CN116763725B - 一种智能响应型可注射水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
一种智能响应型可注射水凝胶及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于药物制剂领域,具体涉及一种智能响应型可注射水凝胶及其制备方法和应用。本发明智能响应型可注射水凝胶是由如下重量份的原料制备而成:γ‑PGA‑S‑ADH 20~30份,Oxi‑HA 20~30份。本发明智能响应型可注射水凝胶对免疫细胞有正向的激活作用,具有引起免疫应答的性能,并且可在ROS作用下响应性降解。用本发明水凝胶制成的药物——R848&a‑OX40@Gel,通过综合作用提高了淋巴细胞浸润差、肿瘤突变抗原负荷少、对免疫检查点抑制剂耐受的“冷”肿瘤的免疫治疗效率,且经注射给药就能达到抗肿瘤的作用,具备临床实际推广应用价值。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂领域,具体涉及一种智能响应型可注射水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
利用机体自身的免疫系统对抗肿瘤作为一种新兴的肿瘤治疗手段,在近些年引起了广泛的关注。相比传统的化疗、放疗及手术治疗,免疫治疗具有安全性高、对正常组织伤害相对较小、可以产生免疫记忆以应对肿瘤的转移及复发等多种优点。其中以免疫检查点抑制剂、肿瘤疫苗等为代表的免疫治疗方案为身患各种恶性肿瘤的病人带来新的希望。但在实际应用中,往往面临病人对免疫治疗方案的响应性不足、预后效果差等问题。这主要由于以下几方面造成的:(1)在治疗过程中往往没有将足够的肿瘤抗原信息呈递给效应 T 细胞,导致效应 T 细胞无法有效地履行其功能。(2)许多肿瘤为淋巴细胞浸润差、肿瘤突变抗原负荷少、对免疫检查点抑制剂耐受的“冷”肿瘤,且“冷”肿瘤内含大量的免疫抑制性细胞及细胞因子,包括调节性 T 细胞(Treg)、骨髓来源的抑制性 细胞(MDSC)、转化生长因子 β(TGF-β)等,这些抑制性因素会在体内耗竭效应 T 细胞,导致免疫应答失效。因此,增强抗原呈递细胞(Antigen presenting cell,APC)的呈递效率以提高效应 T 细胞的杀伤功能,同时改善肿瘤内的抑制性因素有望提高抗肿瘤免疫治疗的效果。
水凝胶作为一种性能优良的生物材料,在药物递送、生物传感、医学成像、组织工程等各个方面取得了较大的进展。将水凝胶用于肿瘤的免疫治疗亦是近年来新兴的治疗策略之一。中国科学院长春应用化学研究所的陈学思/宋万通研究团队联合吉林大学中日联谊医院房学东教授团队就开发了一种由四臂聚乙二醇胺(4-arm PEG-NH 2 )和氧化葡聚糖(ODEX) 交联形成的水凝胶,用其搭载瑞喹莫德 (R848)和OX40抗体 (aOX40) ,用于结肠癌术后免疫治疗。该水凝胶植入结直肠位置,交联形成凝胶支架,由于对pH敏感,对已装载药物进行有效控制、持续的释放,以保证长期持久的激活作用,激活的适应性免疫可以消除已经存在的远端转移癌灶,最后产生的免疫记忆效应则能够防止肿瘤复发。但该水凝胶本身不具有引起免疫应答的性能,无法增强药物诱导机体对抗肿瘤,且其为植入式凝胶,强度较高,不利于注射成型,临床应用时以植入形式给药会造成较大创伤,有必要开发一种抗肿瘤效果更好,易于注射的水凝胶应用于至肿瘤的免疫治疗。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供了一种智能响应型可注射水凝胶,它是由如下重量份的原料制备而成:
γ-PGA-S-ADH 20~30份,Oxi-HA 20~30份。
所述γ-PGA-S-ADH的结构式为:
其中n大于5420的整数;
所述Oxi-HA的结构式为:
其中m大于2500的整数。
进一步地,它是由如下重量份的原料制备而成:
γ-PGA-S-ADH 25份,Oxi-HA 25份。
进一步地,所述γ-PGA-S-ADH的制备方法包括如下步骤:
步骤1)
所述丙酮和3-巯基-丙酸甲酯在催化剂作用下反应生成ADH;
步骤2)
所述ADH在溶剂中与N2H4-H2O反应生成S-ADH;
步骤3)
所述γ-PGA在溶剂中通过催化剂活化后,与 S-ADH反应生成γ-PGA-S-ADH。
进一步地,步骤1)所述3-巯基-丙酸甲酯以0.1~1mol/L溶解于丙酮中,在硫酸作用下反应生成ADH,反应温度为60~80℃,时间10~15小时;
步骤2)所述ADH在甲醇中与N2H4-H2O反应,ADH与N2H4-H2O的摩尔比为1:4~8,反应的温度20~30℃,时间6~12小时;
步骤3)所述γ-PGA在MES缓冲液中通过EDCI和NHS活化后,与 S-ADH反应生成γ-PGA-S-ADH,γ-PGA、EDCI、NHS和 S-ADH的质量比为100:150~160:90~100:120~125,活化的时间2~3h,反应的温度20~30℃,时间36~72小时。
进一步地,所述Oxi-HA的制备方法包括如下步骤:
所述HA溶解在水中,避光条件下与NaIO4反应;所述HA与NaIO4的质量比为500:150~165;所述反应的温度20~30℃,时间6h。
本发明还提供了一种前述智能响应型可注射水凝胶的制备方法,它包括如下步骤:
取Oxi-HA和γ-PGA-S-ADH,分别溶解于PBS中,等体积混合进行席夫碱反应,即得。
进一步地,所述PBS中Oxi-HA和γ-PGA-S-ADH的浓度均为20~30 mg/mL;所述席夫碱反应的温度为30~40℃,时间10~20min。
进一步地,所述Oxi-HA和γ-PGA-S-ADH分别溶解在PBS溶液中的浓度均为20~30mg/mL ;含Oxi-HA的PBS溶液与含γ-PGA-S-ADH的PBS溶液按体积比为1:1混合;所述席夫碱反应的温度为30~40℃,时间10~20min。
本发明还提供了一种前述的智能响应型可注射水凝胶在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
本发明还提供了一种治疗肿瘤的药物,它是以R848和a-OX40抗体为活性成分,加上前述智能响应型可注射水凝胶制成的凝胶剂;所述R848和a-OX40抗体的质量比为10~30:4。
本发明还提供了一种制备前述药物的方法,它包括如下步骤:
① 取Oxi-HA和γ-PGA-S-ADH分别溶解于PBS溶液,得20~30 mg/mL等浓度的γ-PGA-S-ADH溶液和Oxi-HA溶液;
②按配比称取R848和a-OX40抗体,R848溶解于γ-PGA-S-ADH溶液,a-OX40抗体溶解于Oxi-HA溶液,等体积γ-PGA-S-ADH溶液和Oxi-HA溶液混合进行席夫碱反应,即得。
本发明最后提供了前述药物在制备治疗三阴性乳腺癌和/或黑色素瘤的药物中的用途。
本发明所述“智能响应型可注射水凝胶”是指在低于17℃的条件下不成胶,在37℃条件下可成胶,以此通过注射方式作用于患处,在活性氧的作用下,发生响应性降解的水凝胶。
本发明的有益效果为:
本发明智能响应型可注射水凝胶,能促进抗原递呈细胞成熟活化,提高机体对肿瘤的免疫应答,具有免疫佐剂效应,并且可在ROS作用下响应性降解。用本发明水凝胶制成的药物——新型凝胶体系 R848&a-OX40@γ-PGA-S-ADH /Oxi-HA Gel,不依赖肿瘤细胞上PD-1/PD-L1及CTLA-4的表达,时空可控性释放其负载的R848及aOX40,克服了免疫检查点的限制,通过综合作用提高了淋巴细胞浸润差、肿瘤突变抗原负荷少、对免疫检查点抑制剂耐受的“冷”肿瘤,如三阴性乳腺癌、黑色素瘤的免疫治疗效率,通过瘤内注射给药就能达到抗肿瘤的作用,且给药后无创口,具备临床实际推广应用价值。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
