WO2006134960A1 - 抗炎症剤のスクリーニング方法 - Google Patents

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WO2006134960A1
WO2006134960A1 PCT/JP2006/311911 JP2006311911W WO2006134960A1 WO 2006134960 A1 WO2006134960 A1 WO 2006134960A1 JP 2006311911 W JP2006311911 W JP 2006311911W WO 2006134960 A1 WO2006134960 A1 WO 2006134960A1
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polypeptide
cells
tnfup
vascular endothelial
expression
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Hisanao Hiramatsu
Jun Ishizaki
Yoshinari Gahara
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Shionogi & Co., Ltd.
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    • G01N2800/26—Infectious diseases, e.g. generalised sepsis

Definitions

  • the present invention relates to a screening method for a vascular endothelial cell adhesion inhibitor and an anti-inflammatory agent.
  • vascular endothelial cells Various inflammatory diseases are caused by accumulation and infiltration of leukocytes in an inflamed lesion.
  • leukocytes In order for leukocytes to accumulate and infiltrate into lymph nodes or inflamed foci, it must first adhere to vascular endothelial cells.
  • This adhesion process includes the following three stages: 1) leukocyte rolling on vascular endothelial cells, 2) leukocyte activation, and 3) strong leukocyte adhesion to vascular endothelial cells.
  • the first rolling (stage 1)) is E-sele ctin, one of the cell adhesion molecules induced and expressed on vascular endothelial cells by inflammatory site force-in, and Sialyl Lewis X expressed on leukocytes.
  • Non-Patent Document 1 Molecular Medicine, 1995, No. 32, p. 90
  • the problem of the present invention is that various inflammations, which have a novel action mechanism of suppressing the expression of cell adhesion molecules and inhibiting adhesion of vascular endothelial cells to leukocytes, have been difficult to treat with conventional anti-inflammatory agents. It is to provide a simple screening system for obtaining useful substances having high therapeutic effects on sex diseases and autoimmune diseases.
  • the present inventors were found as a gene whose expression was induced in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) by addition of TNF-a, which is a kind of inflammatory site force-in.
  • Substances that decrease the expression level of the polypeptides encoded by these genes or inhibit the functions of the polypeptides are substances that suppress adhesion between vascular endothelium and leukocytes. It is considered to be an anti-inflammatory drug based on this mechanism.
  • a screening method for a vascular endothelial cell adhesion inhibitor comprising a step of measuring the expression level of a gene according to any of the following:
  • a screening method for a vascular endothelial cell adhesion inhibitor comprising the step of measuring the expression level of the polypeptide according to any of the following:
  • polypeptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, or 24, or
  • the screening method for a vascular endothelial cell adhesion-suppressing substance according to [6] above, further comprising a step of selecting a test substance that reduces the expression level of the cell adhesion molecule compared to the absence of the test substance;
  • a screening method according to any one of [1] to [11] above, which selects a vascular endothelial cell adhesion inhibitor as an anti-inflammatory drug.
  • FIG. 1 In the primary screening (Cell-ELISA) of Example 2d), the siRNA that showed an inhibitory effect on the expression of either ICAM-1, VCA M-l, or E-selectin The number of experiments was increased to 4 and the expression suppression effect of ICAM 1 was re-evaluated (Example 3a): secondary screening).
  • This graph shows 9 siRNAs (hatched or gray columns) targeting 6 genes that were determined to be inflammatory site force-in-induced polynucleotides from the experimental results of Example 3a) _c), negative control siRNA ( The results of secondary screening of the white column) and positive control siRNA (black column) are shown.
  • Each column shows the average value of absorbance at 490 nm obtained by four series of analysis, and error bars show the standard deviation.
  • the shaded columns indicate siRNA that showed a positive reaction by suppressing the expression of ICAM-1 in the primary screening, and the gray columns indicate siRNA that showed positive results for other adhesion molecules.
  • FIG. 2 In the primary screening (Cell-ELISA) of Example 2d), siRNA that showed an inhibitory effect on the expression of either ICAM-1, VCA M-l, or E-selectin was tested in the Cel 1 ELISA. The number was increased to 4 series, and the expression suppression effect of VCAM 1 was re-evaluated (Example 3a): secondary screening).
  • This graph shows 9 siRNAs (hatched or gray columns) targeting 6 genes that were determined to be inflammatory site force-in-induced polynucleotides from the experimental results of Example 3a) -c), negative control siRNA (White column) and secondary screening results of positive control siRNA (black column) are shown.
  • Each column shows the average value of absorbance at 490 nm obtained by four series analysis, and the error bar shows the standard deviation.
  • the shaded columns indicate siRNA that showed a positive reaction by suppressing the expression of VCAM-1 in the primary screening, and the gray columns indicate siRNA that showed positive results for other adhesion molecules.
  • FIG. 3 In the primary screening (Cell-ELISA) of Example 2d), siRNA that showed an inhibitory effect on the expression of any one of ICAM-1, VCA M-l, and E-selectin was tested in Cel 1 ELISA. Increase the number to 4 series and re-evaluate the E-selectin suppression effect (Example 3a): secondary screening).
  • This graph shows 9 siRNAs (hatched or gray columns) targeting 6 genes that were determined to be inflammatory site force-in-induced polynucleotides from the experimental results of Example 3a) -c), negative control siRNA ( (White column) and secondary control results of positive control siRNA (black column).
  • Each column shows the average value of absorbance at 490 nm obtained by analysis of 4 series, and error bars show the standard deviation.
  • the shaded columns indicate siRNA that showed a positive reaction by suppressing E-selectin expression in the primary screening, and the gray columns indicate siRNA that showed positive results for other adhesion molecules.
  • FIG. 4 In the primary screening (Cell-ELISA) of Example 2d), siRNA that showed ICAM-1 expression suppression effect was evaluated by quantitative PCR at the mRNA expression level.
  • This graph shows 7 siRNAs showing suppression of ICAM-1 expression among 6 siRNAs determined to be inflammatory site force-in-inducing polynucleotides from the experimental results of Example 3a) -c) ( The results for the shaded column), negative control siRNA (white column), and positive control siRNA (black column) are shown.
  • An asterisk (*) indicates that the difference in ⁇ Ct was 1 or more (50% or more expression decreased) compared to negative control siRNA.
  • ICAM-1 mRNA expression level ACt value
  • b It was evaluated by mRNA expression level ( ⁇ Ct value) whether each siRNA of a knocked down the target gene.
  • FIG. 5 In the primary screening (Cell-ELISA) of Example 2d), siRNA that showed VCAM-1 expression suppression effect was evaluated at the mRNA expression level by quantitative PCR.
  • This graph shows five siRNAs that showed suppression of VCAM-1 expression among 6 siRNAs that were determined to be inflammatory site force-in-induced polynucleotides from the experimental results of Example 3a) -c) ( The results for the shaded column), negative control siRNA (white column), and positive control siRNA (black column) are shown.
  • An asterisk (*) indicates that the difference in ⁇ Ct was 1 or more (50% or more expression decreased) compared to negative control siRNA.
  • ICAM-1 mRNA expression level ACt value
  • siRNA expression level ( ⁇ Ct value) whether each siRNA of a knocked down the target gene.
  • siRNA expression level ( ⁇ Ct value)
  • siRNA that showed an E-selectin expression inhibitory effect was evaluated at the mRNA expression level by quantitative PCR.
  • This graph shows eight siRNAs (diagonal lines) showing suppression of E-selectin expression among 6 siRNAs determined to be inflammatory site force-in-inducing polynucleotides from the experimental results of Example 3a) -c). Column), negative control siRNA (white column), and positive control siRNA (black column).
  • the asterisk (*) indicates that the difference in ⁇ Ct was 1 or more (50% or more expression decreased) compared to the negative control siRNA.
  • FIG. 7 In the primary screening (Cell-ELISA) of Example 2d), siRNA that showed an inhibitory effect on the expression of any of ICAM-1, VCA M-1, and E-selectin was transfected into HUVEC. We examined whether adhesion to THP-1 cells induced by TNF-a could be suppressed (4 series of experiments).
  • This graph shows nine siRNAs (shaded columns) targeting six genes that were determined to be inflammatory site force-in-induced polynucleotides from the experimental results of Example 3a) -c), negative control siRNA (white) Column) and positive control siRNA (black column). Each column shows the average value of fluorescence intensity obtained by four series of analysis, and the error bar shows the standard deviation.
  • FIG. 8 In the primary screening (Cell-ELISA) of Example 2d), siRNA that showed the expression suppression effect of any of ICAM-1, VCA M-1, and E-selectin was transformed into HUVEC, We examined whether adhesion with U937 cells induced by TNF-a could be suppressed (4 series of experiments).
