CN109879967A - 一种乙酰氨基葡萄糖偶联物的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种式I乙酰氨基葡萄糖偶联物及应用，属于免疫学检测技术领域。本发明的技术方案是把式I结构的乙酰氨基葡萄糖与含‑COOH的载体物质通过脱水缩合反应，形成乙酰氨基葡萄糖偶联物。通过上述方法获得的乙酰氨基葡萄糖偶联物可用于制备抗乙酰氨基葡萄糖抗体，以及应用于免疫方法检测样品中的抗乙酰氨基葡萄糖抗体。用本发明获得的乙酰氨基葡萄糖偶联物制备抗乙酰氨基葡萄糖抗体检测试剂，具有灵敏度高、特异性强、性能稳定等优点。

Description

一种乙酰氨基葡萄糖偶联物的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种式I乙酰氨基葡萄糖偶联物及应用，具体涉及乙酰氨基葡萄糖偶联物结构、制备方法，以及在制备抗乙酰氨基葡萄糖抗体检测试剂中的应用。属于免疫学技术领域。

背景技术

微生物细胞壁多糖在一些自体免疫性疾病的发生发展过程中起重要作用，这些自体免疫性疾病患者的血清中能检测到多种多糖的抗体。其中抗酿酒酵母细胞壁多糖IgA(anti-Saccharomyces cerevisiae immunoglobulin A，ASCA-IgA)和抗酿酒酵母细胞壁多糖IgG (anti-Saccharomyces cerevisiae immunoglobulin G，ASCA-IgG)是被临床广泛认可的克罗恩病的特异性指标。乙酰氨基葡萄糖是酿酒酵母细胞壁多糖的组分之一，不排除克罗恩病特异性指标ASCA中含有乙酰氨基葡萄糖抗原表位。迄今为止，在临床应用的酿酒酵母细胞壁多糖抗原是天然结构的糖蛋白，其中包含了三种不同糖苷键连接的甘露多糖，以及与乙酰氨基葡萄糖以beta-1，4糖苷键连接的乙酰氨基葡萄糖。由于ASCA检测试剂的各厂家原料来源不同，抗原表位的暴露程度不同，质控难度大，检测结果差异显著。为此，以色列科学家发明了用乙酰氨基葡萄糖作为抗原的乙酰氨基葡萄糖二糖anti-chitobiosidecarbohydrate IgA antibodies(ACCA)以及乙酰氨基葡萄糖多聚糖为抗原的anti-chitinIgA antibodies(anti-C)检测试剂。对比文献US2008/0085838A1公布了乙酰氨基葡萄糖寡糖基与固相载体偶联的方法，其是通过活化1号位-OH与固相载体偶联，这种方法的缺陷是无法保证只跟1号位-OH偶联，如果跟其他位的-OH偶联，会影响与抗体结合，对试剂的稳定性造成显著影响，前期研究发现商品化的ACCA。而且1号位的偶联步骤繁琐、效率低下，最终试剂稳定性差。

此外，目前ACCA和anti-C的检测主要是ELISA，该方法检测时间长，不适合门诊快速检测，临床上需要更便捷、快速的检测技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乙酰氨基葡萄糖偶联物，及其在检测抗乙酰氨基葡萄糖抗体中的应用。

本发明的第一方面，提供一种式I所示乙酰氨基葡萄糖偶联物的结构，其中一个糖基的2 号位-NH2上通过肽键连接载体物质。所述乙酰氨基葡萄糖偶联物比对比文献公布的在1号位偶联具有操作简单、性能稳定、特异性高、不破坏抗原表位等优点。

本发明的第二方面，提供一种乙酰氨基葡萄糖偶联物的制备方法，包括以下步骤：

1)与生物素反应

①取生物素、二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于DMF中，室温磁力搅拌反应，离心收集上清液；

②取式I乙酰氨基葡萄糖溶于磷酸缓冲液中；

③将①中溶液搅拌下逐滴加入到②所得溶液中，搅拌反应；

④缓冲液透析，得到偶联物。

2)与蛋白质、蛋白质片段、合成多肽或半合成多肽反应

取蛋白质、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和式I乙酰氨基葡萄糖溶于DMF中，搅拌反应；缓冲液透析，得到偶联物。

一种优选方案，式I中的R为NH2，此NH2基团跟生物素反应被生物素化，然后与固相载体上的链亲和素反应，或先跟亲和素形成复合物再包被到固相载体上。固相载体包括但不限于树脂微球、乳胶微球、磁微粒、微孔板、硝酸纤维素膜。

