CN108384810B - 一种高转染效率低细胞毒性的阳离子基因载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高转染效率低细胞毒性的阳离子基因载体,包括线性聚‑α‑赖氨酸(PLL)和接枝在所述线性聚‑α‑赖氨酸上的对甲苯磺酰基保护的精氨酸(Arg(Tos));所述线性聚‑α‑赖氨酸与对甲苯磺酰基保护的精氨酸的摩尔比为1:(5~120)。本发明中的阳离子基因载体PLL‑Arg(Tos)最佳转染效率是阳离子基因载体黄金标准“PEI25k”的最佳转染效率的十多倍,且在最佳转染效率的比例时,细胞中存活率均在90%以上。另外PLL‑Arg(Tos)对恒定表达荧光素酶的HuH‑7Luc的最佳基因沉默效率可达到80%以上。本发明还提供一种高转染效率低细胞毒性的阳离子载体的制备方法。
Description
技术领域
本发明属于生物医用新材料技术领域,尤其涉及一种高转染效率低细胞毒性的阳离子基因载体及其制备方法。
背景技术
目前基因治疗作为一种全新的治疗方式在治疗癌症以及遗传疾病上日益受到人们的关注。基因治疗是指将健康的外源基因导入受体细胞也就是靶细胞,以纠正或补偿因基因缺陷或者异常引起的疾病,从而达到治疗目的的新技术。
然而基因治疗需要有效的基因载体。在基因载体中,阳离子型基因载体日益受到人们的关注。在阳离子基因载体中,PEI25k作为阳离子基因载体的“黄金标准”。PEI25k虽然具有较高的转染效率,但是其存在严重的细胞毒性,限制了其在临床上的应用,参见Lungwitz U,Breunig M,Blunk T,Gopferich A.Polyethylenimine-based non-viralgene delivery systems.Eur.J.Pharm.Biopharm 2005;60,247-266。因此设计出高转染效率,低细胞毒性的阳离子基因载体逐渐成为研究的热点。
为了降低细胞毒性,Guan,X.W.;Guo,Z.P.;Wang,T.H,Lin,L.;Chen,J.Tian,H.Y.;Chen,X.S.A pH-Responsive Detachable PEG Shielding Strategy for Gene DeliverySystemin Cancer Therapy.Biomacromolecules 2017,18,1342-1349.Guan,X.W.;Guo,Z.P.;Lin,L.;Chen,J.;Tian,H.Y.;Chen,X.S.以及Ultrasensitive pHTriggered Charge/Size Dual-Rebound Gene Delivery System.Nano Lett.2016,16,6823-6831.Tian,H.Y;Tang,Z.H.;Zhuang,X.L.;Chen,X.S.;Jing,X.B.将mPEG2000或HO-PEG2000-OH用对羧基苯甲醛修饰后,然后将产物与PEI25k进行复合,作为DNA的联合载体。虽然这些方法能够在一定程度上降低细胞毒性,但是其制备方法复杂,可重复性差。因此迫切需要设计一种制备简单,可重复性强的高效的阳离子基因载体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高转染效率低细胞毒性的阳离子基因载体及其制备方法,本发明中的阳离子基因载体转染效率高,细胞毒性低。
本发明提供一种高转染效率低细胞毒性的阳离子基因载体,包括线性聚-α-赖氨酸和接枝在所述线性聚-α-赖氨酸上的对甲苯磺酰基保护的精氨酸;
所述线性聚-α-赖氨酸与对甲苯磺酰基保护的精氨酸的摩尔比为1:(5~120)。
优选的,所述聚-α-赖氨酸的数均分子量为2000~50000。
本发明提供一种高转染效率低细胞毒性的阳离子基因载体的制备方法,包括以下步骤:
A)将C8H17N3.HCl和1-羟基苯并三唑加入对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中,进行活化;
B)将线性聚-α-赖氨酸的水溶液加入所述步骤A)中活化后的溶液中,进行反应;
所述线性聚-α-赖氨酸与对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸的摩尔比为1:(5~120);
C)将所述步骤B)中反应后的溶液依次进行透析、冻干,得到中间产物;
D)将所述中间产物与三氟乙酸进行反应,加入无水乙醚沉降后,进行真空抽干和透析,得到阳离子基因载体。
优选的,所述线性聚-α-赖氨酸水溶液的浓度为0.01~0.5mg/mL。
