WO2012144799A2

WO2012144799A2 - 활성 폴리펩타이드의 결합 친화력 및 결합 특이성을 증강시키는 단백질 골격 모듈

Info

Publication number: WO2012144799A2
Application number: PCT/KR2012/002958
Authority: WO
Inventors: 차기원; 소인섭; 김소연; 이병헌; 김인산
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2011-04-18
Filing date: 2012-04-18
Publication date: 2012-10-26
Also published as: KR20120118186A; JP6050319B2; EP2700649A4; EP2700649A2; WO2012144799A3; KR101818759B1; JP2014519313A; CN103703022A; EP2700649B1; US20140079643A1; US8975369B2

Abstract

본 발명은 활성 폴리펩타이드의 결합 친화력 또는 결합 특이성을 증강시키는 신규한 단백질 골격 모들에 관한것으로， 보다 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 19번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드; 활성폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드; 및 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 29번째 내지 86번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 골격 모들 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 단백질 골격 모들은 내장된 활성 폴리펩타이드의 결합 친화력 또는 결합 특이성을 증강 시키므로 질병의 진단 및 치료에 효과적이다.

Description

【명세서】

【발명의 명칭】

활성 폴리펩타이드의 결합 친황력 및 결합 특이성을 증강시키는 단백질 골격 모들

[기술분야】

<ι> 본 출원은 2011년 04월 18일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10_2011-0035613 호를 우선권으로 주장하고， 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.

<2>

<3> 본 발명은 활성 폴리펩타이드의 결합 친화력 또는 결합 특이성을 증강시키는 신규한 단백질 골격 모듈에 관한것으로 1， 보다 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 19번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드; 활성 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드; 및 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 와 29번째 내지 86번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 골격 모듈 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

<4>

【배경기술】

<5> 단백질의 아미노산 서열과 2차, 3차 구조를 분석하면 많은 단백질들이 독립 적인 도메인 (domain, 또는 module)으로 구성되어 있다. 도메인은 구조적 기능적 독립적인 단위이다. 동일한 도메인은 여러 단백질에 하나 이상으로 분포될 수 있으 며， 하나의 단백질은 여러 도메인으로 구성될 수 있다. 도메인의 구쩨적인 정보는 Prosite (Hulo N 등， Nucleic Acids Res, 36:D245-249, 2008； Website: http://kr.expasy.org/prosite/)， SMART(Letunic I 등， Nucleic Acids Res, 34:D257-D260, 2006; Website: http://smart .embl— heidelberg.de/)등의 생물정보학 웹사이트에서 탐색할 수 있다.

<6>

<7> 생체분자간 상호작용 (예， 단백질-단백질， 단백질-핵산， 등)은 세포의 생장， 분화， 발달， 세포간 /내에서의 신호 전달, 물질이동 등 다양한 생명현상올 일으키는 중요한 기능을 한다. 기존에 표적분자에 특이적으로 결합하여 생물학적 활성을 조 절하는 분자로서, 항체 (전체 또는 절편)가 주도적으로 개발되어져 왔다. 하지만， 항체의 문제점은 발현 양이 적고， 용해도가 낮으며， 동물세포 발현 세포주을 써야 하고， 정제비용이 비싸고， 환원적 세포내 환경에서 안정성이 떨어지는 여러 문제 등이 있다. 따라서， 항체의 문제점을 극복하면서 항체처럼 표적분자 (targeted mol ecules)에 특이 적으로 결합하는 특성을 지닌 항체외 단백질 개발이 시급한 실정 이다 .

<8>

<9> 암이나 동맥경화의 진단 및 치료에 사용하기 위하여 페이지 디스폴레이등의 방법으로 발굴된 펩타이드는 낮은 결합력， 비안정성， 고면역성 등의 한계가 있다 . 이 러 한 문제점을 극복하고 활성 펩타이드를 인체내에서 결합력과 안정성을 높이면 서 면역성을 낮출 수 있는 새로운 기술의 개발이 필요하다.

<10>

【발명 의 상세한 설명】

【기술적 과제】

<1 1> 이에 본 발명자들은 인체유래 단백질 중 일부분을 선택， 최 적 변형하고， 활 성 펩티드를 삽입 하는 경우 활성 폴리펩타이드의 결합 친화력 또는 결합 특이성 이 증강되는 등 기존의 펩티드 제제 및 항체 제제를 대체할 수 있는 우수한 성 질을 나 타내는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

<12>

<13> 본 발명의 다른 목적은 a) 서 열번호 1로 표시되는 아미노산 서 열의 1번째 내 지 19번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 ;

<i4> b) 활성 폴리펩타이드를 포함하는 폴리 펩타이드 및

<i 5> c) 서 열번호 1로 표시되는 아미노산 서 열의 29번째 내지 86번째 아미노산 서 열로 이루어진 폴리펩타이드가 순차적으로 연결된 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들을 제공하는 것 이다.

<\6>

<17> 본 발명의 다른 목적은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들 을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것 이다.

<18> 본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 백터를 제공 하는 것이다 .

<19> 본 발명의 다른 목적은 상기 발현 백터로 형 질전환 된 숙주세포를 제공하는 것이다 .

<20> 본 발명의 다른 목적은 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 활성 폴 리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

<21> 본 발명의 다른 목적은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들 을 유효성분으로 포함하는 진단용 조성물을 제공하는 것이다. <22> 본 발명의 다른 목적은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈 을 이를 필요로 하는 개체에 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 진단 방법을 제 공하는 것이다.

<23> 본 발명의 다른 목적은 진단용 제제의 제조를 위한 상기 활성 폴리펩타이드 가 내장된 단백질 골격 모들의 용도를 제공하는 것이다.

<24> 본 발명의 다른 목적은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들 을 유효성분으로포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

<25> 본 발명의 다른 목적은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들 을 유효성분으로포함하는 진단용 키트를 제공하는 것이다.

<26>

<27> 본 발명의 다른 목적은 a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내 지 19번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드;

<28> b) 서열번호 3으로 표시되는 AP-l(activator protein 1)의 아미노산 서열를 포함하는 폴리펩타이드 및

<29> c) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 29번째 내지 86번째 아미노산 서 열로 이루어진 폴리펩타이드가 순차적으로 연결된 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들을 제공하는 것이다.

<30> 본 발명의 다른 목적은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들 을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

<31> 본 발명의 다른 목적은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들 을 유효성분으로 포함하는 암 또는 동맥경화 진단용 조성물을 제공하는 것이다. <32> 본 발명의 다른 목적은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들 을 이를 필요로 하는 개체에 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 동맥경 화 진단 방법을 제공하는 것이다.

