CN106947084B - 用于络合铜离子的高分子材料及其抗肿瘤用途 - Google Patents

用于络合铜离子的高分子材料及其抗肿瘤用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于络合铜离子的高分子材料及其抗肿瘤用途。如式I所示，A选自聚谷氨酸或透明质酸；B选自三乙烯四胺或二乙烯三胺；C选自聚组氨酸或聚乳酸。该类材料毒性极小，能够通过络合移除肿瘤微环境中的铜离子抑制肿瘤血管生成，进而抑制肿瘤转移；此外，该类材料在pH 7.0~8.0时可以形成直径200~280nm的纳米球，该纳米球可以包载R848等免疫激动剂，在肿瘤微环境激活免疫细胞杀伤肿瘤细胞，从而实现肿瘤免疫疗法与抗肿瘤血管生成的联合治疗。

Description

用于络合铜离子的高分子材料及其抗肿瘤用途
技术领域
本发明涉及药用高分子材料领域，特别是涉及一种用于络合铜离子的高分子材料及其抗肿瘤用途。
背景技术
肿瘤转移是导致癌症患者预后差、死亡率高的主要原因，肿瘤转移依赖于肿瘤血管生成。血管生成在肿瘤的发展和转移过程中起着重要作用。研究表明，良性肿瘤血管生成稀少，血管生长缓慢；而大多数恶性肿瘤的血管生成密集且生长迅速。血管内皮细胞的增殖和迁移是形成肿瘤血管的两个重要条件。目前，已有的肿瘤血管抑制剂，如CA4等，因为其毒性较大，限制了其开发和临床应用。贝伐珠单抗，作为VEGFR抑制剂，也因为其有效的临床疗效而未给广大癌症患者带来太多益处。自上世纪90年代开始，诸多的研究报导先后证明了铜离子与肿瘤血管生成及内皮细胞运动密切相关。2015年《Science》发表报道，一个Ⅳ期乳腺癌妇女，通过服用四硫代钼酸盐络合抑制体内的铜离子，成功消除了远端转移，并已经存活了8年。寻找一种新的、低毒的肿瘤血管生成抑制剂已经成为当前的研究热点，通过抑制肿瘤微环境的铜离子抑制肿瘤血管生成为我们提供了一条新的途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于络合铜离子的高分子材料, 该高分子材料通过络合移除肿瘤微环境中的铜离子达到抑制肿瘤血管生成，进而抑制肿瘤生长和转移。本发明毒性极小，此外，该材料在pH 7.0~8.0时可以形成直径200~280nm的纳米球，该纳米球可以包载R848等免疫激动剂，在肿瘤微环境激活免疫细胞杀伤肿瘤细胞，从而实现肿瘤免疫疗法与抗肿瘤血管生成的联合治疗。
本发明提供的用于络合铜离子的高分子材料,其结构如式I所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
式I
其中，A选自聚谷氨酸；B选自三乙烯四胺或二乙烯三胺；C选自聚组氨酸或聚乳酸。n=8 ~16。
所述高分子材料A为聚谷氨酸，B为三乙烯四胺，C为聚组氨酸，形成材料1。
所述高分子材料A可以为透明质酸，B为三乙烯四胺，C为聚组氨酸，形成材料2。
本发明提供的用于络合铜离子的高分子材料1的合成方法包括的步骤：
1）聚谷氨酸水溶液中依次加入Na2CO3、二碳酸二叔丁酯的无水乙醇溶液，冰浴反应22-24h，加入无水乙醇沉淀出产物，分离，45℃真空干燥48小时得到二碳酸二叔丁酯-聚谷氨酸；聚谷氨酸的分子量为10万；Na2CO3、二碳酸二叔丁酯的摩尔比为1:1；
聚谷氨酸与二碳酸二叔丁酯的摩尔比为1:1-10；
2）在二碳酸二叔丁酯-聚谷氨酸水溶液中加入摩尔比为1:1:1的三乙烯四胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液，用稀盐酸调pH至6.0，室温反应22-24h；反应结束用丙酮沉淀并洗涤，分离，45℃真空干燥48小时得到二碳酸二叔丁酯-聚谷氨酸接枝三乙烯四胺。
二碳酸二叔丁酯-聚谷氨酸与三乙烯四胺的摩尔比为1:1-50。
3）在二碳酸二叔丁酯-聚谷氨酸接枝三乙烯四胺水溶液中加入氢氧化钠搅拌溶解，然后加0.6mmol二硫化碳，室温下搅拌反应10-12h；用丙酮沉淀并洗涤，45℃真空干燥48小时得到二碳酸二叔丁酯-聚谷氨酸接枝三乙烯四胺基双(二硫代甲酸钠)。
