CN116200414A - 一种重组人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

一种重组人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种重组人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白及其制备方法和应用，其制备方法，包括：将opti‑MOG全长序列连接到pET28a载体上，形成pET28a‑opti‑MOG质粒，通过Dele MOG‑TM‑F和Dele MOG‑TM‑R引物反向扩增，获得PCR产物，将PCR产物和用DpnI酶切消化质粒模板进行自连，获得重组质粒；再将重组质粒导入大肠杆菌Rosetta菌株中，得重组菌株；进一步发酵培养、诱导表达和蛋白纯化。本发明方法制备得到的重组MOG蛋白，其表达量高、免疫原性好、纯度高，且应用其制备的试剂盒，与临床上MOG‑IgG的阳性和阴性的一致性较好。

Description

一种重组人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，具体地，本发明涉及一种重组人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)是中枢神经髓鞘的重要组成部分，抗MOG抗体在多发性硬化的病理过程中起着非常重要的作用。目前国内所使用的MOG多为人工合成的MOG肽段。MOG细胞外Ig样结构域(MOG'8)含有多个抗原表位，具有很强的免疫原性。
公开号为CN113024652A的专利公开了一种人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的重组表达及其应用，其通过基因合成技术将重组MOG的Ig样结构域密码子优化后亚克隆至带有不同信号肽序列的pTT5中，构建重组MOG质粒，将其连接到表达载体上再转化入宿主细胞表达纯化大量稳定的MOG蛋白，用于MOG抗体的体外诊断。
发明内容
本发明的目的之一是提供了一种表达量高、免疫原性好、纯度高的重组MOG蛋白的制备方法。
本发明的目的之二是提供了一种重组MOG蛋白，可以准确区分临床上MOG-IgG的阳性和阴性样本。
本发明的目的之三是用于检测人MOG抗体的试剂盒。
本发明采用的技术方案为：
本发明一方面提供了一种重组MOG蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(1)重组质粒的构建
将opti-MOG全长序列连接到pET28a载体上，形成pET28a-opti-MOG质粒，以pET28a-opti-MOG为模板，通过Dele MOG-TM-F和Dele MOG-TM-R引物反向扩增，获得PCR产物，将PCR产物和用DpnI酶切消化质粒模板进行自连，获得重组质粒pET28a-opti-MOG deleTM；
其中所述opti-MOG全长序列如SEQ ID NO.1所示，所述Dele MOG-TM-F的序列如SEQ ID NO.2所示，所述Dele MOG-TM-R的序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)重组菌株的制备
通过转化将重组质粒pET28a-opti-MOG dele TM导入大肠杆菌Rosetta菌株中，得重组菌株；
(3)重组菌株的发酵培养与诱导表达；
(4)重组MOG蛋白的纯化。
其中所述opti-MOG全长序列为SEQ ID NO.1所示：