优选的,所述甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液的浓度为0.01~0.5mg/mL。
优选的,所述C8H17N3.HCl、1-羟基苯并三唑和对甲苯磺酰基保护的精氨酸的摩尔比为(1~5):(1~5):1。
优选的,所述步骤A)中的活化温度为20~35℃;
所述步骤A)中活化的时间为0.5~3小时。
优选的,所述步骤B)中反应的温度为20~35℃;
所述步骤B)中反应的时间为60~80小时。
优选的,所述步骤C)中透析的分子量为1000~3500;
所述步骤C)中透析的时间为60~80小时。
优选的,所述步骤C)中冻干的温度为-50~-80℃。
本发明提供一种高转染效率低细胞毒性的阳离子基因载体,包括线性聚-α-赖氨酸(PLL)和接枝在所述线性聚-α-赖氨酸上的对甲苯磺酰基保护的精氨酸(Arg(Tos));所述线性聚-α-赖氨酸与对甲苯磺酰基保护的精氨酸的摩尔比为1:(5~120)。本发明中的阳离子基因载体PLL-Arg(Tos)具有高转染效率,低细胞毒性。其在MCF-7,HeLa,CT26以及B16F10细胞中的最佳转染效率是阳离子基因载体黄金标准“PEI25k”的最佳转染效率的十多倍,且在最佳转染效率的比例时,在四种细胞中存活率均在90%以上。另外PLL-Arg(Tos)的基因沉默效率高,对恒定表达荧光素酶的HuH-7Luc的最佳基因沉默效率可达到80%以上,明显比PEI25k的基因沉默效率高。制备的PLL-Arg(Tos)阳离子载体在基因载体设计和抗肿瘤领域有巨大的应用前景。
具体实施方式
本发明提供了一种高转染效率低细胞毒性的阳离子基因载体,包括线性聚-α-赖氨酸和接枝在所述线性聚-α-赖氨酸上的对甲苯磺酰基保护的精氨酸;
所述线性聚-α-赖氨酸(PLL)与对甲苯磺酰基保护的精氨酸(Arg(Tos))的摩尔比为1:(5~120)。
在本发明中,所述线性聚-α-赖氨酸的数均分子量优选为2000~50000,更优选为3000~40000,具体的,可以是3000或15000;所述线性聚-α-赖氨酸(PLL)与对甲苯磺酰基保护的精氨酸(Arg(Tos))的摩尔比为1:(5~120),优选为1:(10~90),更优选为1:(20~60),具体的,可以是1:5、1:10、1:20、1:30、1:45、1:60、1:90或1:120。
本发明还提供了一种高转染效率低细胞毒性的阳离子基因载体的制备方法,包括以下步骤:
A)将C8H17N3.HCl和1-羟基苯并三唑加入对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中,进行活化;
B)将线性聚-α-赖氨酸的水溶液加入所述步骤A)中活化后的溶液中,进行反应;
所述线性聚-α-赖氨酸与对甲苯磺酰基保护的精氨酸的摩尔比为1:(5~120);
C)将所述步骤B)中反应后的溶液依次进行透析、冻干,得到中间产物;
D)将所述中间产物在三氟乙酸条件下进行反应,加入无水乙醚沉降后,进行真空抽干和透析,得到阳离子基因载体。
本发明先将对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸(Boc-Arg(Tos))溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,然后再加入C8H17N3.HCl(EDC.HCl)和1-羟基苯并三唑(HOBT),进行活化。
所述甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液的浓度优选为0.01~0.5mg/mL,更优选为0.02~0.3mg/mL,最优选为0.05~0.2mg/mL;所述EDC.HCl、HOBT和Boc-Arg(Tos)的摩尔比优选为(1~5):(1~5):1,更优选为(2~4):(2~4):1。
所述活化的温度优选为20~35℃,更优选为25~30℃;所述活化的时间优选为0.5~3小时,更优选为1~2小时。
完成活化后,本发明将线性聚-α-赖氨酸的水溶液缓慢加入所述步骤A)中活化后的溶液中,进行反应。
所述线性聚-α-赖氨酸的水溶液的浓度优选为0.01~0.5mg/mL,更优选为0.02~0.3mg/mL,最优选为0.05~0.2mg/mL;所述线性聚-α-赖氨酸与对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸的摩尔比为1:(5~120),优选为1:(10~90),更优选为1:(20~60),具体的,可以是1:5、1:10、1:20、1:30、1:45、1:60、1:90或1:120。
