CN114042170A - 一种基于主客体自组装的载体蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于主客体自组装的载体蛋白及其在疫苗中的应用，其中所述载体蛋白上至少化学偶联修饰一个金刚烷结构，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、白喉类毒素、白喉毒素的无毒突变体、破伤风类毒素、锁孔血蓝蛋白、细菌表达的蛋白中一种或两种以上形成的融合蛋白，所述金刚烷修饰的载体蛋白与beta‑环糊精及其衍生物(beta‑环糊精‑鼠李糖)形成主客体自组装结构。本发明所述的主客体自组装的载体蛋白能够促进抗原呈递细胞的吞噬、处理和呈递，从而有效提高疫苗分子的免疫原性，提高抗原相关的免疫反应。本发明不仅增强了对缀合的外源性抗原的免疫反应，还能缩短免疫反应时间，减少免疫次数。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗研制技术领域，具体涉及所述的一种基于主客体自组装的载体蛋白及其应用。
背景技术
在开发肿瘤相关糖抗原疫苗的过程中，人们经常观察到，对载体蛋白的免疫应答很强，而对糖类抗原则没有。载体蛋白中存在的大量肽表位可能与糖抗原竞争有限数量的辅助性T细胞和B细胞，导致不希望的激活或分化信号以及抑制对糖抗原的免疫反应。此外，临床上只有少数载体蛋白被批准用于疫苗工业，同一载体用于不同的疫苗中，可能会造成疫苗干扰，进而导致针对糖抗原的免疫抑制。
因此，需要新的载体构建疫苗。
发明内容
本发明的目的是提供所述的基于主客体自组装的载体蛋白，用于偶联肿瘤抗原、细菌抗原、病毒抗原、真菌抗原等制备疫苗，通过载体蛋白上主客体自组装的环糊精衍生物增强抗原呈递细胞的吞噬、处理和提呈，进而提高免疫反应的效果。本发明可以提高免疫系统对外源性抗原的免疫反应，同时降低对载体蛋白的反应，并可避免相同载体蛋白之间的相互干扰问题。
本发明的第一个目的是提供所述的基于主客体自组装的载体蛋白，在载体蛋白上至少修饰一个金刚烷结构，所述金刚烷结构可用于与环糊精自组装，所述的金刚烷结构通过主客体自组装与beta-环糊精及其衍生物形成复合物。
优选地，所述的载体蛋白选自牛血清白蛋白BSA、人血清白蛋白HSA、卵清蛋白OVA、白喉类毒素、白喉毒素的无毒突变体CRM197、破伤风类毒素、钥孔血蓝蛋白、细菌表达的蛋白中任意一种或两种以上形成的融合蛋白。
优选地，所述的基于主客体自组装的载体蛋白，其特征在于：所述的金刚烷结构通过主客体自组装与beta-环糊精及其衍生物形成复合物。
优选地，所述的beta-环糊精及其衍生物上，beta-环糊精的羟基上修饰鼠李糖结构。
优选地，所述的偶联物为由半抗原修饰的载体蛋白与目标抗原偶联得到的缀合物，其中目标抗原为肿瘤抗原、细菌抗原、病毒抗原或真菌抗原中的任意一种。
优选地，所述外源性抗原为肿瘤抗原中的肿瘤相关糖抗原，包括：TF，Tn，sialylTn(sTn)，Globo H，GM2，GM3，GD2，GD3，MUC1及MUC1的衍生物。Thomsen-Friedenreich(TF)抗原(CD176)；Thomsen-nouvelle(Tn)抗原(CD175)或其唾液酸化形式(sTn抗原，CD175s)；肿瘤相关糖抗原Globo H；神经节苷脂GM2，GM3，GD2，GD3，粘蛋白1，mucin 1(MUC1)。
本发明所述的基于主客体自组装的载体蛋白的偶联物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)先在载体蛋白上修饰上至少一个金刚烷(adamantane，ada)结构，如BSA+ada→BSA-ada；(2)再与目标抗原偶联，得到偶联物，如BSA-ada+sTn→BSA-ada-sTn；(3)随后与环糊精及其衍生物自组装，如形成BSA-ada-sTn+beta-CD-Rha的复合物。