还需要特别指出的是本发明中涉及到的“a-OX40”和“aOX40”,以及“R848&a-OX40”和“R848&aOX40”分别指代的是同一种物质。
附图说明
图1 γ-PGA-S-ADH及其中间产物的核磁共振氢谱;(A) ADH的1H-NMR图,(B) S-ADH的1H-NMR图,(C) γ-PGA-S-ADH的1H-NMR图。
图2 Oxi-HA及HA的核磁共振氢谱及傅里叶-红外光谱;(A)HA的红外光谱;(B)Oxi-HA的红外光谱;(C)HA的核磁共振氢谱;(D)Oxi-HA的核磁共振氢谱。
图3 γ-PGA-S-ADH/ Oxi-HA水凝胶表征图;(A)γ-PGA-S-ADH/Oxi-HA水凝胶的时间流变性能图;(B)γ-PGA-S-ADH/ Oxi-HA水凝胶的温度流变性能图;(C)γ-PGA-S-ADH/Oxi-HA水凝胶的光学成像图;(D)γ-PGA-S-ADH/ Oxi-HA水凝胶的扫描电镜(SEM)图,标尺=80µm。
图4 水凝胶的ROS响应机制。
图5水凝胶体系R848&a-OX40@Gel的制备及ROS响应机理。
图6 R848及 a-OX40抗体加入前后的水凝胶流变学评价图;(A)单独凝胶组及R848&a-OX40@Gel的时间-流变图;(B)R848 @Gel及a-OX40@Gel的时间-流变图。
图7 ROS响应释放曲线图;(A)R848的体外ROS响应释放曲线图;(B)IgG的体外ROS响应释放曲线图。
图8 γ-PGA-S-ADH/Oxi-HA水凝胶的细胞毒性评价图;(A)不同浓度浸提液处理L929细胞后分别在24 h及48 h的成活率;(B)不同浓度浸提液处理NIH3T3细胞后分别在24h及48 h的成活率;(C)不同浓度的γ-PGA-S-ADH及Oxi-HA处理L929细胞后在48h的成活率;(D)不同浓度的γ-PGA-S-ADH及Oxi-HA处理NIH3T3细胞后在48 h的成活率。
图9水凝胶在体内不同时间点的降解情况图。
图10水凝胶对BMDC细胞的影响评价图;(A)不同方法处理后BMDC细胞表面CD 40表达统计图;(B)不同方法处理后BMDC细胞表面CD 80表达统计图。
图11 水凝胶体系R848&a-OX40@Gel显著抑制小鼠三阴性乳腺癌肿瘤的生长;(A)在第1天、第8天及第16天,各组小鼠的肿瘤荧光成像分布图;(B)经治疗后各组小鼠分别的肿瘤体积生长曲线;(C)经治疗后各组小鼠平均肿瘤体积生长曲线。
图12经不同方案治疗后各组小鼠体重变化曲线。
图13经不同方案治疗后小鼠肿瘤中各类浸润性T淋巴细胞含量;(A)经PE/Cyanine7 anti-mouse CD3,FITC anti-mouse CD4,APC anti-mouse CD25, PE anti-mouse Foxp3染色后各组肿瘤代表性Treg流式散点图;(B)各组小鼠Treg细胞占CD4+CD25+T细胞的比率统计图;(C)经PE/Cyanine7 anti-mouse CD3,FITC anti-mouse CD4,APCanti-mouse CD8染色后,各组小鼠肿瘤中CD4+T细胞及CD8+T细胞占比统计图;(D)各组小鼠CD4+T细胞比Treg统计图及CD8+T细胞比Treg统计图。
图14经各组方案治疗后对肿瘤浸润性DC细胞的影响评价;(A)经PE anti-mouseCD11b,FITC anti-mouse CD11c染色后各组代表性流式图;(B)肿瘤浸润性DC细胞占肿瘤细胞比率统计图。
图15 经各组方案治疗后对脾脏中T细胞亚群的影响评价;(A)经PE/Cyanine7anti-mouse CD3,FITC anti-mouse CD4,APC anti-mouse CD8进行染色后各组代表性流式图;(B)经PE/Cyanine7 anti-mouse CD3,FITCanti-mouse CD4,PE anti-mouse CD25, PE/Cyanine5 anti-mouse Foxp3进行染色后各组代表性流式图;(C)CD4+T细胞及CD8+T细胞占比统计图;(D)Treg细胞占比统计图;(1,PBS组;2,R848@Gel组;3,Free组;4,R848&a-OX40@Gel组;5,a-OX40@Gel组)。
图16经各组方案治疗后对小鼠血清中TNF-α及IFN-γ含量测定;(A)经ELISA检测后各组血清TNF-α水平;(B)经ELISA检测后各组血清IFN-γ水平;(1,PBS组;2,R848@Gel组;3,Free组;4,R848&a-OX40@Gel组;5,a-OX40@Gel组)。
图17智能响应水凝胶体系R848&a-OX40@Gel治疗三阴性乳腺癌的治疗方案图及效果图;(A)小鼠复发模型的建立及治疗方案;(B)小鼠分别在第0天、第23天、第60天及第70天的肿瘤荧光成像分布图;(C)经4T1或CT26再次接种后小鼠新的肿瘤体积生长情况。
图18经与辐照过的不同肿瘤细胞共孵育后各组的流式分析结果图。(A)经FITCanti-mouse CD4,APC anti-mouse CD44染色后,各组代表性流式散点图及统计图;(B)经FITC anti-mouse CD8a,APCanti-mouse CD44染色后,各组代表性流式散点图及统计图;(C)经FITC anti-mouse CD4,APC anti-mouse CD44,PE anti-mouseIFN-γ染色后,各组代表性流式散点图及统计图;(D)经FITC anti-mouse CD8a,APC anti-mouse CD44,PE anti-mouseIFN-γ染色后,各组代表性流式散点图及统计图。
图19经与不同肿瘤抗原共孵育后T细胞产生的相关细胞因子评价结果图;(A)IFN-γ的分泌水平检测结果图;(B)TNF-α的分泌水平检测结果图。
图20水凝胶体系R848&a-OX40@Gel抑制三阴性乳腺癌远端转移的实验设计图及肿瘤抑制效果图;(A)小鼠远端转移模型的建立及治疗方案;(B)小鼠分别在在第1天、第8天、第16天的肿瘤荧光成像分布图;(C)经治疗前后各组之间近端肿瘤及远端肿瘤的肿瘤体积生长情况统计图。
图21三阴性乳腺癌远端转移动物模型治疗前后效果图;(A)小鼠的生存期统计图;(B)小鼠的体重变化曲线图。
图22水凝胶体系R848&a-OX40@Gel抑制小鼠黑色素瘤的生长的效果图;(A)小鼠黑色素瘤模型的建立及治疗方案;(B)经治疗前后各组小鼠的肿瘤平均体积曲线;(C)各组小鼠经治疗后的生存期。
具体实施方式
实施例1 本发明智能响应型水凝胶的制备及表征
1、水凝胶基质γ-PGA-S-ADH 的制备及表征
1.1 γ-PGA-S-ADH的制备及表征方法
以 γ-PGA 为骨架的含酮缩硫醇的水凝胶基质一(γ-PGA-S-ADH)的合成方法如下:
步骤1)
步骤2)
;
步骤3)
n大于5420的整数。
以丙酮为底物,通过酮的亲核加成反应生成含有ROS敏感基的中间体ADH;之后通过酰肼化反应生成两端为酰肼的中间体S-ADH;最后经过酰胺化反应将一端的酰肼基接枝在γ-PGA上,形成含ROS敏感基的水凝胶基质γ-PGA-S-ADH。具体反应操作过程如下。
首先合成含有ROS敏感基的中间体ADH:(1)将3-巯基-丙酸甲酯以 0.5 mol/L的浓度溶于丙酮中,后加入无水Na2SO4固体以除去反应中生成的水,再滴加少量浓H2SO4(约100µL)催化反应。(2)将反应置于70℃下加热回流约10小时,通过TLC色谱法进行点板检测,以确定反应的停止时间。(3)反应完成后,过滤掉反应体系中的固体,用旋转蒸发仪除去丙酮,得到棕黄色的粘稠状液体,后加入乙酸乙酯(EA)复溶。(4)用0.1 M的NaHCO3溶液洗涤有机相,中和反应体系中的硫酸。(5)后用饱和NaCl溶液洗涤有机相,经旋转蒸发仪干燥旋蒸得到粗产物。(6)得到的产物在体积比石油醚(PE):乙酸乙酯(EA)=12:1的条件下过硅胶柱纯化产物。(7)收集的液相经旋蒸干燥得到最终产物。产物取样进行1H-NMR表征,无误后用于下一步反应。
