CN113024669A - 含氨基或羧基基团物质标记的rbp抗体、人rbp免疫层析检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

含氨基或羧基基团物质标记的rbp抗体、人rbp免疫层析检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种含氨基或羧基基团物质标记的RBP抗体、人RBP免疫层析检测试剂盒及其制备方法，所述含氨基或羧基基团物质标记的抗体的制备方法，包括以下步骤：1)将RBP单克隆抗体溶于酸性缓冲液中，之后加入胃蛋白酶进行酶切反应；2)将酶切后的混合溶液使用中性缓冲液透析过夜；3)将得到的液体通过Protein A亲和纯化，DEAE纤维素阴离子交换层析法纯化获得RBP‑F(ab’)2；4)将得到的液体通过Protein A亲和纯化，DEAE纤维素阴离子交换层析法纯化获得RBP‑F(ab’)2；5)将得到的抗体中间体与含氨基或羧基基团的物质共价结合，得到含氨基或羧基基团物质标记的RBP抗体。本发明的定向偶联技术能减少补体对检测试剂的影响，降低非特异性结合带来的干扰。

Description

含氨基或羧基基团物质标记的RBP抗体、人RBP免疫层析检测 试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于体外诊断领域，具体涉及一种含氨基或羧基基团物质标记的RBP抗体、人RBP免疫层析检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
常用的检测用抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，是一种IgG。当抗体结合抗原后，补体与抗体Fc段的补体结合位点结合，对检测试剂造成干扰。此外，Fc段的存在也可能使检测试剂存在假性干扰。
另外，当前的抗体偶联技术多采用共价偶联。由于抗体表面含有丰富的氨基和羧基，这两类基团也是抗体偶联中使用最多的官能团。通常采用的策略是将固相如磁性微球，聚苯乙烯微球或者酶类等表面的羧基用EDC/NHS活化，再与抗体表面氨基形成稳定的酰胺键。极少会采用EDC/NHS对抗体表面的羧基进行活化，因为抗体表面本身带有氨基，容易产生自交联的情况。由于氨基和羧基在抗体表面是普遍存在的，因此这种偶联方法也是随机的。当标记于抗体的互补决定区时，会使抗体失活。即使标记位于Fc段也会因空间位阻的存在造成免疫活性的降低。
视黄醇结合蛋白(Retinol-Binding Protein，RBP)是血液中维生素的转运蛋白，由肝脏合成、广泛分布于血液、脑脊液、尿液及其他体液中。测定视黄醇结合蛋白能早期发现肾小管的功能损害，并能灵敏反映肾近曲小管的损害程度，可作为肾功能早期损害和监护治疗的指标，还可作为肝功能早期损害和监护治疗的指标。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种含氨基或羧基基团物质标记的RBP抗体、人RBP免疫层析检测试剂盒及其制备方法。
为了实现上述目的，本发明提供了一种含氨基或羧基基团物质标记的RBP抗体的制备方法，包括以下步骤：
1)将RBP单克隆抗体溶于酸性缓冲液中，之后加入胃蛋白酶进行酶切反应；
2)将步骤1)酶切后的混合溶液使用中性缓冲液透析过夜；
3)步骤2)得到的液体通过Protein A亲和纯化，DEAE纤维素阴离子交换层析法纯化获得RBP-F(ab’)2；
4)将步骤3)得到的RBP-F(ab’)2与HOOC-(CHCHO)n-NH2共价偶联，形成抗体中间体；
5)将步骤4)得到的抗体中间体与含氨基或羧基基团的物质共价结合，得到含氨基或羧基基团物质标记的RBP抗体。
在本发明的一个具体方案中，其中步骤1)中，所述RBP抗体、胃蛋白酶与酸性缓冲液与的质量比例为(0.5-1)：(0.5-1)：10000，优选为1:1：10000。所述IgG抗体为能与抗原特异性结合的单克隆抗体，能被胃蛋白酶切成F(ab’)2段，且保留结合抗原的活性。
