CN1384115A - 一种重组人肝细胞生长因子rhHGF蛋白质的表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用真核表达体系制备肝细胞生长因子(rhHGF)蛋白质的方法,通过克隆hHGF基因,构建真核表达质粒pRC/CMV－rhHGF,选用细胞株稳定、表达效率高的CHO和易成活、生活周期短、生长速度快的NRK作为宿主细胞表达出具有野生活性的rhHGF,与传统的原核表达体系相比,具有易于合成、rhHGF可有效分泌到培养液中、加工方式与天然蛋白相似、能发生折叠、形成二硫键、能发生糖基化、多聚化及前体加工和修饰等优点,不但成活工艺简单,而且保证了表达产物功能活性的存在,提供了一种用外源基因表达产生基因工程药物的方法。

Description

一种重组人肝细胞生长因子rhHGF蛋白质的表达方法

技术领域：

本发明涉及一种蛋白质的表达方法，该方法是通过真核基因工程方法来表达具有野生活性的rhHGF蛋白质。

背景技术：

肝细胞生长因子(HGF)是强有力的细胞分裂促进因子，它可以促进肝细胞及多种内皮细胞、上皮细胞的分裂、分化；参与肝脏及其他重要组织器官损伤后修复和生理条件下死亡细胞的再生，具有重要的生理功效和药用价值，是治疗各种肝病的最理想药物。肝病是东亚人群中发病率最高的疾病之一，我国更是高发地区。因此对HGF的需求量极大，但HGF的来源问题还尚未解决。以往使用的HGF均从含量极微的组织中提取，过程复杂、成本昂贵，很难适应HGF研究和开发的需要。寻找并建立一个体外大量获得HGF的方法和途径是国内外许多实验室竞相努力的目标。90年代开始，本实验室同时用原核细胞和真核细胞研究rhHGF的构建和表达并申请了专利(申请号：01140204.0)。考虑到肝细胞生长因子是一个分子量为82KDa的糖蛋白，有四个糖基化位点，其糖基化效应可能与它的功能有关，本实验室尝试用真核细胞作为表达系统。通过真核细胞表达的产物有以下优点：①易于合成，可有效分泌到培养液中；②工艺简单，加工方式与天然蛋白相似，能发生折叠，形成二硫键；能发生糖基化，多聚化及前体加工和修饰等，在分子结构、理化特性和生物学功能上更接近于天然分子。

发明内容：

本发明的目的在于建立一种通过真核表达体系表达rhHGF蛋白质的方法，探索rhHGFcDNA外源基因表达和生产的可能性。为达到上述目的，本发明采用了以下技术路线和步骤：

一、技术路线：

1.rhHGF表达载体pLX008的构建：

2.rhHGF在真核细胞中的表达：

3.表达产物活性测定：

二、步骤：

1..rhHGF表达载体pLX008的构建

用BamHI和XbaI完全酶切含有HGFcDNA全序列基因片段的重组质粒PBS^KS-HGF(由美国著名科学家闫占清馈赠)，获得了长2.2kb的HGF cDNA完整序列，插入经BamHI和XbaI双酶切的带有强启动效应的巨细胞病毒启动子的载体pRC/CMV(由美国著名科学家闫占清馈赠)，获得重组质粒pLX008。经筛选及限制性内切酶谱鉴定重组正确后，纯化质粒。

2.人HGF在真核细胞中的表达

将纯化的表达载体pLX008用磷酸钙-DNA共沉淀法转染大鼠肾成纤维细胞(NRK：购自中国科学院上海细胞所)及中国仓鼠卵细胞(CHO：购自中国科学院上海细胞所)，采用G418(美国GIBCO产品)抗性筛选法，筛选两种细胞有阳性克隆出现后，将细胞克隆扩大培养。之后常规传代，待生长到60-80％融合时，更换不含G418的培养基，融合状态后继续培养24-48小时。收集培养物于无菌离心管中，900-1200r/min离心20分钟，取培养物上清分装后-20℃保存，用作条件培养基。

3.结果及表达产物活性测定

用HCC-7902细胞(肝癌细胞)及原代培养成年大鼠肝细胞对培养基上清进行活性测定。³H-TdR掺入分析证明，它能有效地抑制体外培养的人肝癌细胞的生长，并可以明显刺激鼠肝细胞DNA的合成。结果表明rhHGF基因在宿主细胞中得到正确的转录和翻译，并将有生物活性的表达产物分泌到培养基中。

