KR20140042796A - 항종양 및 항혈관생성 활성을 갖는 사이클릭 펩타이드 - Google Patents

항종양 및 항혈관생성 활성을 갖는 사이클릭 펩타이드 Download PDF

Info

Publication number
KR20140042796A
KR20140042796A KR1020137027692A KR20137027692A KR20140042796A KR 20140042796 A KR20140042796 A KR 20140042796A KR 1020137027692 A KR1020137027692 A KR 1020137027692A KR 20137027692 A KR20137027692 A KR 20137027692A KR 20140042796 A KR20140042796 A KR 20140042796A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
amino
acid
group
peptide
peptides
Prior art date
Application number
KR1020137027692A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101958964B1 (ko
Inventor
마리아 델 카르멘 아브라한테스 페레즈
그래이 씨네아 산티아고
에듀알도 마르티네즈 다이아즈
힐다 엘리사 가래이 페레즈
오스발도 레예스 아코스타
에르네스토 로페즈 모라
크루즈 마틸드 로페즈 아바드
소니아 곤잘레스 블란코
Original Assignee
센트로 데 인제니에리아 제네티카 와이 바이오테크놀로지아
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 센트로 데 인제니에리아 제네티카 와이 바이오테크놀로지아 filed Critical 센트로 데 인제니에리아 제네티카 와이 바이오테크놀로지아
Publication of KR20140042796A publication Critical patent/KR20140042796A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101958964B1 publication Critical patent/KR101958964B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/4025—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. cromakalim
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5021—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/5031—Organic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, poly(lactide-co-glycolide)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

본 발명은 항종양 및 항혈관생성 특성들을 갖는 사이클릭 펩타이드, 및 그 약제학적으로 허용가능한 염 및 이를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 상기 사이클릭 펩타이드는 인간 및/또는 가축 치료용 약물들의 제조에 사용되고, 진단에도 사용될 수 있다. 본 발명의 복합체는 세포 번식과 관련된 다양한 질환들, 예를 들어 종양성 질환들 및 원치 않는 혈관생성과 같은 질환들을 검출, 모니터링 및/또는 조절하는데 사용될 수 있다. 더 나아가, 상기 복합체는, 자가-조립 능력을 보유하기 때문에 조절 방출 시스템 및 나노생명공학 분야와 관련된 시스템의 일부가 될 수 있고, 다른 시스템들의 부분이 될 수도 있다.

