JP2008505129A - セラリシン(Serralisins)のポリペプチド断片を含む医薬組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
[図1]S.マルセッセンスと腫瘍細胞CB Hep.1との相互作用は、高い抗増殖性能力及び修飾されたタンパク質発現を有する細菌系統を生成する。A−細胞生存。72時間後に、細胞生存をMTT法によって推定した。系統CMIB4202は、ヒト腫瘍細胞HEp−2に対して強い抗増殖性効果を示したが、SM1995系統の効果は非常に弱かった。これらの結果は、1試料4反復を用いた3つの独立した実験の平均であった。B−SDS−PAGE電気泳動(銀染色)。CMIB4202は、25kDa近辺を移動する可溶タンパク質を過剰発現した。
[図2]細胞系HEp−2に対する25及び50kDa分画の増殖抑制作用を示す図である。細胞生存能力はMTT法で測定して、対照細胞と比較した率で表した。分画はSDSゲル(亜鉛−イミダゾール染色)から回収して再生した。25kDa近くの分画は強い増殖抑制作用(IC50値0.35nM/mL)を示したが、p50は増殖を抑制することができなかった。Zn4SO2の5μMをp50に加えたとき、増殖抑制作用の増加が観察された(IC50値45nM/mL)が、p25のそれよりは劣っていた。5つの独立した実験の平均値から曲線を作成して、対応する標準偏差(SD)とともにグラフ表示する。
[図3]系統CBMI4202によるタンパク質及びプロジギオシンの発現の動態を示す図である。培地へのプロジギオシンの発現は、増殖期から安定期までの移行期間の間に起こり、そこではCBMI4202はその高い複製時間に達する。A−細胞複製時間の動態。B−プロジギオシン発現の効率(生成物/バイオマス)。C−MTT法で測定されたHep−2細胞に対する増殖抑制効果の動態。D−光学密度及びタンパク質生合成で測定された細胞増殖の動態。
[図4]MG2327による治療に対する腫瘍細胞及び正常ヒト細胞の感受性を示す図である。正常細胞は低い感受性を有し、造血起源のそれらの感受性は分析した残りの細胞系よりも低い。一方、成長を活性化した細胞(HUVEC bFGF)及び腫瘍悪性病変由来の細胞は、より感受性である。
[図5]MG2327調製物で治療され、又は治療されなく、CBHep1腫瘍を投与された後のBALB/cマウス生存の分析を示す図である。A−1mg/kgの用量は治療された動物の60%で腫瘍退縮を誘導し、未処置動物の100%がday60までに死亡した。B−腫瘍細胞接種の45日後に、無処置動物は充実性腫瘍及び腹水が存在して極めて虚弱な状態を示したが、1mg/kgで治療されたものは腫瘍の所見を示さず、300日を超えて生存した。
[図6]腫瘍モデル3T316に及ぼすMG2327の抗腫瘍効果を示す図である。A−各群の日別平均を示すグラフは、治療動物及び無処置動物の腫瘍量の間の統計学的に有意な差(p<0.003)を示す。その時間を通しての腫瘍増殖の分析は、MG2327治療群で有意な変動(p=0.109)を示さなかったが、陰性対照群はこのパラメータの有意な増加(p=0.04)を示した。B−治療動物及び無処置動物の生存。
[図7]MG2327からのタンパク質有効成分の単離を示す図である。(A)SDS−PAGEでの電気泳動(12.5%)。クマシー染色の結果。レーン1は0.2M NaCl、pH8.00による溶出に対応する試料を示し、50kDaに対応するタンパク質バンドを認める。レーン2は、25kDaのタンパク質バンドを示す。染色は、クマシー法によって実施した。(B)ヒト腫瘍細胞上のp50及びp25タンパク質のHEp−2に対する増殖抑制効果。総タンパク質濃度で表したp25、p50及びMG2327に対する用量反応関係。
[図8]MG2327から単離された有効成分のHEp−2細胞に及ぼす増殖抑制効果を示す図である。MG2327に封入された50及び25kDaのタンパク質は、増殖抑制活性を示した。これらのタンパク質とプロジギオシンとの組合せは、対照と比較して腫瘍細胞の50%の増殖を抑制することができる用量(IC50値)を低下させた。
[図9]SDS−PAGE及びウェスタンブロット法。(A)MG2327から得られたタンパク質のパターン。試料は、SDS−PAGEゲル(12%)によって分析して銀染色した。(B)約50及び25kDaのタンパク質バンド(矢印)を亜鉛イミダゾールで染色した類似のゲルから切断し、再生して新しいSDS−PAGEに流した。これをニトロセルロース膜へ移して、ウェスタンブロットを抗p50抗体で展開した。ヤギで得られたポリクローナル抗体は、p25及びp50の分解物を認識したが、関連しないタンパク質バンド(Neg C)を認識しない。
