JPH10503494A - インフルエンザウイルスのサブユニット複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＨＡタンパク質に対して強い免疫応答を示すワクチンを調製するのに適したインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質の複合体は、界面活性剤抽出によりインフルエンザウイルスから全ＨＡタンパク質を分離するか、または、組み換え手法により全ＨＡタンパク質を得た後、該ＨＡタンパク質をヒドロキシルアミンで処理し、該タンパク質の細胞質領域内に遊離のスルフヒドリル基を形成し、さらに、ビスマレイミド架橋剤を介して遊離のスルフヒドリル基を有するＨＡタンパク質自身、またはマレイミド変性ジフテリア毒素、破傷風毒素、インフルエンザＮＰタンパク質あるいは他のキャリヤー分子に架橋することによって形成する。この手法は、ウイルスなどのように細胞性物質から分離可能であり、かつ、スルフヒドリル基に変換可能なチオエステル結合を有する他のタンパク質に対しても応用可能である。

Description

【発明の詳細な説明】 インフルエンザウイルスのサブユニット複合体 発明の属する技術分野 本発明は、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素（ＨＡ）がキャリヤー分子 に接合した複合体、ならびにそのような複合体を免疫原性組成物、とりわけヒト に投与するワクチンとして使用することに関する。 発明の背景 生体に投与された全ウイルスワクチンは、ウイルス性抗原に対する抗体を形成 することにより免疫応答を起こす。インフルエンザウイルスの場合には、このウ イルスに対するウイルス中和抗体の標的はインフルエンザＨＡタンパク質である 。ある市販の全ウイルスワクチンは分断ウイルスワクチンであり、これは不活化 ウイルスを界面活性剤で処理して得られるものであり、コノートラボラトリーズ （Connaught Laboratories，Inc.）からフルゾン（FLUZONE）という商標名で販 売されている。 ワクチンに関する傾向としては、全ウイルスを材料とするものから離れて、一 般的により小さく、十分に確認されている、より精製された材料からなるものへ と移行している。インフルエンザＨＡ抗原は単離されているが、特定のサブユニ ットは免疫原性が弱く、多くの個体に対して十分に高い免疫応答を誘起すること ができない。 本発明の出願者によって出願され、ＥＰ87−310377として公開されているもの の中には、ＨＡをジフテリア毒素へ共有結合させたものについて既に記載されて いる。その中の記載においては、ブロメリン開裂により全ウイルスからＨＡを除 去し、異種二機能性の架橋剤であるマレイミド−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミ ドエステル型ものも、好ましくはＭＣＳ（マレイミド−カプロン酸−Ｎ−ヒドロ キシスクシンイミドエステル）を用いて、得られたＨＡサブユニットをジフテリ ア毒素に共有結合した。このＨＡ−Ｄ複合体を調製するにあたっては、まずＳＡ ＴＡ（Ｎ−スクシンイミディル−Ｓ−アセチルチオ酢酸）で処理することによっ てＨＡサブユニットにスルフヒドリル基を導入し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ ドエステルがジフテリア毒素（ＤＴ）のアミノ基と反応し、次に、マレイミド部 位がＨＡ抗原に導入された遊離のスルフヒドリル基と反応してＨＡ分子とＤＴ分 子とが結合し、ＨＡ−Ｄ複合体が形成される。 ヒトに対する有効性試験で得られた結果では、ＨＡ−Ｄ複合体ワクチンはＨＡ サブユニットワクチン単独よりも高い免疫応答を示したが、全インフルエンザウ イルスワクチンと比較すると、ＨＡ−Ｄ複合体はヒトに対して十分な免疫応答を 示さなかった。 発明の概要 このたび、発明者らは、これまでに記載されている複合体（conjugates）より も免疫原としての効果が高いＨＡ複合体、およびその他のウイルスのサブユニッ トタンパク質の複合体を調製する新規な方法を開発した。