CN109884308A - 甘露多糖半抗原、偶联物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种式(I)甘露多糖半抗原、偶联物及应用，属于免疫学技术领域。本发明的技术方案是把式(I)结构的甘露多糖半抗原进行修饰，在多糖末端羰基上连接多个CH2和NH2或COOH，通过NH2或COOH偶联多肽、蛋白等载体物质，使半抗原获得免疫原性和抗原性，并能结合在固相载体上。通过上述方法获得的半抗原偶联物一方面可用于制备抗体，另一方面可用于免疫方法检测样品中的抗体。本发明具有免疫原性强、检测简便、特异性高等优点。

Description

甘露多糖半抗原、偶联物及应用

技术领域

本发明涉及一种式(I)甘露多糖半抗原、偶联物及应用，具体涉及甘露多糖半抗原的偶联物结构、糖苷键连接方式，以及在制备抗体及检测样品中抗体方面的应用。属于免疫学技术领域。

背景技术

肠道菌细胞壁多糖在一些自体免疫性疾病的发生发展过程中起重要作用，这些自体免疫性疾病患者的血清中检测到甘露多糖的抗体。其中抗酿酒酵母甘露聚糖IgA(anti-Saccharomyces cerevisiae immunoglobulin A，ASCA-IgA)和抗酿酒酵母甘露聚糖IgG(anti-Saccharomyces cerevisiae immunoglobulin G，ASCA-IgG)是被临床广泛认可的克罗恩病的特异性指标。迄今为止，在临床应用的酿酒酵母甘露聚糖抗原是天然结构的糖蛋白，甘露多糖的结构包含了alpha-1，2、1，3和1，6糖苷键结构，具体哪个结构是ASCA的主要抗原表位未知。由于各厂家原料来源不同，抗原表位的暴露程度不同，质控难度大，检测结果差异显著。为此，以色列科学家发明了用甘露二糖anti-mannobioside carbohydrateIgG antibodies(AMCA)替代酿酒酵母甘露聚糖用于克罗恩的诊断，对比文献US2010/0254971A1公布了AMCA的甘露多糖之间是单纯的alpha-1，3糖苷键连接。但是AMCA用于克罗恩病检测时，其检测灵敏度仍然不如质量较高的ASCA检测试剂，提示由单纯alpha-1，3糖苷键组成的甘露寡糖不是最佳的ASCA替代物。

此外，目前ASCA和AMCA的检测方法主要是ELISA，对比文献CN 204666639 U报道了天然提取的酿酒酵母细胞壁甘露聚糖蛋白可实现免疫层析检测，但对于糖链较短的甘露二糖或甘露多糖，由于抗原表位间位阻较小，不加以改变的情况下，实现免疫层析法检测抗甘露多糖抗体的难度很大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种甘露多糖半抗原结构及偶联物，及其在检测抗甘露多糖抗体检测中的应用，以解决上述ASCA及AMCA检测中存在的两大问题。

本发明的第一方面，提供一种式I所示甘露多糖半抗原的结构，根据这一结构，用化学合成方法能有效获得本发明所述的甘露多糖半抗原。其中，所述的甘露多糖半抗原是由alpha-1，3与alpha-1，2糖苷键连接形成，其中n1、n2、n3和n为大于等于1的整数，分别表示alpha-1，3糖苷键、alpha-1，2糖苷键、CH2和甘露多糖的数量。R表示NH2或COOH。

在优选实施例中，甘露多糖的结构如式II～式V所示。

优选地，alpha-1，3糖苷键的数量为1～6个，alpha-1，2连接的糖苷键数量为2～6个，更优选地，为式II～式IV所示的甘露多糖。

本发明的第二方面，提供了一种甘露多糖半抗原与产生抗原性的载体物质结合的偶联物，所述甘露多糖半抗原为前述的甘露多糖半抗原，载体物质为蛋白质、蛋白质片段、合成多肽或半合成多肽。优选地，载体物质为生物素、链亲和素(SA)、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、铜蓝蛋白(KLH)或牛甲状腺球蛋白(BTG)。