ATGGCGAGCCTGAGCCGCCCGAGCCTGCCGAGCTGCCTGTGCAGCTTTCTGTTACTGCTGTTACTGCAAGTGAGCAGTAGCTATGCGGGTCAGTTTCGCGTGATTGGCCCGCGCCATCCGATTCGCGCGCTGGTGGGCGATGAAGTGGAACTGCCGTGCCGCATTAGCCCGGGCAAAAACGCGACCGGCATGGAAGTGGGCTGGTATCGCCCGCCGTTTAGCCGCGTGGTGCATCTGTATCGCAACGGCAAAGATCAAGATGGCGATCAAGCGCCGGAATATCGCGGCCGCACCGAACTGCTGAAAGATGCGATTGGCGAAGGCAAAGTGACCCTGCGCATTCGCAACGTGCGCTTTAGCGATGAAGGCGGCTTTACCTGCTTTTTTCGCGATCATAGCTATCAAGAAGAAGCGGCGATGGAACTGAAAGTGGAAGATCCGTTTTATTGGGTGAGCCCGGGCGTGCTGGTGCTGCTGGCGGTGCTGCCGGTGCTGTTACTGCAGATTACGGTGGGCCTGATTTTTCTGTGCCTGCAGTATCGCCTGCGCGGCAAACTGCGCGCGGAAATTGAAAACCTGCATCGCACCTTTGATCCGCATTTTCTGCGCGTGCCGTGCTGGAAAATTACCCTGTTTGTGATTGTGCCGGTGCTGGGCCCGCTGGTGGCGCTGATTATTTGCTATAACTGGCTGCATCGCCGCCTGGCGGGTCAGTTCCTGGAGGAACTGCGCAAATTTAGCAGCCTGTGCTATAAACAGCGCATTAAAAGCCAAGAACGCGAAACCGAAGCGACCCGCGGCCGCGGCGGCCTGCTGCGCGATCATATTCCGCGCGGCAAAGAAGAACTGGAAAGCCTGGGCGGTGGCAAAACCCCGCCGGGCCGCTAA(SEQ ID NO.1)
进一步地，步骤(2)为：用重组质粒pET28a-opti-MOG dele TM转化大肠杆菌Top10感受态细胞，将转化后的菌液涂布LB+Kan平板，卡那霉素抗生素终浓度50μg/mL,筛选阳性转化子，过夜培养后挑取阳性转化子接种于LB+Kan液体培养基的同时，做菌落PCR，将菌落PCR验证正确的菌株保菌，用质粒DNA抽提试剂盒抽提质粒后，将质粒转化到Rosetta大肠杆菌表达菌株，得重组菌株。
进一步地，步骤(3)为：将重组菌株接种于LB+Kan液体培养基中，培养至菌体OD600＝0.8-1.0；然后在37℃，0.2mM IPTG进行诱导培养4h，离心，弃去上清，收集菌体，将收集后的菌体进行超声破壁处理和离心处理获得包涵体粗提物。
进一步地，步骤(4)包括洗杂、溶解包涵体步骤，所述洗杂包括如下步骤：先用含有0.5％Triton X-100的PBS洗涤液洗去杂质，再用含有2M尿素的PBS洗涤液洗去杂质；所述溶解包涵体用含有8M尿素的包涵体溶解液溶解。
本发明中，在包涵体纯化方法中添加了洗杂步骤，一方面，添加非离子型去垢剂TritonX-100，在温和保护蛋白的同时洗去杂质；另一方面，在洗涤液中加入2M尿素促进杂蛋白溶解并在离心的步骤中被去除，利于提高目的蛋白纯度。
进一步地，所述的包涵体溶解液为20mM Tris–HCl,0.3M NaCl,8M尿素，pH 8.0。
本发明实施例还提供了一种重组MOG蛋白，所述重组MOG蛋白为氨基酸序列如SEQID NO.4所示的蛋白；或者是由上述制备方法制备得到的蛋白。
MASLSRPSLPSCLCSFLLLLLLQVSSSYAGQFRVIGPRHPIRALVGDEVELPCRISPGKNATGMEVGWYRPPFSRVVHLYRNGKDQDGDQAPEYRGRTELLKDAIGEGKVTLRIRNVRFSDEGGFTCFFRDHSYQEEAAMELKVEDP(SEQ ID NO.4)
本发明还提供了一种编码上述重组MOG蛋白的核酸序列，所述核酸序列如SEQ IDNO.5所示。
ATGGCGAGCCTGAGCCGCCCGAGCCTGCCGAGCTGCCTGTGCAGCTTTCTGTTACTGCTGTTACTGCAAGTGAGCAGTAGCTATGCGGGTCAGTTTCGCGTGATTGGCCCGCGCCATCCGATTCGCGCGCTGGTGGGCGATGAAGTGGAACTGCCGTGCCGCATTAGCCCGGGCAAAAACGCGACCGGCATGGAAGTGGGCTGGTATCGCCCGCCGTTTAGCCGCGTGGTGCATCTGTATCGCAACGGCAAAGATCAAGATGGCGATCAAGCGCCGGAATATCGCGGCCGCACCGAACTGCTGAAAGATGCGATTGGCGAAGGCAAAGTGACCCTGCGCATTCGCAACGTGCGCTTTAGCGATGAAGGCGGCTTTACCTGCTTTTTTCGCGATCATAGCTATCAAGAAGAAGCGGCGATGGAACTGAAAGTGGAAGATCCG(SEQ IDNO.5)
