ES2644554T3 - Péptidos cíclicos con actividad antiangiogénica y antineoplásica - Google Patents

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Glay Chinea Santiago
Eduardo Martínez Díaz
Hilda Elisa GARAY PÉREZ
Osvaldo Reyes Acosta
Ernesto LÓPEZ MOLA
Cruz Matilde LÓPEZ ABAD
Sonia Gonzalez Blanco
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Abstract

La presente invención se refiere a péptidos cíclicos con propiedades antitumorales y antiangiogénicas, así como a sus sales farmacéuticamente aceptables y a las composiciones farmacéuticas que los contienen. Estos péptidos cíclicos se emplean en la preparación de medicamentos para la terapéutica humana y/o veterinaria, y también pueden emplearse en el diagnóstico. Estos compuestos pueden ser usados para detectar, monitorear y/o controlar una variedad de desórdenes relacionados con la proliferación celular, tales como las enfermedades oncológicas y la angiogénesis no deseada. Además, pueden formar parte de sistemas de liberación controlada y en el campo de la nanobiotecnología, ya sea por su capacidad de autoensamblaje o como parte de otros sistemas.

Description

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DESCRIPCION
Peptidos dclicos con actividad antiangiogenica y antineoplasica Campo tecnico
La presente invencion se refiere al campo de la biotecnologfa e industria farmaceutica, mas precisamente con el diseno y obtencion de peptidos dclicos destinados para diagnostico y terapia de enfermedades oncologicas, o cualquier otra patologfa que implique proliferacion celular indeseada.
Antecedente de la invencion
El cancer es una enfermedad caracterizada por el crecimiento y division celular no controlada. Las celulas cancengenas obtienen la capacidad de invadir el organo de origen, de viajar por la dispersarse a traves del torrente sangumeo y la linfa hasta organos distales y establecerse y crecer en ellos. Es decir, un proceso altamente heterogeneo, pero comun para mas de 200 tipos de cancer, de evolucion bastante variada. Diversos genes han estado simultaneamente alterados para desarrollar la enfermedad. Todas estas propiedades aumentan la complejidad para estudiary develar los mecanismos de neoplasias malignas, por lo tanto, la investigacion del cancer es un campo amplio y multidisciplinario e implica diversas lmeas de investigacion. Significativamente esta enfermedad es la segunda causa de muerte a nivel mundial y se espera que sea la primera para el ano 2020, incluso mas letal que las enfermedades cardiovasculares (Forteza F (2004) Avances medicos de Cuba. 40:33).
De hecho, el cancer es la primera causa de muerte en pafses desarrollados y la segunda causa de muerte en pafses en desarrollo (Organizacion Mundial de la Salud. The Global Burden of Disease: 2004 Update. Ginebra: Organizacion Mundial de la Salud; 2008). Su incidencia esta aumentando en los ultimos anos debido al aumento de la poblacion envejecida, e incluso mas frecuentemente, debido a la inactividad ffsica, estilos de vida propensos al cancer, fumar, y dietas “occidentales”. Hubo estimaciones en GLOBOCAN 2008 de 12.7 millones de pacientes que viven con cancer y 7.6 millones de muertes en el 2008; de ellos, el 56% de los pacientes y el 64% de las muertes ocurrieron en pafses en desarrollo (Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers cD, Parkin D. GLOBOCAN 2008, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC Cancer Base No, 10. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer; disponible en:
http://globocan.iarc.fr. 2010. Revisado 8/17/2010).
La supervivencia del cancer tiende a ser bastante menor en pafses en desarrollo, probablemente debido a diagnostico tardfo combinado y acceso limitado al tratamiento adecuado y oportuno. Independiente de los farmacos citotoxicos ya disponibles y que son optimizados para el tratamiento del cancer, se requieren nuevas moleculas biologicas para crear una nueva generacion de medicamentos contra el cancer, mas eficaces y mas seguros en un futuro cercano, y capaces de permear significativamente el mercado de terapeuticos contra el cancer.
Actualmente, se ha aceptado ampliamente que para ser un tratamiento efectivo contra el cancer se tiene que combinar diferentes principios de accion, tal como: accion directa sobre celulas tumorales y efecto en el entorno del tumor. Esto se puede lograr al combinar moleculas por separado que cada una tiene estas propiedades, o que muestran simultaneamente ambas. Indudablemente, este ultimo tipo de moleculas es ventajoso en razon a los puntos de vista farmacologicos y economicos. Ensayos preclmicos con inhibidores de angiogenia destinados a interrumpir el suministro de nutrientes y oxfgeno al tumor han mostrado resultados promisorios, que se alcanzan frecuentemente regresion completa o parcial del tumor en ausencia de resistencia contra el inhibidor. Hasta ahora, el mayor alcance en ensayos clmicos ha sido la compensacion sostenida de la enfermedad durante un penodo de tiempo dado. Para ese proposito, agentes anti- angiogenicos estan siendo utilizados como terapia adyuvante para otros antitumorales en combinacion.
Los resultados de ensayos clmicos han mostrado que la inhibicion individual de moduladores de angiogenia es insuficiente para una respuesta inhibidora sostenida. Existe una creciente demanda de agentes anti-angiogenicos mas efectivos capaces de detener y tambien revertir el crecimiento del tumor, con el fin de alcanzar un aumento significativo en la vida del paciente y la calidad de vida cuando se compara con tratamientos establecidos.
Los peptidos actualmente disponibles representan una pequena fraccion entre la minada de agentes que se utilizan para propositos terapeuticos. De hecho, el potencial de los peptidos esta siendo mejorando con la ayuda de nuevas tecnologfas para modificar su estructura, farmacocinetica, biodistribucion, estabilidad y aplicaciones preclmicas. Particularmente, han ganado importancia en la terapia contra el cancer debido a las tecnologfas novedosas disponibles para modificarlos y aumentar su eficacia antineoplasica (Li, Zhi J.; Cho, Chi H. Current Pharmaceutical Design, 16 (10), April 2010, pp. 11801189).
Se han realizado diversos estudios donde demuestran la factibilidad de utilizar peptidos para terapia y diagnostico de cancer. Algunos de ellos estan en fase avanzada de desarrollo clmico, y estan surgiendo otras nuevas generaciones en los ultimos anos, con resultados preclmicos promisorios.
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La actividad citotoxica de un peptido lttico disenado para unir el receptor del factor de crecimiento epidermoide se demostro en diversas estirpes de celulas neoplasicas humanas. Se evidencio que los cambios conformacionales surgen de unir el peptido lttico que aumenta su selectividad para asociacion a la membrana de las celulas neoplasicas, y esta accion sinergica adquirida resulta en una destruccion selectiva de las celulas tumorales. El tratamiento con el peptido lttico que une el receptor del factor de crecimiento epidermico exhibe actividad citotoxica in vitro contra celulas neoplasicas que son resistentes a inhibidores tirosina quinasa con mutaciones de k-Ras (Kohno, Masayuki. Revista Europea de cancer 47(5), pag. 773, Mar 2011).
Los peptidos que penetran la celula se acoplan comunmente a oligonucleotidos para aumentar su efectividad en terapia antineoplasica. Para este proposito, los peptidos que penetran las celulas han sido disenados para que comprendan un peptido glutamato ligado al terminal N del Oct6 nLs, que demuestra la colocalizacion en el nucleo celular, y tambien su absorcion por estirpes de celulas neoplasicas de prostata y pancreaticas (Lewis, H Dan. BMC Biotechnology, 10(1), p. 79, Oct 2010).
Un fragmento del peptido del inhibidor de ruta del factor tisular (TFPI), que es una protema anticoagulante natural, que es capaz de bloquear la angiogenia y el crecimiento tumoral en modelos in vitro. Mas aun, inhibe la metastasis tumoral y el crecimiento de nuevos vasos sangumeos sin efecto evidente en los normales (HEMBROUGH Todd A.; RUIZ Jose F.; SWERDLOW Bonnie M.; SWARTZ Glenn M.; HAMMERS Hans J.; ZHANG Li; PLUM Stacy M.; WILLIAMS Mark S.; STRICKLAND Dudley K.; PRIBLUDA Victor S. Blood A. 2004, vol. 103, No. 9, pp. 3374-3380).
El desarrollo de mas agentes selectivos para formacion de imagenes y tratamiento de diferentes tumores es la tendencia actual en el diagnostico y terapia contra el cancer. En este sentido, los peptidos son secuencias pequenas de aminoacidos que pueden ser obtenidas o disenadas para unirse a un objetivo molecular predeterminado, y son potencialmente capaces de interferir con su funcion. Estos peptidos espedficos pueden inhibir componentes de senales espedficas esenciales para la progresion y desarrollo del cancer.
La serralisina es la principal protema extracelular de bacterias Serratia marcescens CMIB4202 y se asocia con la patogenicidad de este microorganismo en humanos, con propiedades antitumorales atribuidas dependientes de su actividad catalttica (Wu Jun, T de Akaike, Elfa K, et al., (2001) Japanese J. Cancer res. 92:439-451). En esta cepa (S. marcescens CMIB4202), la mayona de protemas extracelulares abundantes es la protema p50, que pertenece a la familia de Serralysins (SERMA). Se sabe que el polipeptido que comprende el dominio no catalttico del terminal C de esta serralisins (denominado p25) es un potente inhibidor de proliferacion endotelial y crecimiento de tumores primarios y metastasis in vivo ((Abrahantes-Perez MC et al., “Pharmaceutical composition containing polypeptide fragments of serralysins”. Solicitud de patente internacional No. WO 2006/005268). Este polipeptido se denomina CIGB370r cuando se expresa recombinante en Escherichia coli.
Subsiste una gran demanda para identificar y obtener agentes antitumorales mas potentes debido al aumento de la incidencia de esta enfermedad, para reemplazar o complementar la terapia antineoplasica actual en aquellos pacientes que requieren, a pesar de multiples farmacos disponibles para ese proposito.
Descripcion detallada de la invencion
Esta invencion contribuye a resolver los problemas mencionados anteriormente, al proporcionar peptidos dclicos con propiedades antitumorales y antiangiogenicas. Aqrn, el diseno y generacion de estos compuestos de peptidos se dirigen demostrando tambien su eficacia en diversos modelos de animales con cancer.
Sorprendentemente, la actividad antineoplasica del polipeptido S. marcescens p25 se reprodujo mediante un fragmento de peptido estructuralmente restringido que fue escasamente expuesto en la interfaz entre los dominios del terminal N y C de Serralisina. Esto sugiere que la conformacion estructural en esa region del polipeptido fue la unidad estructural funcionalmente activa minima del polipeptido p25, oculto en la Serralisina y que probablemente se expone durante la autocatalisis de la protema o una vez en el entorno proteolftica del tumor. Los datos mostraron que los peptidos restringidos de la presente invencion poseen actividad citotoxica en celulas neoplasicas y actividad antiangiogenica y sugieren un posible mecanismo y un nuevo paradigma para regresion neoplasica mediada por infeccion.
Los peptidos son moleculas muy flexibles y, como tal, pueden adoptar diferentes estructuras. Uno o mas de aquellas estructuras posibles puede ser de importancia biologica espedfica. Para determinar las posibles conformaciones pertinentes, es necesario restringir los peptidos en una unica region del espacio conformacional, determinando adicionalmente si esa es la forma pertinente. Finalmente, al seleccionar diversas de aquellas conformaciones, es posible encontrar conformaciones biologicamente pertinentes.
Existen metodologfas novedosas para crear estructuras sinteticas mas precisas. Se debe tomar en consideracion determinada flexibilidad. Es decir, si la estructura disenada es muy ngida, se puede adoptar otra estructura con las propiedades que desea para su actividad biologica in vivo, considerando que una estructura ligeramente flexible es capaz de ese ajuste. Dicho conocimiento valioso sobre los requisitos que son suficientes para receptores de peptidos, sitios activos de enzimas y una gran variedad de procesos biologicos se proporciona mediante la utilizacion de metodologfas y tecnicas adecuadas para disenar peptidos sinteticos.
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Las propiedades exhibidas por un peptido en los sistemas biologicos dependen de la estructura del peptido. Por lo tanto, la capacidad de utilizar diseno racional para generar peptidos utiles depende de las habilidades respectivas para establecer las relaciones espedficas entre la estructura molecular y su actividad biologica. Las habilidades para reconocer dichas relaciones estan respaldadas por diversas incertidumbres, que surgen no solamente de sistemas de ensayo biologicos, sino tambien de interpretacion de datos. El factor mas complejo involucrado es la dificultad en determinar la estructura tridimensional del peptido propiamente dicho. Muchos peptidos son inherentemente flexibles y asumen un amplio rango de conformaciones en solucion. El problema reside en detectar cual entre todas las posibles conformaciones posibles es la responsable de la actividad del peptido observados, con muchos peptidos que han sido activos en mas de una conformacion. El uso de restricciones conformacionales ha sido util para aclarar dichas relaciones de funcion y estructura. Si el peptido se restringe a una conformacion muy particular o a una semejanza muy cercana a la familia de conformaciones activas, entonces la actividad medida representa directamente el efecto de esa estructura. Incluso cuando una molecula absolutamente ngida es imposible de ser obtenida, se puede empezar en atribuir determinadas actividades biologicas a sus estructuras causales al designar los analogos, con los motivos estructurales prescritos.
Se describe aqrn el mapeo ffsico de sitios funcionales dentro de la secuencia de la protema p50/p25 al utilizar peptidos sinteticos de 20 aa. sobrepuestos en 10 y la busqueda adicional para actividad citotoxica in vitro en las celulas de tumor (vease ejemplo 2) que indica que el peptido Gly255-Ser274 (N06P87) es activo. No obstante, la actividad in vivo de este peptido fue menor que aquella visualizada por la protema p25. Adicionalmente, la sustitucion del segmento Gly266- Asp268 por el tripeptido Ala-Ala-Ala tanto en el polipeptido recombinante CIGB370r similar a p25 como en el peptido sintetico N06P87 abolieron la actividad biologica en ambas moleculas, lo que indica que este segmento es esencial para la actividad antineoplasica. Mas aun, este resultado sugiere que se requieren una o mas cadenas laterales en los residuos Arg267 y Asp268 para la interaccion con los receptores, aun por identificar, a pesar de un efecto negativo posible de la mutacion triple en el respectivo peptido y las conformaciones de protemas biologicamente activas. En este sentido, si de asume que la estructura local, biologicamente pertinente del tripeptido es similar aquella de la estructura p50 cristalografica, entonces la sustitucion de Gly266 per Ala es altamente desfavorable, en razon a que la cadena principal de este residuo adopta angulos de torsion positivos prohibitivos para el aminoacido alanina (Figura 14). Adicionalmente, los resultados mostrados en el ejemplo 2 evidencia que la presencia del fragmento Gly266-Asp268 es insuficiente per se para alcanzar el efecto biologico y otros residuos que tambien se requieren. Como se muestra en la tabla 2, el peptido F07P16sintetico, que comprende la secuencia Thr265-Trp284 y se sobreponen en 10 residuos con el peptido N06P87lineal (Gly255-Ser274), es inactivo, a pesar de llevar la secuencia de Gly266-Asp268.
Se describe aqrn, la sorprendente identificacion del Gly255-Ser274 como parte de un sitio funcional responsable para la actividad antineoplasica del p50/p25, debido a la naturaleza cnptica de ese segmento dentro de la estructura 3D de la protema p50. La mayona de aminoacidos en el segmento de Gly255-Ser274 son completamente o parcialmente ocluidos dentro de la estructura 3D de la protema p50, que incluye los residuos Thr257, Tyr258, Gly259, Phe260, Thr265, Arg267, Phe269, Leu270 y Thr272. El cambio Arg267-Leu270 hace parte de la superficie de interfaz entre los dominios de terminal N- y C- de la protema. Los residuos Arg267 y Asp268 forman puentes de sal (dobles puentes de hidrogeno cada uno) con los residuos Asp98 y Arg171de dominio de terminal N, respectivamente. La interface tambien comprende las interacciones inter-dominios hidrofobas que implican el residuo Phe269 en el dominio de terminal C y los residuos Ala232 y Ala233 en el dominio de terminal N. Adicionalmente, la naturaleza cnptica del sitio es consistente con la mayor potencia de la protema p25 en comparacion con aquella de p50, en razon a que el p25 carece del dominio del terminal N y su segmento Gly255- Ser274 se expone mas (vease el ejemplo 3, figura 5 y tabla 3).
Se evidencia que la conformacion del peptido N06P87 es esencial por su actividad biologica. La relevancia de la conformacion del peptido de N03P87 sobre su actividad biologica esta apoyada por los resultados mostrados en el ejemplo 4, que muestran que su actividad depende de las regiones de flanqueo que garantizan el plegado adecuado de la molecula. De otra parte, el polipeptido p25 no muestra actividad cuando se expresa recombinante y despues de renaturalizacion en ausencia de calcio. Por lo tanto, las preparaciones reveladas corresponden a polipeptidos que carecen de atomos de calcio que no tienen actividad (se requiere union de calcio para el plegamiento y estabilizacion adecuada de la protema). Adicionalmente en el ejemplo 4, se muestra que la introduccion de un puente de disulfuro en el peptido N06P87-al agregar un residuo de cistema de terminal N y otro en el terminal C- promueve la perdida de actividad biologica del peptido (peptido N06P89 en la tabla 4, Figura 7). La cristalizacion introducida por estos medios reduce el espacio conformacional accesible por el peptido en la solucion; no obstante, cristalizacion es incompatible con la conformacion adoptada por el segmento Gly255-Ser274 en la estructura p50 plegada. La distancia entre el terminal amina y carboxilo del segmento Gly255-Ser274 en la estructura cristalografica de la protema es 24.4 A de largo (figura 10E), que es incompatible con la estereoqmmica de puentes de disulfuro (distancia alfa carbono-alfa carbono acoplada entre cistemas nunca es mayor a 7 A). Esta modificacion, por lo tanto, presupone una alteracion significativa en las propiedades estructurales de la cadena de peptido en N06P87. Estos resultados y sus analisis respectivos sugieren que la conformacion activa N06P87 puede ser similar a aquella del segmento Gly255-Ser274 en el polipeptido p25 natural.