在本发明的一个具体方案中，其中步骤1)中，所述酶切反应的温度为37℃-55℃，优选为37℃，这是酶在37℃时的活性较好；所述酶切反应的时间为0.5-2小时。优选时间为30min，优选时间下，反应程度达到最高，时间再往后，趋于平稳，30min既能充分反应，又能节约试验时间。
在本发明的一个具体方案中，其中步骤1)中，所述酸性缓冲液为pH值在1～7之间的缓冲液，优选为pH3.0，优选后能使胃蛋白酶保留酶切活性，包括但不限于柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、Tris-磷酸盐缓冲液、有机酸缓冲液、氨基酸缓冲液、MES缓冲液，优选为柠檬酸缓冲液，这样优选后胃蛋白酶保留酶切活性可以达到最大。
在本发明的一个具体方案中，其中步骤2)中，所述中性透析缓冲液为pH在6～8之间的缓冲液，包括但不限于磷酸缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、MES缓冲液，优选为0.1M的磷酸盐缓冲液pH7.0，这样优选后可以能够保持透析物质的活性。
在本发明的一个具体方案中，其中步骤2)中，所述透析的截留分子量为7000-50000D。
在本发明的一个具体方案中，其中步骤4)中，所述HOOC-(CHCHO)n-NH2中的n为3～100000之间，优选为HOOC-(CH CH O)12-NH2，这样优选后能够使偶联效率更高。
在本发明的一个具体方案中，其中步骤4)中，所述抗体-F(ab’)2与HOOC-(CHCHO)n-NH2的质量比例为(0.5-1)：1。优选比例为1：1，优选后，抗体与HOOC-(CHCHO)n-NH2能够充分反应，反应程度最佳；既不会浪费原料又能达到最佳结合效果。
在本发明的一个具体方案中，其中步骤5)中，所述抗体中间体与含氨基或羧基基团的物质的质量比例为1：(5-10)，优选为1:6，当达到1:6，反应达到最高点，往后趋于平稳，因此1:6时既能节约原料，又能使反应程度达到顶峰。
在本发明的一个具体方案中，其中步骤5)中，所述含氨基或羧基基团的物质为蛋白、抗体、抗原、酶类、氨基酸、聚苯乙烯微球、量子点、磁性颗粒、金属颗粒或胶体金，选择不局限，不受原材料太多限制，优选为金属颗粒，能够使获得的标记物质具有更好的分散性，分离能力。
为了实现上述目的，本发明还提供了一种含氨基或羧基基团物质标记的RBP抗体，所述RBP抗体是通过上述的方法制得；所述含氨基或羧基基团的物质为蛋白、抗体、抗原、酶类、氨基酸、聚苯乙烯微球(如乳胶荧光微球)、量子点、磁性颗粒、金属颗粒或胶体金。
为了实现上述目的，本发明还提供了一种RBP免疫层析检测试剂盒，包括试纸条，所述试纸条包括检测线及质控线，所述检测线上包被有一株RBP单克隆抗体，所述质控线上包被有羊抗兔多克隆抗体；所述标记物垫上包被有所述的含氨基或羧基基团物质标记的另一株RBP单克隆抗体和标记物标记的兔IgG。
在本发明的一个具体方案中，其中所述试纸条还包括PVC板，所述PVC板上固定有依次连接的样品垫、标记物垫、包被垫及吸水垫，所述包被垫上依次设有检测线及质控线，所述样品垫和标记物垫连接为一体。
在本发明的一个具体方案中，其中所述包被垫靠近检测线的一端连接有标记物垫，靠近质控线的一端连接有吸水垫。
在本发明的一个具体方案中，其中所述含氨基或羧基基团物质标记的另一株RBP单克隆抗体和标记物标记的兔IgG多克隆抗体的摩尔比为1:0.2～4。
在本发明的一个具体方案中，其中所述含氨基或羧基基团的物质为蛋白、抗体、抗原、酶类、氨基酸、聚苯乙烯微球(如乳胶荧光微球)、量子点、磁性颗粒、金属颗粒或胶体金；所述标记物为荧光微球、胶体金、胶体硒、彩色乳胶或磁性微球；优选为荧光微球，这样优选后使获得的标记物质具有更好的分散性和层析能力。
在本发明的一个具体方案中，其中所述RBP免疫层析检测试剂盒还包括用于卡设试纸条的卡壳。
