ES2622385T3 - Miméticos de factor de crecimiento de hepatocitos como agentes terapéuticos - Google Patents

Abstract

Mimético de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) que tiene la fórmula general:**Fórmula** en la que R1 es uno de un grupo N-acilo, y un aminoácido, seleccionándose dicho aminoácido del grupo que consiste en tirosina, fenilalanina, ácido aspártico, arginina, isoleucina, serina, histidina, glicina, cisteína, metionina, triptófano, lisina, norvalina, ornitina y s-bencilcisteína; R2 es un aminoácido seleccionado del grupo seleccionado del grupo que consiste en tirosina, fenilalanina, ácido aspártico, arginina, isoleucina, serina, histidina, glicina, cisteína, metionina, triptófano, lisina y valina; R3 es isoleucina; y n oscila entre 3-6; y en la que los enlaces covalentes 1, 2 y 3 se seleccionan del grupo que consiste en enlaces peptídicos o enlaces peptídicos reducidos.

Description

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MIMETICOS DE FACTOR DE CRECIMIENTO DE HEPATOCITOS COMO AGENTES TERAPEUTICOS

DESCRIPCION

Declaracion respecto a investigacion o desarrollo patrocinado federalmente

Esta invencion se realizo, en parte, con apoyo gubernamental con la subvencion n.° MH086032 otorgada por los NIH. El gobierno tiene determinados derechos en la invencion.

Lista de secuencias

Esta solicitud incluye como lista de secuencias el contenido completo del archivo de texto adjunto “Sequence.txt”, creado el 2 de abril de 2012, que contiene 1022 bytes, incorporado por el presente documento por referencia.

Descripcion

Sumario

Campo de la invencion

La invencion se refiere en general al desarrollo de mimeticos de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) que pueden actuar como mimeticos (agonistas) o antagonistas. Los mimeticos actuan: potenciando la funcion cognitiva; como agentes neuroprotectores/neurorregenerativos generales; facilitando la reparacion de heridas; mejorando el transporte de glucosa y la sensibilidad a la insulina; y disminuyendo la fibrosis de organos o tejidos con el fin de prevenir o revertir los smtomas de demencia, proteger de o revertir la enfermedad neurodegenerativa, facilitar la reparacion de lesion traumatica en el sistema nervioso, aumentar la vascularizacion de tejidos y organos, mejorar la cicatrizacion de heridas alterada, y disminuir o revertir cambios fibroticos en organos como corazon, pulmon, rinon e tugado. Los antagonistas actuan, por ejemplo, como agentes antiangiogenicos y anticancengenos; tratando diversos tumores malignos y enfermedades como degeneracion macular y retinopatfa diabetica, que se asocian con hipervascularizacion.

Mimeticos:

Demencia: Solo en los Estados Unidos hay aproximadamente 10 millones de pacientes con demencia diagnosticados y ese numero continua creciendo cada ano a medida que la poblacion envejece. Los costes de tratamiento y cuidado de estos pacientes son superiores a 70 mil millones de dolares anualmente y estan aumentando rapidamente. Desafortunadamente, las opciones de tratamiento actuales para la gestion de la demencia son extremadamente limitadas y en gran medida ineficaces. La falta de opciones de tratamiento para un problema de salud creciente de esta magnitud necesita que se desarrollen enfoques terapeuticos nuevos e innovadores tan rapido como sea posible.

En esencia, la demencia es el resultado de una combinacion de conectividad sinaptica disminuida entre neuronas y muerte neuronal en la corteza entorrinal, el hipocampo y la neocorteza. Por tanto, se esperana que un tratamiento eficaz aumentara la conectividad sinaptica, protegiera a las neuronas de inductores de muerte subyacentes y estimulara el reemplazo de neuronas perdidas a partir de las reservas preexistentes de celulas madre neurales. Estos criterios de valoracion clmicos propugnan el uso terapeutico de factores neurotroficos, que median en el desarrollo neural, la neurogenesis, la neuroproteccion y la sinaptogenesis. De manera no inesperada, se han considerado factores neurotroficos como opciones de tratamiento para muchas enfermedades neurodegenerativas incluyendo enfermedad de Alzheimer (veanse las revisiones- Nagahara y Tuszynski, 2011; Calissano et al., 2010). Un factor neurotrofico particularmente atractivo pero subestimado habitualmente es HGF, que tiene una capacidad demostrada para estimular tanto la neurogenesis (Shang et al., 2011, Wang et al, 2011) como la sinaptogenesis (veanse los estudios preliminares a continuacion). La constatacion de que la aplicacion de HGF podna representar una opcion de tratamiento viable para la demencia no debe ser una sorpresa. HGF es un factor neurotrofico potente en muchas regiones cerebrales (Kato et al., 2009; Ebens et al., 1996), al tiempo que afecta a una variedad de tipos de celulas neuronales.

Neuroproteccion/neurorregeneracion: HGF y c-Met se expresan activamente tanto en los cerebros y nervios en desarrollo como adultos. El sistema de Met es esencial para que el sistema nervioso tanto central como periferico funcionen adecuadamente. Un gran numero de estudios ha mostrado que el HGF y c-Met se expresan en multiples zonas del cerebro incluyendo corteza frontal, subependimo, talamo, corteza cerebelosa, materia gris profunda y el hipocampo, una zona importante para la cognicion. Las actividades biologicas descritas anteriormente tambien caracterizan funciones de Met en el cerebro donde la senalizacion de HGF/c-Met es neurotrofica (Honda et al., 1995) y protectora (Zhang et al., 2000; Takeo et al., 2007; Tyndall y Walikonis, 2007; Takeuchi et al., 2008). De manera similar a sus actividades en otros tejidos, Met en el cerebro esta implicado en el desarrollo, actuando como factor grna durante la diferenciacion, motogenesis y neuritogenesis (Ebens et al., 1996; Sun et al., 2002; Tyndall y Walikonis, 2007). Tambien se ha mostrado que la senalizacion de HGF/c-Met promueve la cicatrizacion de lesiones

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neuronales (Trapp et al., 2008), especialmente tras lesion cerebral isquemica (Takeo et al., 2007). HGF tambien presento efectos neuroprotectores en modelos animales para enfermedades neurodegenerativas incluyendo esclerosis lateral amiotrofica (ELA). Las diversas funciones de HGF, mas sus actividades neurotroficas altamente potentes, promueven HGF como agente terapeutico potencial para el tratamiento de diversas enfermedades del sistema nervioso.

Esclerosis lateral amiotrofica: ELA es una enfermedad neurodegenerativa de rapida aparicion mortal que se caracteriza por la degeneracion de motoneuronas de la medula espinal y neuronas eferentes en la corteza motora y el tronco encefalico. El impacto de esta degeneracion da como resultado una perdida progresiva de la funcion muscular que culmina en paralisis total. Aproximadamente el 90% de los casos de ELA se clasifican como esporadicos con etiologfa desconocida, mientras que el 10% restante parecen ser familiares, debidos en parte a defectos en la cobre/zinc superoxido dismutasa 1 (SODI), lo que conduce a un estres oxidativo exagerado y una respuesta de protema desplegada. La unica cosa que tienen en comun ambas formas de ELA es que actualmente no hay disponible ningun tratamiento eficaz.

A pesar de la escasez de opciones de tratamiento eficaces, varios estudios han destacado los beneficios potenciales de usar el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) como agente terapeutico. Estas investigaciones han demostrado que la aplicacion del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) en un modelo de rata o murino de ELA familiar ralentiza significativamente la degeneracion de motoneuronas (Aoki et al., 2009); reduce la gliosis (Kadoyama et al. 2007), que contribuye al proceso de degeneracion; retrasa la aparicion de paralisis (Kadayama et al., 2009); y aumenta la esperanza de vida (Sun et al., 2002).

La constatacion de que la aplicacion de HGF podna representar una opcion de tratamiento viable para ELA, sin embargo, sena inesperada. HGF junto con su receptor tirosina cinasa de tipo I, c-Met, se han reconocido desde hace tiempo por su papel en el desarrollo de estructuras tubulares (Santos et al., 1993) y sus acciones proliferativas, antiapoptoticas, motogenicas y morfogenicas generales sobre hepatocitos y celulas de origen epitelial. Sin embargo, lo mas relevante, es la constatacion mas reciente de que HGF es un factor neurotrofico potente (Maina y Klein, 1993; Kato et al., 2009) en muchas regiones cerebrales y que es particularmente eficaz como factor prosupervivencia/regenerativo para motoneuronas (Ebens et al., 1996; Yamamoto et al., 1997; Hayashi et al., 2006; Elsen et al., 2009).

Enfermedad de Parkinson: Una opcion de tratamiento considerada durante mucho tiempo para muchas enfermedades neurodegenerativas, incluyendo enfermedad de Parkinson (EP), ha sido la aplicacion de factores de crecimiento con la intencion de detener la progresion de la enfermedad, restaurar la funcion perdida, o con suerte ambas (revision, Rangasamy et al., 2010). Sin embargo, este sueno no se ha cumplido en gran medida a nivel de la medicina clmica debido a las limitaciones en relacion con la administracion al cerebro y los costes. Los factores de crecimiento son protemas universalmente grandes que son tanto metabolicamente labiles como demasiado grandes para atravesar la barrera hemotoencefalica (BHE). Como tal, la mayona de los enfoques para la administracion han utilizado metodos de terapia genica con la esperanza de que el factor de crecimiento se expresara en la ubicacion correcta a una concentracion suficientemente alta y durante un periodo suficientemente prolongado como para proporcionar alivio clmico. Aunque se han empleado varios enfoques creativos y satisfactorios en modelos animales para administrar factores de crecimiento como GDNF (Wang et al., 2011) al cerebro, estas metodologfas son tecnicamente complejas y extremadamente diffciles de llevar a la practica con grandes numeros de pacientes.

Aunque se han examinado muchos sistemas de factores de crecimiento como dianas terapeuticas potenciales para EP, uno que se ha subestimado en gran medida, se piensa que de manera erronea, es el sistema de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)/c-Met (su receptor de tirosina cinasa de tipo I). No obstante, la utilidad potencial de HGF como tratamiento para EP se ha destacado en un estudio por Koike et al. (2006) en el que un plasmido de HGF inyectado directamente en la sustancia negra (SN) dio como resultado sobreexpresion localizada de HGF, y actuo drasticamente evitando la muerte de celulas neuronales y preservando la funcion motora normal en el modelo de rata para EP de 6-hidroxidopamina (6-OHDA). Este efecto neuroprotector observado de HGF sobre neuronas dopaminergicas (DA) concuerda con su capacidad para aumentar la proliferacion y migracion de celulas progenitoras dopaminergicas (Lan et al., 2008)

Sin embargo, el efecto neuroprotector del HGF sobre la ruta nigroestriatal no debe ser una sorpresa dado su papel reconocido en la regulacion de celulas madre, el desarrollo de estructuras tubulares (Santos et al., 1993) y sus acciones proliferativas, antiapoptoticas, motogenicas y morfogenicas generales sobre muchos tipos de celulas incluyendo hepatocitos y celulas de origen epitelial (Gherardi et al., 1993). Maina et al., particularmente relevante es la demostracion de que el HGF es un factor neurotrofico potente para muchos tipos de celulas neuronales (Kato et al, 2009) incluyendo motoneuronas (Elsen et al., 2009; Hayashi et al, 2006), neuronas del hipocampo Lim et al., 2008), celulas granulares cerebelosas (leraci et al., 2002) y neuronas simpaticas (1999). Ademas, hGf parece ser un regulador cntico de la diferenciacion y expansion de celulas madre neurales (Nicoleau et al., 2009) sugiriendo que tipos neurales asf como muchos tipos de celulas madre perifericas estan bajo el control del sistema de HGF/c- Met.

Lesion cerebral traumatica/lesion de la medula espinal: A menudo la LCT tiene un impacto negativo sobre la funcion

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cognitiva y puede provocar efectos que oscilan entre leves, con disminuciones temporales en las capacidades mentales, hasta graves, con disfuncion cognitiva debilitante y prolongada (Kane et al., 2011). Dificultades cognitivas junto con otras deficiencias neurologicas incluyendo: ansiedad, agresividad y depresion dan como resultado una calidad de vida significativamente reducida (Masel y DeWitt, 2010). Con las operaciones militares concluidas en Iraq y que continuan en Afganistan, la LCT ha llegado a ser la principal lesion de combate representando el 28% de todas las bajas en combate (Okie, 2005; U.S. Medicine, mayo de 2006, vol. 42). Las estimaciones totales de los miembros del servicio militar que padecieron LCT entre 2001 y 2010 oscilan entre 180.000 y 320.000 (USA Defense and Veterans Brain Injury Center).

La LCT subyacente es una lesion ffsica en el cerebro que da como resultado una conectividad sinaptica disminuida entre neuronas, perdida y muerte de neuronas, dano a los vasos sangumeos cerebrales dando como resultado dano inducido isquemico/hipoxico, y cicatrizacion glial secundaria. Esta perdida de neuronas y conectividad sinaptica disminuida es particularmente evidente en el hipocampo (Gao et al., 2011; Zhang et al., 2011a; Zhang et al., 2011b) dando como resultado potenciacion a largo plazo defectuosa (Schwarzbach et al., 2006) y deficiencias cognitivas (por ejemplo Dikmen et al., 2009; Patel et al., 2010). La prevalencia de lesiones asociadas con LCT que dan como resultado perdida neuronal y conectividad sinaptica disminuida indican la necesidad de terapias que respalden el reemplazo y/o la reparacion neuronal. Estos criterios de valoracion clmicos propugnan el uso terapeutico de factores neurotroficos que median en el desarrollo neural, la neurogenesis, neuroproteccion y sinaptogenesis, para tratar la LCT. De manera no inesperada, se han considerado los factores neurotroficos como opciones de tratamiento para la LCT (Kaplan et al., 2010; Richardson et al., 2010; Qi et al., 2011). Un factor neurotrofico particularmente atractivo pero subestimado habitualmente es HGF, que tiene una capacidad demostrada para estimular tanto la neurogenesis (Shang et al., 2011; Wang et al., 2011) como la sinaptogenesis (veanse los estudios preliminares a continuacion). El hecho de que la aplicacion de HGF podna representar una opcion de tratamiento viable para la LCT proviene de la reciente constatacion de que el HGF es un factor neurotrofico potente en muchas regiones cerebrales (Kato et al., 2009; Ebens et al, 1997), al tiempo que afecta a una variedad de tipos de celulas neuronales (Yamamoto et al., 1997; Hayashi et al., 2006; Elsen et al., 2009).

HGFy cicatrizacion de heridas: La formacion de cicatrices excesiva se caracteriza por la acumulacion innecesaria de componentes de la ECM en la herida, debido a un equilibrio inadecuado entre smtesis y degradacion. La terapia para la formacion de cicatrices patologica puede dirigirse a inhibir la smtesis y a promover la degradacion de la ECM. El HGF en la piel promueve eficazmente la cicatrizacion de heridas de diversas maneras: motivando la proliferacion y motilidad de celulas endoteliales vasculares dermicas; estimulando la motilidad de queratinocitos epidermicos; potenciando el suministro de sangre local; y acelerando la reepitelizacion de la herida (Nakanishi et al., 2002). La reepitelizacion inhibe la formacion de cicatrices. Estudios han mostrado que la transferencia genica de HGF acelera la cicatrizacion de heridas dermicas estimulando la angiogenesis y la reepitelizacion (Nakanishi et al., 2002). Se esperana que enfoques terapeuticos que aumentan HGF/SF promoviesen la cicatrizacion de heridas y evitasen la formacion de cicatrices.

HGF como opcion de tratamiento para smdrome metabolico y diabetes: Varios estudios recientes han implicado el papel cntico del sistema de HGF/c-Met en la regulacion del manejo de glucosa, secrecion de insulina y sensibilidad tisular a la insulina. Conjuntamente estas investigaciones han destacado el potencial terapeutico de aumentar el sistema de HGF/c-Met para el tratamiento de diabetes de tipo 2 y smdrome metabolico (Fafalios et al., 2011; Flaquer et al., 2012)). Estos investigadores han mostrado que: 1) c-Met, el receptor de HGF se compleja con el receptor de insulina; 2) c-Met esta implicado de manera cntica en la homeostasis de glucosa hepatica; 3) HGF restaura la receptividad a la insulina en un modelo de raton diabetico murino; 4) esta terapia genica de HGF puede evitar el dano renal que normalmente acompana a la diabetes y 5) HGF mejora la complicacion vascular de la diabetes (Peng et al., 2011).

La ruta de senalizacion de HGF/c-Met que potencia la angiogenesis: La angiogenesis se define como la formacion de nuevos vasos sangumeos a partir de lechos vasculares existentes. Es un requisito primordial en procesos fisiologicos tales como la cicatrizacion de heridas y el ciclo menstrual, por otro lado, es una etapa esencial para multiples estados patologicos, como cancer, degeneracion macular, ateroesclerosis, retinopatfa diabetica, glaucoma neovascular, psoriasis y artritis reumatoide. Por consiguiente, la modulacion de la angiogenesis, ya sea a traves del fomento de la angiogenesis terapeutica o deteniendo la angiogenesis patologica, es una perspectiva estimulante para la medicina moderna. El equilibrio entre angiogenesis fisiologica y patologica esta mediado por la comunicacion de numerosos moduladores angiogenicos y antiangiogenicos endogenos.

Numerosos estudios han mostrado que el HGF es un inductor poderoso de la formacion de neovasculatura. Ademas los inhibidores de HGF/c-Met son agentes antiangiogenicos clmicamente relevantes. (Gherardi et al, 2012). Probablemente esto se logra a traves de multiples rutas, conseguidas por accion o bien directa o bien indirecta sobre celulas endoteliales.

HGF como agente antifibrotico: La enfermedad fibrotica adopta muchas formas y es un contribuidor principal a la funcion degradada en el corazon, rinon e tugado secundaria a muchos estados patologicos incluyendo infarto de miocardio, diabetes y alcoholismo. El factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) muestra un fuerte efecto antifibrotico con eficacia notable en la mejora de la fibrosis tisular en un amplio intervalo de modelos animales, HGF

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presenta un efecto antifibrotico notablemente poderoso que mejora la fibrosis tisular en un amplio intervalo de tejidos y modelos animales (Liu y Yang, 2006). Se han documentado pruebas del efecto terapeutico de HGF exogeno en ratas nefropaticas con aloinjertos cronicas, un modelo de inflamacion cronica y formacion de cicatrices tisular progresiva. La administracion intramuscular del gen de HGF humano redujo la tasa de mortalidad, restringio la inflamacion e infiltracion, y redujo la fibrosis renal (Liu y Yang, 2006).

Los acontecimientos isquemicos de arteriopatia coronaria (APC) e infarto de miocardio son las principales causas de insuficiencia cardiaca en el mundo occidental. La unica opcion para el bloqueo coronario grave y la ateroesclerosis es la cirugfa de derivacion. Dos acontecimientos patologicos en la APC desempenan los principales papeles en la perdida de la funcion cardiaca observada en APC: 1) bloqueo de las arterias coronarias dando como resultado perfusion sangumea disminuida al corazon; y 2) la formacion de tejido fibrotico tras ataque cardiaco dando como resultado distension disminuida y remodelacion ventricular. Se han notificado niveles aumentados de HGF en la circulacion tras infarto de miocardio agudo (Zhu et al., 2000; Jin et al., 2003). Este aumento de HGF circulante puede usarse como marcador biologico para lesiones de corazon y da una idea con respecto a su papel protector (Ueda et al., 2001). Potencialmente podnan usarse farmacos que potencian la senalizacion de HGF/Met en el tratamiento de infarto de miocardio, proporcionando proteccion frente al estres oxidativo y la muerte celular debida a apoptosis asf como reduciendo la formacion de tejido fibrotico (Ahmet et al., 2002; Kondo et al., 2004; Pietronave et al., 2010). Ademas, otro efecto beneficioso de HGF tras el infarto de miocardio podna radicar en su capacidad para inducir neovascularizacion, que podna respaldar la formacion de nueva vasculatura cardiaca que mejorana la reperfusion del miocardio.

Aunque se sabe que el HGF protege al hngado frente a ataques externos, la generacion de HGF tambien se ha asociado con varias enfermedades extrahepaticas y del hngado. Pruebas experimentales y clmicas indican que el HGF desempena un papel crucial en la regeneracion del hngado. La cirrosis hepatica es el resultado final irreversible de la formacion de cicatrices fibrosas y la regeneracion hepatocelular y es una causa principal de morbimortalidad en todo el mundo sin terapia eficaz. Aunque no existe etiologfa espedfica para esta enfermedad, la cirrosis se ha definido como una enfermedad cronica del hngado en la que han tenido lugar dado disperso y regeneracion de celulas parenquimatosas hepaticas y en la que la diseminacion de tejido conjuntivo ha dado como resultado una organizacion inadecuada de las estructuras lobulares y vasculares (Fujimoto y Kaneda, 1999; Kaibori et al., 2002). Idealmente, los enfoques para el tratamiento de cirrosis hepatica deben incluir atenuacion de la fibrogenesis, fomento de la mitosis de hepatocitos y reformacion de la arquitectura tisular.

Estudios han mostrado que la administracion exogena de HGF recombinante aumenta el potencial de regeneracion del hngado tras hepatectoirna especialmente en los casos de hngado cirrotico (Boros y Miller, 1995; Kaibori et al., 2002; Borowiak et al., 2004). A la inversa, estudios han mostrado que los compuestos relacionados con clofibrato, que aumentan los niveles de HGF/SF, pueden inducir hepatomegalia, proliferacion de perixomas hepaticos y carcinoma hepatico (Xu y Wu, 1999). El vinculo de hGf/SF tanto positiva como negativamente con las enfermedades hepaticas ha hecho de las opciones terapeuticas relacionadas con HGF un area candente para el desarrollo farmaceutico.

Limitaciones al uso directo de HGF: El uso directo de HGF o cualquier otro factor neurotrofico proteico como agente terapeutico tiene dos limitaciones serias: 1) tamano grande y caracter hidrofilo que impiden la permeabilidad de la barrera hemotoencefalica (BHE); y 2) la necesidad de fabricarse mediante metodos recombinantes a alto coste, limitando por tanto su uso generalizado. Estos impedimentos pueden superarse usando uno o mas de una biblioteca extensa de mimeticos de HGF de molecula pequena que se describen en el presente documento, algunos de los cuales son activos por via oral, presentan una actividad procognitiva/antidemencia/neuroprotectora profunda y son economicos de sintetizar.

Antagonistas: Puede fomentarse la activacion inapropiada del receptor c-Met mediante mutaciones geneticas activantes, regulacion por incremento transcripcional o mediante mecanismos autocrinos o paracrinos dependientes de ligando.

Activacion de c-Met en cancer: El cancer es un grupo heterogeneo de enfermedades que resultan de la acumulacion de mutaciones geneticas. Estas mutaciones provocan una funcion alterada en protooncogenes conduciendo a la desregulacion de la senalizacion apoptotica, proliferacion y reparacion del ADN (Tannock, 2005). La desregulacion en las senales dentro de un grupo de celulas conduce al crecimiento incontrolado, y la invasion que o bien molesta directamente y destruye tejido adyacente o bien se metastatiza y se propaga a otra ubicacion en el organismo a traves del sistema linfatico o el torrente sangumeo.

Un sistema de Met y HGF disfuncional parece ser un rasgo cntico de numerosos tumores malignos humanos. La sobreexpresion ectopica de HGF y/o c-Met en lrneas celulares humanas y de raton les llevan a desarrollar fenotipos tumorigenicos y metastasicos en ratones desnudos atfmicos (Rong et al., 1994). Un gran numero de estudios ha mostrado que la ruta de HGF/c-Met es una de las rutas mas desreguladas en tumores malignos humanos, que incluyen, pero no se limitan a: canceres de vejiga, de mama, de cuello uterino, colorrectal, de endometrio, de esofago, gastrico, de cabeza y cuello, de rinon, de hngado, de pulmon, nasofarmgeo, de ovarios, de pancreas, de prostata y tiroideo (
http://www.vai.org/met/). Por ultimo, se han descubierto mutaciones activantes de c-Met en

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formas esporadicas y heredadas de carcinomas papilares renales humanos (Danilkovitch-Miagkova y Zbar, 2002). Estas mutaciones, que alteran secuencias dentro del dominio de cinasa, tambien se han encontrado en otros tipos de tumores solidos y lesiones metastasicas. En este punto merece la pena mencionar que la sobreexpresion o falta de expresion de hGf a menudo se correlaciona con un mal pronostico y que la regulacion por disminucion de la expresion de c-Met o HGF en celulas tumorales humanas redujo su tumorgenicidad (Abounader et al., 2002). La activacion de Met en cancer se produce lo mas a menudo a traves de activacion autocrina o paracrina con ligando. Osteosarcomas y globlastoma mutliforme, que expresan tanto c-Met como HGF, son ejemplos de control autocrino disfuncional. En otros casos en donde el control paracrino es fundamental, se ha notificado la sobreexpresion de c- Met en tumores primarios humanos mientras que el HGF lo proporcionan celulas estromales y no el propio tumor (Houldsworth et al., 1990; Kuniyasu et al., 1992; Hara et al., 1998; Tong et al., 2004; Miller et al., 2006; Bean et al., 2007).

La lista de neoplasias en las que se ha detectado sobreexpresion de c-Met esta creciendo sin cesar. En el caso de carcinomas, se han encontrado niveles excesivos de expresion de c-Met practicamente en cada tumor maligno (Danilkovitch-Miagkova y Zbar, 2002). La sobreexpresion de receptor puede conducir a la oligomerizacion del receptor local generando celulas reactivas a concentraciones de ligando subumbral. El propio HGF puede desencadenar la transcripcion de c-Met (Boccaccio et al., 1994), y es por tanto HGF, el que se expresa universalmente por celulas estromales en todo el organismo el que dirige normalmente la sobreexpresion tumoral de c-Met (Aguirre Ghiso et al., 1999; Parr et al., 2004). Esta singularidad de HGF le permite desempenar un papel cntico, que establece bucles de retroalimentacion positiva paracrinos que apoyan el crecimiento y la metastasis de celulas cancerosas. De manera interesante, esta nocion esta en consonancia con la observacion de que las mutaciones activantes de c-Met requieren HGF para potenciar su eficacia catalttica (Michieli et al., 1999). HGF tambien puede estimular de manera anomala c-Met de una manera autocrina, como se representa en gliobastomas (Weidner et al., 1990), carcinomas de mama (Potempa y Ridley, 1998), rabdomiosarcomas (Hartmann et al., 1994) y osteosarcomas (Ridley et al., 1995). Con multiples mecanismos de activacion, esta claro que tanto Met como HGF son los principales contribuidores a la progresion de la mayona de canceres humanos. Adicionalmente, las actividades demostradas de c-Met y HGF en la proliferacion, invasion, angiogenesis y antiapoptosis (Weidner et al., 1990; Rong et al., 1994; Kitamura et al., 2000; Xiao et al., 2001; Wang et al., 2002; Derksen et al., 2003) delimitan las diferentes etapas en las que estas moleculas pueden participar en el desarrollo tumoral.

Aunque se usa c-Met como marcador general para el cancer, tambien es un indicador de significacion biologica con respecto al tumor maligno y el pronostico del paciente, correlacionandose altos niveles con un mal pronostico. Por tanto, puede esperarse que moleculas que inhiben c-Met y HGF interfieran con las causas moleculares de muchos canceres, y deben ayudar significativamente a la atenuacion. Estudios recientes del laboratorio Harding han confirmado el uso potencial de antagonistas de HGF como agentes anticancerosos/antiangiogenicos eficaces (Yamamoto et al., 2010, Kawas et al., 2011; Kawas et al., 2012).

Degeneracion macular/retinopatia diabetica: La degeneracion macular asociada con la edad (DMAE) es la causa mas comun de perdida de vision irreversible en estadounidenses por encima de 60 anos de edad. Se predice que 10 millones de americanos padeceran algun nivel de este dano visual asociado con la edad durante sus anos de jubilacion. En los ojos sanos normales, las celulas epiteliales pigmentarias de la retina (EPR) forman una monocapa polarizada adyacente a los fotorreceptores y estan implicadas en diversas actividades que son esenciales para la homeostasis retinal y la funcion visual. En el caso de la degeneracion macular, desafortunadamente, las adhesiones y la comunicacion entre celulas EPR se pierden debido a la inflamacion. Cuando se produce la inflamacion, las celulas EPR secretan muchos factores de crecimiento incluyendo HGF/SF, que estimula la division y migracion de EPR y la formacion de nueva vasculatura a partir de vasos sangumeos existentes (angiogenesis). HGF tambien estimula la produccion de otros factores de crecimiento (por ejemplo VEGF), que promueven ademas la formacion de nuevos vasos sangumeos que invaden la matriz vecina (Jun et al., 2007). Por eso el uso de bloqueantes de HGF puede usarse o bien de manera profilactica, o bien como tratamiento para ralentizar la progresion de la enfermedad y la posterior perdida de vision.