Como se muestra en los ejemplos 2, 4 y 6, es factible disenar analogos del peptido que se asemeja a la actividad biologica del polipeptido p25. En esta invencion se presenta el diseno de una familia de peptidos de tamano medio y corto potentes (9 a 25 residuos de largo) con base en la estructura del peptido N06P87 y modificado por medio de introducir/sustituir determinados grupos qmmicos y/o restricciones estructurales (SEQ ID no. 1-76), que permiten que estos peptidos mostrar valores de potencia y eficacia similares o incluso mejores que aquellos del polipeptido p25.
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A pesar de su potencia y eficacia, los peptidos de tamano medio y de la presente invencion tienen diversas ventajas como agentes antineoplasicos comparados con las protemas completas naturales. En general, el tamano de la molecula influencia las propiedades farmacocineticas de los antineoplasicos (tal como biodistribucion). Ejemplos bien documentados son anticuerpos de cadena sencilla recombinante (r-sc-Fv) cuando se compara con sus anticuerpos respectivos, el anterior visualiza mejor el acceso a tejidos y tumores, difmilmente accesibles a los anticuerpos completos (Retamozo Cortez V, N Backmann, Senter PD, Wernery U, De Baetselier P, Muyldermans S, Revets H; (2004). cancer res. 64(8):2853-7).
Las terapias de anticuerpos han tenido un impacto particularmente limitado sobre el tratamiento de tumores solidos (Stern M, Herrmann R; (2005). Crit Rev Oncol Hematol.54(1): 11-29). En general, las evidencias experimentales indican que las propiedades farmacocineticas del ligando se mejoran al reducir su tamano (Reilly R. M., J. Sandhu, Alvarez-Diez T.M., et al (1995). Clin. Pharmacokinet. 28: 126142). Los peptidos de tamano mediano y corto (normalmente 1 a 3 kDa) pueden superar por lo menos en parte las complicaciones enfrentadas con las terapias antineoplasicas mediadas por anticuerpos (Ladner R. C., Sato A. K., Gorzelany J., de Souza M. (2004). Drug Discov. Today 9: 525529). Particularmente, los peptidos pueden visualizar una mejor penetracion tumoral, menor captacion inespedfica y provocar una menor respuesta inmunitaria. Por lotanto, los peptidos de la presente invencion se disenan para optimizacion interesada con su receptor y garantizan significativamente una biodistribucion eficiente.
Usualmente, los peptidos de tamano medio y corto de hasta 20-25 residuos de largo son pobremente inmunogenicos, a diferencia de las protemas heterologas y especialmente para antigenos derivados de microorganismos como p25. El uso de dichas protemas como agentes terapeuticos puede generar una respuesta inmunitaria en pacientes, seguidos por la induccion de anticuerpos que pueden neutralizar el efecto terapeutico de la protema. Este efecto es particularmente importante para el tratamiento de enfermedades cronicas que requieren el uso repetido de agentes terapeuticos. De otra parte, si el microorganismo es un patogeno para humanos, es posible que una fraccion de la poblacion haya desarrollado anticuerpos neutralizantes, que, preexistente al tratamiento, pueden aumentar la dosis terapeutica requerida. A este aspecto, en razon a que una parte significativa de la superficie molecular del segmento Gly255-Ser274 esta comprometida dentro de la interfaz entre los dominios de terminal C y N de la protema p50 y por lo tanto cnptico en la estructura natural de la protema. Por consiguiente, el peptido N06P87 resultante es potencialmente pobremente inmunogenico, es decir, que los anticuerpos de la protema anti-p50 son ineficientes en reconocer (neutralizar) el peptido N06P87. Por lo tanto y con respecto al potencial antigenico/inmunogenico de la molecula terapeutica, es mas favorable utilizar peptidos en lugar de protemas completas, especialmente cuando los peptidos son capaces de promover un efecto biologico similar a la de la protema natural.
Un aspecto esencial para disenar agentes antineoplasicos potentes en la presente invencion comprende el diseno de peptidos dclicos, es decir, tienen aminoacidos acoplados por enlaces covalentes que implican grupos qrnmicos ubicados en las cadenas laterales y/o grupos en el terminal N y C. Por lo tanto, los peptidos disenados aqrn estan estructuralmente restringidos por medio de ciclizacion que reduce la flexibilidad estructural de estas moleculas. Comunmente, el uso de peptidos como agentes terapeuticos impone algunas desventajas. Es decir, el caso de flexibilidad intrmseca de peptidos, especialmente aquellos de tamano medio y corto que son mas flexibles que las protemas plegadas, y por lo tanto, su proceso de union a las protemas u otras moleculas receptoras implica una perdida significativa de la entropfa conformacional. Este hecho contribuye a que estas moleculas tengan como regla una menor afinidad de union que aquella de la interaccion de protema-protema. La menor afinidad exhibida por peptidos (y por consiguiente, menor potencia) tambien se puede asociar al hecho de que la superficie de contacto protema- receptor es mas pequena en comparacion con las interfaces protema-receptor, particularmente cuando los peptidos comprenden un fragmento de la protema natural. Por estas razones, se requiere un rediseno y modificacion qrnmica de peptidos para aumentar su afinidad para union del receptor (y por consiguiente, potencia). Se identifico anteriormente un polipeptido derivado de un modelo de regresion de tumor mediado por infeccion que se denomina p25, que mostro efecto directo y antiangiogenico en celulas tumorales (solicitud de patente internacional WO 2006/005268). En la presente invencion, se desarrollo una plataforma basada en peptidos que imitan el motivo activado del polipeptido p25 y que muestran diversas mejoras en comparacion con la molecula de origen. El polipeptido natural, bacteriano en origen, se puede aplicar solamente a una serie limitada de veces para tratar cancer, debido a la induccion potencial de respuesta inmunitaria que puede neutralizar su actividad, impidiendo el tratamiento prolongado requerido en enfermedades cronicas como cancer. Es decir, la razon por la que, en la presente invencion, el campo de investigacion se enfoca en generar moleculas derivadas de regresion de tumor mediado por infeccion y utiles para terapia contra el cancer, al identificar la unidad funcionalmente activa minima en el polipeptido p25 que se asemeja a su actividad antineoplasica, pero incapaz de inducir la respuesta inmunitaria negativa durante la administracion prolongada para terapia oncologica y patologfas de proliferacion celular indeseada. Una contribucion significativa de la presente invencion es la factibilidad de desarrollar moleculas de peptido de hasta 25 aminoacidos, que imitan estructuralmente la unidad activa funcionalmente minima de protemas antineoplasicas derivadas de regresion de tumor mediada por infeccion. Sorprendentemente, estas moleculas pequenas no ejercen sus actividades contra el tumor mediante mecanismos inmune-mediados, ya que anteriormente se considero que era un paradigma para la regresion tumoral mediada por infeccion (Paglia P, y Guzman CA. cancer Immunol. Immunother. 1998. 46:88-92). Como se describe aqrn, aquellas regiones activas no se ubican en la superficie expuesta de protemas bacterianas, pero se hacen superficiales una vez se digiere enzimaticamente la protema. Este proceso puede ocurrir en ambientes de tumores ricos en metaloproteinasa, que originan un fuerte efecto citotoxico contra celulas tumorales y angiogenia asociada a tumor. Esto tambien puede contribuir a la actividad antitumoral potente atribuida anteriormente a la regresion tumoral mediada
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por infeccion, un campo de investigacion que espera moleculas utiles para terapia antineoplasica y capaz de convertirse en productos biotecnologicos novedosos en terapias oncologicas por mas de un siglo. En el documento actual, se demuestra esta hipotesis como valida, en razon a que los peptidos de la presente invencion muestran quetienen eficacia antitumoral in vitro e in vivo, sin evidencia de presencia de anticuerpos neutralizantes que pueden limitar su administracion continua. La tecnologfa utilizada para obtenerlos es escalable. Entre las ventajas de estos peptidos estan:
Amplio espectro de accion en celulas tumorales de diferentes ongenes histologicos.
Accion directa sobre angiogenia de tumor y accion directa contra celulas de tumor.
Mecanismo de accion independiente de p53.
Efecto citotoxico en celulas aisladas de metastasis humana y efecto antimetastasico consecuente.
Induce apoptosis en celulas de tumor y son espedficas para proliferar celulas activadas.
Efecto antitumoral mediante rutas intratumoral o sistemicas. Reduce el mdice de crecimiento en tumores enoinjertados y prolonga la supervivencia de animales que tienen tumores.
Regresion tumoral completa en un grupo de tumores.
Falta detoxicidad durante inyeccion repetida en animales durante un penodo prolongado.
Presenta un volumen de distribucion mayor que aquel de la molecula de origen.
El perfil de biodistribucion soporta tratamiento de tumores malignos de diferentes patologfas.
Tecnologfas de produccion economicamente factibles.
Desarrollo farmaceutico mas rapido y mas factible que aquel de las moleculas obtenidas mediante tecnicas recombinantes.
Se describen aqu peptidos dclicos con actividades antiangiogenicas y antineoplasicas, en el que dichos polipeptidos dclicos se caracterizan por una secuencia de aminoacidos que comprende:
a) un segmento con la secuencia de aminoacidos:
X1- Asn-Thr-X2- Arg-Asp-Phe-X3-X4
En el que,
X1 es un aminoacido seleccionado del grupo que comprende de Ser, Cys, Lys, Asp, Glu y un aminoacido no natural cuya cadena lateral comprende el grupo funcional sulfhidrilo, el grupo amino o un grupo carboxilo; o una secuencia seleccionada del grupo que comprende un tetrapeptido, un pentapeptido y un hexapeptido.
X2 es el aminoacido Gly o D -Ala
X3 es un aminoacido seleccionado del grupo que comprende Leu, Cys, Lys, Asp, Glu y un aminoacido no natural cuya cadena lateral comprende el grupo funcional sulfhidrilo, el grupo amino o el grupo carboxilo
X4 es un aminoacido opcional que se puede seleccionar del grupo que comprende Ser, Cys, Lys, Asp, Glu y un aminoacido no natural cuya cadena lateral comprende el grupo funcional sulfhidrilo, el grupo amino o el grupo carboxilo;
b) Un segmento de terminal N, opcional o antes del segmento descrito en a), con la secuencia de aminoacidos:
X-5- Asp-Thr-Val-X'4-X-3-X-2-X-1
En el que,
X-1 es un aminoacido seleccionado del grupo que comprende ADN, D-Asp, D-Glu, Gln D y D -Ala y ligado por un enlace peptfdico al residuo X1 descrito en a), y dicho enlace peptido comprende el grupo carbonilo en la cadena principal del residuo X1 y el grupo amino de la cadena principal del residuo X1 del segmento descrito en a);
X'2 es un aminoacido seleccionado del grupo que comprende Phe, Cys, Lys, Asp, Glu y un aminoacido no natural cuya cadena lateral comprende el grupo funcional sulfhidrilo, el grupo amino o el grupo carboxilo
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X-3 es un aminoacido seleccionado del grupo que comprende Gly y D-Ala
X-4 es un aminoacido seleccionado del grupo que comprende Tyr, Cys, Lys, Asp, Glu y un aminoacido no natural cuya que cadena lateral comprende el grupo funcional sulfhidrilo, el grupo amino o el grupo carboxilo
X-5 es un aminoacido seleccionado del grupo que comprende Gly y D-Ala
c) Un segmento del terminal C opcional y posterior al segmento descrito en a) cuya secuencia de aminoacidos se selecciona del grupo que comprende Thr-X+1X+2, Thr-X+1- X+2 -X+3 y Thr-X+1-X+2-X+3-X+4
En el que,
El residuo Thr del terminal N en dicho segmento de terminal C se liga al segmento descrito en a) mediante un enlace de peptidos que comprende el grupo amino en la cadena principal de dicho residuo Thr de terminal N y el grupo carbonilo en la cadena principal del residuo X4 del segmento descrito en a) X+1 es un aminoacido seleccionado del grupo que comprende Thr, Gly y Ala X+2 es un aminoacido seleccionado del grupo que comprende Ser, Asn, Cys, Lys, Asp, Glu y un aminoacido no natural que comprende la cadena lateral del grupo funcional sulfhidrilo, el grupo amino o el grupo X+3 carboxilo es un aminoacido seleccionado del grupo que comprende Cys, Gin, Arg, Asn, Lys, Asp, Glu y un aminoacido no natural que comprende en la cadena lateral el grupo funcional sulfhidrilo, el grupo amino o un grupo X+4 carboxilo es un aminoacido seleccionado del grupo que comprende Gin, Arg, Asn y Lys
d) Por lo menos un enlace covalente seleccionado del grupo que comprende un enlace peptido formado por los grupos amino y carbonilo del terminal N y C del peptido que esta presente si la secuencia X1 del segmento descrito en a) es la secuencia de un tetrapeptido, un pentapeptido o un hexapeptido; un puente de disulfuro covalente comprende los grupos sulfhidrilo en la cadena lateral de residuos X1 y X4, o X'4 y X3, o X'2 y X+2 o X'2 y X+3 si dicho X1 y X4 o X'4 y X3, o X'2 y X+2 o X'2 y X+3 son cistemas o un aminoacido no natural cuya cadena lateral comprende el grupo sulfhidrilo; un enlace amida comprende un grupo carbonilo y un grupo amino de las cadenas laterales de residuos X1 y X4, o X'4 y X3, o X'2 y X+2, o X' 2 y X+3 si X1 y X4 o X'4 y X3, o X'2 y X+2 o X'2 y X+3 son Lys (o un aminoacido no natural cuya cadena lateral comprende un grupo amino) y Glu (o Asp o un aminoacido no natural cuya cadena lateral comprende un grupo carbonilo), o dichos residuos son respectivamente Glu (o Asp o un aminoacido no natural cuya cadena lateral comprende un grupo carbonilo) y Lys (o un aminoacido no natural cuya cadena lateral comprende un grupo amino); y un enlace amida que comprende el grupo terminal carbonilo del peptido y un grupo amino en la cadena lateral del residuo X'2 y dicho enlace amida esta presente si X+2 es: el residuo en el terminal carboxilo del peptido, el aminoacido Asn y X'2 es el aminoacido Lys o un aminoacido no natural cuya cadena lateral comprende un grupo amino
En una realizacion, los peptidos dclicos comprenden un enlace de peptido entre los grupos amino y carbonilo del terminal C y terminal N del peptido y la secuencia X1 dichos peptidos es una secuencia de aminoacidos tetrapeptido, preferencialmente la secuencia que se selecciona del grupo que comprende (D-Ser)-Pro-Thr-Pro, (D-Ala)-Pro-Thr-Pro y Gly-Pro-Thr-Pro.
En otra realizacion, dichos peptidos dclicos comprenden un enlace peptfdico entre los grupos amino y carbonilo en los residuos de terminal N y C del peptido y la secuencia X1 de dichos peptidos es una secuencia de aminoacidos pentapeptido, preferiblemente la secuencia se selecciona del grupo que comprende Arg-Arg-Pro-Asn-Ser, Arg-Arg-Pro- (D-Ala)-Ser, Lys-Lys-Pro-Asn-Ser y Lys-Lys-Pro-(D-Ala)-Ser.
En otra realizacion, dichos peptidos dclicos comprenden un enlace peptfdico entre los grupos amino y carbonilo en el terminal C y terminal N del peptido y la secuencia X1 de dichos peptidos tiene una secuencia de aminoacidos hexapeptido, preferencialmente la secuencia se selecciona del grupo que comprende Thr-Pro-(D-Ala)-Gln-Asn-Ser, Arg-Pro-(D-Ala)- Gln-Asn-Ser, Thr-Pro-(D-Ala)-(BmGln)-(NmAsn)-Ser y Arg-Pro-(D-Ala)-(BmGln)-(NmAsn)-Ser, en el que BmGln es el aminoacido L-b-metilglutamina y NmAsn es el aminoacido L-N-metilasparagina.
Se describe aqrn, que los peptidos dclicos pueden tener el terminal N ligado covalentemente al grupo acetil, el aminoacido piroglutamico, a un lfpido o un polfmero, preferiblemente polietilenglicol, y el enlace se puede establecer directamente o a traves un grupo separador, preferiblemente el aminoacido Gly. Mas aun, los peptidos dclicos pueden tener el terminal C en la forma amida, o ligados covalentemente a un lfpido o un polfmero, preferiblemente polietilenglicol y el enlace se establece directamente o a traves de un separador, preferiblemente el aminoacido Gly.
En otra realizacion, los peptidos dclicos pueden comprender un enlace covalente entre el peptido y un lfpido o cualquier polfmero, preferiblemente polietilenglicol, y dicho enlace puede comprender el grupo sulfhidrilo, el grupo amino o el grupo carboxilo en la cadena lateral del residuo X1, X3, X4, X'2, X'4, X+2 o X+3 y dicho residuo X1, X3, X4, X'2, X'4, X+2, o X+3 es el aminoacido Cys, Lys, Asp, Glu o un aminoacido no natural cuya cadena lateral comprende el grupo funcional sulfhidrilo, el grupo amino o el grupo carboxilo.