在本发明的一个具体方案中，其中所述卡壳包括：
底槽，其连接于所述PVC板；
上盖，其连接于所述底槽，所述上盖上设置有用于向所述样品垫上加样的加样孔；
观察窗，其设置于上盖上并用于检测线和质控线的数据采集。
为了实现上述目的，本发明还提供了一种RBP免疫层析检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)包被垫的制备：将一株RBP单克隆抗体和羊抗兔多克隆抗体分别包被到硝酸纤维素膜上，干燥备用；
2)标记物垫的制备：将含氨基或羧基基团物质标记的另一株RBP单克隆抗体和标记物标记的兔IgG混合后，喷涂在玻璃纤维素膜上，干燥备用；
3)组装试纸条：在PVC板上粘接包被垫，并在靠近该包被垫上的质控线的一端搭接吸水垫，在靠近该包被垫上的检测线的一端搭接标记物垫及其连接的样品垫；然后将其切成所需宽度的试纸条，之后将该试剂条放入卡壳。
为了实现上述目的，本发明还提供了一种RBP免疫层析检测试剂盒的使用方法，所述方法所用的样本为选自人血清、血浆以及全血。
在本发明的一个具体方案中，其中所述的使用方法，包括以下步骤：
将所采取的样本经样本进行样本前处理，随后取60μL处理好的待测样本滴加到RBP免疫层析检测试剂盒的加样孔处，静置15～20min，然后插入荧光免疫分析仪进行检测，即时可获得检测结果。
在本发明的一个具体方案中，其中所述的使用方法，包括以下步骤：
所述样本前处理的方式为：采血管取样本，离心，分离得血清或血浆即为待测样本；全血无需处理即为待测样本。
本发明的有益效果如下：
1、本发明的定向偶联技术能减少补体对检测试剂的影响，降低非特异性结合带来的干扰。
2、本发明的定向偶联技术能降低标记抗体的空间位阻，提高标记抗体的活性。
3、本发明的定向偶联技术能提高原有抗体的检测灵敏度和特异性。
4、本发明所述的定向偶联技术抗体用量少，节约了成本。
附图说明
图1为本发明实施例所提供的RBP免疫层析试纸条示意图；
图2A为本发明实施例所提供的RBP的免疫层析检测试剂盒中一种上盖的内部结构示意图；
图2B为本发明实施例所提供的RBP的免疫层析检测试剂盒中一种底槽的内部结构示意图；
图3为本发明的RBP标准曲线图；
图4为本发明实施例2得到的试剂盒对40例不同样本(其中20例正常人，20例为阳性患者)进行人IgG检测的ROC曲线界面；
图5是本发明对比例1得到的试剂盒对40例不同样本(其中20例正常人，20例为阳性患者)进行人IgG检测的ROC曲线界面。
其中，1-PVC板，2-包被垫，3-标记物垫，4-吸水垫，5-检测线，6-质控线，7-标记物结合处，8-样本，9-样品垫，11-上盖，12-底槽，13-加样孔，14-观察窗，15-试纸条放置区域，16-定位柱，17-定位孔，18-第一限定部，19-第二限定部，20-第三限定部。
具体实施方式
下面结合说明书附图对本发明进行进一步说明。
以下材料或试剂，除非特别说明，均为市售。
实施例1：
1.视黄醇结合蛋白(RBP)免疫层析检测试剂盒的制备
1)制备RBP-F(ab’)2
取10mg RBP单克隆抗体，以0.1M，pH3-5的柠檬酸缓冲液稀释至2mg/ml。随后在0.1M，pH3-5的柠檬酸缓冲液中搅拌(截留分子量为7000D)透析6小时后取出置于西林瓶中。
取胃蛋白酶1mg加入西林瓶中，搅拌混匀，随后37℃温育3小时。然后将其用0.1M，pH8.0的PBS透析24小时(截留分子量为5万D)。
