CN1840682A

CN1840682A - 用基因工程方法大量生产高活性的胸腺素a1

Info

Publication number: CN1840682A
Application number: CNA2005100599061A
Authority: CN
Inventors: 许松山; 宣锺健; 马素永; 聂李亚
Original assignee: Beijing Northland Biotech Co Ltd
Current assignee: Beijing Northland Biotech Co Ltd
Priority date: 2005-04-01
Filing date: 2005-04-01
Publication date: 2006-10-04

Abstract

本发明涉及一段能在细菌体内大量稳定表达、存在的蛋白与天然胸腺素a1形成的，能在大肠杆菌中进行高产量可溶表达的融合蛋白，以及由上述融合蛋白酶切加工后产生的具有高生物活性的胸腺素a1衍生物。本发明可以使该融合蛋白在大肠杆菌中得到稳定高效的表达。经过表达后的前体蛋白经过切割加工后，得到了超高效生物活性的有效成分蛋白，可用于癌症的辅助治疗。

Description

用基因工程方法大量生产高活性的胸腺素a1

一.技术领域

本发明属于重组蛋白质药物生产领域。通过对前体融合蛋白的基因工程构建，实现了目的蛋白的高效表达，该方法具有表达量高，操作简便，成熟蛋白活性高的特点。

二.背景技术

免疫系统是人体的防御系统。参于免疫反应的主要细胞有T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞。而胸腺是T淋巴细胞发育、分化的免疫中枢器官。胸腺分泌的胸腺因子(或激素)是T淋巴细胞发育分化所需的一系列必需物质，其中胸腺素α1(Tα1)是现已结构和功能较为明确的一种主要的胸腺因子。

Tα1是Goldstein等最早从小牛胸腺中提取的胸腺素组分5(TF5)中分离出来的一种多肽，含28个氨基酸，分子量3.108KD，等电点4.2，无二硫键与糖基化。Tα1的氨基酸序列与原胸腺素α的N端一致，后者是Haritos等从大鼠胸腺中分离出来的，含109～112个氨基酸，不同种属，不同组织来源的原胸腺素α基因序列略有异。Tα1是一种免疫活性肽，它主要作用于胸腺细胞成熟的早期和晚期，可增加T细胞表面Thy-1，Thy-2.3和Lyt-1.2.3表达，能促进T淋巴细胞的增殖，提高淋巴细胞产生干扰素和白介素2等细胞因子的能力，提高机体抗菌和抗感染的能力。因此胸腺素α1是一种重要的免疫调节剂和增强剂。临床上主要作为原发性或继发性免疫功能缺陷病，肿瘤和慢性活动性肝炎的免疫调节剂，其安全性和有效性已经超万例临床应用所证实，长期使用，无蓄积性，无抗原性，并得到国内外相关领域专家的公认。

目前，Ta1的生产主要是来源于生物提取、化学合成、基因工程。其中，生物提取得到的Ta1纯度最低安全隐患最大；化学合成方法中原料药采用固相合成法制成，用高效液相色谱提纯精制，纯度在95％以上，制剂有效成份稳定均一。这种制备方法对原料纯度要求高，合成仪器和设备投资大，生产工艺(合成和化学修饰等)复杂，产品活性较低，成本高等不足；基因工程方法用生物工程技术构建胸腺素α1基因表达载体，在大肠杆菌中表达，经分离纯化而制成，得到的产品纯度与活性高，但由于小肽分子表达后易被降解且不易被检测，其产率和收率均达不到产业化要求。

三.发明内容

本发明的特点是利用一段能在细菌体内大量稳定表达、存在的蛋白作先导。将Tα1在表达过程中带出来，产生“Tα1人工前体蛋白”，再经过体外酶切回收，得到高纯度的Ala-Tα1，且Ala-Tα1与Tα1相比较生物活性相当。但在生产成本上远低于化学合成方法和常规的基因工程表达方法。首先，我们选用的先导蛋白是谷脱甘肽转硫酶(GST)的一段，而这段蛋白在大肠杆菌BL21的胞质中，能大量的以可溶形式稳定存在，比GST完整序列可溶形式表达、存在率高1-2倍，最大量约为菌体蛋白总量的45％-60％。刚好Tα1不能在大肠杆菌内大量可溶表达的原因，很有可能是它本身的结构以及种属关系，不能在大肠杆菌内高产量表达，这就大大降低了产量及增加了生产工艺难度。当我们把Tα1接到先导蛋白后面以后，发现“Tα1人工前体蛋白”也可以在大肠杆菌内超量表达且以可溶性形式存在。又因为我们选用的这段先导蛋白，在一定条件下仍能与谷脱甘肽亲和柱结合，这就进一步提高了生产量、减少工艺难度，从而降低生产成本，使用这套工艺使得1g湿菌体可最终得到约1mg成品蛋白Ala-Tα1，纯度大于98％。虽然终产品的N未端多了一个Ala，但是它是小分子氨基酸不会对Tα1结构产生影响，这点从生物活性上的恒定可以看出。本发明生产的Ala-Tα1与化学合成的Tα1(迈普新)活性相当或高于它。发明通过表达Tα1人工前体蛋白的方法，在大肠杆菌内高效生产人Tα1使生产成本大大降低。更利于取代化学合成的Tα1。