在一个优选实施例中，载体物质为BSA和HSA。

一种优选方案，式I中的R为NH2，此NH2基团跟生物素反应被生物素化，然后与固相载体上的SA反应，或先跟SA形成复合物再包被到固相载体上。固相载体包括但不限于荧光微球、乳胶微球、磁性微球、微孔板、硝酸纤维素膜。

本发明的第三方面，公开前述的甘露多糖半抗原与产生抗原性的载体物质结合的偶联物在制备抗甘露多糖抗体中的应用。

本发明的第四方面，公开前述的甘露多糖半抗原与产生抗原性的载体物质结合的偶联物在检测或测定样品中抗甘露多糖抗体中的应用。

本发明提供的抗甘露多糖抗体检测中的应用，是基于免疫学反应的对样本中抗甘露多糖抗体的测定方法，包括如下步骤：

(1)将前述的甘露多糖偶联物包被在固相载体上；(2)待检测样本作用于固相载体，使样本中的抗甘露多糖抗体与固相载体上的甘露多糖抗原结合；(3)通过标记物测定样品中抗甘露多糖抗体的含量。

甘露多糖经过偶联后，可通过目前任何一种免疫学检测方法检测样本中的抗甘露多糖抗体，比如ELISA、板式化学发光、管式化学发光、免疫层析、免疫渗滤等等。所用的标记物是吖啶酯、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、其他荧光素等。

在实施例3中，为了比较本发明甘露多糖半抗原及偶联物与对比文献AMCA用于克罗恩的检测效果，把甘露多糖半抗原生物素化，包被在预包被有亲和素的微孔板，用于ELISA检测，验证了本发明甘露多糖具有更高的灵敏度。

实施例4所示是一种抗甘露多糖抗体的管式化学发光方法，所述方法是通过把甘露多糖半抗原及其偶联物包被在磁性微球上，与样本作用，捕获样本中的抗甘露多糖抗体，然后用标记抗人IgG或/和IgA检测样本中的抗甘露多糖抗体含量。为了进一步提高检测灵敏度，实施例中的甘露多糖半抗原经过生物素-链亲和素放大系统包被在磁性微球上，或者用预包被SA的磁性微球作为单独的试剂组分，与标记生物素的甘露多糖偶联物以及样本一步法反应，检测结果一样或更好。该检测方法具有灵敏度高、检测时间短、全自动检测等优点。

实施例5提供一种抗甘露多糖抗体的免疫层析方法，所述方法是把甘露多糖半抗原包被在荧光微球上和检测线T线上，形成双抗原夹心法检测样本中的抗甘露多糖抗体含量。更便捷地，实施例6提供了一种金标定性检测方法，可肉眼判断阴性和阳性。为了提高检测灵敏度，优选地，甘露多糖半抗原经过生物素化与链亲和素结合包被在荧光微球上。该检测方法具有快速、检测时间短、仪器成本小等优点。

与现有技术相比，本发明提供的甘露多糖半抗原、偶联物及应用在克罗恩病等自体免疫性疾病诊断方面，具有灵敏度高、性能稳定等优点。

附图说明

图1甘露多糖结构示意图式I

图2甘露多糖结构示意图式II～式V

图3式II～式V甘露多糖管式化学发光定量检测标准曲线

图4式II～式V甘露多糖管式化学发光试剂检测的特异性与灵敏度

图5式II～式V甘露多糖荧光免疫层析试剂标准曲线

具体实施方式

本发明所述的式II～式V甘露多糖半抗原由中科院某研究所合成。

AMCA试剂盒购自以色列Glycominds公司。

生物素购自Sigma。氨基-PEG2-生物素购自北方同正。SA购自盘古基因。其他试剂购自国药试剂。

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。

实施例1 甘露多糖半抗原偶联物制备

1、式II～V甘露多糖半抗原与生物素反应

1)式II～式IV甘露多糖半抗原与生物素反应

取生物素、二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于DMF中，室温磁力搅拌反应后，离心收集上清液；取式II～式IV甘露多糖半抗原，溶于磷酸缓冲液中；将活化好的生物素溶液在搅拌下逐滴加入到甘露多糖溶液中，2-8℃搅拌反应16h后以磷酸盐缓冲液于2-8℃透析24h，得到生物素化甘露多糖半抗原。