En otra realizacion, los peptidos dclicos se pueden caracterizar por los residuos X, X3, X4, X'2, X'4, X+2 o X+3 que se seleccionan del grupo que comprende del aminoacido cistema, el acido (2R)-2-amino-3-sulfanilbutanoico, el acido (2R)-
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2-amino-3-metil-3-sulfanilbutanoico, el acido (2S)-2-amino-4-sulfanilbutanoico, el acido 2-amino-5-sulfanilpentanoico, el acido 2-amino-3-sulfanilpentanoico, el acido 2-amino-4-metil-3-sulfanilpentanoico, el acido 2-amino-3-metil-4- sulfanilpentanoico, el acido 2-amino-3,4-dimetil-3-sulfanil-pentanoico, y el acido 2-amino-3-etil-3-sulfanilpentanoico, el acido (2R)-2-amino-3-metil-3-sulfanilpentanoico, el acido (4S)-4-amino-2-metil-5-sulfanilpentanoico, el acido (4R)-4- amino-2-metil-5-sulfanilpentanoico, el acido (4R)-4-amino-5- sulfanilpentanoico, y el acido (4S)-4-amino-5- sulfanilpentanoico.
En otra realizacion, los peptidos dclicos se pueden caracterizar por los residuos X1, X3, X4, X-2, X-4, X+2 o X+3 que se seleccionan del grupo que comprende los aminoacidos Lys, el acido 2-[bis(3-aminopropil)amino] acetico, el acido (2S)- 2,5-diaminopentanoico, el acido 2,2-diaminoacetico, el acido (3S)-3,4-diaminobutanoico, el acido (2R)-2,4- diaminobutanoico, el acido (2S)-2,4-diaminobutanoico, acido (2S)-2,3-diaminopropanoico, el acido (2R)-2,3- diaminopropanoico, el acido 2-[(2-aminoetil)amino] acetico, el acido 2-[(3-aminopropil) amino] acetico, el acido 2-[(4- aminobutil) amino] acetico, el acido (4S)-4,8-diaminooctanoico, el acido (2S)-2-amino-3-(4-aminofenil) propanoico, el acido (2S)-2-amino-3-[4-(2-aminoetoxi)fenil]propanoico, el acido 2-(piperidin-4-ilamino) acetico, el acido (2S)-2-amino-4-[(5R)- 2,2-dimetil-1,3-oxazolidin-5-il] butanoico, el acido (2S)-2-amino-6-(metilamino) hexanoico, el acido (2R,4R)-4- aminopirrolidino-2-carbox^lico o el acido (2R,4S)-4-aminopirrolidino-2-carboxflico, el acido 2-(4-aminopiperidin-4-il) acetico, el acido 4-aminopiperidino-4-carbox^lico, el acido (2S,4R)-4-aminopirrolidino-2-carboxflico y el acido imidazolidino-2-carboxflico.
En otra realizacion, el peptido dclico se puede caracterizar por los residuos X1, X3, X4, X'2, X'4, X+2 o X+3 que se seleccionan del grupo que comprende del aminoacido Glu , Asp, el acido 3-[(carboximetil)amino] propanoico, el acido 2-[(carboximetil) amino] acetico, el acido 3-[(2-carboxietil) amino] propanoico, el acido (3R)-3-aminohexanodioico, el acido 4- aminoheptanodioico, el acido 4-aminopiperidino-1,4-dicarboxflico, el acido (2S,4S)-4-aminopirrolidino-2-carboxflico, el acido 2-[(carboximetil)amino] acetico, el acido (2S)-2-amino-6-[(carboximetil)amino]hexanoico, el acido 3-[(2-carboxietil) amino] propanoico, el acido (2S)-2-aminoheptanodioico, el acido (2S)-2- aminooctanedioico, el acido (2R)-2-amino-3- [(2- carboxietil) sulfanil] propanoico, el acido (2R)-2-amino-3-[(carboximetil) sulfanil] propanoico, el acido 4-{[(2R)-2-amino-2- carboxietil] sulfanil} butanoico y el acido (2S)-2-amino-3-[4-(carboximetoxi) fenil] propanoico.
La invencion proporciona peptidos dclicos como se define en la reivindicacion 1.
El objeto de la presente invencion son los peptidos dclicos como se define en la reivindicacion 1 para uso en el tratamiento de cancer, trastornos relacionados con la proliferacion celular indeseada o angiogenia indeseada.
Otra realizacion comprende un metodo para tratar cancer, trastornos relacionados con proliferacion celular indeseada y angiogenia indeseada, en el que dicho metodo comprende la administracion de una composicion farmaceutica que comprende una cantidad efectiva de por lo menos uno de los peptidos dclicos de la invencion a un individuo que lo necesita. Las composiciones farmaceuticas como se definen en la reivindicacion 5 tambien son objeto de la presente invencion.
La invencion tambien proporciona compuestos para diagnostico de cancer como se define en la reivindicacion 9.
Otro aspecto de la presente invencion comprende una combinacion farmaceutica como se define en reivindicacion 10. En una realizacion de la invencion, en la dicha combinacion el peptido se conjuga directamente con el agente de tratamiento mediante enlaces covalentes. En otros casos, el peptido se conjuga con el agente de tratamiento mediante un agente de acoplamiento.
La invencion tambien comprende una combinacion farmaceutica como se define en la reivindicacion 13. Los elementos que conforman dichas combinaciones se pueden administrar a los individuos que las requieren, dentro del curso de un tratamiento medico, secuencialmente o simultaneamente.
Se debe administrar una serie grande de medicamentos mediante ruta parenteral, por ejemplo: inyeccion intravenosa, ruta intramuscular o subcutanea, para lograr la eficacia terapeutica pretendida. Para algunos terapeuticos, el uso de vetnculos de liberacion controlada puede aumentar la eficacia del farmaco y el grado de satisfaccion del paciente. El autoensamble molecular ha sido explorado recientemente para disenar materiales con ingeniena para encapsulacion o liberacion controlada de terapeuticos. Existe un gran progreso en disenar plataformas de material de auto ensamble basadas en peptidos y polfmeros (Monica C. Branco a, b, Joel P. Schneider. Acta Biomaterialia 5 (2009) 817-831). Algunos de los peptidos de la presente invencion, tal como J08P48 tienen propiedades anfipaticas que le permiten autoensamblarse, y, por lo tanto, ser parte de sistemas de liberacion controlada para moleculas terapeuticas o en el campo de la nanotecnologfa. Por lo tanto, las realizaciones son formulaciones encapsuladas novedosas en la forma de liposomas o microesferas para liberacion controlada de estos peptidos como medicamentos para terapias combinadas contra el cancer. Y tambien los complejos nanoparticulados con sistemas dirigidos controlados para los sitios de diagnostico terapeutico de interes o que ejercen por ellos mismos estas actividades en forma espedfica.
Breve descripcion de las figuras
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Figura 1. Actividad citotoxica del peptido N06P87 en celulas de tumor de diferente origen histologico. A: celulas Colo 205; B: celulas HEp-2. Polipeptido CIGB370ry cisplatina se utilizan como controles positivos de agentes antineoplasicos.
Figura 2. Actividad citotoxica del N06P87 en estirpes A549 (A) de celulas neoplasicas no microcfticas y en estirpes (B) de celulas neoplasicas de colon. Otros peptidos de la coleccion no muestran actividad cuando se evalua su efecto en la proliferacion de la estirpe de celulas A549.
Figura 3. Ensayo para evaluar la actividad de diversos peptidos de la coleccion sujetos a estudio en estirpes M14 (A) y Ls174T (B) de celulas neoplasicas humanas (A). El polipeptido CIGB370r se utiliza como control positivo en ambos ensayos.
Figura 4. Actividad citotoxica del peptido E07P04 en estirpe M14 de celulas de melanoma. El polipeptido CIGB370r se utiliza como control positivo y para el ensayo.
Figura 5. Calculos de accesibilidad de las superficies de los dominios de terminal N (1 srpN) y terminal C (srpC 1) de la proteasa Serratia principal, en comparacion con la protema natural (1 srp).
Figura 6. Secuencias de flanqueo de 20 aminoacidos lfder peptido (aa.) N06P87.
Figura 7. Actividad citotoxica en celulas de Melanoma humano. El peptido N06P87 lfder fue el unico capaz de inhibir la proliferacion celular en una concentracion de 50 pM.
Figura 8. Evaluacion de la capacidad antitumoral del peptido N06P87 lineal, derivado del polipeptido p25 en comparacion con la molecula de origen. Programa de administracion (A); Efecto antitumoral evaluado al medir el volumen del tumor (B); y efecto antitumoral a traves de la supervivencia de ratones inoculados (C). Modelo utilizado: estirpe de celulas Ls174T neoplasicas de colon humano implantadas en ratones atfmicos de NIH.
Figura 9. Definicion de regiones funcionales en el segmento Gly255-Ser274 (peptido lineal N06P87). El segmento primario del peptido es la region central, flanqueada por los segmentos de terminal N y C secundarios.
Figura 10. Modelado de los peptidos J08P48s-s, A08P28s-s, A08P25s-s, J08P46s-s dclicos y su peptido lineal N06P87, disenado del segmento Gly255-Ser274 de la protema p50. Se obtienen modelos con la ayuda del software MODELLER, al utilizar la estructura cristalografica de la protema p50 como patron. Se introducen puentes de disulfuro en las posiciones previamente identificadas por el metodo MODIP. A: modelado de N06P87 (peptido lineal) de acuerdo con la estructura tridimensional (3D) del segmento Gly255-Ser274 de la protema p50; B: modelado del peptido J08P48s-s; C: modelado del peptido A08P28s-s; D: modelado del peptido A08P25s-s; E: modelado del peptido J08P46s-s, que indica la distancia entre el terminal N y C del peptido.
Figura 11. Modelado de la estructura del peptido dclico 33 en la tabla 5. La lisina 7 forma un enlace amida con el grupo terminal carbonilo.
Figura 12. Imagen estereoscopica de la estructura que modela el peptido 69 dclico en la tabla 5. Se cicliza el segmento Asn264-Ser271 mediante el conector hexapeptido Arg-Pro-(dAla)-Gln-Asn-Ser. El residuo dAla es el estereoisomero D- Ala.
Figura 13. Imagen estereoscopica de estructura que modela el peptido 76 dclico en la Tabla 5. Se cicliza el segmento primario Asn264-Ser271 mediante el conector pentapeptido Arg-Arg-Pro-Asn-Ser (residuos subrayados).
Figura 14. Diagrama de Ramachandran que corresponde a la estructura 3D del segmento Gly255-Ser274 en la protema p50.
Figura 15. Diagrama general de la estructura qmmica de los peptidos dclicos disenados de la presente invencion. Las lmeas indican la presencia de un enlace covalente. Cuando se conectan dos residuos del peptido, las lmeas indican que aquellos residuos se ciclizan, es decir, se enlazan covalentemente. Las lmeas ubicadas por encima de la secuencia del peptido corresponden a la ciclizacion de la cadena principal, y aquellas por debajo representan los enlaces para ciclizacion que implican por lo menos una cadena lateral. Si una lmea indica hacia un residuo X1, significa que el enlace covalente se produce por la cadena lateral de ese residuo X1. Si la lmea empieza en un guion entre dos residuos significa que el enlace covalente implica el grupo amino o carbonilo del residuo despues o que precede el guion, respectivamente. La lmea que indica el guion que precede al X1 representa un enlace covalente amida que comprende el grupo amino del residuo X1; en este caso el peptido no tiene el terminal N secundario. Las lmeas por detras de X4 y X+2 indican un enlace covalente que comprende el grupo carbonilo de X4 y X+2, adicionalmente representa la ausencia del terminal C secundario detras de X4 y que el residuo es el terminal carboxilo del peptido detras de X+2. Entre llaves se indican los grupos implicados en el enlace covalente y el tipo de enlace: enlaces amidas o puentes de disulfuro, tambien muestran las secuencias preferidas para los conectores de peptidos. Las areas sombreadas en la secuencia de peptidos indican el orden del terminal N al C de los segmentos funcionales: (a) segmento de terminal N secundario, (b) segmento primario y (c) segmento de terminal C secundario. El triangulo P indica los sitios capaces de ser modificados mediante enlaces
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covalentes a los poKmeros u otros grupos qmmicos, dichas modificaciones son factibles si el residuo o el grupo de la cadena principal implicada no participa en un enlace de ciclizacion. El peptido puede tener uno o mas enlaces de ciclizacion, y una o mas modificaciones de polfmero y/o grupos qmmicos. Los analogos de aminoacidos mencionados en la figura como que ocupan posiblemente las posiciones de reemplazo X-4, X-2, X1, X3, X4, X+2 y X+3 son aminoacidos cuyas cadenas laterales comprenden el grupo amino o el grupo carboxilo o el grupo sulfhidrilo.
Figura 16. Peptidos dclicos optimizados, derivados del polipeptido p25, aumentan la supervivencia de animales tratados. Animales que llevan el tumor TC-1 subcutaneo fueron inyectados con una unica dosis de 80 pm mediante ruta intratumoral (i.t.). Cada grupo recibe un peptido diferente, o el polipeptido CIGB370r o el excipiente. Se muestra la supervivencia para todos los grupos.
Figura 17. Peptidos dclicos optimizados, derivados del polipeptido p25, aumentan la supervivencia de animales tratados independientemente de la ruta de administracion. Los animales que llevan el tumor TC-1 subcutaneo fueron inyectados con una unica dosis de 80 pm mediante ruta intratumoral (i.t.) o intraperitoneal (i.p.). Cada grupo recibe diferentes peptidos, o el polipeptido CIGB370r o el excipiente. Se muestra la supervivencia para todos los grupos.
Figura 18. Actividad biologica in vitro de J08P48s-s en estirpes de celulas de tumor humano de diferentes ongenes histologicos.
Figura 19. Peptidos dclicos optimizados, derivados del polipeptido p25, aumento de la actividad antitumoral y supervivencia en animales tratados con el peptido lineal, y sus actividades son analogas a aquellas del polipeptido CIGB370r. (A) programa de administracion; (B) efecto antitumoral como se evalua al medir el volumen del tumor (B); y efecto antitumoral evaluado a traves de supervivencia de ratones inoculados (C). Modelo: Ls174T de cancer de colon humano implantado en ratones atfmicos NIH.
Figura 20. Efecto de dos peptidos dclicos de la presente invencion en diferenciacion celular en celulas endoteliales en matrigel. Se cultivan celulas HMEC bajo condiciones de activacion (10 ng/mL EGF, 1 pg/mL hidrocortisona) en la presencia de dos peptidos dclicos de la presente invencion o el excipiente. Los peptidos fueron capaces de inhibir la formacion de estructurastubulares mediante celulas endoteliales activadas para proliferacion, evidenciando la actividad antiangiogenica de los peptidos, mientras el excipiente permite la formacion de dichas estructurastubulares.
Figura 21. Micrograffa de peptidos dclicos de la presente invencion en condiciones que favorecen su autoensamble. Descripcion detallada de la realizacion/ejemplo
Los ejemplos y datos muestran diversos aspectos y propiedades relacionadas con la obtencion de peptidos dclicos, partiendo de una coleccion de peptidos sinteticos lineales y la estructura terciaria de un polipeptido que corresponde al terminal C de Serralisina PrZn_SERMA (Braunagel SC and Benedik MJ (1990). Mol. Gen. Genet. 222:446-451), denominado p25, de potencialidades farmaceuticas probadas (Abrahantes-Perez MC et al., “Pharmaceutical composition containing polypeptide fragments of serralysins”. International Patent Application No. WO 2006/005268).
Los ejemplos mostrados en lo siguiente se refieren a los compuestos de la presente invencion, que incluyen el uso de moleculas derivadas de estos peptidos, optimizados y/o derivados. Comparados con el estado de la tecnica anterior, los compuestos y metodos mostrados aqm proporcionan retos y expectativas sorprendentes. La utilidad de la invencion se ilustra al utilizar estos compuestos en el campo farmaceutico. Dichos compuestos tienen ventajas en comparacion con otros compuestos conocidos por especialistas expertos en este campo de la tecnica.
Ejemplo 1. Diseno y smtesis de una coleccion de peptidos lineales derivados del polipeptido p25.
Se disenan peptidos lineales de 20 aminoacidos (aa.) sobrepuestos en 10, dirigidos a identificar la unidad funcionalmente activa minima del polipeptido p25 (Abrahantes-Perez MC y col., “Pharmaceutical composition containing polypeptide fragments of serralysins”. Solicitud internacional de patente Wo 2006/005268) y generar nuevas moleculas a partir de esa region con propiedades farmacologicas y farmacodinamicas mejoradas para el tratamiento contra el cancer. Que implicana la identificacion de regiones activas comprendidas en una secuencia primaria de 10 a 20 aa. La tabla 1 muestra la secuencia principal de cada peptido, su codigo de generacion y su masa molecular una vez sintetizada y purificada. La masa molecular de las preparaciones de peptidos finales se verifica mediante espectrometna de masa.