二碳酸二叔丁酯-聚谷氨酸与二硫化碳的摩尔比为1:1~10。
4）芴甲氧羰基保护的聚组氨酸水溶液中加入摩尔比为1:1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，稀盐酸调pH至6.0，室温活化0.5h；然后与二碳酸二叔丁酯-聚谷氨酸接枝三乙烯四胺基双(二硫代甲酸钠)的水溶液混合，室温反应22-24h；用丙酮沉淀并洗涤，45℃真空干燥48小时得到二碳酸二叔丁酯-聚谷氨酸接枝三乙烯四胺基双(二硫代甲酸钠)-芴甲氧羰基聚组氨酸。
二碳酸二叔丁酯-聚谷氨酸接枝三乙烯四胺基双(二硫代甲酸钠)与芴甲氧羰基保护的聚组氨酸的摩尔比为1：0.1~2。
5）二碳酸二叔丁酯-聚谷氨酸接枝三乙烯四胺基双(二硫代甲酸钠)-芴甲氧羰基聚组氨酸加到10~20ml体积比为1:1的三氟乙酸和二氯甲烷，室温搅拌反应1小时，用旋转蒸发仪除去溶剂；沉淀加10~20ml含有20%哌啶的二甲基甲酰胺，室温搅拌1小时，用10倍体积的无水乙醇沉淀并洗涤，45℃真空干燥48小时得到聚谷氨酸接枝三乙烯四胺基双(二硫代甲酸钠)-聚组氨酸，即材料1。
上述聚谷氨酸用透明质酸代替，可以制备出材料2。
本发明提供的用于络合铜离子的高分子材料1纳米球的制备方法包括的步骤：
1）取材料1溶解于200~600μL pH =3.0的甘氨酸-盐酸缓冲液中，然后将该溶液边搅拌边加入到1~5倍体积的pH 7.6的磷酸盐缓冲液中，继续搅拌至纳米球出现。
2）取材料1溶解于含有0.1~0.6mg R848的200~600μL pH 3.0的甘氨酸-盐酸缓冲液中，然后将该溶液边搅拌边加入到1~5倍体积的pH 7.6的磷酸盐缓冲液中，继续搅拌至纳米球出现，得到包载R848的材料1纳米球。
本发明提供的用于络合铜离子的高分子材料1纳米球的应用方法包括的步骤：
在材料1的纳米球或包载R848的纳米球的pH 6.5的磷酸盐缓冲液中加入10~100μmol/L硫酸铜溶液，在190nm~400nm波段检测紫外吸收峰。由于络合了铜离子，材料1紫外吸收峰明显红移。
本发明提供的用于络合铜离子的高分子材料纳米球对血管内皮细胞运动能力的抑制，所述血管内皮细胞运动能力包括迁移能力、侵袭能力和粘附能力，10~50μg/mL材料1纳米球或材料1纳米球包载R848剂型能显著抑制血管内皮细胞在划痕实验中的迁移距离、在Transwell侵袭实验中的侵袭能力及在粘附实验中粘附到基质的细胞数。
本发明提供的用于络合铜离子的高分子材料的应用如下:
所述材料1纳米球对血管内皮细胞成管能力的抑制，10~50μg/mL材料1纳米球或材料1纳米球包载R848剂型能显著抑制血管内皮细胞在基质胶上形成闭合的三维管道的能力。
所述材料1纳米球对小鼠乳腺癌模型肿瘤血管生成的抑制，将4T1细胞接种于BALB/C小鼠腋下，1周后开始尾静脉注射12mg/kg材料1纳米球，每3天给药1次，21天后取小鼠腋下肿瘤组织做免疫组织化学染色，用CD31标记肿瘤血管，给药组血管数显著少于对照组。
所述材料1纳米球及材料1纳米球包载R848剂型对小鼠乳腺癌模型肿瘤生长的抑制，将4T1细胞接种于BALB/C小鼠腋下，1周后开始尾静脉注射12mg/kg材料1纳米球，每3天给药1次并用游标卡尺量取肿瘤的长径和短径，计算肿瘤体积，注射材料1纳米球组及材料1纳米球包载R848剂型组，肿瘤体积显著小于对照组。
本发明提供了用于络合铜离子的高分子材料，能够通过络合，影响细胞对铜离子的摄取，抑制血管内皮细胞运动和肿瘤血管生成。较已有的肿瘤血管抑制剂具有毒性小，抑制效果强等优点。并且还可以携载免疫激动剂或细胞毒类抗肿瘤药物，将肿瘤血管抑制与肿瘤免疫疗法或者化疗在一个给药系统中联合起来。
附图说明
图1、实施例1中铜离子终产物材料1的1H-NMR图谱。
图2、实施例1中终产物材料1的13C-NMR图谱。
图3、实施例2中材料1及其包载R848纳米球电镜图。
图4、实施例3中材料1、材料2络合铜离子前后紫外吸收光谱。
图5、实施例4中材料1及其包载R848纳米球对划痕实验结果影响图。
