CN112089832A - 一种半抗原修饰的载体蛋白及其在制备疫苗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种半抗原修饰的载体蛋白及其在制备疫苗中的应用，其中所述载体蛋白上至少化学偶联修饰一个半抗原结构，其中所述半抗原结构选自鼠李糖(Rha)、二硝基苯(DNP)、galactose‑α‑1,3‑galactose(αGal)和磷酰胆碱(PC)其中一种，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、白喉类毒素、白喉毒素的无毒突变体、破伤风类毒素、锁孔血蓝蛋白、细菌表达的蛋白其中一种或两种以上形成的融合蛋白，所述载体蛋白与半抗原结构相互反应，形成共价键。本发明所述的半抗原修饰载体蛋白能够被体内天然存在的抗体识别并结合，形成复合物，促进抗原呈递细胞的吞噬、处理和呈递，从而有效提高疫苗分子的免疫原性，提高抗原相关的免疫反应。

Description

一种半抗原修饰的载体蛋白及其在制备疫苗中的应用

技术领域

本发明涉及一种半抗原修饰的载体蛋白的制备及其在制备疫苗中的应用，属于疫苗研制技术领域。

背景技术

在癌细胞表面过度表达的异常聚糖，即肿瘤相关糖抗原(TACAs)，是开发抗癌疫苗的诱人靶点，糖抗原通常是不依赖于T细胞的抗原，其免疫原性较低，不能诱导抗体亲和力成熟和免疫记忆。为了克服这一障碍，传统的策略是将糖抗原与提供T细胞表位的载体蛋白结合，使TACA由抗原提呈细胞(APCs)摄取，并由MHCII复合物与载体表位一起呈递给辅助性T细胞。因此，诱导的Th细胞可引发较好的B细胞反应，并可显著提高糖抗原的免疫原性。例如，sTn(Neu5Ac-α2，6-GalNAc-α-O-Ser/Thr)抗原与锁孔血蓝蛋白(KLH)结合作为疫苗疗法，在临床试验中，Globo-H与KLH或白喉毒素突变体(CRM197)偶联，并在临床试验中显示出有效性。

虽然基于TACA的糖复合物疫苗已经取得了很大的成功，但人们经常观察到，对载体蛋白的免疫应答很强，而对糖类抗原则没有。载体蛋白中存在的大量肽表位可能与糖抗原竞争有限数量的辅助性T细胞和B细胞，导致不希望的激活或分化信号以及抑制对糖抗原的免疫反应。此外，临床上只有少数载体蛋白被批准用于疫苗工业，同一载体用于不同的疫苗中，可能会造成疫苗干扰，进而导致针对糖抗原的免疫抑制。因此，需要新的载体构建疫苗。

内源性抗体是人体血清中天然存在的抗体。分析研究已经在人类血液中发现了几种含量从1％到3％不等的抗体，如抗半乳糖α-(1,3)-半乳糖(galactose-α-1,3-galactose，α-Gal)、抗-2，4二硝基苯基(DNP)和抗鼠李糖(Rha)抗体等。已经证明，含有上述半抗原之一的疫苗构建物可在体内形成原位免疫复合物，并通过内源性抗体Fc部分与APCs上的Fc受体结合，选择性地将抗原传递给APCs，导致有效的内化并增强细胞和体液免疫反应。例如，Galili及其同事发起的研究表明，α-Gal表位可显著增强肿瘤细胞、HIV和流感疫苗的免疫原性。

发明内容

技术问题：

本发明的目的是提供一种半抗原修饰的载体蛋白，用于偶联肿瘤抗原、细菌抗原、病毒抗原、真菌抗原等制备疫苗，通过载体蛋白上修饰的半抗原招募体内天然存在的抗体形成免疫复合物，从而增强抗原呈递细胞的吞噬、处理和提呈，进而提高免疫反应的效果。本发明可以提高免疫系统对外源性抗原的免疫反应，同时降低对载体蛋白的反应，并可避免相同载体蛋白之间的相互干扰问题。

技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种半抗原修饰的载体蛋白，该半抗原修饰的载体蛋白上至少修饰有一个半抗原结构，所述半抗原结构包括二硝基苯(DNP)、半乳糖α-(1,3)-半乳糖(αGal)、鼠李糖(Rha)和磷酰胆碱(PC)等。

