CN113304258B - 一种半抗原多价修饰的天然多糖偶联物及其在免疫治疗的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种半抗原多价修饰的天然多糖及其在免疫治疗的应用,其中所述半抗原结构包括α‑Gal、Rha和DNP,所述天然多糖为对包括肿瘤、细菌、病毒在内的细胞具有靶向性的天然多糖,包括透明质酸。所述天然多糖如透明质酸上至少化学偶联修饰两个半抗原结构如DNP,所得的DNP多价修饰的透明质酸偶联物能够靶向高表达CD44的癌细胞,同时募集体内天然存在的抗DNP抗体,然后通过存在于免疫效应细胞或蛋白质上的Fc受体识别抗体的Fc结构域,激活先天免疫反应消除靶细胞,例如补体依赖性细胞毒性(CDC),抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性吞噬作用(ADCP)。
Description
技术领域
本发明涉及半抗原多价修饰的天然多糖偶联物的制备及其在免疫治疗中的应用,属于靶向药物研制技术领域。
背景技术
在过去的几十年中,癌症免疫疗法取得了很大的进步,例如免疫检查点抑制剂,嵌合抗原受体-T细胞疗法等。相对较新的方法之一是选择性标记靶细胞,募集已有的抗体然后通过存在于免疫效应细胞或蛋白质上的Fc受体识别抗体的Fc结构域,激活多种先天免疫机制可消除靶细胞,例如补体依赖性细胞毒性(CDC),抗体依赖性细胞毒性 (ADCC)和抗体依赖性吞噬作用(ADCP)。最常用的策略是抗体募集分子(ARMs)选择性标记靶细胞表面,并且已经显示出巨大的治疗潜力。
抗体募集分子(ARMs)是合成的双功能分子。它们包括可以与病原体或癌细胞表面相互作用的靶标结合末端(TBT)和作为半抗原的抗体结合末端(ABT)。抗体结合末端(ABT)可以募集抗体并激活免疫反应。最近引入的可被内源性抗体识别的半抗原是一种特别有前途的方法。分析研究已经鉴定出这些丰富的抗体,在人体血液中的比例从 1%到3%。最常用的内源性半抗原包括半乳糖基(1-3)-半乳糖(α-Gal),L-鼠李糖(Rha) 和2,4-二硝基苯酚(DNP)。根据Spiegel小组的研究,人IgG1是诱导Fc介导的先天性免疫杀伤的最有效的同种型,而人体内鼠李糖和DNP的IgG1抗体滴度相对较高,可能具有特殊的治疗意义。此外,在三种主要的半抗原中,DNP在设计抗体募集分子时受到了最多的关注,这可能是由于亲和力成熟的抗DNP抗体的商业可得性。
多价抗体募集是一种相对较新的策略。多价定义为一个实体上的多个配体同时与另一实体上的多个受体结合。与经典ARM相比,由多个ABT和TBT组成的多价抗体募集分子可以更有效地将抗体募集到细胞表面,然后诱导先天免疫应答。例如,De Geest 研究小组证明了含有多个DNP聚合物-脂质缀合物能够高效地锚定到细胞膜上,并以选择性的方式将抗DNP抗体牢固地募集到细胞表面。由多个抗体募集基序组成的聚合构建体的抗体募集效力大大超过了对照单价构建体。
天然多糖是生物体合成的,位于细胞壁、细胞内、细胞间以及分泌质细胞外的生物大分子,是生命活动的必需成分。自然界中广泛存在的透过明质酸、聚唾液酸、壳聚糖和葡聚糖等高分子材料均属于天然多糖。天然多糖在生物体内是生物体结构的组组成部分、能量储存物质、保护物质、调控和修饰蛋白质的结构和功能、细胞之间相互作用与信息传递。
CD44在胰腺癌,肺癌,卵巢癌,乳腺癌,白血病和其他多种癌症中的过表达,使其成为有希望的癌症药物靶点。CD44的一种特定配体是透明质酸(HA),它是一种天然多糖,由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺二糖的重复单元组成。由于其与CD44 的高度特异性识别而被广泛使用。
发明内容
技术问题:
本发明的目的是提供半抗原多价修饰的天然多糖,通过天然多糖上修饰的DNP等半抗原招募体内天然存在的抗DNP等半抗原抗体,激活各种免疫反应消除靶细胞。本发明可以提高募集抗体到靶细胞表面的能力,同时提高免疫激活效果,增强免疫反应。