本发明的第三方面，公开前述的乙酰氨基葡萄糖偶联物在检测或测定样品中抗乙酰氨基葡萄糖抗体的应用。

本发明提供的抗乙酰氨基葡萄糖抗体检测中的应用，是基于免疫学反应的对样本中抗乙酰氨基葡萄糖抗体的测定方法，包括如下步骤：

(1)将前述的乙酰氨基葡萄糖偶联物包被在固相载体上；(2)待检测样本作用于固相载体，使样本中的抗乙酰氨基葡萄糖抗体与固相载体上的乙酰氨基葡萄糖抗原结合；(3)通过标记物测定样品中抗乙酰氨基葡萄糖抗体的含量。

乙酰氨基葡萄糖偶联物可通过目前任何一种免疫学检测方法检测样本中的抗乙酰氨基葡萄糖抗体，比如ELISA、板式化学发光、管式化学发光、免疫层析、免疫渗滤等等。

在实施例3中，为了比较本发明乙酰氨基葡萄糖偶联物与对比文献ACCA用于克罗恩的检测效果，把乙酰氨基葡萄糖偶联物生物素化，包被在预包被有亲和素的微孔板，用于ELISA检测，验证了本发明乙酰氨基葡萄糖偶联物具有更高的灵敏度。

实施例4所示是一种抗乙酰氨基葡萄糖抗体的管式化学发光方法，所述方法是通过把乙酰氨基葡萄糖偶联物包被在磁微粒上，与样本作用，捕获样本中的抗乙酰氨基葡萄糖抗体，然后用标记抗人IgG或/和IgA检测样本中的抗乙酰氨基葡萄糖抗体含量。为了进一步提高检测灵敏度，实施例中的乙酰氨基葡萄糖偶联物经过生物素-链亲和素放大系统包被在磁微粒上。该检测方法具有灵敏度高、检测时间短、全自动检测等优点。

实施例5和6是提供抗乙酰氨基葡萄糖抗体的免疫层析方法，其中实施例5是荧光免疫层析定量检测，实施例6是胶体金定性检测。所述荧光免疫层析定量检测方法是把乙酰氨基葡萄糖偶联物包被在荧光微球和检测线T线上，形成双抗原夹心法检测样本中的抗乙酰氨基葡萄糖抗体含量。为了提高检测灵敏度，优选地，乙酰氨基葡萄糖偶联物经过生物素化通过链亲和素包被在荧光微球上。该检测方法具有快速、检测时间短、仪器成本小等优点。

与现有技术相比，本发明提供的乙酰氨基葡萄糖偶联物及应用在克罗恩病等自体免疫性疾病诊断方面，具有灵敏度高、性能稳定、操作简单等优点。

附图说明

图1式I乙酰氨基葡萄糖结构示意图

图2管式化学发光定量检测标准曲线

图3管式化学发光试剂检测的特异性与灵敏度

图4荧光免疫层析试剂标准曲线

具体实施方式

本发明所用的式I乙酰氨基葡萄糖原料是市售的脱酰胺度为20％左右的壳聚糖。

对照试剂盒ACCA购自以色列Glycominds公司。

生物素购自Sigma。亲和素购自盘古基因。其他试剂购自国药试剂。

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。

实施例1 式I乙酰氨基葡萄糖偶联物制备

1、式I乙酰氨基葡萄糖生物素偶联物的制备

①取0.01mM生物素、0.01mM二环己基碳二亚胺(DCC)和0.01mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于2ml DMF中，室温磁力搅拌反应16h后，3000rpm离心5min，收集上清液；

②取20mg式I乙酰氨基葡萄糖，溶于1ml磷酸缓冲液中；

③将①中溶液搅拌下逐滴加入到②所得溶液中，2-8℃搅拌反应16h；

④用磷酸盐缓冲液于2-8℃透析24h，得到生物素化式I乙酰氨基葡萄糖。

2、式I乙酰氨基葡萄糖与BSA/HSA/KLH偶联

取式I乙酰氨基葡萄糖、DCC和NHS溶于DMF中，室温磁力搅拌反应16h后，离心收集上清液；将上清液逐滴加入到BSA、HSA或KLH溶液中，2-8℃搅拌反应16h后以磷酸盐缓冲液于2-8℃透析24h，得到式I乙酰氨基葡萄糖与载体蛋白BSA/HSA/KLH偶联物，即式 I乙酰氨基葡萄糖-BSA、式I乙酰氨基葡萄糖-HSA和式I乙酰氨基葡萄糖-KLH。