  • This graph targets 6 genes that were determined to be inflammatory site force-in-induced polynucleotides based on the experimental results of Example 3a) -c). Analysis results of 9 siRNAs (shaded column), negative control siRNA (white column), and positive control siRNA (black column) are shown. Each column shows the average value of fluorescence intensity obtained by four series of analysis, and the error bar shows the standard deviation. The higher the fluorescence intensity, the more U937 cells are attached to HUVEC. Note that the asterisk (*) indicates 50% or more adhesion suppression compared to the negative control siRNA.
  • FIG. 9 In the primary screening (Cell-ELISA) of Example 2d), siRNA that showed an expression inhibitory effect of any of ICAM-1, VCA M-1, and E-selectin was transfected into HUVEC.
  • This graph shows 9 siRNAs (hatched columns) targeted to 6 genes determined to be inflammatory site force-in-induced polynucleotides from the experimental results of Example 3a) -c), negative control siRNA (white) Column) and positive control siRNA (black column). Each column shows the average value of fluorescence intensity obtained by four series of analysis, and the error bar shows the standard deviation. In addition, the higher the fluorescence intensity, the more MOLT-4 cells are attached to HUVEC. An asterisk (*) indicates that the adhesion suppression was 50% or more compared to the negative control siRNA.
  • FIG. 10 In the primary screening (Cell-ELISA) of Example 2d), siRNA that showed an inhibitory effect on the expression of any one of ICAM-1, VCA M-1, and E-selectin was transfected into HUVEC.
  • This graph shows 9 siRNAs (hatched columns) targeting 6 genes determined to be inflammatory site force-in-induced polynucleotides from the experimental results of Example 3a) -c), negative control siRNA ( (White column) and positive control siRNA (black column) analysis results.
  • Each column shows the average value of fluorescence intensity obtained by four series of analysis, and the error bar shows the standard deviation.
  • the higher the fluorescence intensity the more Jurkat cells adhere to HUVEC.
  • the asterisk (*) indicates 50% or more adhesion suppression compared to the negative control siRNA.
  • polynucleotide whose expression is increased by inflammatory site force-in refers to the addition of inflammatory site force-in (inflammatory property of human and Z or non-human mammals). It means a polynucleotide whose expression is increased by site force-in treatment.
  • Inflammatory site force-in refers to a site force-in that is deeply involved in inflammatory reactions associated with bacterial and viral infections, tumors, tissue damage, and the like.
  • interleukin 1 IL-1
  • interleukin 6 IL-6
  • interleukin 8 IL-8
  • TNF-a tumor necrosis factor
  • the polynucleotide whose expression increases by inflammatory site force-in treatment is specifically SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, or 23 in the sequence listing.
  • the polynucleotide which consists of a base sequence represented by these is included.
  • a polynucleotide having a nucleotide sequence in which a part of the nucleotide is substituted, deleted, or added to such a natural nucleotide sequence and exhibiting activity equivalent to that of the polynucleotide of the present invention is also a polynucleotide of the present invention. Included in nucleotides. Examples of nucleotide sequence modification include deletion introduction with restriction enzymes or DNA exonuclease, mutation introduction by site-directed mutagenesis, modification of nucleotide sequence by PCR using mutation primers, direct introduction of synthetic mutant DNA, etc. This method can be used.
  • polynucleotide whose expression level fluctuates due to inflammatory site force-in treatment is as follows: ⁇ selfi U table ⁇ selfi U number 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17,
  • ⁇ selfi U table ⁇ selfi U number 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17,
  • the ability to include, for example, a polynucleotide that can also include any one of the base sequences represented by 19, 21, or 23 is not limited thereto.
  • polynucleotide” in the present invention includes not only DNA but also mRNA and cDNA thereof. Ma It also includes full-length genes and EST (expression sequence tags).
  • the polynucleotide of the present invention whose expression is increased by inflammatory site force-in treatment is expressed by inflammatory site force-in treatment It is a polynucleotide whose amount varies, and an increase in expression can be confirmed by treating vascular endothelial cells with inflammatory site force-in. Specifically, for example, it can be identified by preparing total RNA from vascular endothelial cells by the method shown in Example 1 described later and then performing DNA microarray analysis.
  • a polynucleotide with significantly different expression levels was induced between umbilical vein endothelial cells treated with inflammatory site force-in and human umbilical vein endothelial cells not treated with inflammatory cytokine. It can be specified as a polynucleotide.
  • the identified polynucleotide is hereinafter referred to as “inflammatory site force-in-inducing polynucleotide”.
  • the amount of mRNA of a gene when inflammatory site force-in treatment is performed is determined by analysis using a DNA microarray sold by Affymetrix, Inc. or Agilent. If it is judged that the increase will be more than twice as compared with the case of untreated, real-time PCR system (quantitative PCR system) such as Applied System Co., Ltd. is also available. In this case, the amount of mRNA of the gene is 1 or more in terms of the difference in ⁇ CT value compared to the case where the inflammatory site force-in untreated, that is, the amount of mRNA is increased by 2 times or more.
  • the inflammatory site force-in-inducing polynucleotide thus identified is SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, or 23 of the sequence listing.
  • a polynucleotide comprising the represented base sequence can be mentioned.
  • each polynucleotide is allowed to hybridize under stringent conditions and is expressed by inflammatory site force-in. Elevating polynucleotides can also be included in the polynucleotides of the invention. Polynucleotides thus identified are also “inflammatory site force-in-inducing polynucleotides”. That is, the inflammatory site force-in-inducing polynucleotide of the present invention is the polynucleotide described in either one of the following 1) or 2).
  • “nobbridize under stringent conditions” means, for example, that in a commercially available hybridization solution Express Hybridization Solution (manufactured by Clontech), 68 Hybridize at ° C, or perform hybridization at 68 ° C in the presence of 0.7-1.0M NaCl using a filter with DNA immobilized, and then add 0.1-fold concentration. This refers to noblyzing under conditions that can be identified by washing with 68 ° C using an SSC solution (single-concentration SSC is 150 mM NaCl and 15 mM sodium citrate) and washing at 68 ° C.
  • SSC single-concentration SSC is 150 mM NaCl and 15 mM sodium citrate
  • Inflammatory site force-in-induced polynucleotide is significantly increased in human umbilical vein vascular endothelial cells by inflammatory site force-in treatment compared to when not treated, and cell adhesion caused by inflammatory site force-in Polynucleotides that affect the expression of molecules and changes in adhesion between Z or vascular endothelial cells and white blood cells, screening of substances that affect the expression of cell adhesion molecules and adhesion between vascular endothelial cells and white blood cells, etc. Can be used.
  • a specific assay method first, according to a known method such as a colony hybridization method or the like from a human cDNA library or the like using the identified inflammatory site force-inducing polynucleotide fragment as a probe. Obtain full-length cDNA. This full-length cDNA is introduced into appropriate cells and highly expressed, which affects the adhesion between vascular endothelial cells and white blood cells. It can be tested by examining whether or not it is capable of twisting.
  • an antisense nucleic acid against the total RNA of the gene to be tested can be introduced into a cell to examine how it affects the function of each target cell.
  • Another method of suppressing gene expression is to use double-stranded single-stranded RNA (siRNA) (“Jeans and Developments”), January 15, 2001, 15th, No. 2, p. 188-200).
  • siRNA can be introduced according to the method described in the literature, and the expression level of the gene targeted by siRNA and the expression level of cell adhesion molecules can be examined.
  • transforming cells are prepared according to “5. Method for producing transformed cells” described later, and the effects of the cells, specifically the expression level of cell adhesion molecules and adhesion to leukocytes, are affected. Can be considered.
  • a decrease in the expression level of cell adhesion molecules is observed in vascular endothelial cells that suppress the expression of inflammatory site force-in-inducing polynucleotides.
  • a siRNA for a DNA encoding a polypeptide having (a) a function of inducing cell adhesion molecule expression and Z or (b) a function of inducing adhesion between vascular endothelial cells and white blood cells is prepared, When transfected into human umbilical vein endothelial cells, the expression level of one or more cell adhesion molecules such as ICAM-1, VCAM-1, and E-selectin is significantly higher than that of the negative control. To lower.
  • the inflammatory site force-in inducing polypeptide which is an expression product of the inflammatory site force-in inducing polynucleotide, plays an important role in inducing cell adhesion molecules (cell adhesion molecule expression inducing function).
  • DNA that is expressed by SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, or 23 under stringent conditions is observed in vascular endothelial cells with suppressed expression of inflammatory site force-in-induced polynucleotides.