图6、实施例5中材料1及其包载R848纳米球对侵袭实验结果影响图。
图7、实施例6中材料1及其包载R848纳米球对HUVEC细胞成管抑制图。
图8、实施例7中肿瘤拍照及生长曲线。
图9、实施例7中CD31免疫组化染色结果。
图10、实施例7中CD8免疫组化染色结果。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，它们只用于对本发明进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整，均属本发明保护范围。
主要试剂及材料来源：
4T1、HUVEC细胞系购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心；DMEM/HIGH GLUCOSE(1X)培养基、胎牛血清购自Thermo Scientific(货号分别为SH30022.01B和SV30087.02)；Transwell小室购自MILLIPORE(货号：PIEP12R48)，Matrigel基质胶购自美国BD公司；24孔板、60mm培养皿均购自Corning；紫杉醇购自大连美仑生物技术有限公司；MTT购自SIGMA；合成相关试剂购自北京百灵威科技有限公司；BALB/C小鼠购自军事医学科学院实验动物中心（许可证号：SCXK（军）2012-0004）；小鼠活体成像系统，IVISSpectrumFMT1000，PerkinElmer。
实施例1：材料1的合成及结构表征。
1）取0.03mmol的聚谷氨酸（γ-PGA，Mw=10万）于60mL水中，加3mmol的Na2CO3，逐滴滴加含有3mmol二碳酸二叔丁酯（Boc）的无水乙醇，冰浴反应24h。反应结束用500mL无水乙醇沉淀，并洗涤，干燥，得到中间产物1，Boc-PGA。
2）取0.003mmol的Boc-PGA溶于2mL水中，加1.8mmol三乙烯四胺（TETA），加1mL含有1.8mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和1.8mmol N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的水溶液，稀盐酸调pH至6.0，室温反应24h；反应结束用40mL丙酮沉淀并洗涤，干燥得中间产物2，Boc-PGA-TETA。
3）取0.003mmol的Boc-PGA-TETA溶于3mL水中，加0.615mmol氢氧化钠搅拌溶解，加0.6mmol CS2，室温搅拌反应12h；用60mL丙酮沉淀并洗涤，干燥得中间产物3，Boc-PGA-TETA-DTC。
4）取0.1mmol聚组氨酸溶于2mL水中，加入0.2mmol EDC和0.2mmol NHS，稀盐酸调pH至6.0，室温活化0.5h；然后逐滴滴加到1mL含有0.003mmol的Boc-PGA-TETA-DTC的水中，室温反应24h；用60mL丙酮沉淀并洗涤，干燥得中间产物4，Boc-PGA-TETA-DTC-HIS。
5）取0.01mmol Boc-PGA-TETA-DTC-HIS于10mL含有20%三氟乙酸的二氯甲烷中，室温搅拌30min，脱去Boc保护基，收集沉淀并干燥，得到终产物材料1。
6）产物结构通过1H-NMR和13C-NMR确证，产率为61.43%。1H-NMR见图1，13C-NMR见图2。
同样操作，将上述实施例中聚谷氨酸改为透明质酸，其它不变，得到材料2。
实施例2：材料1及其包载R848纳米球的制备。
取1mg材料1溶于400μL pH 3.0的甘氨酸-盐酸缓冲液中，加入100μL含有0.4mgR848或不含R848的pH 3.0的甘氨酸-盐酸缓冲液，涡旋溶解后，边搅拌边加到500μL pH7.65的硼酸缓冲液中，终pH 7.2，纳米球结构由透射电镜观察，见图3。
实施例3：紫外吸收检测材料1、材料2对铜离子的络合能力。
