CN110044881B - 一种酶法测定肌酐的检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生化检测领域，具体涉及到的是一种酶法测定肌酐的检测试剂盒及其使用方法。该试剂盒包括利用由保藏号CGMCC No.17306的LYH18菌株制备的基因工程菌GLYH18制备出的肌氨酸氧化酶、肌酸酶、过氧化氢酶和缓冲液等各种试剂，通过将样品与试剂混合，再将最终反应物置于生化分析仪下，检测吸光度变化的情况从而测算出肌酐的含量。试剂盒中的肌氨酸氧化酶的制备方法简单，成本低，加入此酶的试剂盒能够快速、准确的测定出样品中肌酐的含量，且试剂盒在室温下能够保持稳定，更有利于实践应用，也更有利于工业化生产。

Description

一种酶法测定肌酐的检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及生化检测领域，具体涉及到的是一种酶法测定肌酐的检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
肾脏疾病病因复杂，由于大多数“原发性”肾小球疾病发病机制尚不完全清楚，目前肾小球疾病的治疗以经验性治疗为多，缺乏病因性治疗的手段，也正因如此，在肾小球疾病治疗领域，前瞻性、随机对照的临床治疗试验非常有限。尽管如此，回顾过去三十年，在每个阶段还是有一些标志性的治疗方法被用于临床，并在一定程度上提高了肾脏疾病的治疗水平。
肾脏疾病的主要临床表现有蛋白尿、血尿、水肿、高血压、肾功能不全等。多年来，临床医生根据患者的病史、体检和化验检查进行综合分析，总结出肾小球疾病的几大临床症候群，如急性肾炎综合征、肾病综合征、急进性肾炎综合征、慢性肾炎综合征等作为临床诊断的依据并指导治疗，在肾活检技术开展以前，对肾脏病的诊断与治疗起到了积极的作用。
肌酐(creatinine，Cr)是人体肌肉组织中肌酸及磷酸肌酸代谢终产物，血液中Cr水平受饮食中摄取的外源性Cr及人体内产生的内源性Cr的影响，正常成人Cr生成速率基本稳定，血Cr及尿Cr测定广泛应用于评估肾小球滤过功能。
测定血清肌酐的方法主要有两种一种是碱性苦味酸速率法，一种是肌氨酸氧化酶法。碱性苦味酸速率法法由于线性范围窄，特异性差，易受样本中其他物质如酮体、抗坏血酸、胆红素、头孢、多巴胺等干扰，出现检测偏差，已逐渐退出市场。目前市场使用较多的为肌氨酸氧化酶法。
肌氨酸氧化酶法的原理是通过肌酐酶的作用使体内的肌酐水解成肌酸和尿素，肌酸又可经一系列反应生成H2O2，生成的H2O2偶联Trinder反应，再通过比色法测定肌酐水平。反应原理如下：
Figure BDA0002018426180000011
Figure BDA0002018426180000012
Figure BDA0002018426180000013
有很多研究表明该法的准确度优于碱性苦味酸法，抗干扰能力相对较好且交叉污染相对较少，虽然现在酶法因其碱性苦味酸速率法较高的稳定性和特异性而受到越来越多临床实验室的青睐，但仍有很多因素可干扰该方法的检测结果。
羟苯磺酸钙和酚磺乙胺对肌氨酸氧化酶法检测肌酐的负干扰对被施用这两种药物的患者造成很大的不便。例如，对于糖尿病患者而言，常伴发肾功能不全，而所施用的羟苯磺酸钙对肌氨酸氧化酶法检测肌酐的负干扰可能造成糖尿病患者肾功能不正确评估，掩盖并延误病情。而对于手术患者，所施用的酚磺乙胺对肌氨酸氧化酶法检测肌酐的负干扰可能使得不能正确评估其肾功能，造成术后并发症，影响患者的预后。
胆红素(bilirubin)是由体内铁卟啉化合物代谢产生的具有抗氧化性的混合物，主要有两种存在形式，一类与白蛋白结合的称为结合胆红素(CBIL)，另一类未与白蛋白结合的称为游离胆红素(FBIl)。胆红素不仅因颜色特性对比色检测方法有干扰，而且因其具有抗氧化性对Tinder反应指示的反应体系也有干扰。胆红素对酶法测定肌酐产生负干扰，这是因为胆红素作为还原剂与Tinder反应体系中氧化剂H2O2发生反应，使得终产物减少，如在试剂中加入亚铁氰化钾、抗坏血酸氧化酶、胆红素氧化酶等可消除胆红素的干扰。
发明内容
为了解决上述现有技术的不足，本发明提供一种毒性低、稳定性高、检测灵敏度准确的酶法测定肌酐的检测试剂盒及其使用方法。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明涉及一种酶法测定肌酐的检测试剂盒，本试剂盒采用的是肌氨酸氧化酶法测定血清中肌酐的含量，具体反应原理如下：