  • V in the presence of inflammatory site force-in, (a) a polypeptide having a function of inducing the expression of cell adhesion molecules, and Z or (b) a function of inducing the adhesion between vascular endothelial cells and leukocytes.
  • siRNA for the encoded DNA is prepared and transfected into the target cells, the amount of adhesion to white blood cells is significantly reduced compared to the negative control.
  • the inflammatory site force-in induced polypeptide an expression product of inflammatory site force-in-induced polynucleotide, plays an important role in inducing adhesion of vascular endothelial cells to white blood cells (induction of adhesion of vascular endothelial cells to leukocytes). Function).
  • the “inflammatory site force-in-inducing polypeptide” of the present invention is a polypeptide that can be used in the screening of the present invention that affects the induction of expression of cell adhesion molecules and adhesion between vascular endothelial cells and leukocytes in vascular endothelial cells. Means.
  • the inflammatory site force-inducing polypeptide in the present invention has a markedly increased expression in human umbilical vein vascular endothelial cells when treated with inflammatory site force in compared with the case where it is not treated, and cell adhesion in vascular endothelial cells.
  • a polypeptide encoded by the inflammatory site force-in-inducing polynucleotide of the present invention which can be used for screening for detecting a test substance that affects molecular expression induction or adhesion between vascular endothelial cells and white blood cells. It is.
  • the inflammatory site force-in-inducing polypeptide of the present invention has the function of inducing the expression of cell adhesion molecules and the contact of Z or vascular endothelial cells with leukocytes as described in 1.4 and 1.5 above. It plays an important role in arrival guidance.
  • the inflammatory site force-in inducing polypeptide that can be used in the screening of the present invention is the polypeptide described in either 1) or 2) below.
  • Polypeptide consisting of an amino acid sequence represented by self-column number 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 or 24, or
  • L0 amino acids have an amino acid sequence deleted, substituted, and Z or added, and in the presence of inflammatory site force-in (a) Induction of cell adhesion molecule expression A polypeptide having a function, and Z or (b) a function of inducing adhesion between vascular endothelial cells and white blood cells.
  • polypeptide of 2 the amino acid sequence represented by ⁇ or IJ number 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 or ⁇ 2 4
  • a polypeptide having (a) a function of inducing the expression of cell adhesion molecules and Z or (b) a function of inducing adhesion between vascular endothelial cells and white blood cells, for example, SEQ ID NOs: 2, 4, 6,
  • Fusion polypeptides are also included as long as they have (a) a function of inducing cell adhesion molecule expression and Z or (b) a function of inducing adhesion between vascular endothelial cells and white blood cells.
  • the marker sequence a sequence for easily confirming the expression of a polypeptide, confirming subcellular localization, purification, etc. can be used.
  • polypeptide includes a protein, a protein having a sugar chain added thereto, and a salt.
  • the inflammatory site force-in-inducing polypeptide can be synthesized in vitro or can be prepared by a known genetic engineering technique using a polynucleotide encoding this polypeptide.
  • a polynucleotide encoding a target protein is incorporated into a vector that can be expressed and then synthesized in a solution containing enzymes, substrates, and energy substances necessary for transcription and translation.
  • a force including, but not limited to, a Rabbit Translation System (RTS) manufactured by Roche Diagnostics.
  • RTS Rabbit Translation System
  • the target gene is cloned into an expression vector controlled by the T7 promoter and added to an in vitro reaction system.
  • mRNA is transcribed by T7 RNA polymerase from the truncated DNA, then translated by ribosomes in E. coli lysate, etc., and the desired polypeptide is synthesized in the reaction solution (Biochemica, 1, 20-23 ( 2001), Biochemica, 2, 28-29 (2001).
  • Transformed cells i.e., transformed cells expressing the polypeptide by transforming other prokaryotic or eukaryotic host cells with an expression vector comprising an inflammatory site force-in inducing polynucleotide
  • An antibody against an inflammatory site force-in-inducing polypeptide specifically recognizes an inflammatory site force-in inducing polypeptide or a part thereof.
  • Such antibodies can include, for example, antibodies that bind to any of the inflammatory site force-in inducing polypeptides and do not bind to any other protein.
  • Such an antibody can be used in a screening method for measuring the expression of a polypeptide described in the section of “6. Screening method” described later, and can also be used as a pharmaceutical composition containing an antibody.
  • the antibody may be prepared using a conventional method (eg, Neochemistry Experiment Course 1, Protein p. 389).
  • a hybridoma can be established by fusing antibody-producing cells that produce antibodies against myeloma cells with myeloma cells to obtain monoclonal antibodies.
  • a target polypeptide or a polypeptide having at least six consecutive partial amino acid sequences, or a derivative having any amino acid sequence or carrier added thereto is used.
  • the antigen polypeptide can be obtained by synthesizing a target polypeptide in vitro or by producing it in a host cell by gene manipulation. Specifically, after incorporating a polynucleotide encoding a desired polypeptide into an expressible vector,
  • a polynucleotide can be obtained.
  • polypeptide to be used as an antigen can be produced by the method described in the above section "3. Production of inflammatory site force-in-inducing polypeptide”.
  • the antibody obtained as described above can be used for various immunological measurement methods such as RIA method, ELISA method, fluorescent antibody method, passive hemagglutination reaction method and immunohistochemical staining.
  • an antibody that specifically binds to the target polypeptide a monoclonal antibody that specifically binds to the target polypeptide can be cited.
  • the method for obtaining the antibody is as described below.
  • myeloma Preparation of myeloma cells (hereinafter “myeloma”)
  • the ability to elaborate the method for producing a monoclonal antibody along the above-mentioned steps is not limited to this method.
  • antibody producing cells other than spleen cells and myeloma are used. It ’s all about using it.
  • the protein of the present invention prepared by the method as described above or a part thereof can be used. Furthermore, since the primary structure of the protein of the present invention has been clarified by the present invention, a partial peptide of the protein of the present invention is chemically synthesized using a method well known to those skilled in the art, and this is used as an antigen. You can also.
  • the antigen obtained in step (a) is mixed with Freund's complete or incomplete adjuvant, or an auxiliary agent such as potassium alum, and an experimental animal is immunized as an immunogen.
  • the experimental animal is not limited to the force most suitably used by the mouse.
  • the immunogen administration method for mouse immunization may be subcutaneous injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, intradermal injection, or intramuscular injection, but subcutaneous injection or intraperitoneal injection is preferred.
  • the immunization can be performed once or repeatedly at an appropriate interval (preferably at intervals of 1 to 5 weeks). Thereafter, the antibody titer against the antigen in the serum of the immunized animal is measured, and if an animal having a sufficiently high antibody titer is used as a source of antibody-producing cells, the effect of the subsequent operation can be enhanced. Generally, it is preferable to use antibody-derived cells derived from animals 3 to 5 days after the final immunization for subsequent cell fusion.
  • the antibody titer measurement method used here includes radioisotope immunoassay (hereinafter referred to as "RI A method”), solid-phase enzyme immunoassay (hereinafter referred to as "ELISA method”), fluorescent antibody method, Various known techniques such as the passive hemagglutination reaction method can be mentioned, but the RIA method or the ELISA method is more preferable from the viewpoint of detection sensitivity, rapidity, accuracy, and possibility of automation of operation.
  • RI A method radioisotope immunoassay
  • ELISA method solid-phase enzyme immunoassay
  • fluorescent antibody method Various known techniques such as the passive hemagglutination reaction method can be mentioned, but the RIA method or the ELISA method is more preferable from the viewpoint of detection sensitivity, rapidity, accuracy, and possibility of automation of operation.
  • the antibody titer in the present invention can be measured according to the procedure described below, for example, according to the ELISA method.
  • the purified or partially purified antigen is adsorbed on a solid phase surface such as a 96-well plate for ELISA, and the solid phase surface on which no antigen is adsorbed is a protein unrelated to the antigen, such as ushi serum albumin (hereinafter referred to as ⁇ BSA '').
  • ⁇ BSA '' protein unrelated to the antigen
  • an enzyme label as a second antibody is calculated by adding an antibody against the identified mouse antibody, binding it to the mouse antibody, adding the substrate for the enzyme after washing, and measuring the change in absorbance due to color development based on the degradation of the substrate.
  • a cell line generally obtained from mouse for example, 8-azaguan-metabolite mouse (derived from BALBZc) myeloma strain P3X63Ag8U.1 (P3-Ul) [Yelton, D. .. et al. Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1 — 7 (1978)], P3ZNSI Zl—Ag4—1 (NS— 1) [Kohler, G. et al. Europea n j. Immunology, 6, 511— 519 (1976) ], Sp2 Z ⁇ —Agl4 (SP—2) [Sh ulman, M. et al. Nature, 276, 269—270 (1978)]!