Tabla 1. Diseno y smtesis de una coleccion de peptidos lineales partiendo de la secuencia primaria del polipeptido p25
Peptido
Secuencia de aminoacidos Codigo Masa Molecular (Da)
MJ01
SYWSETNTGGDNGGHYAAAP-amida D06P91 2052.85
MJ02
DNGGHYAAAPLLDDIAAIQH- amida E07P01 2060.00
5
10
15
20
25
MJ03
LLDDIAAIQHLYGANPSTRT- amida E07P05 2167.10
MJ04
LYGANPSTRTGDTVYGFNSN- amida E07P06 2131.98
MJ05
GDTVYGFNSNTGRDFLSTTS- amida J07P73/N06P87 2137.10
MJ06
TGRDFLSTTSNSQKVIFAAW- amida F07P16 2227014
MJ07
NSQKVIFAAWDAGGNDTFDF- amida M07P38 2192.50
MJ08
DAGGNDTFDFSGYTANQRIN- amida M07P39 2160.97
MJ09
SGYTANQRINLNEKSFSDVG- amida A07P42 2198.08
MJ10
LNEKSFSDVGGLKGNVSIAA- amida A07P47 2004.06
MJ11
GLKGNVSIAAGVTIENAIGG- amida A07P44 1839.01
MJ12
GVTIENAIGGSGNDVIVGNA- amida A07P45 1854.96
MJ13
SGNDVIVGNAANNVLKGGAG- amida Y07P48 1824.92
MJ14
ANNVLKGGAGNDVLFGGGGA- amida A07P43 1785.95
MJ15
NDVLFGGGGADELWGGAGKD- amida A07P46 1932.87
MJ16
DELWGGAGKDIFVFSAASDS- amida O07P102 2070.08
MJ17
IFVFSAASDSAPGASDWIRD- amida O07P103 2110.13
MJ18
APGASDWIRDFQKGIDKIDL- amida O07P104 2243019
MJ19
FQKGIDKIDLSFFNKEANSS- amida O07P105 2286.19
MJ20
SFFNKEANSSDFIHFVDHFS- amida O07P106 2373.20
MJ21
DFIHFVDHFSGTAGEALLSY- amida O07P107 2224.07
MJ22
GTAGEALLSYNASSNVTDLS- amida O07P108 1967.99
MJ23
NASSNVTDLSVNIGGHQAPD- amida E02P04 1993.95
MJ24
VNIGGHQAPDFLVKIVGQVD- amida E07P02 2104.14
MJ25
FLVKIVGQVDVATDFIV- amida E07P03 1861.11
MJ26
DVATDFIV- amida U07P78 877.46
Se sintetizan peptidos en fase solida en la resina Fmoc-AM-MBHA, al utilizar la estrategia Fmoc/tBu (Barany, G. and Merrifield, R. B. J Am Chem SOC. 99 (1977) 7363-7365). Se acoplan aminoacidos mediante el metodo de activacion mediada por DIC/HOBt y se completa para reaccion de acoplamiento se verifica mediante el ensayo de ninhidrina (Kaiser,
E. , Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Anal Biochem. 34 (1970) 595-598). Los peptidos se separan de la resina con una solucion TFA/EDT/H2O/TIS (94%/2.5%/2.5%/1%), adicionalmente se precipita el eter y se liofiliza durante 72 h. Se alcanza la ciclizacion al formar un puente de disulfuro a traves oxidacion con sulfoxido de dimetil (DMSO) (Andreu, D., Albericio, F., Sole, N. A., Munson, M. C., Ferrer, M. and Barany, G., Pennington, M. W. and Dunn, B. M. (Eds), Peptide Synthesis Protocols, Methods in Molecular Biology, Totowa, nJ, 1994, pp. 91-169) y los peptidos se purifican mediante RP-HPLC. Las fracciones recolectadas se analizan independientemente mediante RP-HPlC y la preparacion final para cada peptido se formo al agrupar de todas las fracciones representativas que muestran pureza por encima al 99%.
Ejemplo 2. Seleccion de secuencias primarias de la coleccion de peptidos sinteticos derivados del polipeptido p25, basado en su actividad citotoxica in vitro en celulas tumorales.
La actividad citotoxica de la coleccion de peptidos sinteticos derivada de polipeptido p25 se determina en las celulas tumorales mediante el metodo de sulforodamina B (SRB) (Skehan P, Storeng R, Scudiero D, et al., (1990) J. Natl. Cancer Inst. 82: 1107-1112; Monks A, Scudiero D, Skehan P, et al., (1991). J Natl Cancer Inst. 83:757-66; Tesei A, Ulivi P, Fabbri
F, et al., (2005). J Transl Med. 3:7) Las celulas de control negativas se cultivan en un volumen de vehnculo igual a aquel de las muestras experimentales. Se estabiliza una curva “x-y” (dosis-respuesta) con el porcentaje de celulas sobrevivientes, en comparacion con respecto a las celulas de control negativas, y se estiman los siguientes parametros: 50% de inhibicion de crecimiento (GI50); Inhibicion total del crecimiento (TGI); y concentracion 50 letal (CL50), que es la concentracion que provoca el 50% de la muerte celular (Boyd MR, Paull KD, and Rubinstein LR (1992) “Data display and analysis strategies for the NCI Disease Oriented In-Vitro Antitumor Drug Screen, in Cytotoxic Anticancer Drugs: Models and Concept for Drug Discovery and Development” (Baleriote FA, Corbett TH and Baker LH eds) pp 11-34, Kluwer Academia Publishers, Boston).
Se consideran como peptidos citotoxicos los peptidos que son capaces de inhibir el 50% de la proliferacion celular, en una forma dependiente de dosis y que muestra valores GI50 valores por debajo de 100 pm, en por lo menos una de las estirpes celulares estudiadas. Las estirpes celulares tumorales humanas utilizadas fueron: HEp-2 (carcinoma de laringe), 5 A549 (adenocarcinoma epitelial del pulmon), M14 (melanoma), Colo 205 (adenocarcinoma de colon), Ls174T
(adenocarcinoma de colon), LnCAP (carcinoma de prostata), PC-3 (carcinoma de prostata) y H 125 (adenocarcinoma de pulmon de celula no microcftica). Los resultados de esta seleccion de peptidos se muestran en la tabla 2. Se representan secuencias primarias para los peptidos disenados, el codigo utilizado para su generacion y su capacidad citotoxica respectiva en celulas tumorales humanas.
10
Tabla 2. Seleccion de peptido basado en la actividad citotoxica mostradas en celulas de tumor humano in vitro mediante el metodo SRB
Secuencia de aminoacidos
Codigo Actividad Citotoxica in vitro
SYWSETNTGGDNGGHYAAAP- amida
D06P91 -
DNGGHYAAAPLLDDIAAIQH- amida
E07P01 -
LLDDIAAIQHLYGANPSTRT- amida
E07P05 -
LYGANPSTRTGDTVYGFNSN- amida
E07P06 -
GDTVYGFNSNTGRDFLSTTS- amida
J07P73/N06P87* +/+
TGRDFLSTTSNSQKVIFAAW- amida
F07P16 -
NSQKVIFAAWDAGGNDTFDF- amida
M07P38 -
DAGGNDTFDFSGYTANQRIN-amida
M07P39 -
SGYTANQRINLNEKSFSDVG-amida
A07P42 -
LNEKSFSDVGGLKGNVSIAA-amida
A07P47 -
GLKGNVSIAAGVTIENAIGG-amida
A07P44 -
GVTIENAIGGSGNDVIVGNA-amida
A07P45 -
SGNDVIVGNAANNVLKGGAG-amida
Y07P48 -
ANNVLKGGAGNDVLFGGGGA-amida
A07P43 -
NDVLFGGGGADELWGGAGKD-amida
A07P46 -
DELWGGAGKDIFVFSAASDS-amida
O07P102 -
IFVFSAASDSAPGASDWIRD-amida
O07P103 -
APGASDWIRDFQKGIDKIDL-amida
O07P104 -
FQKGIDKIDLSFFNKEANSS-amida
O07P105 -
SFFNKEANSSDFIHFVDHFS-amida
O07P106 -
DFIHFVDHFSGTAGEALLSY-amida
O07P107 -
GTAGEALLSYNASSNVTDLS-amida
O07P108 -
NASSNVTDLSVNIGGHQAPD-amida
E02P04 +
VNIGGHQAPDFLVKIVGQVD-amida
E07P02 -
FLVKIVGQVDVATDFIV-amida
E07P03 -
DVATDFIV-amida
U07P78 -
El sfmbolo + indica la presencia de citotoxicidad y el sfmbolo — indica su ausencia, siguiendo el criterio establecido
en el Ejemplo 2. *Este peptido se sintetizo dos veces, obtenidos.
para garantizar la capacidad de reproduccion de los resultados
15 El peptido GDTVYGFNSNTGRDFLSTTS-amida (codigo N06P87/J07P73) fue positivo (+) para diversas estirpes de celulas tumorales, mientras que el peptido NASsNvTDLSVNIGGHQAPD-amida (codigo E02P04) solo mostro actividad en la estirpe de celulas M14 de melanoma humano. El resto de los peptidos se considero negativo (-). Las figuras 1 y 2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
representan la potencialidad del N06P87 para inhibir la proliferacion de celulas tumorales de diverso origen histologico, de las estirpes celulares Colo 205, HEp-2, A549 y Ls174T. El GI50 esta por debajo de 100 pm para todos los casos. Se utilizan dos lotes de cisplatina como controles positivos en el caso de carcinoma de laringe HEp-2. Este es un producto de primera lmea disponible en el mercado para tratamiento contra el cancer de laringe. En este ensayo su utilidad se demostro en este tipo de patologfa y tambien la validez del ensayo.
Los resultados de la evaluacion de los efectos para algunos peptidos a partir de la coleccion en la Tabla 1 en las estirpes de celulas tumorales M14 y Ls174T humanas se muestran en la figura 3. Este panel de peptidos fue incapaz de inhibir la proliferacion celular en estirpes de celulas ensayadas.
Adicionalmente a la region que abarca el peptido N06P87, la region 20 aa. codificada por el peptido E07P04 (tabla 1) mostro actividad citotoxica, pero solamente la estirpe de celulas M14 y para un mayor GI50 de 100 pm, como se muestra en la figura 4.
La tabla 2 resume todos los resultados de la deteccion de peptidos para seleccion de peptidos para detectar actividad citotoxica en celulas tumorales, evidenciando que el peptido GDTVYGFNSNTGRDFLSTTS-amida comprende la region Gly255-Ser274 en el dominio de terminal C PRZN_SERMa Serralisina y ubicado en la region de terminal N del polipeptido p25 que es activo en estirpes de celula de tumor de diversos ongenes histologicos, reproduciendo el amplio espectro de actividad citotoxica exhibido por la molecula p25 original. Todo esto sugiere que los peptidos identificados como citotoxicos aqu se puede asumir como la secuencia estructuralmente activa minima en el polipeptido p25, que se optimiza adicionalmente para aplicaciones farmacologicas contra el cancer.
Ejemplo 3. Impacto de la remocion del dominio de terminal N en la exposicion en solucion de residuos de protema p50
Es bien sabido que la region de terminal C de Serralisinas (por ejemplo, Serralisina PRZN_SERMA) es responsable de la mayona de actividad citotoxica en celulas tumorales, una vez dividido el terminal N de la protema mediante autocatalisis, digestion qmmica con bromuro de Cianogeno, o mediante expresion del terminal C en Escherichia coli (solicitud de patente internacional no. WO 2006/005268). Esto sugiere que la unidad funcionalmente activa minima en la region de terminal C de Serralisinas promovio su accesibilidad a las celulas tumorales una vez se separa de las protemas de terminal N. Por lo tanto, se decide identificar los residuos de protemas que median su superficie de accesibilidad de disolvente despues de division del terminal C y N de la protema natural, tambien para corroborar si el peptido Gly255-Ser274 (N06P87) lleva dichos residuos. Para probar esta hipotesis, se hacen calculos de accesibilidad para las superficies del terminal C y N de la proteasa Serratia principal (Hamada K, Hata Y, Katsuya Y, Hiramatsu H, Fujiwara T, Katsube Y. (1996) J. Biochem. 119:844-851).
Las regiones de aminoacidos en las partes internas de los dominios de terminal C y N se vuelven accesibles una vez la identificacion proteolftica de los procedimientos de proteasas Serratia identifican ambas moleculas. El calculo de superficie de accesibilidad para los residuos se hace con el software DSSP (Kabsch W, Sander C. 1983. Biopolymers 22:25772637). Los valores de accesibilidad de los residuos se expresaron en Angstroms (A2). Como se muestra en la figura 5, las principales diferencias en los valores de accesibilidad corresponden a los aminoacidos ubicados en la region del terminal C en el dominio proteolftico del terminal N (Gln210, Phe211, Asn226, His229, Leu236, Ile239, Ser251) y la region de terminal N en el dominio no proteolftico del terminal C (Thr252, Phe269, Ile280, Trp284, Arg302 y Phe310) de la proteasa Serratia principal. Los residuos que muestran los mayores cambios significativos en los valores de accesibilidad se muestran en la tabla 3.
Tabla 3. Residuos de aminoacidos (aa.) que muestran la mayor parte de cambios significativos en valores de accesibilidad
Calculos de accesibilidad de las superficies del terminal N (1srpN) yterminal C (1srpC) de la proteasa principal de Serratia, en comparacion con la protema (1rp) natural. Los residuos se reordenan de acuerdo con el valor de la diferencia en exposicion (orden de columnas). Se presentan 64 residuos que muestran los valores mas altos para aumento en exposicion.
aa.
Residuo 1srp IsrpN Orden aa. Residuo 1srp IsrpC Orden
N
20 159 173 51 R 267 47 117 10
I
22 39 80 21 D 268 79 137 14
I
24 76 85 60 F 269 26 110 8
S
29 7 20 53 K 278 63 87 42
S
31 32 51 46 I 280 15 117 4
N
32 11 70 13 F 281 3 15 55
L
91 43 58 50 A 282 11 68 15
Q
94 71 111 25 W 284 15 119 3
D
98 14 109 5 A 286 35 56 43
5
10
15
20
25
30
V
99 8 28 45 R 302 59 152 6
Q
210 6 78 9 N 304 4 45 22
F
211 3 49 19 N 306 54 66 56
T
222 19 33 52 K 308 94 135 23
G
223 43 70 37 F 310 4 134 1
G
224 4 13 61 D 312 16 27 58
D
225 59 121 11 L 316 15 57 20
N
226 5 66 12 K 317 104 190 7
G
227 43 54 57 G 318 2 29 38
H
229 70 121 17 N 319 5 14 63
A
231 2 26 41 S 321 3 19 49
A
232 15 34 47 A 323 1 31 34
A
233 9 39 33 A 324 36 57 44
P
234 6 15 62 V 339 17 55 27
L
235 5 37 30 V 341 0 40 26
L
236 0 106 2 V 357 18 46 36
I
239 3 52 18 F 359 15 46 32
Q
243 34 65 31 I 375 38 49 59
A
248 27 35 64 S 379 20 33 54
N
249 25 53 35 D 403 0 27 39
L
250 126 163 28 S 405 16 43 40
S
251 97 152 16 F 406 40 81 24
K 409 120 155 29
I 470 42 60 48
Los pares Asp98 y Arg267, y Asp225 y Lys317 de residuos, establecen dos puentes de disulfuro entre los dominios de terminal C y terminal N. Mas aun, aquellos residuos muestran una diferencia promedio en los valores de accesibilidad de 78.2 A2. La diferencia promedio en los valores de accesibilidad para el terminal N proteolftico y el terminal C no proteolftico de la proteasa Serratia principal fueron de 5.1 ± 15,4 A2 y 7.1 ± 20.1 A2, respectivamente. Otras posiciones importantes fueron: Ile22, Asn32, Gln94 y Arg171. Hasta ahora, no se ha atribuido actividad biologica a estos residuos.
Por el contrario, ni los residuos de sitio activo (His176, Glu177 y His180) ubicado en la a-helice E en el dominio proteolftico de terminal N ni en los residuos Gly183 y His186 incluidos en el motivo de union de zinc HEXXHXXGXXH muestran algun cambio en sus valores de accesibilidad respectivos. Estos datos estan de acuerdo con los resultados experimentales; se demuestra eficientemente que la actividad citotoxica de la protema p50 (que pertenece a la familia de Serralisinas) no depende de su actividad proteolftica, y se asocia con su region de terminal C no proteolftica, que aumenta su accesibilidad a disolvente una vez se divide del dominio proteolftico. De otra parte, el segmento Gly255-Ser274 (peptido N06P87) llevan tres residuos (Arg267, Asp268 y Phe269) de aquellos que muestran el mayor aumento en exposicion (tabla 3), espedficamente entre los 14 valores mas altos, que soportan adicionalmente la funcion evidente de este segmento como unidad funcional estructural dentro de la protema p25 responsable de la actividad antitumoral.
Ejemplo 4. Modificaciones al segmento Gly255-Ser274 del peptido N06P87
La coleccion de peptidos mostrada en el ejemplo 1 comprende 20 segmentos largos de aa. sobrepuestos en 10 aa, partiendo del terminal N del polipeptido p25. Este diseno se establece dirigido a identificar una region lineal de 10 aa. con relacion al sujeto de actividad citotoxico de seleccion. Sin embargo, los 10 aa. sobrepuestos comprendidos por el N06P87 no mostraron actividad citotoxica (tabla 2) en otro contexto (figura 6, peptidos E07P06 y F07P16). Esto sugiere que los 20 aa. que comprenden la region Gly255-Ser274 (peptido N06P87) se requieren para establecer la exposicion correcta del motivo para la interaccion con celulas tumorales u otras posiciones adecuada para interacciones secundarias que flanquean el sitio activo, aumentando mediante estos medios su afinidad y/o especificidad para unirse al receptor potencial. Considerando este criterio, los peptidos se disenan y sintetizan con modificaciones, para evaluar su posible influencia en la actividad citotoxica versus celulas tumorales y para caracterizacion parcial del peptido N06P87 para optimizaciones adicionales. Dichas modificaciones comprenden la sustitucion del grupo amida por un grupo carboxilo en el terminal C del peptido N06P87 y la ciclacion del peptido N06P87 al insertar una cistema en ambos terminales de los peptidos. Los peptidos obtenidos y sus masas moleculares se muestran en la tabla 4.
Tabla 4. Modificaciones de los peptidos N06P87 ftder de 20 aa.