La retinopatfa diabetica proliferativa (RDP), que conlleva una neovascularizacion distintiva de la retina que se caracteriza por la invasion de vasos en la cavidad vftrea, esta acompanada de hemorragias y formacion de cicatrices alrededor del canal proliferativo (Katsura et al., 1998). Existe una prueba sustancial de que estan implicados multiples factores de crecimiento en la aparicion y progresion del proceso de neovascularizacion en general y en la RDP espedficamente. Estos incluyen factor de crecimiento de fibroblastos basicos (bFGF), factores de crecimiento similares a la insulina (IGF-I), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y HGF. De estos, HGF tiene los efectos mas pronunciados sobre el crecimiento endotelial y la actividad mitogenica (Boulton, 1999). Estudios han encontrado que los niveles de HGF en el fluido vttreo de pacientes con RDP son considerablemente mas altos que en pacientes no diabeticos, y que los niveles de HGF son especialmente altos en la fase activa de RDP (Katsura et al., 1998). Esto sugiere que hGf estimula o perpetua la neovascularizacion en RDP. Por tanto, es plausible pensar que un antagonista de HGF sena una opcion prometedora como tratamiento profilactico o para mejorar la progresion de la RDP.

HARDING J W; et al, SOCIETY FOR NEUROSCIENCE ABSTRACT VIEWER AND ITINERARY, enero de 2009-20 de octubre de 2009, pagina 529.15, dan a conocer el desarrollo de analogos de angiotensina IV activos por via oral

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como farmacos antidemencia.

La invencion es tal como se define en las reivindicaciones.

Breve descripcion de los dibujos

Figuras 1A, B y C. Efecto de Dihexa sobre el aprendizaje espacial en el laberinto de agua. A: 30 minutes antes de comenzar las pruebas, se les administro a las ratas escopolamina directamente en el cerebro por via intracerebroventricular (ICV) y 10 minutos mas tarde se les administro Dihexa ICV a 10 pmoles (dosis baja) o 100 pmoles (dosis alta). Se realizo esto diariamente antes del primer ensayo de entrenamiento. Hubo 5 ensayos al dfa durante 8 dfas. La demora hasta encontrar el pedestal se considero una medida de aprendizaje y memoria. Las ratas que recibieron alta dosis de Dihexa pudieron superar completamente los deficits de escopolamina y no fueron diferentes de los controles. B. 30 minutos antes de comenzar las pruebas, se les administro a las ratas escopolamina directamente en el cerebro por via intracerebroventricular (ICV) y 10 minutos mas tarde se les administro Dihexa por via 1,25 mg/kg/dfa (dosis baja) y 2 mg/kg/dfa (dosis alta). Se realizo esto diariamente antes del primer ensayo de entrenamiento. Hubo 5 ensayos al dfa durante 8 dfas. La demora hasta encontrar el pedestal se considero una medida de aprendizaje y memoria. Las ratas que recibieron dosis alta de Dihexa pudieron superar completamente los deficits de escopolamina y no fueron diferentes de los controles. B: Se asignaron aleatoriamente ratas ancianas de sexo y edad mixtos (22-26 meses) a un grupo de control/no tratado o un grupo tratado con Dihexa (2 mg/kg/dfa). Las ratas no se examinaron previamente. Observese que normalmente ~el 50% de las ratas ancianas muestran deficits, de ate los errores de grupo grandes. El grupo de Dihexa tuvo un rendimiento significativamente mejor que los controles no tratados.

Figuras 2A y B. Dihexa y Nle1-AngIV estimulan de manera dependiente de la dosis la espinogenesis. A) Dihexa y B) Nle1-AngIV aumentan la densidad de espinas en neuronas del hipocampo transfectadas con mRFP-p-actina de una manera dependiente de la dosis. Se estimularon las neuronas con Dihexa o Nle1-AngIV a lo largo de un periodo de 5 dfas en un amplio intervalo de concentraciones. Datos obtenidos de cultivos separados; los cultivos tetean 12 dfas en el momento de la fijacion. Se conto a mano el numero de espinas dendnticas en segmentos de dendritas de 50 |im. ** = p < 0,05 y *** = p < 0,001; n = 50; media + EEM; Q = significativamente diferente del control.

Figura 3A-E. Efectos dependientes del tiempo de neuronas tratadas con Nle1-AngIV y Dihexa sobre la espinogenesis. Se trataron neuronas del hipocampo transfectadas con mRFP-p-actina con Dihexa o Nle1-Ang IV 10" 12 M durante 5 dfas en cultivo o durante 30 minutos antes de la fijacion en el dfa in vitro 12 (DIV12), promueven la espinogenesis. A) Imagen representativa del arbol dendntico de una neurona del hipocampo tratada con veteculo 5 dfas. B) Imagen representativa de un arbol dendntico de una neurona estimulada durante 5 dfas con Dihexa 10"12 M. C) Imagen representativa del arbol dendntico de una neurona estimulada con Nle1-Ang IV 10"12 M durante 5 dfas. D) Grafico de barras que representa el numero de espinas por longitud de dendrita de 50 |im por condicion de tratamiento tras un tratamiento in vitro de 5 dfas. *** P < 0,001; n = 200. E) Grafico de barras que representa el numero de espinas por longitud de dendrita de 50 |im por condicion de tratamiento tras un tratamiento de 30 minutos agudo. *** P < 0,001; n = 60. *Datos obtenidos de cultivos separados; los cultivos tetean 12 dfas en el momento de la fijacion. Media + EEM mediante ANOVA de una via y prueba a posteriori de Tukey.

Figura 4. Nle1-AngIV y Dihexa aumentan la anchura de la cabeza de espina. Se midio la anchura de la cabeza de espina como una indicacion de la resistencia sinaptica. Las cabezas de espina con una mayor area de superficie pueden alojar mas receptores de neurotransmisores y es mas probable que formen sinapsis funcionales. El aumento inducido por el tratamiento con analogo de AngIV en la anchura de la cabeza de espina sugiere una neurotransmision facilitada. *** = p < 0,001; media + EEM; n = 100.

Figura 5A-G. Patrones de neurotransmisores para neuronas estimuladas con Nle1-AngIV y Dihexa. Se inmunotineron neuronas tratadas con Dihexa y Nle1-AngIV para detectar el marcador presinaptico universal sinapsina y el marcador presinaptico glutamatergico VGLUT1. Se midio el porcentaje de correlacion entre las espinas postsinapticas (rojo) y los puntos presinapticos (verde) como una indicacion de sinapsis funcionales. A) Grafico de barras que representa un aumento en el numero de espinas tras el tratamiento con veteculo, Nle1-AngIV o Dihexa. Esto garantiza un fenotipo activo en las neuronas (*** = P < 0,001; media + EEM; n = 25). B) Grafico de barras que representa el porcentaje de correlacion de espinas postsinapticas inducidas por el tratamiento con el marcador presinaptico glutamatergico VGLUT1. Un alto porcentaje de correlacion entre el marcador presinaptico y las espinas postsinapticas sugiere que se forman conexiones funcionales (P > 0,05; media + EEM; n = 25). C) Grafico de barras que representa un aumento en el numero de espinas tras el tratamiento con veteculo, Nle1-AngIV o Dihexa, que garantiza la salud de las neuronas (***=P < 0,001; media + EEM; n = 25). D) Grafico de barras que representa el porcentaje de correlacion de espinas postsinapticas inducidas por el tratamiento con el marcador presinaptico general sinapsina. No se observaron diferencias significativas entre las neuronas estimuladas y neuronas tratadas con control de veteculo (P > 0,05; media + EEM; n = 25) lo que sugiere que la mayona de la entrada presinaptica es glutamatergica. E) Grafico de barras que representa un aumento en el numero de espinas tras el tratamiento con veteculo, Nle1-AngIV o Dihexa, que garantiza un fenotipo activo (***=P < 0,001; media + EEM; n = 25). F) Grafico de barras que representa el porcentaje de correlacion de espinas postsinapticas inducidas

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por el tratamiento con el marcador postsinaptico PSD-95. G) El grafico de barras no muestra diferencias significativas (P > 0,05; media + EEM; n = 25) entre el marcador postsinaptico PSD-95 y las espinas postsinapticas, lo que sugiere que las espinas recien formadas tienen un elemento postsinaptico funcional.

Figuras 6A y B. Corrientes postsinapticas excitatorias en miniatura (mEPSC) en neuronas del hipocampo disociadas. El tratamiento con Nle1-AngIV y Dihexa aumenta la frecuencia de corrientes postsinapticas excitatorias en miniatura (mEPSC). Se realizaron registros en neuronas del hipocampo disociadas tratadas con vehmulo, Nle1-AngIV o Dihexa 10"12 M durante 5 dfas antes del registro. Las corrientes registradas eran rafagas espontaneas de transmision sinaptica mediada por AMPA en ausencia de potenciales de accion portados en presencia de estricnina, picrotoxina y tetrodotoxina. A) Perfiles representativos de registros de mEPSC de neuronas del hipocampo tratadas con Nle1- AnglV o Dihexa. B) Grafico de barras que representa el aumento en las frecuencias mediadas por AMPA de neuronas del hipocampo tratadas con Nle1-AngIV o Dihexa. Las frecuencias aumentadas indican que las espinas inducidas por Nle1-AngIV o Dihexa soportan sinapsis funcionales. *** = p < 0,001; + EEM; n = 25.

Figura 7A y B. Evaluacion de la espinogenesis dependiente de Nle1-AngIV y Dihexa en neuronas del hipocampo CA1 de cultivos de cortes del hipocampo organotfpicos de rata. Se encontro que Nlel-AnglV y Dihexa soportaban la espinogenesis en neuronas del hipocampo CA1. Cultivos de cortes del hipocampo organotfpicos (grosores de 400 |im), que representan un entorno mas intacto, se transfectaron de manera biolfstica con la protema fluorescente roja soluble Tomato. Se seleccionaron neuronas del hipocampo CA1 para su evaluacion debido a su respuesta plastica conocida durante el aprendizaje. Se obtuvieron cortes de ratas en el dfa postnatal 5. A) Imagenes representativas de dendritas de neuronas CA1 de cortes del hipocampo transfectados con Tomato. Las imagenes representan un tratamiento de 2 dfas con Nle1-AngIV o Dihexa 10"12 M. B) Se observa espinogenesis inducida por el tratamiento en neuronas del hipocampo piramidales CA1. Los numeros de espinas medidos para cortes de control fueron de 7 por longitud de dendrita de 50 |im frente a 11 espinas por longitud de dendrita de 50 |im para neuronas tratadas con tanto Nle1-AngIV como Dihexa; media + EEM, n = 17; ** = P < 0,01 significacion estadfstica mediante ANOVA de una via seguido por una prueba de comparaciones multiples de Tukey; se repitieron los experimentos al menos tres veces.

Figura 8. HGF potencia la espinogenesis de manera dependiente de la dosis. Efecto de HGF sobre la espinogenesis en neuronas del hipocampo disociadas. Se transfectaron neuronas del hipocampo disociadas de ratas de 1 o 2 dfas de edad con mRFP-p-actina y se estimularon con HGF durante 5 dfas. El tratamiento con HGF 2,5 ng/ml no afecto a los numeros de espinas basales y se considero un subumbral. Dosis de 5, 10 y 20 ng/ml aumentaron significativamente el numero de espinas por longitudes de dendrita de 50 |im en comparacion con neuronas tratadas con control de vehmulo. *** P < 0,001; media + EEM; n = 50 por grupo tratamiento.

Figuras 9A y B. Efectos de Dihexa y HGF sobre la espinogenesis en cultivos de cortes del hipocampo organotfpicos. Se transfectaron de manera biolfstica cultivos de cortes del hipocampo con la protema soluble roja Tomato el DlV3 y se estimularon con Dihexa o HGF el DIV5. Los cultivos de cortes del hipocampo organotfpicos mantienen una trayectoria perforante mas intacta y por tanto representan un entorno mas intacto. A) Imagenes representativas de neuronas CA1, el tipo de neurona en el hipocampo que presenta plasticidad sinaptica asociada al aprendizaje. Se estimularon cortes del hipocampo con vehmulo, Dihexa 10"12 M o HGF 10 ng/ml durante 2 dfas. B) Grafico de barras que representa el numero de espinas por longitud de dendrita de 50 |im para cada grupo de tratamiento. Dihexa y HGF aumentan significativamente el numero de espinas en neuronas del hipocampo CA en comparacion con neuronas tratadas con control. *** = P < 0,001; media + EEM; n = 20 para neuronas estimuladas con control, 26 para neuronas estimuladas con Dihexa y 38 para neuronas estimuladas con HGF.

Figuras 10A-D. Efecto del tratamiento con HGF sobre la sinaptogenesis en neuronas del hipocampo disociadas. Tratamiento con HGF apoya la formacion de sinapsis funcionales tal como se indica por una alta correlacion entre espinas postsinapticas (rojo) y marcadores de zonas activas presinapticas (verde). A) Imagenes representativas de neuronas del hipocampo transfectadas con mRFP-p-actina el DIV6 y tratadas con 10 ng/ml de HGF o vehmulo durante 5 dfas in vitro. Se tineron las neuronas para detectar el marcador presinaptico general sinapsina y el marcador presinaptico glutamatergico VGLUT1. B) Grafico de barras que representa un fenotipo activo tal como se indica mediante un aumento significativo en el numero de espinas por longitud de dendrita de 50 |im tras estimulacion con HGF (10 ng/ml). Numero medio de espinas = 33 frente al control = 23; *** = P < 0,001 mediante ANOVA de una via y prueba de comparaciones multiples de Tukey; media + EEM; n = 25). C) Porcentaje de correlacion de espinas postsinapticas enriquecidas en actina (rojo) yuxtapuestas al marcador presinaptico universal sinapsina (verde). Un alto porcentaje de correlacion sugiere que se forman sinapsis funcionales. D) Porcentaje de correlacion de espinas enriquecidas en actina (rojo) yuxtapuestas al marcador presinaptico glutamatergico VGLUT1 (verde). Una correlacion mayor del 95% sugiere que muchas de estas entradas son glutamatergicas.

Figura 11. Efecto de Dihexa y el tratamiento con HGF sobre la frecuencia de mEPSC en neuronas del hipocampo disociadas. Se estimularon neuronas del hipocampo disociadas transfectadas con mRFP-p-actina con Dihexa 10-12M o 10 ng/ml durante 5 dfas antes de registrar las mEPSC. Se trataron las neuronas con tetrodotoxina, picrotoxina y estricnina para suprimir el potencial de accion, la inhibicion dependiente de GABA y la inhibicion dependiente de glicina. El tratamiento con ambos agonistas potencio significativamente las corrientes mediadas por

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AMPA en comparacion con neuronas tratadas con vehmulo (** P < 0,002; + EEM mediante ANOVA de una via seguido por prueba a posteriori de Newman-Keuls; n = 9, 9 y 11 respectivamente).

Figuras 12A y B. Efecto de dosis maximas y subumbral de analogos de angiotensina IV y HGF sobre la espinogenesis. A) Niveles subumbral de HGF, Dihexa o Nle1-AngIV no afectan a los numeros de espinas basales. Niveles subumbral combinados de Dihexa (10"13 M) y HGF (2,5 ng/ml) copian fenotfpicamente los efectos de Dihexa a su dosis biologicamente eficaz sola; # = 10"13 M y $ = 2,5 ng/ml. B) Una dosis subumbral del compuesto original Nle1-Ang IV (10'13 M) tampoco afecta a los niveles de espinas basales. Niveles subumbral combinados de Dihexa (10'13 M) y HGF (2,5 ng/ml) copian fenotfpicamente los efectos de Nle1-AngIV a su dosis biologicamente eficaz sola; # = 10"13 M y $ = 2,5 ng/ml. La capacidad de los agonistas combinados a dosis subumbral para generar respuestas maximas sugiere una coincidencia de rutas de receptores. *** P < 0,001; media + EEM; n=50.

Figura 13A-D. El efecto del antagonista de HGF Hinge novedoso sobre la espinogenesis mediada por HGF y ligando de angiotensina IV. A) Se evaluaron los efectos del antagonista de HGF Hinge (10'12 M) sobre la espinogenesis. Hinge no afecta a la espinogenesis en neuronas a lo largo de un amplio intervalo de dosis; se incluyo Dihexa para garantizar que las neuronas eran sensibles al tratamiento. B) Hinge inhibe la espinogenesis inducida por HGF. C) Hinge inhibe la espinogenesis inducida por Nle1-AngIV. D) Hinge inhibe la espinogenesis inducida por Dihexa. # = 10"12 M y $ = 10 ng/ml. Los datos anteriores indican ademas que las acciones de Nle1-AngIV y Dihexa estan mediadas por el sistema de HGF/c-Met. *** P < 0,001; media + EEM; n = 50.

Figura 14A-D. Efecto del antagonista de HGF Hinge sobre la potenciacion mediada por HGF y Dihexa de mEPSC en neuronas del hipocampo disociadas. Se trataron neuronas del hipocampo disociadas con Hinge (10-12 M), HGF, Dihexa (10-12 M) o HGF (10 ng/ml) durante 5 dfas, tiempo tras el cual se registraron las mEPSC en ausencia de potenciales de accion. A) Perfiles representativos de una neurona tratada con Hinge. B) Perfil representativo de una neurona tratada con vehmulo. C) HGF aumenta significativamente las frecuencias mediadas por AMPA en comparacion con neuronas tratadas con control. Este efecto se atenua por Hinge mientras que Hinge solo no tiene efecto. D) Las frecuencias mediadas por AMPA espontaneas aumentan significativamente tras el tratamiento con Dihexa y se reducen significativamente tras el tratamiento previo con Hinge, que solo no tiene efecto sobre las frecuencias de lmea base. * P < 0,001; media + EEM mediante ANOVA de una via seguido por prueba a posteriori de Newman-Keuls.

Figura 15A-B. Distribucion de protema c-Met en el cerebro de rata adulta. Se obtuvieron regiones cerebrales macroscopicas de ratas Sprague-Dawley adultas y se congelaron completamente en nitrogeno lfquido. Se homogeneizaron las muestras, se separaron mediante electroforesis y se sometieron a inmunotransferencia para determinar la protema c-Met y actina. A) El grafico de barras representa la cantidad de c-Met (unidades no especificadas) en distintas regiones cerebrales de importancia para la cognicion. Las muestras de cerebro eran en comparacion con hngado en donde se produce HGF. B) Una inmunotransferencia de tipo Western representativa de las muestras estudiadas con sonda frente a protema c-Met (las bandas estan a 145 kDa) y sirviendo la actina como control de carga. Se cargaron cantidades iguales de protema en cada carril basandose en las determinaciones de protema por BCA.

Figura 16. Estimulacion de la fosforilacion de c-Met por HGF y Dihexa en cortes de hipocampo de rata. Para someter a prueba si Dihexa podna activar el receptor c-Met en el cerebro de rata adulta, se estimularon completamente cortes del hipocampo durante 30 minutos con HGF, Dihexa o vehmulo (aCSF). Se midio la activacion del receptor mediante fosforilacion del receptor c-Met mediante inmunotransferencia de tipo Western. Dosis de saturacion de HGF (100 ng/ml) y Dihexa (10'1° M) aumentan eficazmente la fosforilacion de c-Met en cortes del hipocampo adultos estimulados completamente en comparacion con cortes tratados con vehmulo. Dosis subumbral de HGF (50 ng/ml) y Dihexa (10-12 M) no aumentaron significativamente la fosforilacion del receptor c-Met en comparacion con el control. Sin embargo, dosis subumbral combinadas de HGF y Dihexa copiaron fenotfpicamente la dosis de saturacion de HGF y Dihexa.

Figura 17. Efecto del mimetico de HGF, Dihexa, sobre la activacion de c-Met. Se trataron celulas HEK 293 con HGF +/- Dihexa a diversas dosis, se incubaron a 37°C durante 30 minutos y luego se analizaron para detectar c-Met fosforilado (activado) mediante inmunotransferencia. Los resultados demostraron claramente la capacidad de HGF y Dihexa para funcionar de manera sinergica activando c-Met.

Figura 18. Efecto del mimetico de HGF, Dihexa, sobre la dispersion de celulas dependiente de HGF. Se evaluo la dispersion de celulas en celulas MDCK. Se hicieron crecer las celulas hasta la confluencia sobre cubreobjetos, que entonces se transfirieron a una placa limpia. Tras el tratamiento durante cuatro dfas, se cuantifico el numero de celulas que se habfan retirado por dispersion del cubreobjetos. HEX=Dihexa a 10'1° M.

Figura 19. Verificacion de la inactivacion del receptor c-Met. Se confirmo la inactivacion del receptor transfectando celulas HEK con mRFP-p-actina (no transfectada), un producto genico de cMet etiquetado con 6Myc que servfa para verificar la presencia de protema, secuencias de ARNhp (c-Met) (solo se empleo sh1 para el experimento de inactivacion) y se ambos ARNhp combinados. Se cultivaron las celulas transfectadas durante 24 horas adicionales,

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luego se lisaron con tampon RIPA y se prepararon para la electroforesis en gel. Se estudiaron con sonda las muestras frente a Myc mediante inmunotransferencia de tipo Western. Las celulas no transfectadas que seman como control negativo no mostraban senal, el producto genico de cMet etiquetado con 6-Myc era el control positivo y tema una senal fuerte. Las secuencias de tanto shMetl como shMet2 atenuaron considerablemente la senal y combinadas no teman una senal, lo que indica inactivacion eficaz del receptor.

Figura 20. Efecto de la inactivacion de c-Met sobre la espinogenesis usando un ARNhp. La imagen muestra una inmunotransferencia de tipo Western estudiada con sonda para detectar Myc. Se estimularon neuronas del hipocampo transfectadas con mRFP-p-actina sola o con shMet para desactivar el receptor c-Met con HGF (10 ng/ml), Dihexa (10'12 M) o Nle1-AngIV (10'12 M) durante 48 horas. Neuronas transfectadas con mRFP-p-actina y estimuladas con HGF, Dihexa o Nle1-AngIV aumentaron significativamente la espinogenesis (* P < 0,05; media + EEM; n = 100). Las neuronas transfectadas con mRFP-p-actina y shMet no respondieron a la estimulacion con tratamiento con HGF, Dihexa o Nle1-AngIV, confirmando que HGF y c-Met son la diana (P > 0,05; media + EEM; n = 100).

Figura 21. HGF y c-Met tienen una funcion en el aprendizaje espacial y la memoria. Se sometio a prueba en ratas la demora hasta ubicar un pedestal sumergido en la tarea de laberinto de agua de Morris de aprendizaje espacial y memoria para determinar los efectos de HGF/c-Met sobre el aprendizaje y la memoria. Las ratas recibieron inyecciones i.c.v. de farmacos amnesicos o agonistas de receptor c-Met/HGF. Las ratas tratadas con la escopolamina ^ escopolamina no pueden aprender la tarea tal como se mide mediante la demora en escapar. Las demoras de grupo para ratas tratadas con aCSF ^ aCSF fueron significativamente mas cortas que las del grupo tratado con escopolamina en el dfa uno de entrenamiento. Las ratas tratadas con escopolamina ^ Dihexa y las ratas tratadas con Hinge ^ Hinge, aunque no eran significativamente diferentes del grupo tratado con escopolamina en el dfa uno de entrenamiento, muestran una agilizacion rapida de la tarea. El grupo que recibio escopolamina + Hinge ^ Dihexa no era significativamente diferente de los animales tratados con escopolamina y tiene largas demoras en escapar. Demoras de grupo hasta ubicar un pedestal sumergido en la tarea de laberinto de agua de Morris de aprendizaje espacial y memoria. Hinge solo no tiene ningun efecto sobre el aprendizaje; sin embargo Hinge ademas de escopolamina impide la agilizacion de la tarea.

Figura 22. Estabilidad de Norleual en sangre de rata en comparacion con D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2. Se incubaron -▲- Norleual y -■ -D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 en sangre de rata heparinizada a 37°C; la figura muestra el porcentaje de recuperacion a lo largo del tiempo (media + DE). El t-i/2 de estabilidad calculado basandose en una descomposicion exponencial de una unica fase para Norleual fue de 4,6 min y para D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5- CONH2 el t-i/2 de estabilidad fue de 79,97 min.

Figura 23. Union de analogos de D-Nle-X-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 a HGF. Curvas representativas que ilustran la competencia de analogos de D-Nle-X-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 por la union de 3H-Hinge a HGF. Se incubaron los analogos de D-Nle-X-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 y 3H-Hinge (13,3x10‘12 M) con 1,25 ng de HGF durante 40 min a 37°C en 0,25 ml de tampon. Se eluyo Hinge unido a HGF de las columnas de Bio-Gel P6 tras la adicion de diferentes concentraciones de los analogos de D-Nle-X-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 (10'13-10'7 M). Se cuantifico la radioactividad de las disoluciones eluidas usando recuento de centelleo. Estos datos demuestran que los analogos de D-Nle-X-Ile-NH- (CH2)5-CONH2 presentan una gama de afinidades por HGF. Se determino que las Ki para los analogos de Met, Trp, Cys y Tyr eran respectivamente: 1,375x1007 M, 3,372x10'°9 M, 1,330x10'1° M y 2,426x10'1° M; N=9. -▲- D-Nle-Cys- Ile-NH-(CH2)5-CONH2, -•- D-Nle-Met-Ile- NH-(CH2)5-CONH2, -■- D-Nle-Trp-Ile-NH-(CH2)5-CONH2, -▼- D-Nle-Tyr-Ile- NH-(CH2)5-CONH2.

Figura 24. Inhibicion de la dimerizacion de HGF por analogos de D-Nle-X-Ile-NH-(CH2)5-CONH2. HGF se dimeriza espontaneamente cuando se incuba en PBS en presencia de heparina. Se incubo HGF sin (control) o con diversos candidatos a farmaco a 10'1° M. Estos incluyen los derivados de D-Nle-X-Ile-amida del acido (6)-amino-hexanoico, una familia de analogos basados en AngIV, en donde X= Tyr, Cys, Trp y Met. Tras 30 minutos de incubacion, se reticularon las muestras con BS3, se separaron mediante electroforesis en gel y se tineron con plata. Se cuantifico la densidad de bandas y se uso para determinar el nivel de dimerizacion de HGF en cada grupo. Los grupos de tratamiento (Tyr, Cys, Trp) eran estadfsticamente diferentes del grupo tratado con HGF (P<0,05; N=8). (A) Gel representativo. (B) Datos agrupados y cuantificados.

Figura 25. Inhibicion de la fosforilacion de Met por analogos de D-Nle-X-Ile-NH-(CH2)5-CONH2. Se trataron celulas HEK293 durante 10 min con analogos de HGF+/- Nle-X-Ile-amida del acido (6)-amino-hexanoico a las concentraciones indicadas. Se sometieron a inmunotransferencia lisados de celulas HEK293 con anticuerpos anti- fosfo-Met y anti-Met. Las diferencias en los valores medios para la fosforilacion de Met entre los grupos de tratamiento indicados (analogos de Nle-X-Ile-amida del acido (6)-amino-hexanoico) en comparacion con el grupo tratado con HGF eran mayores de los que se esperana por casualidad (P <0,05; N=6). El grupo de Met no era diferente del grupo de HGF (P>0,05; N=6).

Figura 26. Efectos de analogos de D-Nle-X-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 sobre la proliferacion de celulas MDCK. Se trataron celulas MDCK con un vehfculo de PBS (control negativo), HGF o HGF en combinacion con analogos de Nle-

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X-Ile-amida del acido (6)-amino-hexanoico (X= L-aminoacido) a una concentracion de 10"10 M. El peptido Hinge (KDYIRN), que representa el dominio de dimerizacion de HGF, se incluyo como control positivo. Se permitio que las celulas crecieran durante 4 d^as. Se estimaron los numeros de celulas el cuarto d^a con un ensayo de MTT midiendo la absorbancia a 590. % de proliferacion dependiente de HGF: se restaron los valores de control de todos los valores para determinar el aumento inducido por HGF en la proliferacion celular. N=6. *** p<0,001. ** p<0,001, * p<0,05, ns: no significativo.

Figura 27. Efecto de analogos de D-Nle-X-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 sobre la dispersion dependiente de HGF en celulas MDCK. La dispersion de celulas en la que las celulas pierden los contactos de celula a celula y luego migran rapidamente es la respuesta clasica a HGF. Se hicieron crecer celulas MDCK, el modelo celular de referencia para estudiar el sistema de HGF/Met, hasta el 100% de confluencia sobre cubreobjetos y luego se colocaron en una placa limpia. Se estimularon las celulas para que se separaran por dispersion del cubreobjetos anadiendo 20 ng/ml de HGF al medio solo o en combinacion con analogos de Nle-X-Ile-amida del acido (6)-amino-hexanoico (X= L- aminoacido). Tras 48 h de dispersion, se fijaron las celulas con metanol y se tineron con Diff-Quik. Se retiraron los cubreobjetos para revelar el anillo de celulas que se habfan retirado por dispersion del cubreobjetos y sobre la placa. (A) Se cuantifico el efecto de HGF sobre la dispersion determinando mediante densitometna las imagenes digitales de las celulas dispersadas. El analisis de ANOVA indica que los grupos tratados con Tyr + HGF, Cys + HGF y Trp + HGF eran diferentes del grupo de HGF solo pero no eran diferentes del grupo de control. Los grupos de HGF y HGF + Met no eran diferentes. N=8, p<0,05. (B) Imagenes representativas de la separacion por dispersion de celulas MDCK de los cubreobjetos.