之后合成两端为酰肼的中间体S-ADH:(1)将ADH与水合肼按照摩尔比为1:6进行反应,溶剂为甲醇。(2)将反应置于常温搅拌过夜,随着反应的进行会有白色的结晶析出。(3)待白色结晶不再增加时停止反应,用旋转蒸发仪除去溶剂甲醇,后经水泵抽滤,得到的固体为粗产物。(4)用极少量的甲醇对粗产物进行重结晶,经常温干燥挥发溶剂,得到的产物即为S-ADH。产物取样进行1H-NMR表征,无误后用于下一步反应。
最后合成水凝胶基质γ-PGA-S-ADH:(1)取γ-PGA(100 mg,0.684 mmol)溶于MES缓冲液中。(2)待γ-PGA充分溶解后加入催化剂EDCI(157.4 mg,0.821 mmol)和NHS(94.49mg,0.821 mmol)进行活化,反应进行2 h。(3)在活化后的反应体系中加入S-ADH(123.4 mg,0.684 mmol),室温反应48 h。(4)将反应完成后的液体转移到再生纤维素透析袋(截留量为3500)进行透析,以除去未反应的小分子及生成的盐。(5)反应透析3天,每天更换外水相3-4次。(6)收集内水相,经真空冷冻干燥得到产物。取样进行1H-NMR表征。
1.2、γ-PGA-S-ADH的表征结果
1.2.1 水凝胶基质γ-PGA-S-ADH的表征结果
以γ-PGA为骨架的含酮缩硫醇的水凝胶基质(γ-PGA-S-ADH)的合成主要包括三步,首先以丙酮为原料,通过酮的亲核加成反应经硫酸催化生成含有ROS敏感基的中间体ADH,ADH的1H-NMR如图1A,各类氢的化学位移与峰面积之比与目标产物的氢谱一致,说明中间产物的成功合成。1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ3.55(s,6H),2.65-2.59 (t, 4H), 2.55-2.50 (t,4H),1.52 (s,6H)。之后利用酰肼化反应将中间体两段修饰为含有伯氨基的酰肼的中间体S-ADH,通过在无水甲醇中使中间体ADH与水合肼充分反应,经过滤及重结晶得到白色的针状晶体,通过1H-NMR进行表征,S-ADH的1H-NMR如下图1B,各类氢的化学位移与峰面积之比与目标产物的氢谱一致,说明S-ADH的成功合成。1H-NMR(400 MHz,H2O-d2)δ2.95-2.85(t, 4H),2.63-2.50(t, 4H),1.63 (s,6H)。最后通过酰胺化反应将S-ADH接枝在γ-PGA上,形成含ROS敏感基的水凝胶基质γ-PGA-S-ADH,经过透析冷冻干燥后得到白色粉末,通过1H-NMR进行表征,γ-PGA-S-ADH的1H-NMR如下图1C,可以看到经透析后的产物上保留着S-ADH及γ-PGA的特定氢谱,说明S-ADH成功的连接到γ-PGA上,成功制备得到γ-PGA-S-ADH。
2、水凝胶基质Oxi-HA 的制备及表征
2.1 水凝胶基质Oxi-HA的制备及表征方法
氧化的透明质酸钠(Oxidized sodium hyaluronate, Oxi-HA)的合成方法如下
m大于2500的整数。
利用NaIO4的氧化作用,将透明质酸钠(HA)上的邻二醇氧化为邻二醛,通过NaIO4的当量比来控制HA的氧化度。具体反应如下:(1)提前将HA(500 mg,1.26 mmol)溶于双蒸水中,使其充分溶解。(2)将反应置于避光体系中,避光滴加NaIO4(161.69 mg,0.756 mmol),后室温下反应6 h。(3)待反应完成后加入少量乙二醇(约100 µL)终止反应。(4)终止反应20分钟后将体系转移至纤维素透析袋(截留量为3500)中进行透析。(5)透析袋外水相每天更换3-4次。(6)收集透析袋内水相,后置于真空干燥器中冷冻干燥得到产物。取样进行1H-NMR表征,同时用盐酸羟胺法检测Oxi-HA的实际氧化度。
盐酸羟胺滴定法测定Oxi-HA氧化度的具体操作如下:取100 mg冻干的氧化透明质酸钠(Oxi-HA)粉末,加入到25 mL的盐酸羟胺-甲基橙溶液(0.25 mol/L)中,充分搅拌混匀后以0.1 mol/L的NaOH溶液进行滴定,记录溶液颜色突变时NaOH的体积。Oxi-HA最终的氧化度计算公式如下:
2.2 Oxi-HA的表征结果
利用NaIO4的氧化作用,将透明质酸钠(HA)上的邻二醇氧化为邻二醛,制备Oxi-HA。通过NaIO4的当量比来控制HA的氧化度,将HA的理论氧化度控制在60%。通过在双蒸水中避光反应6 h后进行透析冷冻干燥,得到了白色的固体。通过1H-NMR及FTIR对Oxi-HA进行表征,Oxi-HA的1H-NMR图谱及FTIR图谱如下图2。从图2B中可以看出,在约1750 cm-1处出现了一个小峰;从图2D处可以看出,相比图2C,在约4.8-5.2 ppm处出现了一个连续的小峰,其为氧化后的醛基与邻近的羟基形成的半缩醛氢的化学位移。由此可以看出透明质酸钠(HA)的氧化反应成功进行。之后通过盐酸羟胺法对Oxi-HA的氧化度进行了测量,其理论氧化度与实际氧化度测量结果如下表1,平均氧化度约为45.83%。成功获得了Oxi-HA。
3、水凝胶的制备及表征
3.1 水凝胶的制备方法
水凝胶的制备路线如下:
具体操作如下:首先将γ-PGA-S-ADH和Oxi-HA分别以25 mg/mL的浓度溶于PBS中,置于37℃摇床中约4 h,使得γ-PGA-S-ADH和Oxi-HA在PBS中充分溶解。之后取等体积的γ-PGA-S-ADH溶液和Oxi-HA溶液进行充分混合,最后在37℃下静置,待席夫碱反应完全以形成水凝胶γ-PGA-S-ADH/Oxi-HA。
3.2水凝胶的表征方法
3.2.1 水凝胶的流变学表征
使用Thermo Scientific流变仪分别分析水凝胶在37℃的成胶强度与成胶时间及水凝胶随着温度逐渐升高成胶状态逐渐变化的温度-相变曲线。具体方法操作如下所示:
(1)测定水凝胶在37℃下的时间-相变曲线。打开流变仪,预热仪器后将流变仪设置为振荡模式,温度设置为37℃,调整流变仪平行板与转子之间的间隙,使其保持在1 mm;同时将 γ-PGA-S-ADH和Oxi-HA 以25 mg/mL分别溶解于PBS中,并充分混匀形成均一溶液;之后采用双注射器法分别将200 μL γ-PGA-S-ADH和Oxi-HA溶液加在流变仪平行板上,期间避免气泡的产生;最后记录 10 min 内储能模量(G')与损耗模量(G")随时间的变化情况。
(2)测定水凝胶随着温度逐渐升高成胶状态随之变化的温度-相变曲线。改变流变仪的检测模式,将其设置为温度线性增加模式,继续保持流变仪平行板与转子之间的间隙为1 mm,将提前配好的γ-PGA-S-ADH和Oxi-HA溶液混匀后采用双注射器法加至流变仪平行板上,依旧避免气泡的产生,同时避免触碰仪器台面,以保持水平,最后记录从4℃到45℃时凝胶G'与G"的变化曲线。
3.2.2 水凝胶的扫描电子显微镜表征
通过扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)研究水凝胶的结构形态。首先在37℃下形成水凝胶;然后将水凝胶进行冷冻干燥72 h,冷冻干燥时应避免液态水的产生,以使得冻干后的形貌不被液态水在真空状态下形成的泡沫而损坏;之后在液氮中进行冷冻破碎,破碎时应保持切面的完整性;进一步在凝胶脆断面涂一层薄金属;最后在SEM下观察水凝胶表面的横截面形貌。
3.2.3 水凝胶的ROS响应性表征
