CN113069555B - 一种双特异性糖肽纳米分子及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种双特异性糖肽纳米分子及其制备方法和应用。所述纳米分子包括靶向识别单元、酶水解底物单元、自组装单元和免疫识别调节单元，所述靶向识别单元和酶水解底物单元分别与自组装单元连接，所述免疫识别调节单元连接于所述酶水解底物单元。所述双特异性糖肽纳米分能够靶向识别肿瘤细胞，并在肿瘤部位自组装成纳米纤维，长效滞留，长效阻断受体的信号通路，此外，使肿瘤相关巨噬细胞M2型重极化为M1型，增强T细胞抗肿瘤免疫并改善肿瘤免疫抑制，从而抑制肿瘤细胞侵袭能力，突破了空腔器官肿瘤容易种植复发的瓶颈。

Description

一种双特异性糖肽纳米分子及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种双特异性糖肽纳米分子及其制备方法和应用。
背景技术
膀胱癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤，具有术后易复发的特点，其术后五年复发率可高达50％～70％，导致膀胱癌复发率高居不下的主要原因是术后残余肿瘤病灶的存在以及术后游离肿瘤细胞的腔内种植。当前对膀胱癌术后的治疗方法主要是系统性地进行膀胱腔内灌注卡介苗或化疗药物，从而进一步对残余病灶及游离肿瘤进行杀伤，但大量的研究结果表明，当前的治疗方法对膀胱癌细胞的杀伤效果及抑制腔内种植能力仍不理想。因此，探索一种抑制膀胱癌种植复发及进展的新方法已经成为了临床上迫切需要解决的实际问题。
趋化因子受体4(CXCR4)是趋化因子基质细胞衍生因子-1(SDF-1)的特异性受体，它是由352个氨基酸组成的GPCR(G蛋白偶联受体)，具有七次跨膜结构。同时，CXCR4在体内大部分组织和器官中都表达，其与SDF-1介导的信号通路参与体内多种生理机制，包括HIV-1病毒侵染、造血功能、胚胎发育和肿瘤增殖及迁移等。在膀胱癌细胞中，CXCR4呈现出高表达状态，而在正常的膀胱黏膜中CXCR4几乎无表达。有研究表明，CXCR4在侵袭力强的膀胱癌细胞中(pT2-pT4)的表达量明显高于侵袭力低的膀胱癌细胞(pTa-pT1)，此外，还有研究发现CXCR4在复发的膀胱癌组织中表达量明显高于原发膀胱癌，以上结果均表明CXCR4在膀胱癌的种植复发及进展过程中扮演着重要的角色。
异质性和可塑性是巨噬细胞的重要特征，在体外的理想情况下，巨噬细胞可定义为极端的两种类型：经典活化型(促炎型)M1及替代活化型(抗炎型)M2。M1可由IFNγ等激活，介导Th1反应；而M2可由IL-4等激活，介导Th2反应。在肿瘤微环境中，肿瘤相关巨噬细胞(Tumor associated macrophages,TAMs)也是异质的，但更倾向于M2的表型，TAMs的表型由肿瘤微环境(TME)和肿瘤免疫微环境(TIME)组合驱动。TAMs通常与实体瘤预后不良相关，其抑制多种常规治疗，包括化疗、放疗和血管生成抑制剂，放射、化疗和血管破坏已被证明能增加CXCL12的表达，并促进CXCR4依赖的巨噬细胞的重新生长和抵抗，CXCL12可通过优先招募M2巨噬细胞来发挥作用，M2巨噬细胞与血管形成密切相关，对肿瘤血管形成很重要，因此，重极化M2巨噬细胞为M1型，可改善血管破坏，促进T细胞浸润。
当前，超分子组装策略已被广泛用于治疗膀胱癌，这些基于超分子组装的纳米颗粒或粘膜粘附生物材料中的大多数都集中在延长药物保留时间和增强药物渗透性，以增强膀胱内化学药物递送的功效，如CN112315940A公开了一种促肿瘤凝血和酶/ATP双重响应性释药的纳米粒子及其制备方法与应用，所述纳米粒子以甲基丙烯酸酐修饰的交联透明质酸为壳层，以3-氟-4-羧基苯硼酸改性聚赖氨酸后自组装形成的载药纳米粒子为核层，并原位生成CaCO3纳米粒子，能实现肿瘤凝血、去乳酸化和ATP响应释药三者协同快速杀死癌细胞，对肿瘤治疗有重要意义，尽管与单纯药物滴注相比观察到疗效有所提高，但由于其几乎没有活性的靶向能力，严重的副作用如尿道刺激、膀胱炎和血尿限制了其应用。