2)式V甘露多糖半抗原与生物素反应

取式V甘露多糖半抗原、DCC和NHS溶于DMF中，室温磁力搅拌反应，离心收集上清液；取上清液在搅拌下逐滴加入到氨基-PEG₂-生物素溶液中，2-8℃搅拌反应16h后以磷酸盐缓冲液于2-8℃透析24h，得到生物素化甘露多糖半抗原。

2、式II～V甘露多糖半抗原与载体蛋白BSA、HSA及KLH偶联

1)式II～式IV甘露多糖半抗原与载体蛋白BSA/HSA/KLH偶联

取式II～式IV甘露多糖半抗原溶于DMF中；取BSA、HSA或KLH溶于磷酸缓冲液中；将上述两种溶液慢慢混合，在搅拌下逐滴加入25％戊二醛溶液，37℃恒温摇床反应2h后以磷酸盐缓冲液于2-8℃透析24h，得到偶联物式II甘露多糖-BSA、式III甘露多糖-BSA、式IV甘露多糖-BSA，式II甘露多糖-HSA、式III甘露多糖-HSA、式IV甘露多糖-HSA，以及式II甘露多糖-KLH、式III甘露多糖-KLH、式IV甘露多糖-KLH。

2)式V甘露多糖半抗原与载体蛋白BSA、HSA及KLH偶联

取式V甘露多糖半抗原、DCC和NHS溶于DMF中，室温磁力搅拌反应16h后，离心收集上清液；将上清液逐滴加入到BSA、HSA或KLH溶液中，2-8℃搅拌反应16h后以磷酸盐缓冲液于2-8℃透析24h，得到甘露多糖与载体蛋白BSA/HSA/KLH偶联物，式V甘露多糖-BSA、式V甘露多糖-HSA以及式V甘露多糖-KLH。

3、式II～V甘露多糖半抗原包被荧光微球或磁性微球

1)式II～式IV甘露多糖半抗原包被荧光微球和磁性微球

取适量羧基修饰的荧光微球或磁性微球，以MES缓冲液悬浮荧光微球或磁性微球，使其固含量为1％；向其中加入EDC溶液，室温孵育0.5h；离心或磁场分离，以硼酸缓冲液清洗后得到活化的荧光微球或磁性微球；取式II～式IV甘露多糖半抗原以硼酸盐缓冲液稀释后加入活化好的荧光微球或磁性微球，超声混匀，室温孵育2h；离心或磁场分离，向其中加入含BSA的硼酸盐缓冲液，超声混匀，室温孵育1h；离心或磁场分离后，向其中加入硼酸盐缓冲液，2-8℃保存备用。

2)式V甘露多糖半抗原包被荧光微球和磁性微球

取式V甘露多糖半抗原以硼酸盐缓冲液稀释后，向其中加入等体积EDC，室温孵育0.5h后加入到氨基修饰的荧光微球或磁性微球溶液中，超声混匀，室温孵育2h；离心或磁场分离，向其中加入含BSA的硼酸盐缓冲液，超声混匀，室温孵育1h；离心或磁场分离后，向其中加入硼酸盐缓冲液，2-8℃保存备用。

3)式II～V甘露多糖HSA包被T线

取式II～V甘露多糖HSA原以磷酸盐缓冲液稀释至1mg/mL，用划膜仪划到硝酸纤维素膜(Sartorius，CN140)的相应位置上，37℃干燥16h。

实施例2 制备甘露多糖抗体

1、动物免疫

用实施例1式II～V甘露多糖半抗原与载体蛋白KLH偶联步骤中所获得的式II-KLH、式III-KLH、式IV-KLH和式V-KLH免疫小鼠，免疫剂量为50μg/只。产生阳性血清后，加强免疫一次后进行细胞融合。