水凝胶的ROS响应性主要源自水凝胶中γ-PGA-S-ADH对ROS的敏感性,故对γ-PGA-S-ADH在双氧水中的敏感性进行验证,具体如下:取5 mg γ-PGA-S-ADH粉末,分别溶于重水(D2O)及含10 mM 双氧水的D2O中,分别密封后置于37℃摇床震荡24 h,最后直接将样品通过1H-NMR进行表征。
3.3 水凝胶表征结果
3.3.1流变学特征及显微镜表征结果
通过观测该γ-PGA-S-ADH/Oxi-HA水凝胶的流变学行为分析其成胶性能,通过扫描电镜评价该γ-PGA-S-ADH/Oxi-HA水凝胶的成胶后的内部结构。图3A为在37℃下随着时间变化,凝胶的形成过程图,从图中可以看出,起初弹性模量(G’)及粘性模量(G’’)的数值很低,且有明显的波动状态,说明此时凝胶还未形成,体系为溶液状态;随着时间的变化,弹性模量(G’)稳步上升,且远远超过粘性模量(G’’),说明γ-PGA-S-ADH/Oxi-HA水凝胶开始形成;大约10分钟后,弹性模量(G’)的数值趋于稳定,此时粘性模量(G’’)有小幅波动,说明γ-PGA-S-ADH/ Oxi-HA水凝胶内的席夫碱反应充分完成,此时凝胶保持为一个稳定的状态。
之后对γ-PGA-S-ADH/Oxi-HA水凝胶的温敏性质进行了研究,结果如图3B所示,在体系小于17℃时,弹性模量(G’)小于粘性模量(G’’)的数值,说明此时的交联反应还未进行,凝胶为溶液状态;大约17℃后,弹性模量(G’)开始明显升高,且超过了粘性模量(G’’),说明凝胶化反应开始进行;随着温度升高,弹性模量(G’)稳步增加,证明了该γ-PGA-S-ADH/Oxi-HA水凝胶具有一定的温敏性能。在低温时因交联反应被抑制,此时为水溶液状态,在超过17℃后,开始转变为凝胶状态,该性能保证了凝胶的可注射性。图3C为该γ-PGA-S-ADH/Oxi-HA水凝胶的光学成像图,可以看出成胶后可以克服重力作用,粘附于管壁上方;同时该γ-PGA-S-ADH/ Oxi-HA水凝胶为一澄清透明的状态。图3D为γ-PGA-S-ADH/Oxi-HA水凝胶的SEM图,从中可以看到,水凝胶内部表现为高度交联的形态,其中包含大量的多孔状结构,其符合天然高分子多糖材料与聚氨基酸材料混合成胶后的形貌特点,这也有助于后期实验作为药物递送平台时对小分子药物的包裹及对蛋白质抗体的吸附。
3.3.2 ROS响应性表征结果
将γ-PGA-S-ADH分别置于重水(D2O)及含10 mM H2O2的D2O中,最后经1H-NMR验证其响应机制,所得结果如图4,当γ-PGA-S-ADH未与H2O2反应时,此时酮缩硫醇之间的甲基氢CH3在氢谱上的位移为1.55 ppm,且此时的H为单峰;当与10 mM H2O2反应后,此时在活性氧的作用下酮缩硫醇发生亲核取代反应,最后逐步分解为丙酮及硫醇,同时生成H2O,丙酮的氢谱位移在2.15 ppm左右,与γ-PGA的骨架有一定重合。该实验说明在活性氧簇(ROS)的作用下,水凝胶的确可以降解,为包载物的释放提供条件。由于水凝胶具有ROS敏感性,在富含ROS的环境,如肿瘤中,可响应性降解,实现了结构功能化,具备智能特点。
从以上数据可以看出,本发明将Oxi-HA和γ-PGA-S-ADH分别溶解于PBS溶液中,混合后在低于17℃的条件下不成胶,在37℃条件下静置10~20min,席夫碱反应完全后成功获得了水凝胶。
该水凝胶成胶性能良好,且具有ROS响应性,由于还具有一定的温敏性能,可通过注射后以原位交联方式吸附作用于患处,有助于后续作为递送平台完成对小分子药物的递送。
实施例2 本发明治疗肿瘤的药物的制备及表征
1、水凝胶体系R848&a-OX40@Gel的制备方法
取实施例1制备的 γ-PGA-S-ADH 和Oxi-HA 分别以25 mg/mL 的浓度溶于PBS中,置于37℃摇床中放置2h,使得γ-PGA-S-ADH和Oxi-HA溶解。之后分别取4 μg a-X40 抗体加入 50μLγ-PGA-S-ADH溶液中,取 20μg R848 加入50μL 的 Oxi-HA 溶液中,并充分混匀。最后将两者充分混合,在 37°C下静置10~20min形成水凝胶体系 R848&a-OX40@ Gel。
2、水凝胶体系R848&a-OX40@Gel的表征方法
2.1 流变学表征
流变学表征如下:打开流变仪,预热仪器后将流变仪设置为振荡模式,温度设置为37℃,调整流变仪平行板与转子之间的间隙为1 mm;同时将提前制备好凝胶基质溶液(γ-PGA-S-ADH溶液和Oxi-HA溶液)分别采用双注射器法加至流变仪平行板上,样品分组及混合方法如下表2:
混合期间避免气泡的产生,记录10 min内储能模量(G')与损耗模量(G")随时间的变化情况。
2.2 R848&a-OX40@Gel的 ROS响应性释放评价
R848&a-OX40@Gel的体外ROS响应性释放主要通过将凝胶体系置于不同浓度的H2O2溶液以及PBS溶液中检测R848及a-OX40的释放情况来确定,为了便于检测,采用a-OX40的同型对照抗体IgG评价释放行为,分别用HPLC及BCA法对R848及a-OX40进行定量。
3、结果
3.1流变性特征结果
如图5所示,注射至小鼠肿瘤部位的水凝胶体系R848&a-OX40@Gel,在ROS的作用下,将响应性释放药物。为了验证在加入R848及a-OX40前后,对水凝胶的成胶性能是否产生影响,将样品分为四组:R848&a-OX40@Gel,R848 @Gel,a-OX40@Gel及单独凝胶组。如图6A所示,相比单独凝胶,再加入小分子药物R848及抗体a-OX40后,弹性模量G’有小幅的降低,说明R848及抗体a-OX40的加入对凝胶的交联过程未产生明显的影响。之后分别以单独R848及单独抗体a-OX40加入后的凝胶成胶性能做对照,发现R848的加入对弹性模量G’几乎不产生影响,但单独抗体a-OX40加入后的弹性模量G’亦发生小幅的降低(图6B)。从整体上药效成分R848和抗体a-OX40加入到水凝胶中对流变性无显著影响。
3.2响应行为特征结果
分别用HPLC及BCA法对R848及IgG进行定量,所得释放曲线如图7A-B。可以看出,在PBS中时R848及IgG在48 h后的释放量分别为81.99%及50.72%,说明依旧有部分药物包封在凝胶中;而随着H2O2浓度的升高,药物的释放速率变快,同时在48 h的释放量升高,相比PBS组,在含10 mM H2O2的PBS中R848及IgG在48 h的释放量分别提高了18.01%及33.49%,说明随着时间的变化凝胶会发生ROS响应性降解,从而将包封物释放出来。值得注意的是,R848的释放速率快于IgG,在16 h时R848的释放即可达到峰值,而IgG在2天后才可达到峰值。这是由于水凝胶对两个包封物之间的亲和力及分子本身的大小决定的:R848为小分子药物,且在水凝胶中的吸附力不强,当遇到外部介质时,可快速从水凝胶的大孔隙中逃离出来;而IgG为一种抗体蛋白,水凝胶本身对其便具有良好的亲和力,同时其大的分子量决定了在凝胶空隙中具有一定的限制,因此从凝胶中释放的速率较慢。R848及IgG的差异性释放有助于在动物体内的治疗过程,本发明水凝胶体系R848&a-OX40@Gel先将R848释放出,以为T细胞清扫“路障”,之后再通过抗体a-OX40为T细胞“加速”。
从以上数据可以看出,本发明将a-OX40 抗体溶解于γ-PGA-S-ADH溶液中, R848溶解于Oxi-HA 溶液中,混匀, 37℃静置10~20min,发生席夫碱反应后获得的R848&a-OX40@Gel能将R848和a-X40 抗体有序释放,从而达到提高药效的作用。
以下通过试验例进一步说明本发明的有益效果。
试验例1智能响应型水凝胶的性能验证
1、智能响应型水凝胶的安全性
1.1 方法