1、第一反应
Figure BDA0002018426180000021
Figure BDA0002018426180000022
2、第二反应
Figure BDA0002018426180000023
Figure BDA0002018426180000024
Figure BDA0002018426180000025
Figure BDA0002018426180000026
本发明涉及一种酶法测定肌酐的检测试剂盒，所述试剂盒包括试剂组H1和H2，所述试剂组H1包括肌酸酶、肌氨酸氧化酶、过氧化氢酶、色原、缓冲液、聚乙二醇、复合稳定剂、防腐剂，具体组成为：
Figure BDA0002018426180000027
Figure BDA0002018426180000031
所述的肌氨酸氧化酶由基因工程菌GLYH18制备。
所述试剂组H2包括：肌酐酶、肌酸酶、过氧化物酶抑制剂、缓冲液、乙二胺四乙酸(EDTA)、抗坏血酸氧化酶、亚铁氰化钾、氯化钠、红霉素、4-氨基安替比林、TOOS、谷胱甘肽氧化酶、吐温20、蔗糖、防腐剂，具体组成为：
Figure BDA0002018426180000032
优选地，所述的肌氨酸氧化酶600KU/L，肌酸酶200KU/L，过氧化氢酶500KU/L，肌酐酶300KU/L。
所述的缓冲液为：HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液中的任意一种。其中HEPES缓冲液缓冲液pH为7.0。
所述的表面活性剂为十二烷基硫酸钠，其临界胶束浓度为0.008mol/L。
所述的色原为N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-5-二甲氧基苯胺(DAOS)
所述防腐剂为红霉素和proclin系列防腐剂中的一种。
所述过氧化物酶抑制剂为叠氮化物、氟化物、醋酸盐、甲酸盐、乙醇、甲醇中的一种或几种。
复合稳定剂包括吐温80 10～13g/L，谷氨酸20～30g/L，谷胱甘肽1～3g/L，海藻糖50～60g/L，十二烷基二甲基甜菜碱2～5g/L，卵磷脂3～6g/L，缓冲液100～120mmol/L；其为申请号为201610166107.2的多种抗体的复合稳定剂及其使用方法中的复合稳定剂。
本发明还涉及一种酶法测定肌酐的检测试剂盒的使用方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将样品和标准品分别先于试剂组H1均匀混合，混合比例为样品/标准品：H1＝1:9(体积比)，37℃孵育后得到混合液，测定所得混合液的吸光度A1/A3；
(2)将所述试剂组H2与已孵育的步骤(1)的混合液均匀混合，按照已孵育的步骤(1)的混合液：H2＝1:9(体积比)进行混合，37℃孵育5min后测定混合液的吸光度A2/A4；
(3)如(1)(2)所述的吸光度测定中，主波长为548nm，副波长为700nm；
(4)用吸光度差值进行肌酐浓度的测定，公式如下：
ΔA样品＝A2-A1；
ΔA标准品＝A4-A3；
肌酐浓度＝ΔA样品/ΔA标准品×标准液浓度。
本发明的有益效果为：现在目前的试剂盒多为国外进口的，价格昂贵且结果并不稳定，本发明提供了一种酶法测定肌酐的检测试剂盒及其使用方法，本试剂盒中使用的肌氨酸氧化酶是由保藏号CGMCC No.17306的LYH18菌株制备的基因工程菌GLYH18制备，此酶的制备方法简单，成本低，加入本发明中的试剂盒能够快速、准确的测定出样品中肌酐的含量，且具有稳定性高，可抗胆红素、羟苯磺酸钙等物质的干扰，毒性低等特点，有利于进行医学检测应用方面研究。其中的乙二胺四乙酸是一种金属鳌合剂，能够与某些金属离子结合，从而避免金属离子干扰，表面活性剂和吐温充当助溶剂，发挥良好的增溶效果。
附图说明
图1为试剂盒室温开瓶稳定性试验，其中：A为对照试剂盒、B为本发明试剂盒；
图2为试剂盒室温未开瓶稳定性试验，其中：A为对照试剂盒、B为本发明试剂盒；
图3为试剂盒2-8℃开瓶稳定性试验，其中：A为对照试剂盒、B为本发明试剂盒；
图4是出发菌株的目的基因的电泳图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进一步说明。
实施例1
肌氨酸氧化酶的制备
