ES2891174T3 - Péptidos que bloquean el reclutamiento de leucocitos y su uso terapéutico - Google Patents

Abstract

Un péptido aislado que reduce el reclutamiento de leucocitos seleccionados de (i) un péptido aislado que comprende la SEQ ID NO: 1, (ii) el péptido aislado de (i), en el que el péptido se modifica mediante pegilación, acetilación, glicosilación, biotinilación, o sustitución de uno o más L-aminoácidos con el mismo tipo de D-aminoácidos, y (iii) el péptido aislado de (i), en el que el péptido comprende uno o más residuos de aminoácidos modificados o análogos de aminoácidos, en el que los residuos de aminoácidos modificados se modifican mediante metilación, amidación, o acetilación, y en el que los análogos de aminoácidos se seleccionan entre β-alanina, norvalina, norleucina, ácido 4-aminobutírico, ornitina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, ácido cisteico, ciclohexilalanina, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 6- aminohexanoico, t-butilglicina, fenilglicina, o-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, y 3-metilhistidina.

Description

DESCRIPCIÓN

Péptidos que bloquean el reclutamiento de leucocitos y su uso terapéutico

Campo de la invención

La presente invención está definida por las reivindicaciones. Generalmente, en el presente documento se describen péptidos capaces de bloquear el reclutamiento de leucocitos y usos de los mismos para inhibir la metástasis tumoral y para tratar la sepsis en un paciente. Más específicamente, en el presente documento se describen usos de dichos péptidos para inhibir la metástasis tumoral en el hígado y el pulmón.

Antecedentes de la invención

UNIPORT K2G6K2 describe un péptido que se ha identificado en el agua subterránea y que comparte una subsecuencia de aminoácidos de siete aminoácidos con el péptido de SEQ ID NO: 1 de la presente divulgación. En Mummert et al. (2000), The Journal of Experimental Medicine, 192(6):769-779, el péptido GAHWQFNALTVR se identifica en una biblioteca de péptidos de fagos. El péptido previene el reclutamiento de leucocitos en contacto con respuestas de hipersensibilidad.

Los tumores tienen la capacidad de diseminarse a muchas partes diferentes del cuerpo, pero colonizarán preferentemente un conjunto específico de órganos y tejidos (Paget S (1989) Cancer Metastasis Rev 8(2):98-101), una observación que tiene muchos ejemplos clínicos (Chiang AC & Massague J (2008) N Engl J Med 359(26):2814-2823; Nguyen DX, et al. (2009) Nat Rev Cancer 9(4):274-284). Por ejemplo, el 50% de los pacientes con melanoma uveal desarrollan metástasis hepáticas entre 10 y 15 años después del diagnóstico inicial (Bakalian S, et al. (2008) Clin Cancer Res 14(4):951-956; Sato T (2010) Semin Oncol 37(2):127-138). El cáncer de mama tiene la propensión a hacer metástasis en los huesos, pulmones, hígado y cerebro (Chiang AC & Massague J (2008) N Engl J Med 359(26):2814-2823; Nguyen DX, et al. (2009) Nat Rev Cancer 9(4):274-284), las metástasis del cáncer de próstata casi exclusivamente en el hueso (Scharffetter-Kochanek K, et al. (1998) J Exp Med 188(1):119-131), el cáncer colorrectal y de páncreas tienden a hacer metástasis al hígado (Hess KR, et al. (2006) Cancer 106(7):1624-1633; Jones S, et al. (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105(11):4283-4288) mientras que el sarcoma de tejido blando se propaga predominantemente al pulmón (Roberge D et al. (2010) Curr Oncol 17(6):18-22). En conjunto, estos estudios destacan la necesidad real de un tratamiento locorregional de cánceres específicos, una necesidad que requiere la consideración de las células tumorales y el microambiente del huésped dentro de un órgano específico. Estas observaciones refuerzan la hipótesis original del Dr. Paget que ciertos tumores (las "semillas") tienen una afinidad específica por órganos particulares ("suelo") y la compatibilidad entre la "semilla" y el "suelo" determina el destino final de las células tumorales en ese sitio. Esta premisa puede ampliarse para incorporar la idea de que el destino final de la "semilla" requiere que las células infiltrantes del sistema inmune adaptativo e innato determinen si la colonización de células tumorales de sitios de órganos específicos tendrá éxito o fracasará.

Hay distintas etapas secuenciales del proceso metastásico: 1) las células tumorales escapan de la masa del tumor primario y entran a la circulación ya sea por el sistema linfático o la vasculatura sanguínea, 2) la supervivencia de la célula cancerosa dentro de la circulación, 3) la detención inicial dentro del vasculatura, 4) extravasación, 5) establecimiento de una micrometástasis que implica la contribución de las células huésped dentro del microambiente y 6) crecimiento adicional en macrometástasis, lo que requiere la adaptación del microambiente del tejido extraño.

Utilizando una combinación de selección in vivo, enfoques genéticos y farmacológicos, se han identificado variantes de cáncer de mama, páncreas y colorrectal que tienen una alta propensión a hacer metástasis en el hígado ((Du YC, et al. (2011) Proc Natl Acad Sci USA 108(40):16753-16758; Bemmo A, ct al. (2010) PLoS One 5(8):e11981; Tabaries S, et al. (2011) Oncogene 30(11):1318-1328; Tabaries S, et (2012) Mol Cell Biol.; Kang Y, et al. (2003) Cancer Cell 3(6):537-549). Estas variantes demuestran firmas de expresión génica únicas y una selectividad de órganos diana más específica que las células tumorales parentales (Minn AJ, et al. (2005) Nature 436(7050):518-524; Bos PD, et al. (2009) Nature 459(7249):1005-1009; Landemaine T, et al. (2008) Cancer Res 68(15):6092-6099; Minn AJ, et al. (2005) J Clin Invest 115 (1): 44-55; Zhang XH, et al. (2009) Cancer Cell 16(1):67-78; Massague J (2007) N Engl J Med 356(3):294-297). Estas características específicas de los órganos, junto con la observación de que la vasculatura de cada órgano tiene direcciones de superficie celular únicas o "códigos postales" (Ruoslahti E (2004) Biochem Soc Trans 32(Pt3):397-402; Teesalu T, y col. (2012) Methods Enzymol 503:35-56) plantean la intrigante posibilidad de que las células cancerosas puedan "coincidir" con su entorno metastásico basándose en mecanismos de reclutamiento específicos.

Por lo tanto, lo que se necesitan son composiciones capaces de bloquear la unión de las células tumorales en la sangre a los órganos diana metastásicos que irrigan los vasos, como el hígado y los pulmones, para prevenir o inhibir la metástasis tumoral a estos órganos. También se necesitan composiciones eficaces para tratar otras enfermedades asociadas con el reclutamiento de leucocitos, incluida la sepsis, como la sepsis bacteriana.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere en un primer aspecto a un péptido aislado que reduce el reclutamiento de leucocitos, seleccionado entre

(i) un péptido aislado que comprende la SEQ ID NO: 1,

(ii) el péptido aislado de (i), en el que el péptido se modifica mediante pegilación, acetilación, glicosilación, biotinilación o sustitución de uno o más L-aminoácidos con el mismo tipo de D-aminoácidos, y

(iii) el péptido aislado de (i), en el que el péptido comprende uno o más residuos de aminoácidos modificados o análogos de aminoácidos, en el que los residuos de aminoácidos modificados se modifican mediante metilación, amidación o acetilación, y

donde los análogos de aminoácidos se seleccionan entre p-alanina norvalina, norleucina, ácido 4-aminobutírico, ornitina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, ácido cisteico, ciclohexilalanina, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 6-aminohexanoico, t-butilglicina, fenilglicina, o-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina y 3-metilhistidina.

De acuerdo con una forma de realización preferida, el péptido aislado de la invención comprende además 1, 2, 3, 4 o 5 residuos de aminoácidos en el extremo N-terminal y/o C-terminal de la secuencia LSALTPSPSWLKYKAL, donde dichos residuos de aminoácidos comprenden opcionalmente uno o más residuos de aminoácidos modificados o análogos de aminoácidos, en donde los residuos de aminoácidos modificados se modifican mediante metilación, amidación o acetilación, y los análogos de aminoácidos se seleccionan entre p-alanina, norvalina, norleucina, ácido 4-aminobutírico, ornitina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, ácido cisteico, ciclohexilalanina, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 6-aminohexanoico, t-butilglicina, fenilglicina, o-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina y 3-metilhistidina.

De acuerdo con una forma de realización preferida, el péptido aislado de la invención está en comunicación con un virus de fago.

La presente invención se refiere en un segundo aspecto a una composición farmacéutica que comprende un péptido aislado de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con una composición farmacéutica de la invención de una forma de realización preferida, el vehículo se selecciona de agua, solución salina, solución salina regulada con fosfato, solución de Ringer, solución de dextrosa, soluciones que contienen suero, solución de Hank, aceites, ésteres y glicoles.

De acuerdo con otra forma de realización preferida, la composición farmacéutica es adecuada para administración parenteral o intravenosa.

La presente invención se refiere en un tercer aspecto al péptido aislado de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad mediada por el reclutamiento de leucocitos mediante la reducción del reclutamiento de leucocitos.

De acuerdo con una forma de realización preferida del péptido aislado para uso de la invención, el péptido aislado o una variante del mismo debe administrarse a una dosis que está entre 0.01 mg/kg y 100 mg/kg.

De acuerdo con otra forma de realización preferida del péptido aislado para uso de la invención, la enfermedad mediada por reclutamiento de leucocitos es metástasis tumoral.