所述反应的温度优选为20~35℃,更优选为25~30℃;所述反应的时间优选为60~80小时,更优选为65~75小时,最优选为68~72小时。
本发明将上述反应完之后的溶液依次进行透析和冻干,得到中间产物。
在本发明中,所述透析所使用的透析袋的分子量优选为1000~3500,其中,分子量为1000的透析袋适用于数均分子量为3000的线性聚-α-赖氨酸,分子量为3500的透析袋适用于数均分子量为15000的线性聚-α-赖氨酸。每隔8小时换一次透析水,优选透析60~80小时,更优选为65~75小时,最优选为68~72小时。
所述冻干优选采用冷冻干燥机进行,所述冷阱的温度设定为-50~-80℃,优选为-60~-70℃。
冻干之后,将冻干的产物在三氟乙酸存在的条件下进行反应,反应完毕后先进行真空浓缩,然后加入无水乙醚沉降,再进行真空抽干和透析,得到阳离子基因载体。
在本发明中,所述与三氟乙酸反应的时间优选为3~6小时,更优选为4~5小时。
所述真空浓缩优选采用旋转蒸发仪进行,浓缩至反应液中80%的水被去除即可。所述真空浓缩的真空度优选为0.001Pa。
本发明中,该步骤的透析过程的参数与上文中透析的参数一致,在此不再赘述。
本发明提供一种高转染效率低细胞毒性的阳离子基因载体,包括线性聚-α-赖氨酸(PLL)和接枝在所述线性聚-α-赖氨酸上的对甲苯磺酰基保护的精氨酸(Arg(Tos));所述线性聚-α-赖氨酸与对甲苯磺酰基保护的精氨酸的摩尔比为1:(5~120)。本发明中的阳离子基因载体PLL-Arg(Tos)具有高转染效率,低细胞毒性。其在MCF-7,HeLa,CT26以及B16F10细胞中的最佳转染效率是阳离子基因载体黄金标准“PEI25k”的最佳转染效率的十多倍,且在最佳转染效率的比例时,在四种细胞中存活率均在90%以上。另外PLL-Arg(Tos)的基因沉默效率高,对恒定表达荧光素酶的HuH-7Luc的最佳基因沉默效率可达到80%以上,明显比PEI25k的基因沉默效率高。制备的PLL-Arg(Tos)阳离子载体在基因载体设计和抗肿瘤领域有巨大的应用前景。
为了进一步说明本发明,以下结合实施例对本发明提供的一种高转染效率低细胞毒性的阳离子基因载体及其制备方法进行详细描述,但不能将其理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1PLL-Arg(Tos)的制备
将线性聚-α-赖氨酸溶解于去离子水中,将对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸(Boc-Arg(Tos))溶解于溶解在DMF中。将EDC.HCl和HOBT加入到Boc-Arg(Tos)溶液中室温下活化反应1h,然后将PLL的水溶液缓慢加入到上述混合液中,室温反应72h。将反应的混合物透析,冻干。然后将冻干产物在三氟乙酸的条件下反应4h,真空浓缩,加无水乙醚沉降,真空抽干,透析,冻干得到白色固体产物PLL-Arg(Tos)。
聚-α-赖氨酸接枝对甲苯磺酰基保护的精氨酸(Arg(Tos))的接枝率列于表1。
表1 原料的摩尔比与产物分子量的对应关系
载体材料编号 | PLL的分子量 | PLL与Arg(Tos)的摩尔比 |
PLL<sub>3k</sub>Arg(Tos)-1 | 3000 | 1:5 |
PLL<sub>3k</sub>Arg(Tos)-2 | 3000 | 1:10 |
PLL<sub>3k</sub>Arg(Tos)-3 | 3000 | 1:20 |
PLL<sub>15k</sub>Arg(Tos)-1 | 15000 | 1:20 |
PLL<sub>15k</sub>Arg(Tos)-2 | 15000 | 1:30 |
PLL<sub>15k</sub>Arg(Tos)-3 | 15000 | 1:45 |
PLL<sub>15k</sub>Arg(Tos)-4 | 15000 | 1:60 |
PLL<sub>15k</sub>Arg(Tos)-5 | 15000 | 1:90 |
PLL<sub>15k</sub>Arg(Tos)-6 | 15000 | 1:120 |
实施例2
1)利用PLL-Arg(Tos)介导pGL3(荧光素酶质粒)、pEGFPN1(绿色荧光蛋白质粒)对MCF-7细胞的体外转染
(1)MCF-7细胞的培养
将MCF-7细胞于培养在含10%体积分数的胎牛血清培养液中,细胞在设定温度为37℃、体积分数为5%的CO2的恒温培养箱中培养。