[図10]p50自己消化を示す図である。A−SDSページ電気泳動:1−24℃、2−37℃、3−45℃、4−60℃、5−4℃。B−p50及びp25の濃度測定分析は、インキュベーション温度の上昇に伴いp50バンドの強度は低下し、p25バンドの強度は増加することを示した。
[図11]DEAE Sepharosa Fast Flowクロマトグラフィーで精製したp50を示す図である。p50(0.2MのNaClで溶出)は、親分子より高い増殖抑制作用を有する分解物を生成した。
[図12]異なるクロマトグラフィーから得られたp25及びp50の酵素活性を示す図である。A−p25は活性を示さないがp50は酵素活性を示した。B−p50の酵素活性は、7mMのEDTAで完全に抑制された。
[図13]MG2327は、腫瘍細胞P3X63Ag8の時間依存性DNA断片化を誘導した。インキュベーションの6時間後からオリゴヌクレオソーム断片が観察され、それらは経時的に増加し、24時間後に180〜200塩基対のオリゴヌクレオソーム断片で典型的なアポトーシスのパターンに到達する。
[図15]マトリゲル内の内皮細胞の分化に及ぼすMG2327、p25及びp50(クロマトグラフィーによって精製される)及びそれらの分画の影響を示す図である。HMEC細胞を、活性化条件(10ng/mL EGF、1μg/mLのヒドロコルチゾン)で、MG2327(A)、p50(B)及びp25(C)の類似した濃度の存在下で、治療なし(E)及び活性化なし(D)で培養した。グラフ(F)では、3つの独立した実験の結果が集められ、それはマトリゲル内の管状ネットの形成に及ぼすMG2327及びその成分の抑制作用を示す。MG2327及びp50は、誘導された活性化を完全に非活性化細胞のレベルに戻す(ANOVA MG2327、p50及びCN p>0.05)。p25で治療した細胞は、MG2327及びp50で観察されたものより劣った(対応のないt、それぞれp=0.0107及びp=0.0498)ネット形成指数を示した。
[図16]MG2327で免疫化されたか又はされていない、また、X63骨髄腫細胞を投与されたBALB/cの生存を示す図である。1mg/kgのMG2327の3及び6の用量を用いて免疫化された動物の100%は、骨髄性腫瘍を拒絶する。
系統CMIB4202の獲得
抗腫瘍分子の細菌系統産生者を得るために、BALB/cマウスの前方表面から単離した野生型セラチアマルセッセンスSM1995を腫瘍細胞CBHEp.1と混合し(Aleman,M.R.、Valdes,R.、Perez,M.、Ibarra,N.、Reyes,B.、Gonzalez,M.、Mendoza,O.、Padilla,S.、Agraz,A.及びRodriguez,M.P.2000.Biopharm 13:48〜52)、10日前に重流動ワセリン(heavy liquid petrolate)を事前接種したBALB/cマウスに腹腔内接種をした。細胞混合物の接種の8日後に、腹水抽出を2日ごとに実施した。腫瘍増殖の動態を分析して、腫瘍退縮を示す各動物の腹水に微生物管理を実施した。
他方、両者の見込まれる主要な効果は、両者のタンパク質が量の点で顕著な相違を発現すること(p=0.01)、並びにその量が、貯蔵に依存することを示す(p=0.0004)。
さらに、両者の保存状態間で、これらのたんぱく質の発現について顕著な相違が存在する。
[Furthermore, the probability of both principal effects Por otro lado, la probabilidad de ambos efectos principales mostro que ambas proteinas son expresadas en cantidades significativamente diferentes (P = 0.01) y que la cantidad es fuertemente dependiente de la cepa (P = 0.0004). Ademas, existieron diferencias extremadamente significativas de la expresion de estas proteinas entre ambas cepas (P<0.001).]