De acuerdo con una forma de realización preferida adicional, el péptido aislado para uso de la invención, el péptido aislado reduce o inhibe la metástasis tumoral en comparación con la metástasis tumoral en ausencia de tratamiento.

De acuerdo con otra forma de realización preferida más, el péptido aislado para uso de la invención, la enfermedad mediada por el reclutamiento de leucocitos es la sepsis, y la sepsis está causada preferiblemente por una infección bacteriana, viral, fúngica o parasitaria.

Estos y otros objetos y características se harán más plenamente evidentes cuando se lea la siguiente descripción detallada junto con los dibujos adjuntos.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un dibujo esquemático que ilustra la generación de una biblioteca de presentación de fagos T7 específicos de neutrófilos, y la selección y aislamiento in vivo de péptidos que se dirigen al hígado y al pulmón;

Las figuras 2A y 2B son gráficos de la distribución de una biblioteca de fagos T7Li al hígado y otros órganos después de 4 rondas de selección in vivo (2A); y la distribución de una biblioteca de fagos T7Lu a los pulmones y otros tejidos después de tres rondas de selección in vivo (2B);

Las figuras 3A y 3B son gráficos de barras que muestran la orientación de grupos de subclones de presentación de fagos específicos del hígado y no seleccionados hacia el hígado (3A) y la orientación de subclones de T7NLi, T7Nlu y 2-2/2-3 de fagos hacia hígado, pulmón y tejido de riñón (3B);

Las figuras 4A y 4B son gráficos de la cantidad de fagos capturados en hígado, pulmones y riñones en ratones normales y TLR4 (-/-) con y sin pretratamiento con LPS (4A) y en ratones normales y knockout (inactivados) para MyD88 (4B);

Las figuras 5A y 5B son gráficos de recuentos de neutrófilos circulantes medidos en ratones C57 no tratados o tratados con el fago de biblioteca T7NLi o T7NLu (5A) y flujo rodante de leucocitos con ratones C57 en las mismas condiciones de tratamiento (5B);

Las figuras 6A y 6B son gráficos de adhesión en Vénulas Post Sinusoidales (6A) y % de perfusión en ratones C57 no tratados o tratados con el fago de biblioteca T7NLi o T7NLu;

La figura 7 muestra el efecto de las bibliotecas T7NLi y T7NLu sobre el reclutamiento de leucocitos en pulmones, medido por la mieloperoxidasa leucocitaria;

La figura 8 compara la capacidad de tres grupos de fagos, T7N Pulmón de Pulmón, T7N Pulmón de Hígado y Lu-1 (poliA) para bloquear la adhesión de neutrófilos en el hígado de ratón;

La figura 9 compara la adhesión de neutrófilos en sinusoides de hígado de ratón después de la administración de fago Poly A, fago Ube2n (LSALT) y LPS solamente;

La figura 10a y 10b representan cómo LSALT inhibe la metástasis tumoral, según un primer modelo;

Las figuras 11a y 11b representan cómo LSALT inhibe la metástasis tumoral, según un segundo modelo;

La figura 12 muestra datos de un estudio en el que se realizó una inyección intraesplénica de células de cáncer de mama de murino 4T1 en presencia o ausencia del fago de control del fago que expresa LSALT, y se evaluó el número de metástasis de tumor mamario superficial en el hígado 4 semanas después de la inyección;

Las figuras 13A-13F muestran la carga tumoral en tejido pulmonar de ratones inyectados a través de la vena de la cola con 1 x 106 células de melanoma humano 70W que expresan luciferasa, con o sin inyección previa de péptido LSALT de 50 |jM o 500 |jM (13A-13C) e imágenes representativas de pulmones con módulos pulmonares melanóticos visibles en ratones inyectados a través de la vena de la cola con 1 x 106 células de melanoma humano 70W que expresan luciferasa, con o sin inyección previa de ratones con péptido LSALT de 50 j M o 500 j M (13D-13F).

Las figuras 14A-14D muestran imágenes Xcnogcn de pulmones de ratones inyectados a través de la vena de la cola con células de melanoma humano que expresan luciferasa con (14B) y sin (14A) pretratamiento con LSALT; e imágenes de xenógeno de pulmones de ratones inyectados tratados como se describe para las Figs. 13A y 13B, y en presencia (14D) y ausencia (14C) de depleción de neutrófilos usando anticuerpo anti-Ly6G/GRI.

Las figuras 15A y 15B muestran los efectos del péptido LSALT sobre la reducción del número de lesiones metastásicas en el pulmón de ratón después de la inyección de 5 x 105 células de osteosarcoma humano 143B, que expresan de manera estable luciferasa, en la vena de la cola de los animales. Las secciones histológicas representativas (15A) muestran una reducción de las lesiones metastásicas. De manera similar, la cuantificación del número de lesiones metastásicas para todos los lóbulos de los pulmones derecho e izquierdo en cinco secciones histológicas no secuenciales se muestra gráficamente en 15B.

Las figuras 16A y 16B muestran los efectos del péptido LSALT sobre la reducción de la carga metastásica en el hígado de ratón después de la inyección de 5x105 células de osteosarcoma humano 143B, que expresan de manera estable luciferasa, en la vena de la cola de los animales. Las imágenes de bioluminiscencia representativas de animales 3 semanas después de la inyección (16A) muestran una reducción de la bioluminiscencia. La cuantificación de la actividad de luciferasa para mostrar la carga metastásica en estos animales se muestra gráficamente en la figura 16B.

Las figuras 17A y 17B muestran los efectos del péptido LSALT en un modelo de ratón de sepsis. La adhesión de neutrófilos en sinusoides se evaluó en presencia de bacteriófago/LPS de control, bacteriófago/LPS LSALT y LPS solamente (Figura 17A). La inyección con bacteriófago LSALT tuvo un efecto protector sobre la inflamación aguda inducida por LPS (en 4 de 5 ratones) (Figura 17B).

Descripción detallada

Definiciones

Como se usa en el presente documento, el término "aminoácido", en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que pueda incorporarse en una cadena polipeptídica. El término "aminoácido" también se usa indistintamente con "residuo de aminoácido" y puede referirse a un aminoácido libre y/o un residuo de aminoácido de un péptido. Resultará evidente a partir del contexto en el que se usa el término si se refiere a un aminoácido libre o un residuo de un péptido.

Como se usa en el presente documento, "aminoácido estándar" se refiere a cualquiera de los veinte aminoácidos estándar que se encuentran comúnmente en péptidos naturales, incluidos los aminoácidos L y D que se incorporan ambos en péptidos en la naturaleza, seleccionados entre alanina, aspartato, asparagina, arginina, cisteína, glicina, glutamina, glutamato, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, prolina, fenilalanina, serina, tirosina, treonina, triptófano y valina. "Aminoácido no convencional" o "no estándar" se refiere a cualquier aminoácido, distinto de los aminoácidos estándar, independientemente de si se prepara sintéticamente o se obtiene de una fuente natural. Tal como se usa en el presente documento, "aminoácido sintético o no natural" abarca aminoácidos químicamente modificados que incluyen, pero no se limitan a sales, derivados de aminoácidos (tales como amidas) y/o sustituciones.

I. Péptidos

La presente invención se basa en el descubrimiento de péptidos no naturales que reducen el reclutamiento de leucocitos y, por lo tanto, tienen utilidad para tratar enfermedades mediadas por reclutamiento de leucocitos, por ejemplo, metástasis tumoral y sepsis. También se proporcionan variantes y versiones modificadas de este péptido que son capaces de reducir el reclutamiento de leucocitos.

Utilizando un enfoque de biocribado in vivo de fagos combinatorios no sesgados, se aisló un fago que presentaba péptidos específicos que se localizaba en el hígado y los pulmones de animales tratados con un estímulo proinflamatorio y bloquea el reclutamiento de leucocitos. También se descubrió que este fago y su péptido mostrado correspondiente (N-LSALTPSPSWLKYKAL llamado LSALT, identificado como SEQ ID NO: 1) reducen drásticamente la carga tumoral en los hígados o pulmones de animales inyectados con una línea de células tumorales. El péptido también redujo el reclutamiento de neutrófilos en el hígado en un modelo de ratón de sepsis.

El péptido LSALT, así como las variantes y versiones modificadas del mismo se describen en el presente documento. También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden estos péptidos.

El péptido LSALT puede contener una o más modificaciones para aumentar la resistencia a las proteasas, la estabilidad del suero y/o la biodisponibilidad. La modificación puede seleccionarse entre pegilación, acetilación, glicosilación, biotinilación, sustitución con D-aminoácido y/o aminoácido no natural y/o ciclación del péptido.

El péptido LSALT puede contener uno o más L-aminoácidos, D-aminoácidos y/o aminoácidos no estándar. El aminoácido puede tener la estructura general H²N--C(H)(R)--COOH. El aminoácido puede ser un aminoácido de origen natural. El aminoácido puede ser un aminoácido sintético o no natural (por ejemplo, aminoácidos a, a-disustituidos, N-alquil aminoácidos); y el aminoácido puede ser un d-aminoácido; además, el aminoácido puede ser un 1-aminoácido.

El péptido puede comprender aminoácidos, incluidos los aminoácidos carboxi- y/o amino-terminales en los péptidos, o puede modificarse mediante metilación, amidación, acetilación y/o sustitución con otros grupos químicos que pueden cambiar la vida media circulante del péptido sin afectar negativamente a su actividad. Ejemplos de aminoácidos no convencionales o no naturales incluyen, entre otros, citrulina, ornitina, norleucina, norvalina, 4-(E)-butenil-4(R)-metil-N-metiltreonina (MeBmt), N-metil-leucina (MeLeu), ácido aminoisobutírico, estatina y N-metilalanina (MeAla). Los aminoácidos pueden participar en un enlace disulfuro.