Figura 28. Correlacion entre la inhibicion de la dispersion de celulas MDCK y la interferencia con la dimerizacion y la afinidad para unirse a HGF. Se examinaron tres derivados del D-Nle-X-Ile-amida del acido (6)-amino-hexanoico, en donde X es: Cys, Trp o Met para determinar si el porcentaje de inhibicion de la dimerizacion y la afinidad de union para cada compuesto por HGF podna correlacionarse en relacion con la actividad celular in vitro, concretamente inhibicion de dispersion de celulas MDCK. La figura muestra una fuerte correlacion entre porcentaje de inhibicion de la dimerizacion de HGF (♦; R2=0,9809) y para la afinidad de union a HGF (d; valores de Ki; R2=0,9903) y el porcentaje de inhibicion de la dispersion de celulas dependiente de HGF.

Figura 29. Inhibicion de la colonizacion de melanoma pulmon B16-F10 mediante D-Nle-Cys-Ile-NH-(CH2)5-CONH2. Se inyectaron 400.000 celulas de melanoma murino B16-F10 en la vena de la cola de ratones C57BL/6. Los ratones recibieron inyecciones i.p. diarias de D-Nle-Cys-Ile-amida del acido (6)-amino-hexanoico (10 |ig/kg/dfa o 100 |ig/kg/dfa) o vehnculo de PBS. (A) Tras 14 dfas, los pulmones de ratones tratados con D-Nle-Cys-Ile-amida del acido (6)-amino-hexanoico presentaban una reduccion obvia en las colonias de melanoma en comparacion con controles no tratados. (B) Tras la extirpacion, se homogeneizaron los pulmones y se determino el contenido en melanina total espectrofotometricamente y se uso para cuantificar la colonizacion por melanoma pulmonar total en ratones tratados con vehfculo y tratados con D-Nle-Cys-Ile-amida del acido (6)-amino-hexanoico. Pulmones de control de edad coincidente no injertados presentaban una absorbancia de fondo a 410 nm. N=15, media + EEM; *P<0,05, *** P<0,001.

Descripcion detallada

Mimeticos o analogos peptfdicos de HGF (tambien denominados “analogos” o “mimeticos de factores de crecimiento”) que tienen una variedad de utilidades terapeuticas tienen la siguiente formula estructural general:

0

Ri-R2-R3-NMCH2)n-C^

imagen1

en la que

R1 es un grupo N-acilo tal como, por ejemplo, hexanoflo, heptanoflo, pentanoflo, butanoflo, propanoflo, acetanoflo o benzoflo,

un fenilo sustituido o no sustituido, una D o L norleucina,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

un aminoacido (D o L) tal como, por ejemplo, lisina, arginina, norvalina, ornitina o residuos de aminoacido de S- bencilcistema;

R2 es un aminoacido (D o L), tal como, por ejemplo, tirosina, cistema, fenilalanina, acido aspartico, acido glutamico, glicina, triptofano, lisina, homocistema, homoserina, homofenilalanina;

R3 es un residuo de aminoacido de D o L isoleucina, leucina o valina; y

n oscila entre 3-6;

y en la que los enlaces covalentes 1,2 y 3 son o bien enlaces peptidicos (por ejemplo -CO-NH-) o enlaces peptidicos reducidos (CH2-NH2).

A continuacion se representan un enlace peptidico y un enlace peptidico reducido a modo de ejemplo:

Enlace peptidico Enlace peptidico reducido

T

imagen2

Se han sintetizado compuestos dentro de la formula estructural general y se han analizado segun los siguientes procedimientos.

Metodos de smtesis convencionales:

Se sintetizaron todos los compuestos mediante metodos en fase solida usando un sintetizador peptidico AAPPTEC Endeavor 90 usando aminoacidos protegidos con Fmoc. Se sintetizaron todas las amidas peptidicas sobre una resina Rink. Se hincho previamente la resina en dimetilformamida (DMF) y se desprotegio con piperidina al 20%/DMF durante 30 minutos. Entonces se elimino la piperidina/DMF mediante filtracion. Tras la desproteccion, se anadio el aminoacido protegido con N-a Fmoc al recipiente de reaccion como un polvo seco (3 equivalentes). Entonces se lleno el recipiente con 2/3 del total con DMF y diisopropiletilamina seca (DIPEA; 3,5-4 equivalentes). A continuacion, se anadio N-oxido de hexafluorofosfato de N-[(1H-benzotriazol-1-il)(dimetilamino)metilen]-N-metil- metanaminio (HBTU; 2,9 equivalentes) y se mezclo la suspension durante 30 minutos. Entonces se retiro la disolucion mediante filtracion. Entonces se lavo la resina dos veces con DMF, dos veces con metanol, dos veces con diclorometano y finalmente dos veces mas con DMF. Se retiraron las disoluciones mediante filtracion tras cada lavado. Se monitorizo la eficacia de acoplamiento usando una prueba Kaiser para aminas libres. Si la prueba era positiva el aminoacido volvfa a acoplarse a la resina o a la cadena de peptido en crecimiento. Si la prueba indicaba una buena union, se lavo una vez mas la resina con DMF, se desprotegio con piperidina al 20%/ DMF durante 30 minutos tal como se indico anteriormente y se lavo de nuevo con dMf. Entonces se realizo el acoplamiento tal como se indico anteriormente.

Acilacion del extremo N-terminal del peptido:

Tras la desproteccion final, se incuba la resina de peptido con el 20% del anltidrido de acilo apropiado en DMF y DIPEA (1,5 equivalentes) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se lavo ahora la resina dos veces con DMF, dos veces con metanol, dos veces con diclorometano, y finalmente dos veces mas con DMF. Se retiro la disolucion mediante filtracion y se realizo una prueba Kaiser para verificar la finalizacion de la ocupacion de extremos. Si se detecto amina libre, se repitio el procedimiento de ocupacion de extremos.

Insercion de un enlace peptidico reducido N-terminal:

Tras la desproteccion, se anadio hexanal (3 equivalentes) DMF a la resina y se permitio que se mezclara durante 5 minutos. A continuacion, se anadieron 3 equivalentes de cianoborohidruro de sodio y se mezclo la suspension durante 2 horas adicionales. Tras realizarse el procedimiento de lavado convencional (vease anteriormente), se uso de nuevo la prueba Kaiser para verificar la finalizacion de la reaccion. Si el acoplamiento se consideraba incompleto, se repitio el procedimiento.

Escision del peptido de la resina Rink:

Tras desprotegerse el ultimo aminoacido y lavarse se transfirio la resina a un embudo de vidrio sinterizado (porosidad de 4) y se elimino la DMF mediante vacfo. Entonces se suspendio la resina semiseca en acido

5

10

15

20

25

30

35

trifluoroacetico al 20% (TFA) con triisopropil-silano al 2,5% como eliminador, se incubo a temperatura ambiente durante 15 minutos y se filtro. Se lavo la resina tres veces con DMF adicional y se filtro. Se anadieron diez volumenes de dietil eter enfriado con hielo a los filtrados combinados y se permitio que la mezcla se endureciera a 4°C durante la noche. Se recupero el peptido precipitado mediante filtracion y se lavo tres veces con eter enfriado con hielo. Para peptidos muy hidrofobos, volvieron a extraerse los lavados con eter combinados con DMF, se permitio que precipitara el peptido y se filtraron para recuperar peptido adicional.

Purificacidn de peptidos y analisis:

Se purificaron en primer lugar peptidos en bruto mediante HPLC de fase inversa usando una columna C18 usando elucion en gradiente. El gradiente tfpico era del 10% al 40% de componente B a lo largo de 30 minutos a una velocidad de flujo de 1 ml/min a 37°C en donde el componente A era fosfato de trietilamina 80 mM, pH 3,0 y el componente B era acetonitrilo (ACN). En todos los casos solo se detecto y recogio un unico pico con absorcion a 215 nm. Se liofilizo el compuesto recogido y se redisolvio en metanol al 20% y se inyecto sobre una segunda columna C18. El sistema de HPLC/EM usado era de Shimadzu (Kyoto, Japon), que consistfa en un modulo de bus de comunicaciones CBM-20A, bombas LC-20AD, inyector automatico SIL-20AC, detector de red de diodos SPD- M20A y espectrometro de masas LCMS-2010EV. Se lograron la recogida e integracion de datos usando el software de soluciones de CLEM de Shimadzu. La columna analftica usada era una Econosphere C18 (100 mm x 2,1 mm) de Grace Davison Discovery Science (Deerfield, IL, EE.UU.). La fase movil consistfa en metanol de calidad para HPLC y agua con acido trifluoroacetico al 0,1%. Se llevo a cabo la separacion usando un metodo no isocratico (el 20% - 50% de metanol a lo largo de 30 min) a 37°C y una velocidad de flujo de 0,3 ml/min. Para el analisis de EM, se uso un modo de ion positivo (Scan) y se analizaron los picos a la m/z anticipada. El analisis de pureza de pico tfpico revelo un mdice de pureza de pico de >0,95. El racionamiento de la longitud de onda con el detector de red de diodos confirmo adicionalmente la pureza de pico.

La tabla 1 a continuacion presenta un listado de compuestos en la familia 1, referida a mimeticos, y las familias 2-5, referidas a antagonistas, todos los cuales se han sintetizado y analizado segun los procedimientos descritos anteriormente.

TABLA 1

Estructura general de la familia 1 (mimeticos) y las familias 2-5 (antagonistas)

imagen3

Las flechas 1-3 indican pb = enlace peptfdico; y = enlace de peptido reducido (CH2-NH2) n=5

Familia n.°

R1(grupo N-acilo) R2 R3 1

1

hexanoflo Tyr Ile pb

heptanoflo Tyr Ile pb

pentanoflo Tyr Ile pb

butanoflo Tyr Ile pb

propanoflo Tyr Ile pb

acetanoflo Tyr Ile pb

benzoflo Tyr Ile pb

hexanoflo Tyr Ile

Familia n.°

R1 R2 R3

2

D-Nle Tyr Ile

D-Nle Phe Ile

D-Nle Asp Ile

D-Nle Arg Ile

D-Nle Ile Ile

D-Nle Ser Ile

D-Nle His Ile

D-Nle Gly Ile

D-Nle Cys Ile

D-Nle Met Ile

D-Nle Trp Ile

D-Nle Lys Ile

D-Nle Val Ile

D-Nle Gly D-Ile

R1 R2 R3

3

D-Nle D-Tyr Ile

D-Nle D-Phe Ile

D-Nle D-Asp Ile

D-Nle D-Arg Ile

D-Nle D-Ile Ile

D-Nle D-Ser Ile

D-Nle D-His Ile

D-Nle D-Gly Ile

D-Nle D-Cys Ile

D-Nle D-Met Ile

D-Nle D-Trp Ile

D-Nle D-Lys Ile

R1 R2 R3

4

Tyr Tyr Ile

Phe Tyr Ile

Asp Tyr Ile

Arg Tyr Ile

Ile Tyr Ile

Ser Tyr Ile

His Tyr Ile

Gly Tyr Ile

Cys Tyr Ile

Met Tyr Ile

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Lys Tyr Ile

R1 R2 R3

5

D-Tyr Tyr Ile

D-Phe Tyr Ile

D-Asp Tyr Ile

D-Arg Tyr Ile

D-Ile Tyr Ile

D-Ser Tyr Ile

D-His Tyr Ile

D-Cys Tyr Ile

D-Met Tyr Ile

D-Typ Tyr Ile

D-Lys Tyr Ile

Con referencia a la tabla 1, aunque varios compuestos que se han sintetizado incluyen tirosina e isoleucina en R2 y R3, respectivamente, un amplio intervalo de aminoacido y otros residuos podna usarse para los mimeticos o agonistas (familia 1 y familias 2-5, respectivamente) en la practica de realizaciones de la invencion en estas otras 5 posiciones incluyendo, sin limitacion, tirosina, cistema, metionina, fenilalanina, acido aspartico, acido glutamico, histidina, triptofano, lisina, leucina, valina, homocistema, homoserina y homofenilalanina. Ademas, aunque los mimeticos incluyen determinados grupos N-acilo tal como se especifica en la tabla 1 (familia 1), en la practica de las diversas realizaciones de la invencion pueden usarse otros grupos N-acilo o fenilo sustituido o no sustituido en R1. Ademas, aunque varios de los agonistas en la tabla 1 (familias 2-5) tienen norleucina en R1, o un residuo de 10 aminoacido, en la practica de diversas realizaciones de esta invencion pueden usarse varios residuos de aminoacido (D o L) en el residuo R1, incluyendo sin limitacion, los residuos de aminoacido tirosina, fenilalanina, acido aspartico, arginina, isoleucina, serina, histidina, glicina, cistema, metionina, triptofano, norvalina, ornitina, S-bencilcistema. Finalmente, aunque todos los compuestos sintetizados y sometidos a prueba en la tabla 1 inclrnan repeticiones de 5 metilo, las repeticiones de metilo (n) podnan oscilar entre 3-6 dentro de la practica de algunas de las realizaciones 15 de la presente invencion.

Los compuestos dentro de la tabla 1 se han evaluado tambien tal como sigue:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Evaluacion de la actividad del mimetico de HGF:

Se evaluo normalmente la actividad del mimetico de HGF mediante uno o ambos dos metodos: aumento de la fosforilacion dependiente de HGF de c-Met en celulas HEK293, o 2) aumento de la dispersion de celulas dependiente de HGF en celulas MDCK. Se sometieron a prueba todos los compuestos en la familia usando el ensayo de fosforilacion de c-Met. Se evaluaron adicionalmente N-hexanoil-Tyr-Ile-(6)aminohexamida y se encontro que tiene una dispersion de celulas MDCK dependiente de HGF espectacularmente aumentada. La tabla 2 presenta un resumen de los resultados.

TABLA 2

Compuesto (10-12 M)_________________________________Actividad del mimetico de HGF

N-heptanoil-Tyr-Ile-(6)aminohexamida ++++

N-hexanoil-Tyr-Ile-(6)aminohexamida ++++

N-pentanoil-Tyr-Ile-(6)aminohexamida ++++

N-butanoil-Tyr-Ile-(6)aminohexamida +++

N-propananoil-Tyr-Ile-(6)aminohexamida ++

N-acetanoil-Tyr-Ile-(6)aminohexamida +

N-benzoil-Tyr-Ile-(6)aminohexamida +

N-hexanoil-y (CH2-NH2)-Tyr-Ile-(6)aminohexamida +++

Cultivo celular. Se hicieron crecer celulas de rinon embrionario humano 293 (HEK293), celulas de rinon canino Madin Darby (MDCK) y celulas de melanoma murino B16F10 en DMEM, suero bobino fetal (FBS) al 10%. Se hicieron crecer las celulas hasta el 90-100% de confluencia antes de su uso. Para la mayona pero no todos los estudios se privaron de suero las celulas HEK y MDCK durante 24 horas antes del inicio del tratamiento con el farmaco.

Inmunotransferencia de tipo Western. Se sembraron celulas HEK293 en placas de cultivo tisular de 6 pocillos y se hicieron crecer hasta el 95% de confluencia en DMEM que contema FBS al 10%. Se privaron de suero las celulas durante 24 horas antes del tratamiento para reducir los niveles basales de fosfo-Met. Tras la privacion de suero, se prepararon cocteles compuestos por vehmulo y HGF (2,5 ng/ml) con/sin el compuesto de prueba y se preincubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Entonces se anadio el coctel a las celulas durante 10 minutos para estimular el receptor Met y protemas posteriores. Se recogieron las celulas usando tampon de lisis RIPA (Upstate) fortalecido con cocteles de inhibidores de fosfatasa 1 y 2 (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO). Se clarifico el lisado mediante centrifugacion a 15.000 g durante 15 minutos, se determinaron las concentraciones de protema usando el ensayo de protema total BCA, y entonces se diluyeron volumenes apropiados de los lisados con tampon Laemmli reductor 2x y se calentaron durante diez minutos a 95°C. Se resolvieron muestras que conteman cantidades identicas de protema usando SDS-PAGE (Criterion, BioRad Laboratories), se transfirieron a nitrocelulosa y se bloquearon en solucion salina tamponada con Tris (TBS) que contema leche al 5% durante una hora a temperatura ambiente. Se anadio el anticuerpo frente a fosfo-Met al tampon de bloqueo a una concentracion final de 1:1000 y se incubo a 4°C durante la noche con agitacion suave. Entonces se lavaron las membranas varias veces con agua y TBS (PBS, Tween-20 al 0,05%), se anadio una dilucion 1:5000 de antisuero de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa del rabano, y se incubaron adicionalmente las membranas durante una hora a temperatura ambiente. Se visualizaron las protemas usando el sistema de sustrato quimioluminiscente Supersignal West Pico (Pierce, Fenton, MO) y se determinaron los pesos moleculares mediante comparacion con marcadores de peso molecular de protema (BenchMark, Invitrogen; y Kaleidoscope, BioRad). Se digitalizaron las imagenes y se analizaron usando un sistema de deteccion y cuantificacion de la radiactividad UVP.

Ensayo de dispersion. Se hicieron crecer celulas MDCK hasta el 100% de confluencia sobre los cubreobjetos en placas de seis pocillos y se lavaron dos veces con PBS. Entonces se transfirieron de manera aseptica los cubreobjetos confluentes a placas de seis pocillos nuevas que conteman 900 |il de DMEM libre de suero. Se anadieron Norleual, peptido Hinge y/o HGF (2,5 ng/ml) a pocillos apropiados. Los pocillos de control recibieron vehmulo de PBS. Se incubaron las placas a 37°C con el 5% de CO2 durante 48 horas. Se retiro el medio y se fijaron las celulas con metanol. Se tineron las celulas con Diff-Quik Wright-Giemsa (Dade-Behring, Newark, DE) y se tomaron imagenes digitales. Se retiraron los cubreobjetos con pinzas y se capturaron mas imagenes digitales. Se logro la cuantificacion de pfxeles de las imagenes usando Image J y se realizo el analisis estadfstico usando Prism 5 e InStat v.3.05.

Para la formula estructural general presentada anteriormente, y reproducida a continuacion para facilidad de referencia, hay varios compuestos diferentes que pueden prepararse segun los procedimientos de smtesis descritos anteriormente y usados para las terapias descritas a continuacion. La tabla 3 identifica diversas familias a modo de ejemplo con diversos compuestos enumerados en esas familias (identificados por sustitucion de restos dentro de la formula general).

TABLA 3

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C I 5 pb pb V

benzoMo

C I 5 pb pb V

13-16 Mismo patron que las

familias 1-4 con R2=S

17-20 Mismo patron que las

familias 1-4 con R2=T

21-24 Mismo patron que las

familias 1-4 con R2=D

25-28 Mismo patron que las

familias 1-4 con R2=E

29-32 Mismo patron que las

familias 1-4 con R2=Y, R3=V

33-36 Mismo patron que las

familias 1-4 con R2=F, R3=V

37-40 Mismo patron que las

familias 1-4 con R2=C, R3=V

41-44 Mismo patron que las

familias 1-4 con R2=S, R3=V

45-48 Mismo patron que las

familias 1-4 con R2=T, R3=V

49-52 Mismo patron que las

familias 1-4 con R2=D, R3=V

53-56 Mismo patron que las

familias 1-4 con R2=E, R3=V

57-85 Mismo patron que las

familias 29-56 con R3=L

86-170 Mismo patron que las familias 1-85 con n=3

171-256 Mismo patron que las familias 1-85 con n=4

257-341 Mismo patron que las familias 1-85 con n=6

R1

R2 Ra n 1 2 3

342 D-norleucina

Y I 5 pb pb pb

D-norleucina

F I 5 pb pb pb

D-norleucina

C I 5 pb pb pb

D-norleucina

S I 5 pb pb pb

D-norleucina

T I 5 pb pb pb

D-norleucina

D I 5 pb pb pb

D-norleucina

E I 5 pb pb pb

D-norleucina

G I 5 pb pb pb

343 D-norleucina

Y I 5 pb pb V

D-norleucina

F I 5 pb pb V

D-norleucina

C I 5 pb pb V

D-norleucina

S I 5 pb pb ____V________

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D-norleucina T I 5 pb pb V

D-norleucina D I 5 pb pb V

D-norleucina E I 5 pb pb V

D-norleucina G I 5 pb pb V

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D-norleucina Y I 5 V pb pb

D-norleucina F I 5 W pb pb

D-norleucina C I 5 V pb pb

D-norleucina S I 5 V pb pb

D-norleucina T I 5 V pb pb

D-norleucina D I 5 V pb pb

D-norleucina E I 5 V pb pb

D-norleucina G I 5 V pb pb

345

D-norleucina Y I 5 V pb V

D-norleucina F I 5 V pb V

D-norleucina C I 5 V pb V

D-norleucina S I 5 V pb V

D-norleucina T I 5 V pb V

D-norleucina D I 5 V pb V

D-norleucina E I 5 V pb V

D-norleucina G I 5 V pb V

346-349

Mismo patron que las familias 342-345 con R3=V

350-353

Mismo patron que las familias 342-345 con R3=L

LO CD CO '4 LO CO

Mismo patron que las familias 342-353 con R1=D norvalina

366-377

Mismo patron que las familias 342-345 con R3=D-lisina

378-389

Mismo patron que las familias 342-345 con R3=D- arginina

390-401

Mismo patron que las familias 342-345 con R3=D S-metilcistema

402-457

Mismo patron que las familias 342-401 con n=3

458-513

Mismo patron que las familias 342-401 con n=4

514-569

Mismo patron que las familias 342-401 con n=6

Alternativamente, los analogos o

mimeticos de factores de crecimiento de la presente divulgacion tambien pueden

representarse como compuestos por cuatro elementos unidos mediante enlaces peptfdicos covalentes o enlaces

peptidicos reducidos, tal como sigue:

I-II-III-IV en donde

I = un acido tal como acido heptanoico, hexanoico, pentanoico, butmco, proprionico, acetico, benzoico o benzoico sustituido, e isoformas de los mismos; o D o L norleucina, lisina, arginina, norvalina, ornitina o S-bencilcistema

II = un residuo de aminoacido de D o L cistema, fenilalanina, acido aspartico, acido glutamico, serina, tirosina, glicina, homocistema, homoserina u homofenilalanina;

III = un residuo de aminoacido de D o L isoleucina, leucina o valina; y

IV = acido amino-hexanoico, amino-pentanoico o aminobutrnco; en donde los elementos I, II, III y IV estan unidos mediante enlaces peptidicos o enlaces peptidicos reducidos.

En una realizacion de la divulgacion el analogo es: acido hexanoico-tirosina-isoleucina-amida del acido (6)-amino- hexanoico. Usando la formula I como formula generica, para este analogo particular, R1= hexanoflo; R2 es Tyr; R3 es Ile; y n = 5. Alternativamente, usando la nomenclatura I - II - III - IV, en esta realizacion, I = acido hexanoico, II = Tyr; III = Ile; y IV = amida del acido hexanoico.

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Realizaciones de la invencion implican proporcionar uno o mas mimeticos de HGF a un sujeto que lo necesita. Sujetos o pacientes a modo de ejemplo que podnan beneficiarse de recibir terapia tal como administracion del uno o mas mimeticos de HGF descritos en el presente documento son generalmente mairnferos, y habitualmente seres humanos, aunque no es necesario que este sea siempre el caso, puesto que tambien se contemplan aplicaciones veterinarias y relacionadas con la investigacion de la tecnologfa. Generalmente un sujeto o paciente adecuado que necesita terapia lo identifica, por ejemplo, un profesional o profesionales de atencion sanitaria usando pruebas, mediciones o criterios conocidos. Por ejemplo, en el tratamiento para la demencia, se identificaran sujetos que ya tienen smtomas de demencia, o que corren el riesgo de desarrollar smtomas de demencia. Se seguiran procedimientos de identificacion similares para otras enfermedades y/o trastornos (por ejemplo, terapia contra el cancer, otras terapias de disfunciones cognitivas, etc.). Entonces se desarrolla un protocolo de tratamiento adecuado basado en el paciente, la enfermedad y/o el trastorno y su estadio de desarrollo, y el mimetico de HGF y su dosificacion y formato de administracion, asf como otros factores relevantes. El sujeto recibe entonces tratamiento con mimetico de HGF. Realizaciones de la invencion tambien comprenden una o mas etapas en relacion con la monitorizacion de los efectos o el desenlace de la administracion con el fin de evaluar el protocolo de tratamiento y/o ajustar el protocolo segun se requiera o de una manera que es probable que proporcione mas beneficio, por ejemplo aumentando o disminuyendo las dosis de medicacion, o cambiando el tipo particular de mimetico que se administra, o cambiando la frecuencia de dosificacion o la via de administracion, etc. Con particular referencia a la realizacion de proporcionar potenciacion cognitiva por ejemplo, aunque en algunos casos la mejora en la cognicion (o la prevencion de la perdida de cognicion) que se produce puede ser completa, por ejemplo el desempeno del paciente regresa a la normalidad o permanece normal (tal como se evalua en comparacion con sujetos de control adecuados o valores normalizados obtenidos de los mismos), no es necesario que este sea siempre el caso. Los expertos en la tecnica reconoceran que incluso un nivel inferior de mejora en la cognicion puede ser altamente beneficioso para el paciente, tal como puede ser la ralentizacion de la evolucion de una enfermedad, en contraposicion a una cura completa.

Los metodos de la divulgacion implican administrar composiciones que comprenden los mimeticos de HGF dados a conocer en el presente documento a un paciente que lo necesita. La presente invencion por tanto proporciona tambien composiciones que comprenden los analogos/mimeticos de HGF tal como se describe en el presente documento, habitualmente junto con un portador o diluyente farmacologicamente adecuado. En algunas realizaciones, esta presente un mimetico de HGF sustancialmente purificado en una composicion; en otras realizaciones esta presente mas de un mimetico de HGF, estando cada mimetico de HGF sustancialmente purificado antes de mezclarse en la composicion. La preparacion de composiciones farmacologicamente adecuadas para su uso como medicamentos la conocen bien los expertos en la tecnica. Normalmente, tales composiciones se preparan como o bien disoluciones o bien suspensiones lfquidas, sin embargo tambien se contemplan formas solidas tales como comprimidos, pfldoras, polvos y similares. Tambien pueden prepararse formas solidas adecuadas para su disolucion en, o suspension en, lfquidos antes de su administracion. La preparacion tambien puede emulsionarse. Los principios activos pueden mezclarse con excipientes que son farmaceuticamente aceptables y compatibles con los principios activos. Excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solucion salina, dextrosa, glicerol, etanol y similares, o combinaciones de los mismos. Ademas, la composicion puede contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes de tamponamiento del pH, y similares. Si se desea administrar una forma oral de la composicion, pueden anadirse diversos espesantes, aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, adyuvantes de la dispersion o aglutinantes. La composicion de la presente invencion puede contener cualquiera de tales componentes adicionales para proporcionar la composicion en una forma adecuada para su administracion. La cantidad final de mimetico de HGF en las formulaciones puede variar. Sin embargo, en general, la cantidad en las formulaciones sera de desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 99%.

Las composiciones (preparaciones) de mimetico de HGF de la presente invencion pueden administrarse mediante cualquiera de los muchos medios adecuados que conocen bien los expertos en la tecnica, incluyendo pero sin limitarse a: mediante inyeccion, inhalacion, por via oral, por via intravaginal, por via intranasal, mediante ingestion de un alimento o producto que contiene el mimetico, por via topica, como gotas oculares, por medio de pulverizaciones, etc. En realizaciones preferidas, el modo de administracion es por via oral o mediante inyeccion. Ademas, las composiciones pueden administrarse conjuntamente con otras modalidades de tratamiento tales como otros agentes que se usan para tratar, por ejemplo, demencia o los estados que provocan demencia en el paciente, ejemplos de los cuales incluyen pero no se limitan a la administracion de antidepresivos y farmacos psicoactivos, la administracion de dopamina y agentes similares. De manera similar, en modalidades de tratamiento de cancer, los mimeticos de HGF pueden administrarse junto con analgesicos y otros farmacos adecuados. Por tanto, en realizaciones de la invencion, puede usarse uno o mas mimeticos de HGF en combinacion con uno o mas farmacos bioactivos diferentes.

La cantidad de inhibidor de HGF que se administra puede estar en el intervalo de desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 1.000 mg/kg, y preferiblemente en el intervalo de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100 mg/kg, aunque tal como reconocera un experto en la tecnica, la cantidad precisa puede variar dependiendo de uno o mas atributos del receptor del farmaco, incluyendo pero sin limitarse a: peso, salud global, genero, edad, nacionalidad, historia genetica, otros estados que estan tratandose, etc., y dosis mas grandes o mas

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pequenas estan dentro de la practica de esta invencion. La dosificacion tambien puede tener lugar periodicamente a lo largo de un periodo de tiempo, y la dosificacion puede cambiar (aumentar o disminuir) con el tiempo.

