CN107281476A - 一种抗原肽RL‑佐剂CpGODN7909偶联物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于树突状细胞疫苗肿瘤免疫治疗领域，尤其涉及一种抗原肽RL‑佐剂CpGODN7909偶联物及其制备方法和应用技术。所述的RL‑CpG偶联物是由抗原肽RL利用偶联桥通过共价键与佐剂CpGODN7909连接而成；本发明所述RL‑CpG偶联物的合成方法，即抗原肽RL与偶联剂PDPH反应，纯化后与佐剂CpGODN7909反应，进而得到所需偶联物。采用上述技术方案，RL‑CpG偶联物在细胞外循环系统中能稳定存在，在树突状细胞内高浓度的谷胱甘肽和酸性的内体低pH下，抗原肽RL和佐剂CpGODN7909在胞内释放，避免药物在循环中降解，同时使其作用于同一个细胞，提高偶联物利用率，增强靶向抗肿瘤活性。

Description

一种抗原肽RL-佐剂CpGODN7909偶联物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于树突状细胞疫苗肿瘤免疫治疗领域，尤其涉及一种抗原肽RL-佐剂CpGODN7909偶联物及其制备方法和应用技术。

背景技术

树突状细胞疫苗，是一种继手术、化疗、放疗等传统治疗方法后的肿瘤免疫治疗方法，其具有靶向性强、耐药性低等优点，主要通过提高机体对肿瘤细胞的免疫应答，诱导抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞，靶向识别杀伤肿瘤细胞，避免免疫逃逸。但是，由于研究的抗原肽对树突状细胞的功能无显著影响，通常抗原肽与佐剂联合用药，进一步提高构建的树突状细胞疫苗对机体免疫反应，更有效激活抗原特异性的CTL。

抗原肽RL是一种源于HLA-A0201限制性的肿瘤相关抗原AGR2的九肽，其序列为Arg-Ile-Met-Phe-Val-Asp-Pro-Ser-Leu。肿瘤相关抗原AGR2在乳腺癌细胞MDA-MB-231中高表达，在MCF-7中低表达，故抗原肽RL树突状细胞疫苗激活的CTL能够特异性杀伤MDA-MB-231细胞，对MCF-7的杀伤效果无显著变化。佐剂CpGODN 7909是一种人工合成的非甲基化的脱氧核糖核苷酸，其序列为5´-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3´，与细菌DNA相近的免疫作用，能与树突状细胞内受体TLR-9结合，促进DC成熟和抗原递呈。

所述的抗原肽RL和佐剂CpGODN 7909的化学结构分别为：

。

目前，查阅国内外相关文献，没有抗原肽RL和佐剂CpGODN 7909通过偶联剂PDPH共价连接相关报道。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种抗原肽RL-佐剂CpGODN7909偶联物（即RL-CpG偶联物），该偶联物能够提高树突状细胞将抗原递呈于CD8⁺T细胞的功能；所述的RL-CpG偶联物用于构建树突状细胞疫苗，可以有效提高其靶向抗肿瘤效果。

所述的RL-CpG偶联物是由抗原肽RL利用偶联桥通过共价键与佐剂CpGODN7909连接而成，其结构式如下：

。

所述的共价键为可断裂的酰腙键和二硫键。

所述的偶联桥的结构式如下：

。

为了实现上述目的，本发明还提供RL-CpG偶联物的制备方法，具体包括以下步骤。

（1）用Fmoc固相多肽合成技术制备N端半胱氨酸修饰的抗原肽RL，以Wang树脂为载体，EDCi/HOBt 为缩合试剂，无水DMF为反应溶剂，氨基酸与EDCi、HOBt的摩尔比例为1：4：4，脱Fmoc试剂为20%PIP/DMF，脱树脂试剂为50%TFA/DCM，制备得式（a）。

