CN102558600A - 交联透明质酸海绵及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种制备交联透明质酸海绵的方法、以及该方法得到的海绵。方法包括(1)透明质酸原料溶胀于水中，得到透明质酸胶液；(2)调节透明质酸胶液为碱性，加入交联剂，进行交联反应，得到交联透明质酸凝胶；和(3)清洗所述交联透明质酸凝胶，并经低温冷冻干燥得到交联透明质酸海绵。本发明方法制备的交联透明质酸海绵，交联剂含量低，生物相容性好，体内降解周期与组织愈合周期一致，具有良好的止血、防粘连功能。

Description

交联透明质酸海绵及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种医用，特别是止血、防粘连用交联透明质酸海绵及其制备方法。

背景技术

手术后局部出血、组织粘连是一种常见的临床现象，它的发生可能导致严重的临床并发症。理想的止血、防粘连材料一般具有以下特征：生物相容性好，无明显毒副反应；生物可吸收性；体内降解速率与伤口愈合同步；上血迅速，止血效果确切；具有良好组织粘附性；防止术后粘连效果好，能促进创面迅速愈合，粘膜损伤轻。

研究表明，透明质酸(HA)被制成海绵或膜片后，其止血和防粘连效果较为理想，专利申请CN 101912633A采用未交联透明质酸或其盐制备成的透明质酸海绵，具有止血、防粘连功能；国内专利CN 1281816C中采用纤维素、壳聚糖和透明质酸等天然多糖材料及胶原材料制成的生物纸，用于术后止血和防粘连；美国Xomed公司生产的MeroGel为透明质酸酯化衍生物组成的止血海绵，用于耳鼻科术后止血和防粘连。但是，上述专利所涉及的或已经在国外上市的产品，由于透明质酸或是未经修饰或是被修饰程度低，在体内很容易被透明质酸酶等降解，降解速率过快，对其防粘连效果有所影响。经研究，使用一种交联能力强的交联剂来修饰或交联透明质酸，并制备成适合预期用途的材料，可弥补透明质酸在体内降解过快的不足。二乙烯基砜是一种研究较早的用于制备交联透明质酸的交联试剂，其交联能力强，若能控制其在产品中的含量，该试剂交联的产品将适合用于多种临床治疗。国外专利(USP4582865、USP20050142152、USP20070036745等)和国内专利(CN 101056891、CN 101036808A、CN101107270A和CN 1902232A)均涉及使用二乙烯基砜制备交联透明质酸凝胶的方法，并证实了该凝胶可安全用于软组织填充等用途。有文献(米鹏程等，二乙烯基砜交联透明质酸钠凝胶的制备及其生物相容性，中国组织工程研究与临床康复，2008，12(14)：2675-2678)(下文称文献A)阐述了二乙烯基砜为交联剂制备交联透明质酸钠凝胶的方法，并证实了二乙烯基砜交联透明质酸具有生物相容性，该文献中二乙烯基砜交联透明质酸钠凝胶的制备方法为往透明质酸原料中直接加入碱性溶液，搅匀30min后，再加入交联剂进行反应，这会导致产物交联程度不均匀。国外产品HylaSine为二乙烯基砜交联透明质酸组成凝胶制剂，临床上用于鼻科手术或损伤后覆盖鼻腔或鼻窦的粘膜表面，起止血和防粘连作用，但是止血效果并不太理想。

发明内容

本发明的目的是提供一种交联透明质酸海绵及其制备方法，该海绵交联剂含量低，生物相容性好，体内降解周期与组织愈合周期一致，具有良好的止血、防粘连功能。

本发明制备交联透明质酸海绵的方法，其步骤为：(1)透明质酸原料溶胀于水中，得到透明质酸胶液；(2)加碱调节透明质酸胶液为碱性后，加入交联剂，进行交联反应，得到交联透明质酸凝胶；及(3)清洗所述交联透明质酸凝胶后经低温冷冻干燥得到交联透明质酸海绵。