技术方案:
在本发明中,我们使用DNP修饰HA得到DNP-HA偶联物,其中HA可靶向高表达CD44的肿瘤细胞,偶联物上的DNP抗原招募内源性抗DNP抗体到靶细胞表面,激活各种免疫反应消除靶细胞。与单价的抗体募集分子不同,本发明中的多价DNP-HA可以显著提高募集抗DNP抗体的能力,即可以把更多的抗DNP抗体募集到肿瘤细胞表面,从而显著提高ADCC和CDC免疫活性,达到更有效杀伤肿瘤细胞的目的。同时本发明发现:DNP-HA偶联物的抗肿瘤活性与连接半抗原与HA之间的PEG连接臂长度密切相关。
本发明的一个目的是提供一种半抗原多价修饰的天然多糖偶联物,通过在天然多糖上至少修饰两个半抗原结构获得。
进一步的,所述半抗原结构包括α-Gal、Rha和DNP。
更进一步的,作为优选实施方式,所述半抗原结构为DNP。
进一步的,所述天然多糖为对包括肿瘤、细菌、病毒在内的细胞具有靶向性的天然多糖,包括透明质酸。
进一步的,所述的半抗原通过共价化学键与天然多糖连接,包括半抗原通过酰胺缩合反应与天然多糖的羧基基团偶联。
进一步的,在天然多糖上修饰不同连接臂长度的半抗原结构,所述连接臂为不同长度的PEG结构,长度包括1PEG、3PEG和6PEG。
本发明的另一个目的是提供一种半抗原多价修饰的天然多糖偶联物的缀合物,所述的缀合物是由上述的半抗原修饰的天然多糖偶联物与糖、多肽、核酸、氨基酸或其他小分子化合物制备得到;或者是由上述的半抗原修饰的天然多糖偶联物与目标抗原偶联得到,所述目标抗原包括肿瘤抗原、细菌抗原、病毒抗原、真菌抗原,其中肿瘤抗原包括 GM3、sTn等。
本发明的另一个目的是提供一种免疫原性组合物,包含上述的半抗原多价修饰的天然多糖偶联物的缀合物以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
本发明的另一个目的是提供半抗原多价修饰的天然多糖偶联物,或半抗原多价修饰的天然多糖偶联物的缀合物,或免疫原性组合物,在制备免疫治疗药物中的应用。
有益效果:
与单价的抗体募集分子相比,本发明提供的DNP多价修饰的透明质酸,通过靶向高表达CD44的肿瘤细胞,利用透明质酸上多个DNP抗原来募集人体内天然存在的抗 DNP抗体,从而显著提高各种免疫反应的效率,从而更容易的消除靶细胞。
考虑到内源性抗体在靶向免疫治疗和工业中的广泛应用,该发明可用于构建新的复合物用于免疫治疗制剂的开发,本发明的DNP修饰的透明质酸的偶联物也可应用于治疗癌症的药物中。
附图说明
图1为本发明的方法流程示意图。
图2为HA-[PEGm-DNP]n的合成与结构,n和m为自然数,n表示DNP的个数,m 表示PEG连接臂的长度;其中,化合物1(m=1,n=2,PEG连接臂为1,DNP修饰个数为2);化合物2(m=1,n=4,PEG连接臂为1,DNP修饰个数为4);化合物3(m=1, n=8,PEG连接臂为1,DNP修饰个数为8);化合物4(m=3,n=2,PEG连接臂为3, DNP修饰个数为2);化合物5(m=3,n=4,PEG连接臂为3,DNP修饰个数为4);化合物6(m=3,n=8,PEG连接臂为3,DNP修饰个数为8);化合物7(m=6,n=2,PEG 连接臂为6,DNP修饰个数为2);化合物8(m=6,n=4,PEG连接臂为6,DNP修饰个数为4);化合物9(m=6,n=8,PEG连接臂为6,DNP修饰个数为8)。
图3为化合物1的核磁谱图;
图4为化合物2的核磁谱图;
图5为化合物3的核磁谱图;
图6为化合物4的核磁谱图;
图7为化合物5的核磁谱图;
图8为化合物6的核磁谱图;
图9为化合物7的核磁谱图;
图10为化合物8的核磁谱图;
图11为化合物9的核磁谱图;
图12为免疫荧光分析。分别用PBS,游离HA或HA-[PEGm-DNP]n处理MDA- MB-231细胞。比例尺:20μm。