MG2327増殖抑制調製物の獲得
得られたCMIB4202のS.マルセッセンス系統の一部の増殖抑制調製物のために、1Lの微生物培養物及び関心の分子を産生するための最適な培地を産生した(図3)。CMIB4202培養物は、4℃、12000gで30分間遠心分離した。Sobrenatanを収集し、その後無菌条件下で分子tamizajeにより0.2μから濾過した。sobrenadanteの量は、同じ無菌条件で10倍に減らした。上清の量を10kDa排除限度の膜を用いて10倍に減らし、生理的条件で24時間の間、4℃でPBSに対して透析した。透析した材料を無菌条件下で濾過し、5mLのバイアルに分け、パイロジェンフリーのクリスタルバイアルに入れた。この調製物を4℃で保存し、MG2327と命名した。
「in vitro」におけるMG2327調製物の増殖抑制作用の特性評価
「in vitro」におけるMG2327の増殖抑制作用の特性評価のために、一群のヒト細胞系を評価した(表1)。PBMC(20000)を除く合計2000細胞を96穴培養ウェルに接種し、MG2327の異なる濃度を加えた。72時間後に、生存細胞数をMTTの添加により推定した(Skehan,P.、Storeng,R.、Scudiero,D.、Monks,A.、Mcmahon,J.、Vistica,D.、Warren,J.T.、Bokesch,H.、Kenney,S.及びBOYD,M.R.1990.J.Natl Cancer Inst.82:1107)。可溶性ホルマザン生成物が、マルチスキャンプレートリーダーにおいて540nmで検出された。MG2327は、分析したヒト細胞系に対して広範囲の細胞傷害活性を示した。IC50値は、μg/mLの範囲にあった。
MG2327調製物の抗腫瘍活性
MG2327調製物の抗腫瘍活性を示すために、我々はマウス腹水腫瘍を生成することができる骨髄起源のCB Hep−1腫瘍細胞を腹腔内(i.p.)に移植された、BALB/cマウスを使用した(Fontirrochi,G.、Duenas,M.、Fernandez de Cossio,M.E.、Fuentes,P.、Perez,M.、Mainet,D.、Ayala,M.、Gavilondo,J.V.及びDuarte,C.1993.Biotecnol Aplic.10:24〜30)。10日後、マウスはMG2327又はPBSで腹腔内注射した。1mg/kg体重で治療した動物の60パーセントは生存したが、対照のわずか25パーセントが最初の治療から45日まで生存した(図5)。総腫瘍退縮は健康な状態を示したすべての治療された生存動物で観察されたが、対照では腫瘍が進行して大きな固形塊を形成して、動物は不健康な全身状態を示した。
MG2327調製物の分画、非タンパク質生体分子から単離
MG2327調製物の組成を決定するために、分子分画を実施してin vitroで細胞Hep−2ヒト腫瘍細胞系の細胞増殖を抑制するそれらの能力を評価した。
MG2327調製物の分画。増殖抑制効果を有するタンパク質生体分子から、わずか1つのクロマトグラフィー段階、即ちNaCl不連続勾配を用いるイオン交換だけで単離した
組成物MG2327調製物を、50mMのリン酸緩衝液、pH8.00、で平衡化したDEAE Sepharose Fast Flow matrizに加えた。溶出は、NaCl不連続勾配で実施した:50mMリン酸緩衝液−0.1M NaCl、pH8.00、50mMリン酸緩衝液−0.2M NaCl、pH8.00、50mM−2M NaCl、pH8.00、及び、最後にマトリックスに吸収された色素分画を70%無水エタノールで溶出した。
セラリシンポリペプチドとプロジギオシンとの組成物
タンパク成分及びプロジギオシンを同じ1つの組成で製剤化し、それはその独立した形態との比較で抑制効果を有意に(p<0.005)増加させた。図8で、MG2327調製物から単離された増殖抑制性生体分子及びその組成物のIC50を図示する。MG2327調製物は総タンパクと称され、組成物は、独立形態の成分を評価するときに用いたのと同じタンパク質とプロジギオシンとの関係を固く維持すると認められた。そのような組成物では、プロジギオシンの0.1〜100nMの1濃度に対して0.1〜150μg/mLのセラリシン断片を合わせることができる。