用0.1M的PB(pH7.0)缓冲液平衡Protein A亲和层析柱，流速1ml/min，体积应>20ml，平衡至OD280<0.01。将透析后的样品液以1ml/min的流速上样，收集流穿液，并记录体积。再以0.1M的PB(PH7.0)的缓冲液洗涤上样后的层析柱，流速2ml/min，体积>50ml，洗涤至OD280<0.01，保留液体待测。然后以0.1M的柠檬酸(pH3.0)的缓冲液洗脱上样后的层析柱，流速1ml/min，体积不限，分管收集洗脱液，同时调节PH至7.0左右，洗脱至OD280<0.01，保留洗脱液，最后使用分光光度计测OD280，计算初步产量，将获得的样品置于透析袋中，使用0.01M PBS(pH7.0-7.5)中透析20-24小时，期间换液2-3次，将透析后的样品收集。再将样品与DEAE按照100mg/100mg的比例，称取所需量的DEAE经蒸馏水浸泡过夜并换水2-3次去除小颗粒，然后抽干，再经0.5mL/L的NaOH浸泡1-2小时后抽干，用双蒸水洗涤2-3次，调节pH至8.0左右，再用0.5mL/L的HCl浸泡1-2小时后抽干，用双蒸水洗涤2-3次，调节pH至6.0左右。将处理好的DEAE-纤维素用0.01-0.02mol/L，pH6-7的磷酸盐缓冲液浸泡处理1-3小时，并其间换液1-2次，最后搅拌均匀灌入层析柱中直至柱床高约17cm左右为止。柱床做成后，使用0.01-0.02mol/L的磷酸盐缓冲液进行空洗，直至流出液体的pH值与磷酸盐缓冲液pH完全相同为止。平衡完毕后，关闭下口，吸取柱内多于柱下口的液体，控制流速使样品缓慢进入柱内，待样品完全进入后，在柱床上面加一层0.1-0.2mol/L，pH6-7的磷酸盐缓冲液。上样结束后打开柱下口洗脱，控制流速0.5ml/min，按照每管10滴收集洗脱液，从每管中取1滴收集液刚入黑色比色孔中，加入1滴20wt％的黄基水杨酸检查是否产生白色沉淀，在此条件下收集液中首次出现白色沉淀则为纯化的RBP单克隆抗体，收集液直至无白色沉淀出现为止。
样本经Protein A/G抗体纯化柱(10倍柱体积)亲和纯化，每次上样1mL，收集穿透样品，再经DEAE纤维素阴离子交换层析法纯化获得RBP-F(ab’)2。将获得的样品经5wt％的凝胶电泳研制分析，所得样本分子量在110KD左右，纯度≥90％以上。
2)制备抗体中间体
将25mg HOOC-(CHCHO)12-NH2加入1ml的DMSO混合均匀，随后取42.84μl之前得到的混合溶液，将其加入1ml，1mg/ml的上述RBP-F(ab’)2中，并加入碳化二亚胺5mg，常温下搅拌反应1小时，最后在0.01M pH7.2 PBS透析24小时(截留分子量为7000D)，即得抗体中间体。
3)制备荧光微球标记的RBP单克隆抗体
取1mg乳胶荧光微球(购自Merck Millipore公司)加入1mg碳化二亚胺(EDC)，1mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)室温搅拌3h，然后加入到1ml，1mg/ml上述的抗体中间体溶液中，室温下搅拌1h，随后再加入10mg BSA封闭，继续搅拌1h。
在2～8℃下，按照11000r/min的转速离心30min，除去上清液。最后，用0.01M的磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)将固体沉淀物复溶至1mL，再加入1μL的Proclin300在4℃下保存待用。
4)制备荧光微球标记的兔IgG多克隆抗体
取1mg乳胶荧光微球(购自Merck Millipore公司)加入1mg碳化二亚胺(EDC)，1mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)室温搅拌3h，然后加入0.1mg羊兔IgG多克隆抗体，室温下搅拌1h，再加入10mg BSA封闭液，继续搅拌1h。在2～8℃下，按照11000r/min的转速离心30min，除去上清液。最后，用0.01M的磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)将固体沉淀物复溶至1mL，再加入1μL的Proclin300在4℃下保存待用。
5)制备包被垫
将RBP包被抗体和羊抗兔多克隆抗体分别用磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)进行稀释，用划膜喷金仪在硝酸纤维素膜(NC膜)上按照1mg/mL的浓度进行划膜。含有RBP包被抗体的作为检测线(T线)5，含有羊抗兔多克隆抗体的作为质控线(C线)6，然后在37℃湿度<30％的环境下干燥4h制成包被垫2。