图13为免疫荧光分析。分别用PBS,游离HA或HA-[PEG1-DNP]2,HA-[PEG1- DNP]4和HA-[PEG1-DNP]8.处理A549细胞。比例尺:20μm。
图14为免疫荧光分析。分别用PBS,游离HA或HA-[PEG3-DNP]2,HA-[PEG3- DNP]4和HA-[PEG3-DNP]8.处理A549细胞。比例尺:20μm。
图15为免疫荧光分析。分别用PBS,游离HA或HA-[PEG6-DNP]2,HA-[PEG6- DNP]4和HA-[PEG6-DNP]8.处理A549细胞。比例尺:20μm。
图16为免疫荧光分析。分别用PBS,游离HA或HA-[PEG1-DNP]2,HA-[PEG1- DNP]4和HA-[PEG1-DNP]8.处理MCF-7细胞。比例尺:20μm。
图17为免疫荧光分析。分别用PBS,游离HA或HA-[PEG3-DNP]2,HA-[PEG3- DNP]4和HA-[PEG3-DNP]8.处理MCF-7细胞。比例尺:20μm。
图18为免疫荧光分析。分别用PBS,游离HA或HA-[PEG6-DNP]2,HA-[PEG6- DNP]4和HA-[PEG6-DNP]8.处理MCF-7细胞。比例尺:20μm。
图19为免疫荧光分析。分别用PBS,游离HA或HA-[PEG1-DNP]2,HA-[PEG1- DNP]4和HA-[PEG1-DNP]8.处理HEK293细胞。比例尺:20μm。
图20为免疫荧光分析。分别用PBS,游离HA或HA-[PEG3-DNP]2,HA-[PEG3- DNP]4和HA-[PEG3-DNP]8.处理HEK293细胞。比例尺:20μm。
图21为免疫荧光分析。分别用PBS,游离HA或HA-[PEG6-DNP]2,HA-[PEG6- DNP]4和HA-[PEG6-DNP]8.处理HEK293细胞。比例尺:20μm。
图22为MDA-MB-231细胞结合和抗体募集的定量流式细胞术分析。
图2 3为A549细胞结合和抗体募集的定量流式细胞术分析。
图24为MCF-7细胞结合和抗体募集的定量流式细胞术分析。
图25为HEK293细胞结合和抗体募集的定量流式细胞术分析。
图26为偶联物1-9的ADCC和CDC分析。
图27为偶联物HA-[PEG3-DNP]8对红细胞完整性分析。
图28为偶联物HA-[PEG3-DNP]8体内免疫治疗实验。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。本发明的技术路线如图1所示。
实施例
根据下述实施例,可以更好的理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1:制备DNP半抗原多价修饰的透明质酸偶联物1-9
化合物10-12是我们先前项目中(Chemical Science 2019,10(40),9331-9338.doi: 10.1039/C9SC03840J)合成出来的化合物。如图2所示HA和DNP-PEG1-NH2或DNP-PEG3-NH2或DNP-PEG6-NH2化学偶联以合成HA-[PEGm-DNP]n。将HA(0.5μmol), EDC(12μmol)和NHS(10μmol)溶解在DMF/蒸馏水(1:1v/v,1ml)中,将DNP- PEGm-NH2(39.5μmol)溶解在DMF(0.5ml)将其逐滴添加至HA溶液中,并将混合物在室温下剧烈搅拌1天,2天或3天。将溶液浓缩,并通过添加丙酮进一步沉淀。将沉淀物过滤并真空干燥。将该粉末溶于水中,用丙酮沉淀,并在真空下干燥。重复该过程三遍以除去任何残留的杂质。
合成物的结构式如图2所示,对应的核磁谱图如图3-11所示,结果表征如下:
表1DNP半抗原多价修饰的透明质酸偶联物1-9的结构
实施例2:偶联物1-9与癌细胞的结合亲和力和特异性评估