进一步地，在步骤(2)中，先将载体蛋白与目标抗原如sTn偶联，确保成为相同载量的偶联物，再与金刚烷(adamantane，ada)偶联，并进一步与环糊精衍生物进行自组装。
本发明的另一个目的是提供一种免疫原性组合物，其中包含所述的半抗原修饰的载体蛋白的偶联物以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
本发明的另一个目的是还提供了所述的半抗原修饰的载体蛋白，或半抗原修饰的载体蛋白的偶联物，或包含所述的半抗原修饰的载体蛋白的偶联物的免疫原性组合物在制备疫苗方面中的应用。
本发明的另一个目的是提供了所述半抗原修饰的载体蛋白的偶联物在制备预防或治疗癌症的药物中的应用。
有益效果：本发明不仅增强了对缀合的外源性抗原的免疫反应，还能缩短免疫反应时间，减少免疫次数，提供了一种简单而有效的方法来增强载体蛋白在构建疫苗时的效果，且可以对现有的常用的载体蛋白进行合理的改造，从而获得更多的可以用于疫苗制备的载体蛋白，更进一步地可以避开相同载体蛋白之间的相互干扰的问题。考虑到糖类抗原在疫苗研究和工业中的广泛应用，该发明用于构建新的糖复合物用于疫苗开发。
与传统的载体蛋白相比，本发明具有如下优点：
(1)基于主客体自组装的载体蛋白，能够通过环糊精或环糊精衍生物与免疫系统相互作用，促进抗原呈递细胞的摄取、处理和呈递，从而显著提高免疫系统对载体蛋白上缀合的外源性抗原的免疫反应，同时能够降低免疫系统对载体蛋白的免疫反应。考虑到糖类抗原在疫苗研究和工业中的广泛应用，该发明可用于构建新的糖复合物用于疫苗开发，本发明的半抗原修饰的载体蛋白的偶联物也可应用于制备预防或治疗癌症的药物中。
(2)本发明通过主客体自组装在载体蛋白上复合beta-环糊精和鼠李糖结构，以此提高免疫效果。与传统的高免疫原性载体蛋白不同，本发明可以利用低免疫原性、且生物安全性较好的载体蛋白，例如牛血清白蛋白等，显著提高的免疫激活效果，且同时降低免疫系统对载体蛋白本身的免疫反应，从而提高特异性针对其上偶联的外源性抗原(例如肿瘤相关糖抗原、细菌糖抗原等)的免疫反应。
附图说明
图1为本发明的金刚烷修饰的BSA的合成路线图。
图2为本发明的sTn-BSA和sTn-BSA-Ada6的质谱图。
图3为本发明的环糊精衍生物CD-PEGn-Rha7的合成路线图。
图4为本发明的化合物21(CD-PEG1-Rha7)，22(CD-PEG3-Rha7)，23(CD-PEG6-Rha7)的质谱图。
图5为本发明的sTn-BSA-Ada6/CD-PEGn-Rha7包合复合物的示意图。
图6为本发明的等温微量热滴定实验检测化合物包合作用图。
图7为本发明的小鼠免疫第28天血清中sTn特异性抗体滴度的示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。
根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
本发明的一种基于主客体自组装的载体蛋白，在载体蛋白上至少修饰一个金刚烷结构，所述金刚烷结构可用于与环糊精自组装，所述的金刚烷结构通过主客体自组装与beta-环糊精及其衍生物形成复合物；
所述的载体蛋白选自牛血清白蛋白或人血清白蛋白，或两种以上形成的融合蛋白。
所述的beta-环糊精及其衍生物上，beta-环糊精的羟基上修饰鼠李糖结构。
本发明的基于主客体自组装的载体蛋白的偶联物，所述的基于主客体自组装的载体蛋白与目标抗原偶联得到的缀合物，其中目标抗原为肿瘤抗原。
所述的目标抗原为肿瘤相关糖抗原。