A menos que se defina de otro modo, los términos científicos y tecnológicos y la nomenclatura utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por una persona con experiencia ordinaria a la que pertenece esta descripción. Generalmente, los procedimientos de cultivos celulares, infección, procedimientos de biología molecular y similares son procedimientos comunes usados en la técnica. Tales técnicas estándar se pueden encontrar en manuales de referencia tales como, por ejemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001; y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 2001.

Si bien los péptidos pueden ser eficaces para provocar una actividad biológica in vitro, su eficacia in vivo podría verse reducida por la presencia de proteasas. Las proteasas séricas tienen requisitos de sustrato específicos. El sustrato debe tener tanto L-aminoácidos como también enlaces peptídicos para la escisión. Además, las exopeptidasas, que representan el componente más prominente de la actividad de proteasa en suero, normalmente actúan sobre el primer enlace peptídico del péptido y requieren un extremo N libre (Powell et al., Pharm. Res. 10:1268-1273 (1993)). A la luz de esto, a menudo es ventajoso utilizar versiones modificadas de péptidos. Los péptidos modificados conservan las características estructurales de los péptidos de L-aminoácidos originales que confieren la actividad biológica deseada de LSALT, pero ventajosamente no son fácilmente susceptibles de escisión por proteasa y/o exopeptidasas.

Puede usarse la sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso con D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) para generar péptidos más estables. Por tanto, un péptido derivado o peptidomimético descrito en el presente documento puede ser péptido todo L, todo D o mixto D, L, en orden directo o inverso. La presencia de un D-aminoácido N-terminal o C-terminal aumenta la estabilidad in vivo de un péptido ya que las peptidasas no pueden utilizar un D-aminoácido como sustrato (Powell et al., Pharm. Res. 10:1268-1273 (1993) ). Los péptidos de D inversa son péptidos que contienen D-aminoácidos, dispuestos en una secuencia inversa con respecto a un péptido que contiene L-aminoácidos. Por tanto, el residuo C-terminal de un péptido de L-aminoácido se convierte en N-terminal para el péptido de D-aminoácido, y así sucesivamente. Los péptidos D inversos conservan la misma conformación secundaria y, por lo tanto, una actividad similar a la de los péptidos L-aminoácidos, pero son más resistentes a la degradación enzimática in vitro e in vivo y, por lo tanto, pueden tener una mayor eficacia terapéutica que el péptido original (Brady y Dodson, Nature 368:692-693 (1994); Jameson et al., Nature 368:744-746 (1994) ). De manera similar, se puede generar un péptido L inverso usando procedimientos estándar en los que el extremo C-terminal del péptido original se convierte en o toma el lugar del extremo N-terminal del péptido L inverso. Se contempla que los péptidos L inversos de los péptidos de L-aminoácidos que no tienen una estructura secundaria significativa (por ejemplo, péptidos cortos) conservan el mismo espaciado y conformación de las cadenas laterales de los péptidos L-aminoácidos y, por lo tanto, a menudo tienen la actividad similar a la del péptido L-aminoácido original. Además, un péptido inverso puede contener una combinación de L- y D-aminoácidos. El espaciamiento entre los aminoácidos y la conformación de las cadenas laterales pueden conservarse dando como resultado una actividad similar a la del péptido L-aminoácido original.

El péptido puede modificarse químicamente para conferir resistencia a las peptidasas que actúan sobre los residuos N-terminal o C-terminal de un péptido mediante la adición de grupos químicos en los extremos del péptido, de modo que el péptido modificado ya no sea un sustrato para la peptidasa. Una de tales modificaciones químicas puede ser la glicosilación de los péptidos en uno o en ambos extremos. Las modificaciones químicas que mejoran la estabilidad del suero pueden incluir, pero no se limitan a, la adición de un grupo alquilo N-terminal, que consiste en un alquilo inferior de uno a veinte carbonos, tal como un grupo acetilo, y/o la adición de una amida C-terminal o grupo amida sustituido. En particular, la presente divulgación incluye péptidos modificados que consisten en péptidos que llevan un grupo acetilo N-terminal y/o un grupo amida C-terminal.

La sustitución de ciertos aminoácidos naturales por aminoácidos no naturales en los péptidos puede conferir resistencia a la proteólisis. Por ejemplo, tal sustitución puede conferir resistencia a la proteólisis por exopeptidasas que actúan sobre el extremo N sin afectar la actividad biológica. Los ejemplos de aminoácidos no naturales incluyen a, a-aminoácidos disustituidos, N-alquil aminoácidos, C-a-metil aminoácidos, p-aminoácidos y p-metil aminoácidos. Los análogos de aminoácidos útiles en la presente divulgación pueden incluir, pero no se limitan a, p-alanina, norvalina, norleucina, ácido 4-aminobutírico, oritina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, ácido cisteico, ciclohexilalanina, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 6-aminohexanoico, t-butilglicina, fenilglicina, o-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina y otros aminoácidos no convencionales. Además, la síntesis de péptidos con aminoácidos no naturales es conocida en la técnica.

El péptido LSALT puede comprender además residuos de aminoácidos o análogos en el extremo C-terminal, el N-terminal o tanto en el extremo C-terminal como en el extremo N-terminal. Preferiblemente, la secuencia que lleva la actividad del péptido LSALT no se ve afectada apreciablemente por la adición de estos aminoácidos adicionales.

El péptido LSALT puede comprender además 1,2, 3, 4 o 5 residuos de aminoácidos en los extremos N-terminal y C-terminal del péptido LSALT.

El péptido LSALT puede comprender además 1, 2, 3, 4 o 5 residuos de aminoácidos en el extremo N-terminal de la secuencia LSALTPSPSWLKYKAL.

El péptido LSALT puede comprender además 1, 2, 3, 4 o 5 residuos de aminoácidos en el extremo C-terminal de la secuencia LSALTPSPSWLKYKAL.

El péptido puede seleccionarse de XLSALTPSPSWLKYKAL, XXLSALTPSPSWLKYKAL, XXXLSALTPSPSWLKYKAL, XXXXLSALTPSPSWLKYKAL, o XXXXLSALTPSPSWLKYKAL, donde X es cualquier aminoácido no natural o donde X es un aminoácido no convencional o análogo de aminoácido como se describe en el presente documento y se conoce por aquellos expertos en la técnica.

El péptido puede seleccionarse de LSALTPSPSWLKYKALX, LSALTPSPSWLKYKALXX, LSALTPSPSWLKYKALXXX, LSALTPSPSWLKYKALXXXX, o LSALTPSPSWLKYKALXXXX, donde X es cualquier aminoácido no natural donde X es un aminoácido no convencional o análogo de aminoácido como se describe en en el presente documento o se conoce por aquellos expertos en la técnica.

El péptido puede seleccionarse de XLSALTPSPSWLKYKALX, XLSALTPSPSWLKYKALXX, XLSALTPSPSWLKYKALXXX, XLSALTPSPSWLKYKALXXXX, XLSALTPSPSWLKYKALXXXXX, XXLSALTPSPSWLKYKALX, XXLSALTPSPSWLKYKAXX, XXLSALTPSPSWLKYKALXXX, XXLSALTPSPSWLKYKALXXXX, XXLSALTPSPSWLKYKALXXXXX XXXLSALTPSPSWLKYKALX, XXXLSALTPSPSWLKYKALXX, XXXLSALTPSPSWLKYKALXXX, XXXLSALTPSPSWLKYKALXXXX, XXXLSALTPSPSWLKYKALXXXXX, XXXXLSALTPSPSWLKYKALX, XXXXLSALTPSPSWLKYKALXX, XXXXLSALTPSPSWLKYKALXXX XXXXLSALTPSPSWLKYKALXXXX, XXXXLSALTPSPSWLKYKALXXXXX, XXXXXLSALTPSPSWLKYKALX, XXXXXLSALTPSPSWLKYKALXX, XXXXXLSALTPSPSWLKYKALXXX XXXXXLSALTPSPSWLKYKALXXXX, o XXXXXLSALTPSPSWLKYKALXXXXX, donde X es cualquier aminoácido de origen natural o donde X es un aminoácido no convencional o análogo de aminoácido como se describe en el presente documento y se conoce por los expertos en la técnica.

Los análogos de péptidos se utilizan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a las del péptido modelo. Los compuestos no peptídicos se denominan "miméticos peptídicos" o peptidomiméticos (Fauchere et al., Infect. Immun. 54:283-287 (1986); Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229-1239 (1987)). Miméticos peptídicos que están relacionados estructuralmente con péptidos terapéuticamente útiles y pueden usarse para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente o mejorado. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares al polipéptido paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una actividad biológica o farmacológica) como los polipéptidos que se unen al receptor de origen natural, pero tienen uno o más enlaces peptídicos opcionalmente reemplazados por enlaces como --CH²NH--, --CH²S--, --CH²--CH²--, --CH=CH--(cis y trans), -CH²SO--, -CH(OH)CH²--, --COCH²-- etc., por procedimientos bien conocidos en la técnica (Spatola, Peptide Backbone Modifications, Vega Data, 1(3):267 (1983); Spatola et al. Life Sci. 38:1243-1249 (1986); Hudson et al. Int. J. Pept. Res. 14:177-185 (1979); y Weinstein. B., 1983, Chemistry and Biochemistry, of Amino Acids, Peptides and Proteins, Weinstein eds, Marcel Dekker, Nueva York,). Dichos miméticos de péptidos pueden tener ventajas significativas sobre los polipéptidos de origen natural que incluyen una producción más económica, mayor estabilidad química, propiedades farmacológicas mejoradas (por ejemplo, vida media, absorción, potencia, eficiencia, etc.), antigenicidad reducida y otras.