免疫荧光分析方案:将MDA-MB-231,A549,MCF-7和HEK-239(阴性对照) 接种在96孔板中,直到达到50-70%融合为止。在存在20μg/mL Alexa 488偶联兔抗 DNP IgG抗体的情况下,将细胞分别与100μL HA(100nM)或HA-[PEGm-DNP]n偶联物(100nM)一起孵育,温度为37℃30分钟。接下来,将细胞用100μL磷酸盐缓冲盐水(DPBS)洗涤3次,并用4%多聚甲醛固定15分钟,然后再次洗涤3次。细胞用5μg/mL的4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色15分钟。之后,将细胞用 100μL的磷酸盐缓冲液(DPBS)洗涤3次,并用荧光显微镜观察。
流式细胞术分析方案:将MDA-MB-231,A549,MCF-7和HEK-293细胞在 DMEM中于37℃孵育1天后,用胰蛋白酶-EDTA消化后收集这些细胞。将细胞(约 4×104)用FACS缓冲液(含1%FBS的PBS)洗涤两次,并与100μL 20nM HA- [PEGm-DNP]n偶联物在4℃温育30分钟。然后,将细胞用FACS缓冲液洗涤,并与 Alexa 488偶联的兔抗DNP IgG抗体(20μg/mL)在4℃下孵育30分钟。最后,将细胞重悬于FACS缓冲液中,并通过Accuri C6流式细胞仪(BDBiosciences)进行测量。在FlowJo软件上分析数据。
为了评估偶联物(1-9)与癌细胞的结合力和特异性,我们选择了三种先前报道的CD44过表达的人类癌细胞系(乳腺癌MDA-MB-231,MCF-7和肺癌细胞A549)。同时,将阴性表达CD44配体的人胚胎肾细胞HEK293用作对照。在将这些细胞与 PBS,100nM HA或HA-[PEGm-DNP]n缀合物以及Alexa Fluor 488标记的抗DNP IgG抗体孵育后,然后使用荧光显微镜对其成像。如图12-21所示,MDA-MB-231细胞显示相对较强的荧光信号,A549细胞显示相对较弱的荧光信号,而对于MCF-7和 HEK293细胞系,在相同条件下几乎无法观察到荧光信号。在MCF-7细胞系中观察到的较低响应可能是由于其CD44表达水平较低。这些结果表明,所有的HA-[PEGm-DNP]n偶联物(1至9)都可以特异性识别并结合MDA-MB-231细胞上表达的 CD44。
接下来,我们使用荧光定量流式细胞仪分析来进一步验证上述结论。图22-25显示了在存在Alexa 488标记的抗DNP IgG抗体的情况下,用偶联物1-9处理后MDA- MB-231,MCF-7和A549细胞以及正常细胞系HEK293的直方图和相应的平均荧光强度。与免疫荧光分析一致,与偶联物一起孵育的MDA-MB-231,A549和MCF-7细胞比HEK293细胞具有更高的MFI值,这表明DNP修饰的HA可以靶向CD44受体并将抗DNP抗体募集到癌细胞表面。值得注意的是,8个取代的DNP偶联物比2和4个取代的偶联物具有更高的MFI值,这表明DNP取代的越多,募集抗体的能力越强。此外,具有PEG3接头长度的缀合物的荧光强度比其他两个长度强,并且HA-[PEG3- DNP]8的MFI值与其他缀合物相比最高(P<0.0001)。
实施例3:HA-[PEGm-DNP]n偶联物诱导的ADCC和CDC的体外评估
抗体依赖介导的细胞毒性实验(ADCC)方案:将MDA-MB-231细胞以5000细胞/孔的浓度接种在96孔板中。在37℃孵育12小时后,将细胞用ADCC缓冲液洗涤,然后用100nM的HA-[PEGm-DNP]n偶联物处理,在兔抗DNP IgG抗体(20μg/mL)存在下于37℃孵育30分钟。通过用ADCC缓冲液洗涤3次除去过量的蛋白质。接下来,将新鲜分离的人外周血单核细胞(PBMC,2×106/mL,100μL)以效应物与靶标 (E/T)之比为15:1添加到每个孔中。孵育4h后,将60μL上清液转移到新的黑色 96孔板上。然后通过使用LDH试剂盒测量490nm波长下LDH的释放来评估细胞毒性。用相同的方法检测效应细胞自发释放的LDH。通过向靶细胞中添加10x裂解液达到最大杀伤力。通过以下方程式计算细胞毒性:
其中A(spontaneous)是效应细胞自发释放的LDH的OD490值;A (experimental)是在抗DNP IgG抗体和PBMC存在下分别用HA-[PEGm-DNP]n缀合物或HA处理的细胞释放的LDH的OD490值;A(maximum)是用1%Triton X-100 完全溶解的细胞的OD490值。
补体依赖介导的细胞毒性实验(CDC)方案:MDA-MB-231细胞在96孔板(8000个细胞/孔)中于37℃过夜生长。通过用DPBS洗涤2次除去旧培养基。100nM与 100μL HA-[PEGm-DNP]n偶联物和1μL抗DNP IgG抗体(2mg/mL)一起在37℃孵育1小时后洗涤细胞,然后与100μL兔补体血清(在DMEM中为1:100)在37℃孵育4小时。使用CCK8测定试剂盒在酶标仪上于450nm波长下测量细胞活力。通过以下方程式计算比细胞毒性:
其中A(negative)为DPBS和抗DNP IgG抗体处理细胞的OD450值,A(experimental)为HA-[PEGm-DNP]n偶联物或HA和抗DNP IgG抗体处理细胞的 OD450值,A(maximum)为1%Triton X-100完全裂解细胞的OD450值。
我们的策略是选择性标记靶细胞,募集预先存在的抗体至靶细胞表面,然后通过免疫效应细胞或蛋白质上存在的Fc受体识别抗体的Fc结构域。因此,我们期望DNP 修饰的HA可以通过募集内源性抗DNP抗体与靶癌细胞结合来触发Fc介导的ADCC 和CDC。为了验证该概念,我们在抗DNP抗体存在的条件下体外评估了偶联物1-9诱导的ADCC。在该实验中,首先将MDA-MB-231细胞与偶联物1-9和抗DNP IgG抗体一起孵育,然后与新鲜分离的健康人外周血单个核细胞(PBMC)共培养。最后,使用商业试剂盒通过乳酸脱氢酶(LDH)测试确定癌细胞凋亡。如图26A所示,在用偶联物1-9处理的组中观察到了明显的癌细胞裂解。在相同条件下,其他组没有明显的细胞裂解。这些结果清楚地表明,HA-[PEG3-DNP]2,HA-[PEG3-DNP]4和HA-[PEG3- DNP]8可以成功结合靶细胞并募集抗DNP IgG抗体来触发ADCC。其中,PEG-1或PEG-6的偶联物显示出较差的ADCC活性,这再次证明了太长或太短的连接子都可能降低细胞结合能力并导致ADCC活性变弱。
接下来,我们还研究了DNP多价修饰的HA共轭物介导CDC的活性。在这些实验中,首先将MDA-MB-231细胞与HA-[PEGm-DNP]n共轭物和抗DNP IgG抗体一起孵育,然后与1:100稀释的兔补体在37℃孵育4h。之后,用市售CCK8试剂盒测量细胞裂解。如图26B所示,在用DNP取代为8个的偶联物治疗的组中观察到了明显的细胞裂解。在相同条件下,其他组均未观察到明显的细胞裂解。值得注意的是,缀合物HA-[PEG3-DNP]8显示出比其他缀合物更好的CDC功效。
实施例4:偶联物HA-[PEG3-DNP]8的体内抗肿瘤功效评估
偶联物HA-[PEG3-DNP]8对红细胞完整性的影响实验方案:
通过分光光度法检查在HA-[PEG3-DNP]8存在下的红细胞溶血程度。将来自 Balb/c小鼠的新鲜收集的血液以2500rpm离心10分钟以去除血清。然后,用生理盐水洗涤3次后分离出红细胞,并在生理盐水中稀释至2%(v/v)。将HA和HA-[PEG3- DNP]8分散在盐溶液中,浓度为1200μg mL-1。盐水和超纯水分别用作阴性和阳性对照。然后,将0.5mL的小鼠红细胞的稀释悬液与0.5mL的上述样品混合。将混合物在 37℃下孵育2小时,并以3000rpm离心10分钟。使用分光光度计测量所得上清液的吸光度(540nm)。所有溶血实验均一式三份进行。使用以下公式计算溶血率(%):