Description

항종양 및 항혈관생성 활성을 갖는 사이클릭 펩타이드 {Cyclic peptides with an anti-neoplasic and anti-angiogenic activity}
본 발명은 생명공학 및 약학산업 분야와 관련된 것으로서, 더욱 구체적으로는, 종양학적 질병들 또는 바람직하지 않은 세포 번식을 포함하는 다른 질환들의 진단 및 치료를 위한 사이클릭 펩타이드를 고안하고 제조하는 것에 관한 것이다.
암은 미조절된 세포 분열 및 성장이라는 특징을 갖는 질병이다. 암세포들은 근원 장기에 침투할 수 있는 능력을 갖게 되며, 혈류 및 림프를 통하여 원격 장기들로 퍼지고, 그곳에서 정착 및 성장한다. 이는 매우 이종적 과정 (heterogeneous process)이지만, 매우 다양한 진화의 200여 종류의 암들에 대해서 공통적이다. 이러한 질병이 진전되기 위해서는 몇몇 유전자들이 동시에 변이되어야 한다. 상기 모든 특징들로 인해서, 악성 종양들의 메카니즘을 연구하고 풀어내는 데에 있어서 복잡성이 증가되며, 따라서, 암 연구는 폭넓고 여러 학문 분야에 걸쳐있으며, 이를 탐구하는데 몇몇 분야들이 포함된다. 특히, 상기 질병은 관련성 측면에서 전세계적으로 2위의 사인이 되고 있으며, 2020년 경에는 제1의 사인이 되어, 심혈관 질환보다도 빈번한 사인이 될 것으로 예측된다 (Forteza F (2004) Avances mediicos de Cuba. 40:33).
실제로, 암은 이미 선진국들에서는 제1의 사인이 되었으며, 개발도상국들에서는 제2의 사인이 되고 있다 (세계보건기구. The Global Burden of Disease: 2004 Update. Geneva: World Health Organization; 2008). 최근에 암 발생 빈도도 증가하고 있는데, 이는 노령화가 가속화되고, 암 유발 위험성이 높은 생활습관-신체활동 부족, 흡연 및 "서구식" 식습관에 기인한 것이다.
GLOBOCAN 2008은 2008년을 기준으로 12,700,000명의 환자들이 암을 보유한 채 살아가고 있으며, 7,600,000명이 사망하였고; 그 중에서, 56%의 환자들 및 64%의 사망자들이 개발도상국에서 발생한 것으로 보고한 바 있다 (Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers CD, Parkin D. GLOBOCAN 2008, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC Cancer Base No. 10. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer; Available from: http://globocan.iarc.fr. 2010. Accessed 8/17/2010).
암 생존률은 개발도상국들에서는 매우 낮은 경향이 있는데, 이는 아마도 진단이 너무 늦어진데 더해서, 시의적절한 치료에 대한 접근 가능성이 낮기 때문인 것으로 추정되며, 암 치료용으로 이미 이용가능하고 최적화된 세포독성 약물들과는 무관하다. 가까운 미래에 더욱 효과적이면서도 안전하고, 또한 암 치료 시장에 잘 사용될 수 있는 신세대 항암 약물을 개발하기 위해서는 새로운 생분자들이 요구된다.
현재, 효과적이기 위해서는, 암 치료는 다른 기작 원리들을 조합하여야 한다고 널리 받아들여지고 있으며, 예를 들어: 종양 세포들에 대한 직접 작용 및 종양 환경에 대한 효과가 그것이다. 이는 이러한 특성들 각각을 보유한 분자들을 개별적으로 조합함으로써 달성되거나, 또는 그들을 동시에 나타내는 분자를 사용함으로써 달성된다. 의심의 여지 없이, 이러한 후자 유형의 분자들은 약제학적 및 경제적 관점에서 장점을 갖는다. 종양에 대한 산소 및 영양분 공급을 방해하기 위한 목적으로 혈관생성 억제제를 사용한 전임상 시험들을 수행한 바 있으며, 그 결과 매우 유망한 결과들로서, 종종 억제제에 대한 저항성 없이 완전한 또는 부분적인 종양 감소를 달성하였다. 현재까지, 임상 실험들에서 얻어진 주된 결과물은 주어진 시간 동안 질병에 대한 지속적 보상을 얻을 수 있다는 점이었다. 이러한 목적으로, 항혈관생성제들이 다른 항종양제들과 조합되어 어주반트 치료법으로서 사용된다.
임상 실험 결과들을 통해서 지속적인 억제 반응을 위해서는 혈관생성 조절자를 단일 표적화하는 것은 불충분하다는 점이 밝혀진 바 있다. 따라서, 기존의 치료들과 비교할 때에 환자 수명 및 삶의 질을 현저하게 향상시킬 수 있도록 하기 위해서는, 종양 성장을 정지시키고 또한 되돌릴 수 있는 더욱 효과적인 항혈관형성제들이 절실하다.
현재, 치료적 목적으로 사용되는 수 많은 제제들 중에서 사용가능한 펩타이드들은 그다지 많지 않다. 실제로, 펩타이드들의 잠재성은 새로운 기술들의 도움으로 향상되고 있는데, 예를 들어 그 구조, 약물동태학, 생분포, 안정성 및 전임상 적용을 변형시키기 위한 새로운 기술들이 있다.
특히, 펩타이드들은 암 치료 분야에서 호응을 받고 있는데, 이는 이러한 펩타이드들을 변형시키고, 항암 효율성을 증가시킬 수 있는 새로운 방법들이 존재하기 때문이다 (Li, Zhi J.;　Cho, Chi H. Current Pharmaceutical Design, 16 (10), April 2010, pp. 1180-1189).
몇몇 연구들이 암 진단 및 치료에 펩타이드들을 사용할 수 있는 가능성을 보여준 바 있다. 그들 중 일부는 개발이 상당 부분 진전된 임상 단계에 있고, 최근 몇 년 동안 다른 신세대 물질들이 유망한 전임상 결과를 나타내며 개발되고 있다.
상피 성장 인자 수용체에 결합하도록 고안된 용균성 펩타이드의 세포독성 활성이 몇몇 인간 암 세포주들에서 보여진 바 있다. 상기 용균성 펩타이드의 결합으로부터 야기되는 입체적 변화가 암 세포들의 막에 결합하는 선택성을 증가시키고, 이와 같은 후천적 상승 효과가 종양 세포들의 선택적 파괴를 야기하는 것으로 입증된 바 있다. 상피 성장 인자 수용체에 결합하는 용균성 펩타이드로 처리하는 경우, 상기 용균성 펩타이드가 K-ras 돌연변이를 갖는 타이로신 키나아제들에 대해서 내성을 갖는 암 세포들에 대해서 인 비트로에서 세포 독성을 나타내는 것으로 보고된 바 있다 (Kohno, Masayuki. European Journal of Cancer 47(5), p.773, Mar 2011).
세포 투과성 펩타이드들은 암 치료법에 있어서 그 효율성을 높이기 위해서 보통 올리고뉴클레오펩타이드들과 결합된다. 이러한 목적을 위해서, Oct6 NLS의 N-말단에 결합된 글루탐산 펩타이드를 포함하는 세포 투과성 펩타이드들이 고안된 바 있으며, 이는 세포 핵 내로 함께 위치하고, 췌장 및 전립선암 세포주들에 의해서 흡수되는 것으로 보고된 바 있다 (Lewis, H Dan. BMC Biotechnology,10(1), p.79, Oct 2010).
천연 항응고 단백질인 조직 인자 경로 억제제 (tisue factor pathway inhibitor; TFPI)가 인 비보 모델에서 종양 성장 및 혈관생성을 차단할 수 있었다. 더 나아가, TFPI는 정상 세포들에는 그다지 뚜렷한 효과를 나타내지 않으면서도, 종양 전이 및 새로운 혈관들의 성장을 억제한다 (HEMBROUGH　Todd A.; RUIZ　Jose F.; SWERDLOW　Bonnie M.; SWARTZ　Glenn M.; HAMMERS　Hans J.; ZHANG　Li; PLUM　Stacy M.; WILLIAMS　Mark S.; STRICKLAND　Dudley K.; PRIBLUDA　Victor S. Blood A. 2004, vol. 103, no 9, pp. 3374-3380).
다른 종양들을 영상화하고 치료하기 위한 선택적 시약들의 개발이 암 치료 및 진단에 있어서 현재의 추세이다. 이러한 관점에서, 펩타이드들은 미리 정해진 분자 표적에 결합할 수 있도록 제조 또는 고안될 수 있는 작은 아미노산 서열들이며, 그 기능을 방해할 수 있는 잠재력을 갖는다. 이러한 특이적 펩타이드들이 암 발전 및 진전에 필수적인 특정 신호들의 성분들을 억제할 수 있다.
세랄리신은 박테리아인 Serratia marcescens CMIB4202의 주된 세포외 단백질이며, 인체에서 이러한 미생물의 병원성과 관련이 있고, 그 효소적 활성에 의존하여 항종양성 특성들을 갖는다 (Wu Jun, Akaike T, Hayashida K, et al., (2001) Japanese J. Cancer Res. 92:439-451). 이러한 균주에서 (S. marcescens CMIB4202), 가장 풍부한 세포외 단백질은 p50 단백질로서, 이는 세라리신 패밀리 (SERMA)에 속한다. 이러한 세라리신의 C-말단 비효소적 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 (p25로 명명)가 인 비보에서 일차 종양들의 상피 번식 및 성장과 전이에 대한 억제 활성을 갖는다는 것이 알려진 바 있다 (Abrahantes-Perez MC et al., "Pharmaceutical composition containing polypeptide fragments of serralysins." 국제특허출원 제WO 2006/005268호). 이러한 펩타이드는 대장균에서 재조합으로 발현된 경우 CIGB370r로 명명되었다.
따라서, 종양 질환의 발생이 증가하는 추세로 인하여, 더욱 효과적인 항종양제를 확인하고 제조하며, 이를 필요로 하는 환자들에서, 이러한 목적을 위해서 여러 약물들이 존재함에도 불구하고, 현재의 암 치료법을 대체하거나 보충할 수 있는 항종양제에 대한 수요가 크다.
본 발명은 전술한 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 항종양 및 항혈관생성 특성들을 갖는 사이클릭 펩타이드들을 제공함으로써 상기 문제점들을 해결하고자 한다.
이하, 본 발명에 따른 펩타이드 화합물들의 디자인 및 제조에 대해서 설명하며, 더불어 몇몇 동물 모델들에서 그 효능을 서술하고자 한다.
놀랍게도, S. marcescens p25 폴리펩타이드의 항종양 활성이 구조적으로 제한된 펩타이드 단편에 의해서 재현되었는 바, 상기 펩타이드는 세라리신의 N- 및 C-말단 도메인들 사이의 계면 내로 거의 노출되지 않는다. 이는 상기 폴리펩타이드의 해당 영역에서 구조적 형태가 p25 폴리펩타이드의 기능적으로 활성인 최소 구조 유닛으로서, 이는 세라리신 내부에 파묻혀서 아마도 단백질 자가촉매과정 (autocatalysis) 동안 노출되거나 또는 종양 단백질 분해 환경에서 1회 노출된다는 것을 암시한다. 본 명세서에 서술된 데이터는 본 발명에 따른 제한된 펩타이드들이 종양 세포들에 대한 직접적인 세포독성 활성 및 항혈관형성 활성을 나타냄을 보여주며, 감염에 의해서 매개되는 종양의 억제에 대한 가능성 있는 메커니즘 및 새로운 패러다임을 제시한다.
펩타이드들은 매우 유연한 분자들로서, 다른 구조들을 취할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 가능한 구조들이 특이적인 생물학적 관련성을 가질 수 있다. 가능한 관련성 있는 입체 형태들을 결정하기 위해서는, 펩타이드들을 입체 공간의 단일 영역 내로 제한시킬 필요성이 있으며, 더 나아가 그것들이 관련 있는 형태인지를 결정할 필요성이 있다. 궁극적으로, 이러한 입체 형태들 중 몇몇을 스크리닝함으로써, 생물학적으로 관련성 있는 것들을 찾아낼 수 있다.
더욱 정확한 합성 구조들을 제조하기 위한 새로운 방법들이 존재한다. 또한, 특정 유연성을 고려하여야 한다. 즉, 만약 원하는 구조가 너무 경직된다면, 인 비보에서의 그 생물학적 활성을 위해서 바람직한 특성들을 갖는 구조가 채택될 수 없는데, 반면에 약간 유연한 구조는 그러한 조절이 가능하다. 펩타이드 수용체들, 효소의 활성 부위들 및 다양한 다른 생물학적 과정들에 대해서 충족되어야 하는 요구조건들에 대한 그러한 가치있는 지식들은, 합성 펩타이드들을 디자인하기 위한 적당한 기술들 및 방법들을 사용함으로써 제공된다.
생물학적 시스템들에서 펩타이드에 의해서 나타나는 특성들은 펩타이드 구조에 의존한다. 따라서, 유용한 펩타이드들을 제조하기 위한 합리적인 디자인을 사용할 수 있는 능력은 분자 구조 및 그 생물학적 활성 사이의 특정 관계들을 확립하기 위한 각각의 기술에 의존한다. 그러한 관계를 파악하기 위한 기술들은 몇몇 불확실성을 갖는데, 이는 생물학적 분석 시스템들 뿐만 아니라, 데이터 해석으로부터도 유래한다. 더욱 복잡한 관련 인자는 펩타이드 자체의 3차원 구조를 결정하는 것이 어렵다는 점이다. 많은 펩타이드들은 자체적으로 유연성을 지니며, 용액 중에서 다양한 입체 형태를 갖는다. 문제점은 이러한 모든 가능한 구조들 중에서 어느 것이 관찰된 펩타이드의 활성과 관련이 있는지를 파악하기가 어렵다는 점인데, 특히 많은 펩타이드들이 하나 이상의 입체 형태에서 활성을 갖는다는 점을 고려하면 더욱 그렇다. 입체 구조에 제한을 가하는 방법을 사용하는 것은 그러한 구조-기능 관계를 파악하는데 유용할 수 있다. 만약 펩타이드가 매우 특정한 입체 형태, 또는 활성 입체 형태의 패밀리에 근접하게 닮은 입체 형태로만 제한된다면, 측정된 활성은 해당 구조의 효과를 직접적으로 나타내는 것이라 할 수 있다. 완전히 경직된 분자를 제조하는 것이 불가능한 경우라 하더라도, 규정된 구조적 모티프들을 갖는 유사체들을 디자인함으로써 특정 생물학적 활성들을 해당 분자의 인과 구조들에 대응시킬 수 있게 된다.
본 발명에서는, 10개 아미노산들이 중첩되며 20개 아미노산들로 이루어진 합성 펩타이드들을 사용함으로써 p50/p25 단백질의 서열 내에서 기능적 부위들을 물리적으로 지도화하였고, 또한 종양 세포들에 대한 인 비트로 세포독성 활성을 연구한 바 (실시예 2 참조), 펩타이드 Gly255-Ser274 (N06P87)이 활성을 가짐을 밝혀내었다. 그럼에도 불구하고, 이러한 펩타이드의 인 비보 활성은 p25 단백질에 의해서 나타나는 것보다 더 낮았다. 이에 더해서, p-25-유사 CIGB370r 재조합 폴리펩타이드 및 N06P87 합성 펩타이드 모두에서, Gly266-Asp268 세그먼트를 Ala-Ala-Ala 트리펩타이드로 치환할 경우, 두 분자 모두의 생물학적 활성이 파괴되었는 바, 이는 이러한 세그먼트가 항암 활성에 필수적이라는 점을 나타낸다. 또한, 이러한 결과는, 각각의 펩타이드 및 생물학적으로 활성인 단백질 입체 구조에 대한 3중 돌연변이로 인해서 야기되는 가능한 부정적 효과에도 불구하고, 아직 확인되지는 않은 수용체(들)과 상호작용하기 위해서는 Arg267 및 Asp268 잔기들에서 하나 또는 그 이상의 곁사슬들이 필요하다는 점을 암시한다. 이러한 관점에서, 일부의, 생물학적으로 관련성 있는 트리펩타이드의 구조가 p50의 결정학적 구조와 유사하다는 가정 하에서는, Gly266을 Ala로 치환하는 것은 매우 비선호적인 것이라 할 수 있는데, 이는 이러한 잔기의 주사슬은 알라닌 아미노산을 배척하는 포지티브 비틀림 각도를 갖기 때문이다 (도 14). 또한, 실시예 2에 나타낸 결과는 Gly266-Asp268 단편 자체가 존재하는 것만으로는 생물학적 효과를 달성하기에 불충분하고, 다른 잔기들이 또한 필요하다는 점을 입증한다. 표 2에 나타낸 바와 같이, Thr265-Trp284를 포함하고 선형 펩타이드 N06P87 (Gly255-Ser274)과 10개 잔기에서 중첩되는 서열을 포함하는 합성 펩타이드 F07P16은 Gly266-Asp268 서열을 포함하고 있음에도 불구하고 불활성이다.
본 발명에서는, 놀랍게도 Gly255-Ser274이 p50/p25의 항암 활성을 위한 작용 부위의 일부라는 점을 확인하였는데, 이러한 세그먼트가 p50 단백질의 3차원 구조 내에서 은성 (cryptic nature)을 갖기 때문이다. Gly255-Ser274 세그먼트에 존재하는 대부분의 아미노산들은 p50 단백질의 3차원 구조 내에서 완전히 또는 부분적으로 가려지며, 이러한 아미노산에는 Thr257, Tyr258, Gly259, Phe260, Thr265, Arg267, Phe269, Leu270 및 Thr272이 포함된다. 턴 Arg267-Leu270은 단백질의 N- 및 C-말단 도메인 사이의 계면 중 일부를 형성한다. 잔기 Arg267 및 Asp268은 N-말단 도메인 잔기들인 Asp98 및 Arg171 잔기들과 각각 염 다리 (salt bridge) (각각 이중 수소 다리)를 형성한다. 상기 계면은 또한 C-말단 도메인 중의 Phe269 잔기와 N-말단 도메인 중의 Ala232 및 Ala233 잔기들이 관여하는 소수성 인터-도메인 상호작용들을 포함한다. 부가적으로, 상기 부위의 은성은 p25 단백질이 p50 단백질에 비해서 더 높은 효능을 갖는다는 사실과 부합하는데, 이는 p25는 N-말단 도메인이 없고, 그 Gly255-Ser274 세그먼트가 더욱 노출되기 때문이다 (실시예 3, 도 5 및 표 3 참조).
본 발명에서는, N06P87 펩타이드의 입체 구조가 그 생물학적 활성에 필수적이라는 점을 입증하였다. N03P87 펩타이드 입체 구조와 그 생물학적 활성 사이의 관련성은 실시예 4의 결과로부터도 뒷받침되는데, 실시예 4에서는 그 활성이 분자의 적당한 폴딩을 가능케하는 측면 영역에 의존한다는 사실을 보여준다. 반면에, p25 폴리펩타이드는 재조합으로 발현되고 칼슘 부존재 하에서 복원 (renaturation)된 경우에는 활성을 나타내지 않았다. 따라서, 칼슘 원자들이 없는 폴리펩티드에 해당하는 미폴딩된 제조물들은 활성을 나타내지 않았다 (적당한 단백질 폴딩 및 안정화를 위해서는 칼슘 결합이 필요함). 부가적으로 실시예 4에서는, N-말단에 시스테인 잔기와 C-말단에 또 다른 시스테인 잔기를 첨가함으로써 N06P87 펩타이드에 이황화 다리결합을 도입하게 되면, 펩타이드의 생물학적 활성 손실이 촉진된다는 사실을 입증하였다 (표 4, 도 7에서 펩타이드 N06P89). 이러한 수단에 의해서 도입된 고리화는 용액 중에서 펩타이드가 접근가능한 입체 구조적 공간을 감소시키지만; 그럼에도 불구하고, 고리화는 p50 폴딩된 구조 중의 Gly255-Ser274 세그먼트에 의해서 채택된 입체 구조와는 양립될 수 없다. 단백질에 대한 결정학적 구조에 있어서 Gly255-Ser274 세그먼트의 아민과 카르복실 말단들 사이의 거리는 24.4 Å이며 (도 10E), 이는 이황화 다리결합 입체-화학과는 양립불가능한 것이다 (결합된 시스테인들 사이의 알파 탄소-알파 탄소 거리는 결코 7 Å보다 길지 않음). 따라서, 이러한 변형은 N06P87 중 펩타이드 사슬의 구조적 특성들에 대한 현저한 변화를 전제로 한다. 이러한 결과들 및 그들 각각에 대한 분석들은 N06P87 활성 입체 구조가 천연 p25 폴리펩타이드 중의 Gly255-Ser274 세그먼트의 입체 구조와 유사할 수 있다는 점을 암시한다.
실시예 2, 4 및 6에 나타낸 바와 같이, p25 폴리펩타이드의 생물학적 활성과 유사한 유사체들을 디자인하는 것이 가능하다. 본 발명에서는, N06P87 펩타이드의 구조에 기초하여 효능성의 짧은 펩타이드들 및 중간 크기 펩타이드들 (9 내지 25 잔기)로 이루어진 패밀리를 디자인하였으며, 특정 화학 작용기들 및/또는 구조적 제한사항들을 도입/치환시키는 방법에 의해서 상기 펩타이드들을 변형시킴으로써 (표 5), 상기 펩타이드들이 p25 폴리펩타이드의 효율 및 효능 수치와 유사하거나 또는 심지어 더 나은 수치를 갖도록 하였다.
효율 및 효능 이외에도, 본 발명에 따른 짧은 펩타이드들 및 중간 크기 펩타이드들은 항암제로서 천연 완전체 단백질과 비교할 때 몇몇 장점들을 갖는다. 일반적으로, 분자의 크기는 항암제의 약물동태학적 특성들에 영향을 주게 된다 (예를 들어, 생분포). 대표적인 예로는, 재조합 단일 사슬 항체들 (r-sc-Fv)이 그들 각각에 대한 항체들과 비교할 때, 조직들 및 종양들에 더욱 잘 접근할 수 있는데, 이는 완전체 항체들에게는 거의 불가능한 사항이다 (Cortez-Retamozo V, Backmann N, Senter PD, Wernery U, De Baetselier P, Muyldermans S, Revets H; (2004). Cancer Res. 64(8):2853-7).
항체 치료법들은 고형 종양들의 치료에 있어서 특히 제한된 효과만을 나타내고 있다 (Stern M, Herrmann R; (2005). Crit Rev Oncol Hematol.54(1):11-29). 일반적으로, 실험적 증거들에 따르면, 리간드의 약물동태학적 특성들은 그 크기를 감소시킴으로써 향상되는 것으로 알려져 있다 (Reilly R. M., Sandhu J., Alvarez-Diez T. M., et al. (1995). Clin. Pharmacokinet. 28: 126142). 짧은 펩타이드들 및 중간 크기 펩타이드들 (통상적으로 1 내지 3 kDa)은 적어도 부분적으로는 상기 항체-매개 항암 치료법이 갖는 문제점들을 극복할 수 있다 (Ladner R. C., Sato A. K., Gorzelany J., de Souza M. (2004). Drug Discov. Today 9: 525529). 특히, 펩타이드들은 더 나은 종양 투과성, 더 낮은 비특이적 흡수을 나타내고, 더 낮은 면역 반응을 야기한다. 그러므로, 본 발명에 따른 펩타이드들은 그들의 수용체와 최적의 상호작용을 갖고, 효율적인 생분포를 현저하게 보장할 수 있도록 디자인되었다.
보통의 경우, 20-25 잔기 길이의 짧은 펩타이드들 및 중간 크기 펩타이드들은 면역원성이 매우 낮지만, 이는 이종 단백질들, 특히 p25와 같은 미세유기체-유래 항원들에 대해서는 해당 되지 않는 사항이다. 치료제로서 상기 단백질들을 사용하는 것은 환자들에서 면역 반응을 유발할 수 있으며, 이는 상기 단백질의 치료적 효과를 중화시킬 수 있는 항체들의 유도를 수반한다. 이러한 효과는 치료제의 반복적 사용을 필요로 하는 만성 질환들을 치료하는 경우 특히 중요한 사항이다. 한편, 만약 미세유기체가 인간에 대한 병원균인 경우에는, 인구 중 일부에서 중화 항체들이 생성되었다는 점을 가정할 수 있고, 이는 치료전에 미리 존재하는 것들이므로, 요구되는 치료적 투여량을 증가시킬 수 있다. 이러한 관점에서, Gly255-Ser274 세그먼트의 분자 표면 중 상당 부분이 p50 단백질의 N- 및 C-말단 도메인들 사이의 계면 내에서 가려지게 되므로, 단백질의 천연 구조에서는 은성으로 나타나게 된다. 결과적으로, 결과물인 N06P87 펩타이드는 면역원성이 될 가능성이 매우 낮은데, 이는 항-p50 단백질 항체들이 N06P87 펩타이드를 인식 (중화)하는데 비효율적이기 때문이다. 그러므로, 치료 분자의 항원성/면역원성 능력면에 있어서, 완전체 단백질들보다는 펩타이드들을 사용하는 것이 바람직한데, 특히 펩타이드들이 천연 단백질의 생물학적 효과와 유사한 효과를 촉진할 수 있는 경우에는 더욱 그러하다.
본 발명에서, 효능 있는 항암제를 디자인하기 위해서 필수적으로 포함되는 사항은 사이클릭 펩타이드들을 디자인하는 것인데, 즉 N- 및 C-말단들에 위치하는 곁사슬들 및/또는 작용기들에 위치한 화학기들을 포함하는 공유 결합에 의해서 결합된 아미노산들을 포함하는 것이다. 따라서, 본 발명에서 고안된 펩타이드들은 고리화에 의해서 구조적으로 제한을 받게 되고, 이는 이러한 분자들의 구조적 유연성을 현저하게 감소시킨다. 일반적으로, 치료제로서 펩타이드들을 사용하게 되면 몇몇 단점들이 발생한다. 이는 펩타이드들의 내생적 유연성으로 인한 것인데, 특히 짧은 펩타이드들 및 중간 크기 펩타이드는 폴딩된 단백질들에 비해서 훨씬 더 유연하고, 따라서 이들이 단백질들 또는 다른 수용체 거대분자들과 결합하는 과정은 입체 구조 엔트로피의 상당한 손실을 수반한다. 이러한 사실은 이러한 분자들이 일반적으로 단백질-단백질 상호작용에 비해서 더 낮은 결합 친화력을 갖는 원인이 된다. 또한, 펩타이드들에 의해서 나타나는 낮은 친화도 (따라서, 결과적으로 낮은 효능)는 단백질-수용체 접촉 표면이 단배질-수용체 계면에 비해서 더 작다는 사실과도 관련이 있을 수 있으며, 특히 펩타이드들이 천연 단백질의 단편을 포함하는 경우 그러하다. 이러한 연유로, 수용체 결합에 대한 친화도 (따라서, 결과적으로 효능)를 증가시키기 위해서는 펩타이드들을 재디자인하고 화학적으로 변형시키는 것이 필요하다.
기존에, 감염-매개 종양 억제 (infection-mediated tumor regression) 모델로부터 유래된 폴리펩타이드로서 p25로 명명된 폴리펩타이드가 보고된 바 있으며, 이는 항혈관형성 특성 및 종양 세포들에 대해서 직접적인 효과를 나타내었다 (국제특허출원 No. WO 2006/005268). 본 발명에서는, p25 폴리펩티드의 활성 모티프와 유사하면서, 기원이 되는 분자에 비해서 몇몇 개선점들을 나타내는 펩타이드들에 기초한 플랫폼을 개발하였다. 박테리아로부터 유래된 천연 폴리펩타이드는 암을 치료하는 용도로는 제한된 횟수만큼만 가해질 수 있는데, 이는 그 활성을 중화시키고, 암과 같이 만성인 질환에 요구되는 장기간 치료를 방해할 수 있는 면역 반응들이 유도될 수 있다는 가능성 때문이다. 이러한 연유로 인해서 본 발명에서는, p25 폴리펩타이드에서 그 항암 활성과 유사한 활성을 갖지만, 종양학적 또는 원치 않는 세포 번식 병리학적 치료를 위한 장기 투여 기간 동안 네거티브 면역 반응을 유도할 수 없는, 최소 기능적 활성 유닛을 확인함으로써, 암 치료에 유용한 감염-매개 종양 억제 유래의 분자들을 개발하는데 연구의 초점을 맞추었다.
본 발명의 현저한 기여사항은, 감염-매개 종양 억제로부터 유래된 항종양 단백질들의 최소 기능적 활성 유닛과 구조적으로 유사한, 최대 25 아미노산 길이의 펩타이드 분자들을 개발할 수 있는 가능성을 열었다는 점이다. 놀랍게도, 이러한 작은 분자들은, 감염-매개 종양 억제에 있어서 패러다임으로 간주되고 있는 면역-매개 메카니즘에 의해서 종양에 대한 활성을 발휘하는 것이 아니다 (Paglia P, y Guzman CA. Cancer Immunol. Immunother. 1998. 46:88-92). 더 나아가, 본 발명의 또 다른 새로운 점은, 그러한 활성 영역들이 박테리아 단백질들의 노출 표면 상에 존재하지 않고, 일단 단백질이 효소적으로 소화된 이후에 표면에 노출된다는 점이다. 이러한 과정은 메탈로프로테이나아제 (metalloproteinase)가 풍부한 환경에서 발생될 수 있으며, 종양 세포들 및 종양관련 혈관생성에 대해서 강한 세포 독성 효과를 발생시킨다. 이는 기존에 감염-매개 종양 억제로 인한 것으로 간주되던 효능성 항종양 활성에도 기여할 수 있는 바, 지난 세기 동안 상기 분야는 암 치료법에 유용하고 종양 치료법에서 새로운 생명공학적 제품들이 될 수 있는 분자들을 예상하는 연구 분야이다. 본 발명에 있어서, 이러한 가설은 유효한 것으로 입증되었는데, 이는 본 발명에 따른 펩타이드들이 장기간에 걸친 치료에 있어서도 인 비트로 및 인 비보에서 항종양 효율성을 나타내었고, 그들의 지속적 투여를 제한하는 사항이 되는 중화 항체들의 존재에 대한 어떠한 증거도 발견되지 않았기 때문이다. 상기 펩타이드들을 제조하는데 사용된 기술들은 계량가능한 것이다.
본 발명의 대상은 항종양 및 항혈관생성 활성들을 갖는 사이클릭 펩타이드에 관한 것으로서, 상기 사이클릭 펩타이드는:
a) 하기 아미노산 서열을 갖는 세그먼트:
X1-Asn-Thr-X2-Arg-Asp-Phe-X3-X4
상기 서열 중,
X1 은 Ser, Cys, Lys, Asp, Glu 및 그 곁사슬이 설프히드릴 관능기, 아미노기 또는 카르복실기를 포함하는 비천연 아미노산을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산; 또는 테트라펩타이드, 펜타펩타이드 및 헥사펩타이드를 포함하는 군으로부터 선택된 서열이고,
X2는 Gly 또는 D-Ala 아미노산이고,
X3는 Leu, Cys, Lys, Asp, Glu 및 그 곁사슬이 설프히드릴 관능기, 아미노기 또는 카르복실기를 포함하는 비천연 아미노산을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산이고,
X4는 Ser, Cys, Lys, Asp, Glu 및 그 곁사슬이 설프히드릴 관능기, 아미노기 또는 카르복실기를 포함하는 비천연 아미노산을 포함하는 군으로부터 선택된 선택적 아미노산이다;
b) N-말단 세그먼트로서, 상기 a)에 서술된 세그먼트에 선택적으로 선행하는 하기 아미노산 서열을 갖는 세그먼트:
X-5-Asp-Thr-Val-X-4-X-3-X-2-X-1
상기 서열 중,
X-1은 Asn, D-Asp, D-Glu, D-Gln and D-Ala을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산으로서, 펩타이드 결합에 의해서 상기 a)에 서술된 X1 잔기에 결합되고, 상기 펩타이드 결합은 상기 X1 잔기 주사슬 상의 카르보닐기 및 상기 a)에 서술된 세그먼트의 X1 잔기 주사슬 상의 아미노기를 포함하고,
X-2는 Phe, Cys, Lys, Asp, Glu 및 그 곁사슬이 설프히드릴 관능기, 아미노기 또는 카르복실기를 포함하는 비천연 아미노산을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산이고,
X-3는 Gly 및 D-Ala를 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산이고,
X-4는 Tyr, Cys, Lys, Asp, Glu 및 그 곁사슬이 설프히드릴 관능기, 아미노기 또는 카르복실기를 포함하는 비천연 아미노산을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산이고,
X-5는 Gly 및 D-Ala를 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산이다;
c) 상기 a)에 서술된 세그먼트에 선택적으로 후행하는 C-말단 세그먼트로서, Thr-X+1X+2, Thr-X+1-X+2-X+3 및 Thr-X+1-X+2-X+3-X+4 를 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산이며,
상기 C-말단 세그먼트 중의 상기 N-말단 Thr 잔기는 펩타이드 결합에 의해서 상기 a)에 서술된 세그먼트에 결합되고, 상기 펩타이드 결합은 상기 N-말단 Thr 잔기 주사슬 상의 아미노기 및 상기 a)에 서술된 세그먼트의 X4 잔기 주사슬 상의 카르보닐기를 포함하고,
X+1은 Thr, Gly 및 Ala을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산이고,
X+2는 Ser, Asn, Cys, Lys, Asp, Glu 및 그 곁사슬이 설프히드릴 관능기, 아미노기 또는 카르복실기를 포함하는 비천연 아미노산을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산이고,
X+3은 Cys, Gln, Arg, Asn, Lys, Asp, Glu 및 그 곁사슬이 설프히드릴 관능기, 아미노기 또는 카르복실기를 포함하는 비천연 아미노산을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산이고,
X+4는 Gln, Arg, Asn 및 Lys을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산이다; 및