进一步的，作为优选实施例，所述的载体蛋白选自牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA)、白喉类毒素、白喉毒素的无毒突变体CRM197、破伤风类毒素、钥孔血蓝蛋白(KLH)、细菌表达的蛋白中的一种或两种以上形成的融合蛋白。

进一步的，作为优选实施例，所述的半抗原结构通过酰胺缩合反应偶联至载体蛋白的氨基或羧基基团。

本发明的另一个目的是提供一种半抗原修饰的载体蛋白的偶联物，该偶联物由所述的半抗原修饰的载体蛋白与糖、多肽、核酸、氨基酸或其他小分子化合物偶联制备得到。

进一步的，作为优选实施例，所述的偶联物为由半抗原修饰的载体蛋白与目标抗原偶联得到的缀合物，其中目标抗原包括肿瘤抗原、细菌抗原、病毒抗原、真菌抗原。

进一步的，作为优选实施例，所述目标抗原为肿瘤抗原中的肿瘤相关糖抗原，包括：糖蛋白，如Thompson-Freidenreich抗原(TF)，黏蛋白关联Tn抗原(Tn)，唾液酸Tn抗原(sialyl Tn，sTn)；中性糖脂和糖蛋白，如Globo H；神经节苷脂，如GM2，GM3，GD2，GD3；黏蛋白1(mucin 1，MUC 1)及MUC1的衍生物。

本发明的另一个目的是提供一种免疫原性组合物，其中包含所述的半抗原修饰的载体蛋白的偶联物以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。

本发明的另一个目的是还提供了所述的半抗原修饰的载体蛋白，或半抗原修饰的载体蛋白的偶联物，或包含所述的半抗原修饰的载体蛋白的偶联物的免疫原性组合物在制备疫苗方面中的应用。

本发明的另一个目的是提供了所述半抗原修饰的载体蛋白的偶联物在制备预防或治疗癌症的药物中的应用。

有益效果：

与传统的载体蛋白相比，本发明提供的半抗原修饰的载体蛋白，能够通过与人体内天然存在的抗体相互作用，促进抗原呈递细胞的摄取、处理和呈递，从而显著提高免疫系统对载体蛋白上缀合的外源性抗原的免疫反应，同时能够降低免疫系统对载体蛋白的免疫反应。本发明的半抗原修饰的载体蛋白在疫苗构建中的应用，不仅增强了对缀合的外源性抗原的免疫反应，还能缩短免疫反应时间，减少免疫次数。这一策略提供了一种简单而有效的方法来增强载体蛋白在构建疫苗时的效果，且可以对现有的常用的载体蛋白进行合理的改造，从而获得更多的可以用于疫苗制备的载体蛋白，更进一步地可以避开相同载体蛋白之间的相互干扰的问题。考虑到糖类抗原在疫苗研究和工业中的广泛应用，该发明可用于构建新的糖复合物用于疫苗开发，本发明的半抗原修饰的载体蛋白的偶联物也可应用于制备预防或治疗癌症的药物中。

附图说明

图1为STn-BSA-Rha疫苗构建体的设计与结构，CP表示载体蛋白，n和m为自然数，表示半抗原的个数；其中，化合物1(CP＝BSA,sTn-BSA-Rha-0.5,其中含sTn 7.8％w/w,Rha0.5％w/w)；化合物2(CP＝BSA,sTn-BSA-Rha-1,其中含sTn 7.8％w/w,Rha 1％w/w)；化合物3(CP＝BSA,sTn-BSA-Rha-2.8,其中含sTn 7.8％w/w,Rha 2.8％w/w)；化合物4(CP＝BSA,sTn-BSA,其中含sTn 7.8％w/w,Rha 0％w/w)；化合物5(CP＝HSA,sTn-HSA,其中含sTn8.3％w/w,Rha 0％w/w)。

图2为化合物的合成过程方法：(a)戊二酸二琥珀酸酯，DMF：PBS(4:1)，rt；(b)BSA/HSA，PBS，rt；(c)Ac₂O，吡啶，rt；(d)叠氮三甘醇，BF₃·Et₂O，CH₂Cl₂，rt，68％；(e)MeONa，MeOH；(f)10％Pd/c，H₂，MeOH，rt；(g)戊二酸二琥珀酸酯，DMF:PBS(4:1)，rt；(h)4，PBS，rt。