本発明においては、こ れまでに記載されていた方法と異なる方法で全ウイルスからＨＡサブユニットを 分離し、このことにより、より良い結果が得られる。 本発明は、ＨＡタンパク質の免疫的に重要な部位を無傷（インタクト）のまま 残すような方法を開示するものである。これまでに行われていた方法−これはブ ロメリン開裂と呼ばれ、複合体形成過程においてアミノ基の誘導体化を伴うもの である−においてはそのような部位の変性を行うため、全インフルエンザワクチ ンと比較すると有効性が大きく劣るといった結果を招いた。 すなわち、本発明のひとつの目的は、インフルエンザウイルスのＨＡタンパク 質の複合体を形成する方法を提供することにある。該方法の第一の工程は、界面 活性剤抽出により、インフルエンザウイルスから全ＨＡタンパク質を分離するこ とである。従来の方法においては、ブロメリンによりＨＡタンパク質を該ウイル スから切り出していた。本発明で使用している界面活性剤による抽出法の効果と しては、分離されたＨＡタンパク質内にトランスメンブレンとエンドドメインと が含まれていることであり、ブロメリン開裂の場合には、これらの部分はウイル ス材料の方に残っていた。ウイルスからＨＡタンパク質を抽出する以外に、ＨＡ タンパク質を組換えによって作成し、次の工程に供することもできる。 次に、分離したＨＡタンパク質をヒドロキシルアミンまたはその他の適切な化 学物質で処理し、エンドドメイン内のチオエステル基を転換することにより、エ ンドドメイン内に反応性に富むスルフヒドリル基を生成する。従来の方法におい ては、硫化により、ブロメリン開裂したサブユニットにスルフヒドリル基を導入 していた。２つの異なる抽出方法により得られたＨＡサブユニット内のこの違い が、特性が異なっていることの原因だと考えられる。 得られた遊離のスルフヒドリル基を有するＨＡタンパク質を、ＨＡタンパク質 に対して有効な免疫応答を示すことができるキャリヤー分子に架橋する。そのよ うな架橋が、ビスマレイミド架橋剤を用いて該ＨＡタンパク質自身に対して行わ れるか、またはマレイミド変性ジフテリア毒素、破傷風毒素、もしくはインフル エンザＮＰタンパク質に対して行うことにより、複合体を形成することができる 。得られたＨＡ複合体をインフルエンザに対するワクチンとして製剤化すること ができる。 発明の詳細な説明 上述のように、本発明は、複合体化により、インフルエンザウイルスＨＡタン パク質に対する有効な免疫応答を得ることに関する。本発明の方法において重要 な点は、インフルエンザウイルスから全ＨＡタンパク質を抽出、もしくは組換え により形成し、複合化する際に、免疫学的に重要な部位をすべてＨＡタンパク質 にインタクトのまま残していることである。本発明は、Ａ型インフルエンザおよ びＢ型インフルエンザを含むインフルエンザのさまざまな株からのＨＡタンパク 質の分離に応用することが可能である。 ＨＡタンパク質に関して、本発明で得られた成功は、全ウイルスから単離され 、または組換え過程によって形成されたその他の免疫原性の弱いタンパク質であ って、エンドドメインに遊離のスルフヒドリル基が生じているようなタンパク質 に対してもこの手法が応用可能であることを示唆している。本発明の手法を用い ることができるその他の免疫原性の弱いタンパク質としては、ラクロッスウイル スのＧ１およびＧ２タンパク質（明細書の最後に掲載されている参考文献リスト 内の参考文献１）、マウス肝炎ウイルスのＥ２タンパク質（参考文献２）、１型 単純ヘルペスウイルスのｇＥタンパク質（参考文献３）、ニューカッスル病ウイ ルスのＦタンパク質およびＨＮタンパク質（参考文献４）、ラウス家禽肉腫ウイ ル スのｇｐ35タンパク質（参考文献５）、腹腔小胞ウイルスのタンパク質Ｇ（参考 文献６）、牛痘ウイルスのＰ37タンパク質（参考文献７）、シンドビスウイルス のＥ１タンパク質およびＥ２タンパク質（参考文献８）、Ｈ−ラスタンパク質（ 参考文献９）、インフルエンザＭ２タンパク質（参考文献11）およびヒトトラン スフェリンレセプター（参考文献10）が挙げられる。