d) 상기 a)에 서술된 세그먼트의 X1 서열이 테트라펩타이드, 펜타펩타이드 또는 헥사펩타이드인 경우, 상기 펩타이드의 N- 및 C-말단의 아미노기 및 카르보닐기에 의해서 형성된 펩타이드 결합; X1 및 X4, 또는 X-4 및 X3, 또는 X-2 및 X+2, 또는 X-2 및 X+3가 시스테인 또는 그 곁사슬이 설프히드릴기를 포함하는 비천연 아미노산인 경우, X1 및 X4, 또는 X-4 및 X3, 또는 X-2 및 X+2, 또는 X-2 및 X+3 잔기들의 곁사슬 중의 설프히드릴기들을 포함하는 공유 이황화 다리결합; X1 및 X4, 또는 X-4 및 X3, 또는 X-2 및 X+2, 또는 X-2 및 X+3가 Lys (또는 곁사슬이 아미노기를 포함하는 비천연 아미노산) 및 Glu (또는 Asp 또는 곁사슬이 카르보닐기를 포함하는 비천연 아미노산)이거나, 또는 상기 잔기들이 각각 Glu (또는 Asp 또는 곁사슬이 카르보닐기를 포함하는 비천연 아미노산) 및 Lys (또는 곁사슬이 아미노기를 포함하는 비천연 아미노산)인 경우, 잔기 X1 및 X4, 또는 X-4 및 X3, 또는 X-2 및 X+2, 또는 X-2 및 X+3의 곁사슬들 중의 카르보닐기 및 아미노기를 포함하는 아미드 결합; 및 상기 펩타이드의 카르보닐 말단기 및 상기 잔기 X-2의 곁사슬 중의 아미노기를 포함하는 아미드 결합으로서, 상기 아미드 결합은 상기 X+2가 상기 펩타이드의 카르복실 말단 잔기, Asn 아미노산이고, X-2가 아미노산 Lys 또는 곁사슬이 아미노기를 포함하는 비천연 아미노산인 경우에 존재하는 아미드 결합을 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 공유 결합
을 포함하는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 사이클릭 펩타이드에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 사이클릭 펩타이드는 상기 펩타이드의 N- 및 C-말단들의 아미노기 및 카르보닐기 사이에서 형성된 펩타이드 결합을 포함하고, 상기 펩타이드의 X1 서열은 테트라펩타이드 아미노산 서열, 바람직하게는 (D-Ser)-Pro-Thr-Pro, (D-Ala)-Pro-Thr-Pro 및 Gly-Pro-Thr-Pro을 포함하는 군으로부터 선택된 서열이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 사이클릭 펩타이드는 상기 펩타이드의 N- 및 C-말단들의 아미노기 및 카르보닐기 사이에서 형성된 펩타이드 결합을 포함하고, 상기 펩타이드의 X1 서열은 펜타펩타이드 아미노산 서열, 바람직하게는 Arg-Arg-Pro-Asn-Ser, Arg-Arg-Pro-(D-Ala)-Ser, Lys-Lys-Pro-Asn-Ser 및 Lys-Lys-Pro-(D-Ala)-Ser을 포함하는 군으로부터 선택된 서열이다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 사이클릭 펩타이드는 상기 펩타이드의 N- 및 C-말단들의 아미노기 및 카르보닐기 사이에서 형성된 펩타이드 결합을 포함하고, 상기 펩타이드의 X1 서열은 헥사펩타이드 아미노산 서열, 바람직하게는 Thr-Pro-(D-Ala)-Gln-Asn-Ser, Arg-Pro-(D-Ala)-Gln-Asn-Ser, Thr-Pro-(D-Ala)-(BmGln)-(NmAsn)-Ser 및 Arg-Pro-(D-Ala)-(BmGln)-(NmAsn)-Ser을 포함하는 군으로부터 선택된 서열이고, 상기 BmGln은 아미노산 L-b-메틸글루타민이고, 상기 NmAsn은 아미노산 L-메틸 아스파라긴이다.
본 발명에서, 상기 사이클릭 펩타이드는 그 N-말단이, 아세틸기, 파이로글루타믹 아미노산, 지방 또는 폴리머, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된 것일 수 있고, 상기 결합은 직접적으로 또는 스페이서기, 바람직하게는 아미노산 Gly를 통해서 이루어질 수 있다. 더 나아가, 본 발명의 사이클릭 펩타이드는 그 C-말단이, 아미드 형태로 되거나, 또는 지방 또는 폴리머, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된 것일 수 있고, 상기 결합은 직접적으로 또는 스페이서기, 바람직하게는 아미노산 Gly를 통해서 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 사이클릭 펩타이드는 상기 펩타이드와 지방 또는 임의의 폴리머, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜과의 공유 결합을 포함할 수 있고, 상기 결합은 잔기 X1, X3, X4, X-2, X-4, X+2 or X+3의 곁사슬 중의 설프히드릴기, 아미노기 또는 카르복실기를 포함할 수 있으며, 상기 X1, X3, X4, X-2, X-4, X+2 or X+3 잔기는 Cys, Lys, Asp, Glu 또는 곁사슬이 설프히드릴기, 아미노기 또는 카르복실기를 포함하는 비천연 아미노산일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 사이클릭 펩타이드는 상기 X1, X3, X4, X-2, X-4, X+2 또는 X+3 잔기들이 아미노산 시스테인, (2R)-2-아미노-3-설파닐부탄산, (2R)-2-아미노-3-메틸-3-설파닐부탄산, (2S)-2-아미노-4-설파닐부탄산, 2-아미노-5-설파닐펜탄산, 2-아미노-3-설파닐펜탄산, 2-아미노-4-메틸-3-설파닐펜탄산, 2-아미노-3-메틸-4-설파닐펜탄산, 2-아미노-3,4-디메틸-3-설파닐펜탄산, 2-아미노-3-에틸-3-설파닐펜탄산, (2R)-2-아미노-3-메틸-3-설파닐펜탄산, (4S)-4-아미노-2-메틸-5-설파닐펜탄산, (4R)-4-아미노-2-메틸-5-설파닐펜탄산, (4R)-4-아미노-5-설파닐펜탄산, 및 (4S)-4-아미노-5-설파닐펜탄산을 포함하는 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 사이클릭 펩타이드는 상기 X1, X3, X4, X-2, X-4, X+2 또는 X+3 잔기들이 아미노산 Lys, 2-[비스(3-아미노프로필)아미노]아세트산, (2S)-2,5-디아미노펜탄산, 2,2-디아미노아세트산, (3S)-3,4-디아미노부탄산, (2R)-2,4-디아미노부탄산, (2S)-2,4-디아미노부탄산, (2S)-2,3-디아미노프로판산, (2R)-2,3-디아미노프로판산, 2-[(2-아미노에틸)아미노]아세트산, 2-[(3-아미노프로필)아미노]아세트산, 2-[(4-아미노부틸)아미노]아세트산, (4S)-4,8-디아미노옥탄산, (2S)-2-아미노-3-(4-아미노페닐)프로판산, (2S)-2-아미노-3-[4-(2-아미노에톡시)페닐]프로판산, 2-(피페리딘-4-일아미노)아세트산, (2S)-2-아미노-4-[(5R)-2,2-디메틸-1,3-옥사졸리딘-5-일]부탄산, (2S)-2-아미노-6-(메틸아미노)헥산산, (2R,4R)-4-아미노피롤리딘-2-카르복실산 또는 (2R,4S)-4-아미노피롤리딘-2-카르복실산, 2-(4-아미노피페리딘-4-일)아세트산, 4-아미노피페리딘-4-카르복실산, (2S,4R)-4-아미노피롤리딘-2-카르복실산 및 이미다졸린-2-카르복실산을 포함하는 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 사이클릭 펩타이드는 상기 X1, X3, X4, X-2, X-4, X+2 또는 X+3 잔기들이 아미노산 Glu, Asp, 3-[(카르복시메틸)아미노]프로판산, 2-[(카르복시메틸)아미노]아세트산, 3-[(2-카르복시에틸)아미노]프로판산, (3R)-3-아미노헥산디온산, 4-아미노헵탄디온산, 4-아미노피페리딘-1,4-디카르복실산, (2S,4S)-4-아미노피롤리딘-2-카르복실산, 2-[(카르복시메틸)아미노]아세트산, (2S)-2-아미노-6-[(카르복시메틸)아미노]헥산산, 3-[(2-카르복시에틸)아미노]프로판산, (2S)-2-아미노헵탄디온산, (2S)-2-아미노옥탄디온산, (2R)-2-아미노-3-[(2-카르복시에틸)설파닐]프로판산, (2R)-2-아미노-3-[(카르복시메틸)설파닐]프로판산, 4-{[(2R)-2-아미노-2-카르복시에틸]설파닐}부탄산 및 (2S)-2-아미노-3-[4-(카르복시메톡시)페닐]프로판산을 포함하는 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 항종양 및 항혈관생성 활성들을 갖는 사이클릭 펩타이드는 서열번호 1 내지 76으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 다른 대상은 암 치료법 또는 원치 않는 세포 번식-관련 질환들을 치료하기 위한 약품, 또는 항혈관생성 약물을 제조하기 위한 상기 사이클릭 펩타이드의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구현예는 암, 원치 않는 세포 번식-관련 질환들 및 원치 않는 혈관생성을 치료하기 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 투여를 요하는 개체에, 상기 본 발명에 따른 사이클릭 펩타이드들 중 적어도 하나를 유효량만큼 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 상기 본 발명에 따른 펩타이드들 중 적어도 하나 및 부형제 또는 약제학적으로 적당한 담체를 포함하는 약제학적 조성물 역시 본 발명의 대상이다.
본 발명은 또한, 상기 본 발명에 따른 펩타이드들 중 적어도 하나 및 영상화제를 포함하는 암 진단용 복합체를 제공하며, 상기 영상화제는 형광체기, 비형광체기, 반도체 형광 입자, 상자성 또는 초상자성제, 및 방사성 동위 원소를 포함하는 군으로부터 선택된 것이다.
본 발명의 다른 태양은 상기 본 발명에 따른 펩타이드들 중 적어도 하나와 함께 항암제 및 호르몬과 같은 적어도 하나의 치료제를 포함하는 약제학적 조합 (combination)에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 조성물 중의 상기 펩타이드는 공유 결합에 의해서 상기 치료제에 직접적으로 컨쥬게이션된다. 또 다른 구현예에서는, 상기 펩타이드는 커플링제에 의해서 상기 치료제에 컨쥬게이션된다.
본 발명은 또한, 프로디기오신 또는 그 유도체와 조합된 상기 본 발명에 따른 펩타이드들 중 적어도 하나를 포함하는 약제학적 조합에 관한 것이다. 상기 조성물을 형성하는 구성요소들은 그를 필요로 하는 개체에, 의학적 치료과정 동안, 연속적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.
많은 수의 약물들이 비경구로 투여되어야 하며, 예를 들어: 정맥 주사, 근육 또는 피하 경로로 투여되어야 하는 바, 이는 의도된 치료적 효율을 달성하기 위함이다. 일부 치료법들의 경우, 조절 방출 담체를 사용하게 되면 약물의 효율 및 환자의 만족도를 증가시킬 수 있다. 최근에, 치료제의 캡슐화 및 조절 방출을 위한 물질들을 제조하기 위해서 분자 자가-조립이 연구된 바 있다. 펩타이드 및 폴리머에 기반한 자가-조립 플랫폼을 디자인함에 있어서 커다란 진전이 있었다 (Monica C. Branco a,b, Joel P. Schneider. Acta Biomaterialia 5 (2009) 817-831). J08P48과 같은 본 발명에 따른 펩타이드들 중 일부는 양친매성을 나타내며, 따라서 자가-조립하여 치료 분자들의 조절 방출 시스템의 일부가 되거나 또는 나노공학 분야에서 이용가능하다. 그러므로, 본 발명의 또 다른 대상은, 암에 대한 조합 치료법용 약물로서, 상기 펩타이드들의 조절 방출을 위한 리포좀 또는 미세구체 형태의 새로운 캡슐화 제제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 관심 대상이 되는 진단-치료 부위에 대한 조절 표적화 시스템 또는 특정 방식으로 이러한 활성들을 그 자체로 나타내는 나노입자화된 복합체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 펩타이드들은 하기 장점들을 갖는다:
- 다른 조직학적 기원들로부터 유래된 종양 세포들에 대한 폭넓은 작용 스펙트럼
- 종양 혈관생성에 대한 직접 작용 및 종양 세포들에 대한 직접 작용
- p53-독립적인 작용 메카니즘
- 인간 전이로부터 분리된 세포들에 대한 세포독성 효과 및 그에 따른 항전이 효과
- 종양 세포들에서 세포자살 (apoptosis)을 유도하고, 번식 활성화된 세포들에만 특이적 작용
- 전신적 또는 종양내부적 경로에 의한 항종양 효과. 이종이식된 종양들에서 성장 속도를 감소시키고, 종양을 보유한 동물들에서 생존을 연장
- 일련의 종양 세트들에서 완전한 종양 억제
- 장기간 동안 동물에 대해서 반복 주사하는 동안 독성이 나타나지 않음
- 원래 분자의 분포 용적 (distribution volume)보다 더 높은 분포 용적
- 생분포 프로파일은 다른 병리를 갖는 악성 종양들의 치료를 뒷받침함
- 경제적으로 유리한 제조 기술
- 다른 재조합 기술들에 의해서 얻어진 분자들에 비해서 더욱 실현가능하고 빠른 약제학적 발전.
도 1은 다른 조직학적 근원을 갖는 종양 세포들에 대한 N06P87 펩타이드의 세포독성 활성을 나타낸 것이다. A: Colo 205 세포; B: HEp-2 세포. CIGB370r 폴리펩타이드 및 시스플라틴을 항종양제의 양성 대조군으로 사용하였다.
도 2는 비소세포 폐암 세포주인 A549 (A) 및 결장암 세포주 (B)에 대한 N06P87 펩타이드의 세포독성 활성을 나타낸 것이다. 라이브러리의 다른 펩타이드들은 A549 세포주 번식에 대한 그 효과를 평가할 때 활성을 나타내지 않았다.
도 3은 연구대상 라이브러리로부터의 몇몇 펩타이드들의 인간 종양 세포주 M14 (A) 및 Ls174T (B)에 대한 활성을 평가한 것이다. CIGB370r 폴리펩타이드를 양 분석 모두에 있어서 양성 대조군으로 사용하였다.
도 4는 흑색종 세포주 M14에 대한 E07P04 펩타이드의 세포독성 활성을 나타낸 것이다. CIGB370r 폴리펩타이드를 분석을 위한 양성 대조군으로 사용하였다.
도 5는 천연 단백질 (1srp)와 비교할 때, 주된 Serratia 프로테아제의 N-말단 (1srpN) 및 C-말단 (1srpC) 도메인 표면들의 접근가능성 계산값을 나타낸 것이다.
도 6은 20-아미노산 리더 펩타이드 (aa) N06P87에 인접한 서열들을 나타낸 것이다.
도 7은 인간 흑색종 세포들에 대한 세포독성 활성을 나타낸 것이다. 리더 펩타이드인 N06P87만이 50 μM 농도에서 세포 번식을 억제할 수 있었다.
도 8은 p25 폴리펩타이드로부터 유래된 선형 펩타이드 N06P87의 항종양 용량을 근원이 되는 분자와 비교하여 평가한 것이다. 투여 스케줄 (A); 종양 부피를 측정함으로써 평가한 항종양 효과 (B); 및 접종된 마우스의 생존을 통해서 평가한 항종양 효과 (C). 사용된 모델: NIH 무흉선 마우스에 이식된 인간 결장암 Ls174T 세포주.
도 9는 세그먼트 Gly255-Ser274 (N06P87 선형 펩티드) 상의 기능 영역들을 한정한 것이다. 상기 펩타이드의 일차 세그먼트는 중앙 영역으로서, 이차 N- 및 C-말단 세그먼트들에 의해서 인접한다.
도 10은 p50 단백질의 Gly255-Ser274 세그먼트로부터 디자인된, 본 발명에 따른 사이클릭 펩타이드들인 J08P48s-s, A08P28s-s, A08P25s-s, J08P46s-s 및 선형 펩타이드인 N06P87의 모델링을 나타낸 것이다. 모델들은 패턴으로서 p50 단백질의 결정학적 구조를 사용함으로써, MODELLER 소프트웨어의 도움으로 얻었다. 이황화 다리결합들은 이전에 MODIP 방법에 의해서 확인된 위치들에서 도입되었다. A: p50 단백질 상의 Gly255-Ser274 세그먼트에 대한 3차원 구조에 따른 N06P87 (선형 펩타이드)의 모델링; B: J08P48s-s 펩타이드의 모델링; C: A08P28s-s 펩타이드의 모델링; D: A08P25s-s 펩타이드의 모델링; E: J08P46s-s 펩타이드의 모델링으로서, 펩타이드의 N-말단과 C-말단 사이의 거리를 나타낸다.
도 11은 표 5의 사이클릭 펩타이드 33의 구조 모델링을 나타낸 것이다. 라이신 7은 카보닐 말단기와 아미드 결합을 형성한다.
도 12는 표 5의 사이클릭 펩타이드 69의 구조 모델링을 입체적으로 영상화한 것이다. 일차 세그먼트인 Asn264-Ser271은 헥사펩타이드 연결자인 Arg-Pro-(dAla)-Gln-Asn-Ser에 의해서 고리화된다. 잔기 dAla는 D-Ala 입체이성체이다.
도 13은 표 5의 사이클릭 펩타이드 76의 구조 모델링을 입체적으로 영상화한 것이다. 일차 세그먼트인 Asn264-Ser271은 펜타펩타이드 연결자인 Arg-Arg-Pro-Asn-Ser (밑줄 그은 잔기들)에 의해서 고리화된다.
도 14는 p50 단백질의 세그먼트 Gly255-Ser274의 3차원 구조에 해당되는 라마찬드란 다이어그램 (Ramachandran diagram)이다.
도 15는 본 발명에 따라서 디자인된 사이클릭 펩타이드들에 대한 화학 구조의 일반적 다이어그램이다. 선들은 공유 결합의 존재를 나타낸다. 펩타이드의 2개 잔기들을 연결하는 경우에, 선들은 이러한 잔기들이 고리화, 즉 공유 결합되었음을 나타낸다. 펩타이드 서열의 위에 표시한 선들은 주사슬의 고리화에 해당되며, 아래에 표시한 선들은 적어도 하나의 곁사슬을 포함하는 고리화를 위한 결합들을 나타낸다. 만약 하나의 선이 Xi 잔기를 향하고 있는 경우에는, 공유 결합이 X1 잔기의 곁사슬에 의해서 생성됨을 의미한다. 만약 라인이 2개 잔기들 사이의 점선에서 시작되었다면, 공유 결합이 각각 상기 점선을 뒤 또는 앞의 잔기에 있는 아미노 또는 카르보닐기를 포함함을 의미한다. X1에 앞서는 점선을 향하는 선은 X1 잔기의 아미노기를 포함하는 아미드 공유 결합을 나타내고; 이 경우, 상기 펩타이드는 2차 N-말단을 갖지 않는다. X4 및 X+2 뒤의 선들은 X4 및 X+2의 카르보닐기를 포함하는 공유 결합을 나타내며, 더 나아가, X4 뒤에 이차 C-말단이 존재하지 않고, 상기 잔기가 X+2 뒤의 펩타이드의 카르복실 말단임을 의미한다. 괄호 안에는 공유 결합에 관여하는 기들과 결합의 타입이 나타내져 있고: 아미드 결합 또는 이황화 다리 결합, 펩타이드 연결자들에 대한 바람직한 서열이 도시되어 있다. 펩타이드 서열 중 음영으로 표시된 영역들은 본 발명에서 한정된 작용 세그먼트들의 N-말단으로부터 C-말단으로의 순서를 나타내는데: (a) 이차 N-말단 세그먼트, (b) 일차 세그먼트 및 (c) 이차 C-말단 세그먼트를 나타낸다. 삼각형 P는 폴리머 또는 다른 화학기들에 공유 결합에 의해서 변형될 수 있는 부위들을 나타내며, 그러한 변형들은 만일 관여하는 주사슬 중의 잔기 또는 기가 고리화 결합에 참여하지 않는다면 가능하다. 상기 펩타이드는 하나 또는 그 이상의 고리화 결합, 및 하나 또는 그 이상의 폴리머 변형 및/또는 화학기들을 포함할 수 있다. 치환 위치들인 X-4, X-2, X1, X3, X4, X+2 및 X+ 3를 차지할 수 있는 것으로 도면에 언급된 아미노산 유도체들은, 그 곁사슬들이 아미노기 또는 카르복실기 또는 설프히드릴기를 포함하는 것들이다.
도 16은 p25로부터 유래된 최적화된 사이클릭 펩타이드들이 처리된 동물들의 생존율을 높이는 것을 나타낸 것이다. 피하 TC-1 종양을 보유한 동물들에 종양내 경로 (intratumoral route, i.t.)에 의해서 80 μM의 단일 투여량으로 주사하였다. 각각의 군에는 다른 펩타이드, 또는 CIGB370r 폴리펩타이드 또는 부형제를 도입하였다. 생존율은 모든 군에 대해서 도시하였다.
도 17은 투여 경로에 관계없이, p25로부터 유래된 최적화된 사이클릭 펩타이드들이 처리된 동물들의 생존율을 높이는 것을 나타낸 것이다. 피하 TC-1 종양을 보유한 동물들에 종양내 (i.t.) 또는 복강내 (i.p.) 경로에 의해서 80 μM의 단일 투여량으로 주사하였다. 각각의 군에는 다른 펩타이드, 또는 CIGB370r 폴리펩타이드 또는 부형제를 도입하였다. 생존율은 모든 군에 대해서 도시하였다.
도 18은 다른 조직학적 기원들을 갖는 인간 종양 세포주들에 대한 J08P48s-s의 인 비트로 생물학적 활성을 도시한 것이다.
도 19는 p25로부터 유래된 최적화된 사이클릭 펩타이드들이 선형 펩타이드로 처리된 동물들에서 항종양 활성 및 생존율을 높이는 것과, 그들의 활성이 CIGB370r 폴리펩타이드의 활성과 유사함을 나타낸 것이다. (A) 투여 스케쥴; (B) 종양 부피를 측정함으로써 평가된 항종양 효과 (B); 및 접종된 마우스의 생존율을 통해서 평가한 항종양 효과 (C). 모델: 인간 결장암 세포주 Ls174T를 NIH 무흉선 마우스에 이식.
도 20은 마트리겔 중의 내피 세포들의 세포 분화에 대해서 본 발명의 2개 사이클릭 펩타이드들이 미치는 효과를 나타낸 것이다. HMEC 세포들은, 본 발명의 2개 사이클릭 펩티드 또는 부형제 존재 하의, 활성화 조건 (10 ng/mL EGF, 1 ㎍/mL 하이드로코티손) 하에서 배양하였다. 펩타이드들은 번식 활성화된 내피 세포들에 의한 관형 구조 형성을 억제할 수 있었으며, 이는 상기 펩타이드들의 항혈관생성 활성을 증거하는 반면에, 상기 부형제의 경우는 그러한 관형 구조들의 생성이 관찰되었다.
도 21은 본 발명의 사이클릭 펩티드들의 자가-조립이 선호되는 조건 하에서 관찰한 상기 사이클릭 펩티드들의 현미경 사진이다.
실시예들 및 데이터는, 선형 합성 펩타이드들의 라이브러리 및 입증된 약제학적 효능을 갖는 (Abrahantes-Perez MC et al., "Pharmaceutical composition containing polypeptide fragments of serralysins." 국제특허출원 No. WO 2006/005268) p25로 명명된 PRZN_SERMA 세라리신의 C-말단에 해당되는 폴리펩타이드의 3차 구조 (Braunagel SC, and Benedik MJ (1990). Mol. Gen. Genet. 222:446-451)로부터 시작해서 사이클릭 펩타이드들을 제조하는 것과 관련된 몇몇 태양들 및 특성들을 보여준다.
하기 실시예들은 본 발명의 화합물들 및/또는 방법들과 관련되며, 이는 이러한 펩타이드들로부터 유래된 분자들로서, 최적화된 것들 및/또는 유도체들의 사용을 포함한다. 종래기술과 비교할 때에, 본 발명의 화합물들 및 방법들은 기대 이상의 놀라운 효과를 제공한다. 본 발명의 유용성은 이러한 화합물들을 약학 분야에 사용함으로써 설명된다. 상기 화합물들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술자에 의해서 공지된 다른 화합물들에 비해서 장점들을 보유한다.
실시예 1. p25 폴리펩타이드로부터 유래된 선형 펩타이드들의 디자인 및 합성
10개 아미노산들이 중첩되며 20개 아미노산들로 이루어진 선형 펩타이드들을 디자인하였는 바, 이를 통해서 p25 폴리펩타이드의 최소 기능적-활성 유닛을 확인하고 (Abrahantes-Perez MC et al., "Pharmaceutical composition containing polypeptide fragments of serralysins." 국제특허출원 No. WO 2006/005268), 확인된 영역으로부터 암 치료에 있어서 향상된 약제학적 및 약물동태학적 특성들을 갖는 새로운 분자들을 제조하고자 하였다. 이는 일차 서열 10개 내지 20개에 포함된 활성 영역들을 확인하는 것을 의미한다. 표 1은 각 펩타이드가 일단 합성되고 정제된 이후에 그 일차 서열, 생성 코드 (generation code) 및 분자량을 보여준다. 최종 펩타이드 제조물들의 분자량은 질량 스펙트럼에 의해서 확인하였다.
p25 폴리펩타이드의 일차 서열로부터 시작된 선형 펩타이드들의 라이브러리에 대한 디자인 및 합성
Figure pct00001
Fmoc/tBu 방법 (Barany, G. and Merrifield, R. B. J Am Chem Soc. 99 (1977) 7363-7365)을 사용함으로써, Fmoc-AM-MBHA 수지 상에서 고상으로 펩타이드들을 합성하였다 (Barany, G. and Merrifield, R. B. J Am Chem Soc. 99 (1977) 7363-7365). 아미노산들은 DIC/HOBt-매개 활성화 방법을 사용하여 커플링시켰으며, 커플링 반응의 완성도는 닌히드린 분석에 의해서 확인하였다 (Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Anal Biochem. 34 (1970) 595-598). 펩타이드들은 TFA/EDT/H2O/TIS (94%/2.5%/2.5%/1%) 용액을 사용하여 수지로부터 분리하였고; 에테르로 침전시킨 다음 72 시간 동안 동결건조시켰다. 고리화는 디메틸 설폭사이드 (DMSO)로 산화시켜 이황화 다리결합을 형성함으로써 수행하였고 (Andreu, D., Albericio, F., Sole, N. A., Munson, M. C., Ferrer, M. and Barany, G., Pennington, M. W. and Dunn, B. M. (Eds), Peptide Synthesis Protocols, Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, 1994, pp. 91-169) 펩타이드들을 RP-HPLC에 의해서 정제시켰다. 얻어진 분획들은 분석 RP-HPLC에 의해서 개별적으로 분석하였으며, 각 펩타이드에 대한 최종 제제는 순도 99% 이상을 나타내는 모든 각각의 분획들을 수집함으로써 제조하였다.
실시예 2. 종양 세포들에 대한 인 비트로 세포독성 활성에 기초한, p25 폴리펩타이드로부터 유래된 합성 펩타이드들의 라이브러리로부터 일차 서열들의 선별
설포로다민 B (SRB) 방법 (Skehan P, Storeng R, Scudiero D, et al., (1990) J. Natl. Cancer Inst. 82: 1107-1112; Monks A, Scudiero D, Skehan P, et al., (1991). J Natl Cancer Inst. 83:757-66; Tesei A, Ulivi P, Fabbri F, et al., (2005). J Transl Med. 3:7)에 의해서, p25 폴리펩타이드로부터 유래된 합성 펩타이드 라이브러리의 세포독성 활성을 측정하였다. 음성 대조군 세포들은 실험 샘플들의 부피와 동일한 담체 부피 상에서 배양하였다. 음성 대조군 세포들과 비교한 생존 세포들의 백분율에 기초하여 "x-y" 곡선 (투여량-반응)을 작성하였으며, 하기 패러미터들을 계측하였다: 50% 성장 억제 (GI50); 총 성장 억제 (TGI); 및 치사 농도 50 (LC50), 이는 50%의 세포 사멸을 야기하는 농도를 의미함 (Boyd MR, Paull KD, and Rubinstein LR (1992) "Data display and analysis strategies for the NCI Disease Oriented In - Vitro Antitumor Drug Screen, in Cytotoxic Anticancer Drugs: Models and Concept for Drug Discovery and Development (Baleriote FA, Corbett TH and Baker LH eds) pp 11-34, Kluwer Academia Publishers, Boston).
투여량-의존 방식으로 50%의 세포 번식을 억제할 수 있고, 적어도 연구 대상이 되는 세포주들 중 하나에 대해서 100 μM 미만의 GI50 수치들을 나타내는 펩타이드들 모두를 세포독성 펩타이드들로 간주하였다. 사용된 인간 종양 세포주들은 하기와 같았다: HEp-2 (후두암), A549 (폐 상피 선암), M14 (흑색종), Colo 205 (결장 선암), Ls174T (결장 선암), LnCAP (전립선암), PC-3 (전립선암) 및 H 125 (비소 세포 폐 선암). 이러한 펩타이드 스크리닝으로부터의 결과들을 표 2에 나타내었다. 표시된 것들은 디자인된 펩타이드들에 대한 일차 서열들, 그 생성에 사용된 코드 및 인간 종양 세포들에 대한 그들 각각의 세포독성 능력이다.
인 비트로에서 SRB 방법에 따라 인간 종양 세포들에 대해서 나타난 세포독성 활성에 기초한 펩타이드 스크리닝
Figure pct00002
실시예 2에서 제시된 기준에 따라서, 기호 +는 세포독성이 존재함을 의미하고, 기호 -는 세포독성이 없음을 의미한다. * 표시된 펩타이드는 얻어진 결과들의 반복재현성을 보장하기 위해서 2회 합성하였다.
펩타이드 GDTVYGFNSNTGRDFLSTTS -아미드 (코드 N06P87/J07P73)는 몇몇 종양 세포주들에 대해서 양성 (+)이었지만, 펩타이드 NASSNVTDLSVNIGGHQAPD -아미드 (코드 E02P04)는 인간 흑색종 M14 세포주에 대해서만 활성을 나타내었다. 나머지 펩타이드들은 음성 (-)으로 간주되었다.
도 1 및 2는 N06P87이 Colo 205, HEp-2, A549, 및 Ls174T 세포주들과 같은 다양한 조직학적 기원을 갖는 종양 세포들의 번식을 억제하는 효능을 나타낸다. GI50은 모든 경우에 대해서 100 μM 미만이었다. HEp-2 후두암의 경우에는 2 배치의 시스플라틴을 양성 대조군으로 사용하였다. 이는 후두암 치료를 위해서 시중에서 1차 제품으로 구입가능한 것들이다. 본 분석에 있어서, 이러한 유형의 병리에 대한 그 유용성은 입증된 바 있으며, 분석의 유효성 역시 입증된 바 있다.
표 1 라이브러리로부터의 일부 펩타이드들의 인간 M14 및 Ls174T 종양 세포주에 대한 효과의 평가 결과들이 도 3에 도시되어 있다. 이러한 펩타이드들의 패널은 분석된 세포주들에 대해서 세포 성장을 억제할 수 없었다.
N06P87 펩타이드 영역에 더해서, E07P04 펩타이드 (표 1)에 의해서 코딩되는 20개 아미노산 영역도 세포독성 활성을 나타내었지만, 이는 M14 세포주에 대한 것이었을 뿐이며, GI50도 도 4에 도시된 바와 같이 100 μM 보다 높았다.
표 2에는 종양 세포들에 대한 세포독성 활성의 펩타이드 스크리닝으로부터 얻어진 모든 결과들을 요약하였는 바, 이로부터 세라리신 PRZN_SERMA C-말단 도메인 상의 Gly255-Ser274 영역을 포함하고 p25 폴리펩타이드의 N-말단 영역에 위치한 GDTVYGFNSNTGRDFLSTTS-아미드 펩타이드가 다양한 조직학적 기원을 갖는 종양 세포주들에 대해서 활성을 지니면서 원래 p25 분자에 의해서 나타나는 폭넓은 범위의 세포독성 활성을 재현한다는 사실이 입증된다. 이러한 모든 사실들은 본 발명에서 세포독성으로 확인된 펩타이드가 p25 폴리펩타이드 상의 최소 구조적-활성 서열임을 의미하며, 암에 대한 약제학적 응용을 위해서 더욱 최적화될 대상이라는 것을 의미한다.
실시예 3. p50 단백질 잔기들 용액 중에서 노출되는 것에 대한 N-말단 도메인 제거의 영향
세라리신의 C-말단 영역 (예를 들어, 세라리신 PRZN_SERMA)이 종양 세포들에 대한 대부분의 세포독성 활성에 중요하다는 점은 잘 알려져 있는 바, 이는 일단 자가촉매 반응, 시아노겐 브로마이드에 의한 화학적 소화에 의해서 단백질로부터 N-말단이 절단되거나, 또는 Escherichia coli에서 C-말단을 발현시키는 것으로부터 파악할 수 있다 (국제특허출원 No. WO 2006/005268). 이러한 사실은 세라리신의 C-말단 영역 중에 존재하는 최소 기능적-활성 유닛이, 일단 단백질의 N-말단으로부터 분리되면, 종양 세포들에 대한 그 접근 가능성이 촉진된다는 것을 의미한다. 그러므로, 천연 단백질의 N- 및 C- 말단들을 절단한 후에 용매 접근가능성 표면을 매개하는 단백질 잔기들을 확인하고, 또한 Gly255-Ser274 (N06P87) 펩타이드가 그러한 잔기들을 보유하고 있는지 확인하고자 하였다. 이러한 가설을 테스트하기 위해서, 주된 Serratia 프로테아제의 N- 및 C-말단들의 표면들에 대한 접근 가능성 계산식을 만들었다 (Hamada K, Hata Y, Katsuya Y, Hiramatsu H, Fujiwara T, Katsube Y. (1996) J. Biochem. 119:844-851).
Serratia 프로테아제의 단백질분해 소화가 일단 2개의 분자들을 생성하게 되면 접근가능해지는 N- 및 C-말단 도메인들의 내부에 위치한 아미노산 영역들을 확인하였다. 잔기들에 대한 접근가능성 표면 계산은 DSSP 소프트웨어 (Kabsch W, Sander C. 1983. Biopolymers 22:2577-2637)를 사용하여 수행하였다. 잔기들에 대한 접근가능성 수치들은 옹스트롬 (Å2)으로 표현하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 접근가능성 수치들에 있어서 주된 차이는 주된 Serratia 프로테아제의 N-말단 단백질분해 도메인의 C-말단 영역에 위치한 아미노산들 (Gln210, Phe211, Asn226, His229, Leu236, Ile239, Ser251) 및 C-말단 비단백질분해 도메인의 N-말단 영역에 위치한 아미노산들 (Thr252, Phe269, Ile280, Trp284, Arg302, and Phe310)에 해당되는 것이었다. 접근가능성 수치면에서 가장 현저한 변화를 보여주는 잔기들을 표 3에 나타내었다.