6)制备标记物垫
将摩尔比为1:1的上述荧光乳胶微球标记的RBP单克隆抗体和荧光乳胶微球标记的兔IgG多克隆抗体混合均匀后，按照10μL/cm的速度喷涂在玻璃纤维素膜上，然后放置在45℃下干燥2h制成标记物垫3。标记物垫3上包被有荧光乳胶微球标记的抗体和荧光乳胶微球标记的兔IgG多克隆抗体的地方叫做标记物结合处7。
7)组装免疫层析检测试剂盒
首先在PVC板上粘接包被垫2，然后在靠近包被垫2上C线的一端搭接吸水垫4，在靠近包被垫2的检测线5的一端搭接标记物垫3及其连接的样品垫9，用切条机切成4mm±0.1mm的试纸条(见图1)，将试纸条放入卡壳中制备成RBP免疫层析检测试剂盒。
实施例2：
1.视黄醇结合蛋白(RBP)免疫层析检测试剂盒的制备
1)RBP-F(ab’)2的制备
取10mg RBP标记抗体，以0.1M，pH3-5柠檬酸缓冲液稀释至2mg/ml。随后在0.1M，pH3-5的柠檬酸缓冲液中搅拌(截留分子量7000D)透析6小时后取出置于西林瓶中。
取胃蛋白酶1mg加入西林瓶中，搅拌混匀，随后37℃温育3小时。然后将其用0.1M，pH8.0的PBS透析24小时(截留分子量为5万D)。
用0.1M的PB(pH7.0)缓冲液平衡Protein A亲和层析柱，流速1ml/min，体积应>20ml，平衡至OD280<0.01。将透析后的样品液以1ml/min的流速上样，收集流穿液，并记录体积。再以0.1M的PB(pH7.0)的缓冲液洗涤上样后的层析柱，流速2ml/min，体积>50ml，洗涤至OD280<0.01，保留液体待测。然后以0.1M的柠檬酸(pH3.0)的缓冲液洗脱上样后的层析柱，流速1ml/min，体积不限，分管收集洗脱液，同时调节pH值至7.0左右，洗脱至OD280<0.01，保留洗脱液，最后使用分光光度计测OD280，计算初步产量，将获得的样品置于透析袋中，使用0.01M PBS(pH7.0-7.5)中透析20-24小时，期间换液2-3次，将透析后的样品收集。再将样品与DEAE按照100mg/100mg的比例，称取所需量的DEAE经蒸馏水浸泡过夜并换水2-3次去除小颗粒，然后抽干，再经0.5mL/L的NaOH浸泡1-2小时后抽干，用双蒸水洗涤2-3次，调节pH值至8.0左右，再用0.5mL/L的HCl浸泡1-2小时后抽干，用双蒸水洗涤2-3次，调节pH值至6.0左右。将处理好的DEAE-纤维素用0.01-0.02mol/L，pH6-7的磷酸盐缓冲液浸泡处理1-3小时，并在其间换液1-2次，最后搅拌均匀灌入层析柱中直至柱床高约17cm左右为止。柱床做成后，使用0.01-0.02mol/L的磷酸盐缓冲液进行空洗，直至流出液体的pH值与磷酸盐缓冲液的pH值完全相同为止。平衡完毕后，关闭下口，吸取柱内多于柱下口的液体，控制流速使样品缓慢进入柱内，待样品完全进入后，在柱床上面加一层0.1-0.2mol/L，pH6-7的磷酸盐缓冲液。上样结束后打开柱下口洗脱，控制流速0.5ml/min，按照每管10滴收集洗脱液，从每管中取1滴收集液刚入黑色比色孔中，加入1滴20wt％黄基水杨酸检查是否产生白色沉淀，在此条件下收集液中首次出现白色沉淀则为纯化的RBP单克隆抗体，收集液直至无白色沉淀出现为止。
样本经Protein A/G抗体纯化柱(10倍柱体积)亲和纯化，每次上样1mL，收集穿透样品，再经DEAE纤维素阴离子交换层析法纯化获得RBP-F(ab’)2。将获得的样品经5wt％的凝胶电泳分析，所得样本分子量在110KD左右，纯度≥90％以上。
2)制备抗体中间体
将25mg HOOC-(CH2CH2O)16-NH2加入1ml的DMSO混合均匀，随后取42.84μl之前得到的混合溶液，将其加入1ml，1mg/ml的上述RBP-F(ab’)2中，并加入碳化二亚胺5mg，常温下搅拌反应1小时，最后在0.01M pH7.2的PBS透析24小时(截留分子量为7000D)，即得1mg/ml的抗体中间体溶液。