本发明方法的具体实施例中，步骤(1)的透明质酸胶液经4-10℃下溶胀1-5天得到。

本发明方法的具体实施例中，使用碱溶液调节透明质酸胶液为碱性，所述碱溶液所选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾或碳酸钠溶液；碱溶液加入量为，以加入后透明质酸胶液体积计其浓度为0.05M-2M。

本发明方法的具体实施例中，步骤(2)中加碱调节透明质酸胶液的pH值为10-12。

本发明方法的具体实施例中，加碱后透明质酸胶液可先在室温放置0.5-3小时再加入交联剂。

本发明方法的具体实施例中，交联剂可为二乙烯基砜，加入量为碱性透明质酸胶液体积的1/500～1/2000；并且交联反应条件为反应温度30～45℃、反应时间2～8小时。

本发明方法的具体实施例中，加入交联剂后的胶液可倒入反应模具进行所述交联反应，以得到所需形状和尺寸的凝胶。

本发明方法的具体实施例中，反应模具为扁平状，并将反应得到的交联透明质酸凝胶的厚度控制在1-3mm，以形成薄层交联透明质酸凝胶。

本发明方法的具体实施例中，用蒸馏水清洗交联透明质酸凝胶至中性，在-60℃下冷冻24-48小时后，再冷冻干燥机干燥36～60小时，以形成白色的交联透明质酸海绵。

本发明还提供一种根据上述方法得到的交联透明质酸海绵。

本发明制得的交联透明质酸海绵的透明质酸酶降解消化慢，延长了在体内的存留时间，使产品在体内降解速率与组织愈合周期一致。

本发明的交联透明质酸海绵具有高吸水率，能够快速止血和吸收术后渗出液体，渗出液的减少有利于创伤愈合和减少粘连的发生，同时海绵吸收液体后形成的水凝胶具有隔离屏障作用，也可预防粘连形成。本产品可用于普通创伤、外科、耳鼻喉科手术等，起止血、防粘连作用。

具体实施方式

本发明制备止血、防粘连用交联透明质酸海绵的方法，其步骤为：(1)透明质酸原料溶胀于水中，得到透明质酸胶液；(2)调节透明质酸胶液为碱性，加入交联剂，进行交联反应，得到交联透明质酸凝胶；(3)用水清洗凝胶，并经冷冻干燥得到交联透明质酸海绵。

步骤(1)中

透明质酸原料可来源自细菌发酵或鸡冠提取，分子量为80-200万道尔顿。

透明质酸原料在水中的浓度为5-15％(重量体积比)，优选为5-10％。溶胀透明质酸的水可以是蒸馏水或去离子水。

透明质酸原料充分溶胀于水中是经温度4-10℃下放置1-5天得到。

透明质酸充分溶胀后肉眼观察为无白点和/或纤维的均质胶液。

步骤(2)中

调节透明质酸胶液为碱性所使用的碱溶液选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾或碳酸钠溶液，优选碳酸钠溶液。

碱溶液加入量为，以加入后透明质酸胶液体积计其浓度为0.05M-2M，优选0.1M-0.5M。

加入碱性溶液搅拌均匀后，透明质酸胶液可为pH值≥10，优选pH值10-12。加入碱性溶液搅拌均匀后，可以再室温放置0.5-3小时，使透明质酸胶液碱性更均匀，pH可以在此时测定。

交联剂可以使用前述文献中使用的各种交联剂，优选为二乙烯基砜。交联剂的加入量为碱性透明质酸胶液体积的1/500～1/2000。交联反应条件为反应温度30～45℃，反应时间2～8小时。

为得到所需形状和大小的凝胶，加入交联剂搅拌均匀后将混有交联剂的胶液倒入反应模具进行交联反应。

反应模具为扁平状，可为正方形、长方形或圆形，优选正方形或长方形。反应模具材质选自不锈钢、玻璃或聚四氟乙烯等。将混有交联剂的透明质酸凝胶倒入反应模具时，可将凝胶的的厚度控制在1-3mm。