  • These cell lines can be prepared in a suitable medium such as 8-azaguanine medium [RPMI-1640 medium containing glutamine, 2-mercaptoethanol, gentamicin, and urinary fetal serum (hereinafter referred to as “FCS”).
  • FCS urinary fetal serum
  • FCS urinary fetal serum
  • FCS urinary fetal serum
  • FCS urinary fetal serum
  • FCS urinary fetal serum
  • FCS urinary fetal serum
  • FCS urinary fetal serum
  • FCS urinary fetal serum
  • FCS urinary fetal serum
  • FCS urinary fetal serum
  • FCS urinary fetal serum
  • FCS urinary fetal serum
  • FCS urinary fetal serum
  • IMDM Iscov modified Danolebco medium
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Antibody-producing cells are plasma cells and their precursor cells, lymphocytes, which can be obtained from any part of the body, generally the spleen, lymph nodes, peripheral blood, or a combination of these. Forces that can be obtained Forces that can be obtained Splenocytes are most commonly used.
  • the site where the mouse antibody-producing cells with a predetermined antibody titer are present is removed to prepare spleen cells that are antibody-producing cells.
  • the most commonly used method for fusing the spleen cells with the myeloma obtained in step (c) is a method using polyethylene glycol, which has a relatively low cytotoxicity and can be easily fused. This method includes, for example, the following procedure.
  • Splenocytes and myeloma are mixed with serum-free medium (eg RPMI1640) or phosphate buffered physiology. Wash well with saline solution (hereinafter “PBS”), mix so that the ratio of the number of spleen cells to myeloma is about 5: 1 to 10: 1, and centrifuge. The supernatant is removed, the precipitated cells are thoroughly loosened, and a serum-free medium containing 1 ml of 50% (wZv) polyethylene glycol (molecular weight 1000 to 4000) is added dropwise with stirring. Then slowly squeeze 10 ml of serum-free medium and centrifuge.
  • serum-free medium eg RPMI1640
  • PBS phosphate buffered physiology
  • HAT hypoxanthine 'aminopterin' thymidine
  • IL-2 mouse interleukin 2
  • the myeloma cell is an 8-azaguanine resistant strain, that is, when it is a hypoxanthine.guanine.phosphoribosyltransferase (HGPRT) deficient strain
  • HGPRT hypoxanthine.guanine.phosphoribosyltransferase
  • the non-fused myeloma cell and the fusion cell of myeloma cells are Cannot survive in medium containing HAT.
  • a fusion cell between antibody-producing cells, or a hybridoma between antibody-producing cells and myeloma cells can survive. Therefore, by continuing the culture in the HAT-containing medium, only the hyperidoma of the antibody-producing cells and the myeloma cells survives, and as a result, the hyperidoma can be selected.
  • the medium is replaced with a medium (hereinafter referred to as "HT medium") from which HAT medium power aminopterin is removed. Thereafter, a part of the culture supernatant is collected, and the antibody titer is measured, for example, by ELISA.
  • HT medium a medium from which HAT medium power aminopterin is removed.
  • the power exemplifying the method using the 8-azaguanine resistant cell line Other cell lines can also be used depending on the selection method of the hyperidoma, and in this case, the medium composition to be used also changes.
  • the hyperidoma that has been found to produce a specific antibody is transferred to another plate and cloned.
  • the plate is diluted so that one hyperidoma is contained in one well.
  • the limiting dilution method for culturing, the soft agar method for culturing in soft agar medium and collecting colonies, the method of extracting and culturing individual cells with a micro-uplator, and the separation of individual cells with a cell sorter The limiting dilution method is simple and often used.
  • the hybridoma is cultivated by changing the medium to normal medium with HT medium.
  • Large-scale culture is performed by rotary culture using a large culture bottle or spinner culture.
  • a monoclonal antibody that specifically binds to the protein of the present invention can be obtained.
  • ascites containing a large amount of the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by proliferating the mouse and the hybridoma within the abdominal cavity of the same strain of mice (for example, the above-mentioned BALBZc) or NuZNu mice.
  • a commercially available monoclonal antibody purification kit for example, MAbTrap GII kit; manufactured by Pharmacia
  • the monoclonal antibody obtained by force has high antigen specificity for the target polypeptide.
  • the isotype and subclass of the monoclonal antibody obtained by force can be determined as follows. First, identification methods include the Ouchterlony method, the ELISA method, or the RIA method. The octel-mouth method is simple. If the concentration of monoclonal antibody is low, a concentration procedure is required. On the other hand, when the ELISA method or RIA method is used, the culture supernatant is directly reacted with the antigen-adsorbed solid phase, and further, antibodies corresponding to various immunoglobulin isotypes and subclasses are used as secondary antibodies. It is possible to identify the isotype and subclass of a monoclonal antibody.
  • the monoclonal antibody of the present invention thus obtained can be used for detection or separation / purification of a target polypeptide utilizing its specificity.
  • a transformed cell useful for use in the screening of the present invention or for producing a polypeptide of interest is a host cell (prokaryotic) after incorporating an inflammatory site force-in-inducing polynucleotide into an appropriate vector DNA.
  • a host cell prokaryotic
  • Cells, eukaryotic cells can be transformed.
  • the method for producing the polynucleotide encoding the protein of interest is not particularly limited.
  • a method using PCR (i) a conventional genetic engineering method (that is, Or a method of selecting a transformant containing a desired cDNA from a transformant transformed with a cDNA library), or (ii) a chemical synthesis method. This is the method used.
  • a conventional genetic engineering method that is, Or a method of selecting a transformant containing a desired cDNA from a transformant transformed with a cDNA library
  • a chemical synthesis method This is the method used.
  • each manufacturing method will be described in turn.
  • a polynucleotide encoding a target polypeptide can be produced by the following procedure. That is, human cells or tissue powers capable of producing the target polypeptide also extract mRNA. Next, based on the base sequence of the polynucleotide encoding the target polypeptide, two sets of primer sets that can sandwich the entire length of mRNA corresponding to the target polypeptide, or a part of it Create one primer set that can sandwich the mRNA region. Reverse transcription enzyme Polymerase chain reaction (RT-PCR) can be used to obtain the full-length cDNA of the target polypeptide or a part thereof.
  • RT-PCR Reverse transcription enzyme Polymerase chain reaction
  • total RNA containing mRNA encoding the polypeptide of interest is known by known methods from cells or yarns and tissues (for example, spleen) having the ability to produce the polypeptide of interest. Extract. Extraction methods include, for example, guagin 'thiocyanate' hot ' It is preferable to use the guanidine thiocyanate cesium method, which can include the Nord method, the guanidine thiocyanate guanidine hydrochloric acid method, or the guanidine thiocyanate salt cesium method.
  • Cells or yarns and tissues that have the ability to produce the target polypeptide are, for example, Northern blotting methods using a polynucleotide encoding the target polypeptide or a part thereof, or specific for the target polypeptide. It can be identified by Western blotting using an antibody.
  • the extracted mRNA is purified.
  • the mRNA can be purified according to a conventional method. For example, mRNA can be purified by adsorbing it to an oligo (dT) cellulose column and then eluting it. If desired, mRNA can be further fractionated by sucrose density gradient centrifugation or the like. Further, a commercially available extracted and purified mRNA can also be used without extracting the mRNA.
  • the purified mRNA is subjected to a reverse transcriptase reaction in the presence of, for example, a random primer, oligo dT primer, and Z or a custom-synthesized primer to synthesize first strand cDNA.
  • This synthesis can be performed by a conventional method.
  • PCR can be carried out using two primers sandwiching the full length or a partial region of the target polynucleotide to amplify the target cDNA.
  • the obtained DNA is fractionated by agarose gel electrophoresis or the like. If desired, the DNA can be cleaved with a restriction enzyme or the like and connected to obtain the target DNA fragment.
  • the target DNA fragment can also be obtained from genomic DNA.
  • a polynucleotide encoding a target polypeptide can be produced by the following procedure. First, a single-stranded cDNA is synthesized using reverse transcriptase with the mRNA prepared by the above PCR method as a saddle, and then a double-stranded cDNA is synthesized from this single-stranded cDNA.
  • S1 nuclease method Esfstratiadis, A. et al., Cell, 7, 279-288, 1976
  • the Land method Land, H. et al., Nucleic Acids Res. 9, 2251-2266, 1981
  • the host cell when the host cell is Escherichia coli, the host cell is transformed by the method of Hanahan (Hanahan, DJ Mol. Biol. 166, 557-580, 1983), that is, CaCl, MgCl, or RbCl. Prepared
  • a lambda-type phage vector can be used as the vector.