采用MTT法对水凝胶对L929及NIH3T3细胞的细胞毒性进行检测。分别将L929及NIH3T3细胞以4000个/孔及2500个/孔的密度铺于96孔板中,培养体积为100 μL,后分别加入水凝胶浸提液(水凝胶γ-PGA-S-ADH/Oxi-HA置于培养基中,24小时后得到的溶液)及凝胶基质溶液(γ-PGA-S-ADH和Oxi-HA分别溶解在培养基中形成的溶液),24 h或48 h后加每孔加入20 μL MTT溶液,静待4 h后除去孔板中的液体,最后加入100 μL DMSO溶液,后用酶标检测仪检测562 nm处的吸光度值,通过与阴性对照进行对比,计算出细胞成活率。
1.2 结果
将选取的L929及NIH3T3作为小鼠代表性正常细胞系,分别检测水凝胶基质γ-PGA-S-ADH与Oxi-HA及水凝胶浸提液对L929及NIH3T3细胞的影响。如图8A所示,当凝胶浸提液从0%提高至100%时,L929细胞的成活率并未产生明显影响,即使在100%时,在24 h L929细胞的成活率亦维持在85%以上,经浸提液处理48 h后,L929细胞亦未产生明显的下降,相比24 h的结果无显著性差异,说明即使经过长时间共孵育,细胞成活率亦不会被影响。在图8B中可以看出,处理48 h的NIH3T3细胞甚至发生了增殖,其充分说明了凝胶骨架对细胞的安全性。之后分别对凝胶基质γ-PGA-S-ADH与Oxi-HA对细胞的影响分别进行探究,如图8C-4D所示,结果发现即使γ-PGA-S-ADH与Oxi-HA的浓度提高至2.5 mg/mL,L929及NIH3T3细胞的成活率均保持在75%以上,说明凝胶基质即使在大浓度对细胞依旧没有毒副作用。本发明水凝胶γ-PGA-S-ADH/Oxi-HA安全性高。
2、智能响应型水凝胶的生物相容性
2.1方法
通过在Balb/c小鼠皮下注射水凝胶后观察不同时间的凝胶残留情况,评价水凝胶的体内降解,将凝胶注射至6~8周的Balb/c小鼠皮下,以注射当天记为第0天,分别在0天、7天、14天及21天处死小鼠,剥离背部皮肤后观察凝胶在体内的降解情况。
2.2、结果
通过直接在Balb/c小鼠皮下注射200 µL水凝胶,评价水凝胶的体内降解,所得数据如图9,可以看出,在注射当天,凝胶呈明显的块状,其中凝胶为透明的胶体;在第7天时,凝胶的块状明显,同时凝胶变为浅黄色,说明发生了部分降解;在第14天时,凝胶体积明显减少,此时依旧为浅黄色,说明凝胶大部分已经被降解;随着继续观察,在21天时剖开小鼠右侧背部皮肤,此时凝胶已完全降解。在此期间,同时对小鼠的毛色、体重及行为进行了观察,未发现异常,说明该γ-PGA-S-ADH/Oxi-HA水凝胶具有良好的生物安全性,且生物相容性佳。
3、智能响应型水凝胶的免疫佐剂效性
3.1 方法
通过流式细胞术评价了水凝胶体系对BMDC细胞的影响。提取并培养BMDC细胞,之后铺于24孔板中,加入25 μL水凝胶与BMDC细胞共培养24 h, 之后收集细胞分别用PEanti-mouse CD40抗体与PE anti-mouse CD80抗体进行染色,通过流式细胞仪分析BMDC的成熟情况。
3.2 结果
通过流式细胞术对凝胶处理后的BMDC的成熟情况进行检测,所得结果如图10。可以看出,相比未处理组,经γ-PGA-S-ADH/Oxi-HA水凝胶处理后的BMDC成熟情况得到了明显的改善,共刺激分子CD40的水平增强了5倍,CD80的水平增强了1.4倍,说明水凝胶体系促进了BMDC细胞的成熟与活化。BMDC细胞是启动初始T 细胞增殖的抗原递呈细胞,是机体T细胞介导的适应性免疫应答的启动者,在抗肿瘤免疫反应中发挥着极其重要的作用,因此,γ-PGA-S-ADH/Oxi-HA水凝胶能提高机体对肿瘤的免疫应答,具有良好的生物学效应。
从以上数据可以看出,本发明制备的γ-PGA-S-ADH/Oxi-HA水凝胶安全性高,并具有免疫佐剂效应,作为抗肿瘤小分子药物如R848、a-OX40抗体的递送平台,能协同提高抗肿瘤的效果。
试验例2 本发明R848&a-OX40@Gel针对三阴性乳腺癌的疗效实验
一、方法
1、治疗三阴性乳腺癌的效果
1.1 小鼠三阴性乳腺癌模型的建立及治疗方案
分别在6~8周的Balb/c小鼠背部皮下右侧以1×106个/只的密度接种表达荧光素酶的4T1细胞4T1-luciferase,待肿瘤体积长至150~200 mm3时将不同的制剂注射至小鼠肿瘤部位。分组及给药方案如下:(1)PBS组:原位注射100 µL PBS;(2)游离药物联合组:20 µgR848及8 µg a-OX40溶液瘤内注射;(3)R848@Gel组,将20 µg R848混在100 µL水凝胶中瘤内注射;(4)a-OX40 @Gel组,将8 µg a-OX40混在100 µL水凝胶中瘤内注射;(5)单独凝胶组,取100 µL水凝胶瘤内注射;(6)水凝胶体系R848&a-OX40@Gel组,将20 µg R848及8 µga-OX40混在100 µL水凝胶中瘤内注射。治疗三次,每次间隔7天。期间主要观察小鼠的以下指标:(1)小鼠肿瘤体积生长曲线:计算公式为V(mm3)=(长径(mm)×短径(mm)2)/2;(2)小鼠肿瘤体内生长及转移情况:通过小动物活体成像仪观测,向小鼠腹腔注射荧光素酶底物,每只小鼠3 mg,待20分钟后采用活体成像仪进行观测;(3)水凝胶体系的毒副作用:通过观测小鼠治疗前后的体重、毛发、生活状态等进行评价。在最后一次治疗两天后,对小鼠进行安乐死,进行以下分析。注:R848@Gel组、a-OX40 @Gel组、R848&a-OX40@Gel组中的药物制备方法同实施例2中的表2;单独凝胶组中的药物制备方法同实施例1。
1.2治疗后肿瘤免疫微环境分析方案
主要通过流式细胞术评价各组治疗后对小鼠肿瘤免疫微环境的影响,操作方案如下:分离小鼠肿瘤,并剔除坏死区域,后在少量RPMI-1640 培养基中将瘤块剪碎,接着在含1mg/mL的I型胶原酶及2 µg/mL的DNA酶的RPMI-1640 培养基中进行消化,消化时间约为2 h。待消化后将体系摇匀,并静置5分钟,之后经70 µm 细胞筛网过滤,制备成单细胞悬液。然后用PBS清洗,后加入红细胞裂解液5 mL裂解5分钟,之后用PBS洗涤两遍,最后将细胞悬浮于PBS中并进行计数,细胞密度控制为1×107个/mL,用于下一步的分管染色,分管染色方案如下:第一组:PE/Cyanine7 anti-mouse CD3,FITC anti-mouse CD4,APC anti-mouse CD8;第二组:PE/Cyanine7anti-mouse CD3,FITC anti-mouse CD4,APC anti-mouse CD25, PEanti-mouse Foxp3;第三组:PE anti-mouse CD11b,FITC anti-mouse CD11c。
1.3 小鼠脾淋巴细胞分离检测方案
通过淋巴细胞分离液分离小鼠脾脏,方法如下:(1)小鼠安乐死后在75%酒精中浸泡15分钟对小鼠进行初次消毒。在超净工作台中固定小鼠,使用提前灭菌过的手术器械提取小鼠完整的脾脏,用RPMI-1640 培养基清洗两次。(2)将75 µm孔径的筛网置于50 mL的大BD管中,在筛网中碾碎脾脏,并加入小鼠淋巴细胞分离液悬浮提取的细胞。(3)将细胞悬液转移至15 mL的小BD管中,后在上层缓慢沿着管壁加入1 mL RPMI-1640 完全培养基。(4)调整离心机加减速为3,转速为800 g,将混合液在此情况下离心30分钟。(5)离心后的收集中间层的淋巴细胞,后用RPMI-1640 培养基清洗两次,期间离心速率为250 g。(6)将细胞悬浮于RPMI-1640 完全培养基中,调整细胞密度为1×107个/mL备用。之后对脾淋巴细胞进行染色,染色方案如下:第一组:PE/Cyanine7 anti-mouse CD3,FITC anti-mouse CD4,APCanti-mouse CD8;第二组:PE/Cyanine7anti-mouse CD3,FITC anti-mouse CD4,APC anti-mouse CD25, PE anti-mouse Foxp3.
