKTTLIKIDPALKIKTKKVNTADQCANRCTRNKGLPFTCKAFVFDKARKQCLWFPFNSMSSGVKKEFGHEFDLYENKDYIRNCIIGEGESYKGTVSITKSGIKCQPWSSMIPHEHSFLPSSYRGKDLQENYCRNPRGEEGGPWCFTSNPEVRYEVCDIPQC；

<210>12

<211>525

<212> DNA

<213>人工序列

<223>hmHGF

<400>12

CAAAGGAAAAGAAGAAATACAATTCATGAATTCAAAAAATCAGCAAAGACTACCCTAATCAAAATAGATCCAGCACTGAAGATAAAAACCAAAAAAGTGAATACTGCAGACCAATGTGCTAATAGATGTACTAGGAATAAAGGACTTCCATTCACTTGCAAGGCTTTTGTTTTTGATAAAGCAAGAAAACAATGCCTCTGGTTCCCCTTCAATAGCATGTCAAGTGGAGTGAAAAAAGAATTTGGCCATGAATTTGACCTCTATGAAAACAAAGACTACATTAGAAACTGCATCATTGGTGAAGGAGAGAGCTACAAGGGAACAGTATCTATCACTAAGAGTGGCATCAAATGTCAGCCCTGGAGTTCCATGATACCACACGAACACAGCTTTTTGCCTTCGAGCTATCGGGGTAAAGACCTACAGGAAAACTACTGTCGAAATCCTCGAGGGGAAGAAGGGGGACCCTGGTGTTTCACAAGCAATCCAGAGGTACGCTACGAAGTCTGTGACATTCCTCAGTGT；

<210>13

<211>35

<212> DNA

<213>人工序列

<223>HGF-F

<400>13

GCCGCATATGCAAAGGAAAAGAAGAAATACAATTC；

<210>14

<211>42

<212> DNA

<213>人工序列

<223> Mut HGF-R

<400>14

TCCCTTGTAGCTCTCTCCTTCACCAATGATGCAGTTTCTAAT；

<210>15

<211>31

<212> DNA

<213>人工序列

<223> HGF-R

<400>15

GAGGATCCTTAACACTGAGGAATGTCACAGA；

<210>16

<211>42

<212> DNA

<213>人工序列

<223> MutHGF-F

<400>16

ATTAGAAACTGCATCATTGGTGAAGGAGAGAGCTACAAGGGA。

Claims

1.如(I)的蛋白质，

(I)所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.一种编码如权利要求1所述的蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列为如SEQID No.4所示的序列。

4.一种载体，其特征在于，如权利要求2或3所述的核酸分子被克隆到载体之上，所述载体选自原核表达载体和/或真核表达载体。

5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体选自pET28a、pET28b、pET21a、pET21b和pET43.1a中的至少一种。

6.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体选自pCDNA3.1、pCDNA3.0、pEGFP-N1和pDsRed2-N1中的至少一种。

7.一种用于如权利要求2或3所述的核酸分子的引物，其特征在于，所述引物的序列如SEQ ID Nos.7-10所示。

8.如权利要求1的蛋白质在制备预防和/或治疗纤维化疾病的药物中的应用。

9.如权利要求2或3所述的核酸分子在制备预防和/或治疗纤维化疾病的药物中的应用。