图3为化合物6的核磁谱图。

图4为采用MALDI-TOF-MS法测定sTn-BSA的分子量。

图5为采用MALDI-TOF-MS法测定sTn-HSA的分子量。

图6为化合物12的核磁谱图。

图7为采用MALDI-TOF-MS法测定sTn-BSA-Rha-0.5(1)的分子量。

图8为采用MALDI-TOF-MS法测定sTn-BSA-Rha-1(2)的分子量。

图9为采用MALDI-TOF-MS法测定sTn-BSA-Rha-2.8(3)的分子量。

图10为在接种Rha-OVA后第21天，收集5-7组小鼠抗血清中Rha特异性抗体的平均滴度。每个样本显示了三个平行实验的抗体滴度的平均值，误差条显示了三个平行实验的标准差。

图11为人工合成疫苗的免疫学评价：(A)第28天各组抗体滴度，结合物5作为包衣抗原检测sTn特异性抗体；(B)分别于第0、14、21和28天收集第1-7组小鼠血清中sTn特异性总抗体的平均滴度；(C)第1、4和7组混合抗血清中BSA特异性和sTn特异性抗体的评估；(D)结合疫苗的抗体同型和亚型。每个样本显示三个平行实验的抗体滴度平均值，误差条表示三个重复实验的标准误差(*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.005)。

图12为抗Rha抗体的评价：(A)第2-4组小鼠第0、14、21和28天抗血清中的Rha特异性抗体；(B)第5-7组小鼠第0、14、21和28天抗血清中的Rha特异性抗体。每个样本显示了三个平行实验的抗体滴度的平均值，误差条显示了三个平行实验的标准差。

图13为人工合成疫苗的免疫学评价：(A)用流式细胞仪分析第1、4、7组抗血清与MCF-7细胞的结合；(B)用CCK-8法测定各组抗血清的CDC活性。误差条代表三个平行实验的标准差。

图14为二硝基苯修饰的人血清白蛋白偶联GM3(DNP-HSA-GM3)引起的GM3特异性抗体滴度分布。

图15为αGal修饰的载体蛋白卵清蛋白OVA偶联MUC1(αGal-OVA-MUC1)引起的MUC1特异性抗体滴度分布。

图16为PC修饰的载体蛋白钥孔血蓝蛋白KLH偶联GM2形成PC-KLH-GM2引起的GM2特异性抗体滴度分布。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。

实施例

根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

对于以下实施例，需要提前说明的是，本发明的方法是先在载体蛋白上修饰上至少一个半抗原结构，形成半抗原结构修饰的载体蛋白，如BSA+Rha→BSA-Rha；得到的半抗原结构修饰的载体蛋白再与目标抗原偶联，得到偶联物，如BSA-Rha+sTn→BSA-Rha-sTn。但是合成过程中，本实验设计为先将载体蛋白与目标抗原如sTn偶联，成为相同载量的偶联物，再分成几份，分别修饰不同量的半抗原如Rha,以确保目标抗原sTn的量是一致的，这样便于比较不同量的半抗原对偶联物的影响。

实施例1：制备L-鼠李糖Rha修饰的载体蛋白BSA及其偶联抗原sTn缀合物

载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)，半抗原结构为L-鼠李糖8(Rha)，目标抗原为唾液酸Tn抗原(sialyl Tn，sTn)。

1.1：sTn和Rha衍生物的合成及其与BSA的偶联反应

本发明参照文献方法(Org.Biomol.Chem.,2014,12,3238，DOI:10.1039/c4ob00390j)，合成了在还原端带有乙胺的sTn抗原(化合物6)，如图3所示。然后通过双功能戊二酸酯法将sTn抗原与牛血清白蛋白BSA结合，这是我们先前项目中(Org.Biomol.Chem.,2014,12,3238，DOI:10.1039/c4ob00390j)使用的一种成熟方法，不会影响共轭物。化合物6与大量过量(15当量)的戊二酸二琥珀酸酯(DSG)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中反应得到相应的单酯7，通过反复沉淀使其简单纯化以除去过量的DSG。然后，将单酯7与BSA或HSA在PBS缓冲液中混合生成共轭sTn-BSA偶联物4或sTn-HSA偶联物5，用离心过滤装置(MW截止值：10kda)纯化，去除多余的单酯7和其它小分子(反应过程如图2所示)。通过MALDI-TOF-MS测定偶联物4和偶联物5中的sTn抗原负载量，分别为7.8％和8.3％(图4，图5)，表明偶联反应是成功的，抗原装载量水平适合于生物学研究。