접근가능성 수치들에 있어서 가장 현저한 변화들을 보여주는 아미노산 (a.a.)
Figure pct00003
Serratia 주된 프로테아제의 N-말단 (1srpN) 및 C-말단 (1srpC)에 대한 접근가능성 계산값들을 천연 단백질 (1rp)와 비교하였다. 잔기들은 노출 차이값에 따라서 배열하였다 (순위 컬럼). 순위 64는 증가된 노출에 대해서 가장 높은 수치를 갖는 것으로 나타내었다.
잔기쌍 Asp98 및 Arg267, 및 Asp225 및 Lys317은 N- 및 C-말단 도메인들 사이의 2개 이황화 다리결합들을 형성한다. 더 나아가, 상기 잔기들은 접근 가능성 수치에 있어서 78.2 Å2의 평균 차이를 나타내었다. 주된 Serratia 프로테아제의 단백질분해성 N-말단 및 비단백질분해성 C-말단에 대한 접근가능성 수치에 있어서 평균 차이는 각각 5.1 ± 15.4 Å2 및 7.1 ± 20.1 Å2이었다. 다른 관련성 있는 위치들은: Ile22, Asn32, Gln94, 및 Arg171이었다. 아직까지는, 이러한 잔기들에 대해서는 아무런 생물학적 활성이 부여되지 않았다.
이와는 대조적으로, N-말단 단백질분해성 도메인 중의 α-헬릭스 E에 위치한 활성 부위 잔기들 (His176, Glu177, 및 His180)과, 아연-결합 모티프 HEXXHXXGXXH 중에 포함된 Gly183 및 His186 잔기들은 각각의 접근가능성 수치에 있어서 어떠한 변화도 나타내지 않았다. 이러한 데이터는 실험 결과들과 일치하는데; p50 단백질 (세라리신 패밀리에 속함)의 세포독성 활성은 그 단백질분해 활성에 의존하는 것이 아니며, 단백질분해성 도메인으로부터 일단 절단되면 그 용매 접근가능성이 증가하는 비단백질분해성 C-말단 영역과 관련된다는 점을 효과적으로 보여준다. 반면에, Gly255-Ser274 세그먼트 (펩타이드 N06P87)는, 구체적으로 가장 높은 14개 수치들 중에서, 노출에 있어서 가장 높은 증가 정도를 보이는 3개 잔기들 (Arg267, Asp268 및 Phe269)을 포함하며, 이는 항종양 활성을 담당하는 p25 단백질 내의 구조적 기능 유닛으로서의 이러한 세그먼트의 뚜렷한 역할을 뒷받침한다.
실시예 4. N06P87 펩타이드의 Gly255-Ser274 세그먼트에 대한 변형
실시예 1에 기재한 펩타이드 라이브러리는 p25 폴리펩타이드의 N-말단으로부터 시작되는 10개 아미노산들이 중첩되는, 20개 아미노산 길이의 세그먼트들을 포함한다. 이러한 디자인은 스크리닝 대상이 되는 세포독성 활성과 관련된 10개 아미노산의 선형 영역을 확인하기 위한 것이다. 그러나, N06P87에 의해서 포함되는 중첩된 10개 아미노산들은 다른 서열들 (도 6, 펩타이드 E07P06 및 F07P16) 내에서는 아무런 세포독성 활성을 나타내지 않았다 (표 2). 이러한 사실은 Gly255-Ser274 영역 (펩타이드 N06P87)을 포함하는 20개 아미노산들이 종양 세포들과의 상호작용을 위한 모티프에 올바로 노출되도록 하는 것 또는 활성 부위에 인접한 2차 상호작용을 위한 올바른 위치 선정을 위해서 필요하다는 것을 암시하며, 이러한 방법에 의해서 잠재적인 수용체에 결합하는 친화도 및/또는 특이성이 증가하게 된다. 이러한 기준을 고려하여, 변형들을 포함하는 펩타이드들을 디자인 및 합성하였으며, 이를 통해서 그들의 종양 세포들에 대한 세포독성 활성에 미치는 가능한 영향을 평가하고, 이후 최적화를 위한 N06P87 펩타이드의 부분적 특성화를 도모하였다. 상기 변형들은 N06P87 펩타이드의 C-말단에 위치한 아미드기를 카르복실기로 치환하는 것, 및 상기 펩타이드의 양쪽 말단에 하나의 시스테인을 삽입함으로써 N06P87 펩타이드의 고리화를 수행하는 것을 포함한다. 제조된 펩타이드들 및 그들의 분자량들은 하기 표 4에 표시하였다.
20 a.a. 리더 펩타이드 N06P87에 대한 변형
Figure pct00004
펩타이드 N06P89 (N- 및 C-말단에 위치한 2개의 시스테인들에 의해서 고리화됨)가 M14 인간 흑색종 종양 세포들에서 세포 번식을 억제할 수 없는 점을 도 7에 도시하였다. 이는 N06P87 펩타이드 서열 상의 다른 위치들에 또 다른 제한사항이 있어야 하는 점을 암시하는 것이며, 이러한 영역이 p25 폴리펩타이드의 추정 구조 상에서 갖는 3차 구조를 모방하여야 하는 이유를 설명해준다. 도 7에는 또한, 관심대상이 되는 펩타이드 영역에 대해서 기대되는 세포독성 능력을 달성하기 위해서 C-말단 (예를 들어, 아미드기 또는 다른 변형)을 블록킹하여야 할 필요성도 도시되어 있다.
실시예 5. 리더 펩타이드로 된 제제는 그 세포독성 활성을 증가시키지 않음
리더 펩타이드가 종양 세포들에 대해서 갖는 세포독성 활성에 대해서, 완충용액 조건, pH 및 몇몇 비경구 제제의 첨가제들이 미치는 영향을 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 평가된 완충용액들은; 글라이신, 포스페이트, 시트레이트, 및 산성으로부터 높은 정도의 염기성까지 폭넓은 범위의 pH를 갖는 것들. 또한, 비경구 제제용으로 사용되는 범위 내에서 몇몇 첨가제들도 평가하였으며, 예를 들어: 글라이신, 수크로오스, 덱스트란, 소듐 글루탐산, 소르비톨, 사이클로덱스트린, PEG, EDTA, 비이온성 계면활성제 및 기타의 것들을 평가하였다. 이러한 첨가제들로 제제화된 N06P87 펩타이드는 다양한 조직학적 기원으로부터 유래된 종양 세포들에서 그 세포 독성 활성 증가가 관찰되지 않았다.
실시예 5. 선형 펩타이드 N06P87의 인 비보 활성
선형 Gly255-Ser274 세그먼트 (펩타이드 N06P87)의 인간 종양 모델들에 대한 잠재적인 효과를 평가하기 위해서 무흉선 마우스에서의 Ls174T 결장암 종양 모델을 사용하였으며, CIGB370r 폴리펩타이드와 비교하였다. 인간 종양 세포들은 피하 경로를 통해서 투여하였으며, 관심대상이 되는 분자들 또는 담체는 종양내 경로 (100 μL)를 통해서 투여하였다. 13일 후, 종양들이 이식되어 감지할 수 있을 정도가 되면, 관심대상이 되는 분자들에 대해서 투여 스케줄을 시작하였다 (도 8A). 펩타이드 N06P87은 점차 작은 투여량으로 투여하였다: 매 48 시간 마다 600 μM로 2회 투여에 이어, 매 48 시간 마다 330 μM로 4회 투여한 다음, 마지막으로 매 72 시간 마다 90 μM로 4회 투여. CIGB370r 펩타이드는 1 주일 간격으로 4회 투여하였다.
치료가 개시된지 25일 경과한 시점에서, N06P87 및 담체로 처리된 군에서 현저한 종양 부피의 차이 (p < 0.001)가 관찰되었다 (도 8B). 더 나아가, CIGB370r로 처리된 군과 담체를 투여한 군 사이에는 매우 현저한 차이 (p < 0.0001)가 존재하였는데, 이는 Bonferroni의 사후 테스트에 따른 원-테일드 (one-tailed) ANOVA에 의해서 관찰하였다. 또한, 양 분자들 모두를 투여한 군들 사이에서도 매우 현저한 차이가 관찰되었다 (p < 0.0001).
도 8C는 이러한 분자들로 처리된 동물들 또는 담체를 투여한 동물들 사이에서 관찰된 생존률을 보여준다. 담체를 투여한 군에 비해서, 양 분자 모두 생존률을 현저하게 증가시킬 수 있었다 (Logrank test: p < 0.05). 그럼에도 불구하고, N06P87 펩타이드의 경우에는, T/C 비율 (T는 처리된 동물들의 평균 생존률을, C는 담체만을 투여한 동물들의 평균 생존률을 나타냄)이 117%였다. 이러한 사실은 상기 선형 펩타이드가 인간에서 암 치료용으로서 잠재적으로 유용한 분자가 되지 못한다는 점을 보여주는데, 그렇기 위해서는 T/C 비율이 적어도 120%는 되어야 하기 때문이다. CIGB370r 폴리펩타이드의 경우, 142% T/C 비율을 나타내었으며, 인간 암 치료법에 대해서 잠재적으로 유용한 분자로부터 기대되는 특성을 갖는다.
T/C 비율이 계산되었을 때 효능이 미치지 못하는 펩타이드는 35일째의 종양 부피 (모든 동물들이 여전히 생존한 마지막 날)를 의미하고, 72% T/C 비율을 나타내며, 동일한 패러미터가 CIGB370r 폴리펩타이드에 대해서는 35%였다. 이 경우, T/C 비율이 40-50% 범위 미만인 경우에는 현저하게 활성인 화합물로 특성화된다 (Marie Suggitt and Michael C. Bibby. 50 Years of Preclinical Anticancer Drug Screening: Empirical to Target-Driven Approaches Clinical Cancer Research. 2005. Vol. 11, 971-981.). 상기 사실로부터, 확인된 펩타이드 서열이, CIGB370r 폴리펩타이드에 의해서 달성되는 장기간의 생존률을 달성하고 더욱 진전된 치료적 사용을 위해서는, 더욱 최적화를 요한다는 것을 알 수 있다.
실시예 7. N06P87 펩타이드 상에서 기능성의 잔기들/영역들에 대한 한정
p50 단백질의 3차원 구조 분석 (실시예 3 및 발명의 상세한 설명의 관련 내용)과 더불어, 실시예 2 및 4에 제시된 실험 결과들로부터, 펩타이드의 구조-기능 관계에 미치는 영향에 따라서 N06P87 펩타이드의 화학 구조에서 3개의 세그먼트들 또는 뚜렷한 영역들을 한정하는 것이 가능하였다: a) 일차 결합 영역 (중앙 루프); b) C-말단의 이차 결합 영역; 및 c) 결합 및/또는 구조적 지지를 위한 이차 N-말단 영역. 이러한 사항들은 도 9에 개략적으로 도시되어 있다.
상기 중앙 루프는 p25 및 p50 양자 모두에 대해서 그 노출을 증가시키는 Phe269 및 Leu270 잔기들 뿐만 아니라, 그 생물학적 활성에 필수적인 Gly266-Asp268 세그먼트를 포함한다. C-말단 영역은 p50 단백질 중에서 연장된 입체 형태를 갖는 루프이다. 이러한 세그먼트에 존재하는 잔기들은 수용체와의 상호작용에 참여하고, 실시예 4에서 언급한 바와 같이, N06P87 펩타이드의 C-말단 아미드기가 카르복실기에 의해서 치환되면 생물학적 활성을 상실하게 된다. 그러한 변형은 새로운 지역적 양전하의 도입을 의미하며, 또한 펩타이드 중에서 수소 다리 결합 공여체기의 상실을 의미한다. 또한, 이러한 영역이 구조적 역할을 수행하는 것도 가능한데: a) Leu270은 Phe269, Tyr259 및 중앙 루프의 Arg267의 지방족 곁사슬과 소수성 상호작용을 하고; b) Thr272는 N-말단 영역의 Phe261과 소수성 접촉을 형성하며; 또한 c) Ser271은 중앙 루프의 잔기들과 3개의 수소 다리 결합을 형성하는 바, Ser271 아미노기는 Arg267 카르보닐기에 대한 수소 다리 결합의 공여체이고, Ser271 곁사슬의 OG기 역시 Arg267 카르보닐기에 대한 공여체이자, Thr265 곁사슬에 대한 OH기의 수용체이다. N-말단 세그먼트는 구조적 기능을 수행한다: Asn264 잔기의 ND2 및 OD1 곁사슬의 원자들과 Asp 256 (카르보닐기) 및 Val258 (아미노기)의 주사슬 수소 다리 결합, Asn264 및 Ser263의 OG 원자에 대한 아미노 공여체 (주사슬)로서 Val258 잔기의 카르보닐기 (수용체).
실시예 8. 도입 또는 구조적 제한, 고리화, 곁사슬 결합 및/또는 비천연 아미노산
본 발명에 따라서 강력한 항암 약물을 디자인함에 있어서 핵심적인 사항은 고리 화합물로 디자인된 펩타이드라는 점인데, 즉, 상기 펩타이드들이 곁사슬들 및/또는 아미노 및 카르복실 말단들 상의 반응기들을 포함하는 공유 결합에 의해서 커플링된 아미노산들을 포함한다. 그러므로, 본 발명에서 디자인된 펩타이드들은 고리화에 의해서 구조적으로 제한을 받고, 이러한 분자들의 구조적 유연성이 현저하게 감소된다. 일반적으로, 펩타이드들을 치료제로 사용하게 되면 몇몇 단점들이 발생하게 된다. 이는, 펩타이드들의 자체적인 유연성에 기인하는데; 특히 폴딩된 단백질들보다 더욱 유연한 짧은 펩타이드들 및 중간 크기 펩타이드들의 경우에 더욱 그러하다. 이점이 바로 이러한 펩타이드들이 단백질 또는 다른 수용체 거대분자에 결합하는 과정이 일반적으로 입체구조적 엔트로피의 더 높은 손실에 의해서 제한을 받는 이유이기도 하다. 이러한 사실은 상기 분자들이 일반적으로 단백질-단백질 상호작용의 결합 친화도보다 더 낮은 친화도를 나타내는 원인으로 작용한다. 상기 펩타이드들이 더 낮은 친화도 (결과적으로 더 낮은 효능)을 나타내는 점은 또한, 펩타이드-수용체 접촉 표면이 단백질-단백질 계면에 대해서 요구되는 것에 비해서 더 작다는 점과도 관련이 있을 수 있는데, 특히 펩타이드들이 천연 단백질의 세그먼트를 포함하는 경우에 더욱 그러하다. 이러한 연유로 인해서, 일반적으로 펩타이드들이 수용체에 결합하는 친화도를 높이기 위해서 (결과적으로 효능을 높이기 위해서) 그들을 재디자인하고 화학적으로 변형할 필요성이 있다.
본 발명에서는, 펩타이드 고리화가: a) Lys 및 Asp/Glu의 곁사슬들 사이의 아미드 결합 (표 5의 펩타이드 5-16, 19-22, 40-43) 또는 Lys의 곁사슬과 카르복시 말단기 (펩타이드 32) 사이의 아미드 결합; 및 b) 이황화결합의 도입 (펩타이드 1-4, 17-18, 23-31, 33-39, 44-50)에 의해서 선호적으로 도입된다. 하기 표 5는 대표적 펩타이드들의 서열을 나타낸 것이다.
선형 N06P87 펩타이드에 유사한 사이클릭 펩타이드들의 디자인
Figure pct00005
Figure pct00006
*, 일부 변형이 특정되지 않는 한, C-말단은 아미드화되어 있으며, N-말단은 자유로운 상태이다; -, 공유 결합, (a) 대시가 서열의 말단에 있으면, 말단기가 치환기 또는 폴리머에 공유 결합에 의해서 변형된 것을 의미하며, (b) N-말단 및 C-말단에 존재하는 2개의 대시들은 말단 잔기들의 주사슬 중 아미노 및 카르복실기들 사이의 아미드 결합에 의해서 펩타이드가 사이클릭임을 의미하고; (c) 서열 중간에 존재하는 대시는 펩타이드 결합을 의미함; k, 곁사슬이 분자내 아미드 결합을 형성하는 Lys 잔기; d, 곁사슬이 분자내 아미드 결합을 형성하는 Asp 잔기; e, 곁사슬이 분자내 아미드 결합을 형성하는 Glu 잔기; - co -, 분자내 아미드 결합에 의해서 Lys 곁사슬에 공유 결합된 카르복실 말단; dA, 입체이성체 D-Ala; dQ, 입체이성체 D-Gln; dS, 입체이성체 D-serine; ( PEG )- 및 (PEG), 아미노 말단 및 카르복실 말단 각각에서의 페길화 (pegylation); pGlu, 파이로글루탐산; X3X4 및 Z1Z2, 다이펩타이드들; Bm Q, L-b-메틸글루타민 (베타 탄소에서 메틸화된 Gln); Nm N, N-메틸 Asn.
곁사슬들의 고리화 및/또는 폴리머 또는 곁사슬에 공유 결합됨으로써 펩타이드의 화학적 변형을 위해서 잔기 Lys 및 Asp/Glu에 유사하게 사용될 수 있는 특수 아미노산들
Figure pct00007
이황화 다리결합에 의한 펩타이드 고리화 및/또는 곁사슬을 통한 폴리머에의 결합에 의한 펩타이드 화학적 변형을 위해서 시스테인에 유사하게 사용될 수 있는 특수 아미노산들
Figure pct00008
모든 경우들에서, 디자인된 펩타이드에 도입된 구조적 제한은 분자의 생물학적으로 활성인 입체형태와 양립가능한 것이어야 한다. 그러므로, 본 발명의 고리화 디자인은 곁사슬들에 의해서 결합되는 아미노산들의 치환/도입을 위한 서열 중의 잠재적 위치 선택 및 도입될 아미노산(들)의 유형(들)을 모두 포함한다. 펩타이드 상의 치환 위치들에 해당되는 잔기-간 거리들은 선택된 결합 잔기들의 입체화학적 특성과 양립가능한 것이어야 한다. 예를 들어, 이황화 다리결합을 도입하는 경우, 활성 입체형태에서 알파 탄소들 사이의 거리가 7 Å 보다 길거나 3.8 Å 보다 짧은 위치들은 잠재적 치환 위치로 고려되지 않는다 (Vardhan S. Dani, C. Ramakrishnan and Raghavan Varadarajan. Protein Engineering vol.16 no.3 pp.187-193, 2003). 유사하게, 베타 탄소들 사이의 거리가 3.6 Å 내지 4.7 Å인 위치들은 바람직하게 간주된다. 알파 및 베타 탄소들과 같은, 치환 위치들의 입체-화학적 표시자들은, 연결 잔기들의 측쇄에서의 비틀림 각도들을 뒷받침하는 것이어야 하며, 이는 일단 잔기들 사이에서 공유 결합이 이루어지면, 바람직한 수치들을 얻기 위해 충분한 것이어야 하고, 이것이 바람직한 비-공유 결합 상호작용의 존재를 의미한다 (반 데르 발스).
하기 단계들은 본 발명의 (시스테인에 의한) 이황화 다리 결합에 의해서 고리화된 펩타이드들의 디자인을 위한 것이다: a) 이황화 다리 결합에 의해서 연결된 시스테인들에 의한 치환이 가능한 N06P87 펩타이드의 잠재적 치환 위치 쌍들의 선택, b) 변형된 펩타이드들의 3차원 구조 모델링/모델들의 최소화된 에너지 및 c) 모델들의 에너지 및/또는 입체화학적 품질 패러미터들의 평가. N06P87 펩타이드 상의 시스테인에 대한 치환 위치들은 MODIP (Vardhan S. Dani, C. Ramakrishnan and Raghavan Varadarajan. Protein Engineering vol.16 no.3 pp.187-193, 2003)를 사용하여 선택하였는 바, 이는 단백질 이황화 다리결합을 디자인하기 위해서 개발된 소프트웨어이다. 상기 방법은 알파 및 베타 탄소들에 대한 원자간 거리들에 따라서 경험적 에너지에 의해서, 잠재적인 이황화 다리결합들에 점수를 할당하고, 또한 비틀림 각도들인 χ1, χ2, χss, χ1' 및 χ2'에 대한 수치들도 할당한다 (R. Sowdhamini, N. Srinivasan, B. Shoichet, D.V. Santi, C. Ramakrishnan and P. Balaram (1989). Prot. Engng., 3, 95-103).
잠재적 이황화 다리결합들에 대해서 계산된 에너지 수치들에 따라서, MODIP는 품질 스코어로서 A (이상적 입체화학), B (적당한 기하학적 구조이지만, 입체화학적 비틀림) 또는 C (이황화 다리결합의 형성을 허용하기에 충분히 가까움)를 할당하고, 여기에서 A는 가장 높은 품질을, C는 가장 낮은 품질을 의미한다. 디자인된 3D 구조 모델들을 분자 모델링 소프트웨어를 사용하여 얻을 수 있고, (바람직하게는) 핵 자기 공명에 의해서 얻을 수 있다. 본 발명에서, 펩타이드들을 모델링하기 위해서 MODELLER 소프트웨어 (Sali A, Blundell TL, 1993, J Mol Biol 234:779-815) 및 WHATIF (Vriend G, 1990, J Mol Graph. 8(1):52-6, 29)가 사용되었다.
p50의 결정학적 구조가 이러한 분석의 시작점으로서 사용되었다 - 파일 PDB 1SRP. 전술한 바와 같이, 실험적 데이터는 N06P87 펩타이드의 생물학적으로 활성인 입체형태가 p50/p25 단백질 중의 Gly255-Ser274 단편에 의해서 채택된 것과 유사함을 암시한다. 하기 표 8은 이러한 세그먼트에서 잠재적인 치환 위치들을 예측한 결과를 나타내고 있다.
MODIP를 통한 N06P87 펩타이드 중의 이황화 다리결합에 의해서 연결된 시스테인들의 치환 위치 예측
Figure pct00009
*, 예측은 Thr19 → Gly 치환에 의해서 변형된 N06P87 펩타이드의 모델에 대해서 수행됨; § 예측된 이황화 다리결합에 대한 입체화학적 품질 정도, A는 가장 높은 수치이고, C는 가장 낮은 수치.
쌍 2-4들은 천연 구조로부터 예측되었으며, A 및 B 품질 점수들을 나타내는 반면에, 쌍 1은 T19 잔기에 약간의 입체형태적 변화를 요구하고, 따라서 결과물인 이황화 다리결합이 더 낮은 품질을 갖는다. 따라서, 본 발명은 T19 → G 또는 T19 → A 치환들을 함유하는 펩타이드들을 포함함으로써, 이황화 다리결합을 이루기 위한 바람직한 입체형태를 채택한다. Gly의 치환은 영역적 유연성을 증가시키고, 다리결합의 형성을 돕는 카르복실 말단에서의 입체형태 변화들을 야기한다. 표 5 중 펩타이드 4의 구조에 대해서 얻어진 모델에 따라서 잔기 19에 대해 예측된 것과 같이, Ala가 나선형의 입체 형태를 갖는 성향이 있다는 점을 고려할 때, 그 치환은 적당하다 (모델 -69, -38의 phi-psi 비틀림 각도). T19 → G 치환과 비교할 때, Ala 치환의 도입은 폴딩 및/또는 수용체 결합 동안 입체형태 엔트로피의 더 낮은 손실이라는 특징을 갖는다. 도 10은 표 8에 나타낸 MODIP 예측으로부터 사이클릭 펩타이드 군에 대한 모델들을 보여준다.
이황화 다리결합들을 디자인하는데 사용된 동일한 치환 위치들이 또한 Lys 및 Asp/Glu 잔기들과 같은 아미드 결합들을 형성하는 연결 잔기들을 갖는 사이클릭 펩타이드들을 디자인하기에 적합하다. 이 경우 연결 잔기들의 알파 탄소들을 연결하는 원자들의 개수가 이황화 다리결합에 존재하는 것들에 비해서 많기 때문에, 펩타이드의 디자인 내로 그들을 도입하는 것을 결정하는 입체화학적 제한들이 덜 제한적이며, 따라서 MODIP에 의해서 예측된 치환 위치들 또한 일차적 접근방법으로서 적당하다. 주어진 결합에 대해서 한 쌍의 잔기들을 일단 선택하면, 결과물인 펩타이드를 모델링하고 에너지 관점에서 평가한다 (및/또는 입체화학적 패러미터들에 따라서 품질을 평가한다). 표 5의 펩타이드 33은 유사한 프로토콜에 따라서 디자인하였으며, 이러한 펩타이드는 Lys7 및 카르보닐 말단 사이에서 아미드 결합을 함유한다 (도 11).
본 발명에 따라서 선호되는 또 다른 고리화 방법은 펩타이드들의 N- 및 C-말단들의 아미노기와 카르보닐기 사이에 공유 결합을 도입하는 것을 포함한다. 펩타이드 결합의 입체화학적 제한들은 아미노산 연결자들을 도입할 필요성이 있게 하며, 이는 펩타이드들의 생물학적 활성과 양립가능한 구조를 갖는 것을 용이하게 한다. 예를 들어, 펩타이드 유닛 CA 사이의 기존 3.9 Å 거리에 비해서, 연결되는 p25/p50 단백질의 3차원 구조 중 "앵커 (anchor)"의 알파 탄소들 사이의 거리가 더 멀수록, 요구되는 연결자 잔기들 (Ncon)의 개수가 많아진다. 만약, 각각의 거리 제한사항들을 만족시키기 위해서 2개의 앵커 잔기들 사이에 적당한 연결자 잔기들이 도입되지 않으면, 펩타이드가 실험적으로 관찰된 입체형태를 갖지 못할 확률이 매우 높아지고, 이는 생물할적 활성에 좋지 않은 효과를 미칠 가능성을 높인다. 연결자 잔기들은 하기 프로토콜에 따라서 디자인된다:
I. 연결된 N06P87 펩타이드 잔기들의 선택: 3차원 구조 중에서 인접한 잔기들, 바람직하게는 일차 결합 또는 일차 세그먼트 중에 포함되지 않는 것들;
II. 필요한 연결자 잔기들의 최소 개수 확인: Ncon > dCA - CA/3.9;
III. 앵커링 잔기들의 선택: 연결될 N06P87 펩타이드 잔기들 및 인접한 잔기들로서, 양 말단에서 2-3개의 잔기들이 선택;
IV. 필수적 3차원 단백질 구조 데이터베이스 중에서 N 잔기 세그먼트의 검색 (Ncon + 4 > N > Ncon + 6)으로서, 이는 단편 말단의 2-3 잔기들의 주사슬 구조가 앵커링 잔기들의 구조와 유사하게 되도록 하는 방식으로 수행;
V. 연결자 세그먼트의 서열 및 구조의 선택: IV 단계에서 관찰되는 가장 보편적인 연결자 세그먼트의 구조가 선택되며, 모든 위치의 각각의 아미노산에 대해서 선택 패러미터들을 계산, 즉 아미노산의 출현 횟수와 데이터베이스 중 아미노산의 상대량에 따라서 기대되는 수치 사이의 비율을 계산한다. 가장 높은 선호 패러미터들을 나타내는 아미노산들 (하나 또는 복수)이 각각의 위치에 대해서 선택된다. 선호 패러미터 기준에 따라서 연결자 세그먼트에 인접한 잔기들을 수정하는 것이 가능하다. 양의 비틀림 각도들을 갖는 위치들이 포함되는 경우, D-입체이성체들을 도입하는 것이 가능하다. 또한, 요구되는 구조에 대한 주사슬 상의 적절한 입체형태를 채택하기 위해서 잔기의 구조적 성향을 증가시키는 다른 비천연 아미노산들 (예를 들어, 베타- 및 N-메틸화된 아미노산들)을 도입하는 것도 가능하다.
이러한 펩타이드들은 N- 및 C-말단들 사이의 아미드 결합에 의해서 고리화되기 때문에, 서열의 사이클릭 순열은 동일한 펩타이드들을 포함한다. 본 발명의 실시예에서, 펩타이드들은 N06P87 펩타이드에 대해서 정해진 일차 결합 세그먼트에 기초하여 디자인되며, 상기 세그먼트는 일반 서열 Z1Z2X3X4 (또는 각각 X3X4 및 Z1Z2, 표 5의 펩타이드 64)를 갖는 테트라펩타이드 (2개의 다이펩타이드들)에 의해서 연결된다. 이러한 펩타이드들은 11개까지의 아미노산들을 포함한다. 본 발명의 연결자 서열들은 또한, 잔기들이 양의 비틀림 각도들을 채택하는 위치들에서 (표 5 중 펩타이드 65 및 66) D-아미노산을 포함할 수도 있다. 상기 연결자 테트라펩타이드의 서열은 바람직하게는, 이에 제한되는 것은 아니지만, dSer-Pro-Thr-Pro이고 (표 5 중 펩타이드 65, dS는 D-Ser 입체이성체), 이는 또한 Gly-Pro-Thr-Pro (표 5 중 펩타이드 71) 또는 dAla-Pro-Thr-Pro (표 5 중 펩타이드 70, d-Ala는 D-Ala 입체이성체)일 수도 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 펩타이드들은 p50 폴리펩타이드의 Asn262-Ser271 세그먼트에 해당되는 서열을 포함하며, 이는 테트라펩타이드에 의해서 연결된다. 결과물인 펩타이드들은 14개의 잔기들을 갖는다. 테트라펩타이드 연결자의 바람직한 서열은, 이에 제한되는 것은 아니지만, Thr-Pro-Gly-Gln (표 5 중 펩타이드 72)일 수 있고, 대안으로서는, 이에 제한되는 것은 아니지만, Arg-Pro-(dAla)-Gln (펩타이드 69, 도 12 참조) 또는 Arg-Pro-Gly-Gln (표 5 중 펩타이드 73), 또는 Thr-Pro-(dAla)-Gln (표 5 중 펩타이드 68)일 수도 있다. 따라서, 이러한 펩타이드들의 서열은 연결자 헥사펩타이드에 의해서 고리화된 세그먼트 Asn264-Ser271로 서술될 수 있고, 상기 헥사펩타이드는 바람직하게는: (Thr 또는 Arg)-Pro-(Gly 또는 dAla)-Gln-Asn-Ser이다. 대안으로서, 헥사펩타이드 연결자 중 잔기 4 및 5는 각각 아미노산 BmGln 및 NmAsn일 수 있는 바, 여기서 BmGln 및 NmAsn은 각각 L-b-메틸글루타민 (베타 탄소에서 메틸화된 L-글루타민) 및 L-n-메틸 아스파라긴 (N-메틸 L-아스파라긴)이다. 베타메틸화된 아미노산들은 연장된 입체형태를 갖기가 쉽고 (베타형 구조), N-메틸화된 아미노산들은 폴리프롤린형 구조들을 갖기가 쉬우며, 이는 연결자 세그먼트들의 디자인을 위해서 서술된 프로토콜 (단계 I - IV)에 의해서 얻어진 펩타이드의 모델 구조들에서 잔기 4 및 5에서 채택된 구조들이다.
본 발명의 또 다른 실시예는 트리펩타이드에 의해서 연결된 p50의 Asn262-Ser271 세그먼트 (또는 이와 유사하게 펜타펩타이드에 의해서 연결된 Asn264-Ser271 세그먼트)에 해당되는 서열을 갖는 펩타이드들로 구성된다. 상기 트리펩타이드는 바람직하게는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 서열 (Arg 또는 Lys)-(Arg 또는 Lys)-Pro (표 5 중 펩타이드 76-77, 도 13)을 갖고, 펜타펩타이드 연결자는 (Arg 또는 Lys)-(Arg 또는 Lys)-Pro-Asn-Ser을 갖는다.
실시예 9. 입체이성체
구조적 안정성 및, 결과적으로 펩타이드의 친화도/효능을 증가시키기 위한 목적으로 변형을 고려하였으며, 이는 원래 N06P87 서열 중의 L-아미노산들을 그들의 입체이성체들 (D-아미노산, D-aa.)로 치환하는 것을 포함한다. D-aa.는 선호되는 양의 비틀림 각도들을 가지므로, 치환 후보가 되는 N06P87 잔기들은 천연 단백질 구조 (및/또는 펩타이드들의 구조적 모델들) 중에서 그러한 비틀림 각도들을 갖는 것들이다. 도 14는 p50의 Gly255-Ser274 세그먼트에 대한 3차원 구조에 해당되는 라마찬드란 다이어그램을 도시한 것이다. Rooman 및 Wodak의 라마찬드란 다이어그램 영역들에 대한 정의들을 사용하면 (Rooman MJ, Kocher JP, Wodak SJ. 1991. J Mol Biol. 221(3):961-79), 잔기 N8 및 G12는 L 영역 (왼손 회전 방향을 갖는 나선형 영역)에 위치하고, G6는 연장된 입체형태 E 영역 (G6 phi 및 psi 수치들은 또한 나머지 L-아미노산들에는 맞지 않는다)에 위치한다.
그러므로, D-Ala을 사용한 N8, G12 및 G6의 치환은 선호되는데, 이는 이러한 잔기가 그러한 주사슬 입체형태를 채택하는 경향이 있다는 점 및/또는 폴딩/결합 관련된 입체형태 엔트로피의 손실을 감소시킨다는 점을 고려할 때 그러하다. L-Glu, L-Gln 및 L-Asp는, 이러한 잔기들이 단백질 루프들 내에 존재하는 경우에는 나선형 입체형태 (오른손 회전 방향)를 갖는 경향이 매우 강하기 때문에 (Swindells MB, MacArthur MW, Thornton JM. 1995. Nat Struct Biol. 2(7):596-603), 유추해보면, D-Glu, D-Gln 및 D-Asp는 왼손 회전 방향의 나선형 입체형태를 갖는 경향이 있다는 것을 알 수 있다 (N8 잔기의 경우와 같이). 펩타이드 17, 23, 25, 27-31, 45-51 (표 5)은 전술한 기준에 따라서 디자인된 1개 내지 3개의 D-aa을 갖는다. 본 발명의 펩타이드 구조 중에 D-aa.을 도입하는 것 역시 입체 형태, 따라서 친화도에 대해서 긍정적 효과를 가지며, 이는 이러한 펩타이드들의 인 비보 단백질분해에 대한 내성을 증가시킴으로써 약물동태학적 특성들에, 하기 2가지 주된 원인들에 근거하여 긍정적으로 기여하게 된다: a) 직접적 효과, 이는 혈청 엔도프로테아제들이 입체-특이적 기질들을 분해하기 때문; 및 b) 더 낮은 펩타이드 유연성을 가짐으로써 프로테아제 분해에 덜 취약하게 하기 때문.
실시예 10. 펩타이드 말단 블록킹 및/또는 폴리머에의 컨주게이션
펩타이드들은 인 비보에서 낮은 평균 반감기 (더 작은 크기, 신장 배제 (renal exclusion)), 가장 높은 유연성으로서 단백질분해에 대한 민감도 증가의 원인, 따라서 더 낮은 생이용가능성이라는 특징을 갖는다. 따라서, 펩타이드들에 화학적 변형들을 도입하는 것은 그 생이용가능성을 향상시키기 위한 권장사항일 수 있다. 본 발명은 폴리에틸렌 글리콜 사슬(들) (PEGS)과 공유 결합으로 변형된 펩타이드들의 디자인을 포함하며, 이러한 디자인은 바람직하게는 펩타이드 말단을 변형시킴으로써 수행되지만, 예를 들어 곁사슬들과 같은 다른 변형들을 배제하는 것은 아니다. 본 발명에 따라서 페길화된 펩타이드들에 대한 예들이 표 5에 나타나 있다 (펩타이드 62 및 63). 본 발명의 페길화된 펩타이드들은, 따라서 단백질분해에 대한 내성, 감소된 신장 여과, 항체들과 상호작용하여 그 활성이 중화될 수 있는 더 낮은 가능성, 및 감소된 항원성 및 면역원성 면에서 더 나은 프로필을 나타낸다.
페길화 (pegylation)는 작은 분자들, 급속하게 분비되며 방사성 동위원소 표지된 경우에는 신장 독성을 갖는 것으로 보고된 바 있는 작은 펩타이드들의 순환 시간을 증가시킨다 (Blumenthal R. D., Sharkey R. M., Goldenberg D. M. Goldenberg D. M. eds. Cancer Therapy with Radiolabeled Antibodies, 295-314, CRC Press Boca Raton, FL 1995.). 페길화는, 인터페론 및 항체들과 같은 합성 약물들을 변형하는데 사용되어 왔다. 본 발명은 펩타이드-수용체 결합에 있어서 높은 결합활성 (avidity)을 가능케 하는 선형 또는 분지 PEGS를 사용하여 멀티머 구조들을 디자인함으로써 펩타이드들을 제공하는 것을 포함한다.