Los mimeticos de HGF de la invencion pueden usarse para tratar una variedad de trastornos de la funcion cognitiva (disfuncion cognitiva) asf como otros trastornos que estan relacionados con la actividad de HGF o la falta de la misma. “Funcion cognitiva” o “cognicion” tal como se usa el presente documento se refiere a una gama de funciones cerebrales de alto nivel, incluyendo pero sin limitarse a: la capacidad para aprender y recordar informacion; la capacidad para organizar, planear y solucionar problemas; la capacidad para concentrar, mantener y desplazar la atencion segun sea necesario; y para comprender y usar el lenguaje; la capacidad para percibir de manera precisa el entorno; la capacidad para realizar calculos. Tales funciones incluyen pero no se limitan a memoria (por ejemplo adquirir, retener y recuperar nueva informacion); atencion y concentracion (particularmente atencion dividida); procesamiento de la informacion (por ejemplo tratar con informacion reunida por los cinco sentidos); funciones ejecutivas (por ejemplo planeamiento y priorizacion); funciones visuoespaciales (por ejemplo percepcion visual y capacidades de construccion); habla y fluencia verbal (por ejemplo encontrar las palabras); intelecto general (por ejemplo “inteligencia”); memoria a largo plazo (remota); aptitudes de conversacion; comprension lectora; etc. En cambio, por “disfuncion cognitiva” quiere decirse la perdida de tales capacidades. Las perdidas pueden medirse, detectarse y/o diagnosticarse de cualquiera de las muchas formas conocidas por los expertos habituales en la tecnica. Tales metodos incluyen pero no se limitan a: el uso de pruebas normalizadas realizadas por un profesional (rompecabezas, juegos de palabras o problemas, etc.); por autonotificacion y/o las notificaciones de cuidadores, amigos y miembros de la familia de un individuo aquejado; por observacion de las actividades, aptitudes de vida, habitos y copia de mecanismos del individual por profesionales o profanos; por los resultados de cuestionarios administrados a un individuo aquejado; etc.

Tales trastornos pueden estar provocados, por ejemplo, por una disminucion en la conectividad sinaptica y/o densidad de neuronas debido a una variedad de factores. En algunas realizaciones, la perdida esta provocada por una lesion cerebral, por ejemplo lesion cerebral traumatica. La lesion cerebral traumatica, que esta produciendose a niveles record como resultado de guerras y actividades deportivas, se caracteriza por conectividad neuronal reducida. Por eso, el uso de mimeticos de HGF representa una opcion de tratamiento viable. Tales lesiones cerebrales pueden ser el resultado de un traumatismo externo al cerebro, por ejemplo provocado por un accidente de alto impacto (por ejemplo un accidente de coche, una cafda, etc.), un incidente de disparo, una lesion deportiva (por ejemplo provocada por impacto en la cabeza tal como experimentan boxeadores y jugadores de futbol); lesiones recibidas en combate, etc. Alternativamente, tales lesiones pueden ser el resultado de traumatismo cerebral interno, por ejemplo como resultado de accidente cerebrovascular, aneurisma, procedimiento quirurgico, tumor, etc. u otros tipos de estados que resultan de la falta de oxfgeno en el cerebro o en secciones del cerebro; lesiones debidas a inhalacion de gases toxicos; debido a envejecimiento del cerebro; a enfermedades y trastornos que ejercen un efecto perjudicial sobre el sistema nervioso y/o cerebro, tales como esclerosis multiple, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, trastornos cerebrales tales como esquizofrenia, etc.

Como ejemplo espedfico de una terapia contemplada por realizaciones de la divulgacion, los mimeticos de HGF pueden usarse para el tratamiento de demencia. Por “demencia” quiere decirse una perdida grave de la capacidad cognitiva en una persona previamente sin afectar, mas alla de lo que podna esperarse del envejecimiento normal. Puede ser estatica, el resultado de una lesion cerebral global unica, o progresiva, dando como resultado declive a largo plazo debido a dano o enfermedad en el cuerpo. Aunque la demencia es de lejos mas comun en la poblacion geriatrica, puede producirse en cualquier estadio de adultez. Para los fines de realizaciones de esta invencion, el termino “demencia” puede incluir y/o estar provocada por, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, demencia vascular, demencia con cuerpos de Lewy, etc. o combinaciones de estas. En otras realizaciones de la invencion, puede excluirse la enfermedad de Alzheimer de esta definicion. Otras causas de demencia que puede tratarse tal como se describe en el presente documento incluyen pero no se limitan a hipotiroidismo e hidrocefalia de presion normal. Las formas heredadas de la enfermedades que provocan o estan asociadas con demencia que puede tratarse tal como se describe en el presente documento incluyen pero no se limitan a: degeneracion lobular frontotemporal, enfermedad de Huntington, demencia vascular, demencia pugilfstica, etc. En poblaciones mas jovenes, la alteracion cognitiva progresiva puede estar provocada por enfermedad psiquiatrica, alcohol o consumo de otras drogas, o alteraciones metabolicas. Determinados trastornos geneticos pueden provocar demencia neurodegenerativa verdadera en poblaciones mas jovenes (por ejemplo 45 anos y por debajo). Estos incluyen enfermedad de Alzheimer familiar, SCA17 (herencia dominante); adrenoleucodistrofia (ligada al cromosoma X); enfermedad de Gaucher de tipo 3, leucodistrofia metacromatica, enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, neurodegeneracion asociada a pantotenato cinasa, enfermedad de Tay-Sachs y enfermedad de Wilson. Deficiencias en vitaminas e infecciones cronicas tambien pueden imitar ocasionalmente la demencia degenerativa. Estas incluyen deficiencias de vitamina B12, folato o niacina, y causas infecciosas incluyendo meningitis criptococica, VlH, enfermedad de Lyme, leucoencefalopatfa multifocal progresiva, panencefalitis esclerosante subaguda, sffilis y enfermedad de Whipple. Con respecto a la demencia rapidamente progresiva, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob provoca normalmente una demencia que empeora a lo largo de semanas a meses, estando provocada por priones. Las causas mas comunes de la demencia lentamente progresiva tambien presentan algunas veces progresion rapida, por ejemplo enfermedad de Alzheimer, demencia con cuerpos de Lewy y degeneracion lobular frontotemporal (incluyendo degeneracion corticobasal y paralisis supranuclear progresiva).

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Ademas, la encefalopatia o el delirio puede desarrollarse de manera relativamente lenta y dar como resultado demencia. Las posibles causas incluyen infeccion cerebral (encefalitis viral, panencefalitis esclerosante subaguda, enfermedad de Whipple) o inflamacion (encefalitis lfmbica, encefalopatfa de Hashimoto, vasculitis cerebral); tumores tales como linfoma o glioma; toxicidad farmacologica (por ejemplo farmacos anticonvulsivos); causas metabolicas tales como insuficiencia hepatica o insuficiencia renal; y hematoma subdural cronico. La demencia que se trata segun los metodos de la presente invencion tambien puede ser el resultado de otros estados o enfermedades. Por ejemplo, hay muchos estados medicos y neurologicos en los que la demencia solo se produce tardfamente en la enfermedad, o como una caractenstica menor. Por ejemplo, una proporcion de pacientes con enfermedad de Parkinson desarrollan demencia. Tambien se produce alteracion cognitiva en los smdromes de Parkinson-plus de paralisis supranuclear progresiva y degeneracion corticobasal (y la misma patologfa subyacente puede provocar los smdromes clmicos de degeneracion lobular frontotemporal). Estados inflamatorios cronicos del cerebro pueden afectar a la cognicion a largo plazo, incluyendo enfermedad de Behget, esclerosis multiple, sarcoidosis, smdrome de Sjogren y lupus eritematoso sistemico. Ademas, los estados heredados que tambien pueden provocar demencia junto con otras caractensticas incluyen: enfermedad de Alexander, enfermedad de Canavan, xantomatosis cerebrotendinosa, smdrome de ataxia/temblor asociado al cromosoma X fragil, aciduria glutarica de tipo 1, enfermedad de Krabbe, enfermedad de orina de jarabe de arce, enfermedad de Niemann Pick de tipo C, enfermedad de Kufs, neuroacantocitosis, acidemias organicas, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, trastornos del ciclo de la urea, smdrome de Sanfilippo de tipo B y ataxia espinocerebelosa de tipo 2.

Ademas, para tratar la demencia, los mimeticos de HGF de la invencion pueden usarse para neuroproteccion y/o para tratar enfermedades neurodegenerativas, algunas de las cuales tambien implican demencia tal como se describio anteriormente. Para neuroproteccion, los mimeticos de HGF pueden administrarse de manera profilactica, es decir antes de que el sujeto se encuentre con o se exponga a un posible riesgo neurologico. Por ejemplo, los mimeticos pueden administrarse antes de la exposicion a un farmaco, producto qmmico o procedimiento medico que se sabe o es probable que provoque dano neuronal. Con respecto al tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, la actividad antiapoptotica prosupervivencia general de HGF apoya el uso de mimeticos de HGF para tratar enfermedades neurodegenerativas incluyendo pero sin limitarse a enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington y esclerosis lateral amiotrofica (ELA), etc.

Ademas, los mimeticos pueden usarse para el tratamiento de “depresion”, mediante lo cual quiere decirse trastorno depresivo mayor (TDM) (tambien conocido como trastorno depresivo recurrente, depresion clmica, depresion mayor, depresion unipolar o trastorno unipolar) y tambien depresion que es caractenstica de trastorno bipolar, etc. La depresion es en ultima instancia una enfermedad en la que las neuronas y los contactos sinapticos se pierden en el hipocampo. La capacidad de HGF para inducir nuevas conexiones sinapticas y estimular la neurogenesis en el hipocampo apoya el uso de mimeticos de HGF para el tratamiento de depresion.

Ademas, tambien pueden aumentarse las capacidades cognitivas de personas aquejadas de determinadas predisposiciones geneticas a disfuncion cognitiva, por ejemplo personas con trastornos geneticos tales como smdrome de Down, falta de desarrollo cerebral apropiado por ejemplo debido a falta de oxfgeno antes o durante el nacimiento, diversos trastornos congenitos que interfieren con el desarrollo cerebral, etc.

Tal como se demuestra en los ejemplos a continuacion, los mimeticos de HGF pueden inhibir el sistema de HGF/Met, y por tanto pueden usarse como agentes anticancengenos. Los mimeticos de HGF pueden usarse para atenuar transformaciones malignas y metastasicas.

Los mimeticos de HGF tienen aplicacion en la terapia de enfermedad fibrotica. La fibrosis hepatica, renal, cardiaca y pulmonar es un problema creciente en la poblacion envejecida. Desafortunadamente, la degradacion de la funcion que acompana a los cambios fibroticos es diffcil de tratar. La capacidad drastica de HGF para inhibir o revertir la fibrosis tisular sugiere que mimeticos de HGF activos por via oral proporcionan una opcion terapeutica.

Los mimeticos de HGF tienen aplicacion en la terapia de enfermedad vascular periferica: enfermedad arterial de extremidades inferiores. La enfermedad vascular que da como resultado una mala perfusion es una secuela comun de la diabetes, obesidad y ateroesclerosis. Una opcion de tratamiento es la induccion de nuevos vasos colaterales en los organos y tejidos afectados. La potente actividad angiogenica de HGF y mimeticos de HGF puede proporcionar una utilidad clmica para el tratamiento de insuficiencia vascular.

Tambien pueden usarse mimeticos de HGF para la cicatrizacion de heridas. La cicatrizacion defectuosa de heridas es un rasgo distintivo de vmtimas diabeticas y de quemaduras. La capacidad de HGF para promover la cicatrizacion de heridas debido a sus actividades angiogenicas y mitogenicas apoya el uso de mimeticos de HGF para potenciar el proceso de cicatrizacion de heridas. Los datos indican que varios mimeticos de HGF son potenciadores de la reparacion de heridas eficaces en individuos tanto normales como diabeticos.

Sin querer restringirse a la teona, se cree que el mecanismo probable que subyace a esta marcada actividad procognitiva es una conectividad sinaptica aumentada. Esto se debe probablemente a un aumento en la actividad sinaptica en miniatura ocasionada por el aumento de las densidades de espinas dendnticas y la alteracion del fenotipo morfologico de espinas postsinapticas.

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Los ejemplos anteriores se proporcionan con el fin de ilustrar diversas realizaciones de la invencion, pero no deben interpretarse como limitativos de la invencion de ningun modo.

Ejemplos

EJEMPLO 1. Regulacion de la sinaptogenesis por Dihexa y Nle1-AngIV.

Se encontro previamente que los fragmentos de tetrapeptido (Nle1-YIH) y tripeptido (Nle1-YI) del analogo Nle1- AnglV de AnglV son los fragmentos activos mas pequenos que pueden superar la disfuncion cognitiva inducida por escopolamina en una tarea de aprendizaje espacial. Usando el tripeptido como nuevo molde, se sintetizaron analogos activos adicionales con estabilidad metabolica, permeabilidad de la barrera hematoencefalica y actividad oral mejorada. En este ejemplo, se muestra la caracterizacion del analogo de angiotensina IV novedoso, activo por via oral, Dihexa.

MATERIALES Y METODOS

Animales y cirug^a. Se mantuvieron ratas Sprague-Dawley macho (derivadas de Taconic) que pesaban 390-450 g con libre acceso a agua y alimento (dieta de roedores Harland Tekland F6, Madison, WI) excepto la noche previa a la intervencion quirurgica cuando se retiro el alimento. Se anestesio cada animal con clorhidrato de ketamina mas xilazina (100 y 2 mg/kg por via i.m. respectivamente; Phoenix Scientific; St. Joseph, MO, y Moby; Shawnee, KS). Se coloco de manera estereotaxica una canula de grna intracerebroventricular (icv) (PE-60, Clay Adams; Parsippany, NY) (modelo 900, David Kopf Instruments; Tujunga, CA) en el hemisferio derecho usando coordenadas de craneo planas 1,0 mm posterior y 1,5 mm lateral al bregma (se remite a Wright et al. 1985). La canula grna media 2,5 cm de longitud global y se preparo con una protuberancia de calor colocada a 2,5 mm desde su punta biselada, actuando por tanto como un tope para controlar la profundidad de penetracion. Una vez en posicion, se aseguro la canula al craneo con dos tornillos de acero inoxidable y cemento central. Se alojaron de manera posoperatoria los animales individualmente en un vivario aprobado por la American Accreditation for Laboratory Animal Care mantenido a 22+1°C en un ciclo de luz/oscuridad alterno de 12 h iniciado a las 06:00 h. Todos los animales se trataron de manera cuidadosa durante 5 min al dfa durante los 5-6 dfas de recuperacion posquirurgica. La verificacion histologica de colocacion de la canula se realizo mediante la inyeccion de 5 |il de colorante verde rapido por medio de la canula grna tras la finalizacion de la prueba de comportamiento. La colocacion correcta de la canula fue evidente en todas las ratas utilizadas en este estudio.

Pruebas de comportamiento. El laberinto de agua consistfa en un tanque circular pintado de negro (diametro: 1,6 m; altura: 0,6 m), llenado hasta una profundidad de 26 cm con agua a 26-28°C. Se coloco una plataforma circular negra (diametro: 12 cm; altura: 24 cm) a 30 cm de la pared y se sumergio 2 cm por debajo de la superficie del agua. El laberinto se dividio de manera funcional en cuatro cuadrantes iguales designados como NO, NE, SO y SE. Para cada rata la ubicacion de la plataforma se asigno de manera aleatoria a uno de los cuadrantes y permanecio fija en toda la duracion del entrenamiento. Los puntos de entrada estaban en las esquinas del cuadrante (es decir N, S, E y O) y se asignaron de manera pseudoaleatoria de modo que cada ensayo comenzo en un punto de entrada diferente que el ensayo predecente. Se cubrieron tres de las cuatro paredes de la sala de pruebas con pistas espaciales exteriores al laberinto que consistfan en diferentes formas (drculos, cuadrados, triangulos) y colores. Se registro la trayectoria de bano de los animales usando un sistema de seguimiento de video computerizado (Chromotrack; San Diego Instruments, CA). El ordenador presento la distancia de nado y la demora de nado total. Se determino la velocidad de nado a partir de estos valores.

Cada miembro de los grupos de tratamiento en los estudios de escopolamina recibio una inyeccion icv de bromhidrato de escopolamina (70 nmol en 2 |il de aCSF a lo largo de una duracion de 20 s) 30 min antes de semeterse a prueba seguido por Dihexa 10 min antes de someterse a prueba. Los grupos de control recibieron escopolamina o aCSF 20 min antes de someterse a prueba seguido por aCSF 10 min antes de someterse a prueba. El protocolo de pruebas de comportamiento se ha descrito previamente en detalle (Wright et al. 1999). Las ratas en el estudio de ratas envejecidas recibieron Dihexa de aCSF (grupo de control). Brevemente, se realizaron ensayos de adquisicion en 8 dfas consecutivos con 5 ensayos/dfa. El primer dfa de entrenamiento se coloco el animal sobre la plataforma durante 30 s antes del primer ensayo. Los ensayos comenzaron con la colocacion de la rata mirando hacia la pared del laberinto en uno de los puntos de entrada asignados. Se le dejo a la rata un maximo de 120 s para ubicar la plataforma. Una vez que el animal ubico la plataforma se le permitio un periodo de descanso de 30 s sobre la plataforma. Si la rata no encontraba la plataforma, el experimentador colocaba al animal sobre la plataforma durante el periodo de descanso de 30 s. El siguiente ensayo comenzo inmediatamente tras el periodo de descanso.

Tras el dfa 8 del entrenamiento de adquisicion, se realizo un ensayo adicional durante el cual se retiro la plataforma (ensayo de sonda). Se requena que el animal nadase los 120 s completos para determinar la persistencia de la respuesta aprendida. Se registraron el tiempo total gastado dentro del cuadrante objetivo donde se habfa ubicado la plataforma durante la adquisicion y el numero de cruces de ese cuadrante. Tras la finalizacion de cada conjunto diario de ensayos se seco el animal con una toalla y se coloco bajo una lampara de 100 vatios durante 10-15 min y entonces se devolvio a su jaula de alojamiento.

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Preparacion de cultivos de celulas del hipocampo. Se cultivaron neuronas del hipocampo (2x105 celulas por cm cuadrado) de ratas Sprague Dawley P1 sobre placas recubiertas con poli-L-lisina de Sigma (St. Louis, MO; 300.000 de peso molecular). Se mantuvieron neuronas del hipocampo en medio Neurobasal A de Invitrogen (Carlsbad, CA) complementado con B27 de Invitrogen, L-glutamina 0,5 mM y citosina-D-arabinofuranosa 5 mM de Sigma anadidas a los 2 dfas in vitro. Luego se cultivaron las neuronas del hipocampo 3-7 dfas adicionales, tiempo en el que o bien se transfectaron o bien se trataron con diversos reactivos farmacologicos tal como se describe en (Wayman, Davare et al. 2008).

Transfeccion. Se transfectaron las neuronas con mRFP-p-actina el dfa in vitro 6 (DIV6) usando LipofectAMINE™ 2000 (Invitrogen) segun el protocolo del fabricante. Este protocolo produjo la eficacia de transfeccion del 3-5% deseada propiciando asf la visualizacion de neuronas individuales. Eficacias mas altas ocultaron los arboles dendnticos de neuronas individuales. La expresion de actina etiquetada de manera fluorescente permitio una clara visualizacion de las espinas dendnticas, a medida que las espinas dendnticas se enriquedan en actina. El DIV7 se trataron las celulas con vetuculo (H2O) o peptidos (tal como se describe en el texto) anadidos al medio. El DIV12 se fijaron las neuronas (paraformaldetudo al 4%, sacarosa al 3%, PIPES 60 mM, HEpEs 25 mM, EGTA 5 mM, MgCh 1 mM, pH 7,4) durante 20 min a temperatura ambiente y se montaron. Se secaron los portaobjetos durante al menos 20 horas a 4°C y se obtuvieron imagenes fluorescentes con software de microscopfa digital Slidebook 4.2 que se realiza con un microscopio confocal invertido Olympus IX81 con lentes de inmersion en aceite 60X, NA 1,4 y resolucion de 0,280 |im. Se midio la densidad de espinas dendnticas sobre dendritas primarias y secundarias a una distancia de al menos 150 |im desde el soma. Se analizaron cinco segmentos de 50 |im de longitud de dendrita de al menos 10 neuronas por punto de datos para cada punto de datos notificado. Se repitio cada experimento al menos tres veces usando preparaciones de cultivo independientes. Se determino la longitud de dendrita usando el programa Image J 1.41o de los National Institutes of Health (NIH, Bethesda, MD) y el programa Neuron J de seguimiento de neuritas (Meijering, Jacob et al. 2004). Las espinas se contaron manualmente.

Preparacion y transfeccion de cultivos de cortes del hipocampo organot^picos. Se cultivaron hipocampos de ratas Sprague Dawley P4 tal como se describio previamente (Wayman, Impey et al. 2006). Brevemente, se cultivaron cortes de 400 |im en (Milipore, Billerica, MA) durante 3 dfas tras los cuales se transfectaron biolfsticamente con protema fluorescente de tomate (TFP) usando una pistola genica Helios (BioRad, Hercules, CA), segun el protocolo del fabricante, para visualizar los arboles dendnticos. Tras un periodo de recuperacion de 24 horas se estimularon los cortes con vehfculo (H2O), Dihexa o Nle1-AngIV 1 pM durante 2 dfas. Se fijaron los cortes y se montaron. Se obtuvieron imagenes de procesos neuronales CA1 del hipocampo y se midieron como se describio anteriormente.

Inmunocitoqu^mica. Las neuronas transfectadas se trataron, se fijaron y se tineron. Brevemente, se permeabilizaron las celulas con detergente Triton X-100 al 0,1% (Bio-Rad; Hercules, CA) durante 10 minutos. Se uso una albumina serica bovina al 8% (Intergen Company; Burlington, MA) en PBS para impedir la union no espedfica durante una hora a T.A.; las incubaciones con anticuerpo primario fueron a una dilucion de 1:2500 (vease a continuacion) en BSA al 1% en PBS a 4°C durante la noche. Se aplico anticuerpo secundario, anticuerpo de cabra anti-raton Alexafluor 488 1:3000 (Invitrogen: Carlsbad, CA) durante dos horas a temperatura ambiente. Se montaron los cubreobjetos con reactivo antidesvanecimiento ProLong Gold (Invitrogen; Carlsbad, CA) y se realizaron todos los lavados con PBS. Se realizaron la obtencion de imagenes y el analisis tal como se describio anteriormente. Para la transmision excitatoria presinaptica se empleo el marcador VGLUT1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania) (Balschun, Moechars et al.) y para la transmision presinaptica general se aplico sinapsina1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania) (Ferreira y Rapoport 2002). Se establecio una funcion postsinaptica mediante PSD-95 (Milipore, Billerica, MA) (El-Husseini, Schnell et al. 2000). En cada caso se conto el numero total de espinas para los grupos de tratamiento, control, Nle1- AngIV y Dihexa, para garantizar un fenotipo activo. Se conto el numero total de espinas enriquecidas en actina adyacentes a VGLUT1 o sinapsina y se convirtio en un porcentaje ya que el porcentaje de correlacion de espinas inducidas por tratamiento con respecto a marcadores presinapticos es un indicador fuerte de la capacidad para transmitir senales excitatorias. En esta solicitud el numero de correlaciones consistio en espinas de actina etiquetadas con rojo fluorescente frente a puntos inmunopositivos para PSD-95 verdes que, cuando se fusionaron, dieron como resultado una espina naranja.

Registros de celulas completas. Se realizaron experimentos de registro electrofisiologico de fijacion de voltaje sobre neuronas del hipocampo cultivadas transfectadas con mRFP-p-actina (control de vetuculo) y sobre neuronas del hipocampo transfectadas con pretratamiento de 5 dfas con Dihexa o Nle1-AngIV 1 pM. Se tomaron registros de las neuronas que teman forma de tipo piramidal (cuerpos celulares de ~20 |im y distribucion de dendritas asimetrica). El tiempo tras la transfeccion fue de 6 dfas. Se intercambio el medio de cultivo por una disolucion extracelular que contema (en mM) NaCl 140, KCl 2,5, MgCh 1, CaCl2 3, glucosa 25 y HEPES 5; se ajusto el pH a 7,3 con KOH; se ajusto la osmolalidad a 310 mOsm. Se dejo que los cultivos se equilibrasen en una camara de registro montada sobre un microscopio invertido (IX-71; Olympus optical, Tokio) durante 30 min antes del registro. Se visualizaron las celulas transfectadas con fluorescencia (Olympus optical). Se sacaron las pipetas de registro (extractor de micropipeta P-97 Flaming/Brown; Sutter Instrument, Novato, CA) de vidrio de borosilicato de pared convencional sin filamento (DO = 1,5 mm; Sutter Instrument). La resistencia en CC de pipeta a bano de los electrodos de fijacion de voltaje oscilaba entre 4,0 y 5,2 MQ, y se llenaron con una disolucion interna de la siguiente composicion (en mM):

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CsCI 25, CSCH3O3S 100, fosfocreatina 10, EGTA 0,4, HEPES 10, MgCh 2, Mg-ATP 0,4 y Na-GTP 0,04; se ajusto el pH a 7,2 con CsOH; se ajusto la osmolalidad a 296 - 300 mOsm. Se aislaron farmacologicamente las EPSC en miniatura (mEPSC) bloqueando los canales de cloruro de receptor de GABA con picrotoxina (100 pM; Sigma), bloqueando los receptores de glicina con estricnina (1 pM; Sigma) y bloqueando la generacion de potenciales de accion con tetrodotoxina (TTX, 500 nM; Tocris). Se obtuvieron registros usando un amplificador Multiclamp 700B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se filtraron las senales analogicas con filtro Bessel de paso bajo a 2 kHz, se digitalizaron a 10 kHz a traves de una interfaz Digidata 1440A (Molecular Devices) y se almacenaron en un ordenador usando software Clamplex 10.2 (Molecular Devices). Se mantuvo el potencial de membrana a -70 mV a temperatura ambiente (25°C) durante un periodo de 0,5 - 2 h tras la retirada del cultivo del incubador. No se corrigieron los potenciales de uniones lfquidas. Los analisis de los datos se realizaron usando el software Clampfit 10.2 (Molecular Devices) y software Mini-Analysis 6.0 (Synaptosoft Inc.; Fort Lee, NJ). Los criterios para un registro exitoso incluyeron la resistencia electrica del sello entre la superficie exterior de la pipeta de registro y la celula unida >2 GQ, resistencia de entrada de neuronas >240 MQ. Las mEPSC tuvieron un tiempo de registro de 5 min.

RESULTADOS

Se sabe desde hace tiempo que Nle1-AngIV es un agente de potenciacion cognitiva potente (Wright y Harding, 2008) pero esta limitado en cuanto a la utilidad clmica por su inestabilidad metabolica (t-i/2=1,40 minutos en suero de rata). Con el fin de explotar las propiedades procognitivas de moleculas de tipo AnglV necesitan desarrollarse analogos mas estables metabolicamente. Como parte de este proceso de desarrollo se sintetizo Dihexa (N-acido hexanoico-Tyr-Ile-amida del acido (6)-hexanoico) y se caracterizo (t-i/2=330 minutos en suero de rata). Para determinar si el analogo estabilizado, Dihexa todavfa posefa actividad pro-cognitiva/anti-demencia se sometio a prueba en dos modelos de demencia, los modelos de rata envejecida y amnesia por escopolamina. Estos estudios demostraron que Dihexa podfa revertir los deficits cognitivos observados en ambos modelos. Dihexa administrada o bien por via intracerebroventricular o bien por via oral mediante sonda gastrica mejoraron el rendimiento en el laberinto de agua alcanzando niveles de rendimiento observados en ratas sanas jovenes. En la figura 1A, Dihexa administrada a 100 pmoles (n=8, p<0,01) pero no 10 pmoles revirtio los deficits de aprendizaje dependientes de escopolamina tal como se evidencio por una demora de escape equivalente a controles no tratados con escopolamina. Se observaron resultados similares cuando se administro Dihexa por via oral (figura 1B) a dosis tanto baja (1,25 mg/kgMa) como alta (2 mg/kgMa). El rendimiento del grupo de dosis alta no fue diferente del de los controles (n=8, p<0,01). Las ratas envejecidas agrupadas de manera aleatoria (20-24 semanas) incluidos ambos sexos se trataron de manera similar con Dihexa oral a lo largo del periodo de prueba de 8 dfas (n=8) y se compararon con los controles no tratados (figura 1C). Los resultados indican que las ratas tratadas tuvieron un rendimiento significativamente mejor en el laberinto de agua que las ratas no tratadas. (p<0,05).