综上所述，开发新的治疗药物以减少膀胱癌的术后复发，对于肿瘤治疗有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种双特异性糖肽纳米分子及其制备方法和应用，所述纳米分子具备肿瘤靶向性，在肿瘤细胞表面自组装形成纳米纤维，抑制细胞侵袭能力，并能够识别肿瘤相关巨噬细胞M2型，使其重极化为M1型，进而重塑肿瘤免疫微环境，显著抑制了食管、胃和膀胱等空腔器官肿瘤的种植复发。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案
第一方面，本发明提供一种双特异性糖肽纳米分子，所述纳米分子包括靶向识别单元、酶水解底物单元、自组装单元和免疫识别调节单元，所述靶向识别单元和酶水解底物单元分别与自组装单元连接，所述免疫识别调节单元连接于所述酶水解底物单元。
本发明的双特异性糖肽纳米分子中，靶向识别单元具备靶向识别功能，将纳米分子主动靶向到肿瘤部位，酶水解底物单元具有酶响应功能，在肿瘤部位与肿瘤微环境中高表达的酶发生特异性的高效酶切反应，酶切后，自组装单元能够与肿瘤细胞的受体结合并原位组装成纳米纤维，并在肿瘤部位长效滞留，长效阻断受体的信号通路，此外，酶切后，免疫识别调节单元与肿瘤相关巨噬细胞M2型结合，使其重极化为M1型，增强T细胞抗肿瘤免疫和改善肿瘤免疫抑制，从而抑制肿瘤细胞侵袭能力，突破了空腔器官肿瘤容易种植复发的瓶颈。
优选地，所述靶向识别单元包括SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4或SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列中的任意一种。
SEQ ID NO.1：LGASWHRPDK。
SEQ ID NO.2：RGD。
SEQ ID NO.3：CDHALWHTC。
SEQ ID NO.4：YHWYGYTPQNVI。
SEQ ID NO.5：YNTNHVPLSPKY。
优选地，所述靶向识别单元还包括环状多肽序列RGD。
优选地，所述靶向识别单元的受体包括趋化因子受体4(CXCR4)、整合素αvβ3或碳酸酐酶-9中的任意一种。
优选地，所述多肽序列RGD对应的靶向受体为整合素αvβ3，所述多肽序列LGASWHRPDK对应的靶向受体为CXCR4，所述多肽序列YNTNHVPLSPKY对应的靶向受体为碳酸酐酶-9。
优选地，所述酶水解底物单元包括SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQID NO.9或SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列中的任意一种。
SEQ ID NO.6：GLYGLP。
SEQ ID NO.7：PLGVRG。
SEQ ID NO.8：RVRRCK。
SEQ ID NO.9：DEVD。
SEQ ID NO.10：GPA。
优选地，所述酶水解底物单元的功能酶包括基质金属蛋白酶、福林蛋白酶、细胞凋亡蛋白酶3或成纤维细胞活化蛋白-α中的任意一种。
优选地，所述多肽序列GLYGLP对应的功能酶为基质金属蛋白酶。
优选地，所述自组装单元包括SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.20所示的氨基酸序列中的任意一种。
SEQ ID NO.11：KLVFFAECG。
SEQ ID NO.12：KLVFF。
SEQ ID NO.13：FF。
SEQ ID NO.14：YFFGNNQQNY。
SEQ ID NO.15：GSNKGAIIGLM。
SEQ ID NO.16：GKVQIINKKLDL。
SEQ ID NO.17：SYSSYGQS。
SEQ ID NO.18：GNQQQNY。
SEQ ID NO.19：GNQQQQY。
SEQ ID NO.20：GNNNQNY。
本发明中，双特异性糖肽纳米分子以多肽为基础，具有良好的生物相容性，在体内不产生明显副作用。
优选地，所述免疫识别调节单元包括n个甘露糖。
优选地，所述n为1到9的整数，包括但不限于2、3、4、5、6、7或8，优选为3。
优选地，所述免疫识别调节单元连接于所述酶水解底物单元的末端。
本发明中，双特异性糖肽纳米分子被肿瘤微环境中过表达的酶剪切后，甘露糖残基端能够与肿瘤相关巨噬细胞M2型结合，使其重极化为M1型，增强T细胞抗肿瘤免疫和改善肿瘤免疫抑制。
优选地，所述纳米分子具有如式I、式II或式III中任意一种所示的结构。