<33> 본 발명의 다른 목적은 암 또는 동맥경화 진단용 제제의 제조를 위한 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈의 용도를 제공하는 것이다.

<34> 본 발명의 다른 목적은 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들을 유 효성분으로 포함하는 암또는 동맥경화 진단용 키트를 제공하는 것이다.

<35>

【기술적 해결방법】

<36> 상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 서열번호 1로 표시되는 아미 노산서열의 1번째 내지 29번째 아미노산서열로 이루어진 폴리펩타이드; b) 활성 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 및

c) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 29번째 내지 86번째 아미노산 서 열로 이루어진 폴리펩타이드가 순차적으로 연결된 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 상기 활성 폴리펩타이드 가 내장된 단백질 골격 모들을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 를 포함하는 발현 백터를 제공한다.

본 발명의 다른 목적올 달성하기 위하여， 본 발명은 상기 발현 백터로 형질 전환 된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 상기 숙주세포를 배양하 는 단계를 포함하는 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들을 제조하는 방 법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 활성 폴리펩타이드 가 내장된 단백질 골격 모들을 유효성분으로 포함하는 진단용조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 활성 폴리펩타이드 가 내장된 단백질 골격 모들을 이를 필요로 하는 개체에 유효량으로 투여하는 단계 를 포함하는 진단 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 진단용 제제의 제조를 위한상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들의 용도를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 활성 폴리펩타이드 가 내장된 단백질 골격 모듈을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 상기 활성 폴리펩타이드 가 내장된 단백질 골격 모들을 유효성분으로포함하는 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 a) 서열번호 1로 표시되 는 아미노산서열의 1번째 내지 19번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드; b) 서열번호 3으로 표시되는 AP-l(activator protein 1)의 아미노산 서열를 포함하는 폴리펩타이드 및

c) 서열번호 1로 표시되는 아미노산서열의 29번째 내지 86번째 아미노산 서 열로 이루어진 폴리펩타이드가 순차적으로 연결된 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들을 제공한다. <52> 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 상기 활성 폴리펩타이드 가 내장된 단백질 골격 모들을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

<53> 본 발명의 다른 목적올 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 활성 폴리펩타이드 가 내장된 단백질 골격 모듈올 유효성분으로 포함하는 암 또는 동맥경화 진단용 조 성물을 제공한다.

<54> 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 상기 활성 폴리펩타이드 가 내장된 단백질 골격 모듈을 이를 필요로 하는 개체에 유효량으로 투여하는 단계 를 포함하는 암 또는 동맥경화 진단 방법을 제공한다.

<55> 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 암 또는 동맥경화 진단 용 제제의 제조를 위한 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들의 용도 를 제공한다.

<56> 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 활성 폴리펩타이드가 내 장된 단백질 골격 모들을 유효성분으로 포함하는 암 또는 동맥경화 진단용 키트를 제공한다.

<57>

<58> 이하， 본 발명을 상세히 설명한다.

<59>

<60> 본 발명은 a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 19번째 아 미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드; b) 활성 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타 이드 및 c) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 29번째 내지 86번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드가 순차적으로 연결된 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들 및 상기 활성 폴리펩 타이드가내장된 단백질 골격 모듈을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

<61>

<62> 본 발명의 단백질 골격 모듈은 내장되는 활성 폴리펩타이드의 결합 친화력 또는 결합 특이성을 증강시키는 특징이 있다. .

<63>

<64> 활성 폴리펩타이드는 대상 protein과의 접촉을 통하여 신호전달， 대상 protein의 activation, deactivation, phosphorylation 등 여러 작용을 하는 폴리 펩타이드를 말한다. 본 발명의 단백질 골격 모들은 내장되는 활성 폴리펩타이드의 결합 친화력 또는 결합 특이성을 증가시키는 방법으로 활성 폴리펩타이드의 활성을 증가시킨다. <65> 결합 친화력 (binding affinity)은 생체 분자간 결합하려는 성질의 강도를 말 한다.

<66> 결합 특이성 (binding specif icity)은 특정 생체 분자가 결합 대상 분자와만 특이적으로 결합하려는 성질을 말한다.

<67> 본 발명의 단백질 골격 모들은 생체내 면역 체계에 영향을 미치지 아니하며 활성 폴리펩타이드를 내장할 수 있는 단백질 구조체를 말한다. 본 발명의 단백질 골격 모들은 분자량이 작아 생체내 활동성이 우수하고， 내장되는 활성 폴리펩타이 드의 활성에 영향을 미치지 아니하며， 생체 내 면역 체계에 영향을 미치지 아니하 며， 생체 내에 풍부하게 존재하는 단백질에서 유래하여 개체별 효과의 차이나 개체 특이적 효과의 발생이 없어야 한다. 활성 폴리펩타이드를 내장하여 활성 폴리펩타 이드의 안정성 및 특성을 향상시키는 단백질 골격 모듈은 본 발명자들에 의하여 최 초로 개발된 것이며， DMID(Designed Modular Immunodi agnostics)라고 명명하였다.

<68>

<69> 본 발명의 활성폴리펩타이드는 약리활성을 가질 수 있으며， 활성 폴리펩타이 드가 내장된 단백질 골격 모들은 활성폴리펩타이드의 작용으로 내재된 약리활성을 보일 수 있다. 따라서， 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들은 활성폴리 펩타이드의 약리활성, 특히 증강된 효과의 약리활성을 가질 수 있기도 한다.

<70>

<7i> 본 발명의 단백질 골격 모들은 바람직하게는 Stabilin-2 유래 폴리펩타이드 단편을 기초로 디자인 돨수 있으며， 더욱 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아 미노산 서열 중 골격에 영향을 미치지 않는 부분에 활성 폴리펩타이드가 치환 또는 삽입 된 단백질 골격 모들일 수 있다.

<72>

<73> 본 발명의 일실시예의 단백질 골격 모들은 인간에 풍부하게 존재하는

Stabilin-2 유래 폴리펩타이드 단편을 기초로 디자인 되었다. Stabilin-2는 transmembrane 리셉터로 림브구 유도， 세포 부착, 리셉터 스카벤징， 혈관 생성에 관여한다. 이 단백질은 7 fasciclin, 16 epidermal growth factor (EGF)-like, 2 laminin-type EGF-1 ike domains, a C^~type lectinᅳ like hya 1 ur onan-b i nd i ng Link module등의 다양한 도메인올 가지고 있다.