Una hipotesis que se expuso para explicar los efectos procognitivos de Nle1-AngIV y Dihexa era que estaban actuando como mimeticos de factor de crecimiento de hepatocitos y como tales pueden estar soportando la expansion de la conectividad neuronal induciendo el crecimiento de espinas dendnticas y el establecimiento de numerosas nuevas sinapsis. Para determinar la influencia de la Dihexa sobre la espinogenesis y sinaptogenesis, se sometio a ensayo en cultivos neuronales de hipocampo transfectados con mRFP-p-actina de alta densidad. Las espinas enriquecidas en actina teman una respuesta aumentada al tratamiento con Dihexa y Nle1-AngIV de manera dependiente de la dosis (figuras 2A y B). Se produjo un efecto maximo aparente mediante aplicacion de Dihexa 10-12 M (media + EEM; 30 espinas por longitud de dendrita de 50 pm frente a 19 para el control; ***= P < 0,001; n = 50 y 100 respectivamente) mientras que los resultados de una dosis de 10'13 M no fueron significativamente diferentes de las neuronas tratadas con control (media + EEM; 21 espinas por dendrita de 50 pm para ambos grupos frente a 19 para el control; * = P < 0,05; n = 95 y 100 respectivamente). Sin embargo, fueron diferentes estadfsticamente de la dosis de Dihexa 10-12 M. La neuronas que recibieron una dosis de 10'™ M de Dihexa teman menos espinas que las neuronas tratadas con vehfculo (media + EEM; 11 espinas por longitud de dendrita de 50 pm frente a 19 para el control; # = P < 0,01; n = 50 y 100 respectivamente). Nle1-AngIV indujo de manera similar un aumento dependiente de la dosis en la densidad de espinas con una diferencia marcada en la dosis de 10-™ M que promovio la espinogenesis (media + EEM; 22 espinas por longitud de dendrita de 50 pm frente a 17 para el control; ** = p < 0,01; n = 50). Se observaron de nuevo aumentos maximos en la densidad de espinas tras el tratamiento con una dosis de 10-12 M (media + EEM; 25 y 26 espinas por longitud de dendrita de 50 pm respectivamente frente a 17 para el control; ** = P < 0,01; n = 50). La dosis de 10-13 M de Nle1-AngIV tampoco tuvo efecto sobre los numeros de espinas basales (media + EEM; 17 espinas por longitud de dendrita de 50 pm frente a 17 para el control; ** = P < 0,01; n = 50).

Los efectos de una aplicacion a largo plazo (5 dfas) de los agonistas de AT4 Dihexa y Nle1-AngIV se compararon con una aplicacion aguda de los agonistas (30 minutos) a la dosis biologicamente eficaz de 10-™ M (figuras 3A-E). Los resultados revelaron un aumento de casi 3 veces en el numero de espinas estimuladas por Dihexa y un aumento mayor de 2 veces para espinas estimuladas por Nle1-AngIV tras un tratamiento de 5 dfas (figura 3 D). Ambos grupos de tratamiento difirieron significativamente del grupo de control de vehfculo para el que el numero promedio de espinas por longitud de dendrita de 50 pm fue de 15. El numero promedio de espinas para los grupos tratados con Dihexa y Nle1-AngIV fue de 41 y 32 espinas por longitudes de dendrita de 50 pm, respectivamente (media + EEM, n = 200; *** = P < 0,001 mediante ANOVA de una via y prueba a posteriori de Tukey). Los datos de

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comportamiento (datos no mostrados) sugieren que esta teniendo lugar un rapido mecanismo de accion durante la adquisicion de la tarea de memoria espacial. Por tanto se midio la capacidad de tanto Dihexa como Nle1-AngIV para promover la espinogenesis mediante una aplicacion de 30 minutos aguda el d^a final de cultivo (figura 3 E). La aplicacion de 30 minutos aguda de Dihexa y Nle1-AngIV, el 12° dfa in vitro (DIV12) revela un aumento significativo de espinas en comparacion con neuronas tratadas con vehuculo 30 minutos (numeros de espinas medios con Dihexa por longitud de dendrita de 50 |im = 23,9 + EEM; numeros de espinas medios con Nle1-AngIV = 2,6 + EEM; numeros de espinas medio para neuronas tratadas con control de vehuculo = 17,4 + EEM; n = 60; *** = p < 0,0001 mediante ANOVA de una via seguido por prueba a posteriori de Tukey).

Existen correlaciones fuertes entre el tamano de la espina, la persistencia de las espinas, el numero de receptores de AMPA y la eficacia sinaptica. Tambien se ha sugerido una correlacion entre la existencia de memorias a largo plazo con el volumen de espinas (Kasai, Fukuda et al., 2001; Yasumatsu, Matsuzaki et al. 2008). Con estas consideraciones en mente se tomaron mediciones del tamano de la cabeza de espinas. Los resultados indican que dosis de 10"12 M de Dihexa y Nle1-AngIV aumentaron la anchura de la cabeza de espinas (figura 4). Anchura promedio de la cabeza de espinas para Nle1-AngIV = 0,87 |im (*** = P < 0,001; media + EEM) y Dihexa = 0,80 |im (** = p < 0,01; media + EEM) respectivamente en comparacion con el tamano de la cabeza control (0,67 |im).

Dihexa y Nle1-AngIV median en la sinaptogenesis

Para cuantificar la transmision sinaptica, se sometieron a inmunotincion neuronas transfectadas con mRFP-p-actina frente a marcadores sinapticos. Se estimularon las neuronas del hipocampo durante 5 dfas in vitro con Dihexa o Nle1-AngIV 10"12 M (figuras 5A-F). Se estudiaron con sonda los patrones de neurotransmisores de Nle1-AngIV y Dihexa para determinar la transmision sinaptica excitatoria tinendo frente al marcador presinaptico glutamatergico transportador de glutamato vesicular 1 (VGLUT1) (Balschun, Moechars et al. 2010). Se empleo el marcador presinaptico universal sinapsina para medir la yuxtaposicion de las espinas recien formadas con botones presinapticos (Ferreira y Rapoport 2002). PSD-95 sirvio como marcador para la densidad postsinaptica (El Husseini, Schnell et al. 2000).

Las neuronas tratadas con Dihexa y Nle1-AngIV aumentaron significativamente la espinogenesis; numeros de espinas medios por longitud de dendrita de 50 |im para Nle1-AngIV = 39,4; numeros de espinas medios por longitud de dendrita de 50 |im para Dihexa = 44,2; numeros de espinas medios por longitud de dendrita de 50 |im para neuronas tratadas con vehfculo = 23,1 (media + EEM, *** = P < 0,001) (figuras 3B, D y F y tabla 4). El porcentaje de correlacion para las espinas recien formadas con los marcadores sinapticos se calculo como una medida de la formacion de sinapsis funcionales. Las espinas inducidas por tratamiento con Dihexa y Nle1-AngIV no difirieron de las neuronas tratadas con control en el porcentaje de correlacion con VGLUT1, sinapsina o PSD-95 (P > 0,05) (figuras 5A, C y E y tabla 4).

Tabla 4. Resumen del porcentaje de correlacion con marcadores de componentes sinapticos y el numero de espinas inducidas por tratamiento con Dihexa y Nle1-AngIV.

Tratamiento

Control Nle1-AngIV Dihexa

Numero de espinas/50 |im

22 39 44

% de correlacion con VGLUT1

95,2 95,1 94,4

Numero de espinas/50 |im

19 31 37

% de correlacion con sinapsina

93,4 94,2 96,3

Numero de espinas/50 |im

18 36 43

% de correlacion con PSD-95

98,03 97,38 98,71

El numero total de espinas para cada grupo de tratamiento se indica como el numero de espinas por longitud de dendrita de 50 |im. El porcentaje de correlacion del marcador presinaptico sinapsina, el marcador presinaptico glutamatergico VGLUT1 o el componente postsinaptico PSD-95 se indica directamente a continuacion. N = 25 para cada grupo de tratamiento.

Los resultados anteriores sugieren que las espinas dendnticas recien formadas producidas por tratamiento con Dihexa y Nle1-AngIV estan creando sinapsis funcionales. Para respaldar adicionalmente esta conclusion, se registraron corrientes excitatorias postsinapticas en miniatura (mEPSC), cuya frecuencia se corresponde con el numero de sinapsis funcionales, a partir de neuronas del hipocampo trasfectadas con mRFP-p-actina. Se midio un aumento de casi dos veces en las corrientes mediadas por AMPA tras el tratamiento con Nle1-AngIV y Dihexa 10-12 M (figuras 6A y B). La frecuencia media de las mEPSC mediadas por AMPA registradas de neuronas tratadas con vehfculo fue de 3,06 + 0,23 Hz a partir de 33 celulas. Nle1-AngIV indujo un aumento de 1,7 veces con respecto al porcentaje de la frecuencia de control (5,27 + 0,43 Hz a partir de 25 celulas; media + EEM; *** = P < 0,001 frente al grupo de control y Dihexa produjo un aumento de 1,6 veces (4,82 + 0,34 Hz a partir de 29 celulas; *** = P < 0,001 frente al grupo de control confirmando una amplificacion de las sinapsis funcionales. No se observaron diferencias en la amplitud, tiempos de elevacion o disminucion (datos no mostrados), lo que sugiere que las propiedades

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individuals de la sinapsis no se alteraron.

Para evaluar adicionalmente la significacion fisiologica de la induccion de espinas observada en neuronas del hipocampo neonatales disociadas, se evaluaron los efectos de Dihexa y Nle1-AngIV sobre la formacion de espinas en cultivos de cortes del hipocampo organotfpicos. Estas preparaciones, aunque todavfa de origen neonatal, representan un entorno mas intacto y tridimensional que las neuronas disociadas. Las neuronas CA1 del hipocampo, que se han vinculado funcionalmente a plasticidad del hipocampo y aprendizaje/memoria, pudieron identificarse facilmente basandose en la morfologfa y se seleccionaron para su analisis. Dihexa y Nle1-AngIV aumentaron significativamente la espinogenesis en cultivos de cortes del hipocampo organotipicos en comparacion con neuronas tratadas con vetuculo. No hubo diferencias en los numeros de espinas entre los grupos de tratamiento con Dihexa y Nle1-AngIV (figuras 7A y B). Los numeros de espinas medidos para los cortes de control fueron de 7 por longitud de dendrita de 50 |im frente a 11 espinas por longitud de dendrita de 50 |im para neuronas tratadas con tanto Nle1- AnglV como Dihexa; media + EEM, n = 13-20; ** = P < 0,01.

DISCUSION

En este estudio, tanto Dihexa como Nle1-AngIV fueron un potenciador cognitivo potente cuando se administraron o bien por via ICV o bien por via oral. Como se predijo, tanto Dihexa como Nle1-AngIV promovieron la espinogenesis y potenciaron la sinaptogenesis en neuronas del hipocampo de rata cultivadas. Tal como se espera de un analogo de angiotensina IV, Dihexa ejercio efectos de induccion de espinas a concentraciones subnanomolares (Harding, Cook et al. 1992; Krebs, Hanesworth et al. 2000) produciendose algo de formacion de espinas por Dihexa y Nle1-AngIV tan pronto como 30 minutos tras la estimulacion (figura 3D). Sin embargo, el efecto maximo requiere un periodo de tratamiento significativamente mas largo (figura 3C).

Se tomaron mediciones del tamano de la cabeza de espinas como un indicador de la potenciacion sinaptica. Espinas mas grandes con un area de superficie mayor tienden a tener sinapsis mas grandes, un PSD mas grande para reclutar protemas de andamiaje y un numero mayor de receptores de neurotransmisores receptivos glutamatergicos (Kennedy 1997). Aunque no difieren entre sf (P > 0,05), tanto los grupos de tratamiento con Dihexa como con Nle1- AnglV presentaron grandes expansiones en el tamano de la cabeza de espinas. Se propone que los cambios en los numeros y la morfologfa de las espinas son mecanismos para convertir cambios sinapticos a corto plazo en cambios sumamente estables y duraderos (Hering y Sheng 2001).

Para evaluar la importancia funcional de estos cambios de espinas, se sometieron a inmunotincion neuronas del hipocampo estimuladas con Nle1-AngIV y Dihexa frente al marcador presinaptico glutamatergico VGLUT1 (Balschun, Moechars et al. 2010), el marcador presinaptico general sinapsina (Ferreira y Rapoport 2002) y el marcador postsinaptico PSD-95 (Kennedy 1997; Han y Kim 2008) para descifrar fenotipos de neurotransmisores. La alta e inalterada correlacion entre VGLUT1, sinapsina y PSD-95 en dendritas tanto tratadas como de control sugiere que las espinas recien formadas soportan sinapsis funcionales (figura 5 y tabla 4) (Han y Kim 2008; Yasumatsu, Matsuzaki et al. 2008). Ademas, una correlacion casi perfecta entre espinas marcadas con mRFP-p-actina y la tincion de marcador presinaptico general sinapsina y VLGUT1, que identifica sinapsis glutamatergicas excitatorias, sugiere que la mayona de los efectos dependientes de AnglV sobre espinas del hipocampo se restringfan a sinapsis excitatorias. Estos hallazgos se corresponden de manera adecuada con los hallazgos de De Bundel et al. en los que no se observo efecto sobre el neurotransmisor GABA inhibidor por angiotensina IV nativa (De Bundel, Demaegdt et al. 2010).

El aumento en la frecuencia de mEPSC observada por las preparaciones tratadas con Dihexa y Nle1-AngIV respalda ademas que las espinas nuevas forman sinapsis funcionales (Malgaroli y Tsien 1992; Hering y Sheng 2001; Tiler y Pozzo-Miller 2003). El fortalecimiento consecuente de la neurotransmision iniciado por Dihexa y Nle1-AngIV no podfa atribuirse a fluctuaciones intrmsecas de liberacion de neurotransmisores o influencias metabolicas y mecanicas (Yasumatsu, Matsuzaki et al. 2008). Los datos presentados en el presente documento sugieren que Nle1-AngIV y Dihexa aumentan la actividad sinaptica en miniatura aumentando las densidades de espinas dendnticas y alterando el fenotipo morfologico de las espinas postsinapticas in vitro y puede representar el mecanismo que subyace al aprendizaje facilitado observado con analogos de AnglV (Wright, Stubley et al. 1999; Lee, Albiston et al. 2004).

Para unir los datos de comportamiento adulto a la teona mecamstica in vitro, se emplearon cultivos de cortes del hipocampo organotfpicos que mantienen un entorno representativo de un hipocampo intacto y evaluaron para detectar espinogenesis inducida por tratamiento. La aplicacion de Ne1-AngIV y Dihexa 10-12 M en cortes de hipocampo transfectados balfsticamente aumenta significativamente las densidades de espinas (figura 7) implicando que tales cambios pueden de hecho estar produciendose en el hipocampo intacto.

Por tanto, la Dihexa se ajusta a los criterios necesarios para un farmaco antidemencia eficaz: 1) es activo por via oral, ya que sobrevive al paso a traves del intestino y entra en el cerebro; 2) aumenta la conectividad neuronal, una propiedad necesaria cuando nos enfrentamos a una perdida de conectividad neuronal; y 3) es economico de sintetizar haciendolo por tanto accesible a los pacientes.

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EJEMPLO 2. La diana de analogos de AnglV es el factor de crecimiento de hepatocitos

Este ejemplo muestra que el ligando de angiotensina IV novedoso Dihexa y su molecula original Nle1-AngIV actuan a traves del sistema de HGF/receptor c-Met.

MATERIALES Y METODOS

Animales y Cirug^a

Se mantuvieron ratas Sprague-Dawley macho (derivadas de Taconic) que pesaban 390-450 g con libre acceso a agua y alimento (dieta de roedores Harland Tekland F6, Madison, Wl) excepto la noche previa a la intervencion quirurgica cuando se retiro el alimento. Se anestesio cada animal con clorhidrato de ketamina mas xilazina (100 y 2 mg/kg por via i.m. respectivamente; Phoenix Scientific; St. Joseph, MO, y Moby; Shawnee, KS). Se coloco de manera estereotaxica una canula de grna intracerebroventricular (icv) (PE-60, Clay Adams; Parsippany, NY) (modelo 900, David Kopf Instruments; Tujunga, CA) en el hemisferio derecho usando coordenadas de craneo planas 1,0 mm posterior y 1,5 mm lateral al bregma (Wright et al., 1985). La canula grna media 2,5 cm de longitud global y se preparo con una protuberancia de calor colocada a 2,5 mm desde su punta biselada, actuando por tanto como un tope para controlar la profundidad de penetracion. Una vez en posicion, se aseguro la canula al craneo con dos tornillos de acero inoxidable y cemento central. Se alojaron de manera posoperatoria los animales un vivario aprobado por la American Accreditation for Laboratory Animal Care mantenido a 22+1°C en un ciclo de luz/oscuridad alterno de 12 h iniciado a las 06:00 h. Todos los animales se trataron de manera cuidadosa durante 5 min al dfa durante los 5-6 dfas de recuperacion posquirurgica.

Pruebas de comportamiento

El laberinto de agua consistfa en un tanque circular pintado de negro (diametro: 1,6 m; altura: 0,6 m), llenado hasta una profundidad de 26 cm con agua a 26-28°C. Se coloco una plataforma circular negra (diametro: 12 cm; altura: 24 cm) 30 cm de la pared y se sumergio 2 cm por debajo de la superficie del agua. El laberinto se dividio de manera funcional en cuatro cuadrantes iguales designados como NO, NE, SO y SE. Para cada rata la ubicacion de la plataforma se asigno de manera aleatoria a uno de los cuadrantes y permanecio fija en toda la duracion del entrenamiento. Los puntos de entrada estaban en las esquinas del cuadrante (es decir N, S, E, O) y se asignaron de manera pseudoaleatoria de modo que cada ensayo comenzo en un punto de entrada diferente que el ensayo predecente. Se cubrieron tres de las cuatro paredes de la sala de pruebas con pistas espaciales exteriores al laberinto que consistfan en diferentes formas (drculos, cuadrados, triangulos) y colores. Se registro la trayectoria de bano de los animales usando un sistema de seguimiento de video computerizado (Chromotrack; San Diego Instruments, CA). El ordenador presento la distancia de nado y demora de nado total. Se determino la velocidad de nado a partir de estos valores.

Cada miembro de los grupos de tratamiento recibio una inyeccion icv de bromhidrato de escopolamina (70 nmol en 2 |il de aCSF a lo largo de una duracion de 20 s) 20 min antes de someterse a prueba seguido por Dihexa (300 pmol en 2 |il de aCSF), Hinge (300 pmol en 2 |il de aCSF) o Hinge + Dihexa (300 pmol en 4 |il de aCSF) 5 min antes de someterse a prueba. Esta preparacion de escopolamina es un modelo animal generalmente aceptado de la disfuncion de memoria espacial que acompana a la demencia (Fisher et al., 2003). Los grupos de control recibieron escopolamina o aCSF 20 min antes de someterse a prueba seguido por aCSF 5 min antes de someterse a prueba. El protocolo de prueba de comportamiento se ha descrito previamente en detalle (Wright et al., 1999). Brevemente, se realizaron ensayos de adquisicion en 8 dfas consecutivos, 5 ensayos/dfa. El primer dfa del entrenamiento se coloco el animal sobre el pedestal durante 30 s antes del primer ensayo. Los ensayos comenzaron con la colocacion de la rata mirando hacia la pared del laberinto en uno de los puntos de entrada asignados. Se le dejo a la rata un maximo de 120 s para ubicar la plataforma. Una vez que el animal ubico la plataforma se le permitio un periodo de descanso de 30 s sobre la plataforma.

Si la rata no encontraba la plataforma, el experimentador colocaba al animal sobre la plataforma durante el periodo de descanso de 30 s. El siguiente ensayo comenzo inmediatamente tras el periodo de descanso. Tras la finalizacion de cada conjunto diario de ensayos se seco el animal con una toalla y se coloco bajo una lampara de 100 vatios durante 10-15 min y entonces se devolvio a su jaula de alojamiento.

Analisis estad^sticos

Se uso ANOVA de una via para analizar los resultados de espinas dendnticas y se analizaron los efectos significativos mediante la prueba a posteriori de Tukey. Las demoras medias del conjunto de datos del laberinto de agua de Morris hasta encontrar la plataforma durante cada bloque diario de cinco ensayos se calcularon para cada animal durante cada dfa de adquisicion. Se usaron ANOVA de una via para comparar demoras de grupo los dfas 1, 4 y 8 del entrenamiento. Los efectos significativos se analizaron mediante la prueba a posteriori de Newman-Keuls con un nivel de significacion fijado a P < 0,05.

Ensayo de dispersion. Se hicieron crecer celulas MDCK hasta el 100% de confluencia sobre los cubreobjetos en

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placas de seis pocillos y se lavaron dos veces con PBS. Entonces se transfirieron de manera aseptica los cubreobjetos confluentes a placas de seis pocillos nuevas que conteman 900 |il de DMEM libre de suero. Se anadieron Norleual, peptido Hinge y/o HGF (20 ng/ml) a los pocillos apropiados. Los pocillos de control recibieron vetnculo de PBS. Se incubaron las placas a 37°C con el 5% de CO2 durante 48 horas. Se retiro el medio y se fijaron las celulas con metanol. Se tineron las celulas con Diff-Quik Wright-Giemsa (Dade-Behring, Newark, DE) y se tomaron imagenes digitales. Se retiraron los cubreobjetos con pinzas y se capturaron mas imagenes digitales. Se logro la cuantificacion de pfxeles de las imagenes usando Image J y se realizo el analisis estad^stico usando Prism 5 e InStat v.3.05.

Preparacion de cultivos de celulas neuronales del hipocampo disociadas

Se cultivaron neuronas del hipocampo (2x105 celulas por centfmetro cuadrado) de ratas Sprague Dawley P1-2 sobre placas recubiertas con poli-L-lisina de Sigma (St. Louis, MO; 300.000 de peso molecular). Se mantuvieron neuronas del hipocampo en medio Neurobasal A de Invitrogen (Carlsbad, CA) complementado con B27 de Invitrogen, L- glutamina 0,5 mM y citosina-D-arabinofuranosa 5 mM de Sigma anadidos a los 2 dfas in vitro. Luego se cultivaron las neuronas del hipocampo 3-7 dfas adicionales, tiempo en el que o bien se transfectaron o bien se trataron con diversos reactivos farmacologicos tal como se describe en el texto o las leyendas de las figuras.

Transfeccion de cultivos de celulas neuronales del hipocampo disociadas

Se transfectaron las neuronas con mRFP-p-actina el dfa in vitro 6 (DIV6) usando LipofectAMINE™ 2000 (Invitrogen) segun el protocolo del fabricante. Este protocolo produjo la eficacia de transfeccion del 3-5% deseada propiciando de este modo la visualizacion de las neuronas individuales. Eficacias mas altas ocultaron los arboles dendnticos de neuronas individuales. La expresion de actina etiquetada de manera fluorescente permitio una clara visualizacion de las espinas dendnticas, a medida que las espinas dendnticas se enriquedan en actina. El DIV7 se trataron las celulas con vetnculo (H2O) o peptidos (tal como se describe en el texto) anadidos al medio. El DIV12 se fijaron las neuronas (paraformaldehndo al 4%, sacarosa al 3%, PIPES 60 mM, HEpES 25 mM, EGTA 5 mM, MgCh 1 mM, pH 7,4) durante 20 min a temperatura ambiente y se montaron. Se secaron los portaobjetos durante al menos 20 horas a 4°C y se obtuvieron imagenes fluorescentes con software de microscopfa digital Slidebook 4.2 que se realiza con un microscopio confocal invertido Olympus IX81 con lentes de inmersion en aceite 60X, NA 1,4 y resolucion de 0,280 |im. Se midio la densidad de espinas dendnticas sobre dendritas primarias y secundarias a una distancia de al menos 150 |im desde el soma. Se analizaron cinco segmentos de 50 |im de longitud de dendrita de al menos 10 neuronas por punto de datos para cada punto de datos notificado. Se repitio cada experimento al menos tres veces usando preparaciones de cultivo independientes. Se determino la longitud de dendrita usando el programa Image J 1.41o de los National Institutes of Health (NIH, Bethesda, MD) y el programa Neuron J de seguimiento de neuritas (Meijering, Jacob et al. 2004). Las espinas se contaron manualmente.

Preparacion y transfeccion de cultivos de cortes del hipocampo organodpicos

Se cultivaron hipocampos de ratas Sprague Dawley P4 tal como se describio previamente (Wayman, Impey et al. 2006). Brevemente, se cultivaron cortes de 400 |im en (Milipore, Billerica, MA) durante 3 dfas tras los cuales se transfectaron biolfsticamente con protema fluorescente de tomate (TFP) usando una pistola genica Helios (BioRad, Hercules, CA), segun el protocolo del fabricante, para visualizar los arboles dendnticos. Tras un periodo de recuperacion de 24 horas se estimularon los cortes con Dihexa o Nle1-AngIV 1 pM durante 2 dfas. Se fijaron los cortes y se montaron. Se obtuvieron imagenes de procesos neuronales CA1 del hipocampo y se midieron tal como se describio anteriormente.

Cortes de hipocampo agudos

Se anestesiaron ratas Sprague-Dawley adultas (250 g +) obtenidas de Harlan Laboratories (Ca, EE.UU.) con isofluorano (Vet OneTM, MWI, Meridian, ID, EE.UU.) y se decapitaron. Se extirpo el cerebro rapidamente y se coloco dentro de lfquido cefalorraqrndeo artificial enfriado con hielo (aCSF) durante aproximadamente 30 s. Se separaron ambos hemisferios mediante un corte sagital medio y se retiraron ambos hipocampos. Se seccionaron cortes transversal y longitudinalmente (400 |im) para garantizar la penetrabilidad del farmaco, usando un cortador de tejido McIlwain (Brinkmann, Gomshall, R.U.) y se transfirio a una camara de incubacion gasificada (95% de 02/5% de CO2) que contema aCSF durante 90 minutos a temperatura ambiente. Se transfirieron los cortes a tubos nuevos, se retiro el aCSF mediante succion cuidadosa y se reemplazo por aCSF que contema vetnculo (aCSF + aCSF), 100 ng/ml con factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) recombinante adulto libre de portador (R and D Systems, MN, EE.UU.) en aCSF, Hinge 10-10 M (Harding lab), 50 ng/ml en aCSF, Dihexa 10-10 M (Harding lab) en aCSF, Dihexa 10-12 M en aCSF o HGF 50 ng/ml + Dihexa 10-12 M en aCSF durante 30 minutos a 37°C balanceo suave. Se retiro el aCSF y se lisaron los cortes usando tampon RIPA (Upstate/Milipore, Billerica, MA) y cocteles de inhibidores I y II (Sigma, St. Louis, MO), se sonicaron en hielo y se clarificaron mediante centrifugacion durante 30 minutos, 13.000 rpm a 4°C. Se retiro el sobrenadante del sedimento y se almaceno a -80°C o se proceso inmediatamente para electroforesis en gel.

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ARNhp

Se diseno una secuencia diana para c-Met usando un programa de diseno central de iARN (vease la pagina web ubicada en cancan.cshl.edu/). Se inserto la secuencia diana GTGTCAGGAGGTGTTTGGAAAG (SEQ ID NO: 2) en el vector pSUPER (Oligoengine, Seattle WA) que dirige la produccion endogena de ARNhp bajo el promotor H1. Se transfecto el ARNhp dentro de las celulas usando el metodo de lipofectamina descrito anteriormente. La verificacion del silenciamiento del receptor se realizo creando un producto genico etiquetado con c-Met-6-Myc usando el sistema de clonacion Gateway (Invitrogen). Se clono la secuencia que codifica para la protema Met a partir de ADNc de cerebro completo de rata usando cebadores obtenidos de Integrated DNA Technologies, Inc. Se purifico en gel el producto amplificado y se corto una banda correspondiente a una banda de 190 kDa y se clono en un vector de destino PCAGGS-6-Myc (Gateway).

Electroforesis en gel e inmunotransferencia de tipo Western

Se cuantifico la concentracion de protema de las muestras usando el metodo de BCA (Pierce, Rockford, IL) siguiendo el protocolo del fabricante. Se anadieron las muestras a tampon de SDS-PAGE y se sometieron a ebullicion durante 10 min antes de cargar sobre un gel precolado de Bis-Tris al 4-12% (Invitrogen, Carlsbad, CA) para electroforesis. Se transfirieron las protemas sobre membranas de PVDF (Bio Rad, Hercules, CA) y se bloquearon con AquaBlock™ (New England Biolabs, Ipswich, MA) durante 1 hora a temperatura ambiente (TA). Se realizo la incubacion con anticuerpo primario en AquaBlock™ con anticuerpo de conejo anti-Met y anticuerpo de conejo anti-fosfo-Met (Tyr1234/1235) (1:1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) durante la noche a 4°C. Se realizaron lavados alternativos con PBS y PBST. Se realizaron incubaciones con anticuerpo secundario (IRDye) (Rockland, Gilbertsville, PA) en AquaBlock™ durante una hora a TA. Se obtuvieron imagenes de las inmunotransferencias usando un sistema de obtencion de imagenes Odyssey Infrared Imaging System de LI-COR (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE).