本发明实施例还提供了一种用于检测人MOG抗体的试剂盒，包括上述重组MOG蛋白。
进一步，本发明实施例还提供了一种用于检测人MOG抗体的磁微粒化学发光试剂盒，包括
(1)生物素标记重组MOG蛋白；所述重组MOG蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
(2)碱性磷酸酶标记扩展羧基含量的抗体，所述抗体为驴抗人IgG抗体、羊抗人IgG抗体或鼠抗人IgG抗体；
(3)校准品，采用人源化抗MOG抗体作为校准品。
进一步地，所述碱性磷酸酶标记扩展羧基含量的抗体是将抗体与NH2-(CH2)12-CH-((CH2)12-COOH)2反应，获得扩展羧基含量的抗体，再进行碱性磷酸酶标记。
进一步地，所述NH2-(CH2)12-CH-((CH2)12-COOH)2的用量为抗体质量的0.2-0.5％，优选为0.3％。
在一些实施例中，所述一种用于检测人MOG抗体的磁微粒化学发光试剂盒，包括：
R1试剂：所述R1试剂为上述生物素标记重组MOG蛋白及稀释液配制而成，所述生物素标记重组MOG蛋白的浓度为0.1-10μg/mL，优选为1μg/mL。
R2试剂：所述R2试剂为上述碱性磷酸酶标记扩展羧基含量的抗体及稀释液配制而成，所述碱性磷酸酶标记扩展羧基含量的抗体的浓度为0.005-0.5μg/mL。优选为0.05μg/mL。磁分离试剂M：所述磁分离试剂M为商品化的羧基磁珠及稀释液配制而成，羧基磁珠的浓度为0.05-5mg/ml，优选为0.5mg/ml。
校准品：采用人源化抗MOG抗体作为校准品，浓度梯度为0、1、3、10、30、100U/ml。本发明具有的优点和有益效果为：
(1)本发明制备方法制备得到的重组MOG蛋白，其表达量高、免疫原性好、纯度高。
(2)本发明的重组MOG蛋白及应用其制备的试剂盒，与临床上MOG-IgG的阳性和阴性的一致性较好。进而有效提高临床上MOG-IgG的阳性检出率，减少假阳性。
附图说明
图1为pET28a-opti-MOG信号肽和/或跨膜域删除的菌落PCR电泳检测结果。图1中，A为以pET28a-opti-MOG为模板，表1引物反向扩增获得删除信号肽或跨膜域的线性化序列；B为pET28a-opti-MOG Dele-TM菌落PCR验证；C为pET28a-opti-MOG Dele-SP菌落PCR验证；D为pET28a-opti-MOG Dele-SP&TM菌落PCR验证)
图2为Rosetta菌株中质粒转化验证结果。
图3为MOG蛋白截短体表达检测结果。
图4为包涵体溶解于尿素和盐酸胍的检测结果。
图5为本发明包涵体纯化方法与已有方法的流程比较图。
图6为采用本发明实施例方法纯化包涵体后的电泳检测。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或厂商提供的条件进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径得到。
实施例1引物设计、重组质粒、重组菌制备
将opti-MOG全长序列(SEQ ID NO.1，金唯智公司合成)连接到pET28a载体上，载体上的His-tag标签串联表达MOG蛋白，形成pET28a-opti-MOG质粒，表达带有6*His tag-MOG蛋白。以pET28a-opti-MOG为模板，通过表1所示的扩增引物，分别构建获得：
1)删除信号肽的MOG蛋白表达质粒：pET28a-opti-MOG dele SP；
2)删除跨膜域的MOG蛋白表达质粒：pET28a-opti-MOG dele TM；
3)同时删除信号肽和跨膜域的MOG蛋白表达质粒：pET28a-opti-MOG dele SP&TM；
表1 PCR扩增引物
Figure SMS_1
PCR反应体系如下：
表2 PCR反应体系