p50とp25
ヒツジで得られた抗p50は、p25及びp50の関係を知るため利用した。MG2327は、イミダゾール−亜鉛染色した12%のSDS−PAGEゲルに加えた(Hardy,E.,Santana,H.,Sosa,A.,Hernandez,L.,Fernandez−Padron,C.及びCastellanos−Serra,L.1996.Analytical biochemistry.240:150〜152)。約50及び25kDaのタンパク質バンド(図9)を切断し、ゲル内で再生して、SDS−PAGEに加えた。これらをニトロセルロース膜に移し、ウェスタンブロットを実施した。p50の分解によりp25と認められた抗p50ポリクローナル抗体の分子サイズを予備染色した分子量マーカー(Bio−Rad)で推定した。ここで示したウェスタンブロットは、3つの同等実験を代表する。
得られたp50を温度により分解した結果、p50自体が最も活性である
実施例6で得られたp50を異なる温度でインキュベートし、その増殖抑制活性は前記MTT法を用いてHEp−2で試験した。各条件(4、37、45及び60℃)で生成した分解パターンは、デンシトメータで測定した。
p25は、悪性腫瘍の退縮を誘導する
実施例6で記載されたクロマトグラフィーによって得られたタンパク質p25は、その均質性及び純度を検査するために逆相クロマトグラフィー(RP−HPLC)に加えた。それは、100分で0〜100のアセトニトリル勾配を使用した。それは、90%の高純度タンパク質のピークを観察し、溶出液の均一性を示す。
p50は金属プロテアーゼであり、p25はタンパク分解活性を有しない
カゼインを基質として用いるAnson及びMirskyの修正方法(Anson,M.L.、Mirsky,A.E.1932.J.Gen.Physiol.16:59)を、我々の研究所でTripsinaで調整した(y=1,9314x−0.682:R2=0.999)。実施例6で記載したクロマトグラフィーで得られたタンパク質分画を、この方法で分析した。p50はタンパク分解活性を示したが、それは7mMのEDTAで抑制され、したがってこの結果は金属プロテアーゼp25は酵素活性を示さないことを示す、図12。
MG2327からの25kDaの増殖抑制ポリペプチドの同定
25kDaのバンドに存在する増殖抑制活性を有するタンパク質の同定のために、MG2327を加えたSDS−PAGEゲル(実施例8で記載)を切断した。バンドは、それが完全にtranslucedするまで1mLのTris/HCl(100mM、pH8.5)緩衝液で5分間インキュベートした。バンドを約1mm3の小さな立方体に切断して、アセトニトリルで吸収し、12.5ng/μLの濃度までトリプシン又はLEPを含む重炭酸アンモニウム(25mM)の最小量で再水和した。ゲル内の消化は、37℃で18時間、温度調節ミキサー内でインキュベートした。
p50の同定
増殖抑制活性を有するタンパク質p50を特定するために、実施例6で記載した精製プロトコルから得られた50kDaタンパク質に対応するタンパク質分画を、Lys−Cエンドプロテイナーゼで消化した。ペプチドの同定は、自動Edman Degradacionによる配列決定及びFABキャノンを備えるJMS HX−110二重セクター質量分析計で実施した。これらの結果とSwissprot及びPIRソフトウェアで実施したアラインメントから、このタンパク質は50kDaの分子量を有するセラリシンファミリーであると結論づけた。主要な類似は、SwissprotバンクのPRZN_SERSP及びPRZN_SERMA識別子を有する種で見られた。質量分析計によって分析されたすべてのペプチドの分子質量は、同時だった予想する、Lys−Cエンドプロテイナーゼによるこれらの消化タンパク質のペプチドの期待理論(expect teorics)値に一致した。
クロマトグラフィーによる精製p25の同定