従って、本発明は広い観点 からみると、細胞性材料からの抽出あるいは組換え手法によって、細胞性材料に 関連するタンパク質の複合体を形成する方法であって、末端部位に少なくともひ とつのチオエステル基を有するタンパク質を細胞性材料から分離し、分離したタ ンパク質を処理することにより、少なくともひとつのチオエステル基から少なく ともひとつの遊離のスルフヒドリル基を形成し、さらに、少なくともひとつの遊 離のスルフヒドリル基の結合を介して、スルフヒドリル基を有するタンパク質を キャリヤー分子に架橋することを含む方法を提供するものである。 本発明の手法は、以後、ＨＡタンパク質に関して記載しているが、同様の手法 は、他のタンパク質についてそれらの複合体を形成する場合にも用いることがで きることに留意されたい。 複合体形成の第一段階は、変性を起こさない条件下でインフルエンザウイルス から全ＨＡタンパク質を単離することである。そのような方法には、オクチル− β−グルコシド、コリン酸ナトリウム、またはその他の非変性界面活性剤を用い た界面活性剤抽出が含まれる。別の方法としては、適切な発現系を用いて発現を 行うことにより、組換えによってＨＡタンパク質を形成することもできる。 界面活性剤を用いて全ＨＡタンパク質を抽出、または組換え手法によりＨＡタ ンパク質の形成を行った後、ＨＡタンパク質をヒドロキシルアミン、チオール還 元剤で処理することにより、または酸加水分解もしくはアルカリ加水分解により 、タンパク質のエンドドメイン内に遊離のスルフヒドリル基を形成するか、ある いはエンドドメイン内のチオエステル結合を解離することにより遊離のスルフヒ ドリル基を形成する。 次に、遊離のスルフヒドリル基を有するＨＡタンパク質を、遊離のスルフヒド リル基による化学結合を介して他の分子に結合する。そのような結合は、次式で 表されるような適切なビスマレイミド化合物を利用することにより、ＨＡタンパ ク質自身への結合を経由しているものと考えられる： ここで、Ｒはヘキサンなどの炭化水素ラジカルである。 別の方法としては、ＨＡタンパク質の結合は、ジフテリア毒素、破傷風毒素、 もしくはインフルエンザ（ＮＰ）タンパク質などのマレイミド変性キャリヤータ ンパク質に対して、またはアルギニン酸、デキストラン、もしくはポリエチレン グリコールなどの炭水化物に対して行うことができる。そのようなマレイミド変 性キャリヤー分子は、上述の従来技術に記載されているように、キャリヤー分子 をマレイミド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル型の異種二機能性の架橋 剤に反応させることにより形成することができる。 そのような化合物は次のような構造式で表される： ここでＲは任意の適切な酸残基であり、また、必要に応じて置換されたフェニレ ン基、炭素数１〜12、好ましくは炭素数５〜12のシクロアルケン基またはアルキ レン基を含むことがある。そのような二機能性エステルの例としては、マレイミ ド−カプロイック−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＣＳ）、マレイ ミド−ベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、マレイ ミド−ベンゾイル−スルフォスクシンイミドエステル（スルフォ−ＭＢＳ）、ス クシンイミディル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボ キシレート（ＳＭＣＣ）、スクシンイミディル−４−（ｐ−マレイミドフェニル ）ブチレート（ＳＭＰＰ）、スルフォスクシンイミディル−４−（Ｎ−マレイミ ド メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルフォ−ＳＭＣＣ）および スルフォスクシンイミディル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ス ルフォ−ＳＭＰＰ）がある。 Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル部位はキャリヤータンパク質のアミ ン基と反応してマレイミド部位をフリーにし、抗原のスルフヒドリル基と反応し て架橋材料を形成する。 