Inmunocitoqu^mica

Las neuronas transfectadas se trataron, se fijaron y se tineron como se describio previamente en el capttulo dos. Brevemente, se permeabilizaron las celulas con detergente Triton X-100 al 0,1% (Bio-Rad; Hercules, CA) durante 10 minutos. Se uso una albumina serica bovina al 8% (Intergen Company; Burlington, MA) en PBS para impedir la union no espedfica durante una hora a T.A.; las incubaciones con anticuerpo primario fueron a una dilucion de 1:2500 (vease a continuacion) en BSA al 1% en PBS a 4°C durante la noche. Se aplico anticuerpo secundario, anticuerpo de cabra anti-raton Alexafluor 488 1:3000 (Invitrogen: Carlsbad, CA) durante dos horas a temperatura ambiente. Se montaron los cubreobjetos con reactivo antidesvanecimiento ProLong Gold (Invitrogen; Carlsbad, CA) y se realizaron todos los lavados con PBS. Se realizaron la obtencion de imagenes y el analisis tal como se describio anteriormente. Para la transmision excitatoria presinaptica se empleo el marcador VGLUT1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania) (Balschun, Moechars et al.) y para la transmision presinaptica general se aplico sinapsina1 (Synaptic Systems, Goettingen, Alemania) (Ferreira y Rapoport 2002). Se establecio una funcion postsinaptica mediante pSD-95 (Milipore, Billerica, MA) (E1-Husseini, Schnell et al. 2000). En cada caso se conto el numero total de espinas para los grupos de tratamiento, control, Nle1-AngIV y Dihexa, para garantizar un fenotipo activo. Se conto el numero total de espinas enriquecidas en actina (roja) adyacentes a VGLUT1 o sinapsina y se convirtio en un porcentaje ya que el porcentaje de correlacion de espinas inducidas por tratamiento con respecto a marcadores presinapticos es un indicador fuerte de la capacidad para transmitir senales excitatorias. En esta solicitud el numero de correlaciones consistio en espinas de actina etiquetadas con rojo fluorescente frente a puntos inmunopositivos para PSD-95 verdes que, cuando se fusionaron, dieron como resultado una espina naranja.

Registros de celulas completas

Se realizaron experimentos de registro electrofisiologico de fijacion de voltaje sobre neuronas del hipocampo cultivadas transfectadas con mRFP-p-actina (control de vehmulo) y sobre neuronas del hipocampo transfectadas con pretratamiento de 5 dfas con Hinge o Dihexa 1pM, o HGF 10 ng/ml (R&D Systems). Se tomaron registros de las neuronas que teman forma de tipo piramidal (cuerpos celulares de ~20 mm y distribucion de dendritas asimetrica). El tiempo tras la transfeccion fue de 6 dfas. Se intercambio el medio de cultivo por una disolucion extracelular que contema (en mM) NaCl 140, KCl 2,5, MgCh 1, CaCh 3, glucosa 25 y HEPES 5; se ajusto el pH a 7,3 con KOH; se ajusto la osmolalidad a 310 mOsm. Se dejo que los cultivos se equilibrasen en una camara de registro montada sobre un microscopio invertido (IX-71; Olympus optical, Tokio) durante 30 min antes del registro. Se visualizaron las celulas transfectadas con fluorescencia (Olympus optical). Se sacaron las pipetas de registro (extractor de micropipeta P-97 Flaming/Brown; Sutter Instrument, Novato, CA) de vidrio de borosilicato de pared convencional sin filamento (DO = 1,5 mm; Sutter Instrument). La resistencia en CC de pipeta a bano de los electrodos de fijacion de voltaje oscilaba entre 4,0 y 5,2 MQ, y se llenaron con una disolucion interna de la siguiente composicion (en mM): CsCl 25, CsCHaOaS 100, fosfocreatina 10, EGTA 0,4, HEPES 10, MgCh 2, Mg-ATP 0,4 y Na-GTP 0,04; se ajusto el pH a 7,2 con CsOH; se ajusto la osmolalidad a 296 - 300 mOsm. Se aislaron farmacologicamente las EPSC en miniatura (mEPSC) bloqueando los canales de cloruro de receptor de GABA con picrotoxina (100 |iM; Sigma), bloqueando los receptores de glicina con estricnina (1 |iM; Sigma) y bloqueando la generacion de potenciales de

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accion con tetrodotoxina (TTX, 500 nM; Tocris). Se obtuvieron registros usando un amplificador Multiclamp 700B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se filtraron las senales analogicas con filtro Bessel de paso bajo a 2 kHz, se digitalizaron a 10 kHz a traves de una interfaz Digidata 1440A (Molecular Devices) y se almacenaron en un ordenador usando software Clamplex 10.2 (Molecular Devices). Se mantuvo el potencial de membrana a -70 mV a temperature ambiente (25°C) durante un periodo de 0,5 - 2 h tras la retirada del cultivo del incubador. No se corrigieron los potenciales de uniones Kquidas. Los analisis de los datos se realizaron usando el software Clampfit 10.2 (Molecular Devices) y software Mini-Analysis 6.0 (Synaptosoft Inc.; Fort Lee, NJ). Los criterios para un registro exitoso incluyeron la resistencia electrica del sello entre la superficie exterior de la pipeta de registro y la celula unida >2 GQ, resistencia de entrada de neuronas >240 MQ. Las mEPSC tuvieron un tiempo de registro de 5 min.

RESULTADOS

El factor de crecimiento de hepatocitos aumenta la arquitectura dendritica y soporta la sinaptogenesis

Se ha mostrado previamente que Dihexa y Nle1-AngIV inducen la espinogenesis en neuronas del hipocampo transfectadas con mRFP-p-actina (vease el ejemplo 1); sin embargo el mecanismo que subyace a esta accion era desconocido. Debido a la capacidad de Norleual, otro analogo de AnglV para bloquear la accion de HGF sobre c- Met (Yamamoto et al., 2010), se planteo la hipotesis de que los aumentos en la densidad de espinas iniciados por Dihexa y Nle1-AngIV estan mediados por el sistema de HGF/c-Met. Como tal, se evaluaron los efectos de HGF sobre la espinogenesis en cultivos de hipocampo disociados. Se transfectaron neuronas del hipocampo con mRFP- P-actina el dfa in vitro (DIV) 6 y se estimularon con HGF durante 5 dfas.

Se observo un aumento dependiente de la dosis en los numeros de espinas tras la estimulacion con HGF siendo la dosis eficaz mas baja de 5 ng/ml (numeros de espinas medios = 24,7; **= p < 0,01 frente a control; ns frente a HGF 10 y 20 ng/ml). Los efectos mas significativos se produjeron por dosis de 10 y 20 ng/ml (numeros de espinas medios = 27,5 y 27,0 respectivamente; n = 50 por grupo de tratamiento; *** = p < 0,001; df= 4/245; F = 13,5). Sin embargo, una dosis de 2,5 ng/ml de HGF no tuvo efecto sobre los numeros de espinas basales (numeros de espinas medios = 18,6 frente a control = 18,0) (figura 8) y por tanto se considero que era subumbral.

Para evaluar la capacidad de HGF para aumentar la espinogenesis en un entorno mas relevante fisiologicamente, se emplearon cortes de hipocampo organotfpicos. Se estimularon los cortes de hipocampo, que se transfectaron biolfsticamente con la protema de tomate fluorescente roja soluble con HGF 10 ng/ml, Dihexa 10-12 M o vehfculo durante 48 horas. Las neuronas del hipocampo CA1, que se sabe que experimentan cambios plasticos en respuesta al aprendizaje se seleccionaron facilmente para el analisis basandose en la morfologfa. Dihexa y HGF aumentaron significativamente el numero de espinas por longitud de dendrita de 50 |im en las neuronas del hipocampo CA1 (numeros de espinas medios = 15,0 y 18,5 respectivamente en comparacion con numeros de espinas de control medios = 6,1; *** = P < 0,001 y ** = P < 0,01 entre grupos de tratamiento; df = 2/81; F = 41,5) (figuras 9A y B).

Estudios previos en los que se trataron neuronas con Dihexa y Nle1-AngIV indicaron que la mayona de las espinas dendnticas que se indudan se ubicaban conjuntamente con marcadores tanto pre- como postsinapticos, indicando que estas espinas nuevas soportaban sinapsis funcionales. Ademas, la mayona de las entradas sinapticas paredan ser glutamatergicas. Puesto que se propone que Dihexa, Nlel-AnglV y HGF actuan todos a traves de un mecanismo comun, se evaluaron las propiedades funcionales de espinas inducidas por HGF. Se sometieron a inmunotincion neuronas del hipocampo transfectadas con mRFP-p-actina para detectar un marcador general de zonas activas presinapticas, sinapsina (Ferreira y Rapoport; 2002) asf como un marcador espedfico para sinapsis glutamatergicas, transportador de glutamato vesicular 1 (VGLUT1) (Balschun, Moechars et al. 2010). La estimulacion con HGF aumento significativamente el numero de espinas postsinapticas (numero medio de espinas por longitud de dendrita de 50 |im para HGF = 33 frente a 23 para el control; *** = P < 0,001; + EEM mediante ANOVA de una via) garantizando por tanto un fenotipo activo mediante el tratamiento con HGF (figuras 10A y B). Se conto el numero de espinas postsinapticas adyacentes a VGLUT1, o puntos positivos para sinapsina y se convirtieron a un porcentaje de las espinas totales contadas. Para neuronas tratadas con HGF (10 ng/ml) sometidas a inmunotincion frente a sinapsina1, se observo una correlacion del 98% entre el marcador presinaptico y la espina enriquecida en actina postsinaptica (figura 9C). Una correlacion del 95% para VGLUT1 y espinas postsinapticas indico que las espinas inducidas por HGF eran casi exclusivamente glutamatergicas (figura 10D). La correlacion entre puntos verdes y espinas rojas para neuronas tratadas con vehreulo fue del 94% de manera similar para sinapsina y VGLUT1 (figuras 10C y D).

Los datos anteriores sugieren que las espinas producidas en respuesta al tratamiento con HGF forman sinapsis funcionales. Ademas, la alta correlacion con VGLUT1 sugiere que muchas de estas entradas son de naturaleza excitatoria. Para evaluar adicionalmente esta conclusion, se midio la frecuencia de corrientes postsinapticas excitatorias en miniatura mediadas por AMPA espontaneas (mEPSC) a partir de neuronas tras el tratamiento con HGF y se compararon estos datos con los obtenidos para Dihexa, que se habfan establecido previamente para aumentar la frecuencia de mEPSC. Los registros se realizaron sobre neuronas del hipocampo disociadas transfectadas con mRFP-p-actina y tratadas con Dihexa 10-12 M, HGF 10 ng/ml o un volumen equivalente de vehfculo durante 5 dfas. Tanto el tratamiento con HGF (frecuencia media = 7,09 + 0,53; n = 11) como con Dihexa

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(frecuencia media = 6,75 + 0,99; n = 9) aumentaron la transmision sinaptica excitatoria casi dos veces con respecto a neuronas tratadas con control (frecuencia media = 3,55 + 0,60; n = 9; ** = P < 0,002; media + EEM mediante ANOVA de una via seguido por prueba a posteriori de Neuman-Keuls) (figura 11), lo que confirma la suposicion de que el tratamiento con HGF soporta una sinaptogenesis aumentada.

Con el fin de determinar si las acciones de ligandos de angiotensina IV estan mediadas por HGF/c-Met, se realizo un experimento de sinergia. Se mostro previamente que dosis subumbral de HGF aumentadas con dosis subumbral de Dihexa o Nle1-AngIV promovfan la espinogenesis, lo que sugiere un mecanismo de accion comun. Se estimularon neuronas del hipocampo disociadas transfectadas con mRFP-p-actina durante 5 d^as con concentraciones subumbral de HGF y Dihexa (2,5 ng/ml + 10"13 M, respectivamente), dosis biologicamente activas de HGF (10ng/ml), Dihexa o Nle1-AnglV (10'12 M) o una combinacion de dosis subumbral de HGF 2,5 ng/ml + Dihexa 10"12M o HGF 2,5 ng/ml + Nle1-AngIV 10"12 M. Los resultados se presentan en las figuras 12 A y B. Concentraciones subumbral de HGF (2,5 ng/ml), Dihexa y Nle1-AngIV (10'13 M) no tuvieron efecto sobre la espinogenesis basal y no difirieron de las neuronas tratadas con control (media + EEM, numeros de espinas para el control = 17,4, HGF = 16,5, Dihexa = 17,1 y Nle1-AngIV = 16,5 por longitud de dendrita de 50 |im; p > 0,05). Dosis biologicamente activas de HGF (10 ng/ml), Dihexa y Nle1-AngIV (10"T2 M) produjeron un efecto significativo con respecto a las espinas tratadas con control (media + EEM, numeros de espinas para HGF = 29,3, Dihexa = 26,4 y Nle1-AngIV = 29,8 por dendrita de 50 |im). Dosis subumbral combinadas de Dihexa 2,5 ng/ml + 10"13 M y Nle1-AngIV 2,5 ng/ml + 10"13 M copiaron fenotfpicamente los efectos de cada agonista a su dosis biologicamente activa sola (media + EEM, los numeros de espinas para HGF + Dihexa son 28,8 y para HGF + Nle1-AngIV son 26,2 por longitud de dendrita de 50 |im en comparacion con neuronas tratadas con control = 17,4; *** = P < 0,001; media + EEM; mediante ANOVA de una via seguido por prueba a posteriori de Tukey).

Buscando una confirmacion adicional de interacciones mediadas por HGF/c-Met y ligando de angiotensina IV, se utilizo el antagonista de HGF novedoso Hinge (DYIRNC, SEQ ID NO: 3) (Kawas et al., 20113). Se confirmo Hinge como un antagonista de HGF/receptor c-Met por su capacidad para inhibir la dispersion de celulas de rinon canino Madin-Darby (MDCK), el metodo de referencia para la evaluacion de la actividad mediada por c-Met. La dispersion celular implica una perdida de las propiedades de adhesion celular, migracion y diferenciacion celular, las caractensticas distintivas de las acciones de HGF y c-Met (Yamamoto, Elias et al., 2010; Birchmeier, Sonnenberg et al. 1993). Se sometio Hinge a prueba para determinar sus efectos sobre neuronas del hipocampo disociadas y se encontro que no tema efecto sobre la espinogenesis a lo largo de un amplio intervalo de dosis, indicando por tanto que Hinge y el sistema de HGF/c-Met no desempenan un papel significativo en la espinogenesis basal observada en las neuronas cultivadas (figura 13A). Sin embargo, Hinge inhibio eficazmente la formacion de espinas en neuronas estimuladas con HGF 10 ng/ml (figura 13B), Nle1-AngIV 10-12 M (figura 13C) o Dihexa 10-12 M (Figura 12D) respaldando adicionalmente la confirmacion de que esas acciones estan mediadas por el sistema de HGF/c-Met.

Para evaluar los efectos de Hinge sobre la transmision sinaptica excitatoria, se registraron las mEPSC a partir de neuronas del hipocampo transfectadas con mRFP-p-actina durante 5 dfas con Hinge (10-12 M), HGF (10 ng/ml), Dihexa (10-12 M), Hinge + HGF (10-12 M + 10 ng/ml, respectivamente) o Hinge + Dihexa (10-12 M cada uno). Hinge solo no afecta a la transmision sinaptica (frecuencia media = 4,51 + 0,47) en comparacion con neuronas tratadas con vehmulo (frecuencia media = 5,31 + 0,35; figura 14A y B). Las frecuencias de HGF y Dihexa aumentaron significativamente en comparacion con neuronas tratadas con tanto Hinge como vehmulo (frecuencia media para HGF = 9,66 + 0,20 y para Dihexa = 8,25 + 0,56). Sin embargo estos efectos se ven significativamente atenuados por la estimulacion en presencia de Hinge (frecuencias medias para HGF + Hinge = 5,25 + 0,27 y Dihexa + Hinge = 5,57 + 0,65; figuras 14A y B). Estos resultados sugieren que las espinas recien generadas estan formando sinapsis funcionales y aunque Hinge no tiene efecto sobre la transmision sinaptica, es su capacidad para inhibir la espinogenesis la que atenua las frecuencias mediadas por AMPA.

El receptor de angiotensina IV propuesto, HGF es el ligando para el receptor tirosina cinasa c-Met. Aunque se ha documentado bien la localizacion de ARNm de c-Met y HGF en el cerebro (Jung, Castren et al. 1994; Honda, Kagoshima et al. 1995; Thewke y Seeds 1996; Achim, Katyal et al. 1997), la presencia y distribucion de protema c- Met no se ha examinado. Por tanto se estudiaron con sonda varias regiones cerebrales para determinar la presencia de c-Met pero no se pudo hacer eso para HGF debido a la falta de anticuerpos eficaces. Se observaron altos niveles de protema c-Met en la mayona de las regiones del cerebro. Espedficamente, se observo la senal maxima de protema c-Met en el hipocampo y parece ser mayor que en el dgado que es un sitio principal de produccion de HGF. Tambien se observa una senal fuerte en la corteza prefrontal y el mesencefalo, regiones de importancia para la cognicion, mientras que la neocorteza tema una senal algo atenuada el cerebelo produjo la senal mas baja (figuras 15 A y B).

La aparente dependencia de las acciones de Dihexa del sistema de HGF/c-Met predijo que Dihexa en presencia de niveles subumbral de HGF debe poder estimular la fosforilacion y activacion de c-Met. Por tanto se estimularon cortes del hipocampo de ratas adultas agudas con HGF, Dihexa en condiciones de saturacion y no saturacion solos y en combinacion y se estudiaron con sonda para determinar fosfo-Met. La fosforilacion del receptor c-Met indica activacion del receptor. La figura 16 muestra la fosforilacion del receptor c-Met tras un tratamiento de 30 minutos con vehmulo y diversas concentraciones de HGF o Dihexa. Dosis de saturacion de HGF (100 ng/ml) y Dihexa (10'1° M)

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Dihexa aumentaron ambas las fosforilacion de c-Met en comparacion con cortes tratados con control (aCSF); (p < 0,007). Las dosis de no saturacion de HGF (50 ng/ml) y Dihexa (10-12 M) no eran estadfsticamente diferentes de los cortes tratados con control (p > 0,05) y por tanto se consideraron que eran subumbral. Sin embargo, las dosis subumbral de HGF y Dihexa combinadas paredan producir un efecto de manera similar a la dosis de saturacion de HGF y Dihexa (p < 0,007). Por tanto, dependiente de la dosis, parece que Dihexa puede activar independientemente el sistema de HGF/c-Met en el cerebro de rata adulta sola asf como conjuntamente con HGF. Conjuntamente con estos hallazgos, Dihexa puede aumentar drasticamente la capacidad de HGF para activar c-Met mediante fosforilacion en celulas HEK293 (figura 17) y estimular la dispersion de celulas MDCK (figura 18).

Para confirmar de manera irrefutable que los analogos de AnglV actuan por medio del sistema de HGF/c-met, se empleo un ARNhp para c-Met para inactivar el receptor. Se transfectaron neuronas del hipocampo disociadas con ARN de mRFP-p-actina y shMet y se permitio que tuviera lugar la inactivacion del receptor durante 48 horas antes de la estimulacion con 0,5 |ig (por pocillo) de HGF (10 ng/ml), Dihexa o Nle1-AngIV (ambos a 10-12 M). Una exposicion mas prolongada pareda ser perjudicial o toxica para las neuronas. Se verifico una inactivacion del receptor c-Met eficaz transfectando celulas de rinon embrionario humano (HEK) con (0,1 |ig) de c-Met etiquetado con 6-Myc, (0,1 |ig) de shMet o mRFP-p-actina solo. Se confirmo la inactivacion satisfactoria mediante inmunotransferencia para c-met etiquetado con Myc usando un anticuerpo anti-Myc (figura 19).

Se trataron neuronas transfectadas con mRFP-p-actina sola, que serna como control, con HGF 10 ng/ml, Dihexa o Nle1-AngIV 10-12 M. Se observo un aumento significativo en el numero de espinas en comparacion con neuronas tratadas con control (numeros de espinas medios por longitud de dendrita de 50 |im = 13,2 frente a HGF = 20,6; Dihexa = 21,8 y Nle1-AngIV = 20,0; p < 0,05 mediante ANOVA de una via seguido por prueba a posteriori de Tukey). Neuronas transfectadas con mRFP-p-actina y shMet que se estimularon con HGF 10 ng/ml, Dihexa o Nle1-AngIV 10-12 M, no difenan del control en cuanto al numero de espinas (numeros de espinas medios por longitud de dendrita de 50 |im = 13,5 frente a HGF = 12,4; Dihexa = 12,0 y Nle1-AngIV = 12,1; p > 0,05 mediante ANOVA de una via seguido por prueba a posteriori de Tukey) tal como se muestra en la figura 20. Se empleo una secuencia de ARN reorganizada al azar como control negativo y no tuvo ningun efecto sobre la espinogenesis basal o estimulada (datos no mostrados). Estos resultados confirman que los efectos de analogos de AnglV estan mediados por el sistema de HGF/c-Met.

Se empleo el laberinto de agua de Morris, una tarea de aprendizaje espacial dependiente del hipocampo que requiere que las ratas localicen un pedestal escondido por debajo de la superficie del agua orientandose ellas mismas con claves exteriores al laberinto, para evaluar el impacto del antagonista de HGF, Hinge, sobre los efectos procognitivos de Dihexa. Los grupos sometidos a prueba incluyeron aCSF seguido por aCSF, escopolamina (70 nM) seguido por aCSF, escopolamina seguido por Dihexa (300 pM), aCSF seguido por Hinge (300 pM) y escopolamina + Hinge seguido por Dihexa. La figura 21 representa las demoras medias hasta encontrar el pedestal escondido durante los dfas 1-8 de entrenamiento en el laberinto de agua. Ninguno de los grupos difena significativamente en la demora hasta encontrar el pedestal el dfa uno de entrenamiento. Las demoras medias para el grupo de control de vehfculo (aCSF ^ aCSF) grupo = 89,3 s; el grupo tratado con escopolamina = 114,7 s; la demora del grupo tratado con escopolamina + Hinge ^ Dihexa = 107,9 s; la demora media del grupo de Hinge = 111,1 s; y el grupo de escopolamina ^ Dihexa = 115,2 s. Para el cuarto dfa de entrenamiento, considerado un dfa crucial en el que se produce la mayor mejora en el entrenamiento y la plasticidad neural (Meighan et al., 2006), el grupo de escopolamina (demora media hasta encontrar el pedestal = 102,4 s) y el grupo de escopolamina + Hinge ^ Dihexa (demora media = 105,2 s) no mostraron signos de mejora en comparacion con el grupo de control de vehfculo (demora media = 43,0 s), el grupo de Hinge grupo (demora media = 78,3 s) y el grupo de escopolamina ^ Dihexa (demora media = 63,0 s). El dfa final de entrenamiento, cuando se produjo el aprendizaje maximo (Meighan, Meighan et al. 2006), las demoras medias para el grupo de escopolamina (demora media hasta encontrar el pedestal = 84,8 s) y el grupo de escopolamina + Hinge ^ Dihexa (demora media = 93,6 s) indicaron poca mejora en el aprendizaje en comparacion con el grupo de control de vehfculo (demora media = 43,0 s), el grupo de Hinge (demora media = 46,1 s) y el grupo de escopolamina ^ Dihexa (demora media 62,3 s). Estos resultados sugieren que HGF y c-Met desempenan un papel importante en procesos cognitivos dependientes del hipocampo.

Discusion

Los efectos procognitivos de analogos de angiotensina IV sugieren que pueden desarrollarse farmacos antidemencia basados en este sistema (Braszko, Kupryszewski et al. 1988; Stubley-Weatherly, Harding et al. 1996; Pederson, Harding et al. 1998; Wright, Stubley et al. 1999). Sin embargo, debido a la escasa estabilidad metabolica de la angiotensina IV y muchos analogos de AnglV, la incapacidad de los analogos tempranos para penetrar la barrera hematoencefalica y el no poder identificar el receptor AT4, ninguna comparna farmaceutica ha seguido adelante con su desarrollo. Dihexa, un analogo de angiotensina IV novedoso sintetizado por el laboratorio de los presentes inventores, es estable y activo por via oral y ha superado por tanto los principales impedimentos farmacocineticos que impiden el desarrollo. Se ha comprobado que Dihexa es estable en la sangre durante mas de 5 horas (no mostrado), sobrevive al paso a traves del intestino penetrando la barrera hematoencefalica y supera las deficiencias cognitivas en modelos agudos y cronicos de demencia (no mostrado). Un mecanismo general, establecido para la facilitacion de la tarea de laberinto de agua, implica la expansion del arbol dendntico en forma de espinas

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postsinapticas reden desarrolladas y sinaptogenesis acompanante. El ultimo obstaculo que queda para el desarrollo era la falta de un mecanismo molecular.

En el presente documento se demuestra que las acciones de analogos de AnglV dependen del sistema de HGF/c- Met. Ambos sistemas parecen mediar en efectos fisiologicos similares. El sistema de angiotensina IV/AT4 tiene efectos cerebroprotectores (Wright, Clemens et al. 1996; Date, Takagi et al. 2004), aumenta la potenciacion a largo plazo (Kramar, Armstrong et al. 2001; Wayner, Armstrong et al. 2001; Akimoto, Baba et al. 2004; Davis, Kramar et al. 2006), tiene efectos procognitivos bien establecidos (Wright y Harding 2008) y se sospecha que regula el desarrollo de celulas madre neurales. El sistema de HGF/c-Met tambien tiene efectos procognitivos (Akimoto, Baba et al. 2004; Tyndall y Walikonis 2006; Tyndall y Walikonis 2007) y se sabe que esta implicado en la regulacion de celulas madre (Urbanek, Rota et al. 2005; Nicoleau, Benzakour et al. 2009). Ademas de similitudes funcionales, hay homologfa de secuencia entre angiotensina IV y la region de ligador “bisagra” de HGF (Wright, Yamamoto et al. 2008). Esta nocion se vio reforzada por la observacion de que el antagonista de AT4 bien conocido, Norleual, puede bloquear muchas funciones reguladas por HGF/c-Met tales como dispersion de celulas MDCK (Yamamoto, Elias et al. 2010).

La agilizacion de la tarea de laberinto de agua la efectuan Dihexa y el ligando de angiotensina IV original, Nle1- AnglV, mediante el aumento de la neurotransmision que se produce a traves de la elaboracion del arbol dendntico. El vinculo planteado como hipotesis entre la accion de analogos de AnglV y el sistema de HGF/c-Met predijo que como Dihexa y Nle1-AngIV HGF debe poder estimular el crecimiento de espinas dendnticas en neuronas del hipocampo disociadas. Tal como se predijo, HGF promovio un aumento dependiente de la dosis en la espinogenesis (figura 7) en neuronas del hipocampo disociadas. Se encontro posteriormente que la concentracion mas eficaz de HGF (10 ng/ml) estimulaba neuronas del hipocampo en cultivos de cortes del hipocampo organotfpicos que son preparaciones mas intactas de manera similar a Dihexa (figuras 8A y B) estableciendo ademas un vinculo mecarnstico entre Dihexa y HGF/c-Met. Para evaluar la relevancia fisiologica de estas nuevas espinas y determinar la firma de neurotransmisores de las sinapsis residentes, se sometieron a inmunotincion espinas inducidas por el tratamiento con HGF marcadas con mRFP-p-actina para detectar el marcador presinaptico universal sinapsina que se ubica en las zonas activas presinapticas (Ferreira y Rapoport 2002) y el marcador presinaptico excitatorio VGLUT1 que se encuentra en sinapsis presinapticas glutamatergicas (Balschun, Moechars et al.). La razon de espinas marcadas con mRFP-p-actina postsinapticas yuxtapuestas a espinas con sinapsina o VGLUT1 no era diferente de neuronas tratadas con control lo que sugiere que las espinas inducidas por el tratamiento estan formando sinapsis funcionales (figuras 9A-D). Se obtuvo la validacion adicional de la sinaptogenesis registrando las mEPSC, rafagas presinapticas espontaneas independientes de los potenciales de accion, en neuronas tratadas con HGF y Dihexa. Se amplifico la transmision mediada por AMPA en respuesta al tratamiento con HGF y Dihexa tal como se muestra por el aumento de las frecuencias (figura 10).

Se usaron concentraciones subumbral de Dihexa y HGF o N1el-AngIV y HGF para estimular neuronas del hipocampo in vitro para determinar si los ligandos de angiotensina IV Dihexa y Nle1-AngIV, y HGF afectan a la misma cascada de senalizacion o actuan sobre un receptor (c-Met). Para determinar si Dihexa y Nle1-AngIV intervienen en la misma cascada de senalizacion, se combinaron concentraciones subumbral de ligandos de AnglV con dosis subumbral de HGF. Mientras que las concentraciones subumbral de cada ligando solo no alteraron la espinogenesis basal, concentraciones subumbral combinadas de Dihexa 10-13 M y HGF 2,5 ng/ml o Nle1-AngIV 10-13 M y 2,5 ng/ml de HGF produjeron un efecto casi maximo, de manera similar a dosis de sensibilidad biologica de cada ligando solo (figuras 11A y B). Las similitudes en las respuestas dendnticas a los analogos de AnglV y HGF concuerdan con un mecanismo de accion comun.