从L-鼠李糖8开始合成Rha半抗原。首先将鼠李糖8过乙酰化得到化合物9，然后在BF₃·Et₂O、CH₂Cl₂存在下与叠氮三甘醇进行糖基化反应得到化合物10。在Zemplén酯交换条件下，除去乙酰基，然后加氢还原叠氮基，得到了还原端带有胺基的化合物12(图6)，经DSG转化为单酯13。最后，将sTn-BSA偶联物4与当量比为1：150、1:300和1：500的量的单酯13分别在PBS缓冲液(pH＝7.4)中孵育，得到sTn-BSA-Rha缀合物1、2和3。通过MALDI-TOF-MS测定共轭缀合物1-3中Rha半抗原的负载量，其分别为0.5％、1％和2.8％(图7，图8，图9)，因此，后续的实验中将该三组命名为sTn-BSA-Rha-0.5、sTn-BSA-Rha-1、sTn-BSA-Rha-2.8。sTn-BSA-Rha(缀合物1-3)中Rha含量由低到高有助于揭示抗Rha抗体介导的抗sTn疫苗接种的能力。

合成物的结构式如图1所示，结果表征如下：

缀合物1CP＝BSA sTn-BSA-Rha-0.5 (sTn loading＝7.8％，Rha loading＝0.5％)

缀合物2CP＝BSA sTn-BSA-Rha-1 (sTn loading＝7.8％，Rha loading＝1％)

缀合物3CP＝BSA sTn-BSA-Rha-2.8 (sTn loading＝7.8％，Rha loading＝2.8％)

化合物4CP＝BSA sTn-BSA (sTn loading＝7.8％，Rha loading＝0％)

化合物5CP＝HSA sTn-HSA (sTn loading＝8.3％，Rha loading＝0％)

1.2：疫苗偶联物的免疫活性

七组小鼠C57BL/6J(雌，6周龄)(第1-7组)进行这些研究，实验设置如下：

第1组：用不含Rha的sTn-BSA结合物4免疫；

第2-4组：分别用sTn-BSA-Rha(1-3)免疫；

第5-7组：用Rha-OVA预免疫，然后分别用sTn-BSA-Rha(1-3)免疫。

早期研究已证明(J Am Chem Soc.2010；132(48):17236-46.doi:10.1021/ja107029z)，实验室小鼠不含有显著滴度的天然抗-Rha抗体。因此，我们用Rha-OVA对第5-7组小鼠进行预免疫，以建立高水平的抗Rha抗体，这些抗体被认为是内源性抗体。预免疫方法为：将Rha-OVA(每只小鼠每次3μg糖分)溶解在0.3ml 10×磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液中，然后稀释至1.25ml 1×PBS溶液。将溶液与1.25ml弗氏完全佐剂(1:1，v/v)混合，并根据制造商的方案形成乳液。每组5只雌性C57BL/6小鼠在第1天通过肌肉注射0.1ml上述制备的结合疫苗和弗氏完全佐剂的乳剂进行免疫。在初次免疫后，在第7天、第14天和第21天，通过皮下注射相同的结合物乳剂使小鼠增强3次。在第0天初次免疫前和免疫后第7天、第14天、第21天和第28天通过腿部静脉采集每只小鼠的血样。从血样中提取的抗血清在-80℃保存后使用。抗体滴度显示(图10)，在用Rha-OVA免疫后，Rha特异性的抗体具有很高的滴度。

在第5-7组小鼠血清中检测到抗体(约20万)。之后，在第1天分别用sTn-BSA-Rha缀合物1-3免疫第5-7组小鼠，并在第7、14和21天增强。第一次免疫后第7、14、21、28天采集小鼠血样。用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体。通过对OD值与血清稀释值曲线的回归分析，将抗体滴度设定为在光密度(OD)415nm达到0.2时的稀释因子。