所述的肿瘤相关糖抗原为TF，Tn，sTn，Globo H，GM2，GM3，GD2，GD3，MUC1及MUC1的衍生物。
本发明的(1)先在载体蛋白上修饰上至少一个金刚烷(adamantane，ada)结构，如BSA+ada→BSA-ada；(2)再与目标抗原偶联，得到偶联物，如BSA-ada+sTn→BSA-ada-sTn；先将载体蛋白与目标抗原如sTn偶联，确保成为相同载量的偶联物，再与金刚烷(adamantane，ada)偶联。(3)随后与环糊精及其衍生物自组装，如形成BSA-ada-sTn+beta-CD-Rha的复合物。
本发明的一种免疫原性组合物，其中包含所述的半抗原修饰的载体蛋白的偶联物以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
本发明所述的基于主客体自组装的载体蛋白，或权利要求4-6任一项所述的基于主客体自组装的载体蛋白的偶联物，或权利要求7所述的免疫原性组合物在制备疫苗中的应用。
本发明所述的偶联物在制备预防或治疗癌症的药物中的应用。
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于：所述的载体蛋白选自卵清蛋白。其中目标抗原为细菌抗原。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于：所述的载体蛋白选自卵清蛋白、白喉类毒素、白喉毒素的无毒突变体CRM197、破伤风类毒素、钥孔血蓝蛋白、细菌表达的蛋白中任意一种或两种以上形成的融合蛋白。其中目标抗原为病毒抗原。
实施例4
实施例4与实施例1的区别在于：所述的载体蛋白选自白喉类毒素、白喉毒素的无毒突变体CRM197中两种以上形成的融合蛋白。其中目标抗原为真菌抗原。
实施例5
实施例5与实施例1的区别在于：所述的载体蛋白选自破伤风类毒素、细菌表达的蛋白中任意一种或两种以上形成的融合蛋白。
实施例6
实施例6与实施例1的区别在于：所述的载体蛋白选自钥孔血蓝蛋白。
对于以下试验例，需要提前说明的是，本发明的方法是先在载体蛋白上修饰上至少一个金刚烷(adamantane，ada)结构，如BSA+ada→BSA-ada，再与目标抗原偶联，得到偶联物，如BSA-ada+sTn→BSA-ada-sTn。随后与环糊精及其衍生物自组装，如形成BSA-ada-sTn+beta-CD-Rha的复合物。但是合成过程中，本实验设计为先将载体蛋白与目标抗原如sTn偶联，确保成为相同载量的偶联物，再与金刚烷(adamantane，ada)偶联，并进一步与环糊精衍生物进行自组装，这样便于比较不同的环糊精衍生物对疫苗效果的影响。sTn-BSA的合成根据已有报道合成(Chem Commun，2020，56：13959-13962.)。
试验例1
金刚烷修饰的BSA的合成与表征
金刚烷修饰的牛血清白蛋白BSA的合成如图1所示。以1-金刚烷甲酰氯1为起始原料，与氨基取代的化合物2发生酰胺缩合反应得到3，用50％的TFA脱去氨基的Boc保护基，得到化合物4，随后以HATU为缩合剂，再次通过酰胺缩合反应与含有马来酰亚胺结构的羧酸5缩合顺利得到客体分子6。BSA序列中有35个半胱氨酸，这些半胱氨酸组成了17对二硫键和一个自由的巯基，而马来酰亚胺常常被用于和蛋白上的巯基偶联以实现对蛋白的位点选择性修饰。巯基和马来酰亚胺上的双键会发生迈克尔加成反应，该反应选择性高、速度快，条件也比较温和。因此将过量的客体分子6和sTn-BSA糖蛋白7溶解在PBS(pH＝7.4)中，在室温条件下反应2d，随后10kDa超滤除去未反应的小分子化合物，得到sTn-BSA-Ada6客体分子修饰的糖蛋白8。MALDI-TOF-MS检测表明Ada修饰的糖蛋白8的分子量为74832.219Da，sTn-BSA载体蛋白分子量为71839.030Da分子量相差2993.189Da，因此一个sTn-BSA分子上连接了6个Ada(图2)，产率为90％。