步骤一、获得目的序列
以芽孢杆菌CGMCC No.17306为出发菌株，检测全基因组，与现有肌氨酸氧化酶基因比对得到原始肌氨酸氧化酶基因，如图4所示，改造并全基因合成微生物来源肌氨酸氧化酶编码基因序列，如SEQ No.1所示，肌氨酸氧化酶编码的氨基酸序列如SEQ No.2所示。
所述的出发菌株的保藏信息为：一种海洋细菌LYH18菌株，为芽孢杆菌属Bacillussp.，该菌株已于2019年3月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其生物保藏号为CGMCC No.17306。
步骤二、克隆载体构建
交由宝生物工程(大连)有限公司将步骤(1)中经过改造后肌氨酸氧化酶基编码基因序列插入表达载体pET-28a(+)中，构建成表达载体，命名为载体SOX-pET。
步骤三、目的基因扩增
以SOX-pET为模板进行PCR扩增，PCR产物鉴定纯度和分子量的大小，PCR产物经DNA回收试剂盒回收，交由宝生物工程(大连)有限公司完成扩增。
步骤四、重组质粒的构建
PCR克隆菌株CGMCC No.17306的肌氨酸氧化酶基因，连接到pET28a(+)中构建重组质粒，由宝生物工程(大连)有限公司完成实验操作。
步骤五、重组菌株的构建
将步骤四获得的重组质粒导入到大肠杆菌菌株BL21(DE3)感受态细胞中；使用LB/抗生素Kan(50ug/ul)，平板，50ul转化液涂布，37℃培养，培养18-24h，命名为GLYH18，即为所述的产肌氨酸氧化酶的基因工程菌GLYH18，由宝生物工程(大连)有限公司完成实验操作。
步骤六、重组菌株GLYH18诱导产酶
将步骤五中所述的产肌氨酸氧化酶的基因工程菌GLYH18，进行阳性克隆诱导表达，进行表达。
(1)种培养
挑取基因工程菌GLYH18单菌落至2ml LB/Kan(50ug/μl)培养基中，150rpm，37℃培养18-24h，获得种培养菌液。
(2)主培养诱导
在平板中添加5ml LB/Kan(50ug/μl)培养基，添加种培养菌液100μl。150rpm，37℃培养至OD600nm值约为0.4-0.6，得到发酵液，发酵液中添加150mM IPTG 33μl，IPTG最终浓度达到1mM，进行诱导，18℃表达20小时后获得菌液。
(3)蛋白质抽提
集菌后取OD值为2.0左右的菌体加入320μl PBS进行缓冲液悬浊，悬浊后进行超声波破碎，对菌体破碎液进行离心分离(12000rpm×5min)，离心后分别获得全蛋白、上清、沉淀，全蛋白即为粗酶液。
步骤七、肌氨酸氧化酶的纯化
(1)硫酸铵沉淀：向粗酶液中缓慢加入硫酸铵，使溶液中硫酸铵饱和度达到20％，4℃静置过夜后8000r·min-1冷冻离心，去除杂蛋白。在上清液中继续加入硫酸铵，使其饱和度达到80％，4℃静置过夜后8000r·min-1冷冻离心，弃去上清，将沉淀重悬于PBS缓冲液(pH7.4，50mmol/L磷酸盐缓冲液)，将经过硫酸铵沉淀后的酶液装入透析袋中，用PBS缓冲液进行透析，每隔12h进行更换一次缓冲液，直到硫酸铵透析完全。
(2)透析：采用透析袋对样品透析来除去残留的硫酸铵，4℃条件下，对盐析后样品进行透析，不断更换透析液，直至在透析液中无SO4 2-为止。
(3)超滤与层析：将透析后的样品加入超滤管，离心(4000r/min、4℃、10-20min)后保留上清液，进行Sephadex G-75凝胶过滤层析：将透析后的样品加入到用PBS缓冲液预平衡的Sephadex G-75凝胶过滤层析柱(φ1.6cm×15cm)，先用3倍柱床体积的PBS缓冲液洗脱，再用含0～1mol/L氯化钠的PBS缓冲液进行线性梯度洗脱，体积流量为1ml/min，每管收集6mL，经酶活力检测后收集有酶活组分，即为肌氨酸氧化酶纯品酶液。
实施例2
本实施例的一种酶法测定肌酐的检测试剂盒，具体原料及配比如下：
所述试剂组H1包括：
Figure BDA0002018426180000061
所述试剂组H2包括：
Figure BDA0002018426180000071
实施例3
本实施例的一种酶法测定肌酐的检测试剂盒，具体原料及配比如下：
所述试剂组H1包括：
Figure BDA0002018426180000072
所述试剂组H2包括：
Figure BDA0002018426180000073
Figure BDA0002018426180000081
实施例4