酶联免疫吸附试验方案：将100μl sTn-HSA或Rha-HSA(2μg/ml)溶解在涂层缓冲液(0.1M碳酸氢盐，pH 9.6)中的溶液在4℃下处理每孔ELISA平板，然后在37℃下处理1h，然后用含0.05％吐温-20(PBST)的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，用PBST洗涤3次后，在r.t.中用封闭缓冲液(明胶封闭缓冲液)处理1h，将混合或单个小鼠抗血清(PBS中1:300至1:656100的连续半对数稀释液)添加到涂有ELISA平板(100μL/孔)中，然后在37℃下孵育2小时。然后用PBST清洗平板，并在r.t.下用1:2500稀释的碱性磷酸酶(AP)溶液孵育1小时山羊抗鼠IgG或IgM抗体(100μL/孔)。最后，用PBST洗涤这些板，并用100μL对硝基苯磷酸盐(PNPP)溶液(缓冲液中1.67mg/mL)在室温下显影30分钟，然后在415nm波长下使用iMark微孔板阅读器进行比色读数。根据抗血清稀释值的对数标度绘制光密度(OD)值，得到最佳拟合线。用直线方程计算稀释值，此时OD为0.2，抗体效价在稀释值的倒数处计算。

图11A总结了7组第28天抗血清的ELISA结果结果如表1所示。

第1组用不含Rha的sTn-BSA结合物4免疫，产生的sTn特异性抗体最低(约534)。

第2-4组用sTn-BSA-Rha(1-3)免疫，获得了显著的高效价的抗sTn特异性抗体，分别为10809、19491和22685，与第1组相比，诱导的抗体至少提高了约20倍，最高达约40倍。

第5-7组用Rha-OVA预免疫，然后用sTn-BSA-Rha(1-3)免疫，产生的抗sTn特异性抗体显著增高，分别为23901、29501和34306，与第1组相比，抗sTn抗体的产生分别提高了45、55和64倍。

表1疫苗偶联物的免疫活性结果比较

组别	预免疫	免疫物	第28天抗血清的ELISA结果
				1	/	sTn-BSA	534
2	/	sTn-BSA-Rha-0.5	10809
				3	/	sTn-BSA-Rha-1	19491
4	/	sTn-BSA-Rha-2.8	22685
				5	Rha-OVA	sTn-BSA-Rha-0.5	23901
6	Rha-OVA	sTn-BSA-Rha-1	29501
				7	Rha-OVA	sTn-BSA-Rha-2.8	34306

这些结果表明，小鼠血清中预先存在的内源性抗Rha抗体可以靶向APC细胞传递糖缀合物(1-3)，从而实现更有效的转运和内化以及整体免疫应答。值得注意的是，抗sTn滴度与糖缀合物中Rha的负荷水平密切相关(第2-4组和第5-7组)。Rha半抗原在疫苗上的结合不抑制sTn的免疫原性。相比之下，在抗Rha抗体存在的情况下，疫苗中Rha的高负荷通常会导致sTn抗原的更好吸收，并能够产生更多的抗sTn特异性抗体。

我们还分析了第2-4组和第5-7组抗sTn和抗Rha特异性免疫反应的进展。如图11B和图12A所示，第2-4组小鼠在第21天产生低滴度的抗sTn特异性抗体和相对较高的抗-Rha抗体。然而，抗sTn和抗Rha特异性抗体在第28天显著升高。这一有趣的发现表明，sTn-BSA-Rha疫苗，特别是针对高负荷Rha缀合物3的疫苗，在免疫后期可能具有自佐剂效应，这可能是由于抗Rha抗体介导的抗原摄取机制。而5-7组在接种期间抗Rha抗体的滴度较高(图12B)。因此，在内源性抗Rha抗体的帮助下，可以激发更快的抗sTn免疫反应(图11B)，例如，第21天第5-7组的抗sTn特异性抗体与第28天的第2-4组相似。

用ELISA法检测第1、4、7组的抗BSA和抗sTn特异性抗体。结果发现，第4组和第7组产生的抗sTn特异性抗体显著高于BSA特异性抗体(图11C)。这一结果表明，BSA免疫原性弱，与其他常用的TACAs疫苗设计不同，该疫苗采用KLH等强免疫原性载体蛋白，以抗载体蛋白免疫应答为主。此外，值得注意的是，在内源性Rha抗体的帮助下，抗sTn的免疫应答增强而不受抑制，甚至使用弱免疫原性载体蛋白。这一结果启发了我们，利用半抗原修饰策略，具有低免疫刺激能力的载体蛋白有望在未来的糖类疫苗中得到应用。