Peptido Secuencia de Aminoacidos Codigo MasaMolecular(Da)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
MJ27
GDTVYGFNSNTGRDFLSTTS-amida N06P87 2136.94
MJ28
GDTVYGFNSNTGRDFLSTTS-OH U07P79 2137.91
MJ29
ciclo[GDTVYGFNSNTGRDFLSTTS] N06P89 2340.97
La incapacidad del peptido N06P89 (ciclizado mediante dos cistemas ubicadas tanto en el terminal N como C) para inhibir la proliferacion celular en celulas de tumor de melanoma humano M14se muestra en la figura 7. Esto sugiere la necesidad de agregar restricciones adicionales a otras posiciones en la secuencia del peptido N06P87, que soporta la racionalidad de imitar la estructura terciaria esta region que no tiene estructura putativa del polipeptido p25. En la misma figura 7, tambien se muestra la necesidad de bloquear la terminal C (por ejemplo, un grupo amida u otra modificacion) para alcanzar la capacidad citotoxica esperada para la region peptido de interes.
Ejemplo 5. Formulaciones del peptido lfder no aumentan su actividad citotoxica
Se realiza un estudio para evaluar la influencia de las condiciones de regulador, pH y aditivos de diversas formulaciones parenterales que contienen un peptido lfder en su actividad citotoxica en celulas tumorales. Entre los reguladores evaluados estan; glicina, fosfatos, citratos y otros que comprende un amplio rango de valores de pH, desde acidos hasta altamente basicos. Tambien se evalua diversos aditivos dentro del rango de uso de las formulaciones parenterales, tal como: glicina, sacarosa, dextrano, glutamato de sodio, sorbitol, ciclodextrina, PEG, EDTA, detergentes no ionicos y otros. El peptido N06P87 formulado en estos aditivos no mostro aumento en su actividad citotoxica en celulas tumorales de diversos ongenes histologicos.
Ejemplo 5. Actividad in vivo del peptido N06P87 lineal
El modelo del tumor cancer colon Ls174T en ratones atfmicos se utilizo para evaluar el efecto potencial del segmento Gly255-Ser274 lineal (peptido N06P87), en comparacion con el polipeptido de CIGB370r, en modelos de tumor humanos. Las celulas de tumor humano se administraron mediante ruta subcutanea, y las moleculas de interes o el vehmulo se administraron mediante ruta intratumoral (100 jL). Despues de 13 dfas, cuando se implantaron los tumores y se hicieron palpables, empezaron los programas de administracion para las moleculas de interes (figura 8A). Se administra el peptido N06P87 en dosis a escala reducida: dos administraciones de 600 jm cada 48 h, seguida de 4 administraciones de 330 jm cada 48 h y finalmente 4 administraciones de 90 jm cada 72 h. Se administro el peptido de CIGB370r semanalmente durante 4 semanas.
Treinta y cinco dfas despues del inicio del tratamiento, se detectaron diferencias significativas en el volumen del tumor (p <0.001) entre los grupos tratados con N06P87 y el vehmulo (figura 8B). Mas aun, hubo diferencias altamente significativas (p <0.0001) entre los grupos tratados con CIGB370r y el vehmulo de recepcion, segun se detecta mediante ANOVA de una cola con prueba posterior de Bonferroni. Tambien hubo diferencias altamente significativas entre los grupos que recibieron ambas moleculas (p <0.0001).
La figura 8C muestra la supervivencia entre animales tratados con estas moleculas o que reciben el vehmulo. Ambas moleculas fueron capaces de aumentar la supervivencia significativamente (prueba Logrank: p <0.05) en animales tratados, en comparacion con el grupo que recibe el vehmulo. No obstante, para el caso del peptido N06P87, la relacion T/C (en el que T es la supervivencia media de animales tratados y C que de animales que solo reciben el vehmulo) fue 117%. Esto indica que este peptido lineal no se califica para una molecula potencialmente util para terapia contra el cancer en humanos, en el que la relacion T/C tiene que ser de por lo menos de 120%. En el caso del polipeptido CIGB370r, se muestra una relacion T/C de 142%, que tiene el comportamiento esperado de una molecula potencialmente util para terapeuticos contra el cancer humano.
El peptido ni siquiera se califico cuando se calculo la relacion T/C con referencia al volumen de tumor en el dfa 35 (el ultimo dfa en que todos los animales estaban vivos), mostro una relacion T/C del 72%, con el mismo parametro que es del 35% para el polipeptido CIGB370r. En este caso, la relacion T/C caracteriza un compuesto significativamente activo cuando varia por debajo de 40-50% (Marie Suggitt and Michael C. Bibby. 50 Years of Preclinical Anticancer Drug Screening: Empirical to Target-Driven Approaches Clinical Cancer Research. 2005. Vol. 11, 971-981.). Eso indica que la secuencia de peptido que se identifica requiere optimizacion adicional, para una supervivencia similar prolongada a aquella alcanzada por el polipeptido CIGB370r y para soportar su uso terapeutico adicional.
Ejemplo 7. Definicion de residuos/regiones funcionales en el peptido N06P87
Los resultados experimentales presentados en los ejemplos 2 y 4, junto con los analisis estructurales tridimensionales de la protema p50 (ejemplo 3 y la seccion descripcion detallada de la invencion) permiten definirtres segmentos o regiones distintivas en el estructura qrnmica del peptido N06P87 de acuerdo con su impacto en la relacion de estructura-funcion del peptido: a) region de unio primario (bucle central); b) region de union secundaria en el terminal C; y c) region secundaria del terminal N, para union y/o soporte estructural. Esto se describe esquematicamente en la figura 9. El bucle central contiene el segmento d Gly266-Asp268 esencial para su actividad biologica, asf como los residuos Phe269 y Leu270 que aumentan su exposicion tanto en p25 como p50. La region del terminal C es un bucle que adopta una conformacion extendida en la protema p50. Los residuos en este segmento participan aparentemente en la interaccion con el receptor,
5
10
15
20
25
30
35
como se muestra en el ejemplo 4, en el que el grupo amida de terminal C del peptido N06P87 se sustituye mediante un grupo carboxilo, que resulta en la perdida de actividad biologica. Dicha modificacion implica la introduccion de una nueva carga positiva local y tambien la perdida de un grupo donante de puentes de hidrogeno en el peptido. Tambien es posible que esta region pueda cumplir una funcion estructural: a) Leu270 establece interacciones hidrofobas con Phe269, Tyr259 y la cadena lateral alifatica del Arg267 en el bucle central; b) Thr272 establece contactos hidrofobos con Phe261 en la region terminal N; y c) Ser271 forma tres puentes de hidrogeno con residuos en el bucle central, el grupo amino Ser271 es donante de puentes de hidrogeno para el grupo de carbonilo Arg267, y el grupo OG en la cadena lateral del Ser271 tambien es donante para el carbonilo Arg267 y aceptor para el grupo OH para la cadena lateral Thr265. El segmento de terminal N tiene una funcion estructural: puentes de hidrogeno de cadena principal de Asp256 (grupo carbonilo) y Val258 (grupo amino) con los atomos del ND2 y el OD1 de cadena lateral del residuo Asn264, el grupo carbonilo (aceptador) del Val258 de residuo como donante amino (cadena principal) para Asn264 y el atomo del OG del Ser263.
Ejemplo 8. Introduccion de restricciones estructurales, ciclizacion, enlaces de cadena lateral y/o aminoacidos no naturales
Un aspecto clave para disenar farmacos antineoplasicos fuertes de la presente invencion comprenden peptidos que se disenan dclicos, es decir, contienen aminoacidos acoplados por medios de enlaces covalentes que involucran grupos qmmicos en las cadenas laterales y/o los terminales amino y carboxilo. Por lo tanto, los peptidos disenados aqu se restringen estructuralmente por medio de ciclizacion, que reduce significativamente la flexibilidad estructural de estas moleculas. En general, el uso de peptidos como agentes terapeuticos impone una serie de desventajas. Es decir, el caso de flexibilidad intrrnseca de los peptidos; especialmente el tamano medio y corto, que son protemas mas flexibles que plegadas. Esto es porque su proceso de union a las protemas o cualesquiera otras macromoleculas receptoras se limita usualmente por su mayor perdida de entropfa conformacional. Este hecho contribuye a que estas moleculas se muestren como una regla de afinidad de union menor que aquella de la interaccion de protema-protema. La menor afinidad exhibida por los peptidos (y por consiguiente la menor potencia) tambien se puede asociar al hecho de que la superficie de contacto de peptido-receptor es mas pequena en comparacion aquella requerida para la interfaz de protema-receptor, particularmente cuando loa peptidos comprenden el segmento de una protema natural. Por estas razones, se requiere en general redisenar y modificar peptidos qmmicamente para aumentar su afinidad para union al receptor (y por consiguiente potencia).
En la presente invencion, la ciclizacion de peptidos se introduce preferiblemente por medio de: a) enlaces amida entre cadenas laterales de Lys y Asp/Glu (peptidos 5-16, 19-22, 40-43 en la tabla 5) o entre las cadenas laterales de Lys y el grupo terminal carboxilo (peptido 32); y b) introducir puentes de disulfuro (peptidos 1-4, 17-18, 23-31, 33-39, 44-50). La tabla 5 muestra secuencias de peptidos representativos.
Tabla 5. Diseno de peptidos dclicos analogos al peptido N06P87 lineal
Numero
Secuencia de aminoacidos/estructura Tipo de ciclo/enlace
1.
CNTGRDFLC disulfuro
2.
GDTVYGFNCNTGRDFLCTTS disulfuro
3.
GDTVCGFNSNTGRDFCSTTS disulfuro
4.
GDTVYGCNSNTGRDFLSTGC disulfuro
5.
GDTVYGFNkNTGRDFLdTTS cadena lateral/amida
6.
GDTVYGFNkNTGRDFLeTTS cadena lateral/amida
7.
GDTVYGFNdNTGRDFLkTTS cadena lateral/amida
8.
GDTVYGFNeNTGRDFLkTTS cadena lateral/amida
9.
GDTVkGFNSNTGRDFdSTTS cadena lateral/amida
10.
GDTVkGFNSNTGRDFeSTTS cadena lateral/amida
11.
GDTVdGFNSNTGRDFkSTTS cadena lateral/amida
12.
GDTVeGFNSNTGRDFkSTTS cadena lateral/amida
13.
GDTVYGkNSNTGRDFLSTGd cadena lateral/amida
14.
GDTVYGkNSNTGRDFLSTGe cadena lateral/amida
15.
GDTVYGdNSNTGRDFLSTGk cadena lateral/amida
16.
GDTVYGeNSNTGRDFLSTGk cadena lateral/amida
17.
GDTVYGCNSNT-(dA)-RDFLSTGC disulfuro
18.
GDTVYGCNSNTGRDFLSTTSC disulfuro
19.
GDTVYGkNSNTGRDFLSTTSd cadena lateral/amida
20.
GDTVYGkNSNTGRDFLSTTSe cadena lateral/amida
21.
GDTVYGdNSNTGRDFLSTTSk cadena lateral/amida
22.
GDTVYGeNSNTGRDFLSTTSk cadena lateral/amida
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
GDTVYGCNSNT-(dA)-RDFLSTTSC
GDTVYGCNSNTGRDFLSTGCK
GDTVYGCNSNT-(dA)-RDFLSTGCK
GDTVYGCNSNTGRDFLSTTSCK
GDTVYGC NSNT-(dA)-RDFLSTTSCK
GDTVY-(dA)-CNSNT-(dA)-RDFLSTGC
GDTVY-(dA)-CNSNT-(dA)-RDFLSTGCK
GDTVY-(dA)-CNSNT-(dA)-RDFLSTTSC
GDTVY-(dA)-CNSNT-(dA)-RDFLSTTSCK
GDTVYGkNSNTGRDFLSTTN-co-
GDTVYGkNSNTGRDFLSTTS-co-
(PEG)-GDTVYGCNSNTGRDFLSTGC GDTVYGC NSNTGRDFLSTGCQ GDTVYGC NSNTGRDFLSTGCN GDTVYGC NSNTGRDFLSTGCR GDTVYGC NSNTGRDFLSTTSCQ GDTVYGCNSNTGRDFLSTTSCN GDTVYGCNSNTGRDFLSTTSCR GDTVYGkNSNTGRDFLSTTSeK GDTVYGkNSNTGRDFLSTTSeQ GDTVYGkNSNTGRDFLSTTSeN
disulfuro
disulfuro
disulfuro
disulfuro
disulfuro
disulfuro
disulfuro
disulfuro
disulfuro
cadena lateral de terminal amida/carboxilo
cadena lateral de terminal
amida/carboxilo
disulfuro
disulfuro
disulfuro
disulfuro
disulfuro
disulfuro
disulfuro
cadena lateral/amida cadena lateral/amida cadena lateral/amida
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60. 61. 62.
63.
64.
65.
66.
67.
68. 69.
GDTVYGkNSNTGRDFLSTTSeR
CNT-(dA)-RDFLC
GDTVY-(dA)-C-(dQ)-SNT-(dA)-RDFLSTGC
GDTVY-(dA)-C-(dQ)-SNT-(dA)-
GDTVYT(dA)'-C-(dQ)-SNT-(dA)-RDFLSTTSC
GDTVY-(dA)-C-(dQ)-SNT-(dA)-
GDTVY’T(d'A/)-,F-(dQ)-CNT-(dA)-RDFLCTTSK
GDTVC-(dA)-F-(dQ)-SNT-(dA)-RDFCSTTS
Lip-G-CNTGRDFLC
CNTGRDFLC-G-lip
GDTVYGC NSNTGRDFLSTAC
GDTVYGC NSNTGRDFLSTACQ
GDTVYGC NSNTGRDFLSTACN
GDTVYGC NSNTGRDFLSTACR
GDTVYGCNSNTGRDFLSTAC,
GDTVYGCNSNTGRDFLSTTC
pGlu-GDTVYGC NSNTGRDFLSTGC
Acetil-GDTVYGCNSNTGRDFLSTGC
(PEG)- GDTVYGC NSNTGRDFLSTGC -
GdTVYGCNSNTGRDFLSTGC -(PEG)
-X3X4NTGRDFLZ!Z2-
-L-(dS)-PTPNTGRDF-
-L-(dS)-PTPNT -(dA)-RDF-
(dA)-DTVYGC NSNTGRDFLSTGC
-DFLST-P-(dA)-Q-NSNTGR-
-DFLSR-P-(dA)-Q-NSNTGR-
cadena lateral/amida
disulfuro
disulfuro
disulfuro
disulfuro
disulfuro
disulfuro
disulfuro
disulfuro
disulfuro
disulfuro
disulfuro
disulfuro
disulfuro
disulfuro
disulfuro
disulfuro
disulfuro
disulfuro
disulfuro
cadena principal/amida cadena principal/amida cadena principal/amida disulfuro
cadena principal/amida cadena principal/amida
70.
-L-(dA)-PTPNTGRDF- cadena principal/amida
71.
-L-GPTPNTGRDF- cadena principal/amida
72.
-DFLST-P-G-Q-NSNTGR- cadena principal/amida
73.
-DFLSR-P-G-Q-NSNTGR- cadena principal/amida
74.
-DFLSR-P-(dA)-(BmQ)-(NmN)-SNTGR- cadena principal/amida
75.
-DFLST-P-(dA)-(BmQ)-(NmN)-SNTGR- cadena principal/amida
76.
-DFLS-R-R-P-NSNTGR- cadena principal/amida
77.
-DFLS-K-K-P-NSNTGR- cadena principal/amida
*, a menos que se especifique alguna modificacion, el terminal C se amida y el terminal N es libre; -, enlace covalente, (a) si aparece una lmea punteada en el terminal de la secuencia significa que el grupo terminal se modifica mediante un enlace covalente a un sustituyente o polfmero, (b). dos guiones, uno en el terminal N y el otro en el terminal C, indican que el peptido es dclico al formar un enlace amida entre dos grupos carboxilo y amino de la cadena principal de los 5 residuos terminales; y (c) un guion en el medio de cualquier secuencia representa un enlace de peptido; k, el residuo Lys cuya cadena lateral forma un enlace amida intramolecular; d, el residuo ASP cuya cadena lateral forma un enlace de amida intramolecular; e, el residuos Glu cuya cadena lateral forma un enlace de amida intramolecular; - co-, terminal carboxilo ligado covalentemente mediante un enlace amida intramolecular se une a la cadena lateral Lys; dA, el estereoisomero D-Ala; dQ el estereoisomero D-Gln; dS, el estereoisomero D-serina; (PEG)- y (PEG), pegilacion de en el 10 terminal amino y el terminal carboxilo, respectivamente; pGlu, acido piroglutamicao; X3X4 y Z1Z2 dipeptidos; bmQ, L-b- metilglutamina (Gin metilado en el carbono beta); NmN, N-metil Asn.
Tabla 6. Aminoacidos especiales susceptibles para ser utilizados analogos a los residuos Lys y AsplGlu para ciclizacion de cadenas laterales y/o modificacion qmmica del peptido mediante enlace covalente a un polfmero o cadena lateral.