本实施例的一种酶法测定肌酐的检测试剂盒，具体原料及配比如下：
所述试剂组H1包括：
Figure BDA0002018426180000082
所述试剂组H2包括：
Figure BDA0002018426180000083
Figure BDA0002018426180000091
实施例5
本发明中的试剂盒适用于各类型全自动生化仪，测定方法采用两点终点法，采用实施例1-3所得产品对样品进行肌酐的检测，具体步骤如下：
(1)将样品和标准品分别先于试剂组H1均匀混合，混合比例为样品/标准品：H1＝1:9(体积比)，37℃孵育后得到混合液，测定所得混合液的吸光度A1/A3；
(2)将所述试剂组H2与已孵育的步骤(1)的混合液均匀混合，按照已孵育的步骤(1)的混合液：H2＝1:9(体积比)进行混合，37℃孵育5min后测定混合液的吸光度A2/A4；
(3)如(1)(2)所述的吸光度测定中，主波长为548nm，副波长为700nm；
(4)用吸光度差值进行肌酐浓度的测定，公式如下：
肌酐浓度＝ΔA样品/ΔA标准品×标准液浓度
ΔA样品＝A2-A1；
ΔA标准品＝A4-A3；
验证试验
对于上述实施例2-4中的产品进行测试，并与其他同类型产品进行对比，结果如表1所示。
表1本发明试剂盒与对照试剂盒参数对比
线性范围(μmol/L) 准确度 精密度(μmol/L)
对照试剂盒 0-800 ≤±10％ CV≤10％
本发明试剂盒 50-1500 ≤±10％ CV≤5％
对照试剂盒为一国内市售的肌酐检测试剂盒，其成分及配方为试剂1包含HEPES缓冲液、肌酸酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶、抗坏血酸氧化酶、试剂2包含HEPES缓冲液、肌酐酶、4-AAP。
测试一
稳定性测试：以对照试剂和本发明试剂为材料，设置3组试验，分别为室温开瓶、室温未开瓶、2-8℃开瓶；每两天检测一次，每次检测一个质控水平，连续检测15天。
室温开瓶结果如图1所示，对照试剂盒的测定曲线波动较大，测定第5天后，测定值开始大幅上升，而本试剂盒测定值基本保持稳定。
室温未开瓶结果如图2所示，对照试剂盒在测定7天以后，测定值呈先上升后下降趋势，而本试剂盒仍保持稳定。
2-8℃开瓶结果如图3所示，对照试剂盒和本试剂盒的测定曲线波动较小，基本保持稳定。
由此可以得出以下结论：本发明中的试剂盒相较于对照试剂盒在室温下无论开瓶与否都能保持稳定性，更有利于实践应用，也更有利于工业化生产。
测试二
重复型测试：以血清样本为待测样品，用全自动生化分析仪重复测定10次，与对照试剂盒进行比较，结果如表2：
表2重复性测试结果(μmol/L)
测定次数 对照试剂盒 本试剂盒
1 100.93 100.65
2 100.15 101.88
3 101.88 100.34
4 99.41 102.01
5 100.25 99.82
6 99.68 101.56
7 98.99 102.73
8 101.32 101.66
9 100.44 101.59
10 99.43 101.77
MN 100.24 101.41
SD 0.92 0.87
CV％ 0.91 0.85
(注：其中MN为平均值；SD为标准偏差；CV为变异系数。)
结果表明，本发明中的试剂盒的变异系数CV％＝0.85，小于5％，符合《体外诊断试剂通用技术要求》，且小于对照试剂盒的变异系数，表明本试剂盒的重复性更好。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更和修改均落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 大连大学
<120> 一种酶法测定肌酐的检测试剂盒及其使用方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1241
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccatgagtga tgtaattatt ataggtgcag ggccagcggg attatctgct tctatctctt 60
gtgctcgttt cggactaaaa gtgctcgtta ttgatgaatt tatgaagccg ggcgggagat 120