第1、4、7组检测到抗体的同型和亚型。IgG1和IgG2b是第4组和第7组的主要亚型，这表明Rha修饰的BSA载体蛋白成功地激发了T细胞免疫(图11D)。

1.3：疫苗偶联物的抗体介导的补体依赖细胞毒性实验(CDC)

分别用第1、4、7组免疫小鼠收集的抗血清与人乳腺癌细胞MCF-7共孵育。荧光二抗体标记后，流式细胞仪检测细胞样本。我们还检测了抗体介导的CDC的活性。为此，首先将MCF-7细胞与第1、4和7组的血清在1/100的稀释液中培养1小时，然后用1:100稀释兔血清(作为补体来源)在37℃孵育4h，然后用市售CCK8试剂盒检测细胞裂解。

FACS分析方案：MCF-7细胞在DMEM中37℃孵育2天后，经胰蛋白酶EDTA消化后获得细胞。细胞(约5×10⁵)用FACS缓冲液(含1％FBS的PBS)洗涤两次，于第0天或第28天采集的100μL正常小鼠血清(在FACS缓冲液中稀释1:10)在4℃下孵育30min，然后用FACS缓冲液洗涤细胞，4℃下与FITC结合的山羊抗鼠抗体孵育30min，将细胞重新悬浮在FACS缓冲液中，用Accuri C6流式细胞仪(BD Biosciences)进行检测。数据在FlowJo软件上进行分析。

补体依赖性细胞毒性(CDC)试验：MCF-7细胞在37℃下于96孔板(8000个/孔)中培养过夜。用DPBS洗涤2次，去除旧培养基。用100μL抗血清(1:10DMEM稀释液)37℃孵育1h后，洗涤细胞，用100μL兔补体血清(DMEM中1:100)孵育4h，用CCK8试剂盒在450nm波长下测定细胞活力。具体细胞毒性通过以下公式计算：

％CDC＝1-(A(实验)-A(阳性对照))/(A(阴性对照)-A(阳性对照))。

其中A(实验)镖师对照孔或实验孔的吸光值，A(阴性对照)表示空白孔的吸光值，A(阳性对照)表示最大释放孔的吸光值

图13A显示第4组和第7组诱导的抗血清能够成功识别MCF-7上表达的sTn结构。如图13B所示，来自第7组的血清触发了最强的CDC细胞毒性来杀死癌细胞。这种活性主要归因于第7组产生的抗sTn抗体最高。

实施例2：二硝基苯DNP修饰的载体蛋白人血清白蛋白HSA

半抗原结构选择二硝基苯DNP，采用与实施例1相同的方法，通过酰胺缩合反应偶联至载体蛋白人血清白蛋白HSA，形成二硝基苯偶联物。并采用与实施例1相同的方法，与肿瘤相关糖抗原GM3进行偶联，得到化合物DNP-HSA-GM3。通过上述1.2的方法测定疫苗偶联物的免疫活性，结果如图14所示，偶联物DNP-HSA-GM3能够激起高水平的IgG1抗体滴度，以及较高水平的IgG2b抗体滴度。说明二硝基苯DNP修饰的载体蛋白HSA具有较强的免疫激活能力，能够成功地获得高滴度的GM3特异性的抗体。

实施例3：半乳糖α-(1,3)-半乳糖αGal修饰的载体蛋白卵清蛋白OVA

半抗原结构选择半乳糖α-(1,3)-半乳糖αGal，采用与实施例1相同的方法，通过酰胺缩合反应偶联至载体蛋白卵清蛋白OVA，并与MUC1多肽偶联形成αGal-OVA-MUC1偶联物。通过上述1.2的方法测定疫苗偶联物的免疫活性，结果如图15所示，αGal-OVA-MUC1偶联物激起了强烈的MUC1特异性免疫反应，且其中IgG1的抗体滴度较高，其次为IgG2b的抗体滴度，说明该αGal修饰的载体蛋白具有较强的免疫刺激能力，且获得较高滴度的MUC1特异性抗体。