pet28a-H5HA(稀释至5ng) 1μL
Dele MOG-SP/TM-F(10μM) 0.5μL
Dele MOG-SP/TM-R(10μM) 0.5μL
2*Hieff Canace Gold PCR Master Mix(YEASEN Cat.10149ES03) 10μL
ddH2O To 20μL
使用Taq酶推荐的PCR程序进行扩增：采用两步法或三步法；
两步法的反应程序为：98℃预变性3min；98℃变性10s、68℃退火及延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸5min；
三步法的反应程序：98℃预变性3min；98℃变性10s、56℃退火20s、72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸5min；
pET28a-opti-MOG质粒全长6232bp，经PCR两步法或三步法反向扩增质粒，分别获得删除信号肽(6157bp)或删除跨膜域(5788bp)的PCR产物(图1中A)。用DpnI酶切消化PCR产物中的质粒模板后自连，构建质粒，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，将转化后的菌液涂布LB+Kan平板(卡那霉素抗生素终浓度50μg/mL),筛选阳性转化子。过夜培养后挑取阳性转化子接种于LB+Kan液体培养基的同时，做菌落PCR，验证质粒组装是否正确。菌落PCR使用pET28a载体上的通用引物T7和T7t扩增。pET28a-opti-MOG质粒中，T7和T7t引物扩增产物为1181bp,删除信号肽后的扩增产物为1106bp,删除跨膜域后的扩增产物为737bp.菌落PCR检测结果如图1所示。图1中B为删除跨膜域的转化子，取12个转化子进行菌落PCR验证，除Dele-TM-2号和12号错误外，其余均正确。图1中C为删除信号肽的重组质粒，3个菌株均正确。
信号肽跨膜域双缺失菌株的构建。以Dele-SP-12质粒为模板，通过Dele MOG-TM-F/R引物反向扩增获得在缺失信号肽基础上缺失跨膜域线性化质粒，同样经DpnI酶切消化载体自连，构建得到pET28a-opti-MOG Dele-SP&TM质粒，转化Top 10感受态细胞。图1中D为信号肽和跨膜域双缺失菌株以T7和T7t引物进行菌落PCR验证结果，1、2、3、5、12均正确。
将菌落PCR验证正确的菌株保菌(500μL培养液+500μL甘油)，天根质粒提取试剂盒DP103提取质粒，并将质粒转化到Rosetta大肠杆菌表达菌株中诱导MOG蛋白表达。同样用T7和T7t引物PCR验证转化后的Rosetta菌株是否包含了正确的质粒。结果如图2，Rosetta菌株中的质粒经PCR扩增，MOG大小符合预期。
实施例2、预表达实验
1)蛋白表达情况分析—检测截断体蛋白是否表达、可溶性表达亦或包涵体表达。
将已转入pET28a-opti-MOG、pET28a-opti-MOG dele SP、pET28a-opti-MOG deleTM和pET28a-opti-MOG dele SP&TM重组质粒的四种Rosetta菌株都进行蛋白表达，来确定全长蛋白和截断体蛋白是否表达、可溶性表达亦或包涵体表达。具体步骤为：
a)取平板上生长的单菌落接种到LB+Kan液体培养基中5mL，37℃180rpm培养至对数期(OD600＝0.8-1.0)；
b)取500μL菌液作为未诱导组4℃保存，再取100μL保菌。向剩下的4.4mL菌液中加入终浓度为0.5mM IPTG诱导表达，37℃180rpm继续培养4h；
c)4.4mL菌液分批离心10,000rpm 1min收集菌泥，全部菌体用440μL PBS重悬后超声破碎2次(留50μL作为诱导后组)；
d)超声裂解后的细胞悬液12000rpm 4℃离心1min,获得上清和沉淀。取上清50μL作为诱导后的上清组，沉淀用50μL PBS重悬后作为诱导后的沉淀组，判断蛋白表达以可溶性存在(上清)，还是包涵体存在(沉淀)；
e)500μL未诱导组菌液离心收集菌体后用50μL PBS重悬；