  • methods for selecting a transformation having the target cDNA include, for example, the following (A) screening method using a synthetic oligonucleotide probe, (B) PCR (C) A method for screening by producing a target polypeptide in other animal cells, (D) A method for selecting using an antibody against the target polypeptide, or (E) Selective ' A method using a hybridization 'translation system can be employed.
  • a transformant having the target cDNA can be selected by the following procedure. That is, an oligonucleotide corresponding to all or a part of the target polypeptide is synthesized, and this is used as a probe (labeled with 32 P or 33 P). Hybridization is performed, and the obtained positive strain is searched and selected.
  • synthesizing an oligonucleotide for a probe it can be a nucleotide sequence derived using codon usage, or a plurality of nucleotide sequences combining possible nucleotide sequences. . In the latter case, the type can be reduced by including inosine.
  • a transformant having a target cDNA can be selected by the following procedure. That is, each of the oligonucleotides of the sense primer and antisense primer corresponding to a part of the target polypeptide is synthesized, and these are combined and PCR is performed to amplify a DNA fragment encoding all or part of the target polypeptide.
  • the eyelid DNA used here is CDNA synthesized by reverse transcription from the mRNA of a cell producing a target polypeptide or genomic DNA can be used.
  • the DNA fragment thus prepared is labeled with, for example, 32P or 33P, and colony hybridization or plaque hybridization is performed using this as a probe, thereby transforming the target cDNA. Select a stock.
  • a transformant having the target cDNA can be selected by the following procedure. That is, the transformant is cultured, the polynucleotide is amplified, the polynucleotide is transferred to animal cells, and the polypeptide encoded by the polynucleotide is produced on the cell surface.
  • a plasmid capable of self-replication and containing a transcription promoter region, or a plasmid that can be integrated into the chromosome of an animal cell can be used.
  • a transformant having the target cDNA is selected from the original transformants.
  • a transformant having the target cDNA can be selected by the following procedure. That is, cDNA is preliminarily incorporated into an expression vector, a polypeptide is produced on the cell surface of the transformed strain, and a desired polypeptide-producing strain is detected using an antibody against the target polypeptide and a secondary antibody against the antibody. Then, select a transformant having the target cDNA.
  • a transformant having the target cDNA can be selected by the following procedure.
  • the cDNA obtained from the transformation was blotted onto a nitrocellulose filter or the like, and the mRNA that was separately prepared for the cell force having the ability to produce the desired polypeptide was noidized and then the mRNA bound to the cDNA. Is dissociated and recovered.
  • the recovered mRNA can be injected into an appropriate polypeptide translation system, such as Xenopus oocytes, or translated into a polypeptide using a cell-free system such as rabbit reticulocyte lysate or wheat germ. Let Detect with an antibody against the polypeptide of interest A transformant having a target cDNA is selected.
  • a method for collecting a polynucleotide encoding a target polypeptide from the obtained transformant of interest is a known method (for example, Maniatis, T. et al., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor”). Laboratory, NY, 1982. For example, it can be carried out by separating a fraction corresponding to plasmid DNA from cells and cutting out the cDNA region from the obtained plasmid DNA.
  • a polynucleotide encoding a target polypeptide can be produced by binding a DNA fragment produced by the chemical synthesis method.
  • Each DNA can be synthesized using a DNA synthesizer [for example, Oligo 1000M DNA Synthesizer (Beckman) or 394 DNA / RNA Synthesizer (Applied Biosystems)].
  • the polynucleotide encoding the target polypeptide can be determined based on the information of the target polypeptide, for example, the phosphite 'Triestenore method (Hunkapiller, M. et al., Nature, 10, 105-111, 1984), etc.
  • the codons for the desired amino acid are known per se and can be selected arbitrarily.
  • the codon usage can be determined according to conventional methods in consideration of the codon usage frequency of the host to be used (Crantham, R. et al. , Nucleic Acids Res. 9, 43-74, 1981).
  • partial modification of the codons of these nucleotide sequences can be performed by site-specific mutagenesis (Mark, DF) using a primer composed of a synthetic oligonucleotide encoding the desired modification according to a conventional method. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666, 1984).
  • DNA sequencing thus obtained can be performed, for example, by Maxam Gilbert's chemical modification method (Maxam, AM and Gilbert, W. "Methods in Enzymology", 65, 49 9-559, 1980). This can be done by the xynucleotide chain termination method (Messing, J. and Vieira, J. Gene, 19, 269-276, 1982).
  • prokaryotic host cells include Escherichia coli and Bacillus subtilis. Transform the gene of interest into these host cells
  • a host cell is transformed with a plasmid vector that contains a replicon or origin of origin from a species compatible with the host and regulatory sequences.
  • the vector preferably has a sequence capable of imparting phenotypic (phenotypic) selectivity to transformed cells.
  • the K12 strain is often used as Escherichia coli, and the vector is generally capable of using pBR 322 or pUC-based plasmids, and is not limited to these, and any of various known strains and vectors can be used. .
  • trp tryptophan
  • lac lactose
  • tac tryptophan 'latatose
  • lpp lipoprotein
  • Tu polypeptide chain elongation factor Tu
  • Bacillus subtilis for example, the strain 207-25 is preferred.
  • pTUB228 Ohmura, K. et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93 can be used. Power It is not limited to this.
  • Eukaryotic host cells include vertebrates, insects, yeast, and the like.
  • vertebrate cells include COS cells (Gluzman, Y. (1981) Cell 2), which are monkey cells. 3, 175-182, ATCC: CRL-1650), Chinese'no, Muster ovary cells (CHO cells, Hacchojiji: 0 ⁇ -61), dihydrofolate reductase-deficient strains (1; 1: 1: 1 & 111), G. and Chas in, LA (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220) Forces used in equal force Not limited to these.
  • an expression promoter for vertebrate cells a promoter that is usually located upstream of the gene to be expressed, an RNA splice site, a polyadenylation site, a transcription termination sequence, and the like can be used. May have a replication origin if necessary.
  • expression vectors include pCR3.1 having a cytomegalovirus early promoter (Invitrogen), pSV2dhfr having an SV40 early promoter (Subra mani, S. et al. (1981) Mol. Cell. Biol 1, 854- 864) Equivalent force ⁇ The power mentioned is not limited to this.
  • the expression vector has an SV40 replication origin, and can self-propagate in COS cells, and further, a transcription promoter, transcription termination signal. , And those with RNA splice sites can be used.
  • the expression vector is composed of a jetylaminoethyl (DEAE) -dextran method (Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res. 11, 1295-130 8), a calcium phosphate-DNA coprecipitation method ( Graham, FL and van der Eb, AJ (1973) Virology 52, 456-457), and electric pulse perforation (Neumann, E. et al. (1982) EMBO J.
  • a jetylaminoethyl (DEAE) -dextran method Lithman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res. 11, 1295-130 8
  • a calcium phosphate-DNA coprecipitation method Graham, FL and van der Eb, AJ (19
  • the desired transformed cells can be obtained by force.
  • CHO cells When CHO cells are used as host cells, a vector capable of expressing a neo gene that functions as an antibiotic G418 resistance marker together with an expression vector, such as pRSVneo (Sambrook, J. et al. (1989): 'Molecular Cloning A Laboratory Manual and Old Spring Harbor Laboratories, NY) and pSV2neo (Southern, PJ and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, 327—341).
  • pRSVneo Standardbrook, J. et al. (1989): 'Molecular Cloning A Laboratory Manual and Old Spring Harbor Laboratories, NY
  • pSV2neo Southern, PJ and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, 327—341.
  • ovarian cell-derived cell lines of Spodoptera frugip erda (Sf-9 or Sf-21) of Lepidoptera, Trichoplusia ni egg cells High Five cells (Wickham, TJ et al, (1992) Biotechnol. Prog. I: 39 1-396) is often used as a host cell, and the baculovirus transfer vector is a promoter of the polyhedrin protein of autographer nuclear polyhedrosis virus (AcNPV). PVL1392Z1393 is often used (Kidd, IM and VC Emery (199 5), The use of baculoviruses as expression vectors.
  • vectors using P10 of baculovirus and promoters of the same basic protein can also be used.
  • yeast As an expression system using a eukaryotic microorganism as a host cell, yeast is generally well known, and among them, a yeast of the genus Saccharomyces, for example, a non-yeast Saccharomyces cerevisiae and a petroleum yeast Pichia pastoris are preferable.