このようにして形成された複合体分子を精製し、ワクチン材料としての免疫原 性組成物に用い、宿主に投与した際にＨＡタンパク質に対する免疫応答を誘起す るが、その強さはＨＡ単独よりも強く、いくつかの例においては市販の分断イン フルエンザワクチンによる応答を越えている。 そのような複合体分子を含む免疫原性組成物は、液体溶液またはエマルジョン などの注射可能な形態に調製することができる。複合体分子は、それらと適合性 のある生体許容性のキャリヤーと混合することができる。これらのキャリヤーと しては、水、生理食塩水、デキストラン、グリセロール、エタノールおよびそれ らの組み合わせが挙げられる。組成物にはさらに、湿潤剤もしくは乳化剤、また はｐＨ調整剤などの補助剤を含んでいてもよい。ワクチンは皮下もしくは筋肉内 注射によって投与することができ、または粘膜表面において免疫応答を誘起する ような方法で投与することができる。 該免疫原性組成物は、製剤として適合できるような方法で、治療上有効、防御 的、または免疫原性を有するような量で投与する。投与する複合体の量は、免疫 を与える対象に依存しており、この中には、該対象の免疫系が抗体を合成する能 力、さらに、必要に応じて細胞性免疫を産生する能力も考慮される。投与する複 合体の正確な量は、医療従事者の判断にゆだねられている。しかしながら、好ま しい投与量の範囲は同業者によって容易に決定でき、それはμｇからｍｇのオー ダーである。好ましい初回投与および追加投与の方式における投与量もさまざま であるが、初回投与後数回に分けて投与を行うこともできる。ワクチンの投与量 は、投与経路にも依存しており、また、対象の大きさもよっても異なる。 本明細書に開示している新規な複合体からなる免疫原性組成物は、抗原特異的 な抗体を産生するのに有用であり、この抗体は、イムノアッセイにおいて該抗原 を特異的に同定するのに役立つ。そのようなイムノアッセイとしては、エンザイ ムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＲＩＡおよびその他の当業者に知られている 非酵素性抗体結合アッセイなどが含まれる。 実施例 実施例１ 本実施例は、インフルエンザウイルスサブユニットの調製について記述する。 インフルエンザウイルス（Ａ／台湾型およびＡ／北京型）を遠心分離により沈 澱させ、上清を除去し、この沈澱を少量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再 懸濁した。10重量％の界面活性剤、オクチル−β−グルコシドを含有するＰＢＳ を加え、界面活性剤の最終濃度を２重量％とした。材料を穏やかに混合し、37℃ で１時間インキュベートした。ウイルスのコアおよび組織片は遠心分離により除 去した。遠心分離により得られた上清には、界面活性剤抽出によってウイルスか ら分離されたＨＡサブユニットが含まれていた。 実施例２ 本実施例は、ＨＡ−ＢＭＨ：ＨＡ複合体の調製について記述する。 実施例１の記載に従って調製した界面活性剤抽出ＨＡに、次に、５Ｍのヒドロ キシルアミンとｐＨ7.2の２ｍＭのＥＤＴＡとを４：１の割合で混合し、ＨＡ分 子内に末端スルフヒドリル基を生成した。３倍モル量以上のビスマレイミドヘキ サン（ＢＭＨ、ジメチルスルフォキシドに溶解して５mｇ／mlとしたもの）をＨ Ａ単体に加えた。反応は、室温で30分インキュベートして行った。次に、ＢＭＨ 変性ＨＡを過量のヒドロキシルアミン処理ＨＡと混合した。Ａ／台湾型のＨＡを 用いて材料を調製し、このときのＢＭＨ変性ＨＡに対する非変性ＨＡの比は１： ２、１：４、１：８、および１：16とした。Ａ／北京型のＨＡを用いて材料を調 製した場合の比は、１：２、１：４および１：８とした。これらの反応は、室温 で数時間インキュベートして行った。最終生成物は、分子量300,000を基準とし て分離する膜を用いた限外ろ過により精製した。 実施例３ 本実施例は、ＨＡ−キャリヤー抗原複合体の調製について記述する。 まずはじめに、スルフォ−ＳＭＣＣを用いてキャリヤー抗原を変性した。