페길화는 펩타이드들의 겉보기 분자 크기를 증가시키고, 이는 신장 투과율을 감소시킨다 (Knauf M. J., Bell D. P., Hirtzer P., Luo Z. P., Young J. D., Katre N. V. J. Biol. Chem., 263: 15064-15070, 1988; Behr T. M., Goldenberg D. M., Becker W. Eur. J. Nucl. Med., 25: 201-212, 1998). 본 발명에 따른 펩타이드들은 바람직하게는 PEGs로 변형되어 그 분자량이 50 kDa 이상으로 증가됨으로써, 분자들의 신사구체 투과 (glomerular filtration)가 급격하게 감소된다.
페길화는 순환 시간을 증가시킬 뿐만 아니라, 항원성 및 치료 분자들의 단백질분해에 대한 민감성을 감소시키고 (Delgado C., Francis G. E., Fischer D. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 9: 249-304, 1992.), 용해도 및 맥관 투과 (vascular permeability) 증가를 유도하며 (Francis G. E., Delgado C., Fisher D., Malik F., Agrawal A. K. J. Drug Target., 3: 321-340, 1996), 이는 항종양 약물들에 있어서 매우 바람직한 특성이다.
피, 신장 및 간에는 몇몇 엑소펩티다아제들 (exopeptidases)이 존재하며 (Werle M, Bernkop-Schnrch A. Amino Acids. 2006 Jun;30(4):351-67), 따라서 N- 및 C- 말단들을 변형시키는 것은 그 단백질분해 안정성을 현저하게 증가시킬 수 있다. N-아세틸화, 또한 N-말단에서의 파이로글루탐산 또는 D-입체이성체 아미노산 등의 도입은 본 발명에서 추천되는 변형이다.
본 발명의 펩타이드들은 대부분 C-아미드화되어 있으며 (C-말단에 아미드가 존재), 이는 펩타이드들에 카르복시펩티다아제에 대한 내성을 부여한다.
N- 및/또는 C-말단의 변형 역시 페길화일 수 있는데, 이는 말단 변형에 의해서 프로테아제들, 특히 엑소펩티다아제들에 대한 내성을 증가시킬 뿐만 아니라, 관련되고 전술한 특성들로서 크기 증가 및 항원성/면역원성의 감소를 야기한다. 이외에도, PEGS의 첨가는 단백질분해 효소들에 대한 입체 장해에 의해서 일반적으로 단백질분해에 대한 내성 증가 (엔도 및 엑소)를 유도한다. 이러한 목적을 위해서, PEGS는 선형 또는 분지형으로 사용된다.
고리화 또한, 전술한 N- 및 C-말단들 사이의 공유결합 형성에 의해서 (표 5 중 펩타이드들 64-66, 68-69) 또는 일 말단의 곁사슬에 대한 공유결합에 의해서 (표 5 중 펩타이드들 32-33), 엑소펩티다아제 단백질분해에 대해서 펩타이드들을 보호한다. 엑소펩티다아제들에 대한 내성은 또한 말단 아미노산들을 D-아미노산에 의해서 치환함으로써 달성된다 (표 5 중 펩타이드 67).
PEGs를 사용한 변형의 대안으로서, N-아세틸뉴라믹산 (시알릭산)에 컨주게이션시키는 것도 가능한데, N-아세틸뉴라믹산은 천연적으로 발생되고 매우 친수성을 띄는 폴리머로서, 생분해성을 갖고, 인간에게는 수용체가 존재하지 않으며, 프로테아제들에 대한 내성 (플라즈마 안정화) 및 반감기를 증가시킬 수 있다 (Gregoriadis G, Fernandes A, Mital M, McCormack B (2000) Cell Mol Life Sci 57: 1964-1969; Fernandes AI, Gregoriadis G (1997) Biochim Biophys Acta 1341: 26-34). 본 발명의 펩타이드들에 대한 다른 가능한 변형은 지방산에 의한 N-말단 치환 또는 지방화를 포함할 수 있다 (표 5 중 펩타이드들 52-353). 이러한 방법은 펩타이드들이 엑소펩티다아제들에 의해서 단백질분해되는 것에 대한 내성을 증가시킬 수 있고, 펩타이드들과 멤브레인들과의 상호작용을 용이하게 한다. 지방의 특성에 따라서, 특정 멤브레인 도메인들과의 상호작용이 ㅅ선호될 수 있는데, 이는 펩타이드들의 약물동태학적 활성의 수용체 표적 상에 풍부한 도메인들 중에 펩타이드들이 축적되는 것을 용이하게 한다. 지방화는 또한 더 나은 약물동태학적 및 약물역학적 특성들을 갖는 초분자적 구조 (supramolecular structures)의 형성을 선호한다 (미셀, 응집체, 입자, 소포).
실시예 11. 본 발명의 펩타이드들의 화학적 구조 서술
도 15는 본 발명의 펩타이드들에 대한 화학적 구조의 일반적 표시를 보여준다. 우선, 디자인은 실시예 7에 한정된 일차 세그먼트에 기반한다. 일반적으로, 펩타이드 서열 Asn264-Leu270은 다른 구조적 맥락 내에서 노출되고, 이들 모두는, 펩타이드들의 주사슬 및/또는 곁사슬들을 포함하는 고리화에 의해서, 다른 제한 각도들 (constraints degrees)을 포함한다. 고리화는 또한 다른 화학적 특성을 갖는 결합들에 의해서 이루어지지만: 아미드 또는 이황화 결합들, 치환 위치들은 사이클릭 곁사슬들의 잔기들 및 곁사슬들 자체에 의해서 차지되고, 본 발명에서 확인된 p50/p25 단백질 기능 부위의 구조 및 지형 (topography)을 재현할 수 있도록 조심스럽게 선택된다. 일 해법은 주사슬을 고리화하는 것인데, 이는 일차 세그먼트의 구조와 양립가능한 입체형태를 취하는 높은 구조적 성향을 갖는 앵커 부위 및 연결자 서열들을 선택함으로써 수행된다. 이차 세그먼트들 또한 선택적으로 사용될 수 있는데, 이는 주로 사이클릭 곁사슬들에 의해서 치환 위치들을 지지하기 위한 것이다. 더욱이, 이차 세그먼트들은, p50/p25 기능 부위의 지형에 따라서, 잠재적인 수용체들과 상호작용하기 위한 부가적인 접촉면들을 제공할 수 있다. 예를 들어, C-말단 이차 세그먼트의 X+3 및 X+4 위치에서 양전하 및/또는 수소 다리결합 공여체들을 보유하는 잔기들을 포함시킬 수 있다. 비록 표 5에는 예로서 오직 모노사이클들만 포함되어 있으나, 펩타이드들은 도 15에 도시된 하나 또는 그 이상의 고리들을 포함할 수 있다. 본 발명의 펩타이드들은 비천연 또는 특수 아미노산들을 포함할 수 있는 바, 그 곁사슬들은 고리화 또는 다른 화학적 변형을 위한 치환 위치들을 차지하기 위한 목적으로, 아미노, 카르복실 또는 설프히드릴기들을 포함할 수 있다. 또한, 펩타이드는 일차 또는 이차 세그먼트에 대해서 양의 비틀림 각도들을 가질 수 있는 폴리펩타이드 위치들에서 D-아미노산 입체이성체를 포함할 수도 있다. 이에 더해서, 본 발명의 펩타이드들은 공유결합에 의해서 PEG 및/또는 다른 화학기들과 같은 폴리머들에 공유 결합됨으로써 변형될 수 있다. 그러한 변형들은, 그들이 고리화된 곁사슬들에 의해서 차지되지 않는 한, 치환 위치들의 말단들 및/또는 곁사슬들에서 수행될 수 있다.
표 5 중의 펩타이드 1, 2, 3 및 4 (합성 및 정제 과정에서 각각 하기로 표시: A08P25s-s, A08P28s-s, J08P46s-s, 및 J08P48s-s)는 본 발명의 펩타이드들에 필수적인 양상들을 커버할 수 있는 실제 실시예들이다: 다른 크기들, 이차 세그먼트들 및 주된 치환 위치들을 포함 또는 미포함. 이러한 펩타이드들은 인 비보 모델들에서 그들의 영향을 보여주기 위해서 선택된 것들이다: p25 폴리펩타이드 중 세포독성 활성을 갖는 은성 펩타이드 단편을 구조적으로 시뮬레이션하게 되면 20개까지의 아미노산들을 갖는 펩타이드 분자가 생성되며, 이는 바람직하게는 암 치료법에 사용될 수 있는 항암 활성을 효과적으로 재현한다.
실시예 12. 동종 유전성 (syngeneic) 및 이종이식 (xenograft) 종양 모델들에서 최적화된 사이클릭 펩타이드들의 항암 활성 평가
본 발명의 사이클릭 펩타이드들로 이루어진 새로운 패밀리에 대한 항암 활성을 평가하기 위한 목적으로, 이러한 펩타이드들은 p25 폴리펩타이드의 활성 영역에 대한 구조를 모방하며, 이러한 패밀리에서 다른 고리화 및 삽입 변이체들을 포함하는 4개의 펩타이드 모델들을 선택하였다. 그들은 표 5 중 펩타이드 1, 2, 3 및 4였다 (활성 분석을 위해서 각각 하기로 표시: A08P25s-s, A08P28s-s, J08P46s-s 및 J08P48s-s). 양성 대조군으로는 CIGB370r 폴리펩타이드로 처리된 군을 사용하였다.
체중 22g, 6 내지 8주령의 C57BL/6 암컷 마우스들을 National Center for Laboratory Animal Production (CENPALAB, Havana, Cuba)으로부터 공급받았으며, Bioterium of the Center for Genetic Engineering and Biotechnology (CIGB)에서 무병원체 조건 하에서 수용하였다. 실험들은 실험실 동물들의 적당한 취급 및 보호에 대한 규정에 부합하게 수행하였다. 종양 부피는 각각의 경우에 대해서 측정하였으며 (하기 식에 의해서 계산: 부피 = a2x (b/2), 여기에서 a는 종양의 폭, b는 종양의 길이), 동물 생존율을 평가하였다.
생존율은 Logrank 테스트에 의해서 군들 간에 비교하였다. 통계적 패러미터들은 GraphPad Prism 4.0 소프트웨어 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)를 사용하여 얻었다.
C57BL/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 경로 (s.c.)에 의해서 50 000 TC-1 세포들을 주사하였다. 종양이 검출되었을 때, 마우스들을 처리군들로 무작위화하여 연구 대상이 되는 펩타이드들로 처리한 경우를 평가하였고, 다른 투여 경로들에 따라서 평가하였다. 종양-보유 동물들은 격일로 6회, 80 μM의 대상 펩타이드로 투여하였으며, 담체만을 투여한 경우를 대조군으로 하였다. 각 군에 대해서 5마리의 마우스들을 사용하였다. 동물들은 무병원체 조건 하에서 수용하였으며, 과정들은 실험 동물 취급 및 보호에 적합한 방식으로 수행하였다.
생존율은, 담체를 투여한 군과 비교할 때, 처리된 모든 군들에서 통계적으로 유의미하였다. 도 6은 3개의 블럭들을 보여준다: 1) 고 생존율 블럭으로서, 이는 각각 펩타이드 J08P48s-s 및 CIGB370r로 처리된 군들을 포함하며, 그들 사이에는 통계적으로 유의미한 차이는 없었다; 2) 중간 생존율 블럭으로서, 이는 각각 A08P28s-s, A08P25s-s, 및 J08P46s-s 펩타이드들로 처리된 군들로서, 그들 사이에 통계적으로 유의미한 차이는 없었으며, 블럭 1과는 차이가 있었다; 및 3) 음 대조군. 이러한 결과들은 상기 모델에서 평가된 펩타이드들에 의해서 대표되는 본 발명에 따른 새로운 펩타이드 패밀리가 기원이 되는 폴리펩타이드에 대해서 서술된 활성을 달성할 수 있다는 것을 보여준다.
종양내 경로에 더해서, 상기 TC-1 모델을 사용하여, 복강내 경로와 같은 펩타이드들에 대한 다른 투여 경로들도 조사하였다. 도 17은 사이클릭 펩타이드들 (예를 들어, J08P48s-s 펩타이드)이 이러한 모델에서, 두 경로 모두에 의해서 투여된 경우, CIGB370r 폴리펩타이드에 대해서 관찰된 효과를 재현한다는 것을 보여준다. 이러한 사실은 본 발명에 따른 사이클릭 펩타이드들이 원격 고형 종양 (distal solid tumor)을 치료하는데 효과적이라는 점을 입증한다.
무흉선 NIH 마우스, Ls174T 인간 결장암 모델에서, 도 19에 도시한 투여량 및 스케줄로, 선형 세그먼트 Gly255-Ser274 (펩타이드 N06P87) 및 본 발명에 따른 다른 2개 모델의 사이클릭 펩타이드들의 효과를 CIGB370r 폴리펩타이드의 효과와 비교하였다. 13일 경과 후, 종양이 이식되어 감지할 수 있을 정도가 되면, 생분자들의 투여를 개시하였다 (도 19 A). 펩타이드들은 시간이 경과할 수록 소량을 투여하는 방식으로 투여하였다: 매 48 시간 마다 600 μM씩 2회 투여, 이어서 매 48 시간 마다 330 μM씩 4회 투여, 최종적으로 매 72 시간 마다 90 μM씩 4회 투여. CIGB370r은 4주 동안 주 1회 투여하였다.
이 경우, 선형 펩타이드와는 달리, 도 19에 도시된 사이클릭 펩타이드들은, 담체가 투여된 군 및 선형 펩타이드 N06P87과 비교할 때, 처리된 동물들의 생존율을 현저하게 증가시킬 수 있었다 (Logrank 테스트: p < 0.05). 평균 종양 부피와 관련된 T/C 수치는 (도 19B): A08P25s-s, J08P48s-s, CIGB370r 및 N06P87 펩타이드들 각각에 대해서 35%, 35%, 37%, 및 72%였다. 이러한 결과들은 본 발명에 따른 사이클릭 펩타이드들이 p25의 항암 활성 부위의 3차원 구조와 유사하며, 항종양 치료법을 개발하는데 유용하다는 것을 보여준다. 본 발명에 따른 펩타이드들은 그 천연 단백질들에 비해서 몇몇 약물동태학적 및 약물역학적 장점들을 나타낸다.
실시예 13. 본 발명에 따른 사이클릭 펩타이드들이 다양한 조직학적 기원을 갖는 인간 종양 세포주에 대해서 미치는 다양한 활성 스펙트럼
본 발명에 따른 펩타이드들을 광범위한 조직학적 기원을 갖는 다양한 인간 종양 세포주들에 대해서 평가하였으며, 이는 설포로다민 B 방법을 사용하여 수행하였다 (Skehan P, Storeng R, Scudiero D, et al., (1990) "New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening." J. Natl. Cancer Inst. 82: 1107-1112).
예를 들어, 도 18은 평가된 세포주들에 대해서 광범위한 활성 스펙트럼을 갖는 펩타이드를 보여주며, 이는 투여량-반응성 효과를 보여준다. 이는 이러한 신규 분자들이 광범위한 조직학적 기원을 갖는 악성 종양들을 치료하는데 유용하다는 것을 입증하며, 예를 들어: 후두암 (HEp-2), 소세포 폐암 (H82), 비소세포 폐암 (H125), 자궁경부암 (HeLa, Caski), 및 신경교종 (U87)에 유용하다.
실시예 14. 매트리겔 중에서 튜브형 구조의 억제
현재, 국제 과학계에는 조합치료법이 암 치료법에 대한 핵심사항이라는 점이 확립되어 있는 바, 특히 종양 세포들에 대한 직접 작용 (종양 세포들의 번식을 억제하거나 또는 그 사멸을 유도)과 함께 혈관생성을 억제하는 종양 환경에 대한 작용을 조합하는 치료법이 확립되어 있다. 이러한 연유로, 매트리겔 상에서 인간 맥관구조-유도 상피 세포들 (vasculature-derived endothelial cells, HEMC)에 의한 상피 세포주의 형성을 평가하는 방법에 의해서 (Crum R, Szabo S, Folkman J. (1985). Science. 230:1375-8), 본 발명에 따른 펩타이드들의 혈관생성 억제 활성을 평가하였다. 도 20은 튜브형 구조들의 형성을 억제하는 본 발명에 따른 사이클릭 펩타이드들의 사용된 농도에 따른 효능, 및 그 항혈관형성 활성을 보여준다.
실시예 15. Serratia marcescens로부터 유래된 사이클릭 펩타이드에 기반한, 자가 조립 특성을 갖는 펩타이드 구조들
본 발명에 따른 펩타이드들은 양친매성을 갖는 바, 이는 펩타이드 표면 상에서 소수성 및 친수성 패치들이 분리됨으로써 야기된다. 소수성 패치는 Tyr259, Phe269 및 Leu270 잔기들의 곁사슬에 의해서 주로 형성되는데, 그들의 구조는 p50 단백질의 3차원 구조와 닮아 있다. 나머지 표면은 주로 극성 또는 대전된 잔기들에 의해서 형성된다. 이러한 양친매성은, 도 21의 현미경 사진에도 도시된 바와 같이, 펩타이드들이 나노크기 및/또는 마이크로크기 초분자 응집체를 형성하는 것을 가능케 한다. 부가적으로, 펩타이드들의 응집은 주사슬 및 곁사슬들의 세그먼트들을 포함하는 분자간 수소 다리결합들의 형성에 의해서도 매개된다. 본 발명에 따른 펩타이드들의 N- 및 C-말단 이차 세그먼트들에 대한 연장 구조들은 암 치료법에서의 신규 적용을 위한 특정 형성 조건들 하에서는 소정 응집 유형을 선호할 수도 있는데, 이러한 신규 적용 분야로는 예를 들어: 조합 치료법 및 나노생명공학 분야 및 조절 방출 시스템들을 들 수 있다 (Monica C. Branco, Joel P. Schneider. Acta Biomaterialia 5 (2009) 817-831).
실시예 16. 종양 세포들에 대해서 상승 세포독성 효과를 나타내는, 프로디기오신과 조합된 항암 및 항혈관형성 사이클릭 펩타이드들
Serratia marcescens CMIB4202로부터 분리된 프로디기오신 (Abrahantes-Perez MC, Reyes-Gonzalez J, Veliz Rios G, et al., (2006) Cytotoxic proteins combined with prodigiosin obtained from Serratia marcescens have both broad and selective cytotoxic activity on tumor cells. J Chemother. 18: 172-81)을 적당한 제제화, 또는 공유결합에 의해서, 직접 화학적 합성 또는 단일 분자들 사이에서 화학적 반응시킴으로써, 본 발명에 따른 사이클릭 펩타이드들과 조합하였다. A08P25s-s, A08P28s-s, J08P46s-s 및 J08P48s-s와 같은 사이클릭 펩타이드들은 다양한 인간 종양 세포주들에 대해서 프로디기오신의 세포독성 활성을 향상시켰으며 (A549, A375, PC-3, U87, 등), 이는 SRB 방법에 의해서 평가하였으며 (Skehan P, Storeng R, Scudiero D, et al., (1990) "New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening." J. Natl. Cancer Inst. 82: 1107-1112), 평가 데이터에서 GI50 수치들은 nm 범위였고, 일차 섬유아세포에 대한 프로디기오신의 작용으로부터 유래되는 세포독성 활성을 적어도 10배 만큼 감소시켰다. 이러한 사실은 양 분자들의 작용 메커니즘이 서로 다르다는 것을 의미하며, 따라서 항암 치료법에 있어서 이들이 유리한 결과로 조합될 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 17. 폴리락트-co-글리콜산 (polylactic-co-glycolic acid, PLGA)의 패밀리 폴리머들로 캡슐화된 항종양 및 항혈관형성 사이클릭 펩타이드들의 약제학적 조성물 제조
각 특정 사례에 바람직한 암 치료 지표들에 따라서 본 발명 펩타이드들의 약물동태학 및 생분포를 변형시키기 위해서, 이러한 사이클릭 펩타이드들을 PLGA 미세구체 내에 폴리머들과 함께 캡슐화하는 방안을 실험을 수행하였다. 이러한 목적을 위해서, 1 g의 폴리머를 디클로로메탄 중에 용해시킴으로써 10% 농도로 (w/v) 락트산 및 글리콜산 50:50 코폴리머를 함유하는 용액을 제조하였다. 1 밀리리터의 폴리머 용액을, 본 발명의 펩타이드들로서, A08P25s-s, A08P28s-s, J08P46s-s 및 J08P48s-s와 같은 펩타이드들을 20-40 mg/mL 농도로 적어도 한가지 함유하는 200 μL의 수용액과 혼합하였다. 상기 혼합물을 팁 초음파 (tip ultrasound)를 사용하여 30초 동안 음파처리하였다. 결과물인 에멀전을 40 mL의 1% 폴리비닐 알코올에 부은 다음, 두 가지 상들을 Ultraturrax T8 균질기 (homogenizer) 중에서 14000으로 교반시킴으로써 2차 에멀전을 제조하였다 (w/o/w). 상기 이중 에멀전을 140 mL의 0.1% 폴리비닐 알코올 30000-70000에 붓고, 균질기에서 300 rpm으로 1 시간 동안 교반함으로써 디클로로메탄을 증발시켰다. 최종적으로, 여과에 의해서 미세구체들을 수집하고, 50 mL의 증류수로 5회 세척한 다음, 동결건조기 중에서 동결/건조시켰다. 건조된 미세구체들은 적용되기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
부형제와 더불어 A08P25s-s, A08P28s-s, J08P46s-s 및 J08P48s-s와 같은 사이클릭 펩타이드들을 포함하는 미세구체들을 전술한 바와 같이 제조하였으며, 내부 수성상에는 Pluronic F-127 (10 mg) 및 NaCl (0.5 mg)을 첨가하였다. 두 가지 유형의 미세구체들 모두를, 이식된 인간 흑색종 A375 종양을 보유한 무흉선 마우스에 투여하되, 피하 경로로 종양 부근에 투여하였다. 종양이 200 mm3 를 초과하는 부피에 도달하면, 단일 투여량을 투여함으로써, 복수 회 투여한 후 얻어진 결과들과 유사한 결과들을 얻었는 바 (4 주 동안 주 당 2회), T/C 비율은 종양 부피에 대해서 10%보다 낮고, 생존에 대해서 170%보다 높았다.
실시예 18. 항종양 및 항혈관생성 사이클릭 펩타이드로 로딩된 통상적인 리포좀의 제조
10 mg/mL의 농도의 포스파티딜 콜린을, 50 mL 원형-바닥 플라스크 중에서 순수 에탄올 중에 용해시켰다. 건조층이 수용체의 벽에 형성될 때까지 실온에서 회전증발시킴으로써 지방을 건조시켰다. 리포좀 내에 A08P25s-s, A08P28s-s, J08P46s-s 및 J08P48s-s와 같은 본 발명의 사이클릭 펩타이드들 중 적어도 한 가지를 캡슐화하기 위해서, 전술한 펩타이드들 중 적어도 한 가지를 함유하는 완충용액을 사용한 균질화에 의해서 건조 지방층 수화시켰다. 리포좀들의 크기를 감소시키기 위해서, 상기 펩타이드들이 로딩된 리포좀을 함유한 제제를, 리포좀들의 크기가 약 100 nm가 될 때까지, 평균 직경이 100 nm인 기공들을 갖는 폴리카보네이트 멤브레인을 통해서 연속 사출 단계를 수행하였다.
현탁액을 100000 × g, 4 ℃에서 40분 동안 원심분리시킴으로써, 펩타이드-로딩된 리포좀들로부터 유리 펩타이드들을 분리하였다. 상등액을 깨끗한 바이알 내에 수집하고, 침전물은 pH 7.2의 인산 완충 식염수 용액을 사용하여 재현탁시켰다. 동일한 조건들에서 2차 원심분리 단계를 거친 이후에, 결과물인 상등액을 깨끗한 바이알 내로 수집하고, 첫 번째 원심분리 상등액과 혼합하였다. 침전물 (본 발명에 따른 사이클릭 펩타이드들이 로딩된 리포좀들)을 pH 7.2의 인산 완충 식염수 용액 중에 재현탁시켰다. 이러한 최종 제제는 사용 이전까지 4 ℃에서 보관하였다. 본 발명에 따른 펩타이드들 중 적어도 하나로 로딩된 리포좀들을 TC-1 종양을 보유한 마우스에 단일 투여량으로 투여하였으며, 미캡슐화된 펩타이드들을 복수 회 투여함으로써 얻어진 결과들을 재현하였다 (실시예 12 참조).
실시예 19. 금속 이온들에 결합할 능력을 보유하고, 약물을 특정 장기로 운반할 수 있는 항종양 및 항혈관혈성 사이클릭 펩타이드들
본 발명에 따른 펩타이드들의 아미노산 조성물은 방사성금속 (radiometals) 및 상자성 금속들과 같은 금속 이온들에 결합할 능력을 제공하며, 따라서 그 생물학적 특성들에 미치는 영향 없이 약물로서 사용될 수 있다.
펩타이드-금속 이온 복합체는, 전술한 실시예들에서 언급된 부위들에서, 다양한 물리-화학적 방법들에 의해서 제조될 수 있다. 방사성금속들 중에서도, 본 발명에서는 Tc, Re, Au, Ag, Pd, As, Cu, Hg, 및 Ru의 동위원소들을 발견할 수 있었다. 금속 이온과 펩타이드 사이의 반응 산물은 양 분자들 사이의 복합체로서, TC-1 종양을 보유한 동물 모델들 (C57BL/6 마우스)에서 다양한 조직학적 기원을 갖는 종양들 및 전이세포들을 특이적으로 표적화할 수 있었다. 이러한 복합체들은 매우 특이적인 방식으로 암 진단 및 치료에 사용될 수 있는 바, 생리학적으로 정상인 조직들 및 장기들에 의한 흡수는 최소화된다.
암 진단 및 치료를 위한 용도로서 본 발명에 따른 펩타이드들의 복합체에 있어서, 방사성 동위원소들은, 예를 들어: 99Tc 및 131I일 수 있다. 금속-결합된 펩타이드들은, 본 발명에서 설명된 바와 같이, 직접 투여용으로 또는 다른 캐리어 분자들에 접합되어 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 펩타이드들을, 정상 조직들 및 장기들이 아닌, 종양에 직접 표적화함으로써 종양 내부에 축적될 수 있도록 하기 위해서, A08P25s-s, A08P28s-s, J08P46s-s 및 J08P48s-s와 같은 펩타이드들이 실시예 8에 따라서 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된 복합체를 합성하였다. 결과물을 또한 철 산화물 나노입자와 함께 제제화함으로써, 자성 나노입자화된 벡터 복합체를 제조하였으며, 그 주된 구성성분들은 하기와 같다: 본 발명에 따른 항종양성 사이클릭 펩타이드들, 폴리머 분자 및 철 산화물 나노입자. 상기 복합체를 TC-1 피하 종양을 보유한 C57BL/6 마우스 (오른쪽 옆구리 쪽에 위치)에, 상기 종양의 부피가 200　mm3가 되었을 때, 정맥주사 (마우스 꼬리 정맥을 통해서)에 의해서 투여하였다. 외부 자기장을 상기 종양 영역에 국부적으로 가하였으며, 복합체는 혈류를 통해서 종양에 농축되었다 (Lubbe AS, Bergemann C, Alexiou C. Targeting tumors with magnetic drugs. In: Page M, editor. Cancer drug discovery and development: tumor targeting in cancer therapy. Totowa NJ: Humana Press Inc; 2003. pp. 379-388). 실시예 12에 서술된 것과 유사한 투여 스케줄 및 투여량을 대조군으로 사용하였으며, 음 대조군에는 항종양 펩타이드가 결여된 담체들만을 투여하였다. 항종양 펩타이드들을 보유한 나노입자화된 자성 벡터로 처리된 군에서의 항종양 효과는, 양의 대조군들 보다 조기에 종양 부피를 감소시키고 (p<0.05), 나머지 군들에서보다 현저하게 생존율을 높이는 것 (p<0.05)으로 나타났다. 이러한 결과들은 이러한 기술이 본 발명에 따른 사이클릭 펩타이드들에 대해서 서술된 치료적 효과를 달성하기 위한 충분한 잠재력이 있으며, 이러한 능력은 종양에 치료 분자들을 더 높은 농도로 농축될 수 있게 하는 능력에 기반한다는 것을 보여준다.
실시예 20. 항종양 및 항혈관생성 사이클릭 펩타이드들과 종래 통상적인 세포 증식 억제제를 조합하는 경우 상승 효과
(A08P25s-s, A08P28s-s, J08P46s-s 및 J08P48s-s와 같은) 본 발명의 펩타이드들을 개별적으로 일 군의 종래 통상적인 세포 증식 억제제들과 조합한 경우의 항종양 효과에 대한 상승 효과를 평가하였는 바, 이는 하기 실험적 조건에 따라서 수행하였다. A549 세포들 (비소 폐암 세포)을 전술한 펩타이드들 중의 하나가 200-12.5 μM의 농도 범위로 존재하는 96-웰 플레이트 중에서 배양하였다. 동시에, 본 실험을 위해서 선택된 적어도 하나의 세포 증식 억제제 (시스플라틴, 파클리탁셀, 5-플루오로우라실, 빈크리스틴 (Vincristine), 독소루비신, 사이클로포스파미드, 미토마이신 C (Mitomycin C), 이마티닙 (Imatinib), 벨케이드 (Velcade), 이레사)를 1-2000 nM 농도 범위로 첨가하고, 72 시간 동안 배양을 연장하였다. 이 때, 세포 생존성을 MTT 방법에 의해서 측정하였다. 최종적으로, 모든 경우에 대해서 570 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 각각의 투여량-반응 곡선들을 작성하였다. 모든 세포 증식 억제제에 대해서, 이러한 억제제들이 본 발명에 따른 펩타이드들 중의 적어도 하나와 동시에 조합되는 경우, 세포 번식도를 50% 감소시키는 투여량 수치 (IC50)가 10 내지 100배 감소하였다. 이러한 분석의 결과들은 본 발명에 따른 사이클릭 펩타이드와 더불어 본 발명에서 언급된 세포 증식 억제제를 포함하는 약제학적 조성물이 항종양 효과면에서 향상된다는 것을 보여준다.
실시예 21. 종양 동물 모델에 있어서 약제학적 조성물의 항종양 효과 향상
이러한 목적을 위해서, 5x106의 A549 세포들을 피하 경로에 의해서 6-8 주령의 누드 마우스들의 등 부위에 접종하였다 (Balb/C mice). 10일 경과한 후에, 종양들이 검출가능한 수준이 되면 (약 30 mm3), 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 투여하였다. 조성물의 성분들은 복강내 경로에 의해서 투여하였으며, 이는 본 발명에 따른 사이클릭 펩타이드들 중 적어도 하나를 포함하고 (예를 들어: A08P25s-s, A08P28s-s, J08P46s-s 및 J08P48s-s), 적당한 담체 내에서 제제화되어, 실시예 12에 서술된 동일한 스케줄 및 투여량 하에서 투여하였다. 시스플라틴, 사이클로포스파미드 및 미토마이신 C와 같은 세포 증식 억제제들을, 체중 1 kg 당 1 mg의 일일 투여량으로, 동일한 치료 빈도로, 복강내 경로에 의해서 동시에 투여하였다. 세포 증식 억제제들은 펩타이드들과 동일한 담체 내에 용해되었다. 최종적으로, 종양 총 부피들을 측정하고 시간에 대해서 플롯화함으로써 인 비보 항종양 효과를 평가하였다. 상기 실험의 결과들로부터, 본 발명에 따른 약제학적 조성물이 항종양 효과의 향상을 야기하며, 양 성분들 모두가 동시에 투여되는 경우 종양 덩어리의 완전한 감소를 촉진한다는 것을 알 수 있었다. 위약군에 비해서 종양 성장의 현저한 감소 및 동물 생존율의 현저한 증가가 관찰되었다. 이러한 모든 결과들은 본 발명의 약제학적 조성물 성분들 사이의 상승 작용이, 암에 대한 관련성 있고 예측적인 전임상 모델에서 얻어진 결과들에 따라서, 인 비보에서도 효과적이라는 것을 보여준다.