（2）5´端醛基化和磷酸二酯键的非桥氧原子硫代化修饰的佐剂CpGODN7909由上海生工生物工程股份有限公司提供，其结构式（b）。

（3）将步骤（1）中产物（a）与偶联剂PDPH在无水甲醇中反应，制备得式（c）。

（4）将步骤（3）中产物（c）与步骤（2）中得（b）在无水甲醇中反应，制备得式（d），即为目的产物RL-CpG偶联物。

步骤（3）中，产物（a）与PDPH的摩尔比例为1：5。

步骤（4）中，产物（c）与产物（b）的反应摩尔比例为5：1。

所述的RL-CpG偶联物用于制备树突状细胞疫苗，尤其对HLA-A0201⁺和AGR2高表达细胞的特异性杀伤效应。

本发明的显著效果。

本发明提供的抗原肽RL-佐剂CpGODN 7909偶联物（即为RL -CpG偶联物）是由抗原肽RL利用偶联剂PDPH通过共价键与佐剂CpGODN 7909连接而成；体外培养诱导未成熟树突状细胞，负载RL -CpG偶联物，由于细胞内谷胱甘肽的含量高于细胞外，且酸性的内体内的pH低，RL-CpG偶联物可以在树突状细胞内释放出游离的抗原肽RL和佐剂CpGODN 7909；佐剂CpGODN 7909与细胞内TLR9受体结合，促进树突状细胞的成熟和表面共刺激分子CD80的表达；成熟的树突状细胞递呈抗原肽RL于CD8⁺T淋巴细胞成功诱导抗原肽RL限制性的细胞毒性T淋巴细胞，识别并杀伤抗原肽RL高表达的肿瘤细胞；为了抗原肽RL能通过GSH敏感的二硫键与偶联剂PDPH共价连接，其N端采用半胱氨酸修饰；为了提高佐剂CpGODN 7909在体内的稳定性，对其磷酸二酯键进行非桥氧原子硫代修饰；同时对佐剂CpGODN 7909的5´端进行醛基化修饰，为了其能通过pH敏感的酰腙与偶联剂PDPH共价连接。目前未发现其显著的副作用，是一种可以应用于临床的免疫佐剂。因此，本发明提供RL -CpG偶联物构建树突状细胞疫苗中应用。

本发明制备的树突状细胞疫苗，采用二种可断裂共价键连接而成，确保细胞内药物释放，能够有效提高药物的利用率，提高其靶向抗肿瘤免疫能力；本发明的RL-CpG偶联物能够促进树突状细胞的成熟和共刺激分子的表达，成功诱导抗原肽RL特异性的CTL，增强靶向杀伤效果；实验发现，检测树突状细胞表面分子表达试验显示，分别将无药、抗原肽RL、佐剂CpGODN7909和RL-CpG偶联物孵育未成熟树突状细胞24 h后，与无药组比较，RL-CpG偶联物和佐剂CpGODN7909的imDC的表面分子CD83和CD80的表达增加约15%，而抗原肽RL组无明显改变；细胞毒性试验显示，RL-CpG偶联物诱导的CTL与其他组比较后，能提高对HLA-A020⁺和AGR2高表达的乳腺癌细胞MDA-MB-231的靶向杀伤作用，而对HLA-A020^—和AGR2低表达的乳腺癌细胞MCF-7无显著杀伤作用。

本发明所述RL-CpG偶联物的合成方法，即抗原肽RL与偶联剂PDPH反应，纯化后与佐剂CpGODN7909反应，进而得到所需偶联物。采用上述技术方案，RL-CpG偶联物在细胞外循环系统中能稳定存在，在树突状细胞内高浓度的谷胱甘肽和酸性的内体低pH下，抗原肽RL和佐剂CpGODN7909在胞内释放，避免药物在循环中降解，同时使其作用于同一个细胞，提高偶联物利用率，增强靶向抗肿瘤活性。

附图说明

图1为抗原肽RL-cys的高效液相图。

图2为抗原肽RL-cys的质谱图。

图3为RL-CpG偶联物的合成路线图。

图4为中间产物RL-PDPH的质谱图。

图5为RL-CpG偶联物的质谱图。

图6为RL-CpG偶联物的稳定性结果图。

图7为RL-CpG偶联物对树突状细胞影响的流式检测和统计结果图。

图8为RL-CpG偶联物诱导CTL对MDA-MB-231和MCF-7的杀伤结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1。