本发明中Ta1人工前体的产生及Ala-Tα1的制备方法为：先以Ta1氨基酸序列为模板选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成Tα1DNA序列且在N、C末端加上限制性酶切位点，以GST氨基酸序列为模板选用大肠杆菌偏好密码子全基因合成先导肽DNA序列且在N、C末端加上限制性酶切位点，再将先导肽、Tα1以及筛选质粒pBSK用限制性内切酶处理好，经计算各样品浓度后按一定摩尔比加入T4连接体系。经转化、筛选出一成功重组子命为PSK-T。用限制性酶切下融合蛋白基因，再将该基因与用限制性酶处理好的本公司质粒PGM连接，经筛选得到正确重组子命名为PGMT。将PGMT转化到表达宿主菌BL21中，经表达筛选出高表达工程菌PGMT/BL21，然后在30升发酵罐中对PGMT/BL21进行高密度发酵，经12小时发酵，最终得到目的蛋白表达量占菌体总蛋白量60％(见图1)的工程菌体湿重约100g/L，再经离心得到含目的前体蛋白上清液，将上清液上样到GST亲和柱上，通过柱中在位酶切、洗脱得到纯度大于85％的目的蛋白，再将样品通过阴离子柱，使得最终蛋白纯度大于95％。用E玫瑰药结实验对样品进行生物活力测试：首先分离健康人外周血单核细胞，使用小牛血清调整细胞数至2×10-6/ml。各取200μl细胞液加入EP管中，再分别加入等量的测试样品Ala-Tα与日达仙，37℃水浴90分钟，每支EP管中加入200μl，绵羊红细胞(2×106/ml)，4℃放置3小时，涂片、染色后放于高倍镜下计数200个，淋巴细胞中形成玫瑰花结的细胞数(结合3或以上的为一个玫瑰花结)。计算玫瑰药形成细胞的百分数。按以下公式计算激活率。

经测试，本发明生产的Ala-Tα活性大于化学合成Ta1。

从结果可以看出，本发明在不降低生物活性的基础上大大提高Ala-Ta1的生产量、降低生产成本，有利于最终取代Ta1的化学合成，从而减少由于生产Ta1给自然界带来的污染。

四.具体实施方式

1.胸腺素a1前体蛋白表达质粒的构建与工程菌的获得

首先通过全基因和成扩增出胸腺素a1前体蛋白的全基因序列，设计如下：

GGA TCC CCG CGT GCG TCG GAT GCG GCC GTG GAT

ACC TCG TCG GAA ATT ACC ACG AAA GAT CTG AAA

GAA AAA AAG GAA GTG GTT GAA GAG GCG GAA AAT

TAA TGA CTC GAG

以GST基因为模板，PCR扩增获得500bp左右的产物，经测序质粒克隆、基因测序，得到设计序列备用。

目的片段经BamH I、EcoR I、XhoI双酶切后分别回收小片段，质粒PGM经XhoI和EcoRI双酶切后回收大片段，18℃在T4连接酶体系中三段目的基因片断进行连接，经筛选得到的重组质粒命名为PGMT。然后用CaCl₂法转化大肠杆菌BL21，涂布在含有50ug/ml卡那霉素的LB平板，挑选阳性菌落在LK中培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时加入IPTG 0.1mM诱导3-4小时离心收集菌体，8M尿素破菌后15％SDS-PAGE电泳时出现一条18KD左右的蛋白带，表达量为40％。经胸腺素a1的单克隆抗体免疫印迹检定，显示阳性反应。所获得的高效表达胸腺素a1前体蛋白的工程菌命名为PGMT/BL21。

2.发酵

1).摇瓶表达：含胸腺素a1前体蛋白基因的PGMT/BL21，在含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中摇瓶过夜(37℃，200rpm)，再按1∶30接种含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3小时后，加入0.1mM IPTG诱导4小时。收集菌体经SDS-PAGE电泳分析，发现含胸腺素a1前体蛋白(20KD)以可溶性表达为主，表达量占菌体总蛋白的60％。