Figure BDA0003015790690000061
Figure BDA0003015790690000071
Figure BDA0003015790690000081
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的双特异性糖肽纳米分子的制备方法，所述方法包括：
将靶向识别单元、酶水解底物单元、自组装单元和免疫识别调节单元进行连接，得到所述双特异性糖肽纳米分子。
优选地，所述方法包括：
制备靶向识别单元、酶水解底物单元和自组装单元并进行连接，随后将免疫识别调节单元连接于酶水解底物单元，得到所述双特异性糖肽纳米分子。
优选地，采用多肽固相合成法制备制备靶向识别单元、酶水解底物单元和自组装单元并进行连接。
优选地，通过Click反应将免疫识别调节单元连接于酶水解底物单元。
优选地，所述方法包括：
采用多肽固相合成法制备制备靶向识别单元、酶水解底物单元和自组装单元并进行连接，并通过Click反应将免疫识别调节单元连接于酶水解底物单元，得到所述双特异性糖肽纳米分子。
第三方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的双特异性糖肽纳米分子。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第四方面，本发明提供如第一方面所述的双特异性糖肽纳米分子或第三方面所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选地，所述肿瘤包括膀胱癌、胃癌或食管癌中的任意一种或至少两种的组合。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的双特异性糖肽纳米分子包括靶向识别单元、酶水解底物单元、自组装单元和免疫识别调节单元，能够靶向识别肿瘤细胞，并在肿瘤部位自组装成纳米纤维，长效滞留，长效阻断受体的信号通路，此外，使肿瘤相关巨噬细胞M2型重极化为M1型，增强T细胞抗肿瘤免疫和改善肿瘤免疫抑制，从而抑制肿瘤细胞侵袭能力，突破了空腔器官肿瘤容易种植复发的瓶颈；
(2)本发明的双特异性糖肽纳米分子具备特异性，能够在肿瘤细胞表面富集并长效滞留，抑制肿瘤细胞集落形成能力和侵袭能力，使M2型肿瘤相关巨噬细胞重极化为M1样表型，并能有效抑制肿瘤细胞的种植复发。
附图说明
图1为多肽1的结构示意图；
图2为双特异性糖肽纳米分子的设计原理图；
图3A为多肽1(Cy)在EJ细胞表面的富集荧光信号图；
图3B为多肽1(Cy)在L929细胞表面的富集荧光信号图；
图4为多肽1抑制膀胱癌细胞集落形成能力的结果图；
图5为多肽1抑制膀胱癌细胞侵袭能力的结果图；
图6为多肽1靶向M2型肿瘤相关巨噬细胞，使其重极化为M1样表型的结果图；
图7为多肽1(Cy)在小鼠皮下瘤模型中不同时间段的肿瘤富集荧光信号图；
图8A为试验例4中原位膀胱癌小鼠模型图；
图8B为多肽1(Cy)在原位膀胱癌小鼠模型中的肿瘤富集荧光信号图；
图9为验证多肽1抑制肿瘤皮下种植能力的实验设计流程图；
图10为多肽1抑制肿瘤皮下种植能力的实验结果图；
图11为多肽1抑制膀胱癌细胞种植的实验结果图；
图12为多肽2(Cy)在小鼠皮下瘤模型不同时间段的肿瘤富集荧光信号图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种双特异性糖肽纳米分子，所述纳米分子的分子式为：LGASWHRPDKK(GLYGLP-(man)3)LVFFAECG(以下称“多肽1”)，其中man为甘露糖(mannose)，其它字母为氨基酸简写，所述纳米分子的结构式如式I所示。
所述纳米分子的制备方法包括以下步骤：
实验仪器与材料：