Para reforzar adicionalmente esta coincidencia de mecanismo, se empleo el antagonista de HGF novedoso Hinge y se evaluo para determinar sus efectos sobre neuronas del hipocampo estimuladas con analogos de AnglV y HGF. Hinge, como el antagonista de angiotensina IV Norleual, se establecio como antagonista de c-Met por su capacidad para bloquear la fosforilacion dependiente de HGF de c-Met e impedir la dispersion dependiente de HGF en la lmea de celulas epiteliales MDCK. La dispersion celular, que es el rasgo distintivo de una interaccion HGF/c-Met, conduce a una perdida de las propiedades de adhesion celular que permite que las celulas migren (Yamamoto, Elias et al.; Birchmeier, Sonnenberg et al. 1993). Se encontro que Hinge no terna efectos adversos sobre neuronas del hipocampo cultivadas y no promovfa o dificultaba la espinogenesis (figura 12A). Sin embargo, a concentraciones picomolares, Hinge impedfa la espinogenesis inducida por HGF, Nle1-AngIV y Dihexa (figuras 12B-D) sugiriendo ademas que los efectos observados para los ligandos de angiotensina IV de los inventores estan mediados por HGF/c-Met. Se evaluaron los efectos de Hinge sobre la sinaptogenesis registrando las frecuencias de mEPSC en neuronas del hipocampo cultivadas. Mientras que Hinge solo no alteraba las transmision sinaptica de lmea base, atenuaba los aumentos por HGF y Dihexa en las frecuencias de AMPA (figuras 13A y B). Este efecto se debfa probablemente a una atenuacion de la espinogenesis promovida por los tratamientos con HGF y Dihexa ya que, sin el efecto antagonizante de Hinge, cada agonista aumentaba las frecuencias de mini-AMPA (figuras 13A-B y figura 10) formando por tanto conexiones sinapticas funcionales. Tomados conjuntamente, estos datos sugieren que la inhibicion de HGF no altera el numero de sinapsis funcionales en neuronas tratadas con vehmulo pero atenua los efectos de HGF y Dihexa sobre la sinaptogenesis disminuyendo el numero de espinas postsinapticas.

Para apoyar adicionalmente la opinion de que los agonistas Dihexa y Nle1-AngIV actuan a traves de HGF y su receptor c-Met, se transfectaron neuronas del hipocampo con ARNhp para inactivar el receptor c-Met. Se verifico la

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inactivacion del receptor mediante inmunotransferencia frente a un producto genico de c-Met etiquetado con Myc (figura 16). Tal como se esperaba, la estimulacion de neuronas del hipocampo transfectadas con mRFP-p-actina con HGF, Dihexa y Nle1-AngIV ha^a potenciado significativamente los arboles dendnticos mientras que las que se transfectaron adicionalmente con ARN de shc-Met no eran diferentes de las neuronas tratadas con control (figura 17). Estos datos proporcionan un apoyo concluyente de la creencia de los inventores de que los ligandos de angiotensina IV Dihexa y Nle1-AngIV actuan a traves del sistema de HGF/c-Met.

Se ha mostrado que el ligando de angiotensina IV recien desarrollado Dihexa facilita la adquisicion de una tarea de aprendizaje espacial y memoria en ratas tratadas con escopolamina (datos no mostrados). Debido a que es prohibitivamente caro someter a prueba HGF en el laberinto de agua, en su lugar se evaluo su implicacion en la cognicion empleando el antagonista de HGF Hinge para bloquear las acciones de Dihexa. El tratamiento con el antagonista del receptor colinergico muscarmico escopolamina hace que las ratas sean amnesicas de manera aguda y por tanto no puedan aprender la tarea. Se observa un efecto de rescate en ratas a las que se les administra Dihexa tras el pretratamiento con escopolamina. Estas ratas presentan una agilizacion rapida de la tarea y no tuvieron un rendimiento diferente de las ratas tratadas con vehnculo. El grupo de ratas que se pretrato con una escopolamina y Hinge no presento el efecto de rescate observado mediante Dihexa en la preparacion de escopolamina (figuras 14A y B). Estos datos demuestran una funcion del sistema de HGF y c-Met en el aprendizaje y la memoria, y que pueden usarse agentes que imitan la accion de HGF para potenciar el aprendizaje y la memoria en sujetos que lo necesitan.

EJEMPLO 3: Desarrollo de analogos de angiotensina IV como modificadores de factor de crecimiento de hepatocitos/Met

La familia de 6-AH [D-Nle-X-Ile-NH-(CH2)5-CONH2; en donde X= diversos aminacidos] de analogos de angiotensina IV se unen directamente a factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) e inhiben la capacidad de HGF para formar dfmeros funcionales. El miembro de la familia de 6-AH estabilizado metabolicamente, D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5- CONH2, tema un ti/2 en sangre de 80 min en comparacion con el compuesto original Norleual (Nle-Tyr-Leu-y-(CH2- NH2)3"4-His-Pro-Phe, SEQ ID NO: 1), que tema un ti/2 en sangre de < 5 min. Se encontro que los miembros de la familia de 6-AH actuaban como mimeticos del dominio de dimerizacion de HGF (region de bisagra), e inhibfan la interaccion de una molecula de HGF con un peptido de 3H-bisagra dando como resultado una capacidad atenuada de HGF para activar su receptor Met. Esta interferencia se tradujo en la inhibicion de la senalizacion, proliferacion y dispersion dependiente de HGF en multiples tipos de celulas a concentraciones por debajo del intervalo picomolar bajo. Tambien se observo una correlacion significativa entre la capacidad de los miembros de la familia de 6-AH para bloquear la dimerizacion de HGF e inhibicion de la actividad celular. Ademas, un miembro de la familia de 6-AH con cistema en la posicion 2 era un antagonista particularmente eficaz de las actividades celulares dependientes de HGF. Este compuesto suprimio la colonizacion pulmonar por celulas de melanoma murino B16-F10, que se caracterizan por un sistema de HGF/Met sobreactivo. Conjuntamente estos datos indican que la familia de 6-AH de analogos de AngIV ejercen su actividad biologica modificando la actividad del sistema de HGF/Met y ofrecen el potencial como agentes terapeuticos en trastornos que dependen de o presentan una sobreactivacion del sistema de HGF/Met.

INTRODUCCION

El factor de crecimiento multifuncional, factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y su receptor Met son importantes mediadores para la mitogenesis, motogenesis y morfogenesis en un amplio intervalo de tipos de celulas (Birchmeier et al., 2003) incluyendo celulas epiteliales (Kakazu et al., 2004), endoteliales (Kanda et al., 2006) y hematopoyeticas (Ratajczak et al., 1997), neuronas (Thompson et al., 2004), melanocitos (Halaban et al., 1992) y hepatocitos (Borowiak et al., 2004). Ademas, la regulacion incorrecta del sistema de HGF/Met conduce a menudo a cambios neoplasicos y a cancer (tanto en seres humanos como animales) en donde contribuye a la formacion de tumores, metastasis tumoral y angiogenesis tumoral (Christensen et al., 2005; Liu et al., 2008). La sobreactivacion de este sistema de senalizacion se vincula de manera rutinaria a un mal pronostico del paciente (Liu et al., 2010). Por tanto puede esperarse que moleculas que inhiben el sistema de HGF/Met presenten actividad anticancengena y atenuen transformaciones metastasicas y malignas.

HGF es un factor de crecimiento polipeptfdico heteromerico de vertebrados con una estructura de dominios que se asemeja estrechamente a las proteinasas de la familia del plasminogeno (Donate et al., 1994). HGF consiste en siete dominios: un dominio amino terminal, un dominio de dimerizacion-ligador, cuatro dominios kringle (K1-K4) y un dominio de homologfa a serina proteinasa (SPH) (Lokker et al., 1992; Chirgadze et al., 1999). El propolipeptido de cadena sencilla se procesa proteoltticamente por convertasas para producir un heterodfmero de a (cadena pesada de 55 KDa) y p (cadena ligera de 34 KDa) maduro, que se unen entre sf por medio de una union disulfuro (Stella y Comoglio, 1999; Birchmeier et al., 2003; Gherardi et al., 2006). Ademas del procesamiento proteolftico, HGF requiere dimerizacion para que se active completamente (Lokker et al., 1992; Chirgadze et al., 1999; Youles et al., 2008). Varios informes han mostrado que el HGF forma dfmeros y/o multimeros, que se disponen en una orientacion de cabeza a cola, antes de su interaccion con Met (Gherardi et al., 2006). La superficie de contacto de los dfmeros, que abarca los aminoacidos de ligador entre dominios (K122, D123, Y124, I125, R126 y N127) se denomina region de bisagra (Gherardi et al., 2006; Youles et al., 2008). Aunque tanto pre-pro-HGF como el heterodfmero unido por

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disulfuros activo se unen a Met con alta afinidad, es solo el heterodfmero el que puede activar Met (Lokker et al., 1992; Shet et al., 2008).

Estudios recientes en el laboratorio (Yamamoto et al., 2010) han mostrado que concentraciones picomolares del analogo de AnglV, Norleual (Nle-Tyr-Leu-y-(CH2-NH2)3"4-His-Pro-Phe), pueden inhibir de manera potente el sistema de HGF/Met y se unen directamente a la region de bisagra de HGF bloqueando su dimerizacion (Kawas et al., 2011). Ademas, un hexapeptido que representa la region de bisagra real presentaba propiedades bioqmmicas y farmacologicas identicas a las de Norleual (Kawas et al., 2011). La principal implicacion de esos estudios era que las moleculas que seleccionan como diana el dominio de dimerizacion de HGF podnan representar opciones terapeuticas anticancengenas novedosas y viables. Ademas, estos datos apoyan el desarrollo de tales moleculas usando el peptido Hinge y/o Norleual como moldes sinteticos.

A pesar de su marcado perfil anticancengeno, Norleual es altamente inestable, lo que hace que su transicion a uso clmico sea problematica. Por tanto, se ha desarrollado en el laboratorio una familia de analogos relacionados con Ang IV metabolicamente estables, que se denominan en este caso familia de 6-AH debido a la amida del acido de 6- aminohexanoico sustituida en la posicion C-terminal. Esta sustitucion, junto con D-norleucina en el extremo N- terminal, potencia la resistencia metabolica de miembros de la familia.

En este ejemplo 3, se demuestra que los miembros de la familia de 6-AH (es decir, mimeticos de HGF) tienen estabilidad metabolica superior en comparacion con Norleual, se unen a HGF con alta afinidad y actuan como mimeticos de region de bisagra; impidiendo por tanto la dimerizacion de HGF y la activacion. Esta interferencia se traduce en la inhibicion de la senalizacion, proliferacion y dispersion dependiente de HGF en multiples tipos de celulas a una concentracion en el intervalo picomolar. Era evidente una correlacion positiva entre la capacidad para bloquear la dimerizacion y la inhibicion de los desenlaces celulares de la activacion de HGF. Finalmente, D-Nle-Cys- Ile-NH-(CH2)5-CONH2, un miembro de la familia de 6-AH, supriirna la colonizacion pulmonar por celulas de melanoma murino B16-F10, que se caracterizan por un sistema de HGF/Met sobreactivo. Este ejemplo resalta la capacidad de moleculas de tipo AnglV para unirse a HGF, bloquear la dimerizacion de HGF e inhibir el sistema de HGF/Met. Ademas, estos mimeticos de HGF tienen utilidad como farmacos relacionados con AnglV y pueden funcionar como agentes terapeuticos en trastornos en los que la inhibicion del sistema de HGF/Met sena clmicamente ventajosa.

MATERIAL Y METODOS

Animales. Se usaron ratones C57BL/6 de granjas Taconic en los estudios de colonizacion de pulmon. Se obtuvieron ratas Sprague-Dawley macho (250+ g) de Harlan Laboratories (CA, EE.UU.) para su uso en estudios farmacocineticos. Se alojaron los animales y se cuidaron segun las directrices de los NIH tal como se describe en la “Gma para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio”.

Compuestos. Se sintetizaron D-Nle-X-Ile-NH-(CH2)5-COOH; en donde X= diversos aminacidos y Norleual (Nle-Tyr- Leu-y-(CH2-NH2)3"4-His-Pro-Phe, SEQ ID NO: 1) usando metodos en fase solida basados en Fmoc en el laboratorio de Harding y se purificaron mediante HPLC de fase inversa. Se verificaron la pureza y estructura mediante CL-EM. Se adquirio factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) de R&D Systems (Minneapolis, MN).

Anticuerpos. Se adquirio anticuerpo anti-Met de Cell Signaling Technology (Beverly, MA) y se adquirio el anticuerpo frente a fosfo-Met de AbCam, Inc (Cambridge, MA).

Cultivo celular. Se hicieron crecer celulas de rinon embrionario humano 293 (HEK293) y celulas de rinon canino Madin Darby (MDCK) en DMEM, suero bobino fetal al 10% (FBS). Se hicieron crecer las celulas hasta el 100% confluencia antes de su uso. Se privaron de suero las celulas HEK y MDCK durante 2-24 h antes del inicio del tratamiento con el farmaco.

Estudios de estabilidad en sangre. Para comparar la estabilidad en sangre de Norleual y D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5- CONH2, un miembro representativo de la familia de 6-AH, se anadieron 20 |il de vehfculo que contema compuesto (agua [Norleual] o etanol al 30% [DNle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2]) a 180 |il de sangre heparinizada y se incubo a 37°C durante diversos tiempos. Para Norleual, se detuvieron las incubaciones a 37°C a 0, 20, 40 y 60 min, y para D- Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2, se detuvieron las incubaciones a 0, 1, 3 y 5 h.

Al final de cada incubacion, se anadieron 20 |il de Nle1-AngIV (100 |ig/ml) a cada muestra como patron interno. Se centrifugaron las muestras de D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 a 4°C durante 5 min a 2300x g para sedimentar los eritrocitos, y se transfirio el plasma a tubos limpios. Se precipitaron las muestras de Norleual y D-Nle-Tyr-Ile-NH- (CH2)5-CONH2 anadiendo 3 volumenes de acetonitrilo enfriado con hielo (ACN) y se agitaron con vortex las muestras vigorosamente. Se centrifugaron todas las muestras a 4°C, 2300x g durante 5 min y se transfirieron los sobrenadantes a tubos limpios. Entonces se evaporaron las muestras hasta sequedad en un concentrador Savant SpeedVac® (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), se reconstituyo el residuo en 225 |il de metanol al 35%, se agito con vortex brevemente, se transfirio a viales de inyector automatico de HPLC y se inyectaron 100 |il en el

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sistema de HPLC.

Entonces se separaron las muestras mediante HPLC en una columna Econosphere C18 (100 mm x 2,1 mm) de Grace Davison Discovery Science (Deerfield, IL). Se detectaron los picos y se analizaron mediante metodos de espectroscopfa de masas usando un espectrometro de masas LCMS-2010EV (Shimadzu, Kyoto, Japon). La fase movil consistia en agua para HPLC (Sigma St. Louis, MO) con acido trifluoroacetico al 0,1% o acido heptafluorobutmco al 0,1% (Sigma St. Louis, MO) y concentraciones variables de ACN o metanol. Se llevo a cabo la separacion usando un metodo en gradiente, a temperatura ambiental y una velocidad de flujo de 0,3 ml/min (vease mas adelante para mas informacion). Se determinaron las semividas de estabilidad suponiendo una descomposicion exponencial de una unica fase usando el programa grafico/estadfstico Prism 5 (GraphPad, San Diego, CA).

IV Farmacocinetica.

Procedimientos quirurgicos. Se les permitio a ratas Sprague-Dawley macho (250+ g) alimento (dietas para roedores de Harlan Teklad) y agua a voluntad en la instalacion para animales certificada AAALAC. Se alojaron las ratas en salas de temperatura controlada con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Se cateterizaron las venas yugulares derechas de las ratas con cateteres Hidrocoat™ de poliuretano esteriles (Access Technologies, Skokie, IL, EE.UU.) bajo anestesia con ketamina (Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA, EE.UU.) e isoflurano (Vet One™, MWI, Meridian, ID, EE.UU.). Se exteriorizaron los cateteres a traves de la piel dorsal. Se lavaron los cateteres con solucion salina heparinizada antes y despues de la recogida de muestras de sangre y se llenaron con disolucion de cierre de heparina-glicerol (6 ml de glicerol, 3 ml de solucion salina, 0,5 ml de gentamicina (100 mg/ml), 0,5 ml de heparina (10.000 u/ml)) cuando no se usaba durante mas de 8 h. Se permitio que los animales se recuperaran de la cirugfa durante varios dfas antes de su uso en cualquier experimento, y se sometieron a ayuno durante la noche antes del experimento farmacocinetico.

Estudio farmacocinetico. Se colocaron ratas cateterizadas en jaulas metabolicas antes del inicio del estudio y se recogieron muestras de sangre a tiempo cero. Entonces se les dosifico a los animales por via intravenosa por medio de los cateteres de las venas yugulares, DNle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 (24 mg/kg) en etanol al 30%. Tras la dosificacion, se recogieron muestras de sangre tal como sigue (los tiempos y los volumenes de sangre recogidos se enumeran en orden cronologico):

Compuesto

Tiempo (min) Volumen de sangre recogido (|il)

D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2

0, 12, 30, 60, 90, 120, 180, 240, 300 200, 200, 200, 200, 200, 300, 400, 500, 500

Tras tomarse cada muestra de sangre, se lavo el cateter con disolucion salina y se inyecto un volumen de solucion salina igual al volumen de sangre extrafdo (para mantener el volumen de sangre total).

Preparacion de muestras de sangre. Tras la recogida en tubos de microcentnfuga de polipropileno sin heparina, se centrifugaron las muestras de sangre inmediatamente a 4°C, 2300x g durante 5 min para eliminar cualquier celula y coagulo y se transfirio el suero a tubos de microcentnfuga limpios. Se anadio un volumen de patron interno (Nle1- AngIV, 100 |ig/ml) igual a 0,1 veces el volumen de suero de la muestra. Entonces se anadio un volumen de acetonitrilo enfriado con hielo igual a cuatro veces el volumen de suero de la muestra y se agito con vortex la muestra vigorosamente durante 30 s. Se transfirieron los sobrenadantes a tubos limpios, se mantuvieron sobre hielo hasta el final del experimento y se almacenaron a 4°C despues hasta su procesamiento adicional.

Se prepararon diluciones en serie de D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 en etanol al 30% a partir de la disolucion madre usada para dosificar a los animales para determinar las curvas patron. Se anadieron 20 |il de cada dilucion en serie a 180 |il de sangre sobre hielo para obtener concentraciones finales de 0,01 |ig/ml, 0,1 |ig/ml, 1 |ig/ml y 10 |ig/ml. Se centrifugaron las muestras a 4°C, 2300x g durante 5 min y se transfirio el suero a tubos de microcentnfuga de polipropileno. Se anadio un volumen de patron interno (Nle1-AngIV, 100 |ig/ml) igual a 0,1 veces el volumen de suero de la muestra. Entonces se anadio un volumen de acetonitrilo enfriado con hielo igual a cuatro veces el volumen de suero de la muestra y se agito con vortex la muestra vigorosamente durante 30 s. Se transfirieron los sobrenadantes a tubos limpios y se almacenaron las muestras a 4°C y se procesaron junto con las muestras del estudio farmacocinetico. Se evaporaron todas las muestras hasta sequedad en un concentrador Savant SpeedVac®. Se reconstituyo el residuo en 225 |il de metanol al 35% y se agito con vortex brevemente. Entonces se transfirieron las muestras a viales de inyector automatico de HPLC y se inyectaron 100 |il en el sistema de HPLC un total de 2 veces (2 analisis de HPLC/EM) para cada muestra.

Sistema cromatografico y condiciones. El sistema de HPLC/EM usado era de Shimadzu (Kyoto, Japon), consistiendo en un modulo de bus de comunicaciones CBM-20A, bombas LC-20AD, inyector automatico SIL-20AC, detector de red de diodos SPD-M20A y espectrometro de masas LCMS-2010EV. Se lograron la recogida e integracion de datos usando software de soluciones de CLEM de Shimadzu. La columna analttica usada fue una Econosphere C18 (100 mm x 2,1 mm) de Grace Davison Discovery Science (Deerfield, IL, EE.UU.). La fase movil consistfa en metanol de calidad para HPLC y agua con acido trifluoroacetico al 0,1%. Se llevo a cabo la separacion usando un metodo no

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isocratico (el 40% - 50% de metanol a lo largo de 10 min) a temperature ambiental y una velocidad de flujo de 0,3 ml/min. Para el analisis de EM, se uso un modo de ion positivo (Scan) para monitorizar la m/z de D-Nle-Tyr-Ile- NH-(CH2)5-CONH2 a 542 y la m/z de Nle1-AngIV (usado para el patron interno) a 395. Se logro satisfactoriamente una buena separacion de D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 y el patron interno en sangre. No eluyeron conjuntamente picos interferentes con el analito o patron interno. El analisis de pureza de pico revelo un mdice de pureza de pico para D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 de 0,95 y el patron interno de 0,94. D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 eluyo a los 5,06 min y el patron interno a los 4,31 min. Se normalizaron los datos basandose en la recuperacion del patron interno.

Analisis farmacocinetico. Se realizo el analisis farmacocinetico usando datos de ratas individuales. Se calcularon la media y desviacion estandar (DE) para el grupo. Se calcularon parametros farmacocineticos no compartimentales a partir de los perfiles de concentracion de farmaco en suero-tiempo mediante el uso del software WinNonlin® (Pharsight, Mountain View, CA, EE.UU.). Se determinaron los siguientes parametros relevantes cuando fue posible: area bajo la curva de concentracion-tiempo desde tiempo cero hasta el ultimo punto de tiempo (AUC0-ultimo) o extrapolada hasta el infinito (AUC0-J, concentracion Cmax. en plasma extrapolada hasta tiempo cero (Co), semivida de eliminacion terminal (ti/2), volumen de distribucion (Vd) y aclaramiento (CL).

Metabolismo microsomico. Se obtuvieron microsomas de hngado de rata macho de Celsis (Baltimore, MD, EE.UU.). Se siguio el protocolo de Celsis para evaluar el metabolismo de farmacos dependiente de microsomas con adaptaciones menores. Se preparo un sistema de regeneracion de NADPH (NRS) tal como sigue: se anadieron NADP 1,7 mg/ml, glucosa-6-fosfato 7,8 mg/ml y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 6 unidades/ml a 10 ml de bicarbonato de sodio al 2% y se uso inmediatamente. Se prepararon en acetonitrilo disoluciones 500 |iM de Norleual, D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2, piroxicam, verapamilo y 7-etoxicumarina (controles con metabolizacion baja, moderada y alta, respectivamente). Se suspendieron los microsomas en tampon Tris 0,1 M (pH 7,38) a 0,5 mg/ml y se anadieron 100 |il de la suspension microsomica a tubos de microcentnfuga preenfriados sobre hielo. A cada muestra, se le anadieron 640 |il de tampon Tris 0,1 M, 10 |il de compuesto de prueba 500 |iM y 250 |il de NRS. Se incubaron las muestras en un horno de hibridacion con funcion de asador a 37°C durante los tiempos de incubacion apropiados (10, 20, 30 40 o 60 min). Se transfirieron 500 |il de cada muestra a tubos que conternan 500 |il de acetonitrilo enfriado con hielo con patron interno por muestra de incubacion. Se prepararon muestras de curva patron en tampon de incubacion y se anadieron 500 |il a 500 |il de acetonitrilo enfriado con hielo con patron interno. Entonces se analizaron todas las muestras mediante cromatograffa de lfquidos de alta resolucion/espectrometna de masas. Se determinaron las concentraciones de farmaco y la perdida de muestra original en relacion con muestras de control negativo que no conternan microsomas. Se determino el aclaramiento mediante analisis de regresion no lineal para ke y t-i/2 y la ecuacion Clint = ke Vd. Para la correlacion in vitro-in vivo, se calculo Clint por kg de peso corporal usando las siguientes mediciones para ratas Sprague-Dawley: 44,8 mg de protema por g de hngado, 40 g de hngado por kg de peso corporal.

Union a HGF. Se evaluo la union de analogos de 6-AH a HGF mediante competencia usando un ensayo de union soluble. Se incubaron 250 |il de PBS que conterna HGF humano (1,25 ng) con 3H-Hinge, el dominio de dimerizacion central de HGF, en presencia de concentraciones variables de analogos de 6-AH entre 10-13 M y 10-7 M (diluciones semilogantmicas) durante 40 min a 37°C. Entonces se centrifugaron los productos incubados a traves de columnas de centrifugacion Bio-Gel P6 (400 |il de volumen empaquetado) durante 1 min para separar 3H-Hinge libre y unido y se recogio el eluyente. Se anadieron cinco mililitros de fluido de centelleo al eluyente, que conterna el 3H-Hinge unido a HGF, y entonces se conto usando un contador de centelleo. Se calcularon las desintegraciones totales por minuto de 3H-Hinge unido basandose en la eficacia de recuento de la maquina. Se determinaron los valores de Ki para la union de los peptidos usando el programa Prism 5. Se realizaron curvas de union de competencia por triplicado. Los estudios cineticos preliminares indicaron que se alcanzo la union en equilibrio a los 40 min de incubacion a 37°C. Se ha mostrado recientemente que 3H-Hinge se une a HGF con alta afinidad (Kawas et al., 2011).

Dimerizacion de HGF. Se evaluo la dimerizacion de HGF usando PAGE seguido por tincion con plata (Kawas et al., 2011). Se incubo HGF humano a una concentracion de 0,08 ng/|il con o sin analogos de 6-AH con heparina a una concentracion final de 5 |ig/ml. Entonces se anadio tampon de carga a cada muestra y se separo la mezcla mediante PAGE nativa usando geles precolados Criterion XT en gradiente (Bis-Tris al 4-12%; Biorad Laboratories, Hercules, CA). A continuacion se tino el gel con plata para la deteccion del monomeros y dfmeros de HGF. Se cuantificaron las bandas a partir de imagenes digitales usando un sistema de deteccion y cuantificacion de la radiactividad UVP (Upland, CA).

Inmunotransferencia de tipo Western. Se sembraron celulas HEK293 en placas de cultivo tisular de 6 pocillos y se hicieron crecer hasta el 95% de confluencia en DMEM que conterna FBS al 10%. Se privaron de suero las celulas durante 24 horas antes del tratamiento para reducir los niveles basales de fosfo-Met. Tras la privacion de suero, se prepararon cocteles compuestos por vehfculo y HGF con/sin analogos de 6-AH y se preincubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Entonces se anadio el coctel a las celulas durante 10 minutos para estimular el receptor Met y protemas posteriores. Se recogieron las celulas usando tampon de lisis RIPA (Upstate) fortalecido con cocteles de inhibidores de fosfatasa 1 y 2 (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO). Se clarifico el lisado mediante

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centrifugacion a 15.000 nx g durante 15 minutes, se determinaron las concentraciones de protema usando el ensayo de protema total BCA (Pierce), y entonces se diluyeron volumenes apropiados de los lisados con tampon Laemmli reductor 2x y se calentaron durante diez minutos a 95° C. Se resolvieron muestras que conteman cantidades identicas de protema usando SDS-PAGE (Criterion, BioRad Laboratories), se transfirieron a nitrocelulosa y se bloquearon en solucion salina tamponada con Tris (TBS) que contema leche al 5% durante una hora a temperatura ambiente. Se anadio el anticuerpo frente a fosfo-Met al tampon de bloqueo a una concentracion final de 1:1000 y se incubo a 4°C durante la noche con agitacion suave. Entonces se lavaron las membranas varias veces con agua y TBS (PBS, Tween-20 al 0,05%), se anadio una dilucion 1:5000 de antisuero de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa del rabano, y se incubaron adicionalmente las membranas durante 1 h a temperatura ambiente. Se visualizaron las protemas usando el sistema de sustrato quimioluminiscente Supersignal West Pico (Pierce, Fenton, MO) y se determinaron los pesos moleculares mediante comparacion con marcadores de peso molecular de protema (BenchMark, Invitrogen; y Kaleidoscope, BioRad). Se digitalizaron las imagenes y se analizaron usando un sistema de deteccion y cuantificacion de la radiactividad UVP.