<110> Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia <120> CYCLIC PEPTIDES BEARING ANTINEOPLASTIC AND ANTIANGIOGENIC ACTIVITY <130> HIP0078-CU <150> CU 2011/0067 <151> 2011-03-21 <160> 76 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C1 and C9 <400> 1 Cys Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu Cys 1 5 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C9 and C17 <400> 2 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Phe Asn Cys Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Cys Thr Thr Ser 20 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C5 and C16 <400> 3 Gly Asp Thr Val Cys Gly Phe Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Cys 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser 20 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C20 <400> 4 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Cys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Gly Cys 20 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between K9 and D17 side chains <400> 5 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Phe Asn Lys Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Asp Thr Thr Ser 20 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between K9 and E17 side chains <400> 6 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Phe Asn Lys Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Glu Thr Thr Ser 20 <210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between K9 and K17 side chains <400> 7 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Phe Asn Asp Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Lys Thr Thr Ser 20 <210> 8 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between E9 and K17 side chains <400> 8 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Phe Asn Glu Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Lys Thr Thr Ser 20 <210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between K5 and D16 side chains <400> 9 Gly Asp Thr Val Lys Gly Phe Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Asp 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser 20 <210> 10 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between K5 and E16 side chains <400> 10 Gly Asp Thr Val Lys Gly Phe Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Glu 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser 20 <210> 11 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between D5 and K16 side chains <400> 11 Gly Asp Thr Val Asp Gly Phe Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Lys 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser 20 <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between E5 and K16 side chains <400> 12 Gly Asp Thr Val Glu Gly Phe Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Lys 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser 20 <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between K7 and D20 side chains <400> 13 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Lys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Gly Asp 20 <210> 14 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between K7 and E20 side chains <400> 14 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Lys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Gly Glu 20 <210> 15 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between D7 and K20 side chains <400> 15 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Asp Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Gly Lys 20 <210> 16 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between E7 and K20 side chains <400> 16 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Glu Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Gly Lys 20 <210> 17 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C20, A12 is a D-amino acid <400> 17 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Cys Asn Ser Asn Thr Ala Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Gly Cys 20 <210> 18 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C21 <400> 18 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Cys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser Cys 20 <210> 19 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between K7 and D21 side chains <400> 19 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Lys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser Asp 20 <210> 20 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between K7 and E21 side chains <400> 20 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Lys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser Glu 20 <210> 21 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between D7 and K21 side chains <400> 21 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Asp Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser Lys 20 <210> 22 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between E7 and K21 side chains <400> 22 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Glu Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser Lys 20 <210> 23 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C21, A12 is a D-amino acid <400> 23 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Cys Asn Ser Asn Thr Ala Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser Cys 20 <210> 24 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C20 <400> 24 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Cys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Gly Cys Lys 20 <210> 25 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C20, A12 is a D-amino acid <400> 25 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Cys Asn Ser Asn Thr Ala Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Gly Cys Lys 20 <210> 26 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C21 <400> 26 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Cys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser Cys Lys 20 <210> 27 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C21, A12 is a D-amino acid <400> 27 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Cys Asn Ser Asn Thr Ala Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser Cys Lys 20 <210> 28 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C20, A6 and A12 are D-amino acid <400> 28 Gly Asp Thr Val Tyr Ala Cys Asn Ser Asn Thr Ala Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Gly Cys 20 <210> 29 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C20, A6 and A12 are D-amino acids <400> 29 Gly Asp Thr Val Tyr Ala Cys Asn Ser Asn Thr Ala Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Gly Cys Lys 20 <210> 30 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C21, A6 and A12 are D-amino acids <400> 30 Gly Asp Thr Val Tyr Ala Cys Asn Ser Asn Thr Ala Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser Cys 20 <210> 31 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C21, A6 and A12 are D-amino acids <400> 31 Gly Asp Thr Val Tyr Ala Cys Asn Ser Asn Thr Ala Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser Cys Lys 20 <210> 32 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between K7 side chain and the N20 carboxyl terminus <400> 32 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Lys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Thr Asn 20 <210> 33 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between the K7 side chain and the S20 carboxyl terminus <400> 33 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Lys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser 20 <210> 34 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C20, the amino terminus of G1 pegylated <400> 34 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Cys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Gly Cys 20 <210> 35 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C20 <400> 35 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Cys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Gly Cys Gln 20 <210> 36 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C20 <400> 36 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Cys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Gly Cys Asn 20 <210> 37 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C20 <400> 37 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Cys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Gly Cys Arg 20 <210> 38 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C21 <400> 38 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Cys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser Cys Gln 20 <210> 39 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C21 <400> 39 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Cys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser Cys Asn 20 <210> 40 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C21 <400> 40 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Cys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser Cys Arg 20 <210> 41 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between K7 and E21 side chains <400> 41 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Lys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser Glu Lys 20 <210> 42 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between K7 and E21 side chains <400> 42 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Lys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser Glu Gln 20 <210> 43 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between K7 and E21 side chains <400> 43 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Lys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser Glu Asn 20 <210> 44 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between K7 and E21 side chains <400> 44 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Lys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser Glu Arg 20 <210> 45 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C1 and C9, A4 is a D-amino acid <400> 45 Cys Asn Thr Ala Arg Asp Phe Leu Cys 1 5 <210> 46 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C20; A6, Q8 and A12 are D-amino acids <400> 46 Gly Asp Thr Val Tyr Ala Cys Gln Ser Asn Thr Ala Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Gly Cys 20 <210> 47 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C20; A6, Q8 and A12 are D-amino acids <400> 47 Gly Asp Thr Val Tyr Ala Cys Gln Ser Asn Thr Ala Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Gly Cys Lys 20 <210> 48 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C21; A6, Q8 and A12 are D-amino acids <400> 48 Gly Asp Thr Val Tyr Ala Cys Gln Ser Asn Thr Ala Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser Cys 20 <210> 49 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C21; A6, Q8 and A12 are D-amino acids <400> 49 Gly Asp Thr Val Tyr Ala Cys Gln Ser Asn Thr Ala Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser Cys Lys 20 <210> 50 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C9 and C17; A6, Q8 and A12 are D-amino acids <400> 50 Gly Asp Thr Val Tyr Ala Phe Gln Cys Asn Thr Ala Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Cys Thr Thr Ser Lys 20 <210> 51 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C5 and C16; A6, Q8 and A12 are D-amino acids <400> 51 Gly Asp Thr Val Cys Ala Phe Gln Ser Asn Thr Ala Arg Asp Phe Cys 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser 20 <210> 52 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C2 and C10, G1 is lipidated <400> 52 Gly Cys Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu Cys 1 5 10 <210> 53 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C1 and C9, G10 is lipidated <400> 53 Cys Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu Cys Gly 1 5 10 <210> 54 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C20 <400> 54 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Cys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Ala Cys 20 <210> 55 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C20 <400> 55 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Cys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Ala Cys Gln 20 <210> 56 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C20 <400> 56 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Cys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Ala Cys Asn 20 <210> 57 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C20 <400> 57 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Cys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Ala Cys Arg 20 <210> 58 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C20 <400> 58 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Cys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Ala Cys Lys 20 <210> 59 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C20 <400> 59 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Cys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Thr Cys 20 <210> 60 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C8 and C21, E1 is a pyroglutamic acid <400> 60 Glu Gly Asp Thr Val Tyr Gly Cys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe 1 5 10 15 Leu Ser Thr Gly Cys 20 <210> 61 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C20, G1 is acetylated <400> 61 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Cys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Gly Cys 20 <210> 62 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C20, pegyation on the amino and carboxyl termini <400> 62 Gly Asp Thr Val Tyr Gly Cys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Gly Cys 20 <210> 63 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C8 and C21, pegylation on the carboxyl terminus <400> 63 Asn Gly Asp Thr Val Tyr Gly Cys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe 1 5 10 15 Leu Ser Thr Gly Cys 20 <210> 64 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between the amino and carboxyl groups of the main chain of amino and carboxyl termini residues; S2 is a D-amino acid <400> 64 Leu Ser Pro Thr Pro Asn Thr Gly Arg Asp Phe 1 5 10 <210> 65 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between the amino and carboxyl groups of the main chain of amino and carboxyl termini residues; S2 and A8 are D-amino acids <400> 65 Leu Ser Pro Thr Pro Asn Thr Ala Arg Asp Phe 1 5 10 <210> 66 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Disulfide bridge between C7 and C20; A1 is a D-amino acid <400> 66 Ala Asp Thr Val Tyr Gly Cys Asn Ser Asn Thr Gly Arg Asp Phe Leu 1 5 10 15 Ser Thr Gly Cys 20 <210> 67 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between the amino and carboxyl groups of the main chain of amino and carboxyl termini residues; A7 is a D-amino acid <400> 67 Asp Phe Leu Ser Thr Pro Ala Gln Asn Ser Asn Thr Gly Arg 1 5 10 <210> 68 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between the amino and carboxyl groups of the main chain of amino and carboxyl termini residues; A7 is a D-amino acid <400> 68 Asp Phe Leu Ser Arg Pro Ala Gln Asn Ser Asn Thr Gly Arg 1 5 10 <210> 69 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between the amino and carboxyl groups of the main chain of amino and carboxyl termini residues; A2 is a D-amino acid <400> 69 Leu Ala Pro Thr Pro Asn Thr Gly Arg Asp Phe 1 5 10 <210> 70 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between the amino and carboxyl groups of the main chain of amino and carboxyl termini residues <400> 70 Leu Gly Pro Thr Pro Asn Thr Gly Arg Asp Phe 1 5 10 <210> 71 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between the amino and carboxyl groups of the main chain of amino and carboxyl termini residues <400> 71 Asp Phe Leu Ser Thr Pro Gly Gln Asn Ser Asn Thr Gly Arg 1 5 10 <210> 72 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between the amino and carboxyl groups of the main chain of amino and carboxyl termini residues <400> 72 Asp Phe Leu Ser Arg Pro Gly Gln Asn Ser Asn Thr Gly Arg 1 5 10 <210> 73 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between the amino and carboxyl groups of the main chain of amino and carboxyl termini residues; A7 is D-Ala; Q8 is L-b-methylglutamine and N9 is N-methyl asparagine <400> 73 Asp Phe Leu Ser Arg Pro Ala Gln Asn Ser Asn Thr Gly Arg 1 5 10 <210> 74 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between the amino and carboxyl groups of the main chain of amino and carboxyl termini residues; A7 is D-Ala; Q8 is L-b-methylglutamine and N9 is N-methyl asparagine <400> 74 Asp Phe Leu Ser Thr Pro Ala Gln Asn Ser Asn Thr Gly Arg 1 5 10 <210> 75 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between the amino and carboxyl groups of the main chain of amino and carboxyl termini residues <400> 75 Asp Phe Leu Ser Arg Arg Pro Asn Ser Asn Thr Gly Arg 1 5 10 <210> 76 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amide bond between the amino and carboxyl groups of the main chain of amino and carboxyl termini residues <400> 76 Asp Phe Leu Ser Lys Lys Pro Asn Ser Asn Thr Gly Arg 1 5 10