取3个5mL离心管，每管加入2mL超纯水，分别加入200μL浓度为500μg/mL的γ-PGA、材料1或材料2溶液，在190nm~400nm波段检测紫外吸收峰。另取3个5mL离心管，每管加入2mL浓度为100μM的CuSO4溶液，分别加入200μL浓度为500μg/mL的γ-PGA、材料1或材料2溶液，在190nm~400nm波段检测紫外吸收峰（U-3310分光光度计，Hitachi High-TechnologiesCorporation，日本东京）。材料1、材料2络合铜离子后紫外吸收峰明显右移，见图4。
实施例4：通过划痕实验检测材料1及其包载R848纳米球对HUVEC内皮细胞迁移的抑制能力。
取对数生长期的HUVEC细胞，以1×106个/3mL铺于6孔板中，12h后每孔分别加150μL含有材料1或其包载R848纳米球的pH 7.6的硼酸缓冲液处理24h。材料1终浓度为50μg/mL，对照组加150μL含pH 7.6的硼酸缓冲液。用200μL枪头在每孔中央做划痕，PBS清洗4次，每孔加入3mL不含胎牛血清的培养基。在倒置显微镜下每3h记录一次细胞移动距离，并拍摄0h及24h的照片。实验结果，实验组细胞愈合划痕的速率明显慢于阴性对照组，说明材料1及其包载R848纳米球显著抑制了HUVEC内皮细胞的迁移能力。实验结果见图5。
实施例5：通过Transwell侵袭实验检测材料1及其包载R848纳米球对HUVEC内皮细胞侵袭的抑制能力。
1）Transwell小室铺胶：Matrigel 4℃冰浴过夜融化，用预冷的无血清DMEM培养基按1:3稀释。Transwell小室放于24孔板中，每个小室加50μL胶液，37℃放置1h，然后加200μL无血清的DMEM培养基静置15min使胶重构，最后吸去培养液待用；
2）取对数生长期的HUVEC细胞，以1×106个/3mL种植于6孔板中，12h后每孔分别加150μL含有材料1或其包载R848纳米球的pH 7.6的硼酸缓冲液处理。材料1终浓度为50μg/mL，对照组加150μL含pH 7.6的硼酸缓冲液。24h后，每组细胞用0.05%胰酶消化，不含血清的DMEM培养基重悬，计数，以2×105个/200μL种于已铺好Matrigel胶的Transwell小室中，小室下方加600μL含有10%胎牛血清的DMEM培养基；
3）24h后，取出小室，用三步染色法对细胞染色，倒置显微镜下观察拍照，在400×下，每个小室选取5个细胞均匀的视野计数；
4）实验结果见图6，加材料1或其包载R848纳米球处理组细胞数明显少于对照组，具有非常显著性差异。结果表明材料1或其包载R848纳米球显著抑制了HUVEC细胞侵袭穿过Matrigel胶的能力。
实施例6：材料1及其包载R848纳米球对HUVEC内皮细胞体外成管的抑制。
1）Matrigel胶4℃融化过夜，用预冷的不含血清的DMEM培养基按1:1稀释，分别加入10μM R848、1μM CuSO4、50μg/mLγ-PGA、50μg/mL材料1或50μg/mL材料1包载R848纳米球，120μL每孔铺于48孔板中，37℃孵育1h使胶凝结备用。
2）取4~8代HUVEC细胞，胰酶消化离心，不含血清的DMEM重悬计数，调整细胞浓度至1×106/mL，用40ng/mL VEGF刺激10min，每孔200μL加到铺好Matrigel胶的48孔板中，放回孵箱继续培养。
3）6h后用倒置显微镜观察成管情况并拍照，每孔随机选取5个视野计数。
4）实验结果见图7，CuSO4组成管数明显多于对照组，R848和γ-PGA组成管数与对照组没有显著性差异，材料1及其包载R848纳米球组成管数显著减少，说明材料1及其包载R848纳米球显著抑制了HUVEC细胞成管能力。
实施例7：通过BALB/c原位乳腺癌模型检测材料1及其包载R848纳米球在体内抑制肿瘤生长和血管生成的能力。
1）小鼠：SPF级BALB/c雌鼠，5周龄，18-22g，每组7只；
2）分组及剂量：对照组，γ-PGA/R848，材料1，材料1/R848。γ-PGA、材料1，12mg/kg；R848，3.5mg/kg。