用半胱氨酸修饰的抗原肽RL（即RL-cys）的制备。

采用Fmoc/t-Bu固相合成法合成抗原肽RL-cys，以Wang树脂为载体，EDCi/HOBt 为缩合试剂，无水DMF为反应溶剂，25℃下在多肽自动合成仪中进行反应；首先将C端氨基酸Fmoc-Leu-OH偶联在树脂上，并用醋酸酐/吡啶过夜封闭树脂，真空干燥后，取制备的 WangResin-Leu-Fmoc，进行树脂替代度计算。取上述反应制备的100 mg Wang Resin-Leu-Fmoc，每次加入氨基酸之前，需加入5mL 20 % PIP/DMF反应30 min，用2 mlDMF 清洗，5min/次，共3次；加入77mgEDCi和54 mgHOBt再按照从C端到N端的氨基酸序列加入相应的氨基酸；在抗原肽RL的合成加入氨基酸的顺序和量为： 260 mgFmoc-Ser( t-Bu)-OH、203 mgFmoc-Pro-OH 、274 mg Fmoc-Asp(O t-Bu)-OH、205 mg Fmoc-Val-OH、210 mg Fmoc-Phe-OH、210 mgFmoc-Met-OH、211 mg Fmoc-Ile-OH、540 mg Fmoc-Arg(Pbf)-OH和513 mg Fmoc-Cys(Trt)-OH重复缩合，最后一个氨基酸反应完后，加入5mL 20% PIP/DMF反应30 min，用2 ml DMF清洗5 min/次，共3次；用12 ml的TFA/DCM（体积比为1:1）反应2h脱去树脂，40℃旋转蒸发去二氯甲烷，在剩余0.5 ml时停止蒸发，沿壁缓慢滴加冷乙醚，有白色固体析出，静置10 min，用小钢铲刮白色固体，玻璃漏斗过滤获得RL-cys粗品；然后经 HPLC 分离纯化，得到目的产物a，90mg，收率75%。

HPLC分离和纯化：RL-Cys的保留时间在10.898min，抗原肽RL-cys的高效液相图见图1。

MS检测：RL-Cys的 [M+H] ⁺m/z为1180.58 Da；检测值：1180.40 Da，抗原肽RL-cys的质谱图见图2。

实施例2。

RL-CpG偶联物的制备，合成路线见图3。

取 295µg RL-cys，575µg PDPH溶于50µl的甲醇中，37℃震荡3h，用HPLC分离纯化（流动相：0.1% TFA水和0.1% TFA乙腈，梯度洗脱），得到中间产物c（290µg，收率89%）。

MALDI-TOF-MS检测：RL-Cys的 [M+H] ⁺m/z为1298.6 Da；检测值：1298.5 Da，中间产物RL-PDPH的质谱图见图4。

取290µg中间产物c溶于50 µl无水甲醇中，缓慢加入到48 µl 5OD 前述步骤（2）中公司合成产物b甲醇溶液中，4 ℃搅拌反应12h，高效液相分离，得到目的产物d（98µg，收率在43%）。

ESI-TOF-MS检测：带9个电荷的离子峰m/z为1022.2 Da；检测值：1022.0 Da，RL-CpG偶联物的质谱图见图5。

实施例3。

制备的RL-CpG偶联物在不同条件下的水解研究。

实施例2中制备的RL-CpG偶联物在不同GSH浓度和不同pH条件下的稳定性，具体方法如下。

将实施例2中制备的RL-CpG偶联物分别溶于pH 7.4（无 GSH）、pH 7.4（10 mmol/LGSH）、pH5.0（无 GSH）、pH5.0（10 mmol/L GSH）四种溶液中，每种溶液中RL-CpG偶联物的浓度均为50 µg/mL，置于37℃恒温震荡箱中，在0h、0.5h、1h、2h时间段用高效液相在220nm波长下分别检测药物RL-cys含量，计算RL-CpG偶联物在不同条件下的水解速率。