f)分别取诱导前和诱导后的全菌、上清和PBS重悬的菌泥沉淀制样，加入5*Protein loading buffer后混匀，煮沸5min.12％SDS-PAGE凝胶电泳、考马斯亮蓝染色判定蛋白表达情况。
图3为MOG蛋白截短体表达检测结果，图3中，A中，MOG-FL即MOG蛋白全长经诱导后的检测，Rosetta菌株中转化有pET28a-opti-MOG质粒；Dele-SP-1/2分别为删除信号肽的MOG蛋白，Rosetta菌株中转化有pET28a-opti-MOG dele SP质粒；B中.Dele-TM为仅删除跨膜域的MOG蛋白，Rosetta菌株中转化有pET28a-opti-MOG dele TM质粒；Dele-SP-TM-1/2为既删除信号肽又删除跨膜域的截断体MOG蛋白，Rosetta菌株中转化有pET28a-opti-MOGdele SP&TM质粒。
由图3可知，MOG全长蛋白和只删除信号肽的截断体蛋白在Rosetta菌株中没有表达；删除跨膜域后可见蛋白的表达(第二列，诱导后泳道)，分子量约20KDa.且该蛋白在包涵体(沉淀)中表达，可溶性部分即上清样品与对照组比较没有差异，不考虑收集上清纯化。删除信号肽和跨膜域后蛋白分子量降低3KDa，约17KDa,同样以包涵体中表达为主。因而，后续实验考虑包涵体纯化方法获得目的蛋白。
只删除跨膜域的截断体蛋白明显比同时删除信号肽和跨膜域的截断体蛋白的表达量更高。因此，确定选择pET28a-opti-MOG dele TM质粒转化Rosetta菌株宿主菌，表达删除跨膜域的MOG蛋白。
2)包涵体表达
a)3mL LB+Kan培养单菌落过夜(菌种来自预表达检测的pET28a-opti-MOG Dele-TM Rosetta菌株)；
b)按1:50比例转接到200mL LB+Kan中，37℃培养至对数期(取1mL菌液作为诱导前对照)；
c)对数期菌液中加入终浓度为0.2mM IPTG 16℃诱导过夜；
d)离心收集菌体，加入20mL PBS重悬细胞；
e)菌体破壁：
①超声破壁10min,4℃18000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀。沉淀用20mL包涵体洗涤液(0.05M Tris-HCl,1mM EDTA,100mM NaCl,0.5％Triton X-100,pH 8.0)重悬；
②12000rpm 4℃离心10min收集沉淀；
③向半透明状的包涵体沉淀中加入20mL包涵体溶解液(0.1M Tris-HCl,3mMEDTA,0.2M NaCl,1％Triton X-100,8M盐酸胍(或6M尿素)，pH7.5)重悬沉淀；
④4℃12000rpm离心10min收集上清，即为蛋白溶液。
包涵体沉淀可分批收集。为提高蛋白浓度可在第一次收集时可加入10mL包涵体溶解液，溶解1h离心后再加入10mL继续溶解4℃过夜。将收集到的蛋白质制样，SDS-PAGE胶检测蛋白表达情况。结果由图4可知，8M尿素溶解蛋白沉淀效果较好。
在上述方法的基础上，考虑到16℃诱导蛋白表达量不是很高，改变蛋白诱导条件，37℃4h或过夜诱导，比对蛋白表达量。发现37℃，4h时蛋白表达量最高，过夜诱导后蛋白表达量没有明显增加。因而选择37℃，4h作为蛋白表达的条件。
改变IPTG诱导浓度，对比0.5mM、0.4mM、0.2mM IPTG的蛋白表达量，确定0.2mMIPTG为最佳诱导浓度。
改变宿主菌，对比BL21(DE3)和Rosetta宿主菌对蛋白表达的影响，确定Rosetta是优势菌株。
3)蛋白纯化
a)摇菌：转化有pET28a-opti-MOG-Dele-TM质粒的Rosetta菌株，单菌落接种至5mLLB+Kan液体培养基中，37℃摇床180rpm培养过夜，约10-12h。
第二天早上以1:100比例转接，37℃摇床180rpm培养4-6h，至菌体浓度达到OD600＝0.8-1.0摇晃培养液可见云雾状。
b)诱导：向对数期菌液中加入终浓度为0.2mM IPTG,37℃摇床180rpm培养4h；
c)收菌：培养后的菌液转入离心桶，3500rpm离心10min收集菌体，弃去上清；