3）取对数生长期的4T1细胞，用0.05%的胰酶消化1min，1000rpm离心5min，去上清，重悬计数，用生理盐水洗涤3次，并用生理盐水重悬调整浓度至5×106个/mL。于每只小鼠右侧第二对乳房接种0.1mL细胞悬液；
4）接种1周后开始给药，给药方式为尾静脉注射，每次每只200μL，每3天给药1次，并量取肿瘤长径、短径及小鼠体重。
5）接种4周后，小鼠处死，取肿瘤组织进行石蜡包埋切片，以CD31标记肿瘤血管、CD8标记激活的T细胞进行免疫组化染色。以1/2×长径×(短径)2计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。
6）肿瘤拍照及生长曲线见图8，γ-PGA/R848、材料1、材料1/R848组肿瘤生长均受到了不同程度的抑制，其中材料1/R848组抑制最为显著，说明材料1通过包载R848联合肿瘤血管抑制和免疫治疗能够很好的抑制体内肿瘤生长。
7）CD31免疫组化结果见图9，材料1、材料1/R848组肿瘤血管数显著少于对照组和γ-PGA/R848组，说明材料1及其包载R848纳米球在体内显著抑制了肿瘤血管生成。
8）CD8免疫组化结果见图10，γ-PGA/R848、材料1/R848组激活的T细胞显著增多，且材料1/R848组多于γ-PGA/R848组及对照组、材料1组，说明材料1包载R848纳米球在肿瘤微环境激活了杀伤T细胞，成功的将肿瘤血管抑制和免疫治疗联合了起来，并取得了很好治疗的效果。

Claims (5)

1.一种用于络合铜离子的高分子材料，其特征在于该高分子材料的制备方法经过以下的步骤：
1）取0.03mmol的聚谷氨酸γ-PGA，分子量为10万，溶于60mL水中，加3mmol的Na2CO3，逐滴滴加含有3mmol二碳酸二叔丁酯（Boc）的无水乙醇，冰浴反应24h，反应结束用500mL无水乙醇沉淀，并洗涤，干燥，得到中间产物Boc-PGA；
2）取0.003mmol的Boc-PGA溶于2mL水中，加1.8mmol三乙烯四胺（TETA），加1mL含有1.8mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和1.8mmol N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的水溶液，稀盐酸调pH至6.0，室温反应24h；反应结束用40mL丙酮沉淀并洗涤，干燥得中间产物2，Boc-PGA-TETA；
3）取0.003mmol的Boc-PGA-TETA溶于3mL水中，加0.615mmol氢氧化钠搅拌溶解，加0.6mmol CS2，室温搅拌反应12h；用60mL丙酮沉淀并洗涤，干燥得中间产物Boc-PGA-TETA-DTC；
4）取0.1mmol聚组氨酸溶于2mL水中，加入0.2mmol EDC和0.2mmol NHS，稀盐酸调pH至6.0，室温活化0.5h；然后逐滴滴加到1mL含有0.003mmol的Boc-PGA-TETA-DTC的水中，室温反应24h；用60mL丙酮沉淀并洗涤，干燥得中间产物Boc-PGA-TETA-DTC-HIS；
5）取0.01mmol Boc-PGA-TETA-DTC-HIS于10mL含有20%三氟乙酸的二氯甲烷中，室温搅拌30min，脱去Boc保护基，收集沉淀并干燥，得到最终产物。
2.一种用于络合铜离子的高分子材料纳米球的制备方法，其特征在于包括的步骤：
取1mg权利要求1所述的高分子材料溶于400μL pH 3.0的甘氨酸-盐酸缓冲液中，加入100μL含有0.4mg R848的pH 3.0的甘氨酸-盐酸缓冲液，涡旋溶解后，边搅拌边加到500μLpH 7.65的硼酸缓冲液中，终pH 7.2，纳米球结构由透射电镜观察。
3.权利要求1所述的高分子材料用于制备抑制肿瘤转移药物或试剂盒中的用途。
4.按照权利要求3所述的用途，其特征在于用于制备抗肿瘤血管生成药物的用途。
5.按照权利要求3所述的用途，其特征在于用于制备免疫激动剂或细胞毒类抗肿瘤药物。
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