其中A(sample)为HA-[PEGm-DNP]n偶联物或HA处理细胞的OD540值,A(positivecontrol)为水处理细胞的OD540值,A(negative control)为DPBS处理细胞的 OD540值。溶血率低于5%的化合物被视为无毒。在光学显微镜下还观察到沉淀的红细胞的形态,以进一步检查治疗对红细胞完整性的影响。
抗DNP抗体血清的制备方案:
将DNP-OVA偶联物(2mg/mL)和明矾佐剂(1mL)混合以制备乳液。在第 1、7、14和21天,将乳液(100μg DNP-OVA/小鼠/注射液)分别于第1、7、14和21 天皮下注射至5只Balb/c小鼠(雌性,5-6周大)的腹部。在最终加强免疫后一周收集血样,并根据标准规程用于制备抗DNP血清。
偶联物HA-[PEG3-DNP]8体内免疫治疗实验方案:
皮下注射约5×106悬浮于100μL PBS中的MDA-MB-231细胞于15只Balb/c裸鼠(雌性,5-6周大)的侧面。在形成实体瘤(大小为60-70mm3)后,将小鼠随机分为三组。将第1组小鼠用PBS(50μL,静脉注射)和抗DNP小鼠血清(50μL,静脉注射)治疗;第2组小鼠用HA(50μL,静脉注射)和抗DNP小鼠血清(50μL,静脉注射)治疗;第3组小鼠用缀合物HA-[PEG3-DNP]8(50μL,静脉注射)和抗 DNP小鼠血清(50μL,静脉注射)处理。每组给药量为6mg/kg。每周进行3次治疗,共2周。每两天进行一次肿瘤大小和小鼠体重测量。用游标卡尺测量肿瘤大小,并且将肿瘤体积计算为:肿瘤体积=1/2×长度×宽度2。治疗2周后,对小鼠实施安乐死并解剖其肿瘤以测量体重。
我们建立了Balb/c Nude小鼠的模型,并进一步评估了偶联物HA-[PEG3-DNP]8在体内的抗肿瘤功效。选择缀合物HA-[PEG3-DNP]8是因为它在体外显示出比其他偶联物更好的ADCC和CDC活性。首先,用DNP-OVA偶联物免疫一组(五只)正常的Balb/c小鼠3次,以产生抗DNP抗血清。通过ELISA测试的这些抗血清证明含有高滴度的抗DNP抗体。收集小鼠血清,用于提供抗DNP抗体用于癌症免疫治疗。接下来,评估偶联物HA-[PEG3-DNP]8对红细胞的作用。浓度高达1200μg mL-1的HA或 HA-[PEG3-DNP]8对红细胞膜的完整性或溶血没有影响(图27A和B)。实际上,HA- [PEG3-DNP]8的溶血率小于1%(图27C),并且当触发小于5%的溶血率时,静脉注射制剂通常被认为是安全的。最后,我们研究了我们的偶联物HA-[PEG3-DNP]8靶向策略对小鼠模型中肿瘤生长的影响。
图28A显示了每组切除的肿瘤。如图28B所示,与PBS相比,未修饰的HA对肿瘤的发展没有显着影响。由于具有招募抗体和杀死癌细胞的能力,治疗组显示出显著的肿瘤生长抑制作用(p<0.05)。在治疗过程中,偶联物HA-[PEG3-DNP]8治疗的小鼠体重与对照组相当,表明偶联物HA-[PEG3-DNP]8的没有全身毒性图28C)。治疗组的肿瘤生长抑制率为55.3%,而使用HA仅观察到4.6%的抑制(图28D)。图28E 所示的肿瘤重量进一步证实了偶联物HA-[PEG3-DNP]8的显着抗肿瘤作用。
以上实施例1-4展示了DNP多价修饰的透明质酸及其在免疫治疗的应用,其中所述透明质酸上至少化学偶联修饰两个半抗原结构。所得到的DNP多价修饰的透明质酸偶联物能够靶向高表达CD44的癌细胞,同时募集体内天然存在的抗DNP抗体,然后通过存在于免疫效应细胞或蛋白质上的Fc受体识别抗体的Fc结构域,激活先天免疫反应消除靶细胞,例如补体依赖性细胞毒性(CDC),抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性吞噬作用(ADCP)。
实施例5:制备其他半抗原多价修饰的天然多糖偶联物
同实施例1的制备方法,本发明还适用于其他半抗原多价修饰的天然多糖偶联物的制备,其中,半抗原结构包括α-Gal、Rha和DNP,天然多糖为对包括肿瘤、细菌、病毒在内的细胞具有靶向性的天然多糖。具体的半抗原结构和天然多糖的选择示例,及制得的偶联物的特性表征如表2所示。