2)发酵工艺：

a.培养基：

a)种子液培养基(LK)：

胰蛋白胨：10克/升、酵母粉：5克/升、氯化钠：10克/升、卡那霉素：50微克/毫升。

b)种养基(15升)：

磷酸氢二钠：315克、磷酸二氢钾：100克、氯化钠：10.05克、氯化铵：50克、胰蛋白胨：90克。

以上成分一起在罐中灭菌；下面的成分单独灭菌后加入发酵罐。

硫酸镁：15克、葡萄糖：450克、补料(500克/升)：葡萄糖

b.发酵过程：

1.种子培养：

从已鉴定的平皿上划取菌种，接种到50毫升(250毫升的三角瓶)LC中，36度、200转/分、8小时后将这50毫升种子液转接到700毫升LC中，36度、200转/分，过夜。

2.发酵过程：

将培养好的种子液(od600＝3-4)加入罐中，调好各参数，36度、150转、溶氧100％，开始发酵；5小时后开始以2.5速流加2小时，约加入800毫升补料，加入1克IPTG诱导(三小时)。

2.层析：

(1)亲和层析

采用GSH-Agrose层析介质(Sigma公司)，平衡液采用25mM Tris-HCl，pH8，上样平衡后，裂菌的离心上清上Glutathione Sepharose层析柱，平衡后用含10mM还原型谷胱甘肽(GSH)的洗脱液洗下融合蛋白。

(2)酶解

上一步的洗脱液加入凝血酶(5NIHU/mL)37℃酶切2小时。

(2)阴离子交换层析

采用Source30Q层析介质，平衡液为20mM PB，pH7，上一步得到的样品用水稀释1倍进行上样，平衡后采用20mM PB，pH7，0-1M NaCl的梯度洗脱，收集目的蛋白洗脱峰。

3.检测

得到的胸腺素α1通过SDS-PAGE纯度检测和反相HPLC检测，纯度大于95％。

4.活性检测

E玫瑰药结实验对样品进行生物活力测试

基础细胞培养液：1640基础培养基10.0g，NaHCO₃2.2g，Hepes5.9g，丙酸钠0.11g，0.05M巯基乙醇2.0ml，ddH₂O 1000ml；细胞培养基：基础细胞培养基90ml，小牛血清10ml，双抗(青霉素+链霉素)100U/ml，谷胱甘肽0.03g/ml；测活培养基：基础培养基95ml小牛血清5.0ml，双抗及谷胱甘肽浓度与上相同。过滤灭菌；裂解液：SDS 10g，，DMSO 25ml，ddH2O 19ml，调PH＝4.7。

方法：首先分离健康人外周血单核细胞，使用小牛血清调整细胞数至2×10-6/ml。各取200μl细胞液加入EP管中，再分别加入等量的测试样品Ala-Tα与日达仙，37℃水浴90分钟，每支EP管中加入200μl，绵羊红细胞(2×106/ml)，4℃放置3小时，涂片、染色后放于高倍镜下计数200个，淋巴细胞中形成玫瑰花结的细胞数(结合3或以上的为一个玫瑰花结)。计算玫瑰药形成细胞的百分数。

按以下公式计算激活率。

样品对E玫瑰花结形成率的影响

	E玫瑰花结形成数	激活率
	E玫瑰花结形成数	激活率	阴性对照	38.5±1.00	0
Ala-Ta1(10ug/ml)	55.3±1.07^**	43.6％	阴性对照	38.5±1.00	0
Ala-Ta1(10ug/ml)	55.3±1.07^**	43.6％	Ta1(10ug/ml)	52.6±1.76^**	36.6％

N＝5，^**P＜0.01，与对照比

由上表可知，Ala-Ta1可显著提高人外周血淋巴细胞E玫瑰花结形成数量，且作用大于合成的Ta1。

Claims

1.一种用融合表达的方式生产胸腺素a1的方法，其特征为一段能在大肠杆菌胞质中超量稳定表达、存在的蛋白与28个氨基酸的胸腺素a1融合后在大肠杆菌胞质中超量稳定表达；该前体融合蛋白经发酵、酶切、纯化后得到高活性的成熟蛋白29肽胸腺素a1衍生物氨基酸序列为：Ala-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn。

2.权利要求1中的前体蛋白以大肠杆菌或酵母为宿主菌用基因工程的方法进行可溶性表达。