1.4 ELISA检测小鼠血清中杀伤性细胞因子含量
取小鼠血清用作细胞因子分析,通过ELISA试剂盒检测小鼠血清中TNF-α和INF-γ的含量。
2、防止三阴性乳腺癌复发的效果
2.1 小鼠三阴性乳腺癌复发模型的建立及治疗方案
分别在6~8周的Balb/c小鼠右侧背部皮下以1×106个/只的密度接种表达4T1-luciferase,待肿瘤体积长至100~150 mm3时用水凝胶体系R848&a-OX40@Gel进行治疗,治疗三次,每次间隔7天,期间观察小鼠肿瘤生长情况。待最后一次治疗两个月后,将小鼠分为两组,并且对小鼠用4T1-luciferase及CT26-luciferase进行再次接种,接种密度为1×106个/只,之后观察接种不同肿瘤细胞之后的小鼠肿瘤再次生长情况及小鼠生存状态,主要通过肿瘤体积曲线及肿瘤活体成像技术观察肿瘤生长情况;通过观测小鼠治疗前后的体重、毛发、生活状态等评价整个治疗方案前后的安全性。
2.2 形成的免疫记忆机制评价
首先建立小鼠4T1单侧模型,在6~8周的Balb/c小鼠右侧背部皮下以1×106个/只的密度接种4T1细胞,当肿瘤体积约为200 mm3时将水凝胶体系R848&a-OX40@Gel注射于小鼠瘤内。7天后,将荷瘤小鼠的脾脏取出,并制备成单细胞悬液,之后用淋巴细胞分离液分离T细胞,最后以5×106个/孔的密度铺于24孔板。提前辐照肿瘤细胞4T1及CT26,并将辐照后的肿瘤细胞分别与脾淋巴细胞共同孵育24 h。24 h后收集脾细胞及培养上清液,细胞分为以下四组进行染色:第一组:FITC anti-mouse CD8a,APC anti-mouse CD44;第二组:FITCanti-mouse CD4,APC anti-mouse CD44;第三组:FITC anti-mouse CD8a,APCanti-mouseCD44,PE anti-mouse IFN-γ;第四组:FITC anti-mouse CD4,APC anti-mouse CD44,PEanti-mouse IFN-γ。
第一二组在冰上孵育30 min后,用PBS洗两次,直接用流式细胞仪分析。第三四组首先染表面marker,后用PBS洗涤一次,加入1 mL 2%多聚甲醛室温固定30分钟,接着离心弃去多聚甲醛溶液,加入2% Triton试剂打孔,最后加入PE anti-mouse IFN-γ抗体在冰上过夜,第二天后用PBS洗涤一次,再进行上机检测。培养上清液通过EILSA检测TNF-α和INF-γ的含量。
3、防止三阴性乳腺癌转移的效果
3.1 小鼠三阴性乳腺癌模型转移模型的建立及治疗方案
分别在6~8周的Balb/c小鼠两侧背部皮下以 1×106个/只的密度接种4T1-luciferase,待肿瘤体积长至100~150 mm3时将小鼠随机分为六组,后将不同的制剂注射至小鼠肿瘤右侧肿瘤部位,以此记为原位肿瘤,同时左侧肿瘤不给药,以此模拟远端转移肿瘤。分组及给药方案如如试验例2中“小鼠三阴性乳腺癌模型的建立及治疗方案”。
3.2 肿瘤体积检测及安全性评价
小鼠肿瘤体积观测方法:(1)记录并绘制小鼠肿瘤体积生长曲线;(2)通过小动物活体成像仪观测小鼠肿瘤体内生长及转移情况。同时通过观察小鼠经不同方案治疗后生存期情况,评价治疗效果。若小鼠肿瘤体积超过2000 mm3,出于伦理考虑将小鼠处死,同时记录小鼠死亡日期。最后通过观测小鼠治疗前后的体重、毛发、生活状态等对水凝胶体系的毒副作用进行评价。
4、 实验数据分析方法
所有数据均采用Graphpad Prism软件进行处理,实验结果表示为平均值±标准偏差(Mean±Standard deviation)。两组间差异使用Student-test;多组间差异使用单因素方差分析。小鼠肿瘤体积-时间生长曲线采用双向方差分析和Bonferroni校正。数据显著性差异使用如下表示方法:*,P值<0.05;**,P值<0.01;***,P值<0.001;****,P值<0.0001。
二、结果
1、R848&a-OX40@Gel对三阴性乳腺癌的治疗作用
1.1、R848&a-OX40@Gel对三阴性乳腺癌的抑制
水凝胶体系R848&a-OX40@Gel对小鼠三阴性乳腺癌的作用结果如图11。图11A为在特定时间点小鼠的肿瘤荧光成像图,可以看出在接种第1天时,各组肿瘤大小无差异;当经过第一次治疗一天后,R848&a-OX40@Gel组相比其他组肿瘤无明显变小,说明此时的制剂还未发生作用;当16天时,R848&a-OX40@Gel组接受了两次治疗,此时该组的肿瘤荧光强度明显低于其他组,此时甚至有一只小鼠的皮下无荧光,说明该只小鼠的肿瘤发生了消退,而这时的PBS组小鼠肿瘤发生了明显的转移,充分说明了R848&a-OX40@Gel体系对小鼠三阴性乳腺癌的抑制作用。图11B-C为治疗期间小鼠在肿瘤体积生长曲线及平均生长曲线,从中可以看出相比PBS组,R848&a-OX40@Gel组对肿瘤产生高效的抑制作用,在第24天时,R848&a-OX40@Gel组肿瘤体积相比PBS组产生了明显的差异(P<0.001),之后该组的肿瘤一直处于被抑制状态,且部分小鼠的肿瘤产生了消退。而R848@Gel组及a-OX40@Gel组对小鼠肿瘤亦产生了抑制,相比PBS组延缓了肿瘤的生长,但其效果均不如R848&a-OX40@Gel组,说明单独靠为T细胞清除障碍或者为T细胞加速的策略均不能有效抑制“冷”肿瘤的发展。同时单独Gel组小鼠的肿瘤体积相比PBS组没有明显的减少,说明单独凝胶对肿瘤产生的影响很低。但凝胶的作用主要体现在延缓药物的释放上,从游离药物组与R848&a-OX40@Gel组的对比可以看出来:游离药物组有一定的抑制作用,但因其无法长期持续滞留在肿瘤中,其对肿瘤的持续抑制作用有限。这些结果初步证明了R848&a-OX40@Gel体系对“冷”肿瘤的抑制作用。
对小鼠的体重、毛发、生活状态等进行观测,所得体重记录曲线如下图12,从中可以看出,在小鼠治疗前后,小鼠的体重无明显的变化;同时各组之间小鼠体重无明显差异,说明R848&a-OX40@Gel治疗后的小鼠无明显的毒副作用,且随着对肿瘤的治愈,反倒有助于小鼠状态的恢复,充分证明了该方案的安全性。
1.2、R848&a-OX40@Gel对治疗后肿瘤免疫微环境影响
1.2.1 R848&a-OX40@Gel对T淋巴细胞浸润的影响
肿瘤免疫微环境中最主要的部分为各类浸润性T淋巴细胞,因此首先对各类浸润性T淋巴细胞的变化进行分析,所得结果如图13。图13A-13B为各组Treg细胞的流式图及统计图,从中可以看出,R848&a-OX40@Gel组对Treg细胞水平的抑制作用最强,而游离药物组及R848@Gel组对Treg的抑制情况较弱,说明在单独游离药物作用下及单独药物R848凝胶体系作用下,对Treg细胞均未产生明显的作用。而a-OX40@Gel组及R848&a-OX40@Gel组的平均Treg细胞含量均产生显著降低,这主要与OX40信号被激活有关。作为一种TNF超家族成员分子,OX40在效应T细胞及Treg细胞上均有表达,OX40信号的激活会抑制Treg信号的水平,同时促进效应T细胞的杀伤功能。图13C为CD4+T细胞及CD8+T细胞含量统计图,相比PBS组,经R848@Gel,Free,R848&a-OX40@Gel及 a-OX40@Gel组治疗后,肿瘤浸润性CD4+T细胞及CD8+T细胞水平均升高,说明该凝胶体系中R848及a-OX40的加入均对抑制性微环境有好转的迹象。其次,相比游离药物组,R848&a-OX40@Gel组的CD4+T细胞及CD8+T细胞亦有明显的增高,说明凝胶的延缓释放可以增强对肿瘤浸润性T淋巴的影响,从而改善肿瘤免疫微环境。最后,各组之间CD4+T细胞及CD8+T细胞浸润情况结果与各组小鼠的肿瘤抑制情况的趋势相符合,说明浸润性T淋巴细胞对抗肿瘤免疫治疗具有重要的作用。临床上经常以CD4+T细胞及CD8+T细胞与Treg细胞的比值指示治疗前后免疫微环境的改善情况,其比值越高,说明肿瘤内免疫浸润情况越好,因此继续对CD4+T细胞及CD8+T细胞与Treg细胞的比值进行统计,结果如图13D,可以看出,R848&a-OX40@Gel组的CD4+T细胞及CD8+T细胞与Treg细胞的比值最高,说明该治疗方案对肿瘤免疫微环境的改善效果最佳,其结果亦与动物模型中的抑瘤效果一致。