实施例4：磷酰胆碱修饰的载体蛋白钥孔血蓝蛋白KLH

半抗原结构选择磷酰胆碱PC，采用与实施例1相同的方法，通过酰胺缩合反应偶联至载体蛋白钥孔血蓝蛋白KLH，并与GM2形成PC-KLH-GM2偶联物。通过上述1.2的方法测定疫苗偶联物的免疫活性，结果如图16所示，该偶联物激起了强烈的GM2特异性抗体，且含有高滴度的IgG1,IgG2b和一定量的IgG3、IgM,说明该PC修饰的载体蛋白具有强烈的免疫刺激能力，能够获得高滴度的GM2特异性抗体。

综合以上实施例，本发明提出了一种半抗原修饰的载体蛋白的制备及其在制备疫苗中的应用，通过在载体蛋白上通过共价键至少化学偶联修饰一个包括鼠李糖半抗原(Rha)、二硝基苯(DNP)、半乳糖α-(1,3)-半乳糖(αGal)和磷酰胆碱(PC)等在内的半抗原，使得半抗原修饰载体蛋白能够被体内天然存在的抗体识别并结合，形成复合物，促进抗原呈递细胞的吞噬、处理和呈递，从而有效提高疫苗分子的免疫原性，提高抗原相关的免疫反应。同理，本发明的半抗原修饰的载体蛋白的偶联物也可应用于制备预防或治疗癌症的药物中。

本发明中，我们探索了一种半抗原修饰的载体蛋白新策略，通过其上的半抗原招募内源性抗体来提高免疫效果。与传统的高免疫原性载体蛋白不同，本发明可以显著提高低免疫原性的载体蛋白的免疫激活效果，且同时降低免疫系统对载体蛋白本身的免疫反应，从而提高特异性针对其上偶联的外源性抗原(例如肿瘤相关糖抗原、细菌糖抗原等)的免疫反应。这一策略提供了一种简单而有效的方法来增强载体蛋白在构建疫苗时的效果，且可以对现有的常用的载体蛋白进行合理的改造，从而获得更多的可以用于疫苗制备的载体蛋白，更进一步地可以避开相同载体蛋白之间的相互干扰的问题。考虑到糖类抗原在疫苗研究和工业中的广泛应用，该发明可用于构建新的糖复合物用于疫苗开发。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种半抗原修饰的载体蛋白，其特征在于，在载体蛋白上至少修饰一个半抗原结构，所述半抗原结构包括二硝基苯、抗半乳糖α-(1,3)-半乳糖、鼠李糖和磷酰胆碱。

2.根据权利要求1所述的一种半抗原修饰的载体蛋白，其特征在于，所述的载体蛋白选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、白喉类毒素、白喉毒素的无毒突变体CRM197、破伤风类毒素、钥孔血蓝蛋白、细菌表达的蛋白中任意一种或两种以上形成的融合蛋白。

3.根据权利要求1所述的一种半抗原修饰的载体蛋白，其特征在于，所述的半抗原结构通过酰胺缩合反应偶联至载体蛋白的氨基或羧基基团。

4.一种半抗原修饰的载体蛋白的偶联物，其特征在于，所述的偶联物由权利要求1-3任意一项所述的半抗原修饰的载体蛋白与糖、多肽、核酸、氨基酸或其他小分子化合物制备得到。

5.如权利要求4所述的半抗原修饰的载体蛋白的偶联物，其特征在于，由所述的半抗原修饰的载体蛋白与目标抗原偶联得到的偶联物，其中目标抗原包括肿瘤抗原、细菌抗原、病毒抗原、真菌抗原。

6.如权利要求5所述的半抗原修饰的载体蛋白的偶联物，其特征在于，所述目标抗原为肿瘤抗原，优选的，所述目标抗原选自肿瘤相关糖抗原，包括：TF,Tn，sTn,GloboH,GM2,GM3,GD2，GD3，MUC1及MUC1的衍生物。

7.一种免疫原性组合物，其特征在于，其中包含权利要求4-6中任意一项所述的半抗原修饰的载体蛋白的偶联物以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。

8.如权利要求1-3任意一项所述的半抗原修饰的载体蛋白，或权利要求4-6任意一项所述的半抗原修饰的载体蛋白的偶联物，或权利要求7所述的免疫原性组合物在制备疫苗中的应用。

9.权利要求5-7任一项所述偶联物在制备预防或治疗癌症的药物中的应用。

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