<74>

<75> 한편 본 발명은 상기 단백질 골격 모들을 암호화 하는 폴라뉴클레오티드를 제공한다. <76> 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 활성 폴리펩타이드의 결합 친화력 또는 결합 특이성을 증강시키는 단백질 골격 모들을 암호화 하는 특징이 있다.

<77> 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖거 나 또는 상기 아미노산 서열과 적어도 70% 이상의 상동성 (homo logy)이 있는 아미 노산 서열을 갖는 단백질 골격 모들을 암호화하는 물질을 말하며， 상기 폴리뉴클레 오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있으며， 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 DNA일 수 있다.

<78>

<79> 또한 본 발명은 상기 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현 백터를 제 공하는 것을 특징으로 한다.

<80>

<81> 상기 발현백터는 당업자들이 당업계에 알려진 어떠한 방법에 따라 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 백터내로 삽입하여 적절한 전사 /해독 조절서열을 이용하여 본 발명의 단백질 골격 모들을 발현하도록 제조된 발현백터를 말한다.

<82> 본 발명의 "발현 백터"라는 용어는 본 발명의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레 오티드 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 당업계에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며， 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열 과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함 하고 있는 하나의 발현 백터 내에 포함될 수 있다. "작동 가능하게 연결 (operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가 능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. "발현 조절 서 열 (expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결 된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터， 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 m NA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

<83> 상기 본 발명의 단백질 골격 모들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 삽입할 수 있는 발현 백터로는 대장균 유래 플라스미드 (pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pET30a, pET30c 및 pGEX-GST), 바실러스 서브틸러스 유래 플라스미드 (pUBllO 및 ΡΤΡ5), 효모 유래 플라스미드 (ΥΕρ13, ΥΕρ24 및 YCp50) 및 Ti 플라스미드 등이 있 고， 레트로바이러스， 아데노바이러스 또는 백시니아바이러스와 같은 동물 바이러 스 , 배클로바이러스와 같은 곤층 바이러스 및 식물 바이러스가 사용될 수 있으며 , pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리 백터를 사용할 수 있다. 당업자라면 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열을 도입시키는데 적합한 백터를 선택할 수 있으 며, 본 발명에서는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열을 숙주 세포내로 도밉할 수 있는 백터라면 어떠한 백터라도 모두 사용할 수 있다. 그러나 바람직하게는 단백질 발현 유도 및 발현된 단백질의 분리가 용이하도록 디자인된 백터를 사용할 수 있 고， 보다 바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 백터인 pET32a 백터를 사용할 수 있다.

<84>

<85> 또한 본 발명은 상기 본 발명의 재조합 발현백터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

<86> 상기 형질전환된 숙주세포는 당업자들이 당업계에 공지된 방법에 따라 본 발 명의 재조합 발현백터를 이용하여 형질전환시킨 미생물일 수 있으며, 상기 미생물 은 이에 한정되지는 않지만 바람직하게는 대장균 (E. COli)일 수 있으며 가장 바람직 하게는 대장균 BL21또는 대장균 MC 1061일 수 있다.

<87> 상기 본 발명에 따론 재조합 백터를 숙주세포에 도입하여 형질전환하는 방법 으로는, 이에 한정되지는 않으나, 염화칼슘 (CaCl₂) 및 열 쇼크 (heat shock) 방법， 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커 (Silicon carbide whiskers) , 초음파 처리 (sonication), 전기천공법 (e'lectroporation) 및 PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법 등을사용할 수 있다.

<88> 다양한 숙주 -발현 백터 시스템을 활용하여 본 발명의 단백질 골격 모들을 발 현시킬 수 있다. 이러한 숙주 -발현 시스템은 목적하는 코딩 서열을 생성시키고 이 후 정제할 수 있는 비히클과， 또한 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질 전환 또 는 형질감염시， 본 발명의 단백질 골격 모들을 발생 부위에서 (in situ) 발현시킬 수 있는 세포를 의미한다. 이러한 시스템에는 이에 제한되는 것은 아니고, 미생물， 예컨대 본 발명의 단백질 골격 모들 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA또는 코스미드 DNA 발현 백터로 형질전환된 박테리아 (예를 들 어， 이.콜라이 및 비.서브 틸리스); 단백질 골격 모들 코딩 서열을 함유하는 재조 합 효모 발현 백터로 감염된 효모 (예를 들어, 사카로마이세스 (Saccharomyces), 피 키아 (Pichia)); 단백질 골격 모들 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 백 터 (예를 들어， 배클로바이러스)로 감염된 곤층 세포 시스템; 단백질 골격 모듈 코 딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 백터 (예를 들어， Ti 플라스미드)로 형 질전환되거나 또는 재조합 발현 백터 (예를 들어， 칼리플라워 모자이크 바이러스，

CaMV; 담배 모자이크 바이러스， TMV)로 감염된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈에서 유래한 프로모터 (예를 들어， 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유 동물 바이러스에서 유래한 프로모터 (예를 들어， 아데노바이러스 후기 프로모터; 백 시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구성체를 보유하는 포유 동물세포 시스템 (예를 들어， COS, CHO, BHK, 293, NS0 및 3T3 세포)을 포함한다.

<89>

<90> 본 발명의 단백질 골격 모듈은 내장된 활성 폴리펩타이드의 결합 친화력 또 는 결합 특이성을 증강시키는 특징이 있으며， 이러한 활성 폴리펩타이드의 내장은 상기 단백질 골격 모듈에 내장시킬 활성 폴리펩타이드를 암호화 하는 폴리뉴클레오 티드의 특정 부위에 활성 폴리펩타이드를 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 삽입시 켜 발현하는 방법으로 할 수 있다.

<91>

<92> 또한 본 발명은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 암호 화 하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 백터 및 상기 발현 백터로 형질전환 된 숙주세포를 제공한다.

<93> 상기 발현 백터 및 숙주세포는 전술한 바와 같다.

<94> 상기 숙주세포는 바람직하게는 E. COl i일 수 있다. .

<95>

<96> 한편 본 발명은 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 활성 폴리펩타이 드가 내장된 단백질 골격 모들을 제조하는 방법을 제공한다.

<97> 본 발명의 방법에 의하면 결합 친화력 또는 결합 특이성이 증강된 활성 폴리 펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들이 효율적으로 생산할 수 있다.

<98>

<99> 본 발명의 방법에 의해 제조된 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모 듈은 단백질 정제를 위해 당분야에 공지된 임의의 방법， 예를들어， 크로마토그래피 (예를 들어， 금속-킬레이트 크로마토그래피, 이온 교환 친화성 및 크기 컬럼 크로 마토그래피 등)， 원심분리， 차둥 가용성 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표 준 방법으로 정제할 수 있다.