二甲基甲酰胺(DMF)，哌啶，Wang树脂，二氯甲烷(DCM)，茚三酮反应试剂(茚三酮，维生素C和苯酚)，苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，六氢吡啶，三异丙基硅烷(TIS)，乙二硫醇(EDT)，无水乙醚，三氟乙酸(TFA)，N-甲基吗啉(NMM)，N-芴甲氧羰基-6-氨基己酸(Fmoc-e-Acp-OH)，甲醇，Fmoc-丙氨酸(Fmoc-Ala-OH)，Fmoc-半胱氨酸(Fmoc-Cys(Trt)-OH)，Fmoc-天冬氨酸(Fmoc-Asp(OtBu)-OH)，Fmoc-谷氨酸(Fmoc-Glu(OtBu)-OH)，Fmoc-苯丙氨酸(Fmoc-Phe-OH)，Fmoc-甘氨酸(Fmoc-Gly-OH)，Fmoc-组氨酸(Fmoc-His(Trt)-OH)，Fmoc-赖氨酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH)，Fmoc-亮氨酸(Fmoc-Leu-OH)，Fmoc-天冬氨酸(Fmoc-Asn(Trt)-OH)，Fmoc-脯氨酸(Fmoc-Pro-OH)，Fmoc-精氨酸(Fmoc-Arg(Pbf)-OH)，Fmoc-丝氨酸(Fmoc-Ser(tBu)-OH)，Fmoc-苏氨酸(Fmoc-Thr(tBu)-OH)，Fmoc-缬氨酸(Fmoc-Val-OH)，Fmoc-色氨酸(Fmoc-Trp-OH)，Fmoc-酪氨酸(Fmoc-Tyr(Trt)-OH)，甘露糖(mannose)，菁染料(Cy)，多肽固相合成管；
实验溶液的配制：
脱保护液——将六氢吡啶与DMF按照体积比1:4进行混合；
反应液——将NMM与DMF按体积比1:24进行混合；
裂解液——将TFA、TIS和EDT混合，混合后各溶液的体积分数为：92.5％TFA、2.5％TIS和2.5％EDT；
茚三酮测试液——茚三酮、维生素C和苯酚各一滴；
具体操作方法：
(1)Fmoc(芴甲氧羰酰基)脱保护：称量0.1g Wang树脂并投入到多肽固相合成管中，加入DMF溶胀30min，抽掉DMF，用脱保护液进行Fmoc去保护反应，于摇床上放置10min，抽掉脱保护液，用DMF、DCM洗涤3次，从多肽固相合成管中取10mg Wang树脂于试管中，用乙醇洗涤2次，茚三酮法检测呈深蓝色即为阳性结果后，准备接入第一个氨基酸(R)，进入氨基酸缩合反应；
(2)氨基酸缩合：分别按照多肽1的氨基酸序列顺序取10倍当量的氨基酸和HBTU，用7mL反应液溶解，投入到多肽固相合成管中，搅拌反应，1h后，从多肽固相合成管中取10mgWang树脂于试管中，用乙醇洗涤2次，茚三酮法检测未变色即为阴性结果后证明缩合反应成功，抽掉多肽固相合成管中的液体，用DMF、DCM各洗涤2次，得到第一个氨基酸缩合后的肽树脂；
(3)对所得肽树脂重复进行以上“Fmoc脱保护-氨基酸缩合”反应步骤，至最后一个氨基酸(半胱氨酸)反应完毕；
(4)通过click反应偶联3个甘露糖，具体包括在肽树脂上脯氨酸(P)的后面偶联己炔酸，与带叠氮基团的3个甘露糖的衍生物，在碘化亚铜(0.3摩尔当量)，氮气保护下，室温反应4h，反应完毕后，DMF、DCM各洗涤树脂3次，甲醇洗2次，继续抽干20min，从多肽固相合成管中取出合成的肽树脂，在室温下于裂解液中裂解2h(裂解液先冰浴20min)，将树脂过滤后，于旋蒸仪蒸干，冰浴条件下用无水乙醚洗3次，粗肽使用制备型反相HPLC纯化，使用HPLC检测纯度>94.7％，所得到的纯肽使用质谱(MS，electrospray)进行鉴定，所测量得到的分子量结果与目标分子量相同。
最终得到多肽1，多肽序列LGASWHRPDK为靶向识别单元，GLYGLP为酶水解底物单元，酶水解位点位于Y与G之间，KLVFFAECG为自组装单元，man为免疫识别调节片段，所得多肽1冻干后-20℃保存待用。
双特异性糖肽纳米分子的结构示意图如图1所示，设计原理如图2所示，双特异性糖肽纳米分子通过靶向识别单元LGASWHRPDK识别肿瘤细胞的CXCR4受体，同时与肿瘤微环境中过表达的基质金属蛋白酶发生高效酶水解反应，进而组装残基在肿瘤细胞表面自组装形成纳米纤维，从而实现长效阻断CXCR4受体，抑制细胞侵袭能力；同时甘露糖部分(man)3为免疫识别调节单元，靶向M2型肿瘤相关巨噬细胞，使其重极化为M1表型，增强T细胞抗肿瘤免疫和改善肿瘤免疫抑制。
实施例2
本实施例提供一种双特异性糖肽纳米分子，所述纳米分子的分子式为：RGDK(GLYGLP-(man)3)LVFFAECG，所述纳米分子的结构式如式II所示。
所述纳米分子的制备方法与实施例1相同。
多肽序列RGD为靶向识别单元，GLYGLP为酶水解底物单元，酶水解位点位于Y与G之间，(man)3为免疫识别调节单元，KLVFFAECG为自组装单元。
实施例3