本发明的关键之一在于选用带有强启动效应的巨细胞病毒启动子的pRC/CMV作为载体，并选用限制性内切酶BamHI和XbaI将rhHGFcDNA序列定向重组于真核细胞表达性载体pRC/CMV中，获得了真核表达质粒pRC/CMV-rhHGF；关键之二在于本发明分别选用了细胞株稳定、表达效率高的CHO和易成活、生活周期短、生长速度快的NRK作为宿主细胞；关键之三在于用G418筛选转染阳性细胞。

下面所列实施例是为便于对本发明的理解而非任何限制性目的。

实施例1.hHGF真核表达质粒的构建

1.hHGF基因片段的制备：

用BamHI和XbaI消化PBS^KS-HGF质粒，电泳证实酶切完全后，用低熔点胶回收其中的2.2kb长的DNA片段。微型胶定量，调节DNA浓度为0.1μg/μl。

2.载体pRC/CMV的制备：

pRC/CMV质粒5μg，在50μl反应体积中，用BamHI/XbaI各1μl消化5小时，取6μl电泳观察酶切情况，用0.8％低熔点胶分离5.44kb的区带，回收纯化后调节浓度为0.3μg/μl。

3.基因片段与线性化pRC/CMV的连接、转化及阳性克隆的筛选：

取HGF DNA片段0.6μg和线性化pRC/CMV载体0.4μg，(两者摩尔比3∶1，DNA总量1μg)，混匀，42℃水浴15分钟，冰浴冷却后加4μl 10×连接反应缓冲液，2μlT₄DNA连接酶，用双蒸水补足20μl反应体积，16℃反应12小时。取7μl连接反应混合物转化JM₁₀₅，将50-100μl转化菌液涂布于Amp阳琼脂板上，37℃温育过夜后，筛选阳性菌落。

4.pRC/CMV-HGF的筛选与鉴定：

选取3-5个单菌落接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，进行质粒的小量快速抽提。获得质粒后，从每份样品中取0.5-1μg DNA，进行内切酶分析。经过酶切鉴定分析，HGF基因插入位点和方向完全正确，该质粒的结构完全符合设计要求。

挑选含有正确重组质粒的转化菌株，大量扩增，经质粒抽提和纯化后，-20℃保存备用。

实施例2.hHGF蛋白质在真核细胞中的表达

1.细胞培养

用三蒸水配制细胞培养液(含DMEM培养基；三抗：100u/ml青霉素，100mg/ml链霉素，3mg/ml两性霉素；10％小牛血清)，在37℃、5％CO₂浓度条件下分别培养NRK、CHO细胞，一般第72-96小时传代一次，但不同的细胞情况不完全一样。传代时，用pH7.2的PBS冲洗细胞，适量0.25％胰酶消化1-3分钟(不同细胞株对胰酶的耐受性不同)，待细胞尚未脱壁时，弃去胰酶，加少量含血清培养基，吸管吹打制成细胞悬液，根据实验需要，按不同密度分装入新的培养瓶，补足培养基，常规培养。

2.培养细胞外源基因转染

采用磷酸钙-DNA共沉淀法。

1).转染前20小时传代细胞，以2×105/cm2密度接种于60mm直径平皿中培养，待细胞铺满平皿85-90％时进行转染，转染前4-6小时须更换培养液。

2).制备磷酸钙-DNA沉淀：先将10μl 0.1×TE的DNA溶液(含DNA浓度0.9μg/μl)及125μl 2×HBS(50mM Hepes、280mM NaCl、15mM Na₂HPO₄、10mM KCl、12mM Glucose，pH5.68)混匀后，缓慢沿壁加入18μl 2mol/L CaCl₂边加边摇，室温放置10-15分钟。

3).欲转染细胞吸去旧培养液，用无菌滴管加上述DNA沉淀液于细胞层上，室温孵育10分钟，再将原培养液加回平皿中，37℃、5％CO₂培养6-12小时(NRK、CHO不同)，吸出沉淀液，PBS洗细胞二次，更换新鲜培养基(含10％胎牛血清)继续培养48-72小时。

4).抗性转染细胞株的筛选

采用G418抗性筛选法，培养48-72小时的转染细胞1∶2传代，生长至50-70％融合时，加G418至终浓度200mg/ml，以后每12小时增加一次剂量，最终达600-800mg/ml，3-4天更换一次培养基，去除死亡细胞。待大部分细胞死亡后，G418浓度可降为200mg/ml以维持筛选作用。约10-14天，可见细胞克隆或集落。同时，用未转染细胞作阴性对照。