3)制备荧光微球标记的抗体
取1mL乳胶荧光微球(购自Merck Millipore公司)加入1mg碳化二亚胺(EDC)，1mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)室温搅拌3h，然后加入到1ml，1mg/ml的上述抗体中间体溶液中，室温下搅拌1h，随后再加入10mg BSA封闭，继续搅拌1h。
在2～8℃下，按照11000r/min的转速离心30min，除去上清液。最后，用0.01M的磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)将固体沉淀物复溶至1mL，再加入1μL的Proclin300在4℃下保存待用。
4)制备荧光微球标记的兔IgG多克隆抗体
取1mL乳胶荧光微球(购自Merck Millipore公司)加入1mg碳化二亚胺(EDC)，1mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)室温搅拌3h，然后加入0.1mg羊兔IgG多克隆抗体，室温下搅拌1h，再加入10mg BSA封闭液，继续搅拌1h。在2～8℃下，按照11000r/min的转速离心30min，除去上清液。最后，用0.01M的磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)将固体沉淀物复溶至1mL，再加入1μL的Proclin300在4℃下保存待用。
5)制备包被垫
将一株RBP单克隆抗体和羊抗兔多克隆抗体分别用磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)进行稀释稀释成1mg/mL，用划膜喷金仪在硝酸纤维素膜(NC膜)上进行划膜。含有RBP包被抗体的作为检测线(T线)5，含有羊抗兔多克隆抗体的作为质控线(C线)6，然后在37℃湿度<30％的环境下干燥4h制成包被垫2。
6)制备标记物垫
将摩尔比为1:1的上述荧光乳胶微球标记的抗体和荧光乳胶微球标记的兔IgG多克隆抗体混合均匀后，按照10μL/cm的速度喷涂在玻璃纤维素膜上，然后放置在45℃下干燥2h制成标记物垫3。标记物垫3上包被有荧光乳胶微球标记的抗体和荧光乳胶微球标记的兔IgG多克隆抗体的地方叫做标记物结合处7。
7)组装免疫层析检测试剂盒
首先在PVC板上粘接包被垫2，然后在靠近包被垫2上C线的一端搭接吸水垫4，在靠近包被垫2的检测线5的一端搭接标记物垫3及其连接的样品垫9，用切条机切成4mm±0.1mm的试纸条(见图1)，将试纸条放入卡壳中制备成RBP免疫层析检测试剂盒。
所述RBP免疫层析检测试剂盒还包括用于卡设试纸条的卡壳。所述卡壳选自现有技术，例如，所述卡壳(如图2所示)可以包括：底槽12，其连接于所述PVC板1；上盖11，其连接于所述底槽12，所述上盖11上设置有用于向所述样品垫9上加样的加样孔13；观察窗14，其设置于上盖11上，用于检测线5和质控线6的数据采集。
如图2B所示，所述底槽12包括：位于其内表面的对称分布的多个定位孔17，多个所述定位孔17之间设有多个用于限定试纸条横向移动的第一限定部18以及用于限定试纸条纵向移动的第二限定部19；对称设置的所述第一限定部18与所述第二限定部19围设成纸条放置区域15(虚线区域)，用于放置试纸条；
如图2A所示，所述上盖11包括：与多个所述定位孔17相配合的多个定位柱16，这样配合使用以将上盖11和底槽12固定在一起；所述上盖11还包括用于限定试纸条的上下移动的第三限定部20。
所述包被垫2的上方设有用于数据采集的观察窗14，以露出全部所述检测线5和质控线6，用于收集其检测结果；且所述观察窗14开设于所述上盖11上与试纸条放置区域15的中部相对应的位置。所述上盖11在与所述样品垫9相对应的位置处开设有加样孔，以用于样品垫9上滴加样本8。所述检测线距离加样孔15-25mm。