  • expression vectors for eukaryotic microorganisms such as yeast include alcohol dehydrogenase gene promoters (Bennetzen, JL and Hall, B. d. (1982) J. Biol. Chem. 257, 3018-3025) and acidic vectors.
  • a phosphatase gene promoter (Miyanohara, A. et al. (1983) Proc. Natl. Acad.
  • a secreted protein When expressed as a secreted protein, it can also be expressed as a recombinant having a secretory signal sequence and an endogenous protease possessed by the host cell or a known protease cleavage site on the N-terminal side.
  • a secretory signal sequence For example, in a system in which human mast cell tryptase of trypsin type serine protease is expressed in petroleum yeast, the secretion signal sequence of yeast ⁇ -factor and the cleavage site of ⁇ 2 protease possessed by petroleum enzyme are connected to the N-terminal side. Is known to secrete active tryptase into the culture medium (Andrew, L. Niles, et al. (1998) Biotechnol. Appl. Biochem. 28, 125-131).
  • the transformant obtained as described above can be cultured according to a conventional method, and the desired polypeptide is produced intracellularly or extracellularly by the culture.
  • a medium that can be used for the culture various media that are conventionally used can be appropriately selected according to the employed host cells.
  • a serum component such as fetal bovine serum (FBS)
  • FBS fetal bovine serum
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle minimum essential medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's minimum essential medium
  • FBS fetal bovine serum
  • Recombinants produced inside or outside of the transformant by the above-described culture can be separated into various known separations using the physical properties and biological properties of the target polypeptide. It can be separated and purified by the operation method. Specific examples of the method include treatment with an ordinary protein precipitant, ultrafiltration, molecular sieve chromatography (gel filtration), Examples include adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, various liquid chromatography such as high performance liquid chromatography (HPLC), dialysis methods, and combinations thereof. In addition, by connecting histidine having 6-residue force to the recombinant protein to be expressed, it can be efficiently purified on a nickel-affinity column.
  • the target polypeptide can be easily produced in large quantities with high yield and high purity.
  • the molecular weight of the purified polypeptide can be determined by a usual method such as mass spectrometry or SDS-PAGE.
  • mass spectrometry or SDS-PAGE.
  • splicing variants may exist, these polypeptides are also included in the target polypeptide as long as they have the same function (biological activity) as the target polypeptide.
  • the target polypeptide produced inside and outside the cell is subjected to various well-known separation operations using the physical properties and biochemical properties of the polypeptide. It can be separated and purified by the method. Specifically, for example, by culturing cells expressing the desired polypeptide, suspending them in a buffer, homogenizing, and centrifuging, a fraction containing the desired polypeptide can be obtained. .
  • solubilizing the obtained fraction After solubilizing the obtained fraction, treatment with a normal protein precipitating agent, ultrafiltration, various liquid chromatography [eg molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchanger chromatography] , Affinity chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC), etc.], dialysis, or a combination thereof, and the like, the desired polypeptide can be purified.
  • a solubilizing agent that is as gentle as possible (eg, CHAPS, Triton X-100, or dichitone). Can be held.
  • the target polypeptide is fused and expressed in-frame with the marker sequence, thereby facilitating confirmation of polypeptide expression, confirmation of intracellular localization, purification, and the like.
  • the marker sequence include a FLAG epitope, a hexarhistidine 'tag, a hemadalchun' tag, and a myc epitope.
  • a protease for example, enterokinase, factor Xa, or thrombin
  • a muscarinic acetylcholine receptor and a hexerhistidine 'tag are linked by a thrombin recognition sequence (Hayashi, MK and Haga, TJ Biochem. 120, 12 32-1238, 1996).
  • the polypeptide used in the screening method of the present invention is regarded as a polypeptide encoded by a gene whose expression level is increased by adding TNF-a, which is a kind of inflammatory site force-in, to vascular endothelial cells. It was issued. As shown in the Examples, it is particularly difficult to induce expression of cell adhesion molecules such as ICAM-1, VC AM-1, and E-selectin and adhesion of vascular endothelial cells to leukocytes.
  • a substance that suppresses the function of the polypeptide suppresses the expression of cell adhesion molecules, and thus a substance that inhibits adhesion of vascular endothelial cells to white blood cells (hereinafter referred to as “inhibition of adhesion of vascular endothelial cells”).
  • Such substances inhibit adhesion between vascular endothelial cells and leukocytes, and can be applied to inflammatory diseases, autoimmune diseases, asthma, psoriasis, transplant rejection, rheumatoid arthritis, etc. However, indications for inflammatory diseases are most preferred.
  • screening for an anti-inflammatory drug can be performed by measuring the expression level of at least one of the polypeptide or a polynucleotide encoding the polypeptide.
  • test substance used in the present screening method refers to a substance to be examined for the effect of promoting or suppressing the function of the polypeptide of the present invention by the screening method of the present invention.
  • test substance include compounds, microbial metabolites, extracts of plants and animal tissues, derivatives thereof, and mixtures thereof.
  • nucleic acids or derivatives thereof designed to increase the expression level of the polynucleotide of the present invention can be used as test substances.
  • the dose and concentration of the test substance can be set as appropriate, or can be administered in an appropriate state such as an individual or a liquid that can be set in multiple doses by creating a dilution series, for example.
  • it can be added to a medium and cultured. When added to the medium, it may be added at the start of the culture or added during the culture. The number of additions is not limited to one.
  • the period of culturing in the presence of the test substance may be set appropriately, but preferably 30 minutes force is 48 hours.
  • the administration form such as oral administration, intravenous injection, intraperitoneal injection, transdermal injection, and subcutaneous injection is properly used depending on the physical properties of the test substance.
  • the time from administration to obtaining a sample can be appropriately selected.
  • the cells used in this screening method express inflammatory site force-inducing polypeptide, and are caused by vascular endothelial cells, cells derived from vascular endothelial cells, or inflammatory site force-in such as TNF-a. Any cell that expresses the same inflammatory reaction that occurs in vascular endothelial cells upon stimulation can be used without particular limitation. Moreover, if it shows the same reaction as a human, it can be used without being restricted to the animal species of the cell.
  • Endovascular cells (HUVEC), human microvascular endothelial cells (HMEC-1), etc. are medium for vascular endothelial cells (manufactured by Cell Applications)! / ⁇ is MCD B131 medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) ( Those cultured in Invitrogen) can be used.
  • FBS fetal bovine serum
  • vascular endothelial cells When vascular endothelial cells are used in carrying out this screening method, it is desirable to stimulate the cultured cells in order to reproduce the inflammatory state in vivo.
  • Specific examples include a method of adding inflammatory site force-in, LPS, pertussis toxin, and the like to the medium.
  • Inflammatory site force-in refers to site force-in that is deeply involved in inflammatory reactions associated with bacterial and viral infections, tumors, tissue damage, and the like.
  • IL-1 interleukin 1
  • IL-6 interleukin 6
  • TNF-spider tumor necrosis factor
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor
  • a whole cell extract or a nuclear extract fraction of cultured cells cultured in the presence or absence of a test substance can be used.
  • An extract is preferred. If necessary, the whole cell extract is centrifuged at high speed to remove insoluble substances, and then used for the preparation of ELISAZRIA samples and Western blot samples.
  • a substance that decreases the expression level of the polypeptide is a substance having an ability to suppress adhesion of vascular endothelial cells. Specifically, these substances can be obtained by a screening method including the following steps.
  • a screening method for a vascular endothelial cell adhesion inhibitor comprising a step of measuring the expression level of a gene according to any of the following:
  • a screening method for a vascular endothelial cell adhesion inhibitor comprising the step of measuring the expression level of the polypeptide according to any of the following:
  • Polypeptide consisting of amino acid sequence represented by self-sequence number 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 or 24, or
  • DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, or 23, or 2) Hybridizes under stringent conditions with DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, or 23, and inflammation In the presence of sex site force-in! /, (A) encoding a polypeptide having a function of inducing the expression of cell adhesion molecules, and Z or (b) a function of inducing adhesion between vascular endothelial cells and white blood cells A step of contacting a test substance with a cell transformed with an expression vector containing, and expressing a polypeptide encoded by the gene; and
  • a screening method for a vascular endothelial cell adhesion inhibitor is provided.
  • a method of detecting using an inflammatory site force-in-induced polynucleotide as an index there is a method of detecting using an inflammatory site force-in-induced polynucleotide as an index.
  • a polynucleotide a polynucleotide having the sequence of all or a part of the sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, and 23 in the sequence listing Is mentioned.
  • the polynucleotide can be measured according to the following method.