Numero
Aminoacidos Grupo funcional
1.
acido 2-[bis(3-aminopropil)amino] acetico NH2
2.
acido (2S)-2,5-diaminopentanoico NH2
3.
acido 2,2-diamino acetico NH2
4.
acido (3S)-3,4-diaminobutanoico NH2
5.
acido (2R)-2,4-diaminobutanoico NH2
6.
acido (2S)-2,4-diaminobutanoico NH2
7.
acido (2S)-2,3-diaminopropanoico NH2
8.
acido (2R)-2,3-diaminopropanoico NH2
9.
acido 2-[(2-aminoetil)amino] acetico NH2
10.
acido 2-[(3-aminopropil)amino] acetico NH2
11.
acido 2-[(4-aminobutil)amino] acetico NH2
12.
acido (4S)-4,8-diaminooctanoico NH2
13.
acido (2S)-2-amino-3-(4-aminofenil)propanoico NH2
14.
acido (2S)-2-amino-3-[4-(2-aminoetoxi)fenil]propanoico NH2
15.
acido 2-(piperidin-4-il amino) acetico NH
16.
acido (2S)-2-amino-4-[(5R)-2,2-dimetil-1,3-oxazolidin-5-il] butanoico NH
17.
acido (2S)-2-amino-6-(metilamino)hexanoico NH
18.
acido (2R,4R)-4-aminopirrolidino-2-carboxflico NH
19.
acido (2R,4S)-4-aminopirrolidino-2-carboxflico NH
20.
acido 2-(4-aminopiperidino-4-il) acetico NH
21.
acido 4-aminopiperidino-4-carboxflico NH
22.
acido (2S,4R)-4-aminopirrolidino-2-carboxnico NH
23.
acido Imidazolidino-2-carboxflico NH
24.
acido 3-[(carboximetil)amino]propanoico COOH
25.
acido 2-[(carboximetil)amino] acetico COOH
26.
acido 3-[(2-carboxietil)amino]propanoico COOH
27.
(3R)-3-aminohexanodioico COOH
28.
acido 4-aminoheptanodioico COOH
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
29.
acido 4-aminopiperidino-1,4-dicarboxflico COOH
30.
acido (2S,4S)-4-aminopirrolidino-2-carboxflico COOH
31.
acido 2-[(carboximetil)amino] acetico COOH
32.
(2S)-2-amino-6-[(carboximetil)amino]hexanoico COOH
33.
acido 3-[(2-carboxietil)amino]propanoico COOH
34.
acido (2S)-2-aminoheptanodioico COOH
35.
acido (2S)-2-aminooctanodioico COOH
36.
acido (2R)-2-amino-3-[(2-carboxietil)sulfanil]propanoico COOH
37.
acido (2R)-2-amino-3-[(carboximetil)sulfanil]propanoico COOH
38.
acido 4-{[(2R)-2-amino-2-carboxietil]sulfanil}butanoico COOH
39.
acido (2S)-2-amino-3-[4-(carboximethoxi)fenil]propanoico COOH
Tabla 7. Aminoacidos especiales susceptibles de ser utilizados analogos a la cistema para ciclizacion de peptidos por medio de puente de disulfuro y/o para modificacion qmmica de peptidos mediante enlace a un poUmero mediante la cadena lateral.
No
Aminoacido
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10. 11. 12.
13.
14.
acido (2R)-2-amino-3-sulfanilbutanoico acido (2R)-2-amino-3-metil-3-sulfanilbutanoico acido (2S)-2-amino-4-sulfanilbutanoico acido 2-amino-5-sulfanil-pentanoico acido 2-amino-3-sulfanil-pentanoico acido 2-amino-4-metil-3-sulfanilpentanoico acido 2-amino-3-metil-4-sulfanilpentanoico acido 2-amino-3,4-dimetil-3-sulfanil-pentanoico acido 2-amino-3-etil-3-sulfanilpentanoico acido (2R)-2-amino-3-metil-3-sulfanilpentanoico acido (4S)-4-amino-2-metil-5-sulfanilpentanoico acido (4R)-4-amino-2-metil-5-sulfanilpentanoico acido (4R)-4-amino-5-sulfanilpentanoico acido (4S)-4-amino-5-sulfanilpentanoico
En todos los casos, las restricciones estructurales introducidas en la estructura del peptido disenado tienen que ser compatibles con la conformacion biologicamente activa de la molecula. Por lo tanto, el diseno de las ciclizaciones de la presente invencion incluye la seleccion de posiciones potenciales sobre la secuencia para la sustitucion/introduccion de aminoacidos que se van a ligar mediante cadenas laterales (posiciones de reemplazo) y los tipos de amino acidos que se van a introducir (residuos de enlace). Las distancias interresiduo que corresponden a las posiciones de reemplazo en el peptido tienen que ser compatibles con la naturaleza estereoqmmica de los residuos de enlaces seleccionados. En el caso espedfico de introducir puentes de disulfuro, por ejemplo, no se consideran como posiciones de reemplazo potenciales aquellos residuos cuya distancia entre los carbonos alfa sea mayor de 7 A o menor de 3.8 A en la conformacion activa (Vardhan S. Dani, C. Ramakrishnan and Raghavan Varadarajan. Protein Engineering vol.16 no.3 pp.187-193, 2003). Del mismo modo, las posiciones con distancias entre beta carbones entre 3.6 A y 4.7 A se consideran preferidas. Las posiciones de reemplazo de la tecnica de descriptores estereoqmmicos, tal como carbonos alfa y beta, debe soportar angulos de torsion en las cadenas laterales de residuos de enlace suficiente para adoptar valores favorables una vez establecido el enlace covalente entre los residuos, lo que indica la existencia de interacciones no covalentes favorables (van der Waals).
Las siguientes etapas se consideran para el diseno de peptidos ciclizados mediante puentes de disulfuro (por cistemas) de la presente invencion: a) seleccion de pares de posicion de reemplazo potencial del peptido N06P87 capaz de ser sustituidos por cistemas ligadas por puentes disulfuro, b) modelamiento de estructura tridimensional de energfa minimizada/peptidos modificados de los modelos y c) evaluacion de energfa y/o parametros de calidad estereoqmmica de los modelos. Posiciones de reemplazo para cistemas en el peptido N06P87 se seleccionan al utilizar MODIP (Vardhan S. Dani, C. Ramakrishnan and Raghavan Varadarajan. Protein Engineering vol.16 no.3 pp.187-193, 2003), un software desarrollado para disenar puentes de disulfuro de protemas. El metodo asigna una calificacion a potenciales puentes de disulfuro, al utilizar una energfa empmca que depende de las distancias interatomicas para los carbonos alfa y beta, y tambien los valores para los angulos de torsion x1, X2, XSS, X1’ y X2’ (R. Sowdhamini, N. Srinivasan, B. Shoichet, D.V. Santi, C. Ramakrishnan and P. Balaram (1989). Prot. Engng. 3, 95-103). Dependiendo de los valores de energfa calculados para los puentes de disulfuro potenciales, el MODIP asigna una puntuacion de calidad de A (estereoqmmica ideal), B (de geometna adecuada pero que tiene torsion estereoqmmica) o C (suficientemente cercano para permitir la formacion de puentes de disulfuro), mientras que A representa la mayor calidad y C la mas baja. Los modelos estructurales 3D de los peptidos disenados se obtienen al utilizar software de modelamiento molecular y (preferiblemente) se pueden obtener
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
mediante Resonancia Magnetica Nuclear. Se utiliza el Software MODELLER para modelar los peptidos (Sali A, Blundell TL, 1993, J Mol Biol 234:779-815) y WHATIF (Vriend G, 1990, J Mol Graph. 8(1):52-6, 29).
La estructura cristalografica del p50 se utiliza como punto de partida para este analisis - archivo PDB 1SRP. Como se discutio anteriormente en la seccion descripcion detallada de la invencion, los datos experimentales sugieren que la conformacion biologicamente activa del peptido N06P87 es similar a aquella adoptada por el fragmento Gly255-Ser274 en la protema p50/p25. La tabla 8 muestra los resultados para la prediccion de posiciones de reemplazo potenciales en este segmento.
Tabla 8. Prediccion de las posiciones de reemplazo para cistemas ligadas mediante puentes de disulfuro en el peptido N06P87 con la ayuda de MODIP
No.
Residuo i Residuo j grado§
1*
PHE 7 SER 20 C
2
THR 11 LEU 16 A
3
SER 9 SER 17 A
4
TYR 5 LEU 16 B
*, la prediccion se hace para el modelo de peptido N06P87 modificado por la sustitucion Thr-ig^Gly; §, grado de calidad estereoqmmica para el puente de disulfuro predicho, A la mas alta, C la mas baja.
Los pares 2-4 se predicen a partir de la estructura natural y muestras las puntuaciones de calidad A y B, mientras que el par 1 requiere un ligero cambio conformacional en el residuo T-^y de esta manera, el puente de disulfuro resultante tiene una menor calidad. Por lo tanto, las realizaciones incluyen peptidos que contienen las sustituciones T^^-G o T-^^A para favorecer la adopcion de una conformacion favorable para establecer el puente de disulfuro. La substitucion de Gly permite aumentar la flexibilidad local, favoreciendo los cambios conformacionales en el terminal carboxilo ayudando en la formacion del puente. La sustitucion de Ala es adecuada, considerando su propension favorable de este residuo a adoptar conformaciones helicoidales, como una predicha para el residuo 19 de acuerdo con los modelos obtenidos para la estructura del peptido 4 en la tabla 5 (angulos de torsion phi-psi del modelo -69, -38). La introduccion de Ala, comparado con la sustitucion T^^-G, se caracteriza por una menor perdida de entropfa de configuracion durante el plegado y/o union de receptor. La figura 10 muestra los modelos para un grupo de peptidos dclicos, disenados para la prediccion MODIP mostrada en la tabla 8.
Las mismas posiciones de reemplazo utilizadas para disenar los puentes de disulfuro tambien son adecuadas para disenar los peptidos dclicos con residuos de enlace que forman enlaces amida, como los residuos Lys y Asp/Glu. En razon a que el numero de atomos de enlace de los carbonos alfa de residuos de enlace es mayor en este caso que aquellos que existen en los puentes de disulfuro, las restricciones estereoqmmicas que determinan si su introduccion en el diseno de los peptidos es menos restrictiva y por lo tanto las posiciones de reemplazo predichas con MODIP tambien son adecuadas como un metodo primario. Una vez seleccionado un par de residuos para un enlace dado, el peptido resultante se modela y evalua energeticamente (y/o evalua la calidad de acuerdo con los parametros estereoqmmicas). El peptido 33 en la tabla 5 se diseno mediante un protocolo similar, este peptido contiene un enlace amida entre Lys7 y el grupo carbonilo terminal (figura 11).
Otro metodo de ciclizacion como se describe aqm comprende la introduccion de un enlace covalente entre los grupos carbonilo y amino del terminal N y C de peptidos. Las restricciones estereoqmmicas del enlace peptido hacen necesario introducir conectores aa., que facilitan adoptar una estructura compatible con la actividad biologica de los peptidos. Por ejemplo, entre mayor es la distancia entre los carbonos alfa de los residuos “de anclaje” en la estructura 3D de la protema p25/p50 que se va a ligar (dcA-cA) en comparacion con la distancia 3,9 A que existe entre CA de una unidad peptido, mayor es el numero de residuos conectores (Ncon) requeridos. Si los residuos conectores adecuados no se introducen entre dos residuos de anclaje para satisfacer las restricciones de distancias respectivas, es altamente probable que el peptido no pueda adoptar la conformacion experimentalmente observada, esto muy probablemente tiene un efecto negativo sobre la actividad biologica. El residuo conector se disena de acuerdo con el siguiente protocolo:
I. seleccion de residuos de peptido de N06P87 que se van a conectar: residuos vecinos en la estructura 3D, preferiblemente aquellos no incluidos en el segmento de union primaria o segmento primario;
II. identificacion del numero mmimo de residuos conectores requeridos: Ncon > dCA-ca/3.9;
III. seleccion de residuos de anclaje: residuos de peptido N06P87 que se van a conectar y los vecinos, con residuos 2-3 que se seccionan entre ambos terminales;
IV. busqueda de segmentos de residuos N (Ncon + 4 > N > Ncon + 6) en una base de estructura de protemas 3D no redundantes, en una forma en que la estructura de cadena principal de los 2-3 residuos en el terminal de fragmentos sera similar a la estructura de los residuos de anclajes;
5
10
15
20
25
30
35
40
45
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55
60
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V. seleccion de la secuencia y estructura del segmento conector: la estructura del segmento del conector mas comun observado en la etapa IV se selecciona y los parametros de eleccion se calculan para cada aminoacido en cada posicion, es decir, la relacion entre el numero de apariciones de aminoacidos y el valor esperado de acuerdo con la abundancia relativa del aminoacido en la base de datos. Aminoacidos (uno o varios) que muestran los parametros de mayor preferencia que se seleccionan para cada posicion. Es posible modificar los residuos vecinos al segmento conector, siguiendo el criterio de mayor valor del parametro de preferencia. En aquellos casos implican posiciones con angulos de torsion positivos que es posible introducir en los D-estereoisomeros. Tambien es posible introducir otros aminoacidos no naturales (tal como, aminoacidos beta y N-metilados) para aumentar la propension estructural del residuo a adoptar la conformacion adecuada en la cadena principal para la estructura requerida.
En razon a que estos peptidos ciclizan mediante enlaces amida entre los terminales N y C, las permutaciones dclicas de la secuencia comprenden peptidos identicos. En una muestra, los peptidos se disenan con base en el segmento de puente primario definido por el peptido N06P87 y dicho segmento se conecta mediante un tetrapeptido (dos dipeptidos) de la secuencia general Z1Z2X3X4 (o X3X4y Z1Z2 respectivamente, peptido 64 en la tabla 5). Aquellos peptidos contienen hasta 11 aminoacidos. Las secuencias conectoras como se describe aqu tambien pueden incluir D-aa. en aquellas posiciones cuyos residuos adoptan los angulos de torsion positivos (peptidos 65 y 66 en la tabla 5). La secuencia del tetrapeptido conector es preferiblemente pero no exclusivamente, dSer-Pro-Thr-Pro (peptido 65 en la tabla 5, dS en el estereoisomero D-Ser), aunque tambien puede ser Gly-Pro-Thr-Pro (peptido 71 en la tabla 5) o dAla-Pro-Thr-Pro (peptido 70 en la tabla 5, dAla es el estereoisomero D -Ala).
En otra ejemplificacion, los peptidos pueden comprender la secuencia que corresponde al segmento Asn262-Ser271 del polipeptido p50, conectado mediante un tetrapeptido. Los peptidos resultantes tienen 14 residuos. La secuencia preferida del conector tetrapeptido puede ser, pero no exclusivamente, Thr-Pro-Gly-Gln (peptido 72 en la tabla 5), alternativamente, pero no exclusivamente, Arg-Pro-(dAla)-Gln (peptido 69, vease figura 12) o Arg-Pro-Gly-Gln (peptido 73 en la tabla 5) o Thr-Pro-(dAla)-Gln (peptido 68 en la tabla 5). Por lo tanto, la secuencia de estos peptidos se puede describir como el segmento Asn264-Ser271 ciclizado por medio de un hexapeptido conector cuya secuencia es preferiblemente: (Thr o Arg)-Pro-(Gly o dAla)-Gln-Asn-ser. Alternativamente los residuos 4 y 5 en el conector hexapeptido pueden ser respectivamente aminoacidos BmGln y NmAsn, en el que BmGln y NmAsn son aminoacidos L-b-metilglutamina (L-glutamina metilada en su carbono beta) y L-n-metil asparagina (N-metil L-Asparagina), respectivamente. Los aminoacidos betametilados son mas propensos a adoptar conformaciones extendidas (estructuras similares a beta) y el N-metilado a adoptar estructuras similares a poliprolina, que son las estructuras adoptadas por los residuos 4 y 5 en las estructuras modelos del peptido obtenido mediante el protocolo descrito (etapas I-IV) para disenar segmentos conectores. Otra ejemplificacion consiste de peptidos cuya secuencia corresponde al segmento Asn262-Ser271 de p50 conectada por un tripeptido (o analogamente el segmento Asn264-Ser271 conectado por un pentapeptido). El conector tripeptido tiene preferencialmente, pero no exclusivamente, la secuencia (Arg o Lys)-(Arg o Lys)-Pro (peptidos 76-77 en la tabla 5, figura 13), el conector pentapeptido respectivo tiene la secuencia (Arg o Lys)-(Arg o Lys)-Pro-Asn-ser.
Ejemplo 9. Estereoisomeros
Para el proposito de aumentar la estabilidad estructural y, por consiguiente, la afinidad/potencia de peptidos, una modificacion considerada comprende la sustitucion de L-aminoacidos naturales en la secuencia N06P87 original mediante sus respectivos estereoisomeros (D-aminoacidos, D-aa.). En razon a que D-aa. adopta angulos de torsion positivos favorables, los residuos N06P87 candidatos a ser sustituidos son aquellos que adoptan dichos angulos de torsion en la estructura de la protema natural (y/o modelos estructurales de los peptidos). La figura 14 muestra el diagrama Ramachandran que corresponde a la estructura 3D del segmento Gly255-Ser274 de p50. Con la ayuda de definiciones de las regiones del diagrama Ramachandran de Rooman and Wodak (Rooman MJ, Kocher JP, Wodak SJ. 1991. J Mol Biol 221(3): 961-79), los residuos Nay G12 se ubican en la region L (region helicoidal con rotacion a mano izquierda) y G6 en region de conformacion extendida E (valores G6 phi y psi tambien son prohibitivos para el resto de L-aminoacidos). Por lo tanto, la sustitucion de Na, G12 y G6 por D-Ala es favorable considerando la propension de este residuo a adoptar dichas conformaciones de cadena principal y/ a reducir la perdida asociada con plegamiento/union de entropfa de configuracion. En razon a que los residuos L-Glu, L-Gln y L-Asp son altamente propensos a adoptar conformaciones helicoidales (rotaciones a mano derecha) cuando estos residuos se ubican en bucles de protema (Swindells MB, MacArthur MW, Thornton JM. 1995. Nat Struct Biol. 2(7):596-603), por analogfa, D-Glu, D-Gln y D-Asp son propensos a adoptar conformaciones helicoidales de rotacion a mano izquierda (como en el caso del residuo Na). Los peptidos 17, 23, 25, 2731, 45-51 (tabla 5) llevan de uno a tres D-aa. disenados de acuerdo con el criterio mencionado anteriormente. La introduccion de D-aa. en la estructura de los peptidos tambien tiene un efecto favorable en la conformacion, y por lo tanto, en la afinidad, contribuyendo positivamente a las propiedades farmacocineticas de los peptidos al aumentar su resistencia a la proteolisis in vivo con base en dos motivos principales: a) un efecto directo, en razon a que las endoproteasas de suero digieren sustratos estereo espedficos; y b) la menorflexibilidad de los peptidos que los hace menos susceptibles a digestion proteolftica.