d)超声破菌：用1/10体积的裂解液PBS(10mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4,137mM NaCl)或1/10体积的Tris-HCl(pH 8.0)重悬菌体，例如，200mL菌液离心后收集的菌体，需要20mL裂解液重悬。裂解时加入终浓度为1mM PMSF蛋白酶抑制剂(100mM PMSF:17.4mg PMSF溶解于1mL异丙醇溶液，-20℃保存)。超声设置：总时长15min,2s on,3s off，超声过程中菌体样品始终处于冰浴中，以便快速降温；
e)离心：超声后的菌体18000rpm离心10min,弃去上清，保留包涵体沉淀部分；
f)洗杂：用含有0.5％Triton X-100的PBS洗杂液I重悬包涵体沉淀，洗杂液体积不少于裂解液体积的80％，例如，裂解液20mL,洗杂液需要16mL充分重悬，18000rpm离心10min，弃去上清；洗杂过程重复两次；
g)洗杂：用含有2M尿素的PBS洗杂液II重悬包涵体沉淀，洗杂液体积不少于裂解液体积的80％，充分重悬，18000rpm离心10min，弃去上清；洗杂过程重复两次；
h)溶解包涵体：纯化的包涵体沉淀用20mL包涵体溶解液重悬(20mM Tris–HCl,pH8.0,0.3M NaCl,8M urea).18000rpm离心30min,上清为溶解后的包涵体，4℃短期保存；
i)浓度和纯度检测：OD280检测收集到的包涵体蛋白浓度，SDS-PAGE检测蛋白纯度，电泳时以诱导前、诱导后的全菌为对照。
j)包涵体复性：检测正确的MOG蛋白包涵体溶液，装入14KD透析袋中，经尿素浓度逐渐降低，8M-6M-4M-2M尿素，在4℃层析柜中加入转子并不断更换透析液。透析完成后从透析袋中取出溶液12000rpm 4℃离心10min，上清即为纯化后的蛋白，OD280检测蛋白浓度，分装后-80℃冰箱冻存。
图5展示了本发明包涵体纯化方法与已有方法的流程比较图。本发明中，在包涵体纯化方法中添加了洗杂步骤，一方面，添加非离子型去垢剂TritonX-100，在温和保护蛋白的同时洗去杂质；另一方面，在洗涤液中加入2M尿素促进杂蛋白溶解并在离心的步骤中被去除，利于提高目的蛋白纯度。
图6为采用本发明方法纯化包涵体后的电泳检测，其中沉淀1和沉淀2为同一样品的不同上样量，其中沉淀1对应的上样量为4微升，沉淀2对应的上样量为1微升。图6中用8M尿素溶解的包涵体蛋白经透析袋梯度透析，最终溶解在2M尿素中送样，样品浓度为12.14mg/mL，共送样10mL。
实施例3磁微粒化学发光试剂盒及其制备方法和应用
一、所述磁微粒化学发光试剂盒包括：
(1)生物素标记重组MOG蛋白；所述重组MOG蛋白序列如SEQ ID NO.4所示。
(2)碱性磷酸酶标记扩展羧基含量的抗体，所述抗体为驴抗人IgG抗体、羊抗人IgG抗体或鼠抗人IgG抗体；
(3)校准品，采用人源化抗MOG抗体作为校准品。
二、磁微粒化学发光试剂盒的制备
1、生物素标记重组MOG蛋白(SEQ ID NO.4所示)
(1)前处理：选择适当截留的超滤柱中加入200μl标记反应溶液(0.1M PBS，pH7.2)，加入1mg重组MOG蛋白，混匀。
4℃，4,000rpm，离心5min，弃滤液；于超滤柱中再加入200μl标记反应溶液，混匀。4℃，4,000rpm，离心5min，
重复步骤1-3次。
混匀超滤柱中的残留的液体，室温静置1min；将超滤柱反转倒置于一新的超滤管中，4℃，4,000rpm，5min，收集液体。
取50μl PBS于超滤柱中混匀，静置1min。倒置超滤柱，4℃，6,000rpm，2min，收集液体。
将收集的滤液合并，用标记反应溶液调节重组MOG蛋白的浓度到2mg/ml，4℃放置备用。
(2)生物素的标记：将生物素用DMSO溶解，浓度为20mg/ml,按照生物素与重组MOG蛋白分子摩尔比1:10～100(最佳1：50)的比例加入重组MOG蛋白溶液，室温搅拌避光反应1h。
(3)葡聚糖凝胶分离纯化/透析袋或者超滤管去除游离生物素及其他试剂。
(4)将重组MOG蛋白保存于0.02M磷酸盐缓冲液中。
2、碱性磷酸酶标记扩展羧基含量的抗人二抗(驴抗人抗体、羊抗人抗体或鼠抗人抗体)
1)制备扩展羧基含量的抗体