<100>

<101> 본 발명의 결합 친화력 또는 결합 특이성이 증강된 활성 폴리펩타이드가 내 장된 단백질 골격 모들은 활성 폴리펩타이드 단독일 때 보다 타겟 물질에 대한 결 ■ 합 친화력 또는 결합 특이성이 높다.

<102>

<103> 한편 본 발명의 단백질 골격 모들에는 공지의 검출방법에 사용되는 표지물질 등을 추가로 부착할 수 있다.

<104> 또한 본 발명의 단백질 골격 모들에는 활성 폴리펩타이드의 결합 대상 타겟 에 유효한 물질 등을 추가로 부착할 수 있다.

<105> 예를 들어 본 발명의 단백질 골격 모들에는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 인간 혈청 알부민 (HSA), 항체의 Fc 영역， IgG 분자， 세포독성 약물, 방사성 동위원소， 조영제， His-태그, 비오틴, Flag-태그, 핵산， 또는 사이토카인 등이 추가로 부착될 수 있다.

<106>

<107> 따라서 본 발명은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들을 유 효성분으로 포함하는 진단용 조성물을 제공한다 .

<108>

<109> 아울러， 본 발명은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들을 이 를 필요로 하는 개체에 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 진단 방법을 제공한 다.

<110>

<ιιι> 또한 본 발명은 진단용 제제의 제조를 위한 제 1항의 활성 폴리펩타이드가 내 장된 단백질 골격 모들의 용도를 제공한다.

<112>

<113> 본 발명에서 '유효량'이라 함은 본 발명의 조성물 또는 제제가 투여 대상인 개체 내에서 질환을 진단하는 또는 진단에 필요한 정보를 제공하는 효과를 나타내 는 양을 말하며, 상기 '개체 (subject)'란 동물， 바람직하게는 포유동물， 특히 인간 을 포함하는 동물일 수 있으며， 동물에서 유래한 세포, 조직， 기관 등일 수도 있 다. 상기 개체는 진단이 필요한 환자 (patient)일 수 있다.

<114>

<115> 본 발명의 조성물은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들

0.001 내지 99.999중량 % 및 잔량의 담체를 포함하는 조성을 가질 수 있다.

<116>

<117> 본 발명에서 진단용 조성물은 본 발명의 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다. <Π8> 본 발명에서 진단은 활성 폴리펩타이드의 타겟 물질의 유무， 분포， 양 등을 알아낼 수 있으며， 이를 바탕으로 관련된 질병의 유무， 진행 상태를 판단하는 것을 의미한다 .

<Π9> 예를 들어， IL-4 receptor는 여러 가지 인간 암 (대장암, 폐암, 자궁암 및 유방암)에서 과발현한다. 본 발명의 AP-1이 내장된 단백질 골격 모들의 경우 IL-4 receptor와 결합력을 가지므로 상기 암 진단 및 치료에 웅용이 가능하다.

<120> 단백질의 존재 여부와 그 양 및 /또는 패턴을 측정하는 방법으로는， 웨스턴 블릿 ·, EL ISA (enzyme linked immunosorbent assay) , 방사선 면역분석 (Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radioi圆 unodi f fusion)， 오우크테를로나 (Ouchterlony) 면역 확산법， 로케트 (rocket) 면역 전기영동， 조직면역 염색， 면역 침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay) , 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay) , FACS, 단백질 칩 (protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

<121> 상기 단백질의 존재여부와 그 양 및 /또는 패턴을 측정하기 위하여 통상 2차 항체 에 연계된 검출 라벨 (detection label)의 시그널의 크기 및 패턴을 검출함으로써 측정이 가능하다.

<122> 이러한 검출 라벨은 효소， 형광물， 리간드, 발광물， 미소입자, 레독스 분자， 방사선 동위원소 등을 예로 들 수 있으나， 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검 출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제， β- D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제， 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스 파타아제， 아세틸콜린에스테라제， 글루코즈 옥시다제， 핵소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제, 루시페라제, 포스포프럭토키나제， 포스포에놀피루베이 트 카복실라제， 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실 라제 , β-라타마제 등이 있으나， 이로 제한되지않는다.

<123> 검출 라벨로서 형광물이 사용되는 경우 이용 가능한 형광물에는 플루오레신， 이소티오시아네이트， 로다민, 피코에리테린， 피코시아닌， 알로피코시아닌, 0-프탈 데히드, 플루오레스카민 등이 있으나， 이로 제한되지 않는다. 검출 라벨로서 리간 드가 사용되는 경우 이용 가능한 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으나， 이로 제한되지 않는다. 검출 라벨로서 발광물이 사용되는 경우 이용 가능한 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린， 루시퍼라아제 등이 있으나， 이로 제한되지 않는 다. 검출 라벨로서 미소입자가 사용되는 경우 이용 가능한 미소입자에는 콜로이드 금， 착색된 라텍스 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.

<124> 검출 라벨로서 레독스 분자가 사용되는 경우 이용 가능한 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물， 바이올로젠， 퀴논， Ti 이온， Cs 이온， 디이미드， 1,4-벤 조퀴논, 하이드로퀴논， K4W(CN)₈, [0s(bpy)₃]²⁺ ， [RU(bpy)₃]²⁺, [M0(CN)₈]⁴—등이 있으 나, 이로 제한되지 않는다.

검출 라벨로서 방사성 동위원소가사용되는 경우 이용 가능한 방사성 동위원

, 3 14 32 35 36 51 57 58_^ 59 90 125 131 186 ^_ - 소에는 H, C, P, S, CI, Cr, Co, Co, Fe, Y, I， I 또는 Re 등이 있으나， 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 진단용 조성물은 활성 폴리펩타이드의 타겟 물질의 유무， 분포， 양 등을 알아낼 수 있으며， 이와 관련된 질병의 유무, 진행 상태를 판단 할 수 있 는 정보를 제공한다. 본 발명의 조성물은 본 발명의 단백질 골격 모듈에 내장되지 아니한 활성 폴리펩타이드가 포함된 진단용 조성물에 비하여 진단의 감도， 정밀도， 정확도가 뛰어나 진단능력이 뛰어나다. 따라서 본 발명은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들을 유 효성분으로 포함하는 진단용 키트를 제공한다.