Claims (26)

  1. 항종양 및 항혈관생성 활성들을 갖는 사이클릭 펩타이드로서, 상기 사이클릭 펩타이드는:
    a) 하기 아미노산 서열을 갖는 세그먼트:
    X1-Asn-Thr-X2-Arg-Asp-Phe-X3-X4
    상기 서열 중,
    X1 은 Ser, Cys, Lys, Asp, Glu 및 그 곁사슬이 설프히드릴 관능기, 아미노기 또는 카르복실기를 포함하는 비천연 아미노산을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산; 또는 테트라펩타이드, 펜타펩타이드 및 헥사펩타이드를 포함하는 군으로부터 선택된 서열이고,
    X2는 Gly 또는 D-Ala 아미노산이고,
    X3는 Leu, Cys, Lys, Asp, Glu 및 그 곁사슬이 설프히드릴 관능기, 아미노기 또는 카르복실기를 포함하는 비천연 아미노산을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산이고,
    X4는 Ser, Cys, Lys, Asp, Glu 및 그 곁사슬이 설프히드릴 관능기, 아미노기 또는 카르복실기를 포함하는 비천연 아미노산을 포함하는 군으로부터 선택된 선택적 아미노산이다;
    b) N-말단 세그먼트로서, 상기 a)에 서술된 세그먼트에 선택적으로 선행하는 하기 아미노산 서열을 갖는 세그먼트:
    X-5-Asp-Thr-Val-X-4-X-3-X-2-X-1
    상기 서열 중,
    X-1은 Asn, D-Asp, D-Glu, D-Gln and D-Ala을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산으로서, 펩타이드 결합에 의해서 상기 a)에 서술된 X1 잔기에 결합되고, 상기 펩타이드 결합은 상기 X1 잔기 주사슬 상의 카르보닐기 및 상기 a)에 서술된 세그먼트의 X1 잔기 주사슬 상의 아미노기를 포함하고,
    X-2는 Phe, Cys, Lys, Asp, Glu 및 그 곁사슬이 설프히드릴 관능기, 아미노기 또는 카르복실기를 포함하는 비천연 아미노산을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산이고,
    X-3는 Gly 및 D-Ala를 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산이고,
    X-4는 Tyr, Cys, Lys, Asp, Glu 및 그 곁사슬이 설프히드릴 관능기, 아미노기 또는 카르복실기를 포함하는 비천연 아미노산을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산이고,
    X-5는 Gly 및 D-Ala를 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산이다;
    c) 상기 a)에 서술된 세그먼트에 선택적으로 후행하는 C-말단 세그먼트로서, Thr-X+1X+2, Thr-X+1-X+2-X+3 및 Thr-X+1-X+2-X+3-X+4 를 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산이며,
    상기 C-말단 세그먼트 중의 상기 N-말단 Thr 잔기는 펩타이드 결합에 의해서 상기 a)에 서술된 세그먼트에 결합되고, 상기 펩타이드 결합은 상기 N-말단 Thr 잔기 주사슬 상의 아미노기 및 상기 a)에 서술된 세그먼트의 X4 잔기 주사슬 상의 카르보닐기를 포함하고,
    X+1은 Thr, Gly 및 Ala을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산이고,
    X+2는 Ser, Asn, Cys, Lys, Asp, Glu 및 그 곁사슬이 설프히드릴 관능기, 아미노기 또는 카르복실기를 포함하는 비천연 아미노산을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산이고,
    X+3은 Cys, Gln, Arg, Asn, Lys, Asp, Glu 및 그 곁사슬이 설프히드릴 관능기, 아미노기 또는 카르복실기를 포함하는 비천연 아미노산을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산이고,
    X+4는 Gln, Arg, Asn 및 Lys을 포함하는 군으로부터 선택된 아미노산이다; 및
    d) 상기 a)에 서술된 세그먼트의 X1 서열이 테트라펩타이드, 펜타펩타이드 또는 헥사펩타이드인 경우, 상기 펩타이드의 N- 및 C-말단의 아미노기 및 카르보닐기에 의해서 형성된 펩타이드 결합; X1 및 X4, 또는 X-4 및 X3, 또는 X-2 및 X+2, 또는 X-2 및 X+3가 시스테인 또는 그 곁사슬이 설프히드릴기를 포함하는 비천연 아미노산인 경우, X1 및 X4, 또는 X-4 및 X3, 또는 X-2 및 X+2, 또는 X-2 및 X+3 잔기들의 곁사슬 중의 설프히드릴기들을 포함하는 공유 이황화 다리결합; X1 및 X4, 또는 X-4 및 X3, 또는 X-2 및 X+2, 또는 X-2 및 X+3가 Lys (또는 곁사슬이 아미노기를 포함하는 비천연 아미노산) 및 Glu (또는 Asp 또는 곁사슬이 카르보닐기를 포함하는 비천연 아미노산)이거나, 또는 상기 잔기들이 각각 Glu (또는 Asp 또는 곁사슬이 카르보닐기를 포함하는 비천연 아미노산) 및 Lys (또는 곁사슬이 아미노기를 포함하는 비천연 아미노산)인 경우, 잔기 X1 및 X4, 또는 X-4 및 X3, 또는 X-2 및 X+2, 또는 X-2 및 X+3의 곁사슬들 중의 카르보닐기 및 아미노기를 포함하는 아미드 결합; 및 상기 펩타이드의 카르보닐 말단기 및 상기 잔기 X-2의 곁사슬 중의 아미노기를 포함하는 아미드 결합으로서, 상기 아미드 결합은 상기 X+2가 상기 펩타이드의 카르복실 말단 잔기, Asn 아미노산이고, X-2가 아미노산 Lys 또는 곁사슬이 아미노기를 포함하는 비천연 아미노산인 경우에 존재하는 아미드 결합을 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 공유 결합
    을 포함하는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 사이클릭 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 사이클릭 펩타이드는 상기 펩타이드의 N- 및 C-말단들의 아미노기 및 카르보닐기 사이에서 형성된 펩타이드 결합을 포함하고, 상기 펩타이드의 X1 서열은 테트라펩타이드 아미노산 서열, 바람직하게는 (D-Ser)-Pro-Thr-Pro, (D-Ala)-Pro-Thr-Pro 및 Gly-Pro-Thr-Pro을 포함하는 군으로부터 선택된 서열인 것을 특징으로 하는 사이클릭 펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 사이클릭 펩타이드는 상기 펩타이드의 N- 및 C-말단들의 아미노기 및 카르보닐기 사이에서 형성된 펩타이드 결합을 포함하고, 상기 펩타이드의 X1 서열은 펜타펩타이드 아미노산 서열, 바람직하게는 Arg-Arg-Pro-Asn-Ser, Arg-Arg-Pro-(D-Ala)-Ser, Lys-Lys-Pro-Asn-Ser 및 Lys-Lys-Pro-(D-Ala)-Ser을 포함하는 군으로부터 선택된 서열인 것을 특징으로 하는 사이클릭 펩타이드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 사이클릭 펩타이드는 상기 펩타이드의 N- 및 C-말단들의 아미노기 및 카르보닐기 사이에서 형성된 펩타이드 결합을 포함하고, 상기 펩타이드의 X1 서열은 헥사펩타이드 아미노산 서열, 바람직하게는 Thr-Pro-(D-Ala)-Gln-Asn-Ser, Arg-Pro-(D-Ala)-Gln-Asn-Ser, Thr-Pro-(D-Ala)-(BmGln)-(NmAsn)-Ser 및 Arg-Pro-(D-Ala)-(BmGln)-(NmAsn)-Ser을 포함하는 군으로부터 선택된 서열이고, 상기 BmGln은 아미노산 L-b-메틸글루타민이고, 상기 NmAsn은 아미노산 L-메틸 아스파라긴인 것을 특징으로 하는 사이클릭 펩타이드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 사이클릭 펩타이드는 그 N-말단이, 아세틸기, 파이로글루타믹 아미노산, 지방 또는 폴리머, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된 것일 수 있고, 상기 결합은 직접적으로 또는 스페이서기, 바람직하게는 아미노산 Gly를 통해서 이루어진 것을 특징으로 하는 사이클릭 펩타이드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 사이클릭 펩타이드는 그 C-말단이, 아미드 형태로 되거나, 또는 지방 또는 폴리머, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜에 공유 결합된 것일 수 있고, 상기 결합은 직접적으로 또는 스페이서기, 바람직하게는 아미노산 Gly를 통해서 이루어진 것을 특징으로 하는 사이클릭 펩타이드.
  7. 제1항에 있어서, 상기 사이클릭 펩타이드는 상기 펩타이드와 지방 또는 임의의 폴리머, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜과의 공유 결합을 포함할 수 있고, 상기 결합은 잔기 X1, X3, X4, X-2, X-4, X+2 or X+3의 곁사슬 중의 설프히드릴기, 아미노기 또는 카르복실기를 포함할 수 있으며, 상기 X1, X3, X4, X-2, X-4, X+2 or X+3 잔기는 Cys, Lys, Asp, Glu 또는 곁사슬이 설프히드릴기, 아미노기 또는 카르복실기를 포함하는 비천연 아미노산인 것을 특징으로 하는 사이클릭 펩타이드.
  8. 제1항에 있어서, 상기 사이클릭 펩타이드는 상기 X1, X3, X4, X-2, X-4, X+2 또는 X+3 잔기들이 아미노산 시스테인, (2R)-2-아미노-3-설파닐부탄산, (2R)-2-아미노-3-메틸-3-설파닐부탄산, (2S)-2-아미노-4-설파닐부탄산, 2-아미노-5-설파닐펜탄산, 2-아미노-3-설파닐펜탄산, 2-아미노-4-메틸-3-설파닐펜탄산, 2-아미노-3-메틸-4-설파닐펜탄산, 2-아미노-3,4-디메틸-3-설파닐펜탄산, 2-아미노-3-에틸-3-설파닐펜탄산, (2R)-2-아미노-3-메틸-3-설파닐펜탄산, (4S)-4-아미노-2-메틸-5-설파닐펜탄산, (4R)-4-아미노-2-메틸-5-설파닐펜탄산, (4R)-4-아미노-5-설파닐펜탄산, 및 (4S)-4-아미노-5-설파닐펜탄산을 포함하는 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 사이클릭 펩타이드.
  9. 제1항에 있어서, 상기 사이클릭 펩타이드는 상기 X1, X3, X4, X-2, X-4, X+2 또는 X+3 잔기들이 아미노산 Lys, 2-[비스(3-아미노프로필)아미노]아세트산, (2S)-2,5-디아미노펜탄산, 2,2-디아미노아세트산, (3S)-3,4-디아미노부탄산, (2R)-2,4-디아미노부탄산, (2S)-2,4-디아미노부탄산, (2S)-2,3-디아미노프로판산, (2R)-2,3-디아미노프로판산, 2-[(2-아미노에틸)아미노]아세트산, 2-[(3-아미노프로필)아미노]아세트산, 2-[(4-아미노부틸)아미노]아세트산, (4S)-4,8-디아미노옥탄산, (2S)-2-아미노-3-(4-아미노페닐)프로판산, (2S)-2-아미노-3-[4-(2-아미노에톡시)페닐]프로판산, 2-(피페리딘-4-일아미노)아세트산, (2S)-2-아미노-4-[(5R)-2,2-디메틸-1,3-옥사졸리딘-5-일]부탄산, (2S)-2-아미노-6-(메틸아미노)헥산산, (2R,4R)-4-아미노피롤리딘-2-카르복실산 또는 (2R,4S)-4-아미노피롤리딘-2-카르복실산, 2-(4-아미노피페리딘-4-일)아세트산, 4-아미노피페리딘-4-카르복실산, (2S,4R)-4-아미노피롤리딘-2-카르복실산 및 이미다졸린-2-카르복실산을 포함하는 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 사이클릭 펩타이드.
  10. 제1항에 있어서, 상기 사이클릭 펩타이드는 상기 X1, X3, X4, X-2, X-4, X+2 또는 X+3 잔기들이 아미노산 Glu, Asp, 3-[(카르복시메틸)아미노]프로판산, 2-[(카르복시메틸)아미노]아세트산, 3-[(2-카르복시에틸)아미노]프로판산, (3R)-3-아미노헥산디온산, 4-아미노헵탄디온산, 4-아미노피페리딘-1,4-디카르복실산, (2S,4S)-4-아미노피롤리딘-2-카르복실산, 2-[(카르복시메틸)아미노]아세트산, (2S)-2-아미노-6-[(카르복시메틸)아미노]헥산산, 3-[(2-카르복시에틸)아미노]프로판산, (2S)-2-아미노헵탄디온산, (2S)-2-아미노옥탄디온산, (2R)-2-아미노-3-[(2-카르복시에틸)설파닐]프로판산, (2R)-2-아미노-3-[(카르복시메틸)설파닐]프로판산, 4-{[(2R)-2-아미노-2-카르복시에틸]설파닐}부탄산 및 (2S)-2-아미노-3-[4-(카르복시메톡시)페닐]프로판산을 포함하는 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 사이클릭 펩타이드.
  11. 제1항에 있어서, 서열번호 1 내지 76으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 사이클릭 펩타이드.
  12. 암 치료법 또는 원치 않는 세포 번식-관련 질환들을 치료하기 위한 약물, 또는 항혈관형성 약물을 제조하기 위한 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 사이클릭 펩타이드의 용도.
  13. 암, 원치 않는 세포 번식-관련 질환들 및 원치 않는 혈관생성을 치료하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 투여를 요하는 개체에, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 사이클릭 펩타이드들 중 적어도 하나를 유효량만큼 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 비형광체기, 형광 반도체 입자, 상자성 또는 초상자성제, 및 방사성 동위 원소를 포함하는 군으로부터 선택된 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 사이클릭 펩타이드들 중 적어도 하나 및 부형제 또는 약제학적으로 적당한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 사이클릭 펩타이드가 조절 방출 시스템 및 나노바이오생명공학 분야에 속하는 시스템의 일부를 구성하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 조절 방출 시스템이 리포좀을 형성하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 상기 조절 방출 시스템이 미세구체를 형성하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  19. 제16항에 있어서, 상기 조절 방출 시스템이 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 사이클릭 펩타이드와 함께 자가-조립 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  20. 제15항에 있어서, 반도체 입자, 상자성 또는 초상자성제, 및 방사성 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택된 물질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  21. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 사이클릭 펩타이드 중 적어도 하나 및 영상화제를 포함하는 암 진단용 복합체로서, 상기 영상화제는 형광체기, 비형광체기, 반도체 형광 입자, 상자성 또는 초상자성제, 및 방사성 동위 원소를 포함하는 군으로부터 선택된 복합체.
  22. 제1항 내지 제11 항 중 어느 한 항에 따른 사이클릭 펩타이드 중 적어도 하나와 함께 항암제 및 호르몬을 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치료제를 포함하는 약제학적 조합 (combination).
  23. 제22항에 있어서, 상기 사이클릭 펩타이드는 공유 결합에 의해서 상기 치료제에 직접적으로 컨쥬게이션되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조합.
  24. 제22항에 있어서, 상기 펩타이드는 커플링제에 의해서 상기 치료제에 컨쥬게이션되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조합.
  25. 제24항에 있어서, 상기 커플링제는 아미노산 잔기, 및 하이드로카르빌 및 치환된 하이드로카르빌을 포함하는 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 약제학적 조합.
  26. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드 중 적어도 하나 및 프프로디기오신 또는 그 유도체를 포함하는 약제학적 조합.
KR1020137027692A 2011-03-21 2012-03-21 항종양 및 항혈관생성 활성을 갖는 사이클릭 펩타이드 KR101958964B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CU2011000067A CU23950B1 (es) 2011-03-21 2011-03-21 Péptidos cíclicos con actividad antineoplásica y antiangiogénica
CU2011/0067 2011-03-21
PCT/CU2012/000002 WO2012126441A2 (es) 2011-03-21 2012-03-21 Péptidos cíclicos con actividad antineoplásica y antiangiogénica.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140042796A true KR20140042796A (ko) 2014-04-07
KR101958964B1 KR101958964B1 (ko) 2019-07-02