キャ リヤータンパク質の濃度は、マイクロ−ＢＣＡタンパク質分析を用いて測定した 。これは、ｐＨ7.3のリン酸緩衝生理食塩水中の毒素キャリヤータンパク質を15 倍モル量以上のスルフォ−ＳＭＣＣと室温下で２時間インキュベートして行った 。ＮＰタンパク質は、１モルの塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水中に おいて25倍モル量以上のスルフォ−ＳＭＣＣと室温下で２時間インキュベートし た。アルギニン酸は、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボ ジイミドの存在下、ｐＨ５において、アジピン酸ジヒドラジドを用いて室温下で 120分間インキュベートすることにより変性した。アジピン酸による変性に続い て、この材料をリン酸緩衝生理食塩水に対して透析し、未反応のヒドラジドを除 去した。ヒドラジド変性アルギニン酸は、ｐＨ7.3のリン酸緩衝生理食塩水中、 ２倍モル量以上のスルフォ−ＳＭＣＣと室温下で270分インキュベートした。 未反応のスルフォ−ＳＭＣＣ架橋剤は、急速脱塩カラム（ファルマシアＬＫＢ バイオテクノロジー（Pharmacia LKB Biotechnology）社製、米国、ニュージャ ージー州（New Jersey）、ピスカタウェイ（Piscataway））を用いてゲルろ過を 行うことにより除去した。変性キャリヤー中のマレイミド含量は、５’５−ジチ オ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）を用いて測定した。次に、遊離のスルフヒド リル基１個につきマレイミド基１個の割合で、実施例２に記載しているように調 製したヒドロキシルアミン処理ＨＡに変性キャリヤーを結合した。架橋反応およ び複合体形成した材料の精製は実施例２の記載に従って行った。 実施例４ 本実施例は、ある複合体（Ａ／台湾型を使用）に対してマウスにおいて得られ た免疫応答に関して記述する。 Ａ／台湾型のＨＡ−ＢＭＨ：ＨＡ複合体およびＨＡ−カルボヒドレート複合体 について、マウスを用いて免疫原性および有効性を調べた。マウスに０週および ３週目に免疫し、５週目に採血または生きているＡ／台湾型ウイルスをチャレン ジした。ＨＡ−ＨＡ複合体およびＨＡ−カルボヒドレート複合体をさまざまなワ クチン投与量において市販の分断インフルエンザワクチン（フルゾン（Fluzone ））およびプラセボと比較した。得られた結果を次の表Ｉに示している： このデータからわかるように、ＢＭＨを用いて作成した自己複合体はマウスの 肺においてウイルスの複製を阻止することができ、従来型のワクチンよりも高い 抗体価が得られた。 実施例５ 本実施例は、その他の複合体（Ａ／台湾型を使用）に対するマウスの免疫応答 について記述する。 ＤＴ、ＴＴおよびＮＰとＨＡとの複合体についてもマウスにおける免疫原性お よび有効性を実施例４と同様のプロトコールに従って調べ、市販の分断インフル エンザワクチン（フルゾン（Fluzone））およびプラセボ（ＰＢＳ）と比較した 。得られた結果を次の表ＩＩに示している： このデータからわかるように、毒素複合体はマウスの肺中でウイルスの複製を 阻止することができる。複製の阻止という点に関しては、破傷風毒素複合体がわ ずかに優れている。 実施例６ 本実施例は、ある複合体（Ａ／台湾型を使用）に対してモルモットにおいて得 られた免疫応答に関して記述する。 モルモットにおける抗体アッセイでは、マウスについて行った実施例４および ５に示されている結果とは異なる結果が得られた。本実施例においては、モルモ ットを０週目に免疫し、２週目および４週目に追加免疫を行った。５週目および ７週目に採血し、試験を行った。 自己複合体および破傷風毒素複合体ともに全細胞ワクチンと同程度の結果を示 した。ジフテリア毒素複合体は極めて高い抗体価を示した。ＮＰタンパク質との 複合体は低い抗体応答しか示さなかったが、試験期間中を通して応答が上昇し続 け、試験終了時には極めて高い抗体応答を示した。