tgttaggaca gttgcatcaa gagcctactg gagaatggtg gaacggaata gaagaatcga 180
agcgacttca tgaagaagca gaatcacttt cagtacatat caggtgcggt gtttcggtct 240
ataatttaga tagagatgaa aacaattggt ttgtacatac taatatcggt acgttagaag 300
cacctttcgt actacttgct actggagctg cggaatattc tattcccctt cctggctgga 360
cacttccagg agtgatgtca attggagcag ctcaagttat gacaaatgtt catcgcgtgc 420
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aattgcaatt agcgggaatt acagtggatc atattgtact ccctgagaaa agcgagttaa 540
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ttgactctaa aggaaatgtt attaatggaa cagagaaaat atatgaagca gattttgtat 840
gtattgccgg gggattatac ccacttgccg aacttgcagc tgtagccggt tgtcccttcc 900
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cgcaaggaac agttgcaggt ctatctatcg caaaatatgc aagtaaaaaa cgtgatatag 1080
tcgaccaaca attatctcac gccatgcaaa acgttcactt tgttcgtcag aaagctgcaa 1140
ttcagtttaa tccgatggta gatatcggta gacgaaaaat gaatgaaatt tggcgtgatt 1200
attcttctac atatgcacat actaaaaaga gctgcctcga g 1241
<210> 2
<211> 411
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ser Asp Val Ile Ile Ile Gly Ala Gly Pro Ala Gly Leu Ser Ala
1 5 10 15
Ser Ile Ser Cys Ala Arg Phe Gly Leu Lys Val Leu Val Ile Asp Glu
20 25 30
Phe Met Lys Pro Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gln Leu His Gln Glu Pro
35 40 45
Thr Gly Glu Trp Trp Asn Gly Ile Glu Glu Ser Lys Arg Leu His Glu
50 55 60
Glu Ala Glu Ser Leu Ser Val His Ile Arg Cys Gly Val Ser Val Tyr
65 70 75 80
Asn Leu Asp Arg Asp Glu Asn Asn Trp Phe Val His Thr Asn Ile Gly
85 90 95
Thr Leu Glu Ala Pro Phe Val Leu Leu Ala Thr Gly Ala Ala Glu Tyr
100 105 110
Ser Ile Pro Leu Pro Gly Trp Thr Leu Pro Gly Val Met Ser Ile Gly
115 120 125
Ala Ala Gln Val Met Thr Asn Val His Arg Val Gln Val Gly Lys Lys
130 135 140
Gly Ile Ile Ile Gly Ala Asn Ile Leu Ser Phe Ala Ile Leu Ser Glu
145 150 155 160
Leu Gln Leu Ala Gly Ile Thr Val Asp His Ile Val Leu Pro Glu Lys