3、乙酰氨基葡萄糖与多肽偶联

取20mg多肽，0.01mM 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和20mg式I乙酰氨基葡萄糖溶于2ml DMF中，2-8℃搅拌反应16h；用磷酸盐缓冲液于2-8℃透析24h，得到偶联物。

实施例2 制备抗乙酰氨基葡萄糖抗体

1、动物免疫

用实施例1式I乙酰氨基葡萄糖KLH免疫小鼠，免疫剂量为50μg/只。产生阳性血清后，加强免疫一次后进行细胞融合。

如需要制备多克隆抗体，可同样方法免疫山羊或兔子，取血清获得多克隆抗体。

2、细胞融合

PEG1500预温，吸取1×10⁷个SP2/0骨髓瘤细胞悬液和5×10⁷个免疫后的小鼠脾脏B淋巴细胞悬液(细胞数1∶5)与预温的50％PEG1500溶液融合，离心弃上清，加入10ml HAT(SIGMA) 培养基重悬细胞，接种至已铺有滋养细胞的96孔细胞培养板进行培养。

3、筛选和克隆

融合细胞培养10-14天后，用实施例1制备的式I乙酰氨基葡萄糖-BSA包被微孔板进行筛选，阳性孔进行有限稀释，然后再培养10-14天，如此反复3-4次，获得抗式I乙酰氨基葡萄糖的单克隆杂交瘤细胞株。

4、腹水制备

单克隆细胞接种小鼠腹腔，待小鼠腹水积聚后收集腹水。将腹水在4℃条件下，10000转 /分钟离心10分钟，去除脂类物质。离心后吸取上清，并用用0.45μm膜过滤。protein G 进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、分装、冻存备用。

实施例3 乙酰氨基葡萄糖偶联物与ACCA比较

1、乙酰氨基葡萄糖偶联物包被微孔板

(1)将实施例1制备的式I乙酰氨基葡萄糖BSA以包被缓冲液稀释至5μg/ml，包被到微孔板上，每孔100μl，4℃孵育16h或37℃孵育2h。

(2)以PBST洗涤3次，甩干；

(3)用含有1％牛血清白蛋白的蛋白溶液进行封闭，每孔加入200uL封闭液，37℃反应2h，弃去孔内封闭液，甩干；

(4)将包被板置于37℃烘箱4h，即完成包被，以铝箔袋密封，存放于-20℃保存备用。

2、抗乙酰氨基葡萄糖抗体ELISA检测

(1)将样本以样本稀释液稀释后加入到包被好的微孔板中，室温反应1h，洗板4次；

(2)加入酶标二抗，37℃反应0.5h，洗板4次；

(3)底物显色；

(4)终止，读数。

3、抗乙酰氨基葡萄糖抗体与ACCA结果比较

取20份血清样本(10份阳性，10份阴性)，同时以式I乙酰氨基葡萄糖抗体检测试剂盒和对照试剂盒ACCA进行检测，定值方法参照对照试剂盒，高于100为阳性，低于或等于100为阴性。结果如表1，式I试剂盒的特异性和灵敏度分别为80％和50％，而对照试剂盒的特异性和灵敏度分别为80％和30％，提示式I乙酰氨基葡萄糖经本发明的方法偶联后，检测灵敏度有显著提高。

表1 两种试剂盒测试结果对比

实施例4 乙酰氨基葡萄糖偶联物用于制备管式化学发光检测试剂

本实验所用SA预包被磁性微球及吖啶酯标记的羊抗人IgG和IgA均为市售产品。

可有两种不同的实现方法：

第一种：(1)按实施例1的步骤3方法，把式I乙酰氨基葡萄糖偶联物直接包被在磁性微球上，此微球溶液为R1；(2)R2为吖啶酯标记的羊抗人IgG/IgA抗体。检测时把待检测血清样本与R1反应，之后磁性分离去除血清杂质，清洗3次，与R2反应，形成含有抗原-抗体-抗抗体夹心复合体，复合物进行吖啶酯荧光定量分析。

第二种：(1)按实施例1的步骤1方法，把式I乙酰氨基葡萄糖偶联物生物素化，此溶液为R1；(2)R2为预包被SA的磁性微球；(2)R3为吖啶酯标记的羊抗人IgG/IgA抗体。检测时可用一步法或二步法，前者把代检样本、R1和R2同时反应；后者先把SA磁性微球与生物素化的R1反应，磁性分离并洗涤后加入代检样本。两种方法同样有效。一步法或二步法形成含有抗原-抗体-抗抗体夹心复合体，复合物进行吖啶酯荧光定量分析。