2.检测
取60μL的待测样本(采血管取样本之后在3000转/min下离心3min，分离得血清即为待测样本)，通过加样孔13向标记物垫3滴加标准品或待测样本，室温静置15min，抗原就会与标记物混合反应并沿着包被垫2层析，分别与检测线5和质控线6反应，然后采用荧光免疫分析仪进行检测，即时可获得检测结果。检测时首先将免疫层析检测试剂盒按照图1所示的箭头指示插入荧光免疫分析仪，然后点击检测即可，仪器自动计算出样本T/C值，通过与正常值范围判断阴阳性。另外当在紫外光照射下呈现出两条荧光条带时，即为阳性。
紫外光也可以叫作紫外线，可以具体使用紫外线灯。
3.标准曲线的建立
配置不同浓度的RBP标准品(0、70、200、400、800、1500ng/mL)，用本发明中制备的RBP免疫层析检测试剂盒进行检测，用本发明实施例2中制备的人RBP试剂盒进行检测，检测范围为10～5000ng/mL，检测结果如表1所示，采用检测范围为10～5000ng/mL，四参数进行曲线拟合，标准曲线为：Y＝(8011604.0000-1532.0400)/(1+(X/16443.3800)^-1.0467)+1532.0400，相关系数r＝1.0000，如图3所示。从表1及图3可以看出，随着浓度的增加，信号值(发光值)也随之增大，拟合曲线拟合的较好，数据可靠。
表1检测数据
Figure BDA0002973389570000111
Figure BDA0002973389570000121
4.性能评估
使用实施例2得到的试剂盒分别对40例不同样本(其中20例正常人，20例为阳性患者)进行检测，然后通过Medcalc制作ROC曲线分析发现所述试剂盒的特异性为100％，敏感性为100％，临界值CUTOFF为69.83，AUC为1.000见图2。具体数据见表2。说明该试剂盒敏感度高，测值准确误差小。
表2
样本类型 正常人(ng/ml) 阳性病人(ng/ml)
血清 58.28 157.09
血清 51.38 528.71
血清 44.28 783.55
血清 29.68 471.55
血清 68.8 917.03
血清 41.7 257.93
血清 38.06 839.47
血清 68.52 305.44
血清 46.5 854.98
血清 57.23 703.4
血清 48.54 332.03
血清 33.82 461.45
血清 39.41 268.22
血清 43.72 577.91
血清 69.83 532.25
血清 46.25 676.62
血清 51.27 543.6
血清 33.71 789.79
血清 40.51 248.19
血清 68.87 949.74
使用实施例2得到的试剂盒与对比例1的非定向偶联技术制备的试剂盒(其与实施例2的试剂盒制备的区别在于：无抗体中间体的制备步骤，其余步骤相同)分别对40例不同样本(其中20例正常人，20例为阳性患者)进行检测，通过Medcalc分析非定向偶联标记之前临床样本和正常人之间未有明显的区分，对比例1的试剂盒的敏感性为55％，特异性为100％，临界值CUTOFF为24.68，AUC为0.713，然而定向偶联标记之后临床样本和正常人之间有明显的区分，实施例2的试剂盒的敏感性为100％，特异性为100％，临界值CUTOFF为69.83，AUC为1.000，如图4、图5所示，具体数据见表3。对比两组分析结果发现，对比例1的非定向偶联由于空间位阻使得检测结果不准确，无法满足试剂盒的基本性能。
表3
Figure BDA0002973389570000131
Figure BDA0002973389570000141
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种含氨基或羧基基团物质标记的RBP抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将RBP单克隆抗体溶于酸性缓冲液中，之后加入胃蛋白酶进行酶切反应；