实施例3  表达产物生物活性测定

方法：

1).表达细胞液的收集：将阳性克隆扩大培养，常规传代，生长到50-70％融合时，更换不含G418的培养基，融合状态后继续培养24-48小时。收集培养基于无菌离心管中，800-1000r/min离心10分钟，取上清培养基分装后-20℃保存，用作条件培养基。

2).肝癌细胞生长曲线观察：HCC-7902常规培养至融合，0.25％胰酶消化3分钟，制成单细胞悬液，，以104个细胞/孔的密度接种24孔板。分别设置实验组和对照组。实验组按30％体积比加入转染阳性细胞培养液，对照组则加入同等体积的未转染细胞培养液。两组细胞分别又分成5个小组，每小组含3个平行孔。37℃、5％CO₂培养，每天更换一次培养基。接种后，每隔48小时，两组细胞各检测其中一个小组，进行细胞计数。计数前每孔加150μl胰酶，准确消化3分钟后加500μl培养基终止消化，吸管反复吹打，以细胞计数板计数，每孔计数3次，每计一次数3遍，计数后的细胞弃去。

结果：

转染细胞表达产物HGF生物活性的测定

本发明分别用肝癌细胞HCC-7902和原代培养的成年大鼠肝细胞对HGF进行活性检测。

(一)肝癌细胞生长曲线的观察

HCC-7902单细胞悬液，以104/孔细胞数接种24孔板。实验组每孔加30％(V∶V)的条件培养基，对照组加未转染的细胞培养基，分别于接种后48h，96h……计数细胞。同时观察了两种转染细胞培养基的作用(图1、图2)。

注：每个点设3个平行孔，每孔计数3次，每次数三遍，因此每点由27个计数值平均求得。

由图1和图2可以看出，未转染细胞培养基组生长曲线呈“S”型，细胞经48～72小时潜伏期后进入指数生长期，细胞生长旺盛，数量倍增明显，细胞数量在整个生活周期中增加不明显，生长曲线呈低平状，表明细胞生长受到明显抑制。倒置显微镜下细胞生长状态两组亦有区别。

(二)转染细胞表达上清对原代培养鼠肝细胞DNA合成的影响

结果见图3。

在无血清培养条件下，肝细胞培养基中加入转染阳性及未转染细胞的培养基，结果显示，经转染阳性细胞培养基处理的肝细胞组，其cpm值显著高于未转染组。发明优点：

本发明的优点在于对哺乳动物细胞体系表达rhHGF的可能性进行了探索，构建了rhHGF真核表达性质粒，并成功地在CHO、NRK中获得了高效表达，为基因工程生成rhHGF提供了重要的工程细胞株。这对于大量制备rhHGF并研究肝细胞生长调控，肝特异性蛋白的表达等基础领域方面有着重要的意义和价值。

附图说明：

图1—HCC-7902生长曲线

    其中：A—野生NRK细胞培养基组

          B—转染NRK细胞培养基组

图2—HCC-7902生长曲线

    其中：A—野生CHO细胞培养基组

          B—转染CHO细胞培养基组

图3—转染NRK细胞培养基对原代培养成年大鼠肝细胞DNA合成的影响

    其中：A—转染NRK细胞培养基

          B—未转染NRK细胞培养基

Claims (5)

1.一种用真核表达体系制备肝细胞生长因子rhHGF蛋白质的方法，其特征在于所说的方法包括以下步骤：hHGF基因的获取，rhHGF表达载体pLX008的构建和rhHGF在真核细胞中的表达及分离纯化。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于hHGF基因的获取，是用BamHI和XbaI完全酶切含有人HGFcDNA全序列基因片段的PBS^KS-HGF(由美国著名科学家闫占清馈赠)，获得了长2.2kb的rhHGF cDNA完整序列。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于真核表达质粒的构建，是选用带有强启动效应的巨细胞病毒启动子的pRC/CMV作为载体，并选用限制性内切酶BamHI和XbaI将rhHGFcDNA序列定向重组于真核细胞表达载体pRC/CMV中，获得了真核表达质粒pRC/CMV-rhHGF。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于选用了细胞株稳定、表达效率高的CHO和易成活、生活周期短、生长速度快的NRK作为宿主细胞；

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于rhHGF的表达，采用G418抗性筛选法，筛选两种细胞有阳性克隆出现后，将细胞克隆扩大培养，之后常规传代，待生长到50-70％融合时，更换不含G418的培养基，呈融合状态后继续培养24-48小时，收集培养基于无菌离心管中，800-1000r/min离心10分钟，取上清培养基分装后-20℃保存，用作条件培养基。

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