本实施例提供一种双特异性糖肽纳米分子，所述纳米分子的分子式为：YNTNHVPLSPKYK(GLYGLP-(man)3)LVFFAECG，所述纳米分子的结构式如式III所示，其制备方法与实施例1相同。
YNTNHVPLSPKY对应的受体为碳酸酐酶-9，GLYGLP为酶水解底物单元，酶水解位点位于Y与G之间，(man)3为免疫识别调节单元，KLVFFAECG为自组装单元。
对比例1
本对比例提供一种特异性纳米药物LGASWHRPDKC，并记为多肽2，该特异性纳米药物与实施例1制备的双特异性糖肽纳米药物的区别在于：不具备自组装单元，不具有组装功能，不具备免疫调节单元。
试验例1
利用实施例1制备的多肽1(Cy)进行细胞水平特异性识别及长效滞留实验，Cy指经过菁染料标记，实验所选细胞为CXCR4高表达的肾癌细胞系EJ细胞和CXCR4低表达的成纤维细胞系L929细胞。
使用多肽1(Cy)分别对两组细胞进行孵育处理15min，在多光束激光共聚焦成像系统(U-Vox)中对细胞进行观察，如图3A所示，在EJ细胞表面观察到多肽1(Cy)的荧光，图3B所示，未在L929细胞表面观察到多肽1(Cy)的荧光，说明多肽1(Cy)能够在CXCR4高表达的肿瘤细胞表面组装并滞留，而在CXCR4表达量较低的细胞表面无法组装并滞留，因此多肽1(Cy)具有特异性。
随后使用多肽1(Cy)对EJ细胞进行处理，以PBS处理的EJ细胞作为对照，并对细胞进行观察，在共聚焦显微镜下的不同时间点对细胞进行观察，结果如图4及图5所示，多肽1(Cy)处理的EJ细胞克隆形成量明显减少、穿透的细胞数显著降低，表明多肽1(Cy)具有良好的克隆形成抑制能力及侵袭性抑制能力。
试验例2
利用实施例1制备的多肽1进行细胞水平靶向M2型肿瘤相关巨噬细胞，使其重极化为M1样表型实验，实验所选细胞为RAW264.7细胞。
使用多肽1对细胞进行孵育处理24h，以PBS处理细胞作为对照，使用流式细胞仪对细胞进行观察，结果如图6所示，多肽1处理的细胞CD206表达量明显减少、CD86表达量显著增加，表明多肽1能够良好的靶向M2型肿瘤相关巨噬细胞，使其重极化为M1样表型。
试验例3
利用实施例1制备的多肽1(Cy)进行动物水平的特异性识别及长效滞留实验，实验所选动物为小鼠。
小鼠皮下瘤模型的构建：用膀胱癌细胞进行小鼠皮下移植瘤的建立，取1×106个EJ细胞注射到小鼠右腿皮下，2周后肿瘤成型，得到小鼠皮下瘤模型。
用多肽1(Cy)进行鼠尾静脉注射，所用小鼠为3只，用小动物活体成像仪(IVISSpectrum)进行成像，成像结果如图7所示，多肽1(Cy)在肿瘤组织处具有明显的信号聚集，并长效滞留可达120小时。
试验例4
利用实施例1制备的多肽1(Cy)在小鼠原位膀胱癌模型中进行肿瘤精准识别。
原位膀胱癌小鼠模型的构建：用膀胱癌细胞进行小鼠原位膀胱肿瘤模型的建立，取1×106个细胞注射到小鼠膀胱内，2周后肿瘤成型，得到原位膀胱癌小鼠模型，如8A所示。
经小鼠尿道灌注多肽1(Cy)，随后在灌注后1小时进行膀胱离体成像，结果如图8B所示，多肽1(Cy)在肿瘤部位信噪比较高。
试验例5
利用实施例1制备的多肽1进行动物水平的皮下瘤种植抑制实验，实验所选动物为小鼠。
小鼠皮下瘤模型的构建：用膀胱癌细胞进行小鼠皮下移植瘤的建立，取1×106个EJ细胞注射到小鼠右腿皮下，2周后肿瘤成型，得到小鼠皮下瘤模型。
用多肽1进行鼠尾静脉注射，然后将皮下瘤取下，切成小碎块包埋到健康小鼠的皮下，如图9所示，以PBS替换多肽1进行处理作为对照，所用小鼠为5只/组，然后统计记录小鼠皮下瘤生长状态，结果如图10所示，多肽1预处理的肿瘤生长明显被抑制。
试验例6
利用实施例1制备的多肽1进行动物水平的肿瘤细胞膀胱种植抑制实验，实验所选动物为小鼠。
膀胱癌细胞EJ的预处理：用50μM的多肽1对EJ细胞进行预处理2h，使其在肿瘤细胞表面形成纳米纤维。
然后将多肽1处理的EJ细胞进行小鼠膀胱内灌注，选取8只小鼠进行实验，于13天后将小鼠的膀胱取出剖开，统计记录小鼠膀胱种植，肿瘤生长情况，结果如图11所示，8只小鼠中仅有1只生长肿瘤，表明多肽1预处理的肿瘤生长种植明显被抑制，肿瘤复发率显著降低。
试验例7