増殖抑制、アポトーシス及び抗血管新生活性を有する25kDaタンパク質を同定するために、実施例6で記載したDEAEクロマトグラフィーにより精製したp25を、SDS−PAGEに加えた。タンパク質バンドは500μLの水で5分間洗浄し、次にクエン酸溶液100mMで脱色し、その後milliQ水で新しく洗浄して、約1mm3の小さな立方体に切断した。次に、脱水されて過剰分が除去されるまでアセトニトリルを添加した。ゲル立方体を蒸発遠心機で完全に脱水し、その後、12.5ng/μLの濃度のトリプシンを含む炭酸水素アンモニウム溶液(50mM)中で再水和した。温度調節した攪拌機(mingler)中で30分インキュベートした後、37℃で終夜インキュベートした。
配列内には、成熟タンパク質には存在しないアミノ酸が見られる。これらのアミノ酸がない場合は、PRZN_SERSP及びPRZN_SERMAタンパク質の分子量はそれぞれ50595.4Da及び50293.4Daである。分子が異なるトリプシン性ペプチドが同定されたことは、両種が存在して共存物(coexistir)(緑(イタリック):質量分析で同定、栗色(強調):連続長方形中のエドマン分解による同定)を含むことを示唆する。ペプチド標識
が、実施例6で記載したクロマトグラフィーによって得られたp25で特定された。ペプチド標識
及び下線は、実施例6で記載したクロマトグラフィーによって得られたp50で特定され、(イタリックの)ペプチドはゲル断片から特定された。
N末端及びC末端の25kDaタンパク質
SDS−PAGEの25kDaでPRZN_SERMA/PRZN_SERの分解の一部と共存する可能性のあるタンパク質の分子の大きさを測定するために、その配列を作製してGenRunプログラムに導入した。25kDa(±2kDa)のN及びC末端に対応する断片を表7で示す。
MG2327によって誘導されるアポトーシス
MG2327は骨髄腫X63でアポトーシスを誘導し、断片化DNA、ミトコンドリア及び微小管を含む。
p25及びp50はアポトーシスを誘導する
MG2327によって誘導されるアポトーシス事象におけるp25及びp50の役割を確かめるために、それらを個々に異なる濃度でP3X63Ag8細胞に投与して、電顕法により分析した。すべての場合において、クロマチン凝縮、損傷したミトコンドリアクリステ及び集合したミトコンドリアが検出された。実際、MG2327によるアポトーシス誘導は、これらの2つのタンパク質の影響に関係する。
MG2327の抗血管新生効果及び抗増殖性ポリペプチド
マトリゲル内の管状構造物の発達
ヒト微小脈管構造由来のヒト内皮細胞(HMEC)を、MG2327、p25及びp50の非細胞傷害性濃度の下で培養した後に、マトリゲル上の内皮コード形成について評価した(Crum R、Szabo S、Folkman J.1985.Science.230:1375〜8、Vacca,A.、Ribatti,D.、Presta,M.、Minischettti,M.、Iurlaro,M、Ria,R、Albini,A、Bussolino,F.及びDammaacco,F.1999.Blood 93:3064)(Sanz.L.、Pascual,M.、Munoz,A.、Gonzalez,M.A.、Salvador CH、Alvarez−Vallina L.2002.Microvascular Research 63:335〜339)。結果は、Image−Pro Express 4.5パッケージを用いて計算した管状構造物の長さ及びそれらの間の接続の数を考慮した。それらは、MG2327調製物並びにそのp25及びp50分画による処理後の内皮細胞の分化又は成熟の有意な抑制(p<0.05、ANOVA)を示した(図15)。
増殖性細胞に及ぼすMG2327の間接効果
MG2327は、Balb/cマウスを骨髄性腫瘍移植片から保護する。
他のセラリシンのC末端ドメインも細胞傷害効果を有するがタンパク質分解活性はない
ATCC14756系統を実施例2に従ってCMIB4202系統と類似した条件の下で培養し、その培養液上清を実施例6で記載したように処理した。両方の調製物において、我々は50mMリン酸−0.2M NaCl、pH8.00、で溶出した50kDaレベルのタンパク質を観察した。これらのタンパク質は、10mMのEDTAで抑制され、5μMのZn2SO4で回復された酵素活性を示した。両タンパク質をCNBrで化学的に消化したが消化パターンは類似していて、配列の内部メチオニンから分子の末端までのp50のC末端に対応する約25kDaの類似した断片を生成した。
セラリシン断片と抗体又は抗体断片との組合せ