1)标准曲线制作

把吖啶酯标记的羊抗人IgG和IgA抗体各稀释5个浓度，分别为0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml。用上述第一种和第二种检测方法，分别获得标准曲线1和标准曲线2(见图2)。

2)样本检测

用上述第一种和第二种方法检测100例健康人血清及100例克隆恩病患者血清，两种方法的ROC曲线见图3。第一种ROC下曲线面积0.715，第二种0.733，第二种灵敏度与特异性略优。

实施例5 乙酰氨基葡萄糖偶联物用于制备荧光免疫层析检测试剂

本实验所用抗体标准品为实施例2所制备的抗式I乙酰氨基葡萄糖鼠单抗，兔抗鸡IgY市售。

1、荧光免疫层析试剂盒的制备

(1)荧光微球的标记

取荧光微球微球200μl(210nm)(1％原液)，13000rpm，4℃离心10min，弃上清，加入400ul 去离子水超声10S混匀；离心，加入MES buffer(50mM，PH6.0)400μl，超声混匀；离心，加入EDC溶液，室温反应15分钟；离心，加入标记抗体(乙酰氨基葡萄糖偶联物和兔抗鸡IgY)100ug，室温摇床中速反应2小时；离心，加入封闭液，冰水超声混匀，室温摇床中速反应1 小时；离心，加入400μl硼酸盐缓冲液(20mM PH8.0)，冰水超声混匀，4℃保存待用。

(2)样品垫和结合垫的制备

玻璃纤维素膜用含有表面活性剂的缓冲液(配方：100mM pH 7.4PB，其中含有2％NaCl， 2％BSA、0.5％酪蛋白、0.1％吐温-20、0.5％S9和5％蔗糖)浸泡进行预封闭后，37℃干燥过夜，制备得到样品垫；

取制备好的样品垫，用喷金划膜仪将标记有荧光微球的乙酰氨基葡萄糖和兔抗鸡IgY抗体按照5μl/cm的量喷至预处理过宽为1cm的样品垫上，37℃干燥5h，制备得到结合垫。

(3)硝酸纤维素膜(NC膜)的包被

用磷酸盐缓冲液将乙酰氨基葡萄糖偶联物稀释至1mg/ml，用于制备T线；将鸡IgY抗体稀释至0.5mg/ml，用于制备C线；按1μl/cm划液量，用喷金划膜仪将上述两种溶液均匀的划至NC膜上制备T线和C线；将划好的NC膜放置于37℃干燥箱中，干燥16h。

(4)组装

将步骤2)得到的结合垫叠压在步骤3)得到的硝酸纤维素膜的一端，并将吸水垫固定叠压在硝酸纤维素膜的另一端，最后将步骤2)得到的样品垫叠压在结合垫另一端，用微电脑自动斩切机按每条5.5mm的宽度进行裁剪，并装入层析条壳体中，即得成品。

2、标准曲线

抗式I鼠单抗稀释5个浓度，分别：0ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml，将50μl以上校准品分别滴加到加样孔上，15分钟后用荧光检测仪检测，可在检测线T和质控线C位置上采集到荧光。以样品浓度与T/C值进行二次多项式拟合，绘制标准曲线，R²为0.9985，见图4。质控线用于试纸有效性判断以及对检测线信号作相应校正，如质控线未出现条带，则说明试纸失效。

3.样品检测

取50μl的待检血样，滴加到加样孔上，15分钟后用荧光检测仪检测，如果检测线出现条带，说明样品中含抗式I抗体，其含量可依据校准曲线获得。20例样本的检测结果见表2。当cut-off值设30ng/ml时，特异性为80％，灵敏度为60％。与实施例3酶联免疫吸附法相比，特异性无差异，灵敏度有明显提高。

表2 荧光免疫层析测试结果

实施例6 乙酰氨基葡萄糖偶联物用于制备金标定性检测试剂

1、乙酰氨基葡萄糖HSA金标试剂盒的制备

1)胶体金的制备

在圆底烧瓶中加入100ml 0.01％氯金酸溶液，置于电热套上加热至沸腾，立刻加入2ml1％柠檬酸三钠溶液，继续搅拌15min，自然冷却后4℃保存备用。

2)胶体金标记

取胶体金10ml，加入适量O.1M K₂CO₃调节pH。混匀后加入适量式I乙酰氨基葡萄糖HSA 或兔抗鸡IgY，继续搅拌30min；加入10％BSA至其终浓度为1％，继续搅拌30min；10000rpm 4℃离心20min，收集沉淀，以胶体金稀释液(0.2M BB，1％BSA，3％海藻糖，0.03％proeline300) 定容至1ml。

