CN109503701B - 一种环肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

一种环肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用，属于生物制药领域。所述环肽得氨基酸序列为

Description

一种环肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种环肽及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

多肽药物因其适应证广、安全性高且疗效显著，已成为21世纪最有发展前途的药物之一。目前已有超过60种多肽药物上市，并有超过600种多肽药物处于临床前试验阶段，未来将有更多的多肽药物上市，应用于各种疾病的治疗。

环肽药物作为多肽药物的一种，在药物研发领域也取得了令人欣喜的成果。目前已有超过40种环肽药物进入临床，并且平均每年有一种新的环肽药物上市。经FDA和EMA批准的环肽药物中，抗肿瘤环肽药物有：用于治疗肢端肥大症和内分泌肿瘤的Lanreotide和Pasireotide，以及用于治疗T细胞淋巴瘤的Romidepsin。环肽药物具有的高亲和力和低毒性以及靶点选择性等特点，在其作为治疗肿瘤等重大疾病的药物中发挥了非常有利的作用，在未来的药物研发中将会得到更广泛的应用。

发明内容

本发明提供了一种环肽以及在制备抗肿瘤药物中的应用，所述环肽的氨基酸序列为

其中两个Cys形成二硫键，从而形成环肽。

该抗肿瘤环肽的分子量为1457.77，可以通过反相高效液相色谱法进行纯化，并且通过该方式纯化可以使其纯度达到95.9％。

本发明提供了所述环肽在制备用于抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。所述肿瘤包括肝癌和肺癌。所述环肽在10-640μM浓度范围内对肝癌细胞HepG-2的增殖抑制率为30.91％-100％，其IC₅₀值为19.4μM，所述环肽在同样的浓度范围内对肺癌细胞A549的增殖抑制率为23.11％-100％，其IC₅₀值为29.1μM。

本发明提供了所述环肽在制备用于促进肿瘤细胞凋亡的药物中的应用。

在一个实施方案中，所述肿瘤细胞包括肝癌细胞和肺癌细胞。

在一个优选的实施方案中，所述肿瘤细胞为肝癌细胞。所述环肽浓度为40μM时，对肝癌细胞HepG-2的促凋亡率为54.57％。

本发明提供了一种抗肿瘤组合物，所述抗肿瘤组合物包含本发明所述的环肽。

本发明进一步公开了所述环肽的制备方法，所述方法采用固相合成法来制备所述抗肿瘤环肽，所述固相合成法可通过以下措施达到：

以CTC高分子树脂为载体，所述环肽C端的Fmoc-Gly-OH以共价键形式连接到CTC树脂上，从C端到N端依次与所对应的氨基酸反应，相邻氨基酸之间通过脱水缩合反应形成的肽键相连，形成GCRLYGFKIWGCG多肽；利用HPLC纯化多肽粗品，然后缓慢滴加I₂/MeOH溶液使其中的两个Cys形成二硫键从而使多肽成环；

本发明使用MS确定所述环肽的分子量，使用HPLC进一步纯化得到纯度高达95.9％的目标环肽。

与现有技术相比，本发明具有以下的优点和技术效果：本发明首次合成了该抗肿瘤环肽，并且采用CCK-8方法测定了该环肽的抗肿瘤活性，所述抗肿瘤环肽具有显著的抑制肿瘤细胞增殖的能力。此外，本发明人还采用流式细胞技术检测了该环肽对肿瘤细胞的促凋亡作用，结果发现，所述抗肿瘤环肽对肿瘤细胞具有显著的促凋亡作用。

附图说明

图1抗肿瘤环肽

的HPLC图。

图2抗肿瘤环肽

的MS图。

图3浓度为40μM的本发明抗肿瘤环肽对肝癌细胞HepG-2的促细胞凋亡检测图。

具体实施方式

本发明的具体实施方式结合以下实施例来说明，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1环肽的固相合成

本发明所述的抗肿瘤环肽使用Fmoc方案的固相合成方法，选取CTC高分子树脂作为载体，首先将保护氨基酸Fmoc-Gly-OH以共价键形式连接到CTC树脂上，再加入脱保护试剂25％哌啶/DMF溶液脱掉Fmoc保护基团，此时Gly与CTC树脂连接在一起；然后加入HBTU、N-甲基吗啉，将下一个保护氨基酸Fmoc-Cys(Trt)-OH连接在Gly上，Fmoc-Cys(Trt)-OH与Gly发生脱水缩合反应形成肽键，选用茚三酮作为检测反应程度的试剂来检验反应是否完全；重复上述步骤，即加入脱保护试剂25％哌啶/DMF溶液，再加入HBTU、N-甲基吗啉，在加入下一个保护氨基酸，依次类推将后续的氨基酸依次连接上去，直至目标环肽序列的所有氨基酸全部偶联完毕。