如需要制备多克隆抗体，可同样方法免疫山羊或兔子，取血清获得多克隆抗体。

2、细胞融合

PEG1500预温，吸取1×10⁷个SP2/0骨髓瘤细胞悬液和5×10⁷个免疫后的小鼠脾脏B淋巴细胞悬液(细胞数1∶5)与预温的50％PEG1500溶液融合，离心弃上清，加入10ml HAT(SIGMA)培养基重悬细胞，接种至已铺有滋养细胞的96孔细胞培养板进行培养。

3、筛选和克隆

融合细胞培养10-14天后，分别用式II-BSA、式III-BSA、式IV-BSA和式V-BSA包被微孔板进行筛选，阳性孔进行有限稀释，然后再培养10-14天，如此反复3-4次，获得抗式II～V单克隆杂交瘤细胞株。

4、腹水制备

单克隆细胞接种小鼠腹腔，待小鼠腹水积聚后收集腹水。将腹水在4℃条件下，10000转/分钟离心10分钟，去除脂类物质。离心后吸取上清，并用用0.45μm膜过滤。proteinG进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、分装、冻存备用。

5、人源化

分别对抗式II～V杂交瘤细胞株进行高变区测序，把该序列通过基因重组的方法，导入CHO 2.0载体，把高变区序列接到人IgG的Fc，并在CHO细胞表达，纯化获得抗式II～V甘露多糖人源化抗体。

实施例3 甘露多糖偶联物与AMCA比较

1、式II～V甘露多糖-BSA包被微孔板

1)将II～V甘露多糖BSA以包被缓冲液稀释至5μg/ml，包被到微孔板上，每孔100μl，4℃孵育16h或37℃孵育2h。

2)以PBST洗涤3次，甩干；

3)用含有1％牛血清白蛋白的蛋白溶液进行封闭，每孔加入200uL封闭液，37℃反应2h，弃去孔内封闭液，甩干；

4)将包被板置于37℃烘箱4h，即完成包被，以铝箔袋密封，存放于-20℃保存备用。

2、抗甘露多糖ELISA检测

1)将样本以样本稀释液稀释后加入到包被好的微孔板中，室温反应1h，洗板4次；

2)加入酶标二抗，37℃反应0.5h，洗板4次；

3)底物显色；

4)终止，读数；

5)用实施例2获得的抗式II～V人源化抗体配制标准品及质控品进行内控及半定量分析。

3、甘露多糖偶联物与AMCA结果比较

取20份血清样本(10份健康人血清，10份克罗恩病CD血清)，同时以自制试剂盒和对照AMCA试剂盒进行检测，结果见表1，与标准品计算后的数值大于100为阳性，小于等于100为阴性，其中式II～V的特异性分别为80％、80％、80％和90％，对照试剂盒的特异性为80％。式II～V灵敏度分别为50％、50％、60％和60％，对照试剂盒的阳性符合率即灵敏度为40％。该结果说明式II～式V四种甘露多糖偶联物用于CD辅助诊断均有效果，而且检测灵敏度均优于对照试剂盒AMCA。

表1 ELISA试剂盒与对照试剂AMCA测试结果对比

实施例4 甘露多糖偶联物用于管式化学发光检测

本实验所用SA预包被磁性微球及吖啶酯标记的羊抗人IgG和IgA均为市售产品。

可有两种不同的实现方法：

第一种：(1)按实施例1的步骤3方法，把式II～V甘露多糖偶联物直接包被在磁性微球上，此微球溶液为R1；(2)R2为吖啶酯标记的羊抗人IgG/IgA抗体。检测时把待检测血清样本与R1反应，之后磁性分离去除血清杂质，清洗3次，与R2反应，形成含有抗原-抗体-抗抗体夹心复合体，复合物进行吖啶酯荧光定量分析。

第二种：(1)按实施例1的步骤1方法，把式II～V甘露多糖偶联物生物素化，此溶液为R1；(2)R2为预包被SA的磁性微球；(2)R3为吖啶酯标记的羊抗人IgG/IgA抗体。检测时可用一步法或二步法，前者把代检样本、R1和R2同时反应；后者先把SA磁性微球与生物素化的R1反应，磁性分离并洗涤后加入代检样本。两种方法同样有效。一步法或二步法形成含有抗原-抗体-抗抗体夹心复合体，复合物进行吖啶酯荧光定量分析。