1mg羊抗人抗体(南京开尔泰生物技术有限公司)溶解于1mL pH＝6.0 50mM的MES溶液中，先后投入0.05mg的NHS和0.05mg的EDC，室温搅拌20min，使用50KD分子截留量的超滤管除去EDC和NHS，1mL MES溶解超滤处理的抗体，然后投入0.003mg(10mg/ml，0.3μl)的NH2-(CH2)12-CH-((CH2)12-COOH)2，室温搅拌30min，在pH＝6.0 50mM的MES中透析24小时(截留分子量100000)，每12h更换一次透析液，即得1mg扩展羧基含量后的抗体。
2)制备碱性磷酸酶共价标记的扩展了羧基含量的羊抗人抗体
1mg扩展羧基后的羊抗人抗体中，投入2mg碱性磷酸酶，然后投入0,05mg的EDC，室温搅拌30min，再投入10mg BSA封闭30min，加入10μL的Proclin300和1mL的丙三醇，即得碱性磷酸酶共价标记的扩展了羧基含量的羊抗人抗体。
3、稀释液的配制：
表3稀释液的组成
Figure SMS_2
将上述试剂称量好放入洁净容器中，加纯化水定容1000mL，溶解混匀,用pH计测定pH值7.10～7.60。
将生物素标记重组MOG蛋白按照1:1000稀释，重组MOG蛋白浓度约1μg/mL，记作R1；
将碱性磷酸酶共价标记的扩展了羧基含量的羊抗人抗体按照1:20000稀释，羊抗人抗体浓度约0.05μg/mL，记作R2；
采购1.5μm羧基磁珠(购自博岳生物)，稀释至0.5mg/ml，记作M。
4、配制校准品
采用人源化抗MOG抗体作为校准品，浓度0、1、3、10、30、100U/ml。阳性CUTOFF值设定为10U/ml。
5、检测
按照样本10μL+50μL R1+50μL M，37℃温育5min；洗涤3-5次；随后添加100μL R2试剂，37℃温育5min；洗涤3-5次；最后添加200μL发光底物(碱性磷酸酶催化发光的底物液)，检测发光值。
对比例1
与实施例3不同的是，实施例3的试剂盒采用碱性磷酸酶共价标记的扩展了羧基含量的羊抗人抗体。对比例1的试剂盒采用碱性磷酸酶共价标记羊抗人抗体。
碱性磷酸酶共价标记羊抗人抗体的制备工艺为：
1)碱性磷酸酶的改性和纯化
取1mg碱性磷酸酶，加入5uL 2mg/mL Traut’s Reagent(2亚氨基硫烷盐酸盐)溶液，混匀室温反应1小时，加入1uL 1M甘氨酸溶液反应10分钟，用脱盐柱进行脱盐纯化。碱性磷酸酶与Traut’s Reagent质量比10：1，碱性磷酸酶与甘氨酸质量比1：0.75。
2)抗体的活化和纯化
取1mg羊抗人抗体加入5uL 2mg/mL Sulfo SMCC(4(N马来酰亚胺甲基)环己烷1羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐)溶液，涡旋混匀室温反应1小时，加入1uL甘氨酸溶液反应10分钟，用脱盐柱进行脱盐纯化。抗体与SulfoSMCC质量比10：1，抗体与甘氨酸质量比1：0.75。
3、活化抗体与碱性磷酸酶的偶联以及封闭
将活化的抗体与改性的碱性磷酸酶涡旋混匀，室温反应1小时，加入10uL10mg/mL的N乙基马来酰亚胺，涡旋混匀室温反应半小时，加入10uL10mg/mL的乙醇胺涡旋混匀室温反应半小时，用脱盐柱脱盐纯化得到纯化后的酶标记产物，加入1mL pH7.4的PBS(50mM PB150mM NaCl，2mM EDTA)缓冲液，加入等体积甘油保存在20℃。
需要说明的是：本发明的对比例的方案并非现有技术，仅是为了与实施例的方案进行对比而设置，不作为对本发明的限制。
表4采用实施例3和对比例1的试剂盒与临床诊断的比对结果
Figure SMS_3
/>
Figure SMS_4
通过表4可以看出，实施例3的试剂盒阳性符合率86.67％，阴性符合率90％，总符合率88.57％。一致性较好，对比例1的试剂盒阳性符合率80.00％，阴性符合率85.00％，总符合率82.86％，一致性较好。且实施例3的试剂盒检测的阴性和阳性符合率均高于对比例1的试剂盒，且实施例3的阳性测试值高于后者测试值。
在本发明中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种重组MOG蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)重组质粒的构建