1.2.2 R848&a-OX40@Gel对DC细胞浸润影响
对经各种治疗方案后对肿瘤浸润性DC细胞的影响进行评价,图14可以看出经R848&a-OX40@Gel治疗后,肿瘤浸润性DC细胞的占比明显提高,相比PBS组,提高了12.93%,为PBS组的3.27倍,说明R848&a-OX40@Gel提高了DC细胞的浸润情况。同时相比Control组,经R848@Gel,Free,R848&a-OX40@Gel及 a-OX40@Gel组治疗后,肿瘤浸润性DC细胞水平亦产生了提升,分别提高了4.8%,7.51%,8.45%,且提高的值均低于R848&a-OX40@Gel组的12.93%,说明仅活化APC细胞为T细胞清除障碍或仅加速T细胞的策略并不能显著改善微环境,从而改善DC细胞的浸润。
1.2.3 R848&a-OX40@Gel对抗肿瘤系统免疫的影响
荷瘤小鼠在治疗后处死获得肿瘤单细胞悬液的同时,分离了小鼠的血清以检测血清中抗肿瘤相关细胞因子的分泌,同时将脾脏制备成单细胞悬液,并对其中CD4+T细胞,CD8+T细胞及Treg细胞的水平进行检测,所得结果如图15。经R848&a-OX40@Gel治疗后,小鼠脾脏中CD4+T细胞及CD8+T细胞占比明显增加(图15A),图15C为统计图,可以看出相比阴性对照组,R848&a-OX40@Gel组的CD4+T细胞比率及CD8+T细胞比率分别增加了27.28%及23.84%,分别为阴性对照组的2.73及4.67倍,说明经R848&a-OX40@Gel治疗后增强了小鼠系统性抗肿瘤免疫反应。R848@Gel组,a-OX40@Gel组及游离药物组亦显著促进了CD4+T细胞的水平;R848@Gel组,a-OX40@Gel组及游离药物组对CD8+T细胞却没有显著的影响。CD8+T细胞被认为是抗肿瘤免疫治疗的直接杀伤细胞,其含量的增加表面体内免疫反应的高效生成。由此可见,R848@Gel组,a-OX40@Gel组及游离药物组对系统性抗肿瘤免疫反应的生成均不如经水凝胶体系R848&a-OX40@Gel治疗后的小鼠。其结果也与肿瘤原位免疫反应的产生程度的趋势一致。
图15B及15D为脾脏中对Treg细胞的影响情况,从中可以看出,不同组间治疗后的脾脏Treg细胞含量无明显影响。因Treg细胞是免疫耐受的主要调控细胞,脾脏中的Treg细胞不仅调控抗肿瘤免疫反应,还对机体内的自身免疫调控起重要的作用,其含量的变化可能会导致其他非必要炎症反应的发生,因此脾脏内Treg细胞的稳定有助于其他炎症反应的发生,从而降低治疗后的副作用。对小鼠血清中TNF-α及IFN-γ水平进行检测,结果如图16。可以看出相比阴性对照组,R848&a-OX40@Gel组的TNF-α及IFN-γ含量分别提高了143.61pg/mL及112 pg/mL,分别提高了7.84及8.45倍,说明系统性抗肿瘤免疫反应的生成。同时该结果与脾脏T淋巴细胞分析结果的趋势一致。
2、R848&a-OX40@Gel防止三阴性乳腺癌肿瘤复发的效果
2.1 R848&a-OX40@Gel抑制小鼠三阴性乳腺癌肿瘤复发
建立肿瘤复发模型,经不同方法治疗后的小鼠肿瘤再次生长情况及小鼠生存状态(图17A),17B为整个治疗周期内小鼠肿瘤荧光强度图,可以看出当刚接种4T1-luciferase时,两组为相同的荧光强度,经过一轮治疗后,小鼠肿瘤均发生了消退,之后在第60天接种4T1-luciferase及CT26-luciferase时,可以看到较强的荧光信号,继续对两组小鼠进行观察,待70天时可以看到接种4T1-luciferase的小鼠肿瘤发生了明显消退,接种CT26-luciferase的肿瘤则明显增大,说明该治疗方案可以产生长效的抗原特异性免疫反应,对相似的肿瘤类型有明显的抑制,但对不同的肿瘤类型抑制效果不明显。之后对再次接种的小鼠进行肿瘤体积观测,所得结果如图17C,可以看出,CT26荷瘤小鼠的肿瘤体积变大,同时4T1荷瘤小鼠肿瘤发生明显的消退,由此可以证明抗原特异性的免疫记忆反应的产生。同时也对小鼠第二次接种后的毛发、生活状态等进行观测,未发现小鼠状态的明显变化,说明在经R848&a-OX40@Gel治疗后的小鼠未出现明显的毒副作用。
2.2 R848&a-OX40@Gel对抗原特异性免疫记忆的影响效果
2.2.1 水凝胶体系R848&a-OX40@Gel可引起抗原特异性T细胞杀伤
建立小鼠4T1单侧模型,当肿瘤体积约为200 mm3时将智能响应的凝胶体系R848&a-OX40@Gel注射于小鼠瘤内,7天后,将荷瘤小鼠的脾脏取出,并制备成单细胞悬液,同时分别与提前辐照肿瘤细胞4T1及CT26细胞进行共培养,24 h后取细胞上清液用作ELISA检测细胞因子的产生情况,取细胞进行流式细胞术分析,所得结果如图18所示。图18A及图18B为经与不同辐照过的肿瘤细胞共孵育后各组的CD4+CD44+T细胞及CD8+CD44+T细胞产生情况,从中可以看出,当与4T1肿瘤抗原共孵育后,相比阴性对照组,CD4+CD44+T细胞及CD8+CD44+T细胞水平分别增加了9.24%及19.68%;而与CT26共孵育组则未产生明显的变化。尤其是CD8+CD44+T细胞的水平,当遇到相似抗原时,相比阴性对照组,其细胞水平增加了2倍,而对CT26肿瘤细胞抗原则未产生反应,CD8+CD44+T细胞的免疫记忆反应产生后的主要杀伤细胞,由此可以看出当接受水凝胶体系R848&a-OX40@Gel治疗后,小鼠的确产生了高效的免疫记忆。图18C及18D为经与不同辐照过的肿瘤细胞共孵育后各组的CD4+CD44+IFN-γ+T细胞及CD8+CD44+IFN-γ+T细胞产生情况,可以看出,与4T1共孵育组的两者细胞水平分别增加了5.64倍及2.27倍,说明记忆T细胞介导的杀伤性细胞因子的高效产生;而与CT26肿瘤抗原孵育组则没有产生该变化,说明经R848&a-OX40@Gel治疗后的免疫记忆是抗原特异性的。
2.2.2 水凝胶体系R848&a-OX40@Gel促进杀伤性细胞因子的产生
采用ELISA检测脾淋巴细胞培养上清液中TNF-α和INF-γ的含量,所得结果如图19。可以看出当与相似肿瘤抗原共孵育后,记忆T细胞产生的TNF-α和INF-γ水平集聚增高。相比阴性对照组,4T1肿瘤抗原组的IFN-γ及TNF-α的含量分别增加了23.43倍及5.52倍;而CT26肿瘤抗原组仅增加了6.98倍及2.58倍,其水平均显著低于4T1肿瘤抗原组。这些结果表明,经R848&a-OX40@Gel治疗后,小鼠会产生一个高效的抗原特异性的免疫记忆反应,当遇到相同的抗原时,记忆T细胞会被快速激活,从而通过分泌细胞因子IFN-γ及TNF-α介导抗原特异性杀伤,这一机制在乳腺癌复发模型中得到了充分的体现,复发的肿瘤被体内产生的记忆效应快速清退。