利用对比例1制备的多肽2(Cy)进行动物水平的特异性识别及长效滞留实验，实验选择小鼠皮下瘤模型，用多肽2(Cy)进行鼠尾静脉注射，所用小鼠为3只，用IVIS小动物成像仪进行成像，结果如图12所示，1小时左右多肽2(Cy)在肿瘤组织处具有明显的信号聚集，但是信号值迅速衰减，结合试验例3分析可知，多肽1的肿瘤滞留能力强于多肽2。
综合上述，本发明提供的双特异性糖肽纳米分子，可以靶向识别肿瘤细胞，同时与肿瘤微环境中过表达的酶发生高效酶水解反应，进而组装残基在肿瘤细胞表面自组装形成纳米纤维，从而实现长效阻断肿瘤细胞受体，抑制细胞侵袭能力；同时免疫识别调节单元靶向M2样肿瘤相关巨噬细胞，使其重极化为M1样表型，增强T细胞抗肿瘤免疫和改善肿瘤免疫抑制，显著抑制了肿瘤的种植复发。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 国家纳米科学中心
<120> 一种双特异性糖肽纳米分子及其制备方法和应用
<130> 20210409
<160> 20
<170> PatentIn version 3.3
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<212> PRT
<213> 人工序列
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1
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<213> 人工序列
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<212> PRT
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<212> PRT
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1 5

Claims (10)

1.一种双特异性糖肽分子，其特征在于，所述双特异性糖肽分子包括靶向识别单元、酶水解底物单元、自组装单元和免疫识别调节单元，所述靶向识别单元和酶水解底物单元分别与自组装单元连接，所述免疫识别调节单元连接于所述酶水解底物单元；
所述双特异性糖肽分子具有如式I、式II或式III中任意一种所示的结构；
Figure FDA0003717755120000011
Figure FDA0003717755120000021
Figure FDA0003717755120000031
2.一种如权利要求1所述的双特异性糖肽分子的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
将靶向识别单元、酶水解底物单元、自组装单元和免疫识别调节单元进行连接，得到所述双特异性糖肽分子。
3.根据权利要求2所述的双特异性糖肽分子的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
制备靶向识别单元、酶水解底物单元和自组装单元并进行连接，随后将免疫识别调节单元连接于酶水解底物单元，得到所述双特异性糖肽分子。
4.根据权利要求3所述的双特异性糖肽分子的制备方法，其特征在于，采用多肽固相合成法制备制备靶向识别单元、酶水解底物单元和自组装单元并进行连接。
5.根据权利要求3所述的双特异性糖肽分子的制备方法，其特征在于，通过Click反应将免疫识别调节单元连接于酶水解底物单元。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
采用多肽固相合成法制备制备靶向识别单元、酶水解底物单元和自组装单元并进行连接，并通过Click反应将免疫识别调节单元连接于酶水解底物单元，得到所述双特异性糖肽分子。
7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的双特异性糖肽分子。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
9.如权利要求1所述的双特异性糖肽分子或权利要求7所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括膀胱癌、胃癌或食管癌中的任意一种或至少两种的组合。
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