상기 진단용 키트는 지지체， 적당한 완층용액， 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체， 발색 기질액 등을 더 포함할 수 있다. 상기 지지체는 니트로샐 를로오즈막， 폴리비닐수지로 합성된 96웰플레이트 (96 well plate), 폴리스티렌수지 로 합성된 96웰플레이트, 또는 유리로 된 슬라이드글라스 둥일 수 있고， 상기 발색 효소는 퍼옥시다아제 (peroxidase), 또는 알칼라인 포스파타아제 (alkal ine phosphatase) 둥일 수 있으며, 상기 형광물질은 FITC, 또는 RITC 등일 수 있고， 상 기 발색 기질액은 ABTS(2,2'-Az K)-bis(3-ethylbenzenzothiazoline-6-sulfonic acid)), OPD(o-Phenylenedi amine) , 또는 TMB Tetramethyl Benzidine) 등일 수 있 다. 또한 본 발명은 상기 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들을 유효 성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. ―

본 발명의 약학적 조성물은 활성 폴리펩타이드의 결합 타겟에 유효한 치료물 질， 세포독성 약물 등을 전달 할 수 있다. 약학적 조성물은 활성 폴리펩타이드의 종류에 따라 그 대상 질병 수 있다. 예를 들어 본 발명의 활성 폴리펩타이드로서 AP-1이 내장된 단백질 골격 모들을 유효성분으로 하는 약학적 조성물의 경우 여러 가지 인간 암 (대장암, 폐암， 자궁암 및 유방암)에서 과발현하는 IL-4 receptor에 결합하므로 이를 타겟으로 하 는 치료물질 또는 세포독성 약물 등의 전달이 가능하다.

<136>

<137> 따라서 본 발명은 a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 19 번째 아미노산서열로 이루어진 폴리펩타이드;

<i38> b) 서열번호 3으로 표시되는 AP-1( activator protein 1)의 아미노산 서열를 포함하는 폴리펩타이드 및

<i39> c) 서열번호 1로 표시되는 아미노산서열의 29번째 내지 86번째 아미노산 서 열로 이루어진 폴리펩타이드가 순차적으로 연결된 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 AP-1이 내장된 단백질 골격 모듈. 및

<140> 상기 AP-1이 내장된 단백질 골격 모들을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 제 공한다.

<i4i> 상기 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 4 내지 서열번호 6으로 이 루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

<142> 활성 폴리펩타이드는 대상 protein과의 접촉을 통하여 신호전달 대상 protein의 activation, deactivation, phosphorylation 등 여러 작용을 하는 폴리 펩타이드를 말한다. AP-1은 cytokine IL-4가 IL-4 receptor에 결합하는 아미노산 서열을 가지므로 자체적으로 IL-4 receptor에 결합력을 가진다. IL-4 receptor는 여러 가지 인간 암 (대장암， 폐암， 자궁암 및 유방암)에서 과발현함이 알려져 있으 므로 IL-4 receptor에 선택적으로 결합하는 활성 폴리펩타이드의 개발은 암의 진단 및 치료에 웅용될 수 있다. IL-4는 세포부착을 증가시키는 cytokine으로 동맥경화 를 유발시키는 작용을 하므로 AP-1 펩타이드는 동맥경화의 진단 및 치료제로 개발 될 수 있다.

<143> 따라서 본 발명은 AP-1이 내장된 단백질 골격 모들을 유효성분으로 포함하는 암 또는 동맥경화 진단용 조성물 및 AP-1이 내장된 단백질 골격 모들을 유효성분으 로 포함하는 암또는 동맥경화 진단용 kit를 제공한다.

<144> 아울러， 본 발명은 AP-1이 내장된 단백질 골격 모들을 이를 필요로 하는 개 체에 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 동맥경화 진단방법을 제공한 다.

<145> 또한 본 발명은 암 또는 동맥경화 진단용 제제의 제조를 위한 AP-1이 내장된 단백질 골격 모들의 용도를 제공한다.

<146>

<147> 상기 암은 그 발생， 진행， 퇴화 또는 소멸에 의해 AP-1이 친화력을 가지는 구조를 가진 생체 물질의 수준을 변화 시키는 암이면 어떤 암도 가능하며， 바람직 하게는 대장암， 폐암, 자궁암또는 유방암 일 수 있다.

<148>

<149> 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 단백질 골격 모듈을 단독으로 함 유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체， 부형제 또는 희석제를 추가 로 함유할 수 있다.

<150> 약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대， 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여 용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 콱토스， 전분， 셀를로스 유 도체， 마그네슴 스테아레이트， 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러， 펩티드 제제에 대한 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또 한， 비경구 투여용 담체는 물， 적합한 오일， 식염수， 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안 정화제로는 아황산수소나트륨， 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드， 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클 로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되 어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed. , Mack Publishing Company, East on, PA, 1995) .

<151>

<152> 본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면， 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으 로는 이에 한정되지는 않으나， 정맥내， 근육내, 동맥내, 골수내， 경막내， 심장내， 경피， 피하, 복강내， 비강내, 장관， 국소， 설하또는 직장내 투여일 수 있다.

<153>

<154> 본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

<155>

<156> 경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말， 과립, 정계, 환제, 당 의정제， 캡슐제, 액제， 겔제, 시럽제， 슬러리제， 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부 형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공 함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈， 덱스트로즈， 수크로즈， 솔비를, 만니를， 자일리를， 에리스리를 및 말티를 등을 포 함하는 당류와 옥수수 전분， 밀 전분， 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분 류， 셀를로즈, 메틸 셀를로즈， 나트륨 카르복시메틸셀를로오즈 및 하이드록시프로 필메틸-샐를로즈 등을 포함하는 셀를로즈류, 젤라틴， 폴리비닐피를리돈 등과 같은 층전제가 포함될 수 있다. 또한， 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈， 한천， 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제， 습윤제， 향료， 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

<157>

<158> 비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제， 크림제， 로션제 외용연고제， 오일 제， 보습제， 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문 헌 (Remington ' s Pharmaceutical Science, 15th Edit ion, 1975. Mack Publishing Company, East on, Pennsylvania 18042， Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

<159>

<160> 본 발명 조성물의 단백질 골격 모듈의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며， 다중 투여량 (multiple dose)으로 장기간 투 여되는 분할 치료 방법 (fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있 다. 바람직하게 본 발명 조성물의 단백질 골격 모들의 바람직한 용량은 1일당 환자 체중 1kg 당 약 O.Olug 내지 l,000mg, 가장 바람직하게는 O.lug 내지 lOOmg일 수 있다. 그러나 상기 단백질 골격 모들의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중， 건강 상태， 성별， 질환의 중증도， 식이 및 배 설율둥 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로， 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 단백질 골격 모들을 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명 에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형， 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다. <162> 본 발명의 이와 같은 효과는 본 발명 명세서의 실시예에 잘 나타나 있다 .