Ejemplo 10. Bloqueo del terminal peptido y/o conjugacion a polfmeros
Los peptidos se caracterizan por un tiempo de semivida media inferior in vivo (exclusion renal, tamano inferior), la mas alta a flexibilidad tambien implica aumento de susceptibilidad a proteolisis, y por tanto menor biodisponibilidad. Por lo
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tanto, la introduccion de modificaciones qmmicas en los peptidos se puede prever para mejorar su biodisponibilidad. Se describe aqm, el diseno de peptidos modificados covalentemente con cadenas de polietilenglicol (PEGS), que modifican preferiblemente el terminal peptido, pero no sin excluir otras modificaciones, como, por ejemplo, cadenas laterales. Ejemplos de peptidos pegilados de la presente invencion se muestran en la tabla 5 (peptidos 62 y 63). Los peptidos pegilados de la presente invencion, muestran, por lo tanto, un mejor perfil de resistencia a la proteolisis, filtracion renal reducida, menor probabilidad de interaccion con anticuerpos y posterior neutralizacion de su actividad, y antigenicidad e inmunogenicidad reducidas.
La pegilacion aumenta el tiempo de circulacion de moleculas pequenas, peptidos pequenos que se excretan rapidamente, que han sido reportados por tener toxicidad renal frecuentemente cuando se radioetiquetan (Blumenthal R. D., Sharkey R. M., Goldenberg D. M. Goldenberg D. M. eds. Cancer Therapy with Radiolabeled Antibodies, 295-314, CRC Press Boca Raton, FL 1995.). Se ha utilizado la pegilacion para modificar farmacos sinteticos, como interferones y anticuerpos. Las realizaciones incluyen la presentacion de peptidos por medio de disenar estructuras multimericas, utilizando PEG lineal o ramificado, que permiten mayor avidez para union de receptores peptido.
La pegilacion incrementa el tamano molecular evidente de los peptidos, reduciendo el mdice de filtracion renal (Knauf M.
J. , Bell D. P., Hirtzer P., Luo Z. P., Young J. D., Katre N. V. J. Biol. Chem., 263: 15064-15070, 1988; Behr T. M., Goldenberg D. M., Becker W. Eur. J. Nucl. Med., 25: 201-212, 1998). Los peptidos como se describe aqm se modifican preferiblemente cuando aumenta el PEG su tamano molecular a valores iguales o por encima de 50 kDa, para reducir drasticamente la filtracion glomerular de la molecula.
La pegilacion, en adicion a aumentar el tiempo de circulacion, reduce la antigenicidad y susceptibilidad a proteolisis de moleculas terapeuticas (Delgado C., Francis G. E., Fischer D. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 9: 249-304, 1992.), e induce un aumento en su solubilidad y permeabilidad vascular (Francis G. E., Delgado C., Fisher D., Malik F., Agrawal A.
K. J. Drug Target., 3: 321-340, 1996), una propiedad altamente deseable para farmacos antineoplasicos.
Existen diversas exopeptidasas en sangre, rinon e hngado (Werle M, Bernkop-Schnrch A. Amino Acids. 2006 Jun; 30(4):351-67), y por lo tanto, la modificacion del terminal N y C del peptido puede aumentar significativamente su estabilidad proteolftica. La N-acetilacion es una modificacion recomendada y tambien la introduccion de piroglutamato en el terminal N, o un aminoacido D-estereoisomero, etcetera.
Los peptidos son C-amidados principalmente (amida en el Terminal C), que les da resistencia carboxipeptidasa.
La modificacion del terminal N y terminal C tambien puede ser pegilacion, que aumenta la resistencia de las proteasas y en particular a las exopeptidasas mediante modificacion de terminales, en adicion a sus propiedades relacionada sy previamente mencionadas relacionadas con el aumento de tamano y reduccion de antigenicidad/inmunogenicidad. A pesar de eso, la adicion de PEGS induce un aumento en la resistencia a la proteolisis en general (endo y exo) mediante obstaculizacion esterica para enzimas proteoltticas. Para este proposito, se utiliza PEGS ya sea lineal o ramificado. La ciclizacion tambien protege los peptidos contra proteolisis de exopeptidasa, al formar un enlace covalente entre el terminal C y N previamente descritos (peptidos 64-66, 68-69 en la tabla 5) o mediante enlace covalente de un terminal a una cadena lateral (peptidos 32-33 en la tabla 5). La resistencia a la exopeptidasa tambien se alcanza a sustituir los aminoacidos terminales mediante D-aa. (peptido 67 en la tabla 5).
Como una alternativa a la modificacion con PEG, tambien es posible la conjugacion a acido N-acetilneurammico (acido sialico), un polfmero que se presenta en forma natural y altamente hidrofilo biodegradable, de polfmero, sin receptor en humanos, y que puede aumentar la resistencia a las proteasas (estabilizacion de plasma) y el tiempo de semi vida (Gregoriadis G, Fernandes A, Mital M, McCormack B (2000) Cell Mol Life Sci 57: 1964-1969; Fernandes Al, Gregoriadis G (1997) Biochim Biophys Acta 1341: 26-34). Otra modificacion plausible de los peptidos comprende la sustitucion del terminal N por acidos grasos o lipidacion (peptidos 52-53 en la tabla 5). Esta estrategia aumenta la resistencia de los peptidos a la proteolisis por exopeptidasas y facilita la interaccion de los peptidos con membranas. Dependiendo de la naturaleza del lfpido puede favorecer la interaccion con determinados dominios de membrana, que facilitan la acumulacion de los peptidos en dominios ricos en el receptor objetivo de la accion farmacologica de los peptidos. La lipidacion tambien favorece la formacion de estructuras supramoleculares de mejores propiedades farmacocineticas y farmacodinamicas (micelas, agregados, partfculas, vesfculas).
Ejemplo 11. Descripcion de la estructura qrnmica de peptidos de la presente invencion.
La figura 15 muestra una representacion general de la estructura qrnmica de los peptidos de la presente invencion. El diseno se basa, en primer lugar, en el segmento primario definido en el ejemplo 7 de realizacion. En general, la secuencia de peptido Asn264-Leu270 se expone en diferentes contextos estructurales, que incluyen todos diferentes grados de restriccion, por medio de ciclizacion que implica la cadena principal y/o cadenas laterales de los peptidos. Las ciclizaciones se estabilizan por medio de enlaces de diferente naturaleza qrnmica: enlaces amida o disulfuro, pero son posiciones de reemplazo ocupadas por los residuos de cadenas laterales dclicas y las cadenas laterales mismas, se selecciona cuidadosamente para reproducir la estructura y topograffa del sitio funcional de la protema p50/p25 identificada en la presente invencion. Una solucion particular consiste de ciclizacion de la cadena principal, llevada a cabo al seleccionar los sitios de anclaje y las secuencias conectoras que tienen alta propension estructural a adoptar una conformacion
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compatible con la estructura del segmento primario. Los segmentos de secundarios tambien se utilizan opcionalmente, principalmente para soportar posiciones de reemplazo con cadenas laterales dclicos. Mas aun, los segmentos secundarios pueden proporcionar superficies de contacto adicionales para interactuar con los receptores potenciales, de acuerdo con la topograffa del sitio funcional p50/25. Un ejemplo adicional comprende la inclusion de residuos que llevan carga positiva y/o donantes de puentes de hidrogeno en las posiciones X+3 y X+4 del segmento secundario del terminal C. Los peptidos pueden incluir uno o mas ciclos de aquellos mostrados en la figura 15, aunque se han incluido solo monociclos como ejemplos que se muestran en la tabla 5. Los peptidos pueden incluir aa. natural o especial, cuya cadena lateral comprende los grupos amino, carboxilo o sulfhidrilo, dirigidos a ocupar las posiciones de reemplazo para cristalizacion o cualquier otra modificacion qmmica. Tambien puede incluir estereoisomeros D-aa. en las posiciones de cadena de polipeptidos capaces de adoptar angulos de torsion positivos, ya sea para los segmentos primarios o secundarios. Adicionalmente, los peptidos se pueden modificar mediante enlaces covalentes a polfmeros, tal como PEG y/o otros grupos qmmicos. Dichas modificaciones se pueden hacer en los terminales y/o cadenas laterales de posiciones de reemplazo, a menos que sean ocupados por cadenas laterales ciclizados.
Los peptidos 1, 2, 3 y 4 en la tabla 5 (codificado durante su smtesis y purificacion como: A08P25s-s, A08P28s-s, J08P46s- s y Jo8P48s-s, respectivamente) son ejemplos de realizacion que cubren aspectos esenciales de los polipeptidos de la invencion, que incluyen: tamanos diferentes, con y sin segmentos secundarios y las posiciones principales de reemplazo. Estos peptidos se seleccionan para demostrar su efecto en modelos de tumor in vivo: simulacion estructural en el fragmento de peptidos cnpticos que tiene actividad citotoxica en el polipeptido p25 que genera moleculas de peptidos de hasta 20 aa., que reproducen efectivamente la actividad antitumoral de p25, ventajosamente, para ser utilizada en terapia contra el cancer.
Ejemplo 12. Evaluacion de actividad antitumoral de peptidos dclicos optimizados en modelos de tumor de xenoinjerto y singeneicos
Con el objetivo de evaluar la actividad antitumoral de la nueva familia de peptidos dclicos de la presente invencion, estos peptidos imitando la estructura de la region activa del polipeptido p25, se seleccionan 4 modelos de peptido que comprende variantes de diferentes inserciones y ciclizacion de esta familia. Fueron peptidos 1, 2, 3 y 4 en la tabla 5 (codificados para evaluar la actividad como A08P25s-s, A08P28s-s, J08P46s-s y J08P48s-s, respectivamente). Como grupo de control positivo se utilizo un grupo tratado con el polipeptido CIGB370r.
Ratones hembra C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad, de 22 g de peso fueron suministrados por el National Center for Laboratory Animal Production (CENPALAB, Havana, Cuba) y se alojaron bajo condiciones libres de patogenos en el of the Center for Genetic Engineering and Biotechnology (CIGB). Se llevaron a cabo experimentos de acuerdo con las reglamentaciones para el manejo apropiado y cuidado de animales de laboratorio. El volumen de tumor se mide en cada caso (estimado por la formula: volumen = a2x (b/2), en donde na es el ancho y b es la longitud del tumor) y se evalua la supervivencia animal.
La supervivencia se compara entre grupos mediante la prueba Logrank. Se obtienen parametros estadfsticos con la ayuda del software GraphPad Prism 4.0 (Graph Pad Software, San Diego, CA, USA).
Se inyectan ratones C57BL/6 en el flanco derecho mediante ruta subcutanea (s.c.) con 50.000 celulas TC-1. Cuando los tumores fueron detectables, se aleatorizaron los ratones en grupos de tratamiento para evaluar el tratamiento con el tema de peptidos objetivos de estudio, para evaluarlos mediante diferentes rutas de administracion. Los animales que teman tumores recibieron 6 administraciones en dfas alternos, con 80 pm del peptido objetivo, solamente recibieron el vehfculo como control. Cinco ratones se utilizaron para cada grupo. Los animales fueron alojados bajo condiciones libres de patogenos, y se realizaron procedimientos de acuerdo con las buenas practicas para manejo y cuidado de animales de laboratorio.
La supervivencia fue estadfsticamente significativa en todos los grupos tratados, en comparacion con el grupo que recibe el vehfculo. La figura 6 muestra 3 bloques: 1) el bloque de mas alta supervivencia, incluyen los grupos tratados con el peptido J08P48s-s y CIGB370r, respectivamente, sin diferencias estadfsticamente significativas entre ellas; 2) el bloque de supervivencia intermedio, que incluye los grupos tratados con los peptidos A08P28s-s, A08P25s-s y J08P46s-s, respectivamente, sin diferencias estadfsticamente significativas entre ellas y diferentes del bloque 1; y 3) el grupo de control negativo. Estos resultados demuestran que la nueva familia de peptidos descrita aqrn, representada por los peptidos evaluados en este modelo, es capaz de alcanzar la actividad descrita para el polipeptido de origen.
Ademas de la ruta intratumoral, en este modelo TC-1 se exploro otras rutas de administracion para los peptidos, como la ruta intraperitoneal. La figura 17 muestra que los peptidos dclicos, (por ejemplo, el peptido J08P48s-s), reproducen los efectos observados en este modelo para el polipeptido CIGB370r cuando se administran mediante ambas rutas. Esto evidencia la efectividad de los peptidos dclicos de la presente invencion para tratar tumores solidos distales.
Los efectos en el sistema Gly255-Ser274 lineales (peptido N06P87) y otros dos modelos de peptidos dclicos de la presente invencion se comparan con el efecto del polipeptido CIGB370r en el modelo de cancer de colon humano Ls174T en ratones NIH atfmicos, con dosis y programas mostrados en la figura 19. Despues de 13 dfas, se implanto uno de los tumores y se hizo palpable, las biomoleculas empezaron a ser administradas (figura 19A). Los peptidos se administraron
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en dosis a baja escala: 2 administraciones de 600 pm cada 48 h, seguido por 4 administraciones de 330 pm cada 48 h y 4 administraciones finales de 90 pm cada 72 h. El ClGB370r se administro semanalmente durante 4 semanas.
En este caso y diferente del peptido lineal, los peptidos dclicos mostrados en la figura 19 fueron capaces de aumentar significativamente la supervivencia de animales tratados (prueba Logrank: p <0.05), en comparacion con el grupo que recibe el vetuculo y con el peptido N06P87 lineal. Los valores T/C relacionados con el volumen de tumor medio (figura 19B) fueron: 35%, 35%, 37% y 72%, para los peptidos A08P25s-s, J08P48s-s, CIGB370r y N06P87, respectivamente. Estos resultados demuestran que los peptidos dclicos de la presente invencion imitan la estructura tridimensional del sitio activo antitumor de p25, son utiles para desarrollar terapias antineoplasicas. Los peptidos de la presente invencion muestran diversas ventajas farmacocineticas y farmacodinamicas en comparacion con sus protemas nativas.
Ejemplo 13. Espectro de amplia accion de peptidos dclicos de la presente invencion en estirpes de celulas de tumor humano de diverso origen histologico
Los peptidos de la presente invencion se evaluan en diversas estirpes de celulas de tumor humano, de diverso origen histologico y utilizando el metodo B de sulforodamina (Skehan P, Storeng R, Scudiero D, et al., (1990) “New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening”. J. Natl. Cancer Inst. 82: 1107-1112).
La figura 18 muestra, como ejemplo, un peptido de espectro de amplia accion en estirpes de celulas evaluadas, que muestran un efecto de respuesta de dosis. Esto evidencia que estas moleculas novedosas son utiles para tratar tumores malignos para diverso origen histologico, tal como: carcinoma de laringe (HEp-2), cancer de pulmon microdtico (H82), cancer de pulmon no microcftico (H125), cancer de cuello uterino (HeLa, Caski) y gliomas (U87), entre otros.
Ejemplo 14. Inhibicion de formacion de estructura tubular en matrigel
Actualmente, la comunidad cientffica internacional ha establecido bien que la combinacion es la clave para la terapia contra el cancer, especialmente al combinar la accion directa en celulas tumorales (inhibiendo su proliferacion u originando su muerte) junto con la accion del entorno del tumor para inhibir la angiogenia. Por esa razon, la actividad antiangiogenica de los peptidos de la presente invencion se evalua, mediante el metodo de evaluacion de la formacion de cadenas de celulas endoteliales mediante celulas endoteliales derivadas de vasculatura humanas (HMEC) en matrigel (Crum R, Szabo S, Folkman J. (1985). Science. 230:1375-8). La figura 20 muestra la capacidad de loa peptidos dclicos de la presente invencion para inhibir la formacion de estructuras tubulares, dependiendo de la concentracion utilizada, y que muestra su actividad antiangiogenica.
Ejemplo 15. Estructuras de peptidos con propiedades de autoensamble, con base en peptidos dclicos derivados de Serratia marcescens
Los peptidos de la presente invencion tienen caracter anfipatico, proporcionado por la segregacion de parches hidrofobos e hidrofilos sobre la superficie de los peptidos. El parche hidrofobo se forma principalmente por cadenas laterales de residuos Tyr259, Phe269 y Leu270, que asemejan su estructura en la estructura 3D de la protema p50. El resto de la superficie se forma, principalmente, por residuos polares o cargados. Este caracter anfipatico permite a los peptidos formar agregados supramoleculares nanometricos y/o micrometricos, como se muestra en la micrograffa de la figura 21. La agregacion de peptidos se puede mediar adicionalmente por la formacion de segmentos que implican puentes de hidrogeno intermolecular de cadena principal y cadenas laterales. Las estructuras extendidas de segmentos secundarios de terminal C y N de los peptidos de la presente invencion pueden favorecer un tipo de agregacion bajo determinadas condiciones de formulacion, para aplicaciones novedosas en terapia contra el cancer, tal como: terapia combinada y en el campo de sistemas de liberacion controlada y nanobiotecnologfa (Monica C. Branco, Joel P. Schneider. Acta Biomaterialia 5 (2009) 817-831).