RL-CpG偶联物在不同条件下的水解结果，见图6；结果显示，在pH5.0（10 mmol/LGSH）条件下, 偶联物RL-CpG水解速率最快，2h后能达到93%，在pH7.4（10 mmol/L GSH） 、pH5.0（无 GSH）二种条件下，RL-CpG偶联物水解速率较快，2h后能达到85%，在pH7.4（无GSH）条件下，RL-CpG偶联物水解速率很慢，2h后只达到4%。实验结果说明，RL-CpG偶联物在体循环中保持相对稳定，而在10 mmol/L GSH或pH5.0的酸性的内体的树突状细胞中可以快速水解，从而达到促进树突状细胞成熟和抗原递呈功能。

实施例4。

制备的RL-CpG偶联物对未成熟树突状细胞的影响；imDC的吞噬能力强，递呈能力弱；mDC是抗原递呈能力强，提高DC的成熟，才能促进抗原递呈RL-CpG偶联物主要研究：促进DC的成熟和提高抗原递呈能力，所以以imDC为研究对象。

实施例2中制备的RL-CpG偶联物对未成熟树突状细胞的促进成熟和提高抗原递呈功能作用，具体如下。

用细胞分离液提取的HLA-A 0201⁺ PBMC加入适量的贴壁培养基，在37 ℃，5 % CO₂孵箱中培养；在孵箱2h后，将悬浮细胞离心沉淀，加入适量AIM-V培养基培养用于CD8⁺T淋巴细胞的筛选；向贴壁的细胞加入适量生成培养基和10 µl/ml的compent A，在37 ℃，5 %CO₂孵箱中培养。培养的第4天，用显微镜观察细胞状态，并进行生成培养基半量换液，补齐compent A，继续在37 ℃，5 % CO₂孵箱中培养；在培养的第6天，分别进行无药、10µg /mlRL-cys、40 µg/ml CpG ODN7909和50 µg/ml RL-CpG处理imDC，在培养的第7天，分别孵育FITC-anti-CD83、PE-anti-CD80抗体，放在4 ℃冰箱中，避光30 min。用PBS清洗2次，1200rpm离心沉淀，最后300 µl PBS重悬，混匀，用流式细胞术检测树突状细胞表面CD83和CD80的表达情况。

RL-CpG偶联物对未成熟树突状细胞的影响结果，见图7。

结果显示，与未成熟树突状细胞共培养24h后，RL-CpG偶联物对树突状细胞的成熟度和抗原递呈有一定的影响；RL-CpG-imDC组的CD83、CD80表达高于RL-imDC组和imDC组，约20%，(其中：＊，与imDC组比较，p<0.05；#，与RL-imDC组比较，p<0.05)。

未成熟树突状细胞的影响实验表明，RL-CpG偶联物与单独抗原肽RL比较，能促进树突状细胞的成熟和提高抗原递呈功能。证实了RL-CpG偶联物构建树突状细胞疫苗有更为广泛的前景。

实施例5。

RL-CpG偶联物诱导的细胞毒性T淋巴细胞的效应评价。

实施例2制备的RL-CpG偶联物诱导细胞毒性T淋巴细胞对MCF-7和MDA-MB-231的杀伤作用，具体如下。

在六孔板中的树突状细胞培养的第6天，分为四组，分别加入无药、10µg/mlRL-cys、40µg/ml CpGODN7909、50µg/ml RL-CpG，在37 ℃，5 % CO₂孵箱中培养，第7天加入10 µl/ml compentB过夜培养；将上述DC和筛选的CD8⁺T淋巴细胞以1：10的比例在适量AIM-V培养基中混合孵育，加入10ng/ml rhIL-2和5ng/ml rhIL-7；隔两天用AIM-V培养基半量换液，并补齐上述因子；第8天向六孔板中加入对应的无药、10µg/ml RL-cys、40µg/mlCpGODN7909、50µg/ml RL-CpG偶联物进行第二次诱导，激活CTL，用RPMI-1640培养液调整细胞浓度为2x10⁶个/ml；随后准备靶细胞，将MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞消化后，用PBS清洗，1000rpm离心沉淀，用RPMI-1640培养液调整细胞浓度为2x10⁵个/ml；在96孔板中加入细胞悬液和试剂，每个孔设3个复孔，其中阴性释放孔是加入100 µl/well靶细胞和100 µl/wellRPMI-1640培养液，阳性释放孔是加入100 µl/well靶细胞和100 µl/well 1 % TritonX-100，实验孔是加入100 µl/well靶细胞和100 µl/well效应细胞；混匀各个孔，在37 ℃，5 %CO₂孵箱中培养2h；用96孔板离心机1500rpm离心5 min，用注射器取上清100 µl放在新的96孔板中，用酶标仪在490 µm波长读各孔的OD值；根据公式计算CTL对靶细胞的杀伤率：特异性杀伤率（% ）=（实验孔-阴性释放孔）/（阳性释放孔-阴性释放孔）。