3)样品垫和金标垫的制备

玻璃纤维素膜用处理液液(配方：100mM pH 7.4PB，其中含有2％BSA、0.5％吐温-20、 0.5％S9和5％蔗糖)浸泡进行预封闭后，37℃干燥过夜，制备得到样品垫；

取制备好的样品垫，用喷金划膜仪将标记有式I乙酰氨基葡萄糖HSA的金标复合物和兔抗鸡IgY抗体标记的金标复合物按照5μl/cm的量喷至预处理过宽为1cm的样品垫上，37℃干燥5h，制备得到金标垫。

4)硝酸纤维素膜(NC膜)的包被

用磷酸盐缓冲液将式I乙酰氨基葡萄糖HSA稀释至1mg/ml，用于制备T线；将鸡IgY抗体稀释至0.5mg/ml，用于制备C线；按1μl/cm划液量，用喷金划膜仪将上述两种溶液均匀的划至NC膜上制备T线和C线；将划好的NC膜放置于37℃干燥箱中，干燥16h。

5)组装

将上述金标垫、样品垫、包被好的NC膜以及吸水垫等辅料组装成金标试剂盒。

2、试剂盒检测

(1)检测方法

取样本以样本稀释液(BB，0.5％s9，1％BSA)稀释后取100μl，直接加入层析条中样品窗口；15min后，目测观察结果。

(2)结果判定

阴性结果(-)：仅出现质控线，无检测线；

阳性结果(+)：质控线与检测线同时出现；

无效结果：质控线不出现，表明操作错误或试剂盒失效。

(3)检测

取100μl实施例5配制的标准品及20例血清样本分别加入层析条中样品窗口；15min后，目测观察结果。具体结果见表3。金标试剂检测的特异性为80％，灵敏度为40％，其中灵敏度不如荧光免疫层析。

表3 金标试剂测试结果

浓度	结果		10例阴性血清样本	10例阳性血清样本
					0	-	1	-	-
25	-	2	+	+
					50	+	3	+	-
100	+	4	-	-
					200	+	5	-	-
/	/	6	-	+
					/	/	7	-	+
/	/	8	-	+
					/	/	9	-	-
/	/	10	-	-
					/	/		敏感度80％	特异性40％

Claims (9)

1.一种式I所示乙酰氨基葡萄糖偶联物，其特征在于，糖基间以beta-1，4糖苷键连接，其中乙酰氨基葡萄糖数量n为大于1或等于1的整数，R为载体物质，与其中一个糖基的2号位NH2以肽键连接。

2.一种乙酰氨基葡萄糖偶联物的制备方法，其特征在于，式I中的游离-NH2与载体物质中的-COOH的脱水缩合反应形成偶联物，包括以下步骤：

1)与生物素反应

①取生物素、二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于DMF中，搅拌反应，离心收集上清液；

②取式I乙酰氨基葡萄糖溶于缓冲液中；

③将①中溶液搅拌下逐滴加入到②所得溶液中，搅拌反应；

④缓冲液透析，得到偶联物。

2)与蛋白质、蛋白质片段、合成多肽或半合成多肽反应

取蛋白质或多肽、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和式I乙酰氨基葡萄糖溶于DMF中，搅拌反应；缓冲液透析，得到偶联物。

3.权利要求2所述的载体物质，为含有-COOH的有机物，包括但不限于生物素、蛋白质、蛋白质片段、合成多肽或半合成多肽。

4.权利要求3所述的蛋白质，其特征在于，包括但不限于亲和素(SA)、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、铜蓝蛋白(KLH)、牛甲状腺球蛋白(BTG)。

5.一种乙酰氨基葡萄糖抗原的应用，其特征在于，用权利要求4所述乙酰氨基葡萄糖抗原免疫动物，获得抗乙酰氨基葡萄糖抗体。

6.一种抗乙酰氨基葡萄糖抗体检测方法，该抗体来自粪便和/或体液，通过与权利要求1～4所述的乙酰氨基葡萄糖偶联物的免疫反应来进行，其中在免疫反应中使用所述乙酰氨基葡萄糖偶联物与固相载体结合，检测所述抗乙酰氨基葡萄糖抗体。

7.权利要求6所述的固相载体，其特征在于，包括但不限于荧光微球、树脂微球、磁性微球、胶体金颗粒、微孔板、薄膜、微孔膜、硝酸纤维素膜。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述体液为血液。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述体液为血清。