<163>

<164> 본 발명의 실시예에서는 많은 modular 도메인 중 친화력이 높으며， 분자량 및 면역원성이 낮고， 사람에게 풍부하게 존재하며, 3차원 구조의 검증이 가능한 modular 도메인을 스크리닝 하여 가장 적합한 도메인으로 Stamiin-2의 EGFL 도메인 을 선정하였다. 선정된 서열을 3차원 모델링을 하고 in silico 상에서 돌연변이를 유발하여 가장 적합한 모델을 확립하였다.

<165>

<166> 본 발명의 다른 일 실시예에서는 선정된 단백질 골격 모들을 암호화 하는 폴 리뉴클레오티드 서열을 제작하고， 이를 발현가능한 발현 백터에 도입한 후， 이를 이용하여 대장균을 형질전환 하였다. 형질전환 된 균주를 배양하여 본 발명의 단백 질 골격 모들을 발현시킨 후 이를 추출 정제 하였다.

<167>

<168> 본 발명의 다른 일 실시예에서는 표면플라즈몬 공명 분석에 의하여 본 발명 의 활성 폴리펩타이드로서 AP-1이 내장된 단백질 골격 모들의 결합 능력을 측정하 였다. 측정 결과 본 발명의 단백질 골격 모들에 AP— 1이 내장되는 경우 친화력이 naked AP-1 펩타이드에 비하여 174배나 높아 지는 것을 확인하였다.

<169>

<170> 본 발명의 다른 일 실시예에서는 본 발명 단백질 골격 모들에 의한 활성 폴 리펩타이드의 detection 민감도 변화를 측정하였다. 그 결과 본 발명의 단백질 골 격 모듈에 AP-1이 내장되는 경우 naked AP-1 펩타이드에 비하여 10 배이상 IL-4의 활성을 잘 저해함을 확인하였다.

<171>

<172> 본 발명의 다른 일실시예에서는 본 발명의 활성 플리펩타이드가 내장된 단백 질 골격 모듈에 의한 진단 민감도를 측정하였다. Cellular imaging 또는 Animal imaging실험 결과 본 발명의 단백질 골격 모들에 APᅳ 1이 내장되는 경우 naked AP- 1 펩타이드에 비하여 종양 타켓팅 기능이 향상되었음을 확인하였다.

<173>

【유리한 효과】

<174> 이상 살펴본 바와 같이， 본 발명은 활성 폴리펩타이드의 결합 친화력 또는 결합 특이성을 증강시키는 신규한 단백질 골격 모들에 관한것으로， 보다 상세하게 는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 19번째 아미노산 서열로 이 루어진 폴리펩타이드; 활성 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드; 및 서열번호 1 로 표시되는 아미노산 서열의 29번째 내지 86번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 골격 모들 및 이의 제조방법을 제 공한다. 본 발명의 단백질 골격 모들은 내장된 활성 폴리펩타이드의 결합 친화력 또는 결합 특이성을 증강시키므로 질병의 진단 및 치료에 효과적이다.

<175>

【도면의 간단한 설명】

<176> 도 1은 Stabilin— 2의 도메인 배열 모식도 및 본 발명의 단백질 골격 모들과 활성 펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈의 3차원 모델링 결과사진이다.

<177> 도 2는 표면 플라즈마 공명 실험 결과 그래프 이다 (DMID AP-1: 본 발명의

AP-1이 내장된 단백질 골격 모들, Peptide AP-1: 단백질 골격 모들이 결합하지 아 니한 AP-1 펩타이드， Negative control: 음성대조군).

<178> 도 3은 표면 플라즈마 공명 실험 결과 측정된 결합 상수를 비교한 그래프이 다 (authentic control: IL-4의 결합상수, peptide control: 단백질 골격 모들이 결 합하지 아니한 AP-1 펩타이드의 결합 상수， Peptide-embeded DIMID: 본 발명의 AP- 1이 내장된 단백질 골격 모들의 결합 상수)

<179> 도 4는 AP-1이 내장된 본 발명의 단백질 골격 모들의 IL-4 receptor의 신호 전달을 억제하는 효과를 측정한 실험 결과 사진이다 (IL4: 인터투킨 4， API: 단백질 골격 모들에 결합하지 아니한 API, AP1-DIMID: 단백질 골격 모듈이 결합된 API, STAT6: STAT6의 수준, pSTAT6: 인산화 된 STAT6의 수준).

<180> 도 5는 AP-1이 내장된 본 발명의 단백질 골격 모듈의 detection능력 향상을 측정한 cellular imaging 실험 결과 사진이다 (DAPI: 세포핵을 4， ,6-diamidino-2- phenyl indole (DAPI)로 염색한 사진， FITC: Fluorescein Isothiocyanate로 단백질 골격 모들을 표지한 사진， MERGE: DAPI 및 FITC 사진을 합친 이미지, AP1-DIMID- FITC: FITC가 표지된 단백질 골격 모들이 결합된 API, AP1-FITC: FITC가 표지된 AP-1, Control DMID-FITC: AP-1이 내장되지 않은 FTTC가 표지된 단백질 골격 모들ᅳ NSSSVDK서열의 펩타이드에 FITC표지를 한 control peptide).

<i8i> 도 6은 AP-1이 내장된 본 발명의 단백질 골격 모들의 detection능력 향상을 측정한 Animal imaging실험 결과 사진이다 (Scafold control： AP-1이 내장되지 않 은 단백질 골격 모들을 주입한 생쥐， AP-1 Peptide: AP-1 펩타이드를 주입한 생쥐， DMID AP-l: DMID AP-1을 주입한 생쥐). 【발명의 실시를 위한 형태】

<183> 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

<184> 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.

<185>

<186> <실시예 1>

<i87> DMIDCDesigned Modular Immunodi agnostics) 후보군스크리닝 및 모델링

<188>

<189> <1-1>스크리닝

<190> 인간에서 발현되는 단백질 도메인 중 다량으로 존재하는 modular 도메인을 인간유전자 데이터 베이스를 비교분석하는 포스트 지노믹 스크리닝을 통해 20개의 후보군으로 선정 한 후 a) 높은 친화력 (high affinity), b) 낮은 분자량, c) 낮은 면역원성 (low imraunogenicity), d) 사람에 풍부하게 존재, 및 e) 3차¾ 구조 검증 가능 의 조건을 기준으로 EGFL (EGF-like) 도메인을 선정하였다.