在模具中进行交联反应的结果为形成了薄层交联透明质酸凝胶。

步骤(3)中

用水清洗交联凝胶至中性或接近中性。例如，用蒸馏水对交联透明质酸凝胶进行清洗(如浸泡)，直至清洗液pH值为6-8。

冷冻干燥过程为低温冷冻干燥。具体可以为：将清洗后交联透明质酸凝胶在低温(如-60℃)下冷冻24-48小时后，再移至冷冻干燥机干燥36～60小时，形成了白色的交联透明质酸海绵。

得到的交联透明质酸海绵，可对其进行裁切、内包装后，最后使用γ射线灭菌。

本发明制备的制备方法或得到的交联透明质酸海绵具有如下优点：

(1)本发明在制备交联透明质酸时，先用水溶胀(溶解)透明质酸，再调节pH值为碱性，避免了透明质酸分子链长时间处于碱环境而被碱降解，这意味着仅需添加较少量交联剂即可获得交联程度较高的产物。

透明质酸分子在pH值10以上的碱性条件下，被降解为N-乙酰氨基葡糖的还原末端的半缩醛和醛，醛基上的α-氢原子在强碱条件下很不稳定，糖苷键很容易断裂，进一步降解，形成含有还原末端的葡糖醛酸。所以透明质酸分子长时间暴露于碱性环境下，很容易被降解成葡糖醛酸。但是制备交联透明质酸的交联反应必须在碱性条件下进行。所以，为了既保证交联反应正常进行又减少透明质酸被碱降解，本发明先用蒸馏水溶解透明质酸，之后再将溶液调节为碱性。

(2)本发明的交联透明质酸海绵能够耐受透明质酸酶的降解，延长了其在体内的存留时间，使产品在体内降解速率与组织愈合周期一致。

这是由于本发明方法中(i)透明质酸的碱降解程度低、交联程度高，(ii)得到交联凝胶后未经破碎而直接冷冻干燥形成海绵，有利于保存产品的三维网络结构。

(3)本发明的交联透明质酸海绵具有高吸水率，能够快速止血和吸收术后渗出液体，渗出液的减少有利于创伤愈合和减少粘连的发生，同时海绵吸收液体后形成的水凝胶具有隔离屏障作用，也可预防粘连形成。本产品可用于普通创伤、外科、耳鼻喉科手术等，起止血、防粘连作用。

(4)本发明的交联透明质酸海绵产品在体内存留一段时间后，最后被机体完全降解，最终降解产物为CO₂和水，具有生物可降解性；

(5)本发明方法中加入交联剂量少，是终产品中交联剂含量低的前提，采用气相色谱法检测显示，本发明方法得到的海绵中交联剂含量低于0.1μg/g，远远低于交联剂产生细胞毒性的浓度水平，确保了产品的生物安全性。

测试方法

1.凝胶的水膨胀度

试验目的：通过测定凝胶在水中膨胀度，可以推算交联产物的交联程度，交联度越高，凝胶的水膨胀度越低。

试验方法：交联反应得到交联透明质酸凝胶后，在未使用蒸馏水清洗之前，直接称取凝胶块1g(W1)置于大量蒸馏水中浸泡24小时以使凝胶块充分吸收水分而膨胀。取出，使用纱纸除去凝胶块表面上残余水，称重凝胶块得到W2。凝胶块在水中的膨胀度P(％)根据下列公式计算：

P(％)＝(W2-W1)/W1×100

2.透明质酸酶消化率

试验目的：通过测定透明质酸酶消化率，可以了解产品的抗酶解能力，间接反映产品在体内存留时间的长短，产品抗酶消化能力越强，体内存留时间越长。

试验方法：称取0.5g冷冻前的交联凝胶块或20mg交联透明质酸海绵悬浮在含有300U/ml透明质酸酶的30ml PBS缓冲液(pH＝7.2)中，于37℃下培养24小时。过滤并收集酶解液，煮沸30分钟以去除透明质酸酶活性。使用咔唑分析酶消化液中透明质酸浓度，推算凝胶块和海绵的消化率。

3.交联剂含量的测定

试验目的：由于交联剂对机体有一定毒性，产品应用于临床领域时，必须严格控制在产品中的含量，产品中交联剂含量越低，安全性越高。

试验方法：称取交联透明质酸海绵于含有透明质酸酶1000U/ml的生理平衡液中，37℃恒温箱放置至透明质酸海绵完全降解后，使用气相色谱法检测降解液中的交联剂含量，然后推算出海绵中交联剂含量。

4.细胞毒性试验

试验目的：细胞毒性是评估材料安全性的一项常用方法，根据国家行业标准，作为体内植入材料，要求其细胞毒性不得大于1级。

试验方法：按照国家GB16886系列标准的方法，采用MTT法、浸提液方式，检测产品的细胞毒性。

5.体内降解试验

试验目的：体内降解试验可直接反应产品在体内存留时间的长短。

试验方法：按照国家GB16886系列标准的方法，将试验产品植入至动物皮下，观察产品在植入的第3周和第6周时的降解情况。

6.止血试验

试验目的：通过动物试验验证产品的止血效果。

试验方法：在小白鼠的后肢制造2cm×1cm大小的出血创面，分别用不同的止血材料敷压止血，记录止血时间。每种止血材料平行做3例，计算其平均止血时间。

7.防粘连试验

试验目的：通过动物试验验证产品的防粘连效果。

试验方法：实验动物为SD大鼠，体重220±40g，雌雄不分，每组动物10只。实验大鼠均使用2％无巴比妥钠腹腔注射进行麻醉，麻醉后开腹手术，逐层切开，暴露腹腔，距回肠部5cm处选取3cm回肠段，用干纱布来回摩擦20次，肠管充血并有点状出血点，空白对照组不加任何材料直接关腹，试验组在摩擦主要部位放置3cm×3cm试验海绵轻轻按压后关腹。各组在相同条件下饲养，术后3周全部处死动物。参照粘连等级分级法，腹腔内粘连情况进行评定分级。粘连等级分级法具体为：0级无粘连，回肠浆膜面完全修复；I级仅疏松少量粘连，易分离，无渗血，回肠浆膜大部修复；II级粘连较I级略密，分离时渗血，回肠浆膜修复一半左右；III级粘膜连成团状或与其他脏器广泛粘连，但无梗阻，回肠浆膜少部分修复；IV级粘连广泛，致密，有肠梗阻，近端肠管扩张明显。

下面通过实施例进一步说明本发明，但不局限于下列实例。

材料

下面例子所用的透明质酸原料均来源于细菌发酵。

实施例1

称取2g透明质酸原料干粉于烧杯中，加入35ml蒸馏水，用玻棒搅拌均匀后，封口，于4℃冰箱存放5天，透明质酸在蒸馏水中充分溶胀后，加入2M碳酸钠溶液5ml，搅拌均匀，室温放置0.5h，测得溶液的pH值为11.5，加入0.05ml二乙烯基砜，迅速搅拌均匀后，分别倒入玻璃盘中，厚度约为2mm，于40℃恒温箱放置2小时，即可获得不溶于水的交联透明质酸凝胶块。将凝胶放到蒸馏水中进行洗涤，清洗液pH值为6.8时，沥干水分，将交联凝胶块转移到冷冻盘，置于-60℃冰柜冷冻48h后使用冷冻干燥机对其进行冷冻干燥48h，即可获得交联透明质酸海绵，用铝箔纸包装密封，γ射线灭菌。

实施例2

称取2g透明质酸原料干粉于烧杯中，加入35ml蒸馏水，用玻棒搅拌均匀后，封口，于4℃冰箱存放1天，透明质酸在蒸馏水中充分溶胀后，加入2M碳酸钠溶液5ml，搅拌均匀，室温放置0.5h，测得溶液的pH值为11.2，加入0.05ml二乙烯基砜，迅速搅拌均匀后，分别倒入玻璃盘中，厚度约为2mm，于37℃恒温箱放置4小时，即可获得不溶于水的交联透明质酸凝胶块。将凝胶放到蒸馏水中进行洗涤，清洗液pH值为7.1时，沥干水分，将交联凝胶块转移到冷冻盘，置于-60℃冰柜冷冻48h后使用冷冻干燥机对其进行冷冻干燥48h，即可获得交联透明质酸海绵，用铝箔纸包装密封，γ射线灭菌。

对比例1(使用强碱溶液溶解透明质酸后制备交联透明质酸海绵)

称取2g透明质酸原料于烧杯中，加入40ml 0.2M氢氧化钠溶液，用玻棒搅拌均匀后，封口，于4℃冰箱存放5天，室温放置1h，测定溶液pH值为13.7，加入0.05ml二乙烯基砜，迅速搅拌均匀后，分别倒入玻璃盘中，厚度约为2mm，于40℃恒温箱放置2小时，即可获得水不溶性交联透明质酸凝胶块。将凝胶放到蒸馏水中进行洗涤，清洗液pH值为7.5时，沥干水分，将交联凝胶块转移到冷冻盘，置于-60℃冰柜冷冻48h后使用冷冻干燥机对其进行冷冻干燥48h，即可获得交联透明质酸海绵，用铝箔纸包装密封，γ射线灭菌。

对比例2(参照背景技术提及文献A的方法制备凝胶，再冻干成海绵)

称取2g透明质酸原料，加入0.2M的NaOH溶液40ml，搅拌均匀，0.5h后，测定pH值为13.2，加入0.05ml二乙烯基砜，搅拌均匀后于40℃恒温箱放置3小时，即可获得不溶于水的交联透明质酸凝胶块。将凝胶放到蒸馏水中进行洗涤，清洗液pH值为6.8时，沥干水分，将交联凝胶块转移到冷冻盘，置于-60℃冰柜冷冻48h后使用冷冻干燥机对其进行冷冻干燥48h，即可获得交联透明质酸海绵，用铝箔包装密封，γ射线灭菌。

对实施例1、实施例2、对比例1和对比例2中交联透明质酸凝胶块和海绵分别测定其水膨胀度以及透明质酸酶消化率，结果见表1。

表1

由表1可见，本发明制备得到的产品交联密度更高，耐透明质酸酶消化能力更强。

实施例3

称取2g透明质酸原料干粉于烧杯中，加入25ml蒸馏水，用玻棒搅拌均匀后，封口，于4℃冰箱存放3天，透明质酸在蒸馏水中充分溶胀后，加入2M碳酸钠溶液5ml，搅拌均匀，室温放置1h，测得溶液的pH值为11.3，加入0.03ml二乙烯基砜，迅速搅拌均匀后，分别倒入玻璃盘中，厚度约为2mm，于37℃恒温箱放置4小时，即可获得不溶于水的交联透明质酸凝胶块。将凝胶放到蒸馏水中进行洗涤，清洗液pH值为7.2时，沥干水分，将交联凝胶块转移到冷冻盘，置于-60℃冰柜冷冻48h后使用冷冻干燥机对其进行冷冻干燥48h，即可获得交联透明质酸海绵，用铝箔纸包装密封，γ射线灭菌。

实施例4

称取3g透明质酸原料干粉于烧杯中，加入40ml蒸馏水，用玻棒搅拌均匀后，封口，于4℃冰箱存放4天，透明质酸在蒸馏水中充分溶胀后，加入2M碳酸钠溶液10ml，搅拌均匀，室温放置1.5h，测得溶液的pH值为11.5，加入0.05ml二乙烯基砜，迅速搅拌均匀后，分别倒入玻璃盘中，厚度约为2mm，于40℃恒温箱放置4小时，即可获得不溶于水的交联透明质酸凝胶块。将凝胶放到蒸馏水中进行洗涤，清洗液pH值为7.3时，沥干水分，将交联凝胶块转移到冷冻盘，置于-60℃冰柜冷冻48h后使用冷冻干燥机对其进行冷冻干燥72h，即可获得交联透明质酸海绵，用铝箔纸包装密封，γ射线灭菌。