(2)细胞转染
在转染前24h,取对数生长期细胞,胰酶消化后用含体积分数10%的胎牛血清培养液稀释,按照1×104细胞/孔的密度铺板于96孔细胞培养板中,置于培养温度为37℃、含体积分数5%的CO2的恒温培养箱中培养直至细胞汇合度达80~90%。转染时,将载体/ρDNA复合物复合20min后,按照0.2μgρDNA/孔的用量加入到96孔细胞板中,继续培养48小时。
(3)细胞转染效率的测定
a)荧光素酶活性检测
从培养箱中取出细胞培养板,移除细胞培养液,用PBS洗涤2次,加入细胞裂解液放入-80℃中裂解20min,然后每孔加入一定量的荧光素酶底物,通过光度计定量测定细胞转染效率。表2给出了荧光素酶质粒的复合物的转染效率。
绿色荧光蛋白(GFP)的表达是通过荧光显微镜来观察绿色荧光蛋白信号。绿色荧光蛋白表达阳性的细胞发出明亮的绿色荧光,而阴性细胞则不会发出荧光。用流式细胞仪检测阳性细胞的百分比。表3给出了绿色荧光蛋白质粒的复合物的转染效率。
表2 PLL-Arg(Tos)介导荧光素酶质粒的体外转染效率
载体材料编号 | 转染效率,LUC/mgProtein | 载体与DNA的质量比 |
PLL<sub>3k</sub> | 5.5×10<sup>4</sup> | 20:1 |
PLL<sub>3k</sub> Arg(Tos)-1 | 5.7×10<sup>7</sup> | 2.5:1 |
PLL<sub>3k</sub> Arg(Tos)-2 | 1.2×10<sup>8</sup> | 2.5:1 |
PLL<sub>3k</sub> Arg(Tos)-3 | 7.3×10<sup>7</sup> | 2.5:1 |
PEI25k | 4.3×10<sup>7</sup> | 2.5:1 |
PLL15k | 3.5×10<sup>5</sup> | 10:1 |
PLL<sub>15k</sub> Arg(Tos)-1 | 2.2×10<sup>8</sup> | 2.5:1 |
PLL<sub>15k</sub> Arg(Tos)-2 | 4.6×10<sup>8</sup> | 2.5:1 |
PLL<sub>15k</sub> Arg(Tos)-3 | 7.8×10<sup>8</sup> | 2.5:1 |
PLL<sub>15k</sub> Arg(Tos)-4 | 2.3×10<sup>9</sup> | 2.5:1 |
PLL<sub>15k</sub> Arg(Tos)-5 | 5.3×10<sup>8</sup> | 2.5:1 |
PLL<sub>15k</sub> Arg(Tos)-6 | 4.7×10<sup>7</sup> | 2.5:1 |
表3 PLL-Arg(Tos)介导绿色荧光蛋白质粒的体外转染效率
实施例3
1)利用PLL-Arg(Tos)介导沉默荧光素酶的Luc siRNA,在HuH-7细胞系中的转染
(1)HuH-7细胞的培养
将细胞置于含体积分数10%的胎牛血清培养液中,在培养温度37℃下体积分数为5%的CO2的恒温箱中连续培养。
(2)细胞转染
在转染前24h,取对数生长期细胞,胰酶消化后用含体积分数10%的胎牛血清培养液稀释,按照1×104细胞/孔的密度铺板于96孔细胞培养板中,置于培养温度为37℃、含体积分数5%的CO2的恒温培养箱中培养直至细胞汇合度达80~90%。转染时,将载体/siRNA复合物复合20min后,按照0.2μg siRNA/孔加入到96孔细胞板中,继续培养48小时。
(3)细胞转染效率的测定
从培养箱中取出细胞培养板,移除细胞培养液,用PBS洗涤2次,加入细胞裂解液放入-80℃中裂解20min,然后每孔加入一定量的荧光素酶底物,通过光度计定量测定细胞转染效率。表4给出了荧光素酶的沉默效率。
表4 PLL-Arg(Tos)介导沉默荧光素酶的Luc siRNA的体外转染效率
表5 PLL-Arg(Tos)/pDNA复合物在MCF-7细胞中的存活率
实施例4 PLL-Arg(Tos)在体内pDNA转染中的应用
(1)细胞培养
将CT26细胞置于含有10%的胎牛血清培养液中,在含体积分数为5%(体积分数)CO2、温度为37℃的恒温箱中培养。
(2)肿瘤接种
购买周龄5-6周的体重20g左右的Balb/C小鼠,肿瘤接种前,取对数生长期的CT26细胞,用胰蛋白酶消化,然后用细胞培养液混合胰蛋白酶,1×103rpm离心5min,PBS洗涤三次,用PBS悬浮细胞。按每只小鼠3×106细胞接种于小鼠腋下,大约7后,小鼠平均瘤径长到7mm时进行体内转染。