  • the cultured cells used in the method of the present invention are cultured under such conditions as long as one of the target polynucleotides can be expressed when no test substance is added. May be.
  • culture conditions established for the cultured cells are known, and when the cells express the target polynucleotide under the conditions, the cells may be cultured under the conditions.
  • RNA extraction methods include guanidine thiocyanate 'salt-cesium ultracentrifugation, guanidine thiocyanate, hot phenol method, guanidine hydrochloric acid method, guanidine acid thiocyanate' phenol 'black mouth form method. (Chomczynski ⁇ P. and Sacchi ⁇ N., (1987) Anal. Biochem., 162, 156-159) and the like. The acid guanidine thiocyanate 'phenol' black mouth form method is suitable.
  • RNA extraction reagents for example, IS OGEN (manufactured by Futtsubon Gene), TRIZOL reagent (manufactured by Invitrogen), etc. can be used according to the protocol attached to the reagent.
  • the total RNA obtained is preferably further purified to only mRNA if necessary. Yes.
  • the purification method is not particularly limited, but most mRNAs present in the cytoplasm of eukaryotic cells are known to have a poly (A) sequence at the 3 ′ end. MRNA is adsorbed to the oligo (dT) probe, and the paramagnetic particles to which streptavidin is immobilized are captured using the binding between piotin Z streptavidin, washed, and then eluted. Thus, mRNA can be purified. Alternatively, a method may be employed in which mRNA is adsorbed on an oligo (dT) cellulose column and then eluted and purified.
  • mRNA can be further fractionated by sucrose density gradient centrifugation or the like.
  • these mRNA purification steps are not essential. As long as it is possible to detect the expression of the polynucleotide encoding the inflammatory site force-in-inducing polypeptide, all RNAs can be detected. This is used in the subsequent process.
  • the expression level of the inflammatory site force-in-induced polynucleotide may be measured by solid-phased samples such as RT-PCR, ribonuclease protection assay, run-on assay, gene chip, etc. Forces that can be carried out according to nucleic acid hybridization using a PCR. It is particularly preferred to carry out using RT-PCR.
  • PCR is performed to specifically amplify a DNA fragment.
  • an antisense primer complementary to a specific partial sequence of the target mRNA and a reverse transcriptase generated from the antisense primer are used.
  • a sense primer complementary to a specific partial sequence in the cDNA sequence is used.
  • RT-PCR can be performed using a commercially available kit (for example, RNA PCR kit AM V ver. 2.1: manufactured by Takarabio Co., Ltd.) according to the manual attached to the kit, but can also be performed by the following method.
  • the antisense primer used for both the reverse transcriptase reaction and the PCR is substantially a sequence in the antisense sequence of the nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the inflammatory site force-in inducing polypeptide of the present invention.
  • the nucleotide sequence consists of 15 to 40 nucleotides, preferably at least 18 to 30 nucleotides, more preferably 23 to 30 nucleotides.
  • the sequence of the sense primer used in PCR is the nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the inflammatory site force-inducing polypeptide of the present invention, and the sequence corresponding to the complementary strand of the antisense primer.
  • a nucleotide sequence irrelevant to may be added as a linker. However, it is preferable that the linker does not cause non-specific annealing with the nucleic acid in the reaction solution during the reaction so as not to hinder the detection of a specific polynucleotide.
  • RT-PCR reactions can be performed by conventional methods. Note that samples for detection by RT-PCR do not usually need to be purified to poly (A) + RNA.
  • the reaction solution is electrophoresed to detect whether or not a band of the desired size has been amplified.
  • PCR is performed under the same conditions using a serially diluted cDNA clone as a standard vertical DNA, and the number of temperature cycles capable of quantitative detection is determined, or for example, 5 Sample a portion of the reaction solution for each cycle and perform electrophoresis.
  • radiolabeled dCTP during PCR reaction, the amount of radioactivity incorporated into the band can be quantified as an index.
  • competitive RT-PCR method (Souaze et al. (1996) BioTechniques 21, 280-285) improved from the above RT-PCR method, TaqMan PCR method (Heid et al. ( 1996) Genom. Res. 6, 986-994) is also possible.
  • the detection results were compared between a sample derived from a cell cultured in the presence of the test substance and a sample derived from a cell cultured in the absence of the test substance. As a result, the expression of the target polynucleotide was determined.
  • the test substance having a reduced amount is a substance that suppresses the function of the polypeptide of the present invention, and suppresses adhesion of vascular endothelial cells resulting from the expression of the polypeptide, thereby treating or preventing an anti-inflammatory agent Can be.
  • the screening method of the present invention there is a method for detecting an inflammatory site force-inducing polypeptide (protein). Specifically, the expression level of the polypeptide can be measured by the following embodiment.
  • the method for measuring the polypeptide expression level a method using an antibody will be described.
  • the antibody used at this time can be prepared according to the description in “4. Antibody to inflammatory site force-in-inducing polypeptide” above.
  • the polypeptide in the sample is solid-phased on the inner bottom of a well or membrane of a multiwell plate such as a 96-well plate or 384-well plate, and then the inflammatory site force-in-inducing polypeptide is specifically recognized. Detection using the antibody to be performed is performed.
  • multiwell plates such as 96-well plates and 384-well plates is a method generally called solid-phase enzyme immunoassay (ELISA) or radioisotope immunoassay (RIA).
  • ELISA solid-phase enzyme immunoassay
  • RIA radioisotope immunoassay
  • a method of solidifying on the membrane a method of transferring the polypeptide to the membrane through polyacrylamide electrophoresis of the sample (Western plot method), or directly imbibing the sample or its diluted solution into the membrane, V, The so-called dot blot method and slot blot method can be mentioned.
  • a whole cell extract or a nuclear extract fraction of cultured cells cultured in the presence or absence of a test substance can be used. Is preferred. If necessary, the whole cell extract is centrifuged at high speed to remove insoluble substances, and then used for the preparation of ELISAZRIA samples and Western blot samples.
  • sample for ELISAZRIA for example, a whole cell extract of cultured cells cultured in the presence or absence of a test substance is used as it is, or a sample diluted appropriately with a buffer is used.
  • Samples for western plotting are for example in the presence or absence of the test substance Either use the whole cell extract of cultured cells cultured in the state as it is, or dilute it appropriately with a buffer, and sample buffer containing 2-mercatolethanol for SDS-polyacrylamide electrophoresis (manufactured by Sigma, etc.) Mix with.
  • a dot Z slot plot for example, using a blotting apparatus, using a whole cell extract of cultured cells cultured in the presence or absence of the test substance, or appropriately diluted with a buffer. Adsorb directly to membrane.
  • the sample is precipitated by immunoprecipitation, a method using ligand binding, etc., and detected without immobilization. It is also possible to immobilize the sample to be detected as it is.
  • the membrane used for Western blotting, dot blotting or slot blotting may be a nitrocellulose membrane (for example, manufactured by Norad) or a nylon membrane (for example, High Bond-ECL (for example). Amersham (manufactured by Falmacia)), or poly-vinylidene difluoride (PVDF) membrane (for example, manufactured by Biorad).
  • a wet blotting method (CURRENT PROTOCOLS IN IMMUN OLOGY volume 2 ed by JE Coligan, AM Kruisbeek, DH Mar gulies, EM Shevach, W. Strober), semi-dry blotting method (see CU RRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY volume 2 above), and the like.
  • Equipment for dot plotting and slot plotting is also commercially available (eg, 'No' dot (Bio-Rad)).
  • a sample or a diluted solution thereof (for example, 0.05) is put on a dedicated 96-well plate (for example, Imunoplate Maxi Soap (Nunk)). Place in phosphate buffered saline containing% sodium azide (diluted with “PBS”) and leave at 4 ° C to room temperature for 1 to 3 hours at 37 ° C. To adsorb the polypeptide on the inner bottom of the well and immobilize it.
  • PBS phosphate buffered saline containing% sodium azide
  • An antibody is used for detection in cooperation with a labeled secondary antibody that directly labels it or uses the antibody as a primary antibody and specifically recognizes the antibody (recognizes an antibody from the animal from which the antibody was produced). .
  • the preferred label type is an enzyme (alkaline phosphatase or horseradish peroxidase) or piotin (however, an operation for binding an enzyme-labeled streptavidin to the secondary antibody piotin is added).
  • Various pre-labeled antibodies (or streptavidin) are commercially available for methods using labeled secondary antibodies (or labeled streptavidin).
  • RIA use an antibody labeled with a radioisotope such as 1125, and measure using a liquid scintillation counter.
  • the amount of polypeptide as an antigen is measured.
  • substrates that develop color or emit light by the catalyst of these enzymes are commercially available.