Family

ID=46000593

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137027692A KR101958964B1 (ko) 2011-03-21 2012-03-21 항종양 및 항혈관생성 활성을 갖는 사이클릭 펩타이드

Country Status (16)

Country Link
US (1) US9375459B2 (ko)
EP (1) EP2690107B1 (ko)
JP (1) JP6032854B2 (ko)
KR (1) KR101958964B1 (ko)
CN (1) CN103534265B (ko)
AR (1) AR088727A1 (ko)
AU (1) AU2012231427B2 (ko)
BR (1) BR112013024265B1 (ko)
CA (1) CA2830325C (ko)
CO (1) CO6801641A2 (ko)
CU (1) CU23950B1 (ko)
ES (1) ES2644554T3 (ko)
MX (1) MX348677B (ko)
RU (1) RU2603286C2 (ko)
WO (1) WO2012126441A2 (ko)
ZA (1) ZA201307037B (ko)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9908919B2 (en) * 2013-07-25 2018-03-06 Novartis Ag Cyclic apelin derivatives for the treatment of heart failure
AU2014293386B2 (en) * 2013-07-25 2016-11-17 Novartis Ag Cyclic polypeptides for the treatment of heart failure
EP3024492A2 (en) * 2013-07-25 2016-06-01 Novartis AG Bioconjugates of synthetic apelin polypeptides
EP3024847A1 (en) * 2013-07-25 2016-06-01 Novartis AG Disulfide cyclic polypeptides for the treatment of heart failure
CN106573031B (zh) * 2014-04-15 2021-05-28 加利福尼亚大学董事会 双末端聚乙二醇化整合素-结合肽及其使用方法
CN109503701B (zh) * 2018-07-20 2022-03-15 北京工业大学 一种环肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用
CN111662363A (zh) * 2020-06-22 2020-09-15 上海大学 环肽类抗肿瘤活性化合物及其制备方法与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004019961A1 (en) * 2002-08-30 2004-03-11 Biopharmacopae Design International Inc. Plant extracts for treatment of angiogenesis and metastasis
WO2006005268A2 (es) * 2004-07-08 2006-01-19 Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia Composición farmacéutica conteniendo fragmentos polipéptidicos de serralisinas
WO2007022557A1 (en) * 2005-08-23 2007-03-01 Diatech Pty Ltd Mimotopes of epstein-barr virus (ebv) epitopes

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2625206C (en) * 2005-10-08 2021-12-07 Potentia Pharmaceuticals, Inc. Compstatin and analogs thereof for eye disorders
ITTO20060852A1 (it) * 2006-11-30 2008-06-01 Univ Degli Studi Torino Peptidi metastasi-specifici e loro applicazioni diagnostiche e terapeutiche
EP2283028A2 (en) * 2007-08-08 2011-02-16 The Board of Regents of The University of Texas System Vegfr-1/nrp-1 targeting peptides
WO2009155556A2 (en) * 2008-06-20 2009-12-23 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Crkl targeting peptides
US20100015058A1 (en) * 2008-06-25 2010-01-21 Stanford University Radiolabeled bbn-rgd heterodimers for cancer targeting

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004019961A1 (en) * 2002-08-30 2004-03-11 Biopharmacopae Design International Inc. Plant extracts for treatment of angiogenesis and metastasis
WO2006005268A2 (es) * 2004-07-08 2006-01-19 Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia Composición farmacéutica conteniendo fragmentos polipéptidicos de serralisinas
JP2008505129A (ja) * 2004-07-08 2008-02-21 セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア セラリシン（Ｓｅｒｒａｌｉｓｉｎｓ）のポリペプチド断片を含む医薬組成物
WO2007022557A1 (en) * 2005-08-23 2007-03-01 Diatech Pty Ltd Mimotopes of epstein-barr virus (ebv) epitopes

Also Published As

Publication number Publication date
MX348677B (es) 2017-06-23
CU23950B1 (es) 2013-10-29
JP2014513066A (ja) 2014-05-29
AU2012231427B2 (en) 2016-08-04
CA2830325C (en) 2019-09-10
ZA201307037B (en) 2014-06-25
MX2013010813A (es) 2013-10-07
US9375459B2 (en) 2016-06-28
RU2013146690A (ru) 2015-04-27
EP2690107B1 (en) 2017-08-02
CO6801641A2 (es) 2013-11-29
AU2012231427A1 (en) 2013-10-03
EP2690107A2 (en) 2014-01-29
BR112013024265B1 (pt) 2020-12-08
WO2012126441A3 (es) 2012-11-22
CN103534265B (zh) 2016-06-08
JP6032854B2 (ja) 2016-11-30
RU2603286C2 (ru) 2016-11-27
CU20110067A7 (es) 2012-10-15
AR088727A1 (es) 2014-07-02
CA2830325A1 (en) 2012-09-27
CN103534265A (zh) 2014-01-22
US20140112976A1 (en) 2014-04-24
ES2644554T3 (es) 2017-11-29
WO2012126441A2 (es) 2012-09-27
BR112013024265A2 (pt) 2016-12-27
KR101958964B1 (ko) 2019-07-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101958964B1 (ko) 항종양 및 항혈관생성 활성을 갖는 사이클릭 펩타이드
AU2008296733B2 (en) VEGFR-1/NRP-1 targeting peptides
JP6249949B2 (ja) 薬物動態特性の改善されたコンプスタチンアナログ
AU764277B2 (en) Peptide antiangiogenic drugs
JP6084207B2 (ja) 虚血性脳損傷及び疼痛治療用の効率的な神経保護剤としてのｐｓｄ−９５の高親和性二量体阻害剤
CN107206254A (zh) 白细胞介素‑23受体的口服肽抑制剂以及其治疗炎症性肠病的用途
MX2011004019A (es) Conjugados de etoposido y doxorubicina para entrega de farmacos.
IL223678A (en) Immunosuppressive Modulation Compounds
JP7100639B2 (ja) Ｃｘｃｒ４アンタゴニストおよび使用方法
CN110248953A (zh) 新型订书肽及其用途
US10441628B2 (en) High activity tumour inhibitor and preparation method and use thereof
JP2001514659A (ja) ドラスタチン−１５誘導体とタキサンとの併用
JP2003514920A (ja) 抗血管新生活性を有するｎ−アルキル化ペプチド
KR102017973B1 (ko) 항-b형 간염 바이러스 x 단백질 폴리펩티드 약제
EP0670728A1 (en) Lipophilic peptide-based carriers for targeted drug delivery using rational drug-binding design
CN106589064A (zh) 高活性的肿瘤抑制剂及其制法和应用
Cupka Development of an αᵥβ₆-Binding Peptide for In Vivo Applications: Modulation of Serum Stability and Biodistribution

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant