CN103897206A - N,o-羧甲基化壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医用材料领域,具体涉及N,O-羧甲基化壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶及其用途。本发明的目的是提供一种防粘连效果好、生物相容性好、可生物吸收的防粘连阻隔剂。本发明提供了一种N,O-羧甲基化壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶,其结构单元如式Ⅰ所示,其中x=10~10000,y=10~10000。本发明还提供了上述N,O-羧甲基化壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶的制备方法,及其在防治术后组织粘连中的用途。本发明所制备的N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶为防粘连阻隔剂提供了一种新的选择。
Description
技术领域
本发明属于医用材料领域,具体涉及N,O-羧甲基化壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶及其用途。
背景技术
腹腔粘连是普通腹盆腔手术的常见并发症,发生率约为67~93%,在盆腔手术中高达97%。腹腔粘连不仅可以发生在相邻的手术创伤组织间,也可能发生在远离手术区域的组织中。尽管大多数腹腔粘连没有症状,但粘连也可以导致不孕、慢性盆腹腔痛及肠梗阻。术后粘连的形成增加再次手术的难度,并增加了患者的医疗费用。
腹腔粘连一般发生在术后的前期阶段,因此,在术中应用防粘连药物或器件成为防治术后粘连的首选方法。理想的防粘连阻隔剂不仅应该防粘连效果好、生物相容性好、可生物吸收、可以用在开腹手术和腹腔镜手术,还应该可以粘附在一般或者出血的创面上,并且无需缝合。并且,这种阻隔剂不应妨碍创口愈合和重新间皮化。
几十年来,科学家们为此一直进行着不懈的努力。科学家们针对粘连形成的发病机理进行了相关研究。并提出应用抗炎药物或者纤溶药物进行治疗,但是抗炎药物会妨碍伤口愈合,而纤溶药物则可能会有引起流血不止的风险。另外,药物在腹腔内的吸收代谢较快,这也妨碍了药物防治粘连的治疗效果。专家们推荐使用防粘连阻隔剂在术后的前几天内将受损的创面分离开,以免形成粘连。防粘连阻隔剂可分为,聚合物粘稠溶液和固体膜。这些阻隔剂被设计用来覆盖在受损组织表面,尽量避免受损组织的接触。对于聚合物溶液,如以透明质酸钠为原料,名字叫做“医用透明质酸钠凝胶”的聚合物(其商品名为施沛克、施沛特、哈艾路、快可聆等),由于其在体内降解吸收太快,在体内的滞留时间较短,导致效果不佳。对于固体膜,它不可能完全覆盖创面,而且对于出血的创面,膜的贴附性受到影响,并且由于肠蠕动膜可能会从创面脱落,所以有时需要将膜缝合于创面上,增加了操作难度。而且在腹腔镜手术中,膜的应用极不方便。另外,固体膜的残留(超过30天)可能对创口愈合和人体有潜在危险。所以至今仍未找到一种理想的防粘连阻隔剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种防粘连效果好、生物相容性好、可生物吸收的防粘连阻隔剂。
本发明提供了一种N,O-羧甲基化壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶,其结构单元如式Ⅰ所示:
其中,x=10~10000,y=10~10000。优选的,x=200~8000,y=200~8000。进一步优选的,x=500~5000,y=500~5000。
上述N,O-羧甲基化壳聚糖与多醛基透明质酸组成的三维网状结构,其结构如式Ⅱ所示:
其中,x=10~10000,y=10~10000。优选的,x=200~8000,y=200~8000。进一步优选的,x=500~5000,y=500~5000。并且,所述结构式中每个x和y的取值可以不同。
上述N,O-羧甲基化壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶是通过以下方法制备得到的:将N,O-羧甲基壳聚糖与多醛基透明质酸的水溶液相互混合,制备得到N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶。所述的N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶为一种水凝胶。
所述N,O-羧甲基壳聚糖的结构如式Ⅲ所示:
其中,x=10~10000。优选的,x=200~8000。进一步优选的,x=500~5000。
所述多醛基透明质酸的结构如式Ⅳ所示:
其中,y=10~10000。优选的,y=200~8000。进一步优选的,y=500~5000。
进一步优选的,上述N,O-羧甲基化壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶的制备步骤包括:将N,O-羧甲基壳聚糖与多醛基透明质酸分别溶解在水中形成质量浓度为0.1~20%水溶液,随后将N,O-羧甲基壳聚糖水溶液和多醛基透明质酸水溶液相互混合,在室温下静置5~30分钟,制备得到N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶;其中,所述N,O-羧甲基壳聚糖和多醛基透明质酸的质量比为0.1~10︰1。
更进一步优选的,将N,O-羧甲基壳聚糖与多醛基透明质酸分别溶解在水中形成质量浓度为0.1~10%水溶液。
优选的,所述N,O-羧甲基化壳聚糖的制备方法包括:将氯乙酸与壳聚糖的氢氧化钠水溶液在室温下反应1~4小时,随后提高反应温度至50~80℃继续反应1~4小时后终止反应;过滤出固体,用60~90%乙醇或者甲醇水溶液洗涤固体;再用水溶解所得到的固体,用截留分子量为8000~14000的透析袋在水中进行透析处理3天后冻干,得到N,O-羧甲基壳聚糖。
进一步优选的,所述的壳聚糖的氢氧化钠水溶液,是将壳聚糖加入到20~60%氢氧化钠水溶液中,在-20~0℃下放置1~24h;所述的壳聚糖与氢氧化钠的质量比为0.1~10︰1。
进一步优选的,所述的壳聚糖与氯乙酸质量比为0.1~10︰1。
优选的,所述多醛基透明质酸的制备方法包括:将高碘酸钠水溶液与透明质酸水溶液在室温下反应2~8h,随后向体系中加入与高碘酸钠等当量的乙二醇终止反应;混合体系用截留分子量为3500的透析袋在水中进行透析处理3天后冻干,得到多醛基透明质酸。
进一步优选的,所述的高碘酸钠与透明质酸质量比为0.05~5︰1。
进一步优选的,所述的高碘酸钠水溶液的质量浓度为0.5~20%。
进一步优选的,所述的透明质酸水溶液的质量浓度为0.1~10%。
本发明还提供了N,O-羧甲基化壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶的制备方法,包括以下步骤:
a、将氯乙酸与壳聚糖的氢氧化钠水溶液在室温下反应1~4小时,随后提高反应温度至50~80℃继续反应1~4小时后终止反应;过滤出固体,用60~90%乙醇或者甲醇水溶液洗涤固体;再用水溶解所得到的固体,用截留分子量为8000~14000的透析袋在水中进行透析处 理3天后冻干,得到N,O-羧甲基壳聚糖;
b、将高碘酸钠水溶液与透明质酸水溶液在室温下反应2~8h,随后向上述体系中加入与高碘酸钠等当量的乙二醇终止反应;混合体系用截留分子量为3500的透析袋在水中进行透析处理3天后冻干,得到多醛基透明质酸;
c、将N,O-羧甲基壳聚糖与多醛基透明质酸分别溶解在水中形成质量浓度为0.1~20%的水溶液,随后将N,O-羧甲基壳聚糖水溶液和多醛基透明质酸水溶液相互混合,在室温下静置5~30分钟,制备得到N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶。
其中,上述N,O-羧甲基化壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶的制备方法中,步骤a所述的壳聚糖的氢氧化钠水溶液,是将壳聚糖加入到20~60%氢氧化钠水溶液中,在-20~0℃下放置1~24h;所述的壳聚糖与氢氧化钠的质量比为0.1~10︰1。
其中,上述方法中,步骤a所述N,O-羧甲基壳聚糖的结构如式Ⅲ所示:
其中,x=10~10000。优选的,x=200~8000。进一步优选的,x=500~5000。
其中,上述方法中,步骤a所述多醛基透明质酸的结构如式Ⅳ所示:
其中,y=10~10000。优选的,y=200~8000。进一步优选的,y=500~5000。
其中,上述方法中,步骤a所述的壳聚糖与氯乙酸质量比为0.1~10︰1。
其中,上述方法中,步骤b所述的高碘酸钠与透明质酸质量比为0.05~5︰1。
其中,上述方法中,步骤b所述的高碘酸钠水溶液的质量浓度为0.5~20%。
其中,上述方法中,步骤b所述的透明质酸水溶液的质量浓度为0.1~10%。
优选的,上述方法的步骤c中,将N,O-羧甲基壳聚糖与多醛基透明质酸分别溶解在水中形成质量浓度为0.1~10%水溶液。
本发明还提供了N,O-羧甲基化壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶在防治术后组织粘连中的用途。
本发明提供的N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶,具有良好的三维网状互穿孔洞结 构。孔洞的粒径大小在100~200μm不等。而且随着N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶体系中多醛基透明质酸的含量升高,孔径越来越小,同时其结构的完整性越来越好。研究发现N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶的吸水性具有明显的pH敏感依赖性,N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶在碱性条件下(pH=10)的吸水率是N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶在酸性条件(pH=2)下吸水率的7倍左右。N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶在中性环境下(pH=7.4)的吸水率是N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶在酸性条件(pH=2)下吸水率的3倍左右。
本发明提供的N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶能在体内逐渐的被降解和吸收,具有良好的细胞相容性;实验表明其是一种安全的凝胶材料,可以用于体内,并且无任何毒副作用;并具有良好的防粘连效果,特别是在腹腔肿瘤术后的治疗有较好的应用前景,为本领域提供了一种新的选择。
附图说明
图1壳聚糖、N,O-羧甲基壳聚糖、透明质酸和多醛基透明质酸的红外图谱。将冻干得到的壳聚糖、N,O-羧甲基壳聚糖、透明质酸和多醛基透明质酸样品与溴化钾共混压片处理,在NICOLET-200SXV(Nicolet Co.USA)型红外光谱仪上进行傅里叶红外光谱(FTIR)测试。结果如下:1648cm-1和1554cm-1是壳聚糖酰胺I和-NH2的特征吸收带。而在合成的N,O-羧甲基壳聚糖红外图谱中,我们发现在1748cm-1出现一个新的吸收带,通过比对图谱确定是羧基上的羰基振动吸收带。由于引入基团的缘故,原壳聚糖在1648cm-1和1554cm-1的特征吸收带合并到1633cm-1处,吸收强度也有所加强。说明壳聚糖在N-位和O-位不同程度的引入了羧甲基。由于多醛基透明质酸的醛基会形成缩醛的形式,因此透明质酸和多醛基透明质酸的红外特征吸收峰较为相似。
图2N,O-羧甲基壳聚糖和多醛基透明质酸的核磁共振图谱。以重水(D2O)为溶剂,在Varian400(400MHz,Varian,USA)型核磁共振仪上进行核磁共振氢谱(1H-NMR)测试。在N,O-羧甲基壳聚糖的1H-NMR图中(图2-A),δ=2.07ppm的峰是壳聚糖乙酰基C9上质子的峰,δ=2.41ppm的峰是壳聚糖C2上质子的峰,δ=2.75ppm则出现了典型的C2位取代的羧甲基上的质子的信号峰(-NCH2COOD),δ=3.4~3.9的各个峰分别为杂环中C3~6羟甲基上质子的峰。而δ=3.9~4.2ppm则出现了典型的C6位取代的羧甲基上的质子的信号峰(-CH2COOD)。通过核磁结果来简单的计算N,O-羧甲基壳聚糖的羧甲基取代度大约为85%。在多醛基透明质酸(图2-B)的4.9ppm和5.0ppm出现的新特征峰为其醛基形成的缩醛的氢的特征吸收峰。
图3N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶的扫描电镜图。N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶具有明显的三维网状互穿结构,孔径大约在100-200μm不等。而且随着N,O-羧甲 基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶体系中多醛基透明质酸的含量升高,孔径越来越小,同时其结构的完整性越来越好,说明多醛基透明质酸的含量直接影响N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶显微结构。
图4N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶在不同pH介质(pH=2,7.4和10)中的吸水率。
图5N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶的体外降解图。
图6细胞毒性实验。
图7N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶的细胞相容性。
图8N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶的体内降解。
图9N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶的体内防粘连效果。A:NS对照;B:透明质酸钠组;C:N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶组。
图10N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶组的腹壁-盲肠的防粘连状况(1,3,5,7,10,14天)。
图11使用N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶后恢复的腹壁(A-C)和盲肠(D-F)间皮细胞。
图12使用N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶后恢复的腹壁的H&E染色图片(A)和Masson染色图片(C),以及未使用水凝胶组的粘连组织的H&E染色图片(B)和Masson染色图片(D)。
具体实施方式
N,O-羧甲基化壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶的制备方法,具体操作步骤如下:
a、将氯乙酸与壳聚糖的氢氧化钠水溶液在室温下反应1~4小时,其中壳聚糖与氯乙酸质量比为0.1~10︰1;随后提高反应温度至50~80℃继续反应1~4小时后终止反应;过滤出固体,60~90%乙醇或者甲醇水溶液洗涤固体;再用水溶解所得到的固体,用截留分子量为8000~14000的透析袋在水中进行透析处理3天后冻干,得到N,O-羧甲基壳聚糖。其中,所述壳聚糖的氢氧化钠水溶液,是将壳聚糖加入到20~60%氢氧化钠水溶液中,在-20℃~0℃放置1~24h得到的;所述的壳聚糖与氢氧化钠的质量比为0.1~10︰1。
采用氯乙酸和壳聚糖在碱性条件下合成水溶性的N,O-羧甲基壳聚糖,通过调整氯乙酸、氢氧化钠用量、反应温度以及反应时间可以获得不同羧甲基取代度的壳聚糖衍生物。
b、采用高碘酸异相降解多糖的方法合成多醛基透明质酸。按高碘酸钠与透明质酸质量比为0.05~5︰1,将高碘酸钠水溶液与透明质酸水溶液在室温下反应2~8h,随后向体系中加入与高碘酸钠等当量的乙二醇终止反应。混合体系用截留分子量为3500的透析袋在水中进行透析处理3天后冻干,得到多醛基透明质酸。其中,所述的高碘酸钠水溶液的质量浓度为0.5~ 20%,所述的透明质酸水溶液的质量浓度为0.1~10%。
通过改变高碘酸钠与透明质酸单体的投料比,可以得到理论取代度为20%,40%,60%以及80%的多醛基透明质酸,但是在降解过程中透明质酸的分子量会随着降解时间和高碘酸用量的增加而出现明显的下降。本发明多醛基透明质酸的醛基取代度范围为5%~80%。
c、将N,O-羧甲基壳聚糖与多醛基透明质酸分别溶解在水中形成质量浓度为0.1~20%的水溶液,优选为0.5~10%的水溶液;随后将N,O-羧甲基壳聚糖水溶液和多醛基透明质酸水溶液相互混合,在室温下静置5~30分钟,制备一系列的N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶;其中,N,O-羧甲基壳聚糖和多醛基透明质酸的质量比为0.1~10︰1。通过调节多醛基透明质酸的含量可以有效的控制N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸混合溶液凝胶化时间。
其中,上述方法中,步骤a所述N,O-羧甲基壳聚糖的结构如式Ⅲ所示:
其中,x=10~10000。优选的,x=200~8000。进一步优选的,x=500~5000。
其中,上述方法中,步骤a所述多醛基透明质酸的结构如式Ⅳ所示:
其中,y=10~10000。优选的,y=200~8000。进一步优选的,y=500~5000。
其中,上述多醛基透明质酸的醛基取代度的测定方法为:取约0.1g的多醛基透明质酸放置在50mL的锥形瓶中,加入到25mL0.25mol/L的盐酸羟氨-甲基橙水溶液使其完全溶解形成透明的溶液,闭光条件下保存2h。以0.1M氢氧化钠水溶液进行滴定,采用电位滴定的方法测定溶液中释放的盐酸量,反应方程式如下:
Hyaluronan(透明质酸)-(CHO)n+nH2N-OH-HCl=Hyaluronan-(C=N-OH)n+nH2O+nHCl醛基含量可以由以下方程式计算得到:
V×0.001×nNaOH=nCHO
透明质酸醛基取代度=(nCHO/2)/(w透明质酸/198)
其中,V指的是滴定终点氢氧化钠所消耗的体积,nNaOH是氢氧化钠的摩尔浓度,nCHO是透明质酸中含有的醛基的摩尔数,w透明质酸是测定时透明质酸样品的质量。
由于壳聚糖(Chitosan)具有良好的生物相容性和生物可降解性,并且具有低毒、无免疫原性等特点,同时由于它含有某些有助于细胞黏附和保持细胞分化功能的信息,无免疫原性,并可与其它生物医学材料复合,广泛应用于抗凝血材料、骨修复材料、药物载体系统、人工皮肤、可吸收手术缝合线、人造肾膜等生物医学领域。透明质酸无毒性,具有良好的生物相容性和生物可降解性,也广泛应用于现代医药学领域。但是壳聚糖难溶于中性水溶液,因此本发明采用N,O-羧甲基化修饰,得到可溶性的N,O-羧甲基化壳聚糖。而本发明还另外使用高碘酸钠氧化透明质酸,制备得到多醛基化透明质酸。然后巧妙的以N,O-羧甲基化壳聚糖和多醛基透明质酸为原料,通过常温条件的西弗碱反应,得到可生物降解N,O-羧甲基化壳聚糖-多醛基化透明质酸凝胶。这主要由于N,O-羧甲基壳聚糖中含有一定含量的氨基基团,使其在常温条件下即可以与多醛基透明质酸中含有的醛基发生反应生成西佛碱,从而实现N,O-羧甲基壳聚糖分子链之间的相互交联实现混合溶液的凝胶化转变。
本发明的实施例中,所使用的材料和试剂:
壳聚糖(Chitosan,Sigma-Aldrich);透明质酸(Alginate,Sigma-Aldrich);醋酸(CH3COOH,成都科龙化工试剂);氢氧化钠(NaOH,成都科龙化工试剂);氯乙酸(ClCH2COOH,成都科龙化工试剂);高碘酸钠(NaIO4,成都科龙化工试剂);乙二醇(C2H6O2,成都科龙化工试剂);盐酸羟氨(OH-NH2·HCl,成都科龙化工试剂);甲基橙(C14H14N3NaO3S,成都科龙化工试剂);盐酸(HCl,成都科龙化工试剂);氯化钠(NaCl,成都科龙化工试剂);3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT,Sigma-Aldrich);磷酸盐缓冲液(PBS,pH=7.4,爱建德固赛引发剂有限公司);二甲基亚砜(DMSO,成都科龙化工试剂)。纤维素透析袋(截流分子量为8~14kDa和3.5kDa),购自上海生工生物化学公司。以上药品及其它试剂均为分析纯。
NIH-3T3细胞株(小鼠胚胎成纤维细胞)和HUVEC(人脐静脉内皮细胞)细胞株购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC),四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室保存。RPMI1640培养基、DMEM培养基和胎牛血清(FBS)购自美国Gibico BRL公司,培养基用青霉素和链霉素为国产注射用药。
BALB/c小鼠,鼠龄6~8周,体重18±2克,雌性,购于四川大学实验动物中心。饲养温度为20~22℃,相对湿度50~60%,自由取食取水,小鼠在实验前至少饲养一周熟悉新环境。
本发明的实验数据均用SPSS15.0统计软件包处理,试验结果以均数加减标准差表示。计量数据采用Student’s T检测;各组之间的均数比较采用方差分析(ANOVA)。生存数据用 Kaplan-Meier法计算,并采用Log-rank test进行统计学分析。粘连评分并不总是符合正态分布,因此中位粘连评分采用Mann-Whitney U-检验,粘连率的比较采用Fisher确切概率法。以P<0.05为统计学显著性界限。
实施例1
a、N,O-羧甲基化壳聚糖的制备:将5g的壳聚糖(分子量100万,x≈2130)置于250mL的圆底烧瓶中,加入25mL40%氢氧化钠水溶液,将烧瓶放置在-20℃冰箱保存过夜处理.另外将20g的氯乙酸用一定量的水溶解放置在恒压漏斗中,在搅拌下缓慢的滴加氯乙酸水溶液,滴加完毕之后,室温搅拌条件下反应2h,随后提高反应温度至60℃继续反应2h后终止反应。将烧瓶中的混合体系抽滤,得到的滤渣用80%乙醇水溶液进行反复的冲洗3次。冲洗结束之后用水溶解所得到的初产物,用截留分子量为8000~14000的透析袋在水中进行透析处理3天,后冻干处理得到N,O-羧甲基化壳聚糖。
b、多醛基透明质酸的制备:首先将1g的透明质酸(分子量100万,y≈2400)分散在100mL水溶液中,室温条件下搅拌2h。随后将20mL的高碘酸钠水溶液(浓度为10mg/mL)缓慢的加入到透明质酸溶液中,在室温条件下反应4h,随后向体系中加入与高碘酸等当量的乙二醇终止反应。混合体系用截留分子量为3500的透析袋在水中进行透析处理3天,后冻干处理得到最终的产物。
c、凝胶的制备和性能:将N,O-羧甲基壳聚糖与多醛基透明质酸分别溶解在水中形成浓度为10%水溶液。将N,O-羧甲基壳聚糖和多醛基透明质酸按质量比为3︰2相互混合,在室温下静置10min,制备得到N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶。其在37℃下,凝胶时间2min,此时凝胶的储能模量高于1000Pa。
实施例2
a、N,O-羧甲基化壳聚糖的制备:将5g的壳聚糖(分子量100万,x≈2130)置于250mL的圆底烧瓶中,加入10mL20%氢氧化钠水溶液,将烧瓶放置在-20℃冰箱保存过夜处理.另外将5g的氯乙酸用一定量的水溶解放置在恒压漏斗中,在磁力搅拌条件下缓慢的滴加氯乙酸水溶液,滴加完毕之后,室温搅拌条件下反应1h,随后提高反应温度至50℃继续反应1h后终止反应。将烧瓶中的混合体系抽滤处理得到的滤渣用60%乙醇水溶液进行反复的冲洗3次。冲洗结束之后用水溶解所得到的初产物,用截留分子量为8000~14000的透析袋在水中进行透析处理3天,后冻干处理得到最后的终产物。
b、多醛基透明质酸的制备:首先将1g的透明质酸(分子量100万,y≈2400)分散在100mL水溶液中,室温条件下搅拌1h。随后将10mL的高碘酸钠水溶液(浓度为1mg/mL) 缓慢的加入到透明质酸溶液中,在室温条件下反应2h,随后向体系中加入与高碘酸等当量的乙二醇终止反应。混合体系用截留分子量为3500的透析袋在水中进行透析处理3天,后冻干处理得到最终的产物。
c、凝胶的制备和性能:将N,O-羧甲基壳聚糖与多醛基透明质酸分别溶解在水中形成浓度为1%水溶液。将N,O-羧甲基壳聚糖和多醛基透明质酸按质量比为2︰8相互混合,在室温条件下静置30min,制备得到N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶。其在37℃下,凝胶时间5min,此时凝胶的储能模量高于10Pa。
实施例3
a、N,O-羧甲基化壳聚糖的制备:将5g的壳聚糖(分子量100万,x≈2130)置于250mL的圆底烧瓶中,加入100mL60%氢氧化钠水溶液,将烧瓶放置在-20℃冰箱保存过夜处理.另外将40g的氯乙酸用一定量的水溶解放置在恒压漏斗中,在磁力搅拌条件下缓慢的滴加氯乙酸水溶液,滴加完毕之后,室温搅拌条件下反应4h,随后提高反应温度至80℃继续反应4h后终止反应。将烧瓶中的混合体系抽滤处理得到的滤渣用90%乙醇水溶液进行反复的冲洗3次。冲洗结束之后用水溶解所得到的初产物,用截留分子量为8000-14000的透析袋在水中进行透析处理3天,后冻干处理得到最后的终产物。
b、多醛基透明质酸的制备:首先将1g的透明质酸(分子量100万,y≈2400)分散在100mL水溶液中,室温条件下搅拌4h。随后将50mL的高碘酸钠水溶液(浓度为20mg/mL)缓慢的加入到透明质酸溶液中,在室温条件下反应8h,随后向体系中加入与高碘酸等当量的乙二醇终止反应。混合体系用截留分子量为3500的透析袋在水中进行透析处理3天,后冻干处理得到最终的产物。
c、凝胶的制备和性能:将N,O-羧甲基壳聚糖与多醛基透明质酸分别溶解在水中形成浓度为5%水溶液。将N,O-羧甲基壳聚糖和多醛基透明质酸按质量比为8︰2相互混合,在室温条件下静置20min,制备得到N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶。其在37℃下,凝胶时间10min,此时凝胶的储能模量高于20Pa。
实施例4
a、N,O-羧甲基化壳聚糖的制备:将5g的壳聚糖(分子量250万,x≈5320)置于250mL的圆底烧瓶中,加入100mL60%氢氧化钠水溶液,将烧瓶放置在-20℃冰箱保存过夜处理.另外将40g的氯乙酸用一定量的水溶解放置在恒压漏斗中,在磁力搅拌条件下缓慢的滴加氯乙酸水溶液,滴加完毕之后,室温搅拌条件下反应4h,随后提高反应温度至80℃继续反应4h后终止反应。将烧瓶中的混合体系抽滤处理得到的滤渣用90%乙醇水溶液进行反复的冲洗3次。冲洗结束之后用水溶解所得到的初产物,用截留分子量为8000-14000的透析袋在水中进 行透析处理3天,后冻干处理得到最后的终产物。
b、多醛基透明质酸的制备:首先将1g的透明质酸(分子量200万,y≈4900)分散在100mL水溶液中,室温条件下搅拌4h。随后将50mL的高碘酸钠水溶液(浓度为20mg/mL)缓慢的加入到透明质酸溶液中,在室温条件下反应8h,随后向体系中加入与高碘酸等当量的乙二醇终止反应。混合体系用截留分子量为3500的透析袋在水中进行透析处理3天,后冻干处理得到最终的产物。
c、凝胶的制备和性能:将N,O-羧甲基壳聚糖与多醛基透明质酸分别溶解在水中形成浓度为3%水溶液。将N,O-羧甲基壳聚糖和多醛基透明质酸按质量比为1︰1相互混合,在室温条件下静置30min,制备得到N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶。其在37℃下,凝胶时间5min,此时凝胶的储能模量高于150Pa。
实施例5
a、N,O-羧甲基化壳聚糖的制备:将5g的壳聚糖(分子量10万,x≈213)置于250mL的圆底烧瓶中,加入100mL60%氢氧化钠水溶液,将烧瓶放置在-20℃冰箱保存过夜处理.另外将40g的氯乙酸用一定量的水溶解放置在恒压漏斗中,在磁力搅拌条件下缓慢的滴加氯乙酸水溶液,滴加完毕之后,室温搅拌条件下反应4h,随后提高反应温度至80℃继续反应4h后终止反应。将烧瓶中的混合体系抽滤处理得到的滤渣用90%乙醇水溶液进行反复的冲洗3次。冲洗结束之后用水溶解所得到的初产物,用截留分子量为8000-14000的透析袋在水中进行透析处理3天,后冻干处理得到最后的终产物。
b、多醛基透明质酸的制备:首先将1g的透明质酸(分子量10万,y≈240)分散在100mL水溶液中,室温条件下搅拌4h。随后将50mL的高碘酸钠水溶液(浓度为20mg/mL)缓慢的加入到透明质酸溶液中,在室温条件下反应8h,随后向体系中加入与高碘酸等当量的乙二醇终止反应。混合体系用截留分子量为3500的透析袋在水中进行透析处理3天,后冻干处理得到最终的产物。
c、凝胶的制备和性能:将N,O-羧甲基壳聚糖与多醛基透明质酸分别溶解在水中形成浓度为2%水溶液。将N,O-羧甲基壳聚糖和多醛基透明质酸按质量比为1︰1相互混合,在室温条件下静置30min,制备得到N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶。其在37℃下,凝胶时间10min,此时凝胶的储能模量高于1Pa。
实施例6
a、N,O-羧甲基化壳聚糖的制备:将5g的壳聚糖(分子量100万,x≈2130)置于250mL的圆底烧瓶中,加入25mL40%氢氧化钠水溶液,将烧瓶放置在-20℃冰箱保存过夜处理.另外将20g的氯乙酸用一定量的水溶解放置在恒压漏斗中,在搅拌下缓慢的滴加氯乙酸水溶液, 滴加完毕之后,室温搅拌条件下反应2h,随后提高反应温度至60℃继续反应3h后终止反应。将烧瓶中的混合体系抽滤,得到的滤渣用80%乙醇水溶液进行反复的冲洗3次。冲洗结束之后用水溶解所得到的初产物,用截留分子量为8000~14000的透析袋在水中进行透析处理3天,后冻干处理得到N,O-羧甲基化壳聚糖。
b、多醛基透明质酸的制备:首先将1g的透明质酸(分子量180万,y≈4500)分散在100mL水溶液中,室温条件下搅拌2h。随后将5mL的高碘酸钠水溶液(浓度为42mg/mL)缓慢的加入到透明质酸溶液中,在室温条件下反应2h,随后向体系中加入与高碘酸等当量的乙二醇终止反应。混合体系用截留分子量为3500的透析袋在水中进行透析处理3天,后冻干处理得到最终的产物。
c、凝胶的制备和性能:将N,O-羧甲基壳聚糖与多醛基透明质酸分别溶解在水中,分别形成浓度为2%的N,O-羧甲基壳聚糖水溶液和3%的多醛基透明质酸水溶液,按N,O-羧甲基壳聚糖和多醛基透明质酸的质量比为1︰1相互混合,在室温下静置30min,制备得到N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶。其在37℃下,凝胶时间2min,此时凝胶的储能模量高于100Pa。
实施例7N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶的形貌
N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶的形貌是采用电子扫描显微镜(Scanning electron microscopy,SEM)进行观察,所采用的仪器型号是仪器型号为JSM-5900LV(JEOL,Japan)。首先将所得到的N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶用冷冻干燥机(FD-1A-50,北京博医康有限公司,中国)进行冷冻干燥处理3天,得到所需要的样品,然后经过液氮脆断取得凝胶的断面,进行喷金处理后,再在电子扫描显微镜下观察形貌。
本发明制备的N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶体系的扫描电镜图见图3。其中,图3A为实例6制备得到的N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶,图3B为实例1制备得到的N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶。
从图3中可以看出凝胶具有明显的三维网状互穿结构,孔径大约在100~200μm不等。而且随着N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶体系中多醛基透明质酸的含量升高,孔径越来越小,同时其结构的完整性越来越好,说明多醛基透明质酸的含量直接影响N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶显微结构。
实施例8N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶吸水性考察
首先将实施例6制备的N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶用冻干机进行冻干处理3天,得到所需要的冻干样品,电子天平准确称重记录。然后将所得的冻干样品分别浸泡在pH=2的盐酸水溶液,pH=7.4磷酸盐缓冲溶液以及pH=10的氢氧化钠水溶液中,在浸泡一定时间后, 取出样品用滤纸吸干凝胶表明残留的水分,电子天平准确称重记录。如此反复测定,直至样品的重量达到一个平衡值。按照以下公式测定其吸水率:
吸水率(%)=(W24–W0)/W0×100%
本实验中样品浸泡24h即达到平衡状态,W24指的是样品浸泡在介质中24h后的重量,W0指的是样品初始重量。
N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶体系在不同介质条件下(pH=2,7.4和10)的吸水率见图4。
图4表明N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶的吸水性具有明显的pH敏感依赖性。N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶在碱性条件下(pH=10)的吸水率远远大于其在酸性环境下(pH=2)的吸水率,是N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶在酸性条件下吸水率的4.5倍左右。N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶在中性环境下(pH=7.4)的吸水率也大于其在酸性环境下(pH=2)的吸水率,是N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶在酸性条件下吸水率的2倍左右。
实施例9N,O-羧甲基壳聚糖/多醛基透明质酸凝胶体的外降解实验
本发明采用的降解介质包括pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液,透明质酸酶和溶菌酶(1mg/mL,pH=7.4)的磷酸盐缓冲溶液。首先在24孔板中加入1mL实例6中的N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸混合溶液,室温静置24h,使其完全凝胶化,而后小心准确称重记录。向凝胶中分别加入3mL的降解介质,每天更换降解介质以保持溶菌酶的活性。在特定的时间点(1天,3天,5天,7天以及10天)取出凝胶块,采用电子天平进行称重记录。体外的降解程度以凝胶的质量损失来表达计算:
重量损失(%)=(W0–Wt)/W0×100
W0指的是凝胶体系的初始重量;Wt指的是凝胶在降解一定时间后的残留重量。
N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶的体外降解图见图5。
图5表明,在降解介质中添加一定量的溶菌酶可以有效的提高N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶的降解速度。发明人发现在含有溶菌酶(1mg/mL)的PBS溶液降解10天后质量损失达到将近100%,说明添加溶菌酶可以加快凝胶的降解速度,同时发明人也观察到没有添加溶菌酶的降解介质也使得Gel-1体系的重量损失75%左右,这可能与加入的多醛基透明质酸的含量偏低导致凝胶的交联度不够从而使得体系在PBS中也有较大的质量损失。
实施例10细胞毒性实验
本发明采用噻唑蓝比色法(MTT法)来评价凝胶体系中各个组成成分N,O-羧甲基壳聚糖,多醛基透明质酸以及N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶(由实例6制备)的浸提液的体 外细胞毒性。
选用的细胞株为NIH-3T3和HUVEC细胞株。NIH-3T3和HUVEC细胞用DMEM培养基(含有10%FBS及双抗),置于37℃,含5%CO2湿润空气的培养箱中培养。在96孔板中分别加入0.1mL含有细胞悬浮液的DMEM培养基,使得细胞密度在1×104个/孔,过夜培养。随后将0.1mL含有一系列不同浓度(0~5000μg/mL)的N,O-羧甲基壳聚糖,或者多醛基透明质酸,或者N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶浸提液的DMEM培养基分别加入到不同的孔中,共培养48h。没有添加任何物质的培养基作为对照组。随后向每个孔中加入20μl的MTT溶液(5mg/mL),37℃共培养4小时后,弃原来的培养基溶液,用磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗,然后每孔中加入0.15mL的二甲亚砜溶液,震荡10分钟。然后用酶标仪(Bio-rad,USA)在波长570nm处测定其吸光值。通过比对实验组和对照组的吸光值来表示细胞的存活率。
N,O-羧甲基壳聚糖、多醛基透明质酸和N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶的细胞毒性实验结果见图6。
从图6中得知,N,O-羧甲基壳聚糖在0~5000μg/mL浓度范围之内与NIH-3T3或者HUVEC细胞共培养48小时对于两种细胞没有显示出明显的细胞毒性,细胞的存活率达到90%以上,见图6(a)。不同氧化度的多醛基透明质酸在0~5000μg/mL浓度范围之内与NIH-3T3或者HUVEC细胞共培养24小时对于NIH-3T3细胞显示出比较明显的浓度依赖的细胞毒性,当多醛基透明质酸的浓度小于1000μg/mL时,其毒性较小,显示合成的多醛基透明质酸还是存在一定的毒性,这可能与多醛基透明质酸分子中存在的大量醛基有关,见图6(b)。图6(c)表明,对于合成后的N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶浸提液,对两种细胞都没有表现出任何细胞毒性,证实合成后的N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶具有低毒性的优点。
实施例11N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶细胞相容性实验
本发明选用的细胞为绿色荧光小鼠原代分离的成纤维细胞,考察N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶(实例6制备)的细胞接触相容性。NIH-3T3细胞用DMEM培养基(含有10%FBS及双抗),置于37℃,含5%CO2湿润空气的培养箱中培养。本发明采用与凝胶接触的培养方式考察凝胶的细胞相容性:0.2mL N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸混合溶液滴加到24孔板中的孔洞中,使其不完全覆盖底部,37℃凝胶化30min。随后用DMEM培养基预先润洗所形成的凝胶,加入2mL含有细胞悬浮液的DMEM培养基,每孔细胞密度为5.0×105个/孔。培养一定时间后(24h,48h以及72h),荧光显微镜下观察细胞的形貌状态。
图7是GFP荧光小鼠原代成纤维细胞与N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶接触共培养48h之后的荧光显微镜图片。从图7中可以看出,细胞可以在凝胶中生长,说明N,O-羧 甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶与细胞共培养不会有明显的细胞毒性,具有良好的体外细胞相容性。
实施例12N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶体内急性毒性试验
本发明选用Balb/c小鼠(6周龄,重量在18~22g)来评价N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶(实例6制备)的急性毒性。20只Balb/c小鼠被随机分成两个小组,每个小组10只小鼠,一组采用腹腔注射50mL/kg剂量的生理盐水,另一小组采用腹腔注射50mL/kg剂量的N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶。注射给药后,进行连续不间断的21天观察。观察的指标包括小鼠的生理状况(运动、毛发、行为等),体重变化以及死亡率。在特定的时间点(7天,14天以及21天)处死小鼠,进行系统检查,取其主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)用中性福尔马林固定处理,包埋在石蜡中,切片,苏木精-伊红染色(HE染色)显微镜观察其组织微观结构变化。
对照组和凝胶组腹腔给药14天后的主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)的HE切片中,心肌细胞清楚明显,排列规整,未出现出血,坏死,或者炎性渗出。肝小叶结构清楚,排列规整,未出现肝细胞退化或者坏死。未观察到中性粒细胞,淋巴细胞或者巨噬细胞浸润。脾脏的红髓和白髓结构规整明确。脾静脉窦未出现病理异常。肺泡结构规整明确。未出现支气管及肺泡扩张与萎缩,未见肺泡上皮细胞变性。支气管及肺泡周围未见炎性细胞浸润。肾小球和肾小管结构规整明确。未见变性,出血,或者坏死。通过以上主要脏器的HE染色结果,可以看出N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶是一种安全的凝胶材料,可以用于体内,并且无任何毒副作用。
实施例13N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶皮下组织相容性及降解实验
本发明选用Balb/c小鼠(6周龄,重量在18~22g)来评价N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶(实例6制备)的皮下组织相容性。66只Balb/c小鼠被随机分成两个小组,每个小组33只小鼠,一组采用背部皮下注射0.5mL的生理盐水,另一小组采用背部皮下注射0.5mLN,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶。注射给药后2小时,用剪刀剪开注射部位的皮肤观察凝胶形成。在特定的时间点(1~10天,每天取样),每个小组均处死三只小鼠,用剪刀剪开注射部位的皮肤观察凝胶的形态,同时取下凝胶以及周边组织用中性福尔马林固定处理,包埋在石蜡中,切片,苏木精-伊红染色(HE染色)显微镜观察其微观结构。
通过小鼠后背部皮下注射N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸混合溶液来肉眼观察凝胶的形成与消除过程。图8描述了皮下注射0.5mL的N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸(N,O-羧甲基壳聚糖和多醛基透明质酸的质量比为1:1)混合溶液的照片。
图8中可以清楚的看到在皮下注射2小时后N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸混合溶液 迅速的转变为透明的凝胶状态,这个说明N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸混合溶液在体内环境条件下能很快的凝胶化。随着时间的推移,凝胶的体积变得越来越小,同时强度也变得越来越弱,到7天后观察显示在注射部位的凝胶体积已经很小,显示该体系在体内可被缓慢的降解或者吸收。在10天时已经完全降解吸收。
实施例14N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶对腹腔粘连治疗效果评价
选用SD大鼠(重量为200~230g)建立大鼠盲肠-腹壁粘连模型,并进行治疗和效果评价。采用戊巴比妥钠溶液(10mg/mL)腹腔注射麻醉,备皮,消毒术区并铺巾。在大鼠腹壁用手术刀割除一个面积为2×2cm2的正方形创伤面。接下来,寻找盲肠并用无菌干纱布摩擦其浆膜面直至损伤并伴有点状渗血,创面大小约2cm2,随后将摩擦后的盲肠置于腹膜创面位置,使两者对和,模拟在腹腔手术之后无法避免的腹膜损伤。术中未采取任何止血或者腹腔灌洗措施。在创面上分别应用0.5mL以下溶液后,双层缝合关腹。
30只SD大鼠随机分成三组,每组10只大鼠:
第一组为生理盐水对照组,在创伤面上滴加1mL生理盐水处理。
第二组为透明质酸钠凝胶组,在创伤面上滴加1mL透明质酸钠凝胶(2%wt)处理。
第三组为实例6制备的N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶组,在创伤面上滴加1mL实例6制备的N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶处理。
14天后,采用过量的戊巴比妥钠静脉注射处死动物,观察腹腔粘连情况并采用国际标准粘连评分方法进行粘连评分。0分:无粘连;1分:薄膜状粘附;2分:单根条索状粘连;3分:多根条索状粘连;4分:同时累及腹壁及内脏的致密粘连。每只大鼠的粘连程度以最高等级为准。
图9显示,7天之后使用生理盐水做阳性对照组的大鼠,腹壁和盲肠粘连非常严重,粘连面积都大于评分都为4分。
对于单纯的透明质酸钠凝胶而言,7天之后打开腹腔观察发现有2只大鼠(20%)没有发生粘连,其余的8只实验小鼠均有不同程度的粘连。
而对于实施例6制备的N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶组而言,7天之后打开腹腔观察发现有9只大鼠(90%)没有发生粘连,仅仅有一只大鼠出现轻度的粘连。
实验结果显示,本发明所制备的N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶具有良好的术后防粘连效果。
同时,本发明还对实施例1、4和5制备得到的N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶进行了上述腹腔粘连治疗效果评价:
40只SD大鼠随机分成四组,每组10只大鼠:
第一组为生理盐水对照组,在创伤面上滴加1mL生理盐水处理;
第二组为实施例1制备的N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶组,在创伤面上滴加1mL N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶;
第三组为实施例4制备的N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶组,在创伤面上滴加1mL N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶;
第四组为实施例5制备的N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶组,在创伤面上滴加1mL N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶。
14天后,采用过量的戊巴比妥钠静脉注射处死动物,观察腹腔粘连情况并采用国际标准粘连评分方法进行粘连评分。0分:无粘连;1分:薄膜状粘附;2分:单根条索状粘连;3分:多根条索状粘连;4分:同时累及腹壁及内脏的致密粘连。每只大鼠的粘连程度以最高等级为准。
实验结果为:14天之后使用生理盐水做阳性对照组的大鼠,腹壁和盲肠粘连非常严重,粘连评分都为4分。
对于实施例1制备的N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶组而言,14天之后打开腹腔观察发现有9只大鼠(90%)没有发生粘连,仅仅有一只大鼠出现中度的粘连。
对于实施例4制备的N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶组而言,14天之后打开腹腔观察发现有8只大鼠(80%)没有发生粘连,仅有两只大鼠出现中度和轻度的粘连。
对于实施例5制备的N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶组而言,14天之后打开腹腔观察发现有6只大鼠(60%)没有发生粘连,有两只大鼠出现中度粘连,另外两只大鼠出现轻度的粘连。
上述实验结果显示,本发明所制备的N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶具有良好的术后防粘连效果。
实施例15N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶对腹腔粘连和腹壁-盲肠修复的动态观察
为进行腹腔粘连形成和腹壁-盲肠动态修复观察,建立上述实施例14中的大鼠腹壁缺损-盲肠摩擦腹腔粘连模型。
18只大鼠在关腹前,应用1mL N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶(实例6制备)均匀涂抹在盲肠和腹壁创面上,分别于第1,3,5,7,,10和14天后处死大鼠,解剖观察腹壁和盲肠的修复情况。将粘连组织,修复好的腹壁和修复好的盲肠组织取出,去除内容物清洗干净,用中性福尔马林液或者2.5%戊二醛溶液固定。
图10是N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶组的大鼠腹腔粘连图,图10显示了7 天之内大鼠的腹壁和盲肠之间并没有形成粘连的情况,而且5天之后创面已经基本愈合。在术后3天之内可以明显的看到大鼠腹腔内有部分的凝胶残留,但是5天之后腹腔没有发现任何的凝胶残留,说明N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶能在腹腔环境下较快的降解。
实施例16间皮层修复检测
取出受损的盲肠、腹壁及粘连的盲肠和腹壁,用2.5%戊二醛溶液固定后,乙醇梯度脱水,临界点干燥,喷金,并用扫描电镜以观察腹膜创面的间皮化情况。
从图11中可以看出,在第14天处死大鼠(为上述实例15中的大鼠),取其盲肠和腹壁进行扫描电镜检测,图中A为腹壁1000倍、B为腹壁2000倍、C为腹壁5000倍、D为盲肠1000倍、E为盲肠2000倍、F为盲肠5000倍,发现其盲肠和腹壁受破坏的间皮层都已经完全间皮化,其间皮细胞清晰可见,而且间皮细胞绒毛清晰可见,说明间皮细胞功能已经恢复,以后都不会出现粘连情况。
实施例17组织H&E染色和Masson染色
取出上述实例13中在第14天处死大鼠的N,O-羧甲基壳聚-多醛基透明质酸水凝胶组的腹壁及生理盐水对照组的粘连的盲肠和腹壁,用4%多聚甲醛溶液固定后,乙醇梯度脱水(30%,50%,70%,90%,95%,100%)、石蜡包埋、切片,并进行H&E染色和Masso染色,用正置显微镜观察组织恢复或者组织粘连情况。
从图12中可以看出,取N,O-羧甲基壳聚-多醛基透明质酸水凝胶组的腹壁和生理盐水对照组的粘连的盲肠和腹壁进行组织切片染色检测,图中A为N,O-羧甲基壳聚-多醛基透明质酸水凝胶组恢复的腹壁H&E染色、B为和生理盐水对照组粘连组织的H&E染色、C为N,O-羧甲基壳聚-多醛基透明质酸水凝胶组恢复的腹壁Masson染色、D为和生理盐水对照组粘连组织的Masson染色。实验结果为N,O-羧甲基壳聚-多醛基透明质酸水凝胶组的腹壁已经完全恢复,表面覆盖一层新生的间皮细胞,不会在发生粘连现象,而生理盐水对照组的腹壁和盲肠已经形成了致密的粘连组织。
腹膜由单层间皮细胞构成。正常情况下间皮细胞可以分泌具有润滑作用的氨基葡聚糖,可以减轻内脏摩擦及预防腹腔粘连。然而手术创伤几乎必然导致腹腔粘连。这是由于创伤启动了炎症反应,导致血管通透性改变及富含纤维蛋白的渗出物增加,早期形成疏松的纤维素样粘连。此种粘连可以被纤维蛋白溶酶级联反应所降解,但如果该级联反应地功能下降,成纤维母细胞入侵并产生胶原沉积,结果将导致不可逆的致密粘连发生。
所以避免纤维素样粘连形成,防止纤维母细胞入侵和促进间皮化在预防粘连发生起着重要的作用。由以上结果可知,N,O-羧甲基化壳聚糖-多醛基化透明质酸凝胶拥有一些特性,这 些特性可以针对粘连发生的重要步骤来防治腹腔粘连。凝胶防治腹腔粘连的机理如下:在体温下,凝胶成不可流动的凝胶状态,附着于创面上,可以阻止临近创面的接近从而避免了纤维素样粘连形成和纤维母细胞入侵。接下来,伴随着凝胶的降解,吸引来炎性细胞,这些炎性细胞主要由巨噬细胞和泡沫状巨噬细胞组成。这些被吸引来的炎性细胞形成了炎性细胞层,称为防治粘连的第二道屏障,它可以在间皮细胞再生的关键时期有效延缓纤维母细胞的入侵。研究者发现,间皮细胞的再生需要泡沫状巨噬细胞,它可以释放促有丝分离细胞素来激活和促进间皮细胞增值。而且研究者发现,间皮细胞的再生不依赖于其下层的间充质细胞,相反,却与腹腔液中游离的间皮细胞附着有关。因此,上述提到的炎性细胞屏障不仅可以延缓纤维母细胞的入侵,还可以在间皮细胞再生的关键时期,为游离间皮细胞的附着,激活和增殖创造一个非常适宜的微环境。当间皮细胞再生完成,炎性细胞屏障层逐渐消失,被富含胶原和纤维的组织替代。新生的间皮细胞最后生长于纤维化组织上。同时凝胶成分中的壳聚糖和透明质酸可以促进创面愈合。
另外,在凝胶从损伤组织表面消失时,研究者发现了腹腔中粘稠润滑液体的出现,这些液体在7天内被机体完全吸收。在此粘稠润滑液体的生成和完全吸收的周期内,脏层和壁层的创口完成重新间皮化,并且新生间皮细胞恢复了正常形态。这说明了无论是凝胶还是凝胶的降解产物有着良好的组织相容性,不会对妨碍修复过程。我们还注意到,在凝胶治疗组,不仅应用凝胶的受损创面间未发生粘连,在未应用凝胶的切口也没有发生任何的粘连。相反,在生理盐水对照组,不仅在盲肠创面和腹壁创面间发生了粘连,而且在切口和洽正常组织间也发生了粘连。因此,除了上述提到的凝胶防治粘连的机理外,由凝胶降解产生的粘稠润滑液体对防粘连也起到了积极地作用。粘稠润滑液体可以通过“水翼作用”防止创面间的接触和正常组织与创面的接触,从而防治粘连。
凝胶防治粘连的机理可以归纳为以下五点。首先,凝胶附着在创面,防治创面间接触和纤维素样粘连形成。其次,凝胶的降解吸引来大量炎性细胞,形成了炎性细胞层,延缓纤维母细胞入侵。再次,被凝胶吸引来的炎性细胞可以促进游离间皮细胞的附着,激活和增殖。此外,凝胶成分中的壳聚糖和透明质酸可以促进创面愈合。最后,凝胶的降解产物通过“水翼作用”防治粘连形成。
上述实验结果综合表明,本发明所制备的N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶具有良好的防粘连效果,可以用于体内,并且无任何毒副作用,同时在腹腔肿瘤术后的治疗有一定的应用前景。
Claims (11)
1.N,O-羧甲基化壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶,其特征在于:其结构单元如式Ⅰ所示:
其中,x=10~10000,y=10~10000;优选的,x=200~8000,y=200~8000;进一步优选的,x=500~5000,y=500~5000。
2.根据权利要求1所述的N,O-羧甲基化壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶,其特征在于:N,O-羧甲基化壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶是通过以下方法制备得到的:将N,O-羧甲基壳聚糖与多醛基透明质酸的水溶液相互混合,制备得到N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶。
3.根据权利要求2所述的N,O-羧甲基化壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶,其特征在于:将N,O-羧甲基壳聚糖与多醛基透明质酸分别溶解在水中形成质量浓度为0.1~20%水溶液,随后将N,O-羧甲基壳聚糖水溶液和多醛基透明质酸水溶液相互混合,在室温下静置5~30分钟,制备得到N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶;其中,N,O-羧甲基壳聚糖和多醛基透明质酸的质量比为0.1~10︰1。
4.根据权利要求3所述的N,O-羧甲基化壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶,其特征在于:将N,O-羧甲基壳聚糖与多醛基透明质酸分别溶解在水中形成质量浓度为0.1~10%水溶液。
5.根据权利要求2所述的N,O-羧甲基化壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶,其特征在于:所述N,O-羧甲基化壳聚糖的制备方法包括:将氯乙酸与壳聚糖的氢氧化钠水溶液在室温下反应1~4小时,随后提高反应温度至50~80℃继续反应1~4小时后终止反应;过滤出固体,用60~90%乙醇或者甲醇水溶液洗涤固体;再用水溶解所得到的固体,用截留分子量为8000~14000的透析袋在水中进行透析处理3天后冻干,得到N,O-羧甲基壳聚糖;
所述的壳聚糖的氢氧化钠水溶液,是将壳聚糖加入到20~60%氢氧化钠水溶液中,在-20~0℃下放置1~24h;所述的壳聚糖与氢氧化钠的质量比为0.1~10︰1;
所述的壳聚糖与氯乙酸质量比为0.1~10︰1。
6.根据权利要求2所述的N,O-羧甲基化壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶,其特征在于:所述多醛基透明质酸的制备方法包括:将高碘酸钠水溶液与透明质酸水溶液在室温下反应2~8h,随后向体系中加入与高碘酸钠等当量的乙二醇终止反应;混合体系用截留分子量为3500的透析袋在水中进行透析处理3天后冻干,得到多醛基透明质酸;
所述的高碘酸钠与透明质酸质量比为0.05~5︰1;
所述的高碘酸钠水溶液的质量浓度为0.5~20%;
所述的透明质酸水溶液的质量浓度为0.1~10%。
7.N,O-羧甲基化壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
a、将氯乙酸与壳聚糖的氢氧化钠水溶液在室温下反应1~4小时,随后提高反应温度至50~80℃继续反应1~4小时后终止反应;过滤出固体,用60~90%乙醇或者甲醇水溶液洗涤固体;再用水溶解所得到的固体,用截留分子量为8000~14000的透析袋在水中进行透析处理3天后冻干,得到N,O-羧甲基壳聚糖;
b、将高碘酸钠水溶液与透明质酸水溶液在室温下反应2~8h,随后向上述体系中加入与高碘酸钠等当量的乙二醇终止反应;混合体系用截留分子量为3500的透析袋在水中进行透析处理3天后冻干,得到多醛基透明质酸;
c、将N,O-羧甲基壳聚糖与多醛基透明质酸分别溶解在水中形成质量浓度为0.1~20%的水溶液,随后将N,O-羧甲基壳聚糖水溶液和多醛基透明质酸水溶液相互混合,在室温下静置5~30分钟,制备得到N,O-羧甲基壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶。
8.根据权利要求7所述的N,O-羧甲基化壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶的制备方法,其特征在于:步骤a所述的壳聚糖的氢氧化钠水溶液,是将壳聚糖加入到20~60%氢氧化钠水溶液中,在-20~0℃下放置1~24h;所述的壳聚糖与氢氧化钠的质量比为0.1~10︰1;
步骤a所述的壳聚糖与氯乙酸质量比为0.1~10︰1。
9.根据权利要求7所述的N,O-羧甲基化壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶,其特征在于:步骤b所述的高碘酸钠与透明质酸质量比为0.05~5︰1;
步骤b所述的高碘酸钠水溶液的质量浓度为0.5~20%;
步骤b所述的透明质酸水溶液的质量浓度为0.1~10%。
10.根据权利要求7所述的N,O-羧甲基化壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶,其特征在于:步骤c中,将N,O-羧甲基壳聚糖与多醛基透明质酸分别溶解在水中形成质量浓度为0.5~10%水溶液。
11.权利要求1所述的N,O-羧甲基化壳聚糖-多醛基透明质酸凝胶在防治术后组织粘连中的用途。
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