<191>

<i92> EGFL은 다수의 혈장 단백질에 존재하는 40개의 아미노산으로 이루어진 모들 로서 저분자， 고안전성, 저면역성의 특성을 가진다. 2개의 beta-sheet와 3개의 di^¬ sulfide 결합으로 이루어진 단순한 구조로서 3차원 구조 검증이 가능하고 구조에 영향을 주지 않는 loop가 존재하여 활성 폴리펩타이드 삽입이 용이하므로 DMID 후 보로서 적합하다.

<193>

<194> <1-2> 3차원모델링

<i95> EGFL도메인의 3차원 모델링을 위하여 BLAST와 AlignMaster프로그램이 사용 되었다. 인간 EGFL도메인의 구조는 Protein DataBank로부터 제공 받았다.

<196> 이론적 기반의 돌연변이 (Knowledge based mutagenesis)와 이차원 모델링은 nnPr ed i c ( ( www . cmphar m . uc s f . edu/~nom i / nnpr ed i c t . ht m 1 ) 및 jppred

(ht t ： / /www . compb i o . dundee . ac . uk/~www- j r ed/ submi t . htm 1 )를 이용하여 수행하였 다. 이론적 기반의 3차원 모델링 (Knowledge based 3-d i mens ional models)은 Swiss . Model (http: //www. expasy.ch/)에서 제공받았으며， 이를 추가로 in silico 돌연변이 유발 후 Chimera/Modeller 6으로 검증하였다. 마지막 DMID 모델은 PyMOL로 분석되 고 시각화 하였다. <198> <실시예 2>

<i99> 채조합 DMID-AP1 발현 및 정제

<200>

<20i> <2-l> 형질전환 균주 제작 - DMID-Sall-Hindlll cassette의 제작

<202> 본 발명의 단백질 골격 모들 (DMID)을 제작하기 위하여 스태빌린 2 단백질의 존재하는 EGFL 도메인 (4621-4869)을 E-col i 발현백터 인 pET32a (Novagen)의 BamHl 과 Xhol site에 클로닝하여 발현 단백질을 제조하였다. EGFL 도메인의 GCTGAC (4639-4644)을 GTCGAC 로 유전자 변이를 일으켜 제한효소 Sai l site를 제조하고 AAAGCA (4703-4708)을 MGCTT로 변이를 일으켜 제한효소 Hindl l l si te를 제조하여 활성 폴리펩타이드를 끼워 넣을 수 있는 DMID-Sal l-Hindl l l cassette를 제조하였다 .

<203>

<204> <2~2> 형질전환 균주의 배양

<205> 형 질전환 된 Origami strain을 50ug/ral의 Ampici l l in과 25ug/ml의 Kanamycin 이 포함된 20ml의 Tryptone phosphate (TP) broth (2% bacto-tryptone , 0.2% Na₂HP0₄, 0.1% KH₂P0₄, 0.8% NaCl , 1.5% yeast extract and 0.2%glucose)에 밤새 배 양하였다 . 배양액을 4000 X g 로 5분간 원심분리 하여 pel let을 회수 한 후 50ug/ml의 암피실린이 함유된 동일 부피 의 TP에 재현탁시 켰다 . 이를 TP broth에 100배 회석하여 37^°C에서 0D₆₀₀ 값이 0.5가 될 때까지 배양하였다. 배양이 끝난 배양 액을 20^°C로 냉각한 후 0.2mM의 IPTG( Isopropyl-p -D-thiogalactoside) 로 12시간 동안 단백질 발현을 유도한 후 배양 세포를 회수하여 사용시까지 -80^°C에 보관하였 다.

<206>

<207> <2"3> 단백질 추출 및 분리정제

<208> 상기 보관된 세포를 ImM PMSF , 0.5mM DTT가 포함된 10ml of 2X PBS 에 재현 탁한 후， Duty cycle ： 30%, Output： 2.5 for 5 min의 조건으로 초음파 분쇄 하였 다 . 분쇄된 세포를 15,000g로 10분간 원심분리하여 상등액을 취하였다 .

<209> 회수된 상등액을 2XPBS Buf fer로 equi 1 ibrate한 Ni-NTN 컬럼 (amersham

Pharmacia biotech AB, Vt=0.5mO에 제조사의 매뉴얼에 따라 sett ing하여 로딩하였 다. 6 (his) tag이 붙은 DMID는 30mM 아미다졸이 포함된 2X PBS에서는 컬럼에 붙어 있으므로 30mM 이미다졸이 포함된 2X PBS로 컬럼을 수세 (컬럼 볼륨의 10배 )한 후 250mM 이미다졸이 포함된 IX PBS 버퍼 (일루션 버퍼 )로 컬럼에 붙은 단백질을 회수 하였다 . <210>

<211> <실시예 3>

<2i2> 채조합 DMID-AP1결합능력 향상검증 -표면플라즈몬공명 분석

<213>

<214> 본 발명의 API이 내장된 단백질 골격 모듈 (DMID-AP1)의 결합능력을 알아보기 위하여 naked API와 DMID— API의 결합상수를 Biacore 2000를 사용하여 표면 플라즈 몬 공명 분석 방법으로 측정하였다. 곤층세포 (SF21) 에서 발현 및 정제한 인간 IL-4 receptor 의 ectodomain (IL-4Ra) 을 HBS buffer (10 mM HEPES, H 7.4, 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, and 0.005% surfactant P20)에 희석한 후 Biacore CM5 chip 표면에 제조사 (Biacore Inc.)의 방법에 따라 coating 하였다 (2500 RU). 동일 buffer에 희석한 AP-1 펩타이드 혹은 DMID— API를 흘려 (50 ul/min) RU 값의 변화를 측정한후, Biaevaluation 2.0프로그램을 사용하여 결합상수를 구하였다.

<215> [도 2] 및 [도 3]에서 보는 바와 같이， surface plasmon resonance analysis 를 한 결과 peptide imbedded DMID가 naked peptide에 비하여 174배 높은 친화력을 보이는 것을 확인하였다.