将opti-MOG全长序列连接到pET28a载体上，形成pET28a-opti-MOG质粒，以pET28a-opti-MOG为模板，通过Dele MOG-TM-F和Dele MOG-TM-R引物反向扩增，获得PCR产物，将PCR产物和用DpnI酶切消化质粒模板进行自连，获得重组质粒pET28a-opti-MOG dele TM；
其中所述opti-MOG全长序列如SEQ ID NO.1所示，所述Dele MOG-TM-F的序列如SEQ IDNO.2所示，所述Dele MOG-TM-R的序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)重组菌株的制备
通过转化将重组质粒pET28a-opti-MOG dele TM导入大肠杆菌Rosetta菌株中，得重组菌株；
(3)重组菌株的发酵培养与诱导表达；
(4)重组MOG蛋白的纯化。
2.根据权利要求1所述一种重组MOG蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(2)为：用重组质粒pET28a-opti-MOG dele TM转化Top10感受态细胞，将转化后的菌液涂布LB+Kan平板，卡那霉素抗生素终浓度50μg/mL,筛选阳性转化子，过夜培养后挑取阳性转化子接种于LB+Kan液体培养基的同时，做菌落PCR，将菌落PCR验证正确的菌株保菌，用质粒DNA抽提试剂盒抽提质粒后，将质粒转化到Rosetta大肠杆菌表达菌株，得重组菌株。
3.根据权利要求1所述一种重组MOG蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(3)为：将重组菌株接种于LB+Kan液体培养基中，培养至菌体OD600＝0.8-1.0；然后在37℃，0.2mM IPTG进行诱导培养4h，离心，弃去上清，收集菌体，将收集后的菌体进行超声破壁处理和离心处理获得包涵体粗提物。
4.根据权利要求1所述一种重组MOG蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(4)包括洗杂、溶解包涵体步骤，所述洗杂包括如下步骤：先用含有0.5％Triton X-100的PBS洗涤液洗去杂质，再用含有2M尿素的PBS洗涤液洗去杂质；所述溶解包涵体用含有8M尿素的包涵体溶解液溶解。
5.一种重组MOG蛋白，其特征在于，所述重组MOG蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的蛋白；或者是由权利要求1-4任一项所述制备方法制备得到的蛋白。
6.一种编码权利要求5所述重组MOG蛋白的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列如SEQID NO.5所示。
7.一种用于检测人MOG抗体的试剂盒，其特征在于，包括权利要求5所述的重组MOG蛋白。
8.一种用于检测人MOG抗体的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，包括：
(1)生物素标记重组MOG蛋白；所述重组MOG蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
(2)碱性磷酸酶标记扩展羧基含量的抗体，所述抗体为驴抗人IgG抗体、羊抗人IgG抗体或鼠抗人IgG抗体；
(3)校准品，采用人源化抗MOG抗体作为校准品。
9.根据权利要求8所述的一种用于检测人MOG抗体的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记扩展羧基含量的抗体是将抗体与NH2-(CH2)12-CH-((CH2)12-COOH)2反应，获得扩展羧基含量的抗体，再进行碱性磷酸酶标记。
10.根据权利要求9所述的一种用于检测人MOG抗体的磁微粒化学发光试剂盒，其特征在于，所述NH2-(CH2)12-CH-((CH2)12-COOH)2的用量为抗体质量的0.2-0.5％，优选为0.3％。
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