実施例6及び20で得られたポリペプチド断片を、モノクローナル抗体CB/ior−CEA.1(Tormo BらAPMIS 97:1073〜1080、1989)、その可変部、及び組換えDNA技術によってその配列から得られた抗体断片(diabody)(WO03/093315)と化学的にコンジュゲートした。コンジュゲートした生体分子は、実施例3で記載したものと類似した抗増殖アッセイを通してヒト腫瘍細胞系LoVo(ATCC CCL−229)、AsPC−1(ATCC CRL−1682)及びLS 174T(ATCC CL−188)で分析したが、これらのすべては培養内にCEAを発現した。コンジュゲートした断片は、非コンジュゲート型断片のそれらと同等の細胞傷害性濃度で用いると用量依存的反応を示したが、非コンジュゲート型分子では抗増殖反応は観察されなかった。コンジュゲートした断片は細胞上のCEAと結合することが、細胞ELISA及び間接免疫蛍光法(WO03/093315)のような手法を用いて明らかになった。これらの結果は、本明細書で記載したコンジュゲート体は癌の治療及び診断のために用いることができることを証明する。
Claims (12)
- 1つ又は複数のセラリシンのカルボキシ末端配列、即ち配列の内部メチオニンから分子末端までの1つ又は複数のポリペプチド断片、又はここで指摘した断片の変異体を含み、抗腫瘍効果をレシピエント生物に及ぼすことができ、前記抗腫瘍効果は治療的又は予防的であることを特徴とする医薬組成物。
- 前記セラリシン断片は遺伝子操作又は化学合成により細胞培養上清から得られる、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記断片又はそれらの変異体は、単独の、コンジュゲートした、又は混合した組成物で現れる、請求項1及び2に記載の組成物。
- 前記セラリシン断片の変異体又は変異体修飾が化学合成、遺伝子操作又は細胞培養上清から得られる、請求項1に記載の組成物。
- 前記セラリシン断片又はそれらの変異体は、遺伝子操作又は化学合成によって得られるキメラ又はハイブリッドの分子の一部でよい、請求項1、2、3、4に記載の組成物。
- ARA1、ARA2、ARA3及びARA4と命名され、配列リスト内でそれぞれ特定された配列番号1、配列番号2、配列番号3及び配列番号4を含むことを特徴とし、請求項1から5までに記載の、単独の、コンジュゲートした又は混合した組成物の一部であることを特徴とする、請求項1、2、3、4及び5に記載のセラリシン断片。
- 断片、それらに由来する遺伝的又は合成による変異体は抗腫瘍効果を誘導し、前記効果はレシピエント生物内で治療的又は予防的である、請求項6に記載のセラリシン断片ARA1、ARA2、ARA3及びARA4。
- 前記断片は抗体、抗体断片、核酸鎖又は炭水化物若しくはタンパク質の性質を有する分子を含む組成物の一部でよく、前記断片は単独、コンジュゲート体、混合体又は挿入体であり、レシピエント生物で治療的又は予防的な抗腫瘍効果を誘導する、請求項6及び7に記載のセラリシン断片ARA1、ARA2、ARA3及びARA4。
- 分子凝集体、単独体、それらの間の組合せ又はタンパク質若しくは炭水化物の性質を有する他の分子との組合せとしての前記組成物の一部であることを特徴とする、請求項6から8までに記載の単独の又は組み合わせたセラリシン断片ARA1、ARA2、ARA3及びARA4、又はそれらの断片。
- 成長因子受容体の過剰発現に関連した病理及び炎症性疾患の診断又はスクリーニングのための調製物の一部であることを特徴とする、請求項6から9までに記載の単独の又は組み合わせたセラリシン断片ARA1、ARA2、ARA3及びARA4、又はそれらの断片。
- 1つ又は複数のプロジギオシンを含み、前記プロジギオシンは指摘した組成物の抗腫瘍活性を強化することを特徴とする、請求項1から5までに記載の組成物。
- 免疫刺激剤、抗血管形成剤、アポトーシス剤、抗増殖剤、抗微生物剤、及び抗増殖性因子、アポトーシス因子、抗血管新生因子、免疫調節因子又は分化抑制因子のインデューサーとしての、請求項1から5までに記載の組成物の使用。
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