<216>

<217> <실시예 4>

<218> 재조합 DMID-API detection능력 향상검증 1 - IL-4에 의한 IL-4 receptor의 활성 저해도의 측정

<219>

<22o> 5X10⁵의 THP NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, NCI 9949) 세포를 6-well plate에 seeding 후 100ng/ml의 Phorboll2-myristatel3— acetate (PMA) (Sigma,P8139-lMG)을 3일 동안 처리하여 activate 시킨다. 18시간 serum이 없는 조건에서 세포를 배양한 후 0.67 nM (IX)의 ILᅳ 4 단독 혹은 다양한 농도

[10ⁿX(0.67nM)] 의 AP-1 peptide 또는 재조합 DMID-AP1을 함께 처리하였다. IL-4와

IL-4 receptor간의 결합에 의해 유도된 Stat 단백질의 인산화는 Rabbit polyclonal antibody anti^~STAT6 (Cell Signaling, # 9362)와 rabbit polyclonal antibody anti-pTyr641-STAT6 (Cell Signaling, # 9361)을 사용하여 Western blot 방법으로 측정하였다

<22i> 그 결과 [도 4]에서 보는 바와 같이， 본 발명의 DMID-AP1이 API에 비하여

Stat 단백질을 인산화하는 IL-4활성을 10배 이상 잘 저해함을 확인하였다. <223> <실시예 5>

<224> ；재조합 DMID-AP1 detection능력 향상 검증 2 - cellular imaging, animal imaging

<225>

<226> <5-l> Cellular imaging

<227> 본 발명의 API이 내장된 단백질 골격 모들 (DMID-AP1)의 세포에 발현된 IL-4 receptor와의 경쟁적 결합능력을 알아보기 위하여 H226 cell line 에서의 naked API와 DMID-AP1의 IL-4 receptor에 대한 결합능력을 형광표지된 단백질을 사용하여 측정하였다. AP-1 펩타이드 흑은 정제된 DMID-AP1를 투석완층액 (50mM Boric acid, 150mM NaCl, ImM EDTA, pH 9.0)으로 4^°C에서 투석한 후 형광물질 Fluorescein Isothiocyanate (FITC) (sigma)와 37^°C에서 한 시간 동안 반웅시켜 표지하였다. 50 raM Glycine을 37^°C에서 5분간 넣어주어 반응을 중지한 후 투석완충액 (20 mM Tris HC1, pH 8.0)으로 4^°C에서 투석하였다. H226 cell에 각각 동일한 양의 대조군 펩타 이드， AP-l, DMID— Apl을 첨가하여 결합， 세척한 후 4% paraformaldehyde (PFA)로 고정하고 세포핵은 4' , 6-d i am i d i ηο-2-pheny 1 i ndo 1 e (DAPI)로 염색한후 형광현미경 (Zeiss, Oberkochen , Germany)로 관찰하였다.

<228> 그 결과 [도 5]에서 보는 바와 같이， AP1-DMID-FITC가 다른 ΑΡ-ί혹은 대조 군 펩타이드에 비하여 IL-4 receptor를 발현하는 세포표지능력이 우수함을 확인하 였다. 、

<229>

<230> <5-2> Animal Imaging

<23i> 1X10⁷개의 H226 세포를 배양배지에 부유시킨 후, 5~6주령의 암컷 BALB/c nude 마우스의 오른쪽 대퇴부에 피하 주사하여 피하종양모델을 제조하였다. 약 3주 후 종양의 크기가 0.1〜： lcm 되었을 때 실험에 사용하였다. 종양 이종이식 마우스를 마취시킨 후 형광물질이 결합된 AP-1 펩타이드와 DMID— API 150 ug을 꼬리부분의 장 맥에 주사하였다. 형광표지된 펩타이드의 종양타겟팅 기능을 Optics을 이용하여 분 석하였다.

<232> 그 결과 [도 6]에서 보는 바와 같이 , AP-1에 비교하여 DMID-AP1의 종양 타겟 팅 기능이 향상되었음을 확인하였다.

<233>

【산업상 이용가능성】

<234> 따라서， 본 발명은 활성 폴리펩타이드의 결합 친화력 또는 결합 특이성을 증 강시키는 신규한 단백질 골격 모들에 관한것으로， 보다 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 19번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타 이드; 활성 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드; 및 서열번호 1로 표시되는 아 미노산 서열의 29번째 내지 86번째 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 포함 하는 것을 특징으로 하는 단백질 골격 모들 및 이의 제조방법을 제공한다. 본 발명 의 단백질 골격 모들은 내장된 활성 폴리펩타이드의 결합 친화력 또는 결합 특이성 을 증강시키므로 질병의 진단 및 치료에 효과적이므로 산업상 이용가능성이 크다.

Claims

【청구의 범위]

【청구항 1]

a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 19번째 아미노산 서 열로 이루어진 폴라펩타이드;

b) 활성 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 및

c) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 29번째 내지 86번째 아미노산 서 열로 이루어진 폴리펩타이드가 순차적으로 연결된 폴리펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들.

【청구항 2】

제 1항의 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들을 암호화 하는 폴리 뉴클레오티드.

【청구항 3】

제 2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 백터.

【청구항 4】

계 3항의 발현 백터로 형질전환 된 숙주세포.

【청구항 5】

제 4항의 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들을 제조하는 방법.

【청구항 6]

제 1항의 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 유효성분으로포함 하는 진단용 조성물.

【청구항 7】

제 1항의 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들을 유효성분으로 포함 하는 약학적 조성물.

【청구항 8] 제 1항의 활성 ¾리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모듈을 유효성분으로 포함 하는 진단용 키트.

【청구항 9】

a) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번째 내지 19번째 아미노산 서 열로 이루어진 폴리펩타이드;

b) 서열번호 3으로 표시되는 APᅳ Kactivator protein 1)의 아미노산 서열를 포함하는 폴리펩타이드 및

【청구항 10】

제 9항의 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들을 암호화 하는 폴리 뉴클레오티드.

[청구항 11】

제 10항에 있어서， 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.

【청구항 12】

제 9항의 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들을 유효성분으로 포함 하는 암또는동맥경화 진단용조성물.

【청구항 13]

제 9항의 활성 폴리템타이드가 내장된 단백질 골격 모들을 유효성분으로 포함 하는 암또는 동맥경화 진단용 키트.

【청구항 14】

제 1항의 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들을 이를 필요로 하는 개체에 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 진단 방법.

【청구항 15】

진단용 제제의 제조를 위 한 제 1항의 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골 격 모들의 용도 .

【청구항 16】

제 9항의 활성 폴리펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들을 이를 필요로 하는 개체에 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 동맥경화 진단방법 .

【창구항 17】

암 또는 동맥경화 진단용 제제의 제조를 위한 제 9항의 활성 폴리 펩타이드가 내장된 단백질 골격 모들의 용도 .