对比例3(交联透明质酸凝胶块直接破碎为微粒凝胶)

称取2g透明质酸原料干粉于烧杯中，加入25ml蒸馏水，用玻棒搅拌均匀后，封口，于4℃冰箱存放3天，透明质酸在蒸馏水中充分溶胀后，加入2M碳酸钠溶液5ml，搅拌均匀，室温放置1h，测得溶液的pH值为11.3，加入0.03ml二乙烯基砜，迅速搅拌均匀后，分别倒入玻璃盘中，厚度约为2mm，于37℃恒温箱放置4小时，即可获得不溶于水的交联透明质酸凝胶块。将凝胶放到蒸馏水中进行洗涤，清洗液pH值为7.0时，沥干水分，将凝胶块通过挤碎/压碎/绞碎等机械作用变为微粒凝胶。

对比例4(交联透明质酸凝胶先破碎后再冻干成海绵)

将对比例3制备得到的微粒凝胶倒入冷冻盘，置于-60℃冰柜冷冻48h后使用冷冻干燥机对其进行冷冻干燥48h，即可获得交联透明质酸海绵，用铝箔纸包装密封，γ射线灭菌。

对比例5(制备未交联透明质酸海绵)

称取2g透明质酸钠，加入蒸馏水30ml，搅拌均匀，4℃环境放置3天，转移到冷冻盘，置于-60℃冰柜冷冻48h后使用冷冻干燥机对其进行冷冻干燥48h，即可获得透明质酸海绵，用铝箔纸包装密封，γ射线灭菌。

对实施例3、实施例4、对比例3、对比例4和对比例5制备得到的产品进行相关性能检测，检测项目和检测结果如表2所示。

表2

由表2可知，本发明的海绵在体内降解存留时间明显长于对比例2、4、5的海绵和对比例2-5的凝胶微粒，止血和防粘连综合效果也明显好于各对比例的产品。对比例2中交联剂含量较高，可能是透明质酸原料溶解不充分引起交联反应不完全而导致游离交联剂残留增加。

Claims (10)

1.一种制备交联透明质酸海绵的方法，其步骤为：

(1)透明质酸原料溶胀于水中，得到透明质酸胶液；

(2)加碱调节透明质酸胶液为碱性后，加入交联剂，进行交联反应，得到交联透明质酸凝胶；及

(3)清洗所述交联透明质酸凝胶后经低温冷冻干燥得到交联透明质酸海绵。

2.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)的透明质酸胶液经4-10℃下溶胀1-5天得到。

3.如权利要求1所述的方法，其中，使用碱溶液调节透明质酸胶液为碱性，所述碱溶液所选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾或碳酸钠溶液；碱溶液加入量为，以加入后透明质酸胶液体积计其浓度为0.05M-2M。

4.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中加碱调节透明质酸胶液的pH值为10-12。

5.如权利要求1所述的方法，其中，加碱后透明质酸胶液先在室温放置0.5-3小时再加入交联剂。

6.如权利要求1所述的方法，其中，交联剂为二乙烯基砜，加入量为碱性透明质酸胶液体积的1/500～1/2000；并且交联反应条件为反应温度30～45℃、反应时间2～8小时。

7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其中，加入交联剂后的胶液倒入反应模具进行所述交联反应，以得到所需形状和尺寸的凝胶。

8.如权利要求7所述的方法，其中，反应模具为扁平状，并将反应得到的交联透明质酸凝胶的厚度控制在1-3mm，以形成薄层交联透明质酸凝胶。

9.如权利要求7所述的方法，其中，用蒸馏水清洗交联透明质酸凝胶至中性，在-60℃下冷冻24-48小时后，再冷冻干燥机干燥36～60小时，以形成白色的交联透明质酸海绵。

10.一种交联透明质酸海绵，通过权利要求1-9任一项的方法制备。