165 170 175
Ser Glu Leu Ser Gln Lys Ala Gly Glu Pro Glu Glu Val Leu Asn Ser
180 185 190
Leu Leu Asn Ala Ala His Leu Ala Pro Ser Ala Phe Leu Arg Ile Gly
195 200 205
Ser His Phe Met Lys Phe Asp Trp Ile Arg Lys Ala Gly Leu Thr Phe
210 215 220
Tyr Pro Asn Asn Gly Met Lys Ile Asn Gly Thr Pro Leu His Leu Arg
225 230 235 240
Lys Ala Ala Leu Glu Ile Ile Gly Thr Asp Gln Val Glu Gly Val Arg
245 250 255
Ile Ala Asn Ile Asp Ser Lys Gly Asn Val Ile Asn Gly Thr Glu Lys
260 265 270
Ile Tyr Glu Ala Asp Phe Val Cys Ile Ala Gly Gly Leu Tyr Pro Leu
275 280 285
Ala Glu Leu Ala Ala Val Ala Gly Cys Pro Phe His Tyr Ile Ser Glu
290 295 300
Leu Gly Gly His Val Pro Leu His Ser Glu Thr Met Glu Thr Pro Leu
305 310 315 320
Pro Gly Leu Phe Val Ala Gly Asn Ile Thr Gly Ile Glu Ser Gly Lys
325 330 335
Ile Ala Met Ala Gln Gly Thr Val Ala Gly Leu Ser Ile Ala Lys Tyr
340 345 350
Ala Ser Lys Lys Arg Asp Ile Val Asp Gln Gln Leu Ser His Ala Met
355 360 365
Gln Asn Val His Phe Val Arg Gln Lys Ala Ala Ile Gln Phe Asn Pro
370 375 380
Met Val Asp Ile Gly Arg Arg Lys Met Asn Glu Ile Trp Arg Asp Tyr
385 390 395 400
Ser Ser Thr Tyr Ala His Thr Lys Lys Ser Cys
405 410

Claims (9)

1.一种酶法测定肌酐的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括试剂组H1和H2，所述试剂组H1包括肌酸酶、肌氨酸氧化酶、过氧化氢酶、色原、缓冲液、聚乙二醇、复合稳定剂、防腐剂，具体组成为：
Figure FDA0002018426170000011
所述试剂组H2包括：肌酐酶、肌酸酶、过氧化物酶抑制剂、缓冲液、乙二胺四乙酸(EDTA)、抗坏血酸氧化酶、亚铁氰化钾、氯化钠、防腐剂、4-氨基安替比林、TOOS、谷胱甘肽氧化酶、吐温20、蔗糖、防腐剂，具体组成为：
Figure FDA0002018426170000012
2.根据权利要求1所述的一种酶法测定肌酐的检测试剂盒，其特征在于，所述的肌氨酸氧化酶是由保藏号CGMCC No.17306的LYH18菌株制备的基因工程菌GLYH18制备。
3.根据权利要求2所述的肌氨酸氧化酶，其特征在于，制备方法为：
步骤一、获得目的序列
以芽孢杆菌CGMCC No.17306为出发菌株，检测全基因组，与现有肌氨酸氧化酶基因比对得到原始肌氨酸氧化酶基因，改造并全基因合成微生物来源肌氨酸氧化酶编码基因序列，如SEQ No.1所示，肌氨酸氧化酶编码的氨基酸序列如SEQ No.2所示；
所述的出发菌株的保藏信息为：一种海洋细菌LYH18菌株，为芽孢杆菌属Bacillussp.，该菌株已于2019年3月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其生物保藏号为CGMCC No.17306；
步骤二、克隆载体构建
将步骤(1)中经过改造后肌氨酸氧化酶基编码基因序列插入表达载体pET-28a(+)中，构建成表达载体，命名为载体SOX-pET；