试验例2
环糊精衍生物CD-PEGn-Rha7合成与表征
如图3所示，主体分子CD-PEGn-Rha7的合成以全乙酰化鼠李糖9为起始原料。根据乙酸酯糖苷化法，BF3·Et2O在DCM溶液中，催化2-叠氮基乙醇或叠氮基六聚乙二醇进行糖苷化反应，生成化合物10或11。随后用MeONa/MeOH脱去羟基的保护基乙酰基，再利用钯/碳和氢气将叠氮基还原成氨基，得到了14或15。根据已有报道合成16(Chem Commun，2020，56：13959-13962.)。氨基鼠李糖14、15或16分别与10当量对硝基苯碳酸酯反应生成活化酯的17、18或19，随后与6-氨基取代的环糊精反应，顺利得到主体分子21、22或23，产率在40％左右。产物经1H NMR和MALDI-TOF-MS鉴定。质谱结果如图4所示，均与理论分子量相一致，表明合成的产物是正确的。
试验例3
疫苗的自组装与表征
将糖蛋白8和CD(化合物20)及其Rha衍生物21、22或23以1∶18的摩尔比在PBS中进行包合反应(图5)，将此反应在室温下缓慢搅拌2d。通过7kD透析膜透析纯化复合物，真空干燥后得到超分子糖蛋白缀合物sTn-BSA-Ada6/CD-PEGn-Rha724、25、26和27，产率分别为84％，90％，88％和89％。
通过等温滴定量热法(ITC)探究了客体分子修饰的糖蛋白与主体分子环糊精及其衍生物的包合行为，并测定了相关热力学参数。结果如图6所示，客体分子修饰的糖蛋白24与主体分子25-27的结合位点(N)和结合常数(KD)分别为5.34±1.13、9.87e-5±9.84e-5M；4.71±0.978、1.06e-4±1.26e-4M；5.05±0.193、9.44e-5±1.76e-5M和4.05±0.978、1.01e-4±9.39e-5M。
试验例4
sTn-BSA-Ada6/CD-PEGn-Rha7疫苗的免疫活性分析
为了探究内源性抗Rha抗体对非共价键sTn-BSA-Ada6/CD-PEGn-Rha7肿瘤疫苗的免疫活性影响，将35只5-6周的雌性C57BL/6J小鼠随机分为第1-7组进行免疫活性研究(图7)。先用Rha-OVA对5-7组的小鼠进行预免疫，以建立具备高滴度抗Rha抗体的小鼠模型。在用Rha-OVA免疫三次后，在第5-7组的小鼠血清中检测到高滴度的Rha IgG特异性抗体(约567252)，证明成功的建立了高滴度抗Rha抗体的小鼠模型。随后，在第1天用sTn-BSA-Ada6/CD-PEGn-Rha7 24-27分别免疫相应组别小鼠，并在第7、14和21天加强免疫，在第一次免疫后的第7、14、21和28天收集小鼠血液样本用于抗体滴度免疫评价。
sTn特异性的抗体滴度结果如图7所示，在有Rha抗体(第5-7组)和没有Rha抗体的小鼠(第2-4组)体内，复合物25-27都能激起较高的抗体滴度，其中，复合物27所激起的抗体滴度最高，其次是复合物26，再次是25。而不具有Rha修饰的复合物24(仅beta-环糊精包合)所激起的免疫活性显著低于其他几组的免疫活性。这个结果提示，具有beta-CD-Rha7自组装包合的载体蛋白能够显著提高其上负载的抗原的免疫反应。而比较3个化合物的连接臂长度，可以发现，具有6个PEG链长的复合物(27)效果最好，其次是3个PEG链。
另外，比较含有Rha抗体(第5-7组)和不含有Rha抗体的小鼠(第2-4组)，发现，含有Rha抗体的小鼠中，抗体滴度较高。从中可以看出，预存的Rha抗体能够增强免疫反应。人们发现，人体内天然存在着一些抗体，其中，抗鼠李糖Rha的抗体含量占血清抗体含量的1％以上，因此，在本疫苗发明的设计中，修饰Rha的载体复合物能够与人体内的Rha抗体一起发挥作用，进一步提高免疫反应。