2)将步骤1)酶切后的混合溶液使用中性缓冲液透析过夜；
3)步骤2)得到的液体通过Protein A亲和纯化，DEAE纤维素阴离子交换层析法纯化获得RBP-F(ab’)2；
4)将步骤3)得到的RBP-F(ab’)2与HOOC-(CHCHO)n-NH2共价偶联，形成抗体中间体；
5)将步骤4)得到的抗体中间体与含氨基或羧基基团的物质共价结合，得到含氨基或羧基基团物质标记的RBP抗体。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述RBP抗体、胃蛋白酶与酸性缓冲液与的质量比例为(0.5-1)：(0.5-1)：10000；所述酶切反应的温度为37℃-55℃；所述酶切反应的时间为0.5-2小时；所述酸性缓冲液的pH值在1～7之间，其选自柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、Tris-磷酸盐缓冲液、有机酸缓冲液、氨基酸缓冲液和MES缓冲液中的一种。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述中性透析缓冲液的pH值在6～8之间，其为磷酸缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、巴比妥钠-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液或MES缓冲液。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中，所述HOOC-(CHCHO)n-NH2中n为3～100000之间；所述RBP-F(ab’)2与HOOC-(CHCHO)n-NH2的质量比例为(0.5-1)：1；步骤5)中，所述抗体中间体与含氨基或羧基基团的物质的质量比例为1：(5-10)。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤5)中，所述含氨基或羧基基团的物质为蛋白、抗体、抗原、酶类、氨基酸、聚苯乙烯微球、量子点、磁性颗粒、金属颗粒或胶体金。
6.一种含氨基或羧基基团物质标记的RBP抗体，其特征在于，所述RBP抗体是通过权利要求1-5任一项所述的方法制得；所述含氨基或羧基基团的物质为蛋白、抗体、抗原、酶类、氨基酸、聚苯乙烯微球(如乳胶荧光微球)、量子点、磁性颗粒、金属颗粒或胶体金。
7.一种RBP免疫层析检测试剂盒，其特征在于，包括试纸条，所述试纸条包括检测线及质控线，所述检测线上包被有一株RBP单克隆抗体，所述质控线上包被有羊抗兔多克隆抗体；所述标记物垫上包被有权利要求6所述的含氨基或羧基基团物质标记的另一株RBP单克隆抗体和标记物标记的兔IgG。
8.如权利要求7所述的RBP免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述试纸条还包括PVC板，所述PVC板上固定有依次连接的样品垫、标记物垫、包被垫及吸水垫，所述包被垫上依次设有检测线及质控线，所述样品垫和标记物垫连接为一体；所述包被垫靠近检测线的一端连接有标记物垫，靠近质控线的一端连接有吸水垫；所述标记物标记的另一株RBP单克隆抗体和标记物标记的兔IgG的摩尔比为1:0.2～4。
9.如权利要求8所述的RBP免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述含氨基或羧基基团的物质为蛋白、抗体、抗原、酶类、氨基酸、聚苯乙烯微球、量子点、磁性颗粒、金属颗粒或胶体金；所述标记物为荧光微球、胶体金、胶体硒、彩色乳胶或磁性微球。
10.如权利要求7所述的RBP免疫层析检测试剂盒，其特征在于，所述RBP免疫层析检测试剂盒还包括用于卡设试纸条的卡壳。
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