本发明然后使用切割试剂选自TFA、苯酚、H₂O、EDT、苯甲硫醚等溶液的混合溶液，将切割试剂加入上述反应得到的产物中，并使用乙醚沉淀，从而得到多肽粗品。使用HPLC纯化多肽粗品，纯化之后将其溶于纯水中，缓慢滴加I₂/MeOH溶液使多肽的两个Cys发生脱氢氧化形成二硫键，多肽从而成为环肽。用二氯甲烷萃取水溶液得到环肽。使用MS确定目标环肽的分子量为1457.77，进一步使用HPLC确定环肽纯度达到95.9％。最后经过脱盐、冷冻和干燥等步骤得到目标环肽的冻干粉。

实施例2使用CCK-8法检测环肽对肿瘤细胞的增殖抑制作用

本发明使用CCK-8法检测抗肿瘤环肽对肿瘤细胞的增殖抑制效果，本实施例选用的肿瘤细胞为肝癌细胞HepG-2和肺癌细胞A549。将肝癌细胞HepG-2和肺癌细胞A549分别按照1.5×10⁴个/mL、2×10⁴个/mL的浓度制成细胞悬液，并且按照每孔200μL的体积分别均匀地加入96孔板内，使每个孔内的细胞均匀分布，然后于37℃恒温、5％CO₂的培养箱中孵育。24h之后细胞均贴壁生长，单层铺满96孔板的底部，将抗肿瘤环肽分别配制成浓度为10、20、40、80、160、320、640μM的药液，吸出旧的培养液，将药液加入96孔板内，并设置阴性对照和空白对照，于37℃恒温、5％CO₂的培养箱继续孵育。48h后吸出药液，加入配制好浓度的CCK-8溶液，于培养箱中再次孵育2h，将酶标仪的波长设置为450nm检测OD值。结果如表1所示，抗肿瘤环肽能显著抑制肿瘤细胞的增殖，且其生物活性显示出一定的浓度依赖性，它在10-640μM浓度作用下对肝癌细胞HepG-2和肺癌细胞A549的体外增殖抑制率分别为30.91％-100％和23.11％-100％，IC₅₀值分别为19.4μM和29.1μM。

表1抗肿瘤环肽对肿瘤细胞HepG-2和A549细胞增殖的抑制作用

实施例3使用流式细胞法检测环肽对肿瘤细胞的促凋亡作用

本实施例使用流式细胞法检测环肽对肿瘤细胞的促凋亡作用，选取的研究对象为肝癌细胞HepG-2。取对数生长期的肝癌细胞HepG-2，将其按照1.75×10⁵个/mL的浓度制成细胞悬液，按照每孔2mL的体积加入6孔板内，使细胞均匀分布于孔内，于37℃恒温CO₂培养箱培养。24h后细胞贴壁生长，均单层铺满6孔板的底部，此时将环肽配制成浓度为40μM的药液，吸出旧的培养液，将药液加入6孔板内，设置阴性对照和FITC/PI单染的阳性对照，于37℃恒温CO₂培养箱培养。48h后将细胞培养液收集到离心管内备用，用不含EDTA的胰酶消化细胞，再加入前面收集的培养液对细胞终止消化，小心吹打细胞并离心，弃上清后用4℃预冷的PBS洗涤细胞，再次离心沉淀细胞。

将结合缓冲液配制成使用浓度，用结合缓冲液重悬细胞，调整细胞悬液的浓度为1-5×10⁶/mL。取100μL的细胞悬液转移到5mL流式管中，加入Annexin V/FITC混匀后于室温避光孵育5min，然后加入PI和PBS于流式细胞仪上进行流式检测。

流式检测结果如图3所示，由图可知，本发明所述的抗肿瘤环肽对肝癌细胞HepG-2有显著的促凋亡作用，在40μM浓度下对肝癌细胞HepG-2具有54.57％的促凋亡率。

Claims (6)

1.一种环肽，其特征在于，所述环肽的氨基酸序列为

其中两个Cys形成二硫键，从而形成环肽。

2.权利要求1所述的环肽在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤为肝癌和肺癌。

3.权利要求1所述的环肽在制备抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用，所述肿瘤细胞为肝癌细胞和肺癌细胞。

4.权利要求1所述的环肽在制备促进肿瘤细胞凋亡的药物中的应用，所述肿瘤细胞为肝癌细胞。

5.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的环肽。

6.制备权利要求1所述的环肽的方法，其特征在于，采用固相合成法来制备所述环肽，所述固相合成法通过以下方法达到：

以CTC高分子树脂为载体，所述环肽C端的Fmoc-Gly-OH以共价键形式连接到CTC树脂上，从C端到N端依次与所对应的氨基酸反应，相邻氨基酸之间通过脱水缩合反应形成的肽键相连，形成GCRLYGFKIWGCG多肽；利用HPLC纯化多肽粗品，然后缓慢滴加I₂/MeOH溶液使其中的两个Cys形成二硫键从而使多肽成环。

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