Las sales farmacéuticamente aceptables retienen la actividad biológica deseada del péptido original sin efectos secundarios tóxicos. El término "sal farmacéuticamente aceptable" como se usa en el presente documento se refiere a sales que se sabe que no son tóxicas y se usan comúnmente en la bibliografía farmacéutica. Los ácidos inorgánicos típicos usados para formar tales sales incluyen clorhídrico, bromhídrico, yodhídrico, nítrico, sulfúrico, fosfórico, hipofosfórico y similares. También se pueden usar sales derivadas de ácidos orgánicos, tales como ácidos alifáticos mono- y dicarboxílicos, ácidos alcanoicos fenil-sustituidos, ácidos hidroxialcanoicos e hidroxialcanodioicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos. Dichas sales farmacéuticamente aceptables incluyen acetato, fenilacetato, trifluoroacetato, acrilato, ascorbato, benzoato, clorobenzoato, dinitrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxibenzoato, metilbenzoato, o-acetoxibenzoato, naftalen-2-benzoato, bromuro, isobutirato, fenil-butirato, betahidroxibutirato, cloruro, cinamato, citrato, formiatos, fumarato, glicolato, heptanoato, lactato, maleato, hidroximaleato, malonato, mesilato, nitrato, oxalato, ftalato, fosfato, monohidrofosfato, dihidrofosfato, metafosfato, pirofosfato, propionato, fenilpropionato, salicilato, succinato, sulfato, bisulfato, pirosulfato, sulfito, bisulfito, sulfonato, bencenosulfonato, p-bromofenilsulfonato, clorobencenosulfonato, etanosulfonato, 2-hidroxietanosulfonato, metanosulfonato, naftalen-1-sulfonato, naftalen-2-sulfonato, p-toluenosulfonato, xilenosulfonato, tartrato y similares.

Como se usa en esta especificación, las formas singulares "un", "una" y "el" específicamente también abarcan las formas plurales de los términos a los que se refieren, a menos que el contenido indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la referencia a "péptido" incluye mezclas de péptidos.

II. Formulaciones y medicamentos farmacéuticos

Los péptidos descritos, así como las variantes y modificaciones de los mismos, pueden proporcionarse como formulaciones farmacéuticas para uso terapéutico. La formulación farmacéutica puede comprender un péptido aislado de secuencia LSALTPSPSWLKYKAL, identificado como SEQ ID NO: 1, y designado en el presente documento como "LSALT". Además, la formulación farmacéutica puede comprender un péptido aislado contenido como un inserto en un virus de fago y/o puede comprender además 1, 2, 3, 4, 5 residuos de aminoácidos adicionales en el extremo N-terminal y/o C-terminal de la secuencia LSALTPSPSWLKYKAL.

Los regímenes de administración representativos incluyen oral, parenteral (incluyendo inyección subcutánea, intramuscular e intravenosa), rectal, bucal (incluyendo sublingual), transdérmica, inhalación ocular e intranasal. La administración de péptidos puede implicar la inyección subcutánea de una formulación inyectable de liberación controlada. Los péptidos y/o proteínas que se describen en el presente documento son útiles para la administración subcutánea, intranasal y por inhalación.

La selección de la dosis y composición exactas y el régimen de administración más apropiado estarán influenciados, entre otras cosas, por las propiedades farmacológicas del péptido seleccionado, la naturaleza y gravedad de la afección que se está tratando, y la condición física y agudeza mental del receptor. Además, la vía de administración dará como resultado cantidades diferenciales de material absorbido. Las biodisponibilidades para la administración de péptidos a través de diferentes vías son particularmente variables, observándose cantidades desde menos del 1% hasta cerca del 100%. Normalmente, la biodisponibilidad de vías distintas de la inyección intravenosa, intraperitoneal o subcutánea es del 50% o menos.

De acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento, un péptido LSALT como se describe en el presente documento se puede administrar a un sujeto solo (por ejemplo, como un péptido o compuesto purificado), o como un componente de una composición o medicamento (por ejemplo, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad), como se describe en el presente documento. Las composiciones se pueden formular con un vehículo o excipiente fisiológicamente aceptable para preparar una composición farmacéutica. El vehículo y la composición pueden ser estériles. La formulación debe adaptarse al modo de administración, por ejemplo, administración intravenosa o subcutánea. Los procedimientos para formular composiciones son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceuticals Sciences, 17.sup.th Edition, Mack Publishing Co., (Alfonso R. Gennaro, editor) (1989)).

Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, soluciones salinas (por ejemplo, NaCl), solución salina, solución salina con pH regulado, alcoholes, glicerol, etanol, goma arábiga, aceites vegetales, alcoholes bencílicos, polietilenglicoles, gelatina, carbohidratos tales como lactosa, amilosa o almidón, azúcares como manitol, sacarosa u otros, dextrosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, aceite de perfume, ésteres de ácidos grasos, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, etc., así como combinaciones de los mismos. Las preparaciones farmacéuticas se pueden mezclar, si se desea, con agentes auxiliares (por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, reguladores de pH, colorantes y/o sustancias aromáticas y similares) que no reaccionen de manera nociva con los compuestos activos o interfieran con su actividad. Puede usarse un vehículo soluble en agua adecuado para administración intravenosa.

La composición o medicamento, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes reguladores del pH. La composición puede ser una solución líquida, suspensión, emulsión, formulación de liberación sostenida o polvo. La composición también se puede formular como supositorio, con aglutinantes y vehículos tradicionales como los triglicéridos.

La composición o medicamento se puede formular de acuerdo con los procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para la administración a seres humanos. Por ejemplo, preferiblemente, una composición para administración intravenosa es típicamente una solución en regulador de pH acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local para aliviar el dolor en el lugar de la inyección. Generalmente, los ingredientes se suministran por separado o mezclados en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o un concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente cerrado como una ampolla o bolsita que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición deba administrarse por infusión, se puede despachar con una botella de infusión que contenga agua de calidad farmacéutica estéril, solución salina o dextrosa/agua. Cuando la composición se administra mediante inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina para que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración.

La composición farmacéutica puede comprender un vehículo líquido tales como, pero no limitados a, agua, solución salina, solución salina regulada con fosfato, solución de Ringer, solución de dextrosa, soluciones que contienen suero, solución de Hank, otras soluciones acuosas fisiológicamente equilibradas, aceites, ésteres y glicoles.

Los péptidos LSALT como se describen en el presente documento se pueden formular como formas neutras o salinas. Como se indicó anteriormente, las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con grupos amino libres como las derivadas de los ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y las formadas con grupos carboxilo libres como las derivadas de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, etc.

Las formulaciones farmacéuticas descritas en el presente documento contienen, como ingrediente activo, un péptido LSALT, que puede mezclarse con un excipiente, diluirse con un excipiente o encerrarse dentro de un vehículo, que puede estar en forma de cápsula, bolsita, papel u otro recipiente, según procedimientos y composiciones farmacéuticas bien conocidos. La composición puede administrarse por cualquier vía adecuada para la administración de péptidos, incluida la administración parenteral, intravenosa, subcutánea o intramuscular. Normalmente, el péptido se disuelve o suspende en una solución inyectable estéril, a una concentración suficiente para proporcionar la dosis requerida en 0.5 a 2 ml o menos. Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento como adecuadas para administraciones parenterales comprenden uno o más compuestos descritos en el presente documento en combinación con una o más soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables, o polvos estériles que pueden reconstituirse en soluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de su uso, que pueden contener antioxidantes, reguladores de pH, solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor pretendido o agentes de suspensión o espesantes.

Las formas de depósito inyectables se preparan formando matrices microencapsuladas del fármaco en polímeros biodegradables tales como polilactida-poliglicólido. Dependiendo de la relación de fármaco a polímero y de la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación del fármaco. Ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli(ortoésteres) y poli(anhídridos). Las formulaciones inyectables de depósito también se preparan atrapando el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con los tejidos corporales. Los materiales inyectables se pueden esterilizar, por ejemplo, mediante filtración a través de un filtro de retención de bacterias.

Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse en envases sellados de dosis unitaria o multidosis, por ejemplo, ampollas y viales, y pueden almacenarse en un estado liofilizado requiriendo solo la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyección, inmediatamente antes de usar. Pueden prepararse soluciones y suspensiones para inyección extemporánea a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito anteriormente.

III. Kits

También se describen en el presente documento kits u otros artículos de fabricación que contienen el péptido LSALT o las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento, así como las instrucciones para su reconstitución (si están liofilizadas) y/o uso. Los kits u otros artículos de fabricación pueden incluir un recipiente, una jeringa, un vial y cualquier otro artículo, dispositivo o equipo útil en la administración (por ejemplo, subcutánea, por inhalación). Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas (por ejemplo, jeringas precargadas), ampollas, cartuchos, depósitos o lyo-jects (inyecciones). El recipiente puede estar formado por una variedad de materiales, como vidrio o plástico. El recipiente puede ser una jeringa precargada. Las jeringas precargadas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, jeringas de vidrio de borosilicato con revestimiento de silicona horneada, jeringas de vidrio de borosilicato con silicona pulverizada o jeringas de resina plástica sin silicona.

Normalmente, el recipiente puede contener formulaciones y una etiqueta sobre, o asociada con, el recipiente que puede indicar instrucciones para la reconstitución y/o uso. Por ejemplo, la etiqueta puede indicar que la formulación se reconstituye a las concentraciones descritas anteriormente. La etiqueta puede indicar además que la formulación es útil o está destinada, por ejemplo, a la administración subcutánea. El recipiente puede contener una dosis única de una formulación estable que contiene un péptido LSALT. Una dosis única de la formulación estable puede estar presente en un volumen de menos de aproximadamente 15 ml, aproximadamente 10 ml, aproximadamente 5.0 ml, aproximadamente 4.0 ml, aproximadamente 3.5 ml, aproximadamente 3.0 ml, aproximadamente 2.5 ml, aproximadamente 2.0 ml, aproximadamente 1.5 ml, aproximadamente 1.0 ml o aproximadamente 0.5 ml Alternativamente, el recipiente que contiene la formulación puede ser un vial de usos múltiples, que permite administraciones repetidas (por ejemplo, de 2 a 6 administraciones) de la formulación. Los kits u otros artículos de fabricación pueden incluir además un segundo recipiente que comprende un diluyente adecuado (por ejemplo, BWFI, solución salina, solución salina con pH regulado). Tras mezclar el diluyente y la formulación, la concentración final de proteína en la formulación reconstituida será generalmente de al menos aproximadamente 1 mg/ml (por ejemplo, al menos aproximadamente 5 mg/ml, al menos aproximadamente 10 mg/ml, al menos aproximadamente 20 mg/ml, al menos aproximadamente 30 mg/ml, al menos aproximadamente 40 mg/ml, al menos aproximadamente 50 mg/ml, al menos aproximadamente 75 mg/ml, al menos aproximadamente 100 mg/ml). Los kits u otros artículos de fabricación pueden incluir además otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluidos otros reguladores de pH, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones de uso. Los kits u otros artículos de fabricación pueden incluir una instrucción para la autoadministración.

IV. Posología

Cuando se emplean como productos farmacéuticos, los péptidos descritos en el presente documento se administran en forma de composiciones farmacéuticas. Estos compuestos pueden administrarse mediante una variedad de vías que incluyen oral, rectal, transdérmica, subcutánea, intravenosa, intramuscular e intranasal, o mediante instilación intratraqueal o inhalación de aerosol.

Los péptidos descritos en el presente documento son útiles para bloquear o inhibir la metástasis tumoral, por ejemplo, en el hígado. La forma de administración se definirá mediante la aplicación del compuesto y se puede determinar mediante procedimientos rutinarios de pruebas clínicas para encontrar la dosis óptima.

La dosis puede estar entre 0.01 mg/kg y 100 mg/kg de péptido activo, entre 0.01 mg/kg y 50 mg/kg o entre 0.01 mg/kg y 25 mg/kg.

La dosis puede estar entre 0.1 mg/kg y 100 mg/kg, entre 0.1 mg/kg y 50 mg/kg, entre 0.1 mg/kg y 25 mg/kg o entre 0.1 mg/kg y 10 mg/kg.

La dosis puede estar entre 0.5 mg/kg a 100 mg/kg, 0.5 mg/kg a 50 mg/kg, 0.5 mg/kg a 25 mg/kg o 0.5 mg/kg a 10.0 mg/kg.

La dosis puede estar entre 1.0 mg/kg a 25 mg/kg, entre 1.0 mg/kg a 50 mg/kg, entre 1.0 mg/kg a 70 mg/kg, entre 1.0 mg/kg a 100 mg/kg, entre 5.0 mg/kg a 25 mg/kg, entre 5.0 mg/kg a 50 mg/kg, entre 5.0 mg/kg a 70 mg/kg, entre 5.0 mg/kg a 100 mg/kg, entre 10.0 mg/kg a 25 mg/kg, entre 10.0 mg/kg a 50 mg/kg, entre 10.0 mg/kg a 70 mg/kg o entre 10.0 mg/kg a 100 mg/kg.

La dosis puede estar entre 50 pM y 500 pM.

Se entenderá, sin embargo, que la cantidad de péptido administrada realmente será determinada por un médico, a la luz de las circunstancias relevantes, incluida la afección a tratar, la vía de administración elegida, el compuesto real administrado, la edad, peso y respuesta del paciente individual, la gravedad de los síntomas del paciente y similares.

Los péptidos y/o proteínas que se describen en presente documento, o sus sales, pueden administrarse en cantidades entre 0.001 y 20 mg/kg de peso corporal por día, entre 0.01 y 10 mg/kg de peso corporal por día, entre 0.1 y 1000 pg/kg de peso corporal por día, o entre 0.1 y 100 pg/kg de peso corporal por día. Las vías de administración varían. Por ejemplo, los péptidos y/o proteínas que se describen en el presente documento, o sus sales, se administran en cantidades entre 0.1 y 1000 pg/kg de peso corporal por día, o entre 0.1 y 100 pg/kg de peso corporal por día, mediante inyección subcutánea. A modo de ejemplo, para una mujer de 50 kg, la dosis diaria de ingrediente activo es de aproximadamente 5 a 5000 pg, o de 5 a 5000 pg por inyección subcutánea. Se necesitarán diferentes dosis, dependiendo de la vía de administración, la potencia del compuesto, el perfil farmacocinético y la biodisponibilidad aplicable observada, y el agente activo y la enfermedad a tratar. Cuando la administración es por inhalación, la dosis diaria puede ser de 1000 a 20,000 pg, dos veces al día. En otros mamíferos, como caballos, perros y ganado, pueden requerirse dosis más altas. Esta dosis se puede administrar en una composición farmacéutica convencional mediante una sola administración, mediante múltiples aplicaciones o mediante liberación controlada, según sea necesario para lograr los resultados más efectivos.

V. Procedimientos de fabricación

Los péptidos LSALT o derivados descritos en el presente documento pueden obtenerse mediante cualquier procedimiento de síntesis de péptidos conocido por los expertos en la técnica, incluidos los sintéticos (por ejemplo, síntesis en fase sólida exclusiva, síntesis en fase sólida parcial, condensación de fragmentos, síntesis clásica en solución, ligadura química nativa) y técnicas recombinantes. Por ejemplo, los péptidos o derivados de péptidos pueden obtenerse mediante síntesis de péptidos en fase sólida, que, en resumen, consisten en acoplar el grupo carboxilo del aminoácido C-terminal a una resina (por ejemplo, resina de benzhidrilamina, resina clorometilada, resina de hidroximetilo) y añadiendo sucesivamente aminoácidos protegidos con N-alfa. Los grupos protectores pueden ser cualquiera de estos grupos conocidos en la técnica. Antes de que se agregue cada nuevo aminoácido a la cadena en crecimiento, se elimina el grupo protector del aminoácido anterior agregado a la cadena. Tal síntesis en fase sólida ha sido descrita, por ejemplo, por Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1964); Vale et al., Science 213:1394-1397 (1981), en las patentes estadounidenses Nos. 4,305,872 y 4,316, 891, Bodonsky et al. Chem. Ind. (London), 38:1597 (1966); y Pietta y Marshall, Chem. Comm. 650 (1970) mediante técnicas analizadas en Lubell et al. "Peptides" Science of Synthesis 21.11, Chemistry of Amides. Thieme, Stuttgart, 713-809 (2005). El acoplamiento de aminoácidos a resinas apropiadas también es bien conocido en la técnica y ha sido divulgado en la patente estadounidense No. 4,244,946. (Analizado en Houver-Weyl, Methods of Organic Chemistry. Vol E22a. Synthesis of Peptides and Peptidomimetics, Murray Goodman, Editor jefe, Thieme, Stuttgart, Nueva York 2002).

Durante cualquier procedimiento de preparación del péptido LSALT, puede ser deseable proteger los grupos activos sensibles en cualquiera de las moléculas en cuestión. Esto puede lograrse por medio de grupos protectores convencionales tales como los descritos en Protective Groups In Organic Synthesis de T. W. Greene & P. G. M. Wuts, 1991, John Wiley and Sons, Nueva York; y Peptides: chemistry and Biology de Sewald y Jakubke, 2002, Wiley-VCH, Wheinheim p. 142. Por ejemplo, los grupos protectores de alfa amino incluyen grupos protectores de tipo acilo (por ejemplo, trifluoroacetilo, formilo, acetilo), grupos protectores de uretano alifático (por ejemplo, T-butiloxicarbonilo (BOC), ciclohexiloxicarbonilo), grupos protectores de tipo uretano aromático (por ejemplo, fluorenil-9 -metoxicarbonilo (Fmoc), benciloxicarbonilo (Cbz), derivados de Cbz) y grupos protectores de tipo alquilo (por ejemplo, trifenilmetilo, bencilo). Los grupos protectores de la cadena lateral de aminoácidos incluyen bencilo (para Thr y Ser), Cbz (Tyr, Thr, Ser, Arg, Lys), metil etilo, ciclohexilo (Asp, His), Boc (Arg, His, Cys), etc. Los grupos protectores pueden eliminarse en una etapa posterior conveniente usando procedimientos conocidos en la técnica.

Además, el péptido LSALT se puede sintetizar según el protocolo FMOC en una fase orgánica con grupos protectores. Deseablemente, los péptidos se purifican con un rendimiento del 70% con cromatografía líquida de alta presión (HPLC) en una columna de cromatografía C18 y se eluyen con un gradiente de acetonitrilo del 10-60%. El peso molecular de un péptido se puede verificar mediante espectrometría de masas (analizado en Fields, G. B. "Solid-Phase Peptide Synthesis" Methods in Enzymology. Vol. 289, Academic Press, 1997).

Alternativamente, el péptido LSALT se puede preparar en sistemas recombinantes usando, por ejemplo, secuencias de polinucleótidos que codifican los polipéptidos. Se entiende que un polipéptido puede contener más de una de las modificaciones descritas anteriormente dentro del mismo polipéptido.

VI. Caracterización del péptido LSALT

Aunque el péptido LSALT no es de origen natural, el análisis BLAST del péptido LSALT encontró que tenía similitudes con: doble cortina; fibulina-2; -Fermt3; -tetraspannin 18; -shroom3; - clasificación de nexin 8; -FGFR-3; -homólogo de protogenina; -miomesina 3; y -prdm16.

Cuando el fago LSALT se inmovilizó en nitrocelulosa y se bio-cribó frente a una biblioteca de fagos M13 combinatoria, se aislaron los siguientes péptidos como péptidos que se unen específicamente con LSALT. Estos péptidos proporcionan dianas potenciales para la acción de péptidos LSALT, variantes y modificaciones de los mismos.

Tabla 1: Dianas presuntas de LSALT

Como se considera a continuación, todos estos péptidos son dianas potenciales para compuestos, por ejemplo, compuestos peptídicos que serán terapéuticamente efectivos para bloquear el reclutamiento de neutrófilos en el hígado o los pulmones, con el propósito de inhibir la metástasis tumoral en el hígado o los pulmones, y para el tratamiento de septicemia.

VII. Procedimientos de cribado

Por tanto, en el presente documento también se proporciona un procedimiento para identificar un compuesto eficaz para bloquear el reclutamiento de leucocitos en la vasculatura de un paciente. El procedimiento incluye cribar una biblioteca de compuestos de prueba por su capacidad para unirse a un péptido diana que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 2-16. Para aquellos compuestos de biblioteca que muestran una afinidad de unión selectiva a uno de los péptidos diana en la biblioteca, por ejemplo, un aumento de al menos 10­ 100 veces en la afinidad de unión sobre un péptido de secuencia aleatoria, el compuesto está probando adicionalmente su capacidad para inhibir reclutamiento de leucocitos, de acuerdo con los procedimientos que se detallan a continuación. Se ha demostrado que los compuestos de prueba que bloquean el reclutamiento de leucocitos se identifican luego como compuestos principales para pruebas y desarrollo de compuestos adicionales.

En el presente documento también se describe un procedimiento para identificar un compuesto eficaz para bloquear el reclutamiento de leucocitos en la vasculatura de un paciente que comprende: (a) cribar una biblioteca de compuestos de prueba para determinar su capacidad para unirse a un péptido diana que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 2-16; (b) seleccionar compuestos que muestren afinidad de unión selectiva; (c) ensayar los compuestos para determinar la actividad inhibidora del reclutamiento de leucocitos, y (d) seleccionar un compuesto si inhibe el reclutamiento de leucocitos.

La vasculatura puede ser vasculatura pulmonar o vasculatura hepática.

El procedimiento puede comprender además las etapas de (e) ensayar adicionalmente el compuesto para determinar su capacidad para inhibir la metástasis tumoral en un animal que porta un tumor sólido; y (f) seleccionar el compuesto si inhibe la metástasis tumoral en la etapa (e).

El procedimiento puede comprender además las etapas de (e) ensayar adicionalmente el compuesto para determinar su capacidad para inhibir la metástasis tumoral a los pulmones y al hígado en un animal que porta un tumor sólido conocido por hacer metástasis en los pulmones o el hígado; y (f) seleccionar el compuesto si inhibe la metástasis tumoral en la etapa (e).

El procedimiento puede comprender además las etapas de (e) probar adicionalmente el compuesto para determinar su capacidad para tratar la sepsis bacteriana en un paciente; y (f) seleccionar el compuesto si trata la sepsis en la etapa (e).

La etapa (a) en el procedimiento puede incluir el cribado de una biblioteca de compuestos de prueba por su capacidad para unirse a un péptido diana que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 2-7.

La etapa (a) puede incluir el cribado de una biblioteca de compuestos de prueba para determinar su capacidad para unirse a un péptido diana que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 8-16.

VIII. Mecanismo de acción de LSALT

Sin pretender estar ligado a ningún mecanismo particular, se cree que la capacidad de LSALT para bloquear el reclutamiento de neutrófilos en los sinusoides de hígado y pulmón podría ocurrir mediante uno de dos mecanismos de acción, que se ilustran en las Figs. 10 y 11. El modelo 1 (Fig.10) muestra células cancerosas (cc en la figura) que tienen una molécula de adhesión específica que comparten los neutrófilos, por ejemplo, leucocitos, que media la unión de las células cancerosas al endotelio en la vasculatura diana y la extravasación de las células cancerosas a través de la capa de endotelio. La unión de LSALT a este factor anula la unión de las células cancerosas al endotelio y/o la extravasación en el tejido diana, por ejemplo, el hígado.

Un segundo modelo, como se muestra en la Fig. 11, propone que las células cancerosas se unen al endotelio, pero requieren leucocitos para proporcionar la capacidad de extravasar al órgano diana. El péptido LSALT en este modelo actúa bloqueando el reclutamiento de los leucocitos en la proximidad de las células cancerosas o bloqueando la interacción de los leucocitos con las células cancerosas.

Estos dos modelos no son mutuamente excluyentes y podrían invocarse modelos más complejos que requieran la integración de ambos. Si bien no se vincula a ningún mecanismo específico y se basa en la observación de que el fago aislado y su péptido mostrado correspondiente son capaces de inhibir el reclutamiento de leucocitos endógenos y dos modelos diferentes de metástasis de células tumorales (tanto de ratón como de ser humano), parece probable que el péptido LSALT interfiere con las primeras etapas de la metástasis, específicamente la detención inicial/reclutamiento de la célula cancerosa dentro de la vasculatura y/o su extravasación en el tejido circundante.

IX. Tratamiento

La figura 12 muestra datos de un estudio en el que se realizó una inyección intraesplénica de células de cáncer de mama de murino 4T1 en presencia o ausencia del fago de control del fago que expresa LSALT, y se evaluó el número de metástasis de tumor mamario superficial en el hígado 4 semanas después de la inyección. Como se ve, el péptido LSALT redujo significativamente el número de neutrófilos presentes en el tejido sinusoide hepático.

En un estudio de tratamiento, se inyectaron 1x10670W 1x106 células de melanoma humano, que expresan luciferasa, a través de la vena de la cola con o sin inyección previa de péptidos LSALT de 50 pM o 500 pM. 4 semanas después de la inyección, se sacrificaron los animales y se extrajeron los pulmones y se evaluó la carga tumoral (figuras 13A-13F) o se tomaron imágenes usando el sistema de emisión de luz Xenogen (figuras 14A-14D). Las figuras 13A-13C muestran imágenes representativas de los pulmones, con nódulos pulmonares melanóticos visibles que ocurren con menos frecuencia en el animal que recibe la dosis más alta de LSALT. Las figuras 13A-13C muestran secciones de pulmón congeladas teñidas con nucleolina humana (marrón) y contrateñidas con azul de toludina (fila superior), y las Figs. 13D - 13F muestran pulmones extirpados con células tumorales que expresan melanina (marrón) que demuestran una carga tumoral en los pulmones, y el tejido muestra los niveles más altos de LSALT mostrando la menor carga tumoral.

Los animales se trataron como anteriormente en ausencia o presencia de reducción de neutrófilos usando Anti-Ly6G/GR1, y se obtuvieron imágenes de los animales con el sistema de luz Xenogen. Como puede verse en las figuras 14A y 14B, cantidades progresivamente mayores de LSALT produjeron progresivamente menos carga tumoral y se observó el mismo resultado cuando los animales fueron pretratados para el agotamiento de neutrófilos (Figuras 14C y 14D).

X. Vías de administración

Un péptido LSALT como se describe en el presente documento (o una composición o medicamento que contiene péptido LSALT como se describe en el presente documento) puede administrarse por cualquier vía apropiada. El péptido LSALT se puede administrar por vía parenteral. La administración parenteral puede seleccionarse entre administración intravenosa, intradérmica, por inhalación, transdérmica (tópica), intraocular, intramuscular, subcutánea, intramuscular y/o transmucosa. Un péptido LSALT como se describe en el presente documento se puede administrar por vía subcutánea. Como se usa en el presente documento, el término "tejido subcutáneo" se define como una capa de tejido conectivo irregular y suelto inmediatamente debajo de la piel. Por ejemplo, la administración subcutánea se puede realizar inyectando una composición en áreas que incluyen, pero no se limitan a, región del muslo, región abdominal, región glútea o región escapular. Un péptido LSALT como se describe en el presente documento se puede administrar por vía intravenosa. Un péptido LSALT como se describe en el presente documento puede administrarse por administración directa a un tejido diana, tal como corazón o músculo (por ejemplo, intramuscular), tumor (intratumoralmente), sistema nervioso (por ejemplo, inyección directa en el cerebro, de manera intraventricular, intratecal). Alternativamente, un péptido LSALT como se describe en el presente documento (o una composición o medicamento que contiene un péptido LSALT como se describe en en el presente documento) puede administrarse por inhalación, por vía parenteral, intradérmica, transdérmica o transmucosal (por ejemplo, por vía oral o nasal). Se puede utilizar más de una ruta al mismo tiempo, si se desea.

Un péptido LSALT como se describe en el presente documento puede administrarse por vía oral. También se describen formas de dosificación sólidas de péptido LSALT como se describe en el presente documento para administración oral que incluyen (a) un péptido LSALT, (b) al menos un agente reductor del pH farmacéuticamente aceptable, (c) al menos un potenciador de la absorción eficaz para promover la biodisponibilidad del péptido LSALT, y (d) un vehículo protector. La forma de dosificación sólida puede ser una cápsula o un comprimido. Se conocen en la técnica diversos procedimientos e ingredientes para preparar formulaciones orales y se espera que un experto en la materia pueda determinar cuáles de estos procedimientos e ingredientes serán compatibles con la divulgación como se describe en esta especificación y/o en la solicitud de patente provisional estadounidense con No. de serie 61/61/939,561, presentada el 13 de febrero de 2014. Dichos procedimientos e ingredientes también se contemplan en el presente documento.

XI. Horarios de dosificación

Diversas implementaciones pueden incluir diferentes regímenes de dosificación. El péptido LSALT se puede administrar mediante infusión continua. La infusión continua puede ser intravenosa. La infusión continua puede ser subcutánea. Alternativa o adicionalmente, el péptido LSALT puede administrarse bimensualmente, mensualmente, dos veces al mes, trisemanalmente, quincenalmente, semanalmente, dos veces por semana, tres veces por semana, diariamente, dos veces al día o en otro programa de dosificación clínicamente deseable. El régimen de dosificación para un solo sujeto no necesita ser en un intervalo fijo, pero puede variar con el tiempo, dependiendo de las necesidades del sujeto.

XII. Procedimientos de cribado

En el presente documento también se describe un procedimiento para identificar un compuesto eficaz para bloquear el reclutamiento de leucocitos en la vasculatura de un paciente.

La vasculatura puede ser de los pulmones o el hígado del paciente.

El procedimiento puede incluir las etapas de (a) cribar una biblioteca de compuestos de prueba para determinar su capacidad para unirse a un péptido diana que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 2-16; (b) para determinar aquellos compuestos de la biblioteca que muestran una afinidad de unión selectiva a uno de los péptidos diana en la biblioteca; ensayar adicionalmente el compuesto para determinar su capacidad para inhibir la metástasis tumoral a los pulmones o al hígado en un animal que porta un tumor sólido conocido por hacer metástasis en los pulmones o el hígado; y (c) seleccionar el compuesto si inhibe la metástasis tumoral en la etapa (b).

El procedimiento puede incluir un uso para identificar un compuesto eficaz para inhibir la metástasis tumoral a los pulmones o al hígado en un paciente; el procedimiento incluye, además, en la etapa (b), probar el compuesto para determinar su capacidad para inhibir la metástasis tumoral a los pulmones y al hígado en un animal que porta un tumor sólido conocido por hacer metástasis en los pulmones y el hígado.

El procedimiento puede incluir un uso para identificar un compuesto eficaz para tratar la sepsis bacteriana en un paciente; el procedimiento incluye además en la etapa (b) probar el compuesto para determinar su capacidad para tratar la sepsis en un modelo animal.

Ejemplos

Ejemplo 1: Preparación de bibliotecas de presentación de fagos de hígado y pulmón T7

La Fig. 1 ilustra las etapas en la preparación de una biblioteca de presentación de fagos T7 específicos de neutrófilos. En un procedimiento ejemplar, se aislaron neutrófilos de 40 ratones negros C56, de acuerdo con procedimientos conocidos. Se extrajo ARN de los neutrófilos y se convirtió en ADNc usando el kit de ADNc OrientExpress de Novagen (patente de EE.UU. no. 5,629,179). Los ADNc derivados de neutrófilos se fusionaron con el gen de la proteína de la cubierta en un sistema selecto de presentación de fagos T7 (patentes estadounidenses 5223409; 5403484; 5571698; 5766905), y el ADN se empaquetó en partículas de fagos, creando la biblioteca llamada T7N. A continuación, se agotó la biblioteca de fagos que se unían a "células de fondo", es decir, células de endotelio de ratón fetal no estimuladas, mediante tres etapas sucesivas en las que la biblioteca se mezcló con células de fondo y retuvo el fago no unido.

Para seleccionar el fago específico de neutrófilos, se inyectaron ratones negros C57 con anti-Grl para eliminar los neutrófilos del ratón. 24 horas después, a los ratones se les administró una inyección IP de 0.5 mg/kg de lipopolisacárido (LPS), un estímulo inflamatorio que provoca un aumento de las moléculas de adhesión en el revestimiento endotelial de los vasos sanguíneos. Estas moléculas de adhesión reclutan neutrófilos del flujo sanguíneo. Tres horas y media más tarde, los ratones fueron anestesiados con una dosis del 65% de ketamina, y veinte minutos más tarde, los ratones fueron inyectados con 5 x 109 pfu de biblioteca de fagos por la vena de la cola, y los fagos se dejaron circular durante 10 minutos. A continuación, los animales se perfundieron con 15 ml de PBS, se bombearon por la izquierda y se drenaron a través de la aurícula derecha mientras el corazón aún latía, para eliminar los fagos no unidos en la vasculatura.

Se recogieron los pulmones, hígado, corazón, riñones, cerebro y músculo de la pierna, y cada órgano se trituró en 1 ml de EDTA/PBS de 10 mM, se homogeneizó con dounce y se sembró en placa de 1 ul de preparación de órganos final para la titulación de la placa. Se añadieron 10 ml de LB con huésped de fagos bacterianos al resto de la preparación de órganos del hígado y los pulmones para recuperar el fago que se dirigió preferentemente a estos órganos.

La biblioteca de hígado (T7NLi) se tomó a través de 4 rondas de selección in vivo, pero la biblioteca de pulmón (T7NLu) solo pasó por 3 rondas, ya que no se observó ningún enriquecimiento del fago dirigido al pulmón con la selección adicional, como se ve en las Figs. 2A y 2B. Tanto las bibliotecas de T7NLi como las de T7NLu fueron altamente selectivas para unirse al hígado, pero ninguna de ellas fue altamente selectiva para el tejido pulmonar.

Se combinaron y amplificaron dos grupos de 10 placas de la biblioteca T7NLi y dos grupos de 10 placas (subelones 1-1/1-10 y 2-1/2-10) de la biblioteca original no seleccionada (T7N) y luego se verificó su direccionamiento al hígado, con los resultados mostrados en la Fig. 3A. Los grupos seleccionados de subclones mostraron una orientación selectiva significativa hacia el hígado. La T7NLi, T7NLu y una mezcla 50:50 del subclon 2-2 (KKKKKKSWRPPXRN, SEQ ID NO: 17) y el subclon 2-8 (K20XWXXPPXKFFSPX, SEQ ID NO: 18) anteriores también se examinaron para determinar su capacidad para dirigirse al tejido hepático, pulmonar y renal, con los resultados que se ven en la Figura 3B. De acuerdo con los resultados mostrados en las Figs. 2A y 2B, tanto las bibliotecas T7NLi como T7NLu fueron altamente selectivas para unirse al tejido hepático.

Ejemplo 2: Unión del fago hepático T7 al hígado en ratones con mutaciones en el receptor inmunitario

Se secuenciaron los insertos en el fago de 10 bibliotecas de cada uno de los grupos T7NLi seleccionados. Uno de estos, designado subclon 2-2 (KKKKKKSWRPPXRN, SEQ ID NO: 17 se seleccionó como un fago de direccionamiento de hígado representativo. El fago se inyectó en ratones normales y TLR4 (-/-) que fueron no tratados o tratados con LPS durante cuatro horas antes de la inyección del fago. Los ratones TLR4 (-/-) son deficientes en el receptor 4 tipo Toll (TLR4), un receptor que induce la liberación de citocinas proinflamatorias críticas que son necesarias para activar potentes respuestas inmunitarias. Los resultados del estudio, graficados en la Fig. 4A, muestran una unión significativamente mayor del subclon 2-2 T7NLi al hígado de animales TLR4 estimulados con LPS (-/-), lo que indica que en ausencia de t LR4, otros receptores son aumentados por LPS. Puesto que están involucrados en la inmunidad innata, los receptores aumentados pueden unirse a los fagos que se dirigen al hígado, como sugieren los datos.

La capacidad del subclon 2-2 de T7NLi también se investigó en ratones normales (C57) y MyD88 (-/-). El alelo deficiente Myd88 codifica una deleción del exón 3 del locus 88 del gen de respuesta primaria de diferenciación mieloide. La deficiencia de Myd88 se asocia con una serie de anomalías del sistema inmunitario, así como con anomalías del sistema hematopoyético, de señales moleculares y apoptóticas. Los niveles del clon 2-2 que se une al hígado, pulmones y riñón en ratones normales y MyD88 (-/-) se muestran en la Fig. 4B. Como se desprende de los resultados, los ratones MyD88 sobreproducen un receptor u otra proteína de unión reconocida por el subclon 2-2.

Ejemplo 3: Bloqueo del reclutamiento de neutrófilos al hígado con péptidos seleccionados

El siguiente estudio examinó la capacidad de diversos péptidos de la biblioteca T7NLi para bloquear el reclutamiento de neutrófilos en el hígado. En estos estudios, se obtuvieron imágenes del hígado mediante microscopía intravital, lo que permitió observaciones en tiempo real del flujo de neutrófilos a través de la vasculatura hepática. Los péptidos de fago que se examinaron fueron (1) la biblioteca T7NLu completa (3X seleccionada), (2) la biblioteca T7NLi completa (4X seleccionada) y (3) una mezcla 50:50 de subclones 2-2 y 2-8 anteriores.

En cada estudio, a un ratón C57 se le administró una inyección en la vena de la cola del fago, y 5 minutos más tarde se anestesió al animal y se grabó el video del hígado, donde los ratones no fueron tratados o recibieron 0.5 mg/kg de LPS IP 4 horas antes de la inyección de fago. Los órganos se extrajeron posteriormente sin perfusión. Una comprobación del direccionamiento en los órganos seleccionados fue coherente con los resultados anteriores: todas las tres muestras de fagos que se seleccionaron se concentraron en el hígado. Sorprendentemente, la biblioteca T7NLu mostró niveles más altos de unión al hígado que la biblioteca T7NLi.