Ejemplo 16. Peptidos dclicos antiangiogenicos y antitumorales combinados con prodigiosina, que muestra efecto citotoxico en celulas tumorales
Las prodigiosinas aisladas de Serratia marcescens CMIB4202 (Abrahantes-Perez MC, Reyes-Gonzalez J, Veliz Rios G, et al., (2006) Cytotoxic proteins combined with prodigiosin obtained from Serratia marcescens have both broad and selective cytotoxic activity on tumor cells. J Chemother. 18: 172-81) se combinan con peptidos dclicos de la presente invencion, por formulaciones adecuadas, o por medio de enlaces covalentes, ya sea mediante smtesis qmmica directa o mediante reacciones qmmicas entre moleculas sencillas. Los peptidos dclicos tales como A08P25s-s, A08P28s-s, J08P46s-s y J08P48s-s s mejoran la actividad citotoxica de la prodigiosina en diferentes extirpes de celulas tumorales humanas (como A549, A375, PC-3, U87, etcetera) evaluada por el metodo SRB (Skehan P, Storeng R, Scudiero D, et al., (1990) “New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening”. J. Natl. Cancer Inst. 82: 1107-1112), que muestra valores GI50 en el rango nm y reducen la actividad citotoxica que resulta de la accion del prodigiosina en fibroblastos primarios en por lo menos un orden de magnitud. Esto sugiere que el mecanismo de accion de ambas moleculas difiere entre sf y por lo tanto, se pueden combinar con resultados ventajosos en terapeuticos contra el cancer.
Ejemplo 17. Obtencion de una composicion farmaceutica de peptidos dclicos antiangiogenicos y antitumorales encapsulados con polfmeros de la familia de acido polilactico-co-glicolico (PLGA)
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Con el fin de modificar la farmacocinetica y distribucion de los peptidos de la presente invencion, de acuerdo con la indicacion terapeutica oncologica deseada para cada caso particular, se exploro la encapsulacion de estos peptidos dclicos junto con polfmeros en las microesferas PLGA. Para este proposito, se prepara una solucion que contiene el polfmero de acido plicolico y acido lactico 50: 50 en 10% (p/v) al disolver 1 g del polfmero en diclorometano. Un mililitro de la solucion polimerica se mezcla con 200 pL de una solucion acuosa que contiene por lo menos uno de los peptidos de la presente invencion, tal como los peptidos A08P25s-s, A08P28s-s, j08P46s-s y j08P48s-s en concentraciones que vanan de 20-40 mg/mL. Esta mezcla se somete a sonicacion durante 30 s al utilizar una punta de ultrasonido. La emulsion resultante se vierte en 40 mL de alcohol polivimlico al 1% y se obtiene la segunda emulsion (p/o/p) mediante agitacion de las dos fases a 14 000 en un homogeneizador Ultraturrax T8. La emulsion doble se vierte en 140 mL de alcohol polivimlico al 0.1% 30 000-70 000 y se agita en un homogeneizador a 300 rpm durante 1 h para evaporar el diclorometano. Finalmente, se recolectan microesferas mediante filtracion, se lava cinco veces con 50 mL de agua destilada cada uno y se congela/seca en un liofilizador. Se almacenan las microesferas secas a 4°C hasta la aplicacion.
Las microesferas que contienen peptidos dclicos tales como A08P25s-s, A08P28s-s, J08P46s-s, J08P48s-s con excipientes se obtienen como se describe, pero agregando Pluronic F-127 (10 mg) y NaCl (0.5 mg) en la fase acuosa interna. Se administran ambos tipos de microesferas subcutaneamente cerca a los tumores en ratones atfmicos que llevan tumores A375 de melanoma humano implantados. Se administra una unica dosis cuando los tumores alcanzan volumenes por encima de 200 mm3, alcanzando resultados similares a aquellos obtenidos despues de administraciones multiples (tres veces una semana durante 4 semanas), para relaciones T/C menores del 10% para volumenes de tumores y mayor de 170% para supervivencia.
Ejemplo 18. Obtencion de liposomas convencionales cargados con peptidos dclicos antiangiogenicos y antitumorales.
Se disuelve fosfatidil colina, en una concentracion de 10 mg/mL, en etanol absoluto en un matraz de fondo redondo de 50 mL. El lfpido se seca por medio de rotoevaporacion a temperatura ambiente hasta que se forma una capa en las paredes del recipiente. Para el proposito de encapsulacion en liposomas en por lo menos uno de los peptidos dclicos descritos en la presente invencion, tal como A08P25s-s, A08P28s-s, J08P46s-s y J08P48s-s, la capa de lfpido seco se hidrata mediante homogeneizacion con una solucion regulada que contiene por lo menos uno de los peptidos mencionados anteriormente. Para reducir el tamano de los liposomas, la preparacion que contiene los liposomas cargados con dichos peptidos se somete a etapa de extrusion sucesiva a traves de una membrana de policarbonato con poros de un promedio de 100 nm de diametro, hasta que los liposomas tienen un tamano de aproximadamente 100 nm. Se separan los peptidos libres de los liposomas cargados con peptidos al centrifugar la suspension a 100 000 * g durante 40 min a 4°C. Se recolecta el sobrenadante en un frasco limpio y se suspende el precipitado con una solucion salina regulada con fosfato en pH 7.2. Despues de una segunda etapa de centrifugacion en las mismas condiciones, se recolecta el sobrenadante en un frasco limpio y se lava con el primer sobrenadante de centrifugacion. El precipitado (liposomas cargados con peptidos dclicos de la presente invencion) se resuspende en solucion salina regulada con fosfato en pH 7.2. Esta preparacion final se almacena a 4°C hasta uso. Los liposomas cargados con por lo menos uno de los peptidos de la presente invencion se administran como una dosis unica a ratones que tienen tumor TC-1, reproduciendo los resultados obtenidos despues de multiples administraciones de los peptidos no encapsulados (vease ejemplo 12).
Ejemplo 19. Peptidos dclicos antiangiogenicos y antitumorales con capacidad para unir iones metalicos y dirigir el farmaco a un organo espedfico.
La composicion de aminoacidos de los peptidos de la presente invencion proporciona la capacidad de unir iones metalicos como radiometales y metales paramagneticos para utilizarlos como farmaceuticos, sin afectar sus propiedades biologicas.
Se pueden generar complejos de iones de metal-peptidos mediante diferentes procedimientos ffsico-qmmicos, en los sitios indicados en los ejemplos anteriores. Entre los radiometales encontramos los isotopos de Tc, Re, Au, Ag, Pd, As, Cu, Hg y Ru. El producto de la reaccion entre el ion metalico y el peptido es un complejo entre ambas moleculas, que demuestra dirigirse espedficamente tumores y metastasis de diversos ongenes histologicos en modelos animales (ratones C57BL/6) que tienen el tumor TC-1. Estos complejos se pueden utilizar para diagnostico de cancer y terapeuticos en una forma muy espedfica, minimizando su captacion mediante organos y tejidos fisiologicamente normales.
Para el caso de complejos de peptidos de la presente invencion con radioisotopos para diagnostico de cancer y terapia, los radioisotopos pueden ser, por ejemplo: 99Tc y 131I. Los peptidos de union metalica, como se explica en esta invencion, se pueden utilizar para administracion directamente o conjugada a otras moleculas portadoras.
Con el fin de dirigir los peptidos de la presente invencion directamente al tumor para alcanzar su acumulacion dentro de este, en comparacion con tejidos normales y organos, se sintetiza un complejo formado por peptidos, tal como A08P25s- s, A08P28s-s, J08P46s-s y J08P48s-s, ligados covalentemente al polietilenglicol de acuerdo con el ejemplo 8. Se formulan adicionalmente con nanopartfculas de oxido de hierro, que generan un complejo de vector nanoparticulado magnetico cuyos constituyentes principales son: peptidos dclicos antitumorales de la presente invencion, la molecula de polfmero y la nanopartfcula de oxido de hierro. El complejo se administra intravenosamente (mediante la vena de la cola del raton) a ratones C57BL/6 que llevan el tumor subcutaneo TC-1 (ubicado en el flanco derecho de los animales) cuando el volumen del tumor esta por encima de 200 mm3. Un campo magnetico se aplico localmente a la region del tumor y el complejo se
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transforma a traves del torrente sangumeo y se concentra en el tumor (Lubbe AS, Bergemann C, Alexiou C. Targeting tumors with magnetic drugs. In: Page M, editor. Cancer drug discovery and development: tumor targeting in cancer therapy. Totowa NJ: Humana Press Inc; 2003. pp. 379-88). Un programa de administracion y dosis similar a aquel mostrado en el ejemplo 12 se utiliza como grupo de control y el grupo de control negativo solo recibe el veldculo desprovisto de peptidos antitumorales. El efecto antitumoral en el grupo tratado con el vector magnetico nanoparticulado que lleva los peptidos antitumorales demostrador reducir el volumen del tumor antes que los controles positivos (p <0.05) y la supervivencia fue significativamente mayor en el resto de los grupos (p <0.05). Estos resultados demostraron el potencial de esta tecnologfa para alcanzar el efecto terapeutico descrito para los peptidos dclicos de la presente invencion, con base en la capacidad para concentrar una mayor cantidad de moleculas terapeuticas en el tumor.
Ejemplo 20. Efecto sinergico de combinar los peptidos dclicos andantiangiogenicos y antitumorales con citostaticos convencionales.
La sinergia del efecto antineoplasico de peptidos de la presente invencion (tal como, A08P25s-s, A08P28s-s, J08P46s-s, J08P48s-s) cuando se combinan por separado con un grupo de citostaticos convencionales se evalua, bajo las siguientes condiciones experimentales. Se cultivan celulas A549 (celulas de cancer de pulmon no microdticos) en placas de 96 pozos en presencia de uno de los peptidos previamente mencionados en un rango de concentracion de 200-12.5 pm. Simultaneamente, por lo menos uno de los citostaticos seleccionados para este estudio se agrega (Cisplatin, Paclitaxel, 5-Fluorouracil, Vincristine, Doxorubicin, Cyclophosphamide, Mitomycin C, Imatinib, Velcade, Iressa) en concentraciones que varian de 1-2000 nM y la incubacion se extiende por 72. En ese tiempo, la viabilidad celular se revela por el metodo MTT. Finalmente, se mide la absorbancia en 570 nm para todos los casos y se grafica la curva de respuesta de dosis respectiva. Los valores de dosis reducen el 50% de proliferacion celular (IC50) para cada citostatico que se reduce en uno o dos ordenes de magnitud cuando se combina simultaneamente con por lo menos uno de los peptidos de la presente invencion. Los resultados de estos ensayos demuestran una mejora del efecto antineoplasico de la combinacion farmaceutica que comprende los peptidos dclicos de la presente invencion junto con los compuestos citostaticos mencionados en esta invencion.
Ejemplo 21. Mejora del efecto antitumoral de la combinacion farmaceutica en un modelo animal de cancer
Para este proposito, se inoculan 5x106 celulas A549 mediante ruta subcutanea en la region dorsal en ratones sin pelo de 6 a 8 semanas de edad (ratones Balb/C). Despues de 10 dfas, cuando los tumores eran detectables (aproximadamente 30 mm3), se administra la combinacion farmaceutica de la invencion. Los componentes de la invencion se administran mediante ruta intraperitoneal, que comprende por lo menos uno de los peptidos dclicos de la presente invencion (tal como: A08P25s-s, A08P28s-s, J08P46s-s y J08P48s-s), formulados en un vehfculo adecuado y bajo el mismo programa y dosis mostrados en el ejemplo 12. Citostaticos como cisplatina, ciclofosfamida, y mitomicina C se proporcionaron simultaneamente mediante administracion diaria intraperitoneal de 1 mg/kg de peso corporal, con la misma frecuencia de tratamiento. Se disuelven citostaticos en el mismo vehfculo que los peptidos. Finalmente, los volumenes de masas de tumor se miden y grafican contra el tiempo para evaluar el efecto antineoplasico in vivo. Los resultados indican que la combinacion farmaceutica de la invencion produce una mejora del efecto antitumor, promoviendo la regresion completa de la masa de tumor cuando se administran ambos ingredientes simultaneamente. Una inhibicion significativa del crecimiento del tumor y tambien un aumento significativo en la supervivencia animal se observaron, en comparacion con el grupo de placebo. Todo esto demuestran que la accion sinergica entre los componentes de la combinacion farmaceutica de la invencion tambien es efectiva in vivo, de acuerdo con los resultados obtenidos en un modelo de cancer preclmico predictivo.

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    REIVINDICACIONES
    1. Peptidos dclicos que tienen actividad antineoplasica y antiangiogenica, en el que dicho peptido tiene una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste de la secuencia identificada en la lista de secuencias como secuencias SEQ ID No. 1-76.
  2. 2. Los peptidos dclicos de la reivindicacion 1 para uso en el tratamiento de cancer, trastornos relacionados con proliferacion celular indeseada o angiogenia indeseada.
  3. 3. Peptidos dclicos de la reivindicacion 1 o 2 para uso en el tratamiento de cancer, trastornos relacionados con proliferacion celular indeseada o angiogenia indeseada, en el que por lo menos uno de dichos peptidos se administra en o se prepara para administracion en una cantidad efectiva a un individuo en necesidad de tratamiento.
  4. 4. Los peptidos dclicos para uso de acuerdo con la reivindicacion 3, en el que dicha administracion o dicha preparacion para administracion comprende adicionalmente la administracion de un agente seleccionado del grupo que consiste de un grupo no fluorescente, una partfcula semiconductora fluorescente, un agente paramagnetico o superparamagnetico, y un radioisotopo.
  5. 5. Una composicion farmaceutica que comprende por lo menos uno de los peptidos de la reivindicacion 1 y excipientes o vetnculos farmaceuticamente adecuados.
  6. 6. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 5, en el que los peptidos hacen parte de un sistema de liberacion controlada o de un sistema que pertenece al campo de la nanobiotecnologfa.
  7. 7. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que dicho sistema de liberacion controlada es capaz de formar liposomas, microesferas, o estructuras de autoensamble con los peptidos de la reivindicacion 1.
  8. 8. La composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 5, que comprende adicionalmente a un agente seleccionado del grupo que consiste de una partfcula semiconductora, un agente paramagnetico o superparamagnetico y un radioisotopo.
  9. 9. Un compuesto para diagnosticar cancer caracterizado porque comprende por lo menos uno de los peptidos de ala reivindicacion 1 y un agente para formacion de imagenes, en el que dicho agente para formacion de imagenes se selecciona del grupo que consiste de un grupo fluorescente, un grupo no fluorescente, una partfcula fluorescente semiconductora, un agente paramagnetico, o superparamagnetico y un radioisotopo.
  10. 10. Una combinacion farmaceutica que comprende por lo menos uno de los peptidos de la reivindicacion 1 junto con por lo menos un agente de tratamiento seleccionado del grupo que consiste de farmacos antineoplasicos y hormonas.
  11. 11. La combinacion de la reivindicacion 10, en el que dicho peptido se conjuga directamente con dicho agente de tratamiento mediante enlaces covalentes o mediante un elemento de acoplamiento.
  12. 12. La combinacion farmaceutica de la reivindicacion 11, en el que dicho agente se selecciona del grupo que consiste de un residuo de aminoacidos, un hidrocarbilo y un hidrocarbilo substituido.
  13. 13. Una combinacion farmaceutica que comprende por lo menos uno de los peptidos de la reivindicacion 1 y prodigiosinas o sus derivados.
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9908919B2 (en) * 2013-07-25 2018-03-06 Novartis Ag Cyclic apelin derivatives for the treatment of heart failure
WO2015013168A1 (en) * 2013-07-25 2015-01-29 Novartis Ag Cyclic polypeptides for the treatment of heart failure
US9683018B2 (en) * 2013-07-25 2017-06-20 Novartis Ag Disulfide cyclic polypeptides for the treatment of heart failure
WO2015013169A2 (en) * 2013-07-25 2015-01-29 Novartis Ag Bioconjugates of synthetic apelin polypeptides
ES2930029T3 (es) 2014-04-15 2022-12-05 Univ California Péptidos de unión a integrina pegilados biterminales y métodos para su uso
CN109503701B (zh) * 2018-07-20 2022-03-15 北京工业大学 一种环肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用
CN111662363A (zh) * 2020-06-22 2020-09-15 上海大学 环肽类抗肿瘤活性化合物及其制备方法与应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1539204A1 (en) * 2002-08-30 2005-06-15 Biopharmacopae Design International Inc. Plant extracts for treatment of angiogenesis and metastasis
CU23475A1 (es) * 2004-07-08 2009-12-17 Ct Ingenieria Genetica Biotech Composición farmacéutica conteniendo fragmentos polipeptídicos de serralisinas
WO2007022557A1 (en) 2005-08-23 2007-03-01 Diatech Pty Ltd Mimotopes of epstein-barr virus (ebv) epitopes
BRPI0617186A2 (pt) * 2005-10-08 2011-07-19 Potentia Pharmaceuticals Inc uso de análogo de compstatina, implante ocular, micropartìcula ou nanopartìcula, composição, composto multivalente, ácido nucléico, vetor de expressão, célula hospedeira recombinante, proteìna de fusão e método de produção e teste
ITTO20060852A1 (it) * 2006-11-30 2008-06-01 Univ Degli Studi Torino Peptidi metastasi-specifici e loro applicazioni diagnostiche e terapeutiche
RU2488592C2 (ru) * 2007-08-08 2013-07-27 Дзе Борд Оф Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Техас Систем Пептиды направленного действия на vegfr-1/nrp-1
MX2010014173A (es) * 2008-06-20 2011-06-20 Stem The Board Of Regents Of The University Of Texas Sy Peptidos de señalizacion de la crkl.
US20100015058A1 (en) * 2008-06-25 2010-01-21 Stanford University Radiolabeled bbn-rgd heterodimers for cancer targeting

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