表2其他半抗原多价修饰的天然多糖偶联物的结构
其中,β-Glucan代表葡聚糖。
从表2可以看出,不同的半抗原结构和天然多糖形成的偶联物,对CDC毒性与实施例1得到的DNP多价修饰的透明质酸的偶联物都具有类似的效果。
综合以上实施例,本发明提出了一种半抗原多价修饰的天然多糖偶联物及其在免疫治疗中的应用,通过在天然多糖如透明质酸上通过共价键至少化学偶联修饰两个半抗原如二硝基苯(DNP)半抗原,使得DNP多价修饰的透明质酸通过靶向高表达 CD44的肿瘤细胞,利用透明质酸上多个DNP抗原来募集人体内天然存在的抗DNP抗体,从而显著提高各种免疫反应的效率,从而更容易的消除靶细胞。同理,本发明的半抗原多价修饰的天然多糖偶联物也可应用于制备免疫治疗的药物中。
此外,本发明实施例获得的半抗原多价修饰的天然多糖偶联物也可应用与制备半抗原多价修饰的天然多糖偶联物的缀合物,具体是由半抗原修饰的天然多糖偶联物与糖、多肽、核酸、氨基酸或其他小分子化合物制备得到;或者是由半抗原修饰的天然多糖偶联物与目标抗原偶联得到,目标抗原包括肿瘤抗原、细菌抗原、病毒抗原、真菌抗原,其中肿瘤抗原包括CD44。
进一步的,上述所得到的半抗原多价修饰的天然多糖偶联物的缀合物以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂,还可以再制备得到相应的免疫原性组合物。
上述获得的半抗原多价修饰的天然多糖偶联物,以及半抗原多价修饰的天然多糖偶联物的缀合物,及免疫原性组合物,都可以应用于制备免疫治疗药物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种半抗原多价修饰的天然多糖偶联物,其特征在于,通过在天然多糖上通过连接臂至少修饰两个半抗原结构获得,所述连接臂为不同长度的PEG结构,长度包括1PEG、3PEG和6PEG,所述偶联物为以下任意一种:
所述半抗原结构为DNP,所述天然多糖为透明质酸HA,并满足结构式为HA-[PEGm-DNP]n,其中,m=1或3或6,n=2或4或8,或
β-Glucan-[PEG3-α-Gla]2,或
β-Glucan-[PEG3-Rha]4,或
HA-[PEG3-α-Gla]8,或
HA-[PEG3-Rha]2。
2.根据权利要求1所述的半抗原多价修饰的天然多糖偶联物,其特征在于,所述的半抗原通过共价化学键与天然多糖连接,包括半抗原通过酰胺缩合反应与天然多糖的羧基基团偶联。
3.一种半抗原多价修饰的天然多糖偶联物的缀合物,其特征在于,所述的缀合物是由权利要求1-2任意一项所述的半抗原修饰的天然多糖偶联物与糖、多肽、核酸、氨基酸或其他小分子化合物制备得到。
4.一种半抗原多价修饰的天然多糖偶联物的缀合物,其特征在于,所述的缀合物是由权利要求1-2任意一项所述的半抗原修饰的天然多糖偶联物与目标抗原偶联得到。
5.一种免疫原性组合物,其特征在于,包含权利要求3或4所述的半抗原多价修饰的天然多糖偶联物的缀合物以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
6.一种半抗原多价修饰的天然多糖偶联物在制备免疫治疗药物中的应用,所述半抗原多价修饰的天然多糖偶联物包括以下任意一种:
所述半抗原结构为DNP,所述天然多糖为透明质酸HA,并满足结构式为HA-[PEGm-DNP]n,其中,m=1或3或6,n=2或4或8,且m 、n 满足:当m=1时,n=8;或m=3时,n=2或4或8;或m=6时,n= 4或8,或
β-Glucan-[PEG3-α-Gla]2,或
β-Glucan-[PEG3-Rha]4,或
HA-[PEG3-α-Gla]8,或
HA-[PEG3-Rha]2。
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