Proliferacion celular. Se sembraron 5000 celulas MDCK en los pocillos de una placa de 96 pocillos en DMEM con FBS al 10%. Para inducir quiescencia celular, se privaron de suero las celulas durante 24 h antes del inicio del tratamiento. Tras la privacion de suero, se anadio al medio HGF 10 ng/ml solo y con diversas concentraciones de analogos de 6-AH o vehteulo de PBS. Se permitio que las celulas crecieran en estas condiciones durante 4 dfas con una adicion diaria de analogos de 6-AH. En el cuarto dfa, se anadio 1 mg/ml de reactivo de 1-(4,5-dimetiltiazol-2- il)3,5-difenilformazan (MTT, Sigma-Aldrich) preparado en PBS a las celulas y se incubo durante 4 h. Se anadio dimetilsulfoxido diluido en tampon glicina 0,01 M para solubilizar las membranas celulares y se cuantifico la absorbancia de MTT reducido en el tampon a 590 nm usando un lector de placas (Biotek Synergy 2, Winooski, VT). Se determino la proliferacion dependiente de HGF restando la proliferacion basal (en ausencia de HGF) de las tasas de proliferacion total en grupos que contienen HGF.

Ensayo de dispersion. Se hicieron crecer celulas MDCK hasta el 100% de confluencia sobre los cubreobjetos en placas de seis pocillos y se lavaron dos veces con PBS. Entonces se transfirieron de manera aseptica los cubreobjetos confluentes a placas de seis pocillos nuevas que conteman 900 |il de DMEM libre de suero. Se anadieron Norleual, peptido Hinge y/o HGF (20 ng/ml) a pocillos apropiados. Los pocillos de control recibieron vehteulo de PBS. Se incubaron las placas a 37°C con el 5% de CO2 durante 48 horas. Se retiro el medio y se fijaron las celulas con metanol. Se tineron las celulas con Diff-Quik Wright-Giemsa (Dade-Behring, Newark, DE) y se tomaron imagenes digitales. Se retiraron los cubreobjetos con pinzas y se capturaron mas imagenes digitales. Se logro la cuantificacion de pfxeles de las imagenes usando Image J y se realizo el analisis estadfstico usando Prism 5 e InStat v.3.05. (GraphPad; San Diego, CA).

Formacion de colonias en el pulmon. Se les inyectaron a ratones C57BL/6 de seis a ocho meses de edad 400.000 celulas B16-F10 en 200 |il de PBS mediante inyeccion en la vena de la cola y posteriormente recibieron inyecciones intraperitoneales diarias de o bien D-Nle-X-Cys-NH-(CH2)5-CONH2 (10 |ig/kg y 100 |ig/kg) o un control de vehteulo de PBS. Dos semanas despues, se anestesiaron los ratones y se perfundieron los pulmones con PBS y se extirparon. Se tomaron fotograffas y se solubilizaron los pulmones en Triton x-100 al 1%, Tris 20 mM, NaCl 0,15 M, EDTA 2 mM y azida de sodio al 0,02%. Se rompieron las muestras mediante sonicacion (Mixonix, Farmingdale, NY) y se centrifugaron. Se transfirio el sobrenadante a una placa de 96 pocillos y se midio la absorbancia de melanina a 410 nm usando un lector de placas.

Analisis estadfstico. Se uso analisis de la varianza de una via independiente (ANOVA) (InStat v.3.05 y Prism 5) para determinar las diferencias entre grupos. Se realizaron pruebas a posteriori de comparaciones multiples de Tukey- Kramar o Bonferroni cuando fuera necesario. Se determinaron las comparaciones estadfsticas de dos grupos usando la prueba de la t de Student bilateral (InStat v.3.05 y Prism 5).

RESULTADOS

El analogo de AnglV D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 es mas estable metabolicamente que Norleual (Nle-Tyr-Leu-y- (CH2-NH2)3-4-His-Pro-Phe (SEQ ID NO: 1): Se mostro previamente que el peptidomimetico relacionado con AngIV Norleual presentaba actividades anti-HGF/Met, antiangiogenicas y anticancengenas (Yamamoto et al., 2010). La presencia de enlaces peptfdicos no protegidos en las uniones tanto N- como C-terminales predice que Norleual debe tener una mala estabilidad metabolica y un rapido aclaramiento para la circulacion, propiedades que pueden limitar su utilidad clmica. En un intento por superar esta limitacion, se diseno una familia de compuestos, la familia de 6-AH y se sintetizo para ofrecer defensa frente a exopeptidasas. La figura 22 demuestra que tal como se esperaba Norleual es inestable en sangre heparinizada mientras que D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 presentaba una estabilidad mejorada.

El analogo de AngIV D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 tiene una semivida de circulacion mucho mas prolongada que Norleual (Nle-Tyr-Leu-\V-(CH:-NH2)3-4-His-Pro-Phe (SEQ ID NO: 1)):

Tal como se anticipa a partir de los datos de estabilidad en sangre in vitro, D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2

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presentaba una semivida de eliminacion in vivo prolongada de 1012 min tras la inyeccion i.v. en ratas. Otros parametros farmacocineticos relevantes de D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 tras una unica dosis en bolo i.v. se resumen en la tabla 5. Se modelaron los datos en suero usando el software Win-Nonlin® para realizar el analisis no compartimental. D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 pareda distribuirse extensamente fuera del compartimento de sangre central y/o unirse dentro de los tejidos tal como se evidencia por su gran volumen de distribucion (Vd). No se espera que D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 se una sumamente a protemas plasmaticas segun el modelado de relacion de estructura-actividad cuantitativa (QSAR) (comentado mas adelante) y puesto que la recuperacion total a partir del suero era mayor del 35%. Estos resultados, que sugieren que es probable que D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5- CONH2 sea relativamente hidrofobo, estan de acuerdo con el desenlace de las estimaciones del modelado de QSAR generado mediante el programa ADMET Predictor® que calculo un coeficiente de reparto en octanol:agua de 28,18 para D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 (tabla 6).

De manera no sorprendente debido a su estabilidad, caracter hidrofobo y pequeno tamano, se predijo que D-Nle- Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 estaba disponible por via oral. El valor de Pef. representa la permeabilidad en el yeyuno humano eficaz predicha de la molecula. El valor de Pef. predicho para D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 (1,53) es intermedio entre los valores de Pef. para enalapril (1,25) y piroxicam (2,14), dos farmacos biodisponibles por via oral. Tambien se predijo que el 42,68 por ciento de D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 no estaba unido a protemas plasmaticas en circulacion, estando por tanto disponible para su distribucion en los tejidos.

Tambien contribrna a su lenta eliminacion de la sangre la falta de metabolismo de fase I de D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5- CONH2. D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 no presentaba metabolismo detectable a lo largo de 90 min en un ensayo de metabolismo in vitro usando microsomas de dgado de rata (datos no mostrados). Conjuntamente estos datos indican que D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 es mas estable metabolicamente que Norleual, presenta una semivida alargada en la circulacion y penetra en el tejido eficazmente. Globalmente estas propiedades farmacocineticas favorables justifican la evaluacion mecamstica y terapeutica de D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 y moleculas relacionadas.

Los analogos de D-Nle-X-Ile-NH-(CH2)s-CONH2 se unen a HGF y compiten con el peptido 3H-Hinge por la union a HGF:

Se analizaron varios miembros de la familia de 6-AH, D-Nle-X-Ile-NH-(CH2)5-CONH2, para determinar la capacidad para competir por la union de 3H-Hinge a HGF. Tal como resultara evidente a continuacion, los miembros de la familia de 6-AH presentan una capacidad variada para bloquear la accion biologica de HGF. Como tal, se evaluaron las propiedades de union a HGF de una seleccion de analogos con actividad biologica variable para determinar si hada una relacion entre actividad inhibidora y afinidad por HGF. La hipotesis que se formula era que los analogos se unen directamente a HGF y afectan al secuestro de HGF en una forma inactiva. Para comenzar la evaluacion de esta idea, se uso un peptido de H-Hinge como sonda para evaluar la union a HGF directa de los peptidos. El uso de 3H-Hinge para estudiar con sonda la interaccion se basaba en la capacidad de 3H-Hinge para unirse espedficamente y con alta afinidad a HGF (Kawas et al., 2011). Se inicio un estudio de competicion con varios derivados de la familia de D-Nle-X-Ile-NH-(CH2)5-CONH2. Este estudio demostro que diferentes analogos tienen capacidades variables para unirse a HGF, y que los analogos que muestran antagonismos frente a HGF estan actuando como mimeticos de Hinge. Se encontro que derivados de D-Nle-X-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 competfan con Hinge por la union a HGF y presentaban un intervalo de afinidades por HGF, oscilando las Ki entre 1,37x10'7-1,33x10'r° M (figura 23). Tal como se esperaba parece que hay relacion entre la capacidad de un compuesto para unirse a HGF y su capacidad para bloquear la dimerizacion e inhibir actividades dependientes de HGF (veanse las figuras 25, 26, 27).

Analogos de D-Nle-X-Ile-NH-(CH2)s-CONH2 bloquean la dimerizacion de HGF: Varios informes han mostrado que el HGF necesita formar homodfmeros y/o multfmeros, antes de su activacion de Met (Chirgadze et al., 1999; Gherardi et al., 2006). Este dfmero esta dispuesto en una orientacion de cabeza a cola; la superficie de contacto del dfmero comprende una region central, la region de bisagra que es importante para la formacion y orientacion apropiadas del dfmero. Un examen de conservacion de secuencias homologas frente a todos los posibles transcritos que eran independientes de y no se derivaban de angiotensinogeno que buscaba similitudes con AnglV identifico homologfa parcial con la region de bisagra (Yamamoto et al., 2010) de la familia de protemas de plasminogeno, que incluyen el propio plasminogeno, su producto de degradacion antiangiogenico, angiostatina, y las hormonas proteicas factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y protema estimulante de macrofagos (MSP). Ademas, se mostro que el analogo de AnglV Norleual, que es un potente inhibidor del sistema de HGF/Met, se urna a HGF y bloqueaba su dimerizacion (Kawas et al., 2011). Este conocimiento, junto con la demostracion de que algunos miembros de la familia de 6-AH se unen con alta afinidad a la region de bisagra de HGF, condujo a la expectativa de que podna esperarse que otros analogos de AnglV activos, como miembros de la familia de 6-AH, inhibieran la dimerizacion de HGF y que la capacidad de un analogo individual para unirse a HGF e inhibir procesos dependientes de HGF debe reflejarse en su capacidad para atenuar la dimerizacion. Los datos en la figura 24 confirman esta expectativa demostrando que D- Nle-Cys-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 y D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2, que se unen a HGF con alta afinidad (figura 23) y atenuan eficazmente procesos dependientes de HGF (figuras 25, 26, 27), bloquean completamente la formacion de dfmeros de HGF. En cambio D-Nle-Met-Ile-NH-(CH2)5-CONH2, que tienen baja afinidad por HGF (figura 23) y presenta poca actividad anti-HGF/Met, no puede bloquear la dimerizacion a la concentracion sometida a prueba. El analogo de D-Nle-Trp-Ile-NH-(CH2)5-CONH2, que presenta una inhibicion intermedia de la dimerizacion, tiene de

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manera predecible una afinidad moderada por HGF y una capacidad moderada para inhibir procesos dependientes de HGF (figuras 25, 26, 27). Conjuntamente estos datos confirman la expectativa de que analogos de 6-AH activos puedan bloquear la dimerizacion y ademas que el potencial inhibidor de la dimerizacion de un analogo se traduce, al menos cualitativamente, en su capacidad para bloquear procesos dependientes de HGF.

El analogo de D-Nle-X-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 atenua la senalizacion de Met dependiente de HGF:

Tras establecer que los miembros de la familia de 6-AH presentan una gama de perfiles inhibidores de la dimerizacion de y union a HGF, a continuacion se determino si estas propiedades senan paralelas a la capacidad de un compuesto para inhibir la senalizacion de Met. Una caractenstica de receptores de factores de crecimiento unidos a tirosina cinasa como Met es una etapa de autofosforilacion de un residuo de tirosina requerida, que es esencial para el reclutamiento final de diversas protemas de senalizacion con dominio SH2. Por tanto se evaluo la capacidad de varios analogos de 6-AH para inducir la fosforilacion de tirosina de Met. Tal como se anticipo, los datos en la figura 25 demuestran que tanto D-Nle-Cys-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 como D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2, que se unen a HGF con alta afinidad (figura 23) y bloquean eficazmente su dimerizacion (figura 24) podfan bloquear la autofosforilacion de Met. El analogo de D-Nle-Trp-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 tema actividad inhibidora intermedia, y el analogo de D-Nle-Met-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 no mostro capacidad para afectar a la activacion de Met. Conjuntamente, estos datos indican que la capacidad de analogos de 6-AH para inhibir la activacion de Met dependiente de HGF era paralela a su afinidad de union a HGF y su capacidad para bloquear la dimerizacion.

Analogos de D-Nle-X-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 afectan a la proliferacion de celulas MDCK estimulada por HGF/Met:

La activacion de Met inicia multiples respuestas celulares incluyendo aumento de la proliferacion y motilidad, supervivencia potenciada y diferenciacion (Zhang y Vande Woude, 2003). Como prueba inicial de la capacidad de miembros de la familia de 6-AH para alterar la actividad celular dependiente de HGF, se evaluo la capacidad de varios miembros de la familia para modificar la actividad proliferativa de celulas de rinon canino Madin-Darby (MDCK), un modelo celular convencional para investigar el sistema de HGF/Met (Stella y Comoglio, 1999). Tal como se observa en la figura 26, hay un amplio intervalo de actividad inhibidora frente a la proliferacion celular dependiente de HGF. De manera similar a los resultados de los experimentos de union y dimerizacion, los analogos de Cys2 y Tyr2 presentaban una marcada actividad inhibidora. El analogo de Asp2, que no se habfa evaluado en los estudios anteriores, tambien presentaba una actividad inhibidora pronunciada. Los analogos de Trp2, Phe2 y Ser2 tambien mostraban actividad inhibidora, aunque menos que la observada con los analogos mas potentes. La disminucion en la proliferacion de MDCK dependiente de HGF por debajo de los niveles de control para algunos compuestos no es sorprendente puesto que el experimento se llevo a cabo en el 2% de suero, que probablemente contiene algun nivel de HGF. El peptido Hinge (KDYIRN), que representa el dominio de dimerizacion de HGF, se incluyo como control positivo. Un estudio reciente ha demostrado que Hinge se une a HGF con alta afinidad bloqueando su dimerizacion y actuando como un potente inhibidor de las actividades celulares dependientes de HGF incluyendo proliferacion de MDCK (Kawas et al., 2011).

Analogos de D-Nle-X-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 modifican la dispersion celular mediada por HGF/Met en celulas MDCK:

La dispersion celular es el efecto distintivo de la senalizacion de HGF/Met; un proceso caracterizado por disminucion de la adhesion celular, aumento de la motilidad y aumento de la proliferacion. El tratamiento de celulas MDCK con HGF inicia una respuesta de dispersion que se produce en dos fases. En primer lugar, las celulas pierden su adhesion celula a celula y se polarizan. En segundo lugar, se separan completamente y migran lejos unas de otras. Se espera que si los miembros de la familia de 6-AH pueden inhibir el sistema de HGF/Met, entonces deben poder modificar la dispersion de celulas MDCK dependiente de HGF.

Las figuras 27 A y B indican que los analogos que se encontraron anteriormente que bloquean la dimerizacion de HGF eran inhibidores eficaces de la dispersion celular mediada por HGF/Met en celulas MDCK, mientras que los analogos con escasa afinidad por HGF eran ineficaces. La figura 28 muestra una correlacion entre el bloqueo de la dimerizacion de HGF y la afinidad de union a HGF y la capacidad para impedir la dispersion de celulas MDCk.

D-Nle-Cys-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 inhibe la migracion de celulas de melanoma murino B16-F10 y la formacion de colonias en el pulmon:

Para evaluar la utilidad prospectiva de los miembros de la familia de 6-AH' como opciones terapeuticas potenciales, se examino la capacidad de [D-Nle-Cys-Ile-NH-(CH2)5-CONH2], un analogo que presenta un fuerte perfil inhibidor frente a la activacion de Met dependiente de HGF, para suprimir la capacidad migratoria y de formacion de colonias en el pulmon de celulas de melanoma murino B16-F10. Las celulas de melanoma B16 sobreexpresan Met (Ferraro et al., 2006), y se eligieron para estos estudios porque la senalizacion de Met es cntica para su migracion, invasion y metastasis. Como prueba final para la significacion fisiologica del bloqueo por la familia de 6-AH de los desenlaces celulares dependientes de Met, se evaluo la capacidad de D-Nle-Cys-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 para inhibir la formacion de colonias pulmonares por celulas B16-F10 tras inyeccion en la vena de la cola en ratones. La figura 29a ilustra la respuesta inhibidora que se observo con inyecciones intraperitoneales diarias a dos dosis (10 |ig/kg/dfa y 100 |ig/kg/dfa) de [D-Nle-Cys-Ile-NH-(CH2)5-CONH2]. La figura 29b proporciona una evaluacion cuantitativa de la

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colonizacion pulmonar midiendo el contenido en melanina, lo que refleja el nivel de colonizacion por melanoma. Conjuntamente estos datos demuestran que el tratamiento de celulas de melanoma con D-Nle-Cys-Ile-NH-(CH2)5- C0NH2 previno radicalmente la colonizacion del pulmon y resaltan la utilidad de los analogos de 6-Ah como agentes anticancengenos.

DISCUSION:

Recientemente ha crecido el interes en el desarrollo de opciones terapeuticas que seleccionan como diana el sistema de HGF/Met. En la actualidad este interes ha estado dirigido principalmente por la constatacion de que la sobreactivacion del sistema HGF/c-Met es una caractenstica comun de muchos canceres humanos (Comoglio et al., 2008; Eder et al., 2009). Sin embargo, la utilidad potencial de farmacos anti-HGF/Met, va mas alla de su uso como agentes anticancengenos. Por ejemplo, la implicacion reconocida del sistema de HGF/c-Met en la regulacion de la angiogenesis (vease la revision) apoya la utilidad potencial de antagonistas de HGF/Met para el tratamiento de trastornos en los que el control de la vascularizacion tisular sena clmicamente beneficiosa. Estos podnan incluir enfermedades hipervasculares del ojo como retinopatfa diabetica y el tipo humedo de degeneracion macular. En ambos casos estan actualmente en uso terapias antiangiogenicas (vease la revision- Jeganathan, 2011). Tambien estan examinandose compuestos antiangiogenicos como opciones de tratamiento en una variedad de otros trastornos que van desde la obesidad en donde se selecciona como diana la vascularizacion del tejido adiposo (Daquinag et al., 2011), hasta enfermedad hepatica cronica (Coulon et al., 2011), psoriasis en donde esta considerandose la aplicacion topica de farmacos antiangiogenicos (Canavese et al., 2010).

Actualmente la industria farmaceutica esta empleando dos enfoques generales para bloquear las actividades celulares dependientes de Met (Eder et al., 2009; Liu X et al 2010). La primera implica el desarrollo de anticuerpos humanizados de un solo brazo frente a HGF (Burgess et al., 2006; Stabile et al., 2008) o Met (Martens et al., 2006). El segundo enfoque utiliza “inhibidores de cinasa”, que bloquean las consecuencias intracelulares de la activacion de Met. Estos “inhibidores de cinasa” son moleculas hidrofobas pequenas que funcionan intracelularmente compitiendo por la union de ATP al dominio cinasa de Met inhibiendo asf la autofosforilacion del receptor., 2002; Christensen et al., 2003; Sattler et al., 2003). A pesar de la promesa de los enfoques biologico y de inhibidores de cinasa, que estan representados actualmente en ensayos clmicos, ambos tienen limitaciones que surgen de consideraciones de toxicidad o especificidad y/o coste (Hansel et al., 2010; Maya, 2010).

Un tercer enfoque, que el laboratorio de los presentes inventores esta siguiendo, aprovecha una etapa en el proceso de activacion del sistema de HGF-Met; concretamente la necesidad de que se dimerice HGF antes de que pueda activar Met. Por tanto se ha seleccionado como diana el proceso de dimerizacion desarrollando moleculas que imitan el dominio de dimerizacion, la region de bisagra, con la idea de que puedan actuar como reemplazos dominantes negativos. Estudios recientes han validado este enfoque general demostrando que las moleculas disenadas alrededor de angiotensina IV (Yamamoto et al, 2010) o la propia secuencia de bisagra (Kawas et al., 2011) pueden unirse a HGF, bloquear su dimerizacion y atenuar las acciones celulares dependientes de HGF. Los estudios descritos en el presente documento representan una primera etapa hacia la produccion de opciones terapeuticas utiles dirigidas a la dimerizacion de HGF. El enfoque primario de este estudio era mejorar las caractensticas farmacocineticas de un compuesto original, Norleual (Yamamoto et al., 2010) al tiempo que se mantema la actividad biologica. Para este fin se sintetizo y evaluo satisfactoriamente una familia de nuevas moleculas, la familia de 6-AH [D-Nle-X-Ile-NH-(CH2)5-COOH]. Un subconjunto de estas moleculas no solo habfa mejorado la estabilidad metabolica y el t-i/2 circulante sino que presentaba una actividad in vitro e in vivo excelente.

Ademas de caracterizar una nueva familia de antagonistas de HGF/Met, este ejemplo demuestra una relacion cualitativa entre la capacidad de un compuesto para unirse a HGF y bloquear la dimerizacion de HGF y su actividad biologica in vitro. Ademas estos estudios proporcionan datos de estructura-actividad iniciales y allanan el camino para una evaluacion mas extensa. Las modificaciones qmmicas que se hicieron en los extremos N- y C-terminales de la molecula de AnglV y la mejora resultante en la estabilidad metabolica resaltan el papel cntico desempenado por las exopeptidasas en el metabolismo de moleculas derivadas de AngIV. La importancia demostrada de la proteccion de los extremos terminales para las caractensticas farmacocineticas sugiere numerosos enfoques de smtesis adicionales que pueden aplicarse incluyendo la insercion de uniones no peptfdicas (vease Sardinia et al., 1994) entre los aminoacidos primero y segundo, el reemplazo del aminoacido N-terminal con un aminoacido no a y acilacion N-terminal.

En resumen, estos estudios validan adicionalmente la nocion de que la seleccion como diana del dominio de dimerizacion de HGF es un medio eficaz de inhibicion del sistema de HGF/Met. Ademas demuestran que pueden producirse moleculas con caractensticas farmacocineticas favorables resaltando por tanto su utilidad clmica.

Tabla 5. Parametros farmacocineticos estimados con WinNonlin® para D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 tras la administracion intravenosa en ratas Sprague-Dawley macho adultas. Media +/- EEM; n = 5. AUCq.„ = area bajo la curva. Vd = volumen de distribucion. CpQ = concentracion inicial de farmaco en suero. t-i/2 = semivida biologica. Ke = velocidad de eliminacion. CL = velocidad de aclaramiento.

Parametro farmacocinetico D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 (media ± EEM)

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AUC0_„ (min.ng/ml)

692 ± 293,2

Vd (L/kg)

104186,8 ± 65034,3

Cp0 (ng/ml)

68,2 ± 32,2

t1/2 (min)

1012,0 ± 391,4

KE (min-1)

0,001 ± 0,0002

CL (L/min/kg)

58,3 ± 15,6

Tabla 6. Propiedades fisicoqmmicas predichas de D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2. Se estimaron las propiedades fisicoqmmicas de D-Nle-Tyr-Ile-NH-(CH2)5-CONH2 tras el modelado con el software ADMET Predictor®. LogP es el coeficiente de reparto en octanol:agua. Pef. es la permeabilidad en yeyuno humano eficaz predicha. Pprom es la permeabilidad intestinal promedio aproximada a lo largo de todo el tracto intestinal humano. Prno uni. Es el porcentaje no unido a protemas plasmaticas.

Propiedad fisicoqmmica

Valor predicho

logP

1,45

Pef.

1,53

P prom

0,39

Prno uni.

42,68

Aunque la invencion se ha descrito en cuanto a sus realizaciones preferidas, los expertos en la tecnica reconoceran que la invencion puede ponerse en practica con modificacion.

Por consiguiente, la presente invencion no debe limitarse a las realizaciones descritas anteriormente.

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Lista de secuencias

<110> Washington State University Research Foundation

<120> MIMETICOS DE FACTOR DE CRECIMIENTO DE HEPATOCITOS COMO AGENTES TERAPEUTICOS

<130> 03170033ta

<150> Documento US61/471.122 <151>

<150> Documento US61/471.124 <151>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211>6 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Ligando de angiotensina sintetico <220>

<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1)

<223> Norleucina

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (3)..(4)

<223> Un enlace peptidico reducido (-CH2-NH2-)

<400> 1

Xaa Tyr Leu His Pro Phe 1 5

<210> 2 <211> 22 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Oligonucleotido sintetico <400> 2

gtgtcaggag gtgtttggaa ag 22

<210> 3 <211>6 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Peptido de bisagra sintetico 5

<400>3

Asp Tyr lie Arg Asn Cys 1 5

Claims (12)

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5.

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7.

45 8.

9. 50

10.

55 11.

REIVINDICACIONES

Mimetico de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) que tiene la formula general:

imagen1

en la que

R1 es uno de un grupo N-acilo, y un aminoacido, seleccionandose dicho aminoacido del grupo que consiste en tirosina, fenilalanina, acido aspartico, arginina, isoleucina, serina, histidina, glicina, cistema, metionina, triptofano, lisina, norvalina, ornitina y s-bencilcistema;

R2 es un aminoacido seleccionado del grupo seleccionado del grupo que consiste en tirosina, fenilalanina, acido aspartico, arginina, isoleucina, serina, histidina, glicina, cistema, metionina, triptofano, lisina y valina;

R3 es isoleucina; y

n oscila entre 3-6;

y en la que los enlaces covalentes 1,2 y 3 se seleccionan del grupo que consiste en enlaces peptidicos o enlaces peptidicos reducidos.

Mimetico de HGF segun la reivindicacion 1, en el que R1 es i) un grupo N-acilo grupo y se selecciona del grupo que consiste en hexanoflo, heptanoflo, pentanoflo, butanoflo, propanoflo, acetanoflo y benzoflo, o ii) un aminoacido seleccionado de tirosina, fenilalanina, acido aspartico, arginina, isoleucina, serina, histidina, glicina, cistema, metionina, triptofano, lisina, norvalina, ornitina y s-bencilcistema.

Mimetico de HGF segun la reivindicacion 1, en el que R2 es tirosina.

Mimetico de HGF segun la reivindicacion 1, en el que dicho mimetico de HGF es acido hexanoico-tirosina- isoleucina-amida del acido (6)-amino-hexanoico.

Composicion, que comprende:

al menos un mimetico de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un portador, estando dicho mimetico de HGF disuelto o distribuido en dicho portador.

Composicion segun la reivindicacion 5, que comprende ademas al menos otro agente bioactivo diferente de dicho al menos un mimetico de HGF.

Composicion segun la reivindicacion 6, en la que dicho al menos otro agente bioactivo se selecciona del grupo que consiste en antidepresivos, farmacos psicoactivos y analgesicos.

Uno o mas mimeticos de factor de crecimiento de hepatocitos segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su uso en el tratamiento o la prevencion de la disfuncion cognitiva en un sujeto que lo necesita.

Uno o mas mimeticos de factor de crecimiento de hepatocitos para su uso segun la reivindicacion 8,

adaptados para administracion realizada multiples veces a lo largo de un periodo de tiempo.

Uno o mas mimeticos de factor de crecimiento de hepatocitos para su uso segun la reivindicacion 9,

mediante lo cual la cantidad de dicho mimetico de HGF administrado se ajusta basandose en resultados de

prueba obtenidos sometiendo a prueba la cognicion de dicho sujeto durante dicho periodo de tiempo.

Uno o mas mimeticos de factor de crecimiento de hepatocitos para su uso segun la reivindicacion 8, en los que dicho mimetico de HGF es acido hexanoico-tirosina-isoleucina-amida del acido (6)-amino-hexanoico.

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12. Mimetico de HGF segun la reivindicacion 1 para uso medico en la expansion de la conectividad sinaptica y/o produccion de reemplazo neuronal en un sujeto que lo necesita.

13. Mimetico de HGF para su uso segun la reivindicacion 12 adaptado para administracion realizada despues de que dicho sujeto haya padecido traumatismo de la medula espinal.

14. Mimetico de HGF segun la reivindicacion 1 para su uso en i) el tratamiento de demencia en un sujeto que lo necesita, ii) para su uso en la produccion de neuroproteccion o induccion de neuroregeneracion en un sujeto que lo necesita, iii) para su uso en el tratamiento de cancer en un sujeto que lo necesita, iv) para su uso en el tratamiento de diabetes en un sujeto que lo necesita, v) para su uso en el tratamiento de enfermedad fibrotica incluyendo fibrosis cardiaca, pulmonar, renal y hepatica en un sujeto que lo necesita, vi) para su uso en el tratamiento de insuficiencia vascular incluyendo trombosis venosa profunda y oclusion de arterias coronarias en un sujeto que lo necesita, vii) para su uso en la facilitacion de la cicatrizacion de heridas en un sujeto que lo necesita, o viii) para su uso en el retardo o la reversion o de la hipervascularizacion del ojo en enfermedades incluyendo retinopatfa diabetica y degeneracion macular en un sujeto que lo necesita.

15. Uso de un mimetico de HGF segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para mejorar la funcion cognitiva en individuos con capacidades cognitivas normales de los mismos.