En los análisis de video del reclutamiento de neutrófilos en el hígado mediante microscopía intravital, se midieron los siguientes parámetros:

Velocidad de rodamiento en vénulas post sinusoidales;

Flujo de rodamiento (número de neutrófilos que pasan una línea trazada a través de una sinusoide en un minuto) Número de neutrófilos adheridos en un segmento de 100um de una vénula post sinusoidal Número de neutrófilos adheridos en las sinusoides en un campo de visión; y

% Perfusión de sinusoides: medida del daño hepático.

La Figura 5A muestra el número de neutrófilos en la sangre periférica, es decir que no se reclutan en los pulmones o el hígado. El solo LPS provocó una caída sustancial de los neutrófilos circulantes, lo que sugiere un mayor reclutamiento por los pulmones y el hígado. Este efecto se eliminó en gran medida en los animales que recibieron tanto LPS como la biblioteca TN7Lu.

Las mediciones de flujo de rodamiento, que se muestran en la Figura 5B, muestran que las bibliotecas TN7Li y TN7Lu reducen significativamente el flujo de neutrófilos dentro de una sinusoide hepática, lo que indica un menor reclutamiento en las sinusoides.

El aumento de la adhesión de neutrófilos a una vénula postsinusoidal, que se muestra en la Fig.6A, es probablemente causado por LPS (un contaminante por haber hecho crecer el fago en huéspedes bacterianos) presente en ambas bibliotecas TN7Li T7NLu, lo que indica que la cantidad de LPS administrada a los ratones fue más alto de lo previsto y varió dependiendo de la preparación de fago utilizada. Esto sugiere que la capacidad del fago para inhibir el reclutamiento en las sinusoides no se ve obstaculizada por una dosis más alta de LPS.

El porcentaje de perfusión es una medida de la cantidad de flujo sanguíneo presente en el hígado. El reclutamiento de neutrófilos disminuye la perfusión, lo que produce daño hepático. La biblioteca T7NLu mejoró significativamente la perfusión del hígado a pesar de la aplicación de LPS (Fig. 6B), lo que indica una protección sustancial contra el daño hepático relacionado con los neutrófilos.

Ejemplo 4: Evaluación del reclutamiento de neutrófilos a los pulmones

Debido a que no se disponía de imágenes intravitales de los pulmones, la evaluación del reclutamiento de neutrófilos a los pulmones se realizó midiendo la mieloperoxidasa, una enzima de los neutrófilos presente en el tejido pulmonar. Como se ve a partir de los datos de la Fig. 7, no parece haber ninguna reducción de neutrófilos con las dos bibliotecas de fagos utilizadas. Los aumentos observados pueden deberse al LPS adicional presente en las preparaciones de fagos.

Ejemplo 5: Selección de clones de fagos eficaces para bloquear el reclutamiento de neutrófilos

Se homogeneizaron los pulmones y los hígados de un ratón inyectado con la biblioteca T7NLu y se recuperó el fago dentro de ellos, creando dos nuevas bibliotecas:

T7N Pulmón ^ Pulmón

T7N Pulmón ^ Hígado

Estos se probaron para determinar su capacidad para bloquear el reclutamiento de neutrófilos, con los resultados mostrados en la Figura 8. El fago seleccionado de pulmón que pasó por una ronda de selección de hígado pareció contener fagos que fueron eficaces para inhibir la adhesión de neutrófilos específicamente al endotelio de las sinusoides hepáticas. Se seleccionaron al azar clones de un solo fago de cada una de estas bibliotecas y se cultivaron para secuenciarlos para intentar identificar secuencias de genes humanos conocidos. Cuatro de los clones se identificaron como (1) producto fuera del marco del gen Ube2n; (2) producto fuera del marco del gen para la clatrina; y (3) producto fuera de marco para el gen de la hemoglobulina.

Otras 24 placas se volvieron a amplificar, se volvieron a sembrar y se volvieron a secuenciar, y las secuencias se emparejaron con los siguientes genes humanos conocidos: Mkrnl (8 subclones); Espermidina N1-acetil transferasa; Sl0oa9 (2 subclones); Ube2n (2 subclones); Ngp (3 subclones); Rp134; Chrm 17; Lilrb3; Dnaja2; Hbb-b1; Hba-a1 (2 subclones).

Dado que Ube2n está en el grupo que originalmente bloqueó la adhesión de neutrófilos en las sinusoides hepáticas, se probó contra un fago que solo mostraba un aminoácido alanina (A-Stop) y LPS solo. La figura 9 muestra la unión relativa de neutrófilos al hígado con estos tres tratamientos. A partir de este estudio, el péptido codificado por la secuencia fuera de marco de Ube2n se identificó como un subclon de fago que puede inhibir la adhesión de neutrófilos a las sinusoides hepáticas después de la inflamación inducida por LPS. El péptido traducido tiene la secuencia LSALTPSPSWLKYKAL (SEQ ID NO: 1), también designado como péptido "LSALT".

Ejemplo 6: Evaluación de la eficacia del péptido en la metástasis de células de osteosarcoma humano 143B en un modelo de ratón para metástasis

Se inyectaron 5 x 105 células de osteosarcoma humano 143B, que expresan de manera estable luciferasa, en la vena de la cola de animales 5 minutos después de la administración intravenosa de péptidos PBS o LSALT. Los animales se sacrificaron después de 3 semanas. A continuación, se recolectaron los pulmones, se fijaron en formalina y se incluyeron en parafina. La figura 15A muestra secciones histológicas representativas de los lóbulos del pulmón derecho de los animales. Las lesiones metastásicas se visualizaron teñiendo células de osteosarcoma 143B humano con nucleolina antihumana (marrón). La figura 15B proporciona un gráfico que muestra la cuantificación del número de lesiones metastásicas para todos los lóbulos de los pulmones derecho e izquierdo en cinco secciones histológicas no secuenciales. PBS n = 4. Péptidos LSALT n = 6.

En un modelo similar, se inyectaron 5 x 105 células de osteosarcoma humano 143B, que expresan establemente luciferasa, en la vena de la cola de animales 5 minutos después de la administración intravenosa de péptidos PBS o LSALT. Se obtuvieron imágenes de los animales semanalmente usando imágenes de bioluminiscencia (Xenogen, IVIS 200).

La figura 16A muestra imágenes de bioluminiscencia de animales 3 semanas después de la inyección (tiempo de exposición de 30 segundos). La Figura 16B proporciona un gráfico que muestra la cuantificación de la actividad de luciferasa (carga metastásica) en animales en A. PBS n = 4. Péptidos LSALT n = 6.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un péptido aislado que reduce el reclutamiento de leucocitos seleccionados de

(i) un péptido aislado que comprende la SEQ ID NO: 1,

(ii) el péptido aislado de (i), en el que el péptido se modifica mediante pegilación, acetilación, glicosilación, biotinilación, o sustitución de uno o más L-aminoácidos con el mismo tipo de D-aminoácidos, y

(iii) el péptido aislado de (i), en el que el péptido comprende uno o más residuos de aminoácidos modificados o análogos de aminoácidos,

en el que los residuos de aminoácidos modificados se modifican mediante metilación, amidación, o acetilación, y en el que los análogos de aminoácidos se seleccionan entre p-alanina, norvalina, norleucina, ácido 4-aminobutírico, ornitina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, ácido cisteico, ciclohexilalanina, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 6-aminohexanoico, t-butilglicina, fenilglicina, o-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, y 3-metilhistidina.

2. El péptido aislado de la reivindicación 1 que comprende además 1, 2, 3, 4, o 5 residuos de aminoácidos en el extremo N-terminal y/o C-terminal de la secuencia LSALTPSPSWLKYKAL, en el que dichos residuos de aminoácidos comprenden opcionalmente uno o más residuos de aminoácidos modificados o análogos de aminoácidos, en el que los residuos de aminoácidos modificados se modifican mediante metilación, amidación, o acetilación, y en el que los análogos de aminoácidos se seleccionan entre p-alanina, norvalina, norleucina, ácido 4-aminobutírico, ornitina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, ácido cisteico, ciclohexilalanina, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 6-aminohexanoico, t-butilglicina, fenilglicina, o-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, y 3-metilhistidina.

3. El péptido aislado de la reivindicación 1 en comunicación con un virus fago.

4. Una composición farmacéutica que comprende un péptido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

5. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, en la que el vehículo se selecciona de agua, solución salina, solución salina regulada con fosfato, solución de Ringer, solución de dextrosa, soluciones que contienen suero, solución de Hank, aceites, ésteres y glicoles.

6. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, en la que la composición farmacéutica es adecuada para administración parenteral o intravenosa.

7. El péptido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en el tratamiento de una enfermedad mediada por el reclutamiento de leucocitos mediante la reducción del reclutamiento de leucocitos.

8. El péptido aislado para uso de la reivindicación 7, en el que el péptido aislado o una variante del mismo se administrará en una dosis que se encuentra entre 0.01 mg/kg y 100 mg/kg.

9. El péptido aislado para uso de la reivindicación 7, en el que la enfermedad mediada por el reclutamiento de leucocitos es metástasis tumoral.

10. El péptido aislado para uso de la la reivindicación 7, en el que el péptido aislado reduce o inhibe la metástasis tumoral en comparación con la metástasis tumoral en ausencia de tratamiento.

11. El péptido aislado para uso de la reivindicación 7, en el que la enfermedad mediada por el reclutamiento de leucocitos es la sepsis, y en el que la sepsis está causada preferiblemente por una infección bacteriana, viral, fúngica o parasitaria.