RL-CpG偶联物诱导的细胞毒性T淋巴细胞的效应评价结果如图8。

结果显示，其中同一细胞RL-CpG-CTL组与CpG- CTL组、RL-CTL组与CTL组比较，可以说明偶联物RL-CpG诱导的CTL能提高对MDA-MB-231的杀伤，对MCF-7的杀伤主要是佐剂CpGODN7909在起作用。通过RL-CpG-CTL组与RL- CTL组比较可知，RL-CpG偶联物诱导的CTL能明显提高对MDA-MB-231的杀伤，(其中：＊，与MBA-MB-231的CTL组比较，p< 0.05；#，与MCF-7的RL-CTL组比较，p< 0.05；&，与MBA-MB-231的RL-CTL组比较，p < 0.05；※，与MCF-7的RL-CpG-CTL组比较，p < 0.05）。

细胞毒性T淋巴细胞的效应评价实验表明，RL-CpG偶联物诱导的CTL能靶向性杀伤HLA-A0201⁺和AGR2⁺的靶细胞MDA-MB-231，且比单独使用抗原肽RL效果好；又一次证实了RL-CpG偶联物构建树突状细胞疫苗有更为广泛的前景。

序列表

<110> 中国医科大学

<120> 一种抗原肽RL-佐剂CpGODN7909偶联物及其制备方法和应用

<160> 2

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Arg Ile Met Phe Val Asp Pro Ser Leu

1 5

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24

Claims (6)

1.一种抗原肽RL-佐剂CpGODN7909偶联物，其特征在于，所述的RL-CpG偶联物是由抗原肽利用偶联桥通过共价键与佐剂连接而成，其结构式如下：

。

2.如权利要求1所述的抗原肽RL-佐剂CpGODN7909偶联物，其特征在于，所述的共价键为pH敏感的酰腙建和GSH敏感的二硫建。

3.如权利要求1所述的抗原肽RL-佐剂CpGODN7909偶联物，其特征在于，所述的偶联桥的结构式如下：

。

4.如权利要求1所述的抗原肽RL-佐剂CpGODN7909偶联物，其特征在于，具体包括以下步骤：

（1）用Fmoc固相多肽合成技术制备N端半胱氨酸修饰的抗原肽RL，以Wang树脂为载体，EDCi/HOBt 为缩合试剂，无水DMF为反应溶剂，氨基酸与EDCi、HOBt的摩尔比例为1：4：4，脱Fmoc试剂为20%PIP/DMF，脱树脂试剂为50%TFA/DCM，制备得式（a）；

（2）硫代磷酸化和5´端醛基修饰佐剂CpGODN7909，其结构式（b）；

（3）将步骤（1）中产物（a）与偶联剂PDPH在无水甲醇中反应，制备得式（c）；

（4）将步骤（3）中产物（c）与步骤（2）中得（b）在无水甲醇中反应，制备得式（d），即为目的产物RL-CpG偶联物；

。

5.如权利要求1所述的抗原肽RL-佐剂CpGODN7909偶联物的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中产物（a）与PDPH的摩尔比例为1：5；所述步骤（4）中产物（c）与产物（b）的反应比例为5：1。

6.如权利要求1-5任一所述的抗原肽RL-佐剂CpGODN7909偶联物可以用于制备树突状细胞疫苗。