1)标准曲线制作

把吖啶酯标记的羊抗人IgG和IgA抗体各稀释5个浓度，分别为0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml。用上述第一种和第二种检测方法，分别获得标准曲线1和标准曲线2(见图3)。

2)样本检测

用上述第一种和第二种方法检测100例健康人血清及100例克隆恩病患者血清，两种检测方法无显著差异(p＜0.05)。第二种方法的ROC曲线见图4。当cut-off值设30ng/ml时，第二种方法的式II、式III、式IV和式V甘露多糖的ROC下曲线面积分别为0.665、0.720、0.735和0.760(表2)。提示这四种结构的甘露多糖灵敏度和特异性是式V，其他依次是式IV、式III和式II。

表2.曲线下的面积

实施例5 甘露多糖偶联物用于荧光免疫层析检测

1、荧光免疫层析试剂盒的制备

1)荧光微球的标记

以实施例1中3的方法，将式II～V甘露多糖偶联物和兔抗鸡IgY分别标记至荧光微球上。

2)样品垫和结合垫的制备

玻璃纤维素膜用含有表面活性剂的缓冲液(配方：100mM pH 7.4PB，其中含有2％NaCl，2％BSA、0.5％酪蛋白、0.1％吐温-20、0.5％S9和5％蔗糖)浸泡进行预封闭后，37℃干燥过夜，制备得到样品垫；

取制备好的样品垫，用喷金划膜仪将标记有式II～V甘露多糖偶联物的荧光微球和标记有兔抗鸡IgY抗体的荧光微球按照5μl/cm的量超声喷雾至预处理过宽为1cm的样品垫上，37℃干燥5h，制备得到结合垫。

3)硝酸纤维素膜(NC膜)的包被

用磷酸盐缓冲液将式II～V甘露多糖偶联物稀释至1mg/ml，用于制备T线；将鸡IgY抗体稀释至0.5mg/ml，用于制备C线；按1μl/cm划液量，用喷金划膜仪将上述两种溶液均匀的划至NC膜上制备T线和C线；将划好的NC膜放置于37℃干燥箱中，干燥16h。

4)组装

将步骤2)得到的结合垫叠压在步骤3)得到的硝酸纤维素膜的一端，并将吸水垫固定叠压在硝酸纤维素膜的另一端，最后将步骤2)得到的样品垫叠压在结合垫另一端，用微电脑自动斩切机按每条5.5mm的宽度进行裁剪，并装入层析条壳体中，即得成品。

2、标准曲线

式II～V甘露多糖单抗分别稀释5个浓度，分别：0ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml，将50μl以上校准品分别滴加到加样孔上，15分钟后用荧光检测仪检测，可在检测线T和质控线C位置上采集到荧光。以样品浓度与T/C值进行二次多项式拟合，绘制标准曲线，见图5。

3.样品检测

取50μl的待检血样，滴加到加样孔上，15分钟后用荧光检测仪检测，如果检测线出现条带，说明样品中含抗甘露多糖抗体，其含量可依据校准曲线获得。20例样本的检测结果见表2。式II～V甘露多糖抗体检测特异性分别为80％、80％、80％和90％，与ELISA法无差异；式II～V甘露多糖检测灵敏度分别为60％、60％、50％和60％，其中式II和式III比ELISA法略有提高，式IV和式V无差异。

表2 荧光免疫层析测试结果

实施例6 甘露多糖偶联物用于制备金标定性检测试剂

1、II～V甘露多糖HSA金标试剂盒的制备

1)胶体金的制备

在圆底烧瓶中加入100ml 0.01％氯金酸溶液，置于电热套上加热至沸腾，立刻加入2ml1％柠檬酸三钠溶液，继续搅拌15min，自然冷却后4℃保存备用。

2)胶体金标记

取胶体金10ml，加入适量0.1M K₂CO₃调节pH。混匀后加入适量II～V甘露多糖HSA或兔抗鸡IgY，继续搅拌30min；加入10％BSA至其终浓度为1％，继续搅拌30min；10000rpm4℃离心20min，收集沉淀，以胶体金稀释液(0.2M BB，1％BSA，3％海藻糖，0.03％procline300)定容至1ml。