(3)体内转染
将表达荧光素酶的质粒DNA作为转染基因,按照每只小鼠质粒pDNA用量20μg,将载体/pDNA复合物的生理盐水溶液200μL尾静脉注射小鼠体内。
(4)体内转染效率效率的测定
在进行48h的体内转染后,处死Balb/C鼠,取出各组肿瘤,用PBS洗涤2次,组织裂解液进行裂解,匀浆,然后加入荧光素底物,测定转染效率。表6给出了体内实验荧光素酶质粒的复合物的转染效率。
表6 PLL-Arg(Tos)介导荧光素酶质粒体内转染效率
实施例5 PLL-Arg(Tos)在体内siRNA转染中的应用
(1)CT26细胞的培养
将CT26细胞置于含有10%的胎牛血清培养液中,在含体积分数为5%的CO2、温度为37℃的恒温培养箱中培养。
(2)肿瘤接种
购买周龄5-6周的体重20g左右的Balb/C小鼠,肿瘤接种前,取对数生长期的CT26细胞,用胰蛋白酶消化,然后用细胞培养液混合胰蛋白酶,1×103rpm离心5min,PBS洗涤三次,用PBS悬浮细胞。按每只小鼠3×106细胞接种于小鼠腋下。7天后,瘤径平均长大至7mm时进行siRNA体内的转染。
(3)体内转染
基因选用能够表达能够沉默肿瘤血管内皮生长因子的shRNA的质粒DNA(通过抑制VEGF蛋白的表达来抑制肿瘤生长),按照每只小鼠的pDNA用量20ug,50μL,载体/pDNA复合物的生理盐水溶液体积200μL尾静脉注射小鼠体内,每隔一天给一次药,给药14天。
(4)小鼠肿瘤生长的测定
在小鼠第一次给药开始,每天测量小鼠肿瘤大小以及体重的变化。表7给出了对肿瘤进行抑制14天后的瘤径大小。
表7 PLL-Arg(Tos)介导VEGF shRNA的pDNA体内转染后的瘤径大小
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种高转染效率低细胞毒性的阳离子基因载体,包括线性聚-α-赖氨酸和接枝在所述线性聚-α-赖氨酸上的对甲苯磺酰基保护的精氨酸;
所述线性聚-α-赖氨酸与对甲苯磺酰基保护的精氨酸的摩尔比为1:(5~120);
所述聚-α-赖氨酸的数均分子量为3000~15000。
2.一种高转染效率低细胞毒性的阳离子基因载体的制备方法,包括以下步骤:
A)将C8H17N3.HCl和1-羟基苯并三唑加入对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中,进行活化;
B)将线性聚-α-赖氨酸的水溶液加入所述步骤A)中活化后的溶液中,进行反应;
所述线性聚-α-赖氨酸与对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸的摩尔比为1:(5~120);所述线性聚-α-赖氨酸的数均分子量为3000~15000;
C)将所述步骤B)中反应后的溶液依次进行透析、冻干,得到中间产物;
D)将所述中间产物与三氟乙酸进行反应,加入无水乙醚沉降后,进行真空抽干和透析,得到阳离子基因载体。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述线性聚-α-赖氨酸水溶液的浓度为0.01~0.5mg/mL。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液的浓度为0.01~0.5mg/mL。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述C8H17N3.HCl、1-羟基苯并三唑和对甲苯磺酰基保护的精氨酸的摩尔比为(1~5):(1~5):1。
6.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤A)中的活化温度为20~35℃;
所述步骤A)中活化的时间为0.5~3小时。
7.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤B)中反应的温度为20~35℃;
所述步骤B)中反应的时间为60~80小时。
8.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤C)中透析的分子量为1000~3500;
所述步骤C)中透析的时间为60~80小时。
9.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述步骤C)中冻干的温度为-50~-80℃。
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