综合以上实施例，本发明提出了所述的基于主客体自组装的载体蛋白及其应用，通过载体蛋白上通过共价键化学偶联至少一个金刚烷结构。该金刚烷结构能够与beta-环糊精及其衍生物(如：beta-环糊精-鼠李糖)形成主客体自组装结构。通过环糊精衍生物上的鼠李糖等半抗原招募体内已有的天然抗体识别并结合，形成复合物，能够促进抗原呈递细胞的吞噬、处理喝呈递，从而有效提高疫苗分子的免疫原性，提高载体蛋白上面负载的抗原的特异性免疫反应。同理，本发明的金刚烷修饰载体蛋白及其主客体自组装复合物，其上修饰有鼠李糖等结构，可应用于制备预防或治疗癌症的药物中。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应对指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于主客体自组装的载体蛋白，其特征在于：在载体蛋白上至少修饰一个金刚烷结构，所述金刚烷结构可用于与环糊精自组装，所述的金刚烷结构通过主客体自组装与beta-环糊精及其衍生物形成复合物。
2.根据权利要求1所述的基于主客体自组装的载体蛋白，其特征在于：所述的载体蛋白选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、白喉类毒素、白喉毒素的无毒突变体CRM197、破伤风类毒素、钥孔血蓝蛋白、细菌表达的蛋白中任意一种或两种以上形成的融合蛋白。
3.根据权利要求1所述的基于主客体自组装的载体蛋白，其特征在于：所述的beta-环糊精及其衍生物上，beta-环糊精的羟基上修饰鼠李糖结构；所述的基于主客体自组装的载体蛋白与目标抗原偶联得到的缀合物，其中目标抗原为肿瘤抗原、细菌抗原、病毒抗原或真菌抗原中的任意一种。
4.根据权利要求3所述的基于主客体自组装的载体蛋白的偶联物，其特征在于：所述的目标抗原为肿瘤相关糖抗原。
5.根据权利要求4所述的基于主客体自组装的载体蛋白的偶联物，其特征在于：所述的肿瘤相关糖抗原为TF，Tn，sTn，Globo H，GM2，GM3，GD2，GD3，MUC1及MUC1的衍生物。
6.权利要求1至5任一项所述的基于主客体自组装的载体蛋白的偶联物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)先在载体蛋白上修饰上至少一个金刚烷(adamantane，ada)结构，如BSA+ada→BSA-ada；(2)再与目标抗原偶联，得到偶联物，如BSA-ada+sTn→BSA-ada-sTn；(3)随后与环糊精及其衍生物自组装，如形成BSA-ada-sTn+beta-CD-Rha的复合物。
7.根据权利要求6所述的基于主客体自组装的载体蛋白的偶联物的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，先将载体蛋白与目标抗原如sTn偶联，确保成为相同载量的偶联物，再与金刚烷(adamantane，ada)偶联，并进一步与环糊精衍生物进行自组装。
8.一种免疫原性组合物，其特征在于：其中包含权利要求4-6中任一项所述的半抗原修饰的载体蛋白的偶联物以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
9.权利要求1-3任一项所述的基于主客体自组装的载体蛋白，或权利要求4-6任一项所述的基于主客体自组装的载体蛋白的偶联物，或权利要求8所述的免疫原性组合物在制备疫苗中的应用。
10.权利要求4-6任一项所述的偶联物在制备预防或治疗癌症的药物中的应用。
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