步骤三、目的基因扩增
以SOX-pET为模板进行PCR扩增，PCR产物鉴定纯度和分子量的大小，PCR产物经DNA回收试剂盒回收；
步骤四、重组质粒的构建
PCR克隆菌株CGMCC No.17306的肌氨酸氧化酶基因，连接到pET28a(+)中构建重组质粒；
步骤五、重组菌株的构建
将步骤四获得的重组质粒导入到大肠杆菌菌株BL21(DE3)感受态细胞中，使用LB/抗生素Kan(50ug/ul)，平板，50ul转化液涂布，37℃培养，培养18-24h，即为所述的产肌氨酸氧化酶的基因工程菌GLYH18；
步骤六、重组菌株GLYH18诱导产酶
将步骤五中所述的产肌氨酸氧化酶的基因工程菌GLYH18，进行阳性克隆诱导表达，进行表达；
(1)种培养
挑取基因工程菌GLYH18单菌落至2ml LB/Kan(50ug/μl)培养基中，150rpm，37℃培养18-24h，获得种培养菌液；
(2)主培养诱导
在平板中添加5ml LB/Kan(50ug/μl)培养基，添加种培养菌液100μl，150rpm，37℃培养至OD600nm值约为0.4-0.6，得到发酵液，发酵液中添加150mM IPTG33μl，IPTG最终浓度达到1mM，进行诱导，18℃表达20小时后获得菌液；
(3)蛋白质抽提
集菌后取OD值为2.0左右的菌体加入320μl PBS进行缓冲液悬浊，悬浊后进行超声波破碎，对菌体破碎液进行离心分离，12000rpm×5min，离心后分别获得全蛋白、上清、沉淀，全蛋白即为粗酶液；
步骤七、肌氨酸氧化酶的纯化
(1)硫酸铵沉淀：向粗酶液中缓慢加入硫酸铵，使溶液中硫酸铵饱和度达到20％，4℃静置过夜后8000r·min-1冷冻离心，去除杂蛋白，在上清液中继续加入硫酸铵，使其饱和度达到80％，4℃静置过夜后8000r·min-1冷冻离心，弃去上清，将沉淀重悬于PBS缓冲液，缓冲液为pH7.4的50mmol/L磷酸盐缓冲液，将经过硫酸铵沉淀后的酶液装入透析袋中，用PBS缓冲液进行透析，每隔12h进行更换一次缓冲液，直到硫酸铵透析完全；
(2)透析：采用透析袋对样品透析来除去残留的硫酸铵，4℃条件下，对盐析后样品进行透析，不断更换透析液，直至在透析液中无SO4 2-为止；
(3)超滤与层析：将透析后的样品加入超滤管离心，4℃下4000r/min离心10-20min，后保留上清液，进行Sephadex G-75凝胶过滤层析：将透析后的样品加入到用PBS缓冲液预平衡的Sephadex G-75凝胶过滤层析柱
Figure FDA0002018426170000031
先用3倍柱床体积的PBS缓冲液洗脱，再用含0～1mol/L氯化钠的PBS缓冲液进行线性梯度洗脱，体积流量为1ml/min，每管收集6mL，经酶活力检测后收集有酶活组分，即为肌氨酸氧化酶纯品酶液。
4.根据权利要求1所述的一种酶法测定肌酐的检测试剂盒，其特征在于，所述的缓冲液为：HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液中的任意一种，其中HEPES缓冲液pH为7.0。
5.根据权利要求1所述的一种酶法测定肌酐的检测试剂盒，其特征在于，所述的表面活性剂为十二烷基硫酸钠，其临界胶束浓度为0.008mol/L。
6.根据权利要求1所述的一种酶法测定肌酐的检测试剂盒，其特征在于，所述的色原为N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-5-二甲氧基苯胺。
7.根据权利要求1所述的一种酶法测定肌酐的检测试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为红霉素和proclin系列防腐剂中的一种。
8.根据权利要求1所述的一种酶法测定肌酐的检测试剂盒，其特征在于，所述过氧化物酶抑制剂为叠氮化物、氟化物、醋酸盐、甲酸盐、乙醇、甲醇中的一种或几种。
9.根据权利要求1所述的一种酶法测定肌酐的检测试剂盒，其特征在于，复合稳定剂包括吐温80 10～13g/L，谷氨酸20～30g/L，谷胱甘肽1～3g/L，海藻糖50～60g/L，十二烷基二甲基甜菜碱2～5g/L，卵磷脂3～6g/L，缓冲液100～120mmol/L。
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