3、R848&a-OX40@Gel防止三阴性乳腺癌远端转移的效果
3.1 R848&a-OX40@Gel抑制小鼠三阴性乳腺癌的远端转移
建立了小鼠转移模型,建模及治疗方案如图20A。图20B为接种后的小鼠分别在第1天、第8天及第16天的肿瘤荧光强度图,可以看到第一天刚接种时各组小鼠的肿瘤较为均匀,肿瘤体积大小具有随机性;第8天为第一次治疗前的荧光强度图,可以看到各组肿瘤开始变大,且部分肿瘤开始出现转移情况;第16天时继续观察,发现阴性对照组的肿瘤发生明显的增大与转移,同时游离药物组、R848@Gel治疗组及a-OX40@Gel组的荧光强度相比阴性对照组有一定的降低,但其效果不明显,而R848&a-OX40@Gel组的肿瘤荧光强度发生了明显的降低,证明其高效的肿瘤抑制作用。图20C为治疗期间各组小鼠原位肿瘤及远端肿瘤体积增长情况,可以看出:对于原位肿瘤,游离药物组、R848@Gel治疗组及a-OX40@Gel组亦有明显的抑制效果,其中a-OX40@Gel组在21天的抑制效果几乎接近R848&a-OX40@Gel组,但在24天后,该组的肿瘤体积开始反弹,究其原因,可能是因为当直接激活效应T细胞的杀伤功能时,可以产生一定的杀伤,但因“冷”肿瘤的抑制性微环境,产生的肿瘤相关抗原的免疫效应并不能放大,从而导致有短期的杀伤效果却无法长期维持。对于远端肿瘤,除R848&a-OX40@Gel组外,其他组均未产生抑制效应,说明其他组并未形成高效的系统性免疫反应。这一结果说明,经R848&a-OX40@Gel治疗后的小鼠,可在体内形成高效的抗肿瘤免疫反应,其对远端的转移性肿瘤亦可以产生高效的杀伤,证明了该治疗方案的优越性。
3.2 R848&a-OX40@Gel延长小鼠生存期
经各组治疗后小鼠的生存期曲线,相比阴性对照组,水凝胶体系R848&a-OX40@Gel治疗的小鼠生存期得到明显延长(P<0.001),其中有60%的小鼠存活时间长达三个月以上;而游离药物组、R848@Gel治疗组及a-OX40@Gel组的小鼠在60天内均全部死亡,对死亡的小鼠进行解剖发现,大部分的小鼠死于远端肿瘤的无限制增大及转移。由此可以证明水凝胶体系R848&a-OX40@Gel可以通过引起系统性免疫反应抑制远端肿瘤,从而延长小鼠生存期。图21B为治疗前后的小鼠体重变化曲线,从中可以看出,在小鼠治疗前后,小鼠的体重无明显的变化,这些结果充分证明了该水凝胶体系R848&a-OX40@Gel的安全性及优越性。
从以上数据可以看出,本发明制备的R848&a-OX40@Gel治疗三阴性乳腺癌的效果显著,安全性高,并且能防止三阴性乳腺癌的复发及癌细胞的远端转移。
试验例3 本发明R848&a-OX40@Gel针对黑色素瘤的疗效实验
一、方法
1、治疗黑色素瘤的效果
1.1小鼠黑色素瘤模型的建立及治疗方案
分别在6~8周龄的雌性C57BL/6小鼠体内评价水凝胶体系R848&a-OX40@Gel对小鼠黑色素瘤的作用效果。具体方案如下:首先在小鼠背部皮下右侧以 1×106个/只的密度接种B16F10细胞,待肿瘤体积长至150~200 mm3,将小鼠随机分为六组,每组六只,并将不同的制剂注射至小鼠肿瘤部位。分组及给药方案如试验例2中“小鼠三阴性乳腺癌模型的建立及治疗方案”。
1.2 小鼠的肿瘤体积检测及安全性评价
在上述治疗前后期间主要观察小鼠的以下指标:(1)记录并绘制小鼠肿瘤体积生长曲线;(2)记录并绘制小鼠体重变化曲线;(3)观察小鼠经不同方案治疗后生存期情况,评价治疗效果。若小鼠肿瘤体积超过2000 mm3,出于伦理考虑将小鼠处死,同时记录小鼠死亡日期。
2、实验数据分析同试验例2中“4、实验数据分析方法”。
二、结果
黑色素瘤治疗后的结果如图22。可以看出,经R848&a-OX40@Gel体系治疗后的小鼠,肿瘤生长速度得到了明显的控制,在第19天时,与阴性对照组相比产生显著性差异(P<0.0001)(图22B)。观察期生存期可以看出,相比其他组,R848&a-OX40@Gel组的小鼠生存期得到显著的延长,其他组的小鼠在30天左右均全部死亡,而R848&a-OX40@Gel组小鼠可以生存至45天左右,延长了一半的生存时间(图22C)。本发明制备的R848&a-OX40@Gel治疗黑色素瘤的效果依然显著。
综上,本发明针对“冷”肿瘤免疫治疗响应性差的问题,制备了一种具有智能响应的水凝胶体系R848&a-OX40@Gel用于提高“冷”肿瘤的免疫响应性。将该水凝胶体系注射至肿瘤部位后,在肿瘤内丰富的ROS存在下,智能水凝胶响应性降解,其中包封的R848和抗OX40抗体(a-OX40)先后在凝胶中释放出来,实现对“冷”肿瘤的免疫治疗,并形成免疫记忆,防止复发。
Claims (4)
1.一种智能响应型可注射水凝胶在制备免疫佐剂中的应用,其特征在于:所述智能响应型可注射水凝胶是由如下重量份的原料制备而成:
γ-PGA-S-ADH 20~30份,Oxi-HA 20~30份;
所述γ-PGA-S-ADH的结构式为:
其中n是大于5420的整数;
所述γ-PGA-S-ADH的制备方法包括如下步骤:
步骤1)
所述丙酮和3-巯基-丙酸甲酯在催化剂作用下反应生成ADH;
步骤2)
所述ADH在溶剂中与N2H4-H2O反应生成S-ADH;
步骤3)
所述γ-PGA在MES缓冲液中通过EDCI和NHS活化后,与 S-ADH反应生成γ-PGA-S-ADH,γ-PGA、EDCI、NHS和 S-ADH的质量比为100:150~160:90~100:120~125,活化的时间2~3h,反应的温度20~30℃,时间36~72小时;
所述Oxi-HA的结构式为:
其中m是大于2500的整数;
所述Oxi-HA的制备方法包括如下步骤:
;
所述HA溶解在水中,避光条件下与NaIO4 反应;所述HA与NaIO4的质量比为500:150~165;所述反应的温度20~30℃,时间6h。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述智能响应型可注射水凝胶是由如下重量份的原料制备而成:
γ-PGA-S-ADH 25份,Oxi-HA 25份。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:步骤1)所述3-巯基-丙酸甲酯以0.1~1mol/L溶解于丙酮中,在硫酸作用下反应生成ADH,反应温度为60~80℃,时间10~15小时;
步骤2)所述ADH在甲醇中与N2H4-H2O反应,ADH与N2H4-H2O的摩尔比为1:4~8,反应的温度20~30℃,时间6~12小时。
4.根据权利要求1~3任一项所述的应用,其特征在于:所述智能响应型可注射水凝胶的制备方法包括如下步骤:
取Oxi-HA和γ-PGA-S-ADH,分别溶解于PBS中,等体积混合进行席夫碱反应,即得;
所述PBS中Oxi-HA和γ-PGA-S-ADH的浓度均为20~30 mg/mL;所述席夫碱反应的温度为30~40℃,时间10~20min。
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