3)样品垫和金标垫的制备

玻璃纤维素膜用处理液液(配方：100mM pH 7.4PB，其中含有2％BSA、0.5％吐温-20、0.5％S9和5％蔗糖)浸泡进行预封闭后，37℃干燥过夜，制备得到样品垫；

取制备好的样品垫，用喷金划膜仪将标记有II～V甘露多糖HSA的金标复合物和兔抗鸡IgY抗体标记的金标复合物按照5μl/cm的量喷至预处理过宽为1cm的样品垫上，37℃干燥5h，制备得到金标垫。

4)硝酸纤维素膜(NC膜)的包被

用磷酸盐缓冲液将II～V甘露多糖HSA稀释至1mg/ml，用于制备T线；将鸡IgY抗体稀释至0.5mg/ml，用于制备C线；按1μl/cm划液量，用喷金划膜仪将上述两种溶液均匀的划至NC膜上制备T线和C线；将划好的NC膜放置于37℃干燥箱中，干燥16h。

5)组装

将上述金标垫、样品垫、包被好的NC膜以及吸水垫等辅料组装成金标试剂盒。

2、试剂盒检测

(1)检测方法

取样本以样本稀释液(BB，0.5％s9，1％BSA)稀释后取100μl，直接加入层析条中样品窗口；15min后，目测观察结果。

(2)结果判定

阴性结果(-)：仅出现质控线，无检测线；

阳性结果(+)：质控线与检测线同时出现；

无效结果：质控线不出现，表明操作错误或试剂盒失效。

(3)检测

取100μl实施例5配制的标准品及20例血清样本分别加入层析条中样品窗口；15min后，目测观察结果。具体结果见表3。式II～V甘露多糖抗体检测的特异性70～90％，灵敏度40～50％。与对应的管式化学发光及荧光免疫层析略低，但与对照试剂的结果无显著差异，提示本发明式II～V甘露多糖偶联物用于制备抗甘露多糖抗体检测都是有效的。

表3 金标试剂测试结果

Claims (11)

1.一种式I甘露多糖半抗原，其特征在于，甘露多糖是通过alpha-1，3和alpha-1，2连接而成，其中n1、n2、n3和n为大于等于1的整数，分别表示alpha-1，3糖苷键、alpha-1，2糖苷键、CH2和甘露多糖的数量。R表示NH2或COOH。

2.权利要求1所述的甘露多糖半抗原，优选地，alpha-1，3糖苷键的数量为1～6个，alpha-1，2连接的糖苷键数量为2～6个，更优选地，为式II～式V所示的甘露多糖。

3.权利要求1-2所述的甘露多糖半抗原，其特征在于，通过R与载体物质偶联，形成甘露多糖抗原。

4.权利要求3所述的载体物质，其特征在于，包括但不限于蛋白质、蛋白质片段、合成多肽或半合成多肽。

5.权利要求4所述的蛋白质，其特征在于，包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、铜蓝蛋白(KLH)、牛甲状腺球蛋白(BTG)。

6.一种甘露多糖抗原的应用，其特征在于，用权利要求3所述甘露多糖抗原免疫动物，获得抗甘露多糖抗体。

7.一种抗甘露多糖抗体检测的方法，该抗体来自粪便和/或体液，该方法通过与权利要求1-5所述的甘露多糖半抗原或抗原的免疫反应来进行，包括如下步骤：

(1)将权利要求1～5所述的甘露多糖及偶联物包被在固相载体上；

(2)待检测粪便和/体液作用于固相载体；

(3)通过标记物测定样品中抗甘露多糖抗体的含量。

8.权利要求7所述的方法，其特征在于，所述固相载体包括但不限于荧光微球、树脂微球、磁性微球、胶体金颗粒、微孔板、薄膜、微孔膜、硝酸纤维素膜。

9.权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的标记物包括但不限于荧光性稀土、酶、吖啶酯、胶体金、彩色乳胶。

10.权利要求7所述的方法，其特征在于，所述体液为血液。

11.权利要求7所述的方法，其特征在于，所述体液为血清。