得られた結果を表ＩＩＩに示 す： 実施例７ 実施例１および２に記載した方法でＡ／北京型のＨＡ−ＢＭＨ：ＨＡ複合体を 調製し、実施例４の記載に従って試験を行った。得られた結果はＡ／台湾型での ものと類似しており、次の表ＩＶに示す： 開示のまとめ 本開示をまとめると、本発明は、インフルエンザウイルスからＨＡタンパク質 を分離し、複合体化して、ＨＡタンパク質に対する有効な免疫応答を得るための 新規な方法に関する。本方法の各種の変形も本発明の範ちゅうに含まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハーモン，モーリス ダブリュ アメリカ合衆国 ペンシルヴァニア州 18372 タンナーズヴィル コーブル ク リーク ドライヴ ボックス 150 アー ルアール １

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．細胞性材料に関連するタンパク質の複合体を形成する方法であって、 末端領域に少なくともひとつのチオエステル基を有し、該細胞性材料から分 離したタンパク質を提供し、 前記タンパク質を処理して少なくともひとつの該チオエステル基から少なく ともひとつの遊離のスルフヒドリル基を形成し、さらに、 少なくともひとつの遊離の該スルフヒドリル基を介した結合により、スルフ ヒドリル基を有するタンパク質とキャリヤー分子とを架橋する ことを特徴とする方法。 ２．前記細胞性材料がウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の 方法。 ３．前記タンパク質が、界面活性剤抽出によってウイルスから分離されたもので あることを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。 ４．インフルエンザウイルスの赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質の複合体を形成 する方法であって、 インフルエンザウイルスから分離されたトランスメンブレンおよびエンドド メインを有する全ＨＡタンパク質を形成し、 該全ＨＡタンパク質を処理してタンパク質のエンドドメイン内に遊離のスル フヒドリル基を形成し、さらに、 遊離の該スルフヒドリル基を介し、該ＨＡタンパク質に対して免疫応答を示 すことができるようなキャリヤー分子に、スルフヒドリル基含有ＨＡタンパク質 を架橋する ことを特徴とする方法。 ５．インフルエンザウイルスからの全ＨＡタンパク質の形成が、インフルエンザ ウイルスから非変性界面活性剤抽出を行うことにより全ＨＡタンパク質を得るこ とを特徴とする請求の範囲第４項記載の方法。 ６．前記非変性界面活性剤抽出において、オクチル−β−グルコシドまたはコリ ン酸ナトリウムを用いることを特徴とする請求の範囲第５項記載の方法。 ７．分離された全ＨＡタンパク質を処理して少なくともひとつの遊離のスルフヒ ドリル基を形成するにあたり、ヒドロキシルアミンを用いることを特徴とする請 求の範囲第４項記載の方法。 ８．前記キャリヤー分子が、架橋剤分子を介して前記全ＨＡタンパク質が結合し ている遊離のスルフヒドリル基を有する全ＨＡタンパク質を含むことを特徴とす る請求の範囲第４項記載の方法。 ９．前記架橋剤分子がビスマレイミド化合物であることを特徴とする請求の範囲 第８項記載の方法。 10．前記キャリヤー分子が、異種ニ機能性架橋剤分子を介して前記全ＨＡタンパ ク質に結合したキャリヤータンパク質または炭水化物を含むことを特徴とする請 求の範囲第４項記載の方法。 11．前記キャリヤー分子または炭水化物がジフテリア毒素、破傷風毒素またはイ ンフルエンザＮＰタンパク質を含むことを特徴とする請求の範囲第10項記載の方 法。 12．前記異種ニ機能性架橋剤がマレイミド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス テルを含むことを特徴とする請求の範囲第11項記載の方法。 13．前記複合体がワクチンとして製剤化されることを特徴とする請求の範囲第１ 項記載の方法。 14．前記複合体がワクチンとして製剤化されることを特徴とする請求の範囲第４ 項記載の方法。