  • a substrate that develops color When used, it can be detected visually in the Western plot method or the dot Z slot plot method.
  • quantification is preferably performed by measuring the absorbance of each well (measurement wavelength varies depending on the substrate) using a commercially available microplate reader.
  • a dilution series of the antigen used for antibody production in (3) above is prepared, and this is used as a standard antigen sample, and the detection operation is performed simultaneously with other samples, and the standard antigen concentration and measured values are plotted. By creating a curve, it is possible to quantify the antigen concentration in other samples.
  • the membrane is previously placed in a buffer containing substances that inhibit such nonspecific adsorption (skimmed milk, casein, ushi serum albumin, gelatin, polyvinylpyrrolidone, etc.). Perform a soaking operation (blocking).
  • a buffer containing substances that inhibit such nonspecific adsorption for example, phosphate buffered saline (PBS) or Tris buffered saline (TBS) containing 5% skim milk, 0.05 force, etc. and 0.1% Tween 20 is used.
  • PBS phosphate buffered saline
  • TBS Tris buffered saline
  • Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), 1 to 10% ushiserum albumin, 0.5 to 3% gelatin or 1% polybulurpyrrolidone may be used.
  • the blocking time is 16 to 24 hours at 4 ° C or 1 to 3 hours at room temperature.
  • the membrane was washed with PBS or TBS (hereinafter referred to as "washing solution") containing 0.05% force or 0.1% Tween20 to remove excess blocking solution, and then the above (3)
  • the antibody prepared by the method described above is immersed in a solution appropriately diluted with a blocking solution for a certain period of time to bind the antibody to the antigen on the membrane.
  • the dilution ratio of the antibody at this time can be determined, for example, by conducting a preliminary Western blotting experiment using a serial dilution of the recombinant antigen described in 3) above as a sample.
  • This antibody reaction operation is preferably performed at room temperature for 2 hours. After completion of the antibody reaction operation, the membrane is washed with a washing solution.
  • the detection operation can be performed immediately. If an unlabeled antibody is used, a secondary antibody reaction is subsequently performed.
  • the labeled secondary antibody should be diluted 2000 to 20000 times with a blocking solution (if a suitable dilution factor is described in the attached instructions, follow that description).
  • a blocking solution if a suitable dilution factor is described in the attached instructions, follow that description.
  • blocking is performed in advance as in the case of the Western plot.
  • the blocking conditions are as described in the Western blot section. It is.
  • washing solution PBS or TBS containing 0.05% Tween20 or 0.05%
  • a solution prepared by appropriately diluting the antibody prepared by the method described above with a washing solution is dispensed and incubated for a predetermined time to bind the antibody to the antigen.
  • the dilution ratio of the antibody at this time can be determined by conducting a preliminary ELISA experiment using, for example, a serial dilution of the recombinant antigen described in (3) above as a sample. This antibody reaction operation is preferably performed at room temperature for about 1 hour.
  • the inside of the well is washed with a washing solution.
  • the detection operation can be performed immediately. If an unlabeled antibody is used, a secondary antibody reaction is subsequently performed.
  • the labeled secondary antibody should be diluted 2000 to 20000 times with a washing solution (if a suitable dilution factor is described in the attached instructions, follow that description). .
  • the primary antibody is washed away, dispense the secondary antibody solution into the well, incubate at room temperature for 1 to 3 hours, wash with the washing solution, and perform the detection procedure according to the labeling method.
  • the washing operation is performed by first dispensing the washing solution into the well and shaking for 5 minutes, then replacing the washing solution with a new one, shaking for 5 minutes, and then changing the washing solution again and shaking for 5 minutes. . If necessary, the cleaning solution can be changed and cleaned.
  • the so-called sandwich ELISA can be carried out, for example, by the method described below.
  • One of these antibodies is labeled as described in (4) above.
  • the antibody with the stronger label is immobilized on the inner bottom surface of the 96-well ELIS A plate according to the method described in (2) above. After blocking, place the sample solution in a well and incubate at room temperature for 1 hour. After washing the wells, dispense the diluted antibody dilution to each well and incubate. Wash the inside of the well again and perform the detection operation according to the labeling method.
  • the inflammatory site force-in-inducing polypeptide has an activity of inducing cell adhesion molecule expression by inflammatory site force-in stimulation and an activity of inducing adhesion between Z or vascular endothelial cells and leukocytes. Therefore, a substance that suppresses the function of the polypeptide is a substance having an ability to suppress adhesion of vascular endothelial cells. Specifically, these substances can be obtained by a screening method including the following steps.
  • DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, or 23, or
  • DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, or 23, or
  • a screening method for a vascular endothelial cell adhesion inhibitor is provided.
  • the test substance is cultured in the culture supernatant for an appropriate period of time, then intercelluler adhesion molecule (ICAM) -1, vascular cell adhesion molecule (VCAM) -1 and E-selectin, etc. Evaluation is based on the expression of adhesion molecules induced by endothelial cells.
  • the expression of each adhesion molecule on the cell surface is detected by a technique using a flow cytometer after removing endothelial cells from the incubator, staining with a fluorescently labeled monoclonal antibody (BD Biosciences) against each adhesion molecule be able to.
  • ELISA enzyme-linked immunosor bent assay
  • Anti-human ICAM-1, Anti-VCAM-1, Anti-E-selectin mouse IgGl monoclonal antibody (BD Bioscience) after blocking with PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA: Sigma) was reacted with a diluted solution of 0.1% BSA-containing PBS, washed with 0.05% Tween-20-containing PBS, and again blocked with PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA: Sigma).
  • test substance is a substance that suppresses the function of the inflammatory site force-in-inducing polypeptide of the present invention.
  • the method for measuring the adhesion between white blood cells and vascular endothelial cells uses the Vybrant Cell Adhesion Assay Kit on cells cultured for a suitable time in a 96-well microplate with the test substance added.
  • fluorescently labeled T lymphocyte cultured cells M 01 / 1-4, &1; etc.
  • monocyte cultured cells 13 ⁇ 4? 1 U937 etc.
  • white blood cells isolated from human peripheral venous blood The fluorescence of white blood cells that have been added and washed and adhered to endothelial cells can be quantified by measuring with a fluorescent microplate reader.
  • the test substance with reduced adhesion of any white blood cell compared to the control (no test substance added) cell is a substance that suppresses the function of the inflammatory site force-in-inducing polypeptide of the present invention. It can be determined that there is.
  • the specific conjugate includes a protein (including an antibody) that can specifically bind to an inflammatory site force-in-inducing polypeptide, an Abutama low molecular weight compound, and the like.
  • Inflammatory cytoforce-in-inducing polypeptides are thought to regulate their activity by binding directly or indirectly to other proteins inside or outside the cell. Therefore, a substance that inhibits the binding between the polypeptide and the protein is highly likely to be a substance that regulates vascular endothelial cell adhesion. Specifically, these substances can be obtained by a screening method including the following steps.
  • Examples of a method for obtaining a protein that can specifically bind include a method of using a purified inflammatory site force-in-inducing polypeptide to purify a protein that binds to the polypeptide.
  • a purified inflammatory site force-in-inducing polypeptide fused with a sequence of 6 histidines as a utility tag is prepared, and this is extracted with a cell extract (previously nickel-free). Charge the galose column and pass through the ram) and incubate at 4 ° C for 12 hours, then add another nickel-agarose support to this mixture and incubate at 4 ° C for 1 hour.
  • the lOOmM imidazole is covered to elute proteins in the cell extract that specifically bind to the inflammatory site force-in-inducing polypeptide. To determine the structure. In this way, there is no binding activity to proteins that directly bind to inflammatory site force-in-inducing polypeptides and inflammatory site force-in-inducing polypeptides!
  • a protein that binds to inflammatory site force-in-inducing polypeptide indirectly can be purified by forming a complex with the protein that directly binds to inflammatory site force-in-inducing polypeptide [Experimental Medicine, Biomanual Series 5 “Transcription Factor Research Method” PP215—219 (published by Yodosha)].
  • a cDNA of a protein that interacts directly or indirectly with the inflammatory site force-in inducing polypeptide of the present invention can be obtained by these methods, the inflammatory site force in inducing polypeptide and the protein can be combined. It can be used to screen for substances that inhibit the interaction. Specifically, first, a lysate prepared by disrupting cells such as transformed cells expressing the inflammatory site force-in inducing polypeptide (preferably a purified preparation of the inflammatory site force in inducing polypeptide) To prepare. Optimize screening conditions such as buffer, ion, and / or pH, and lysates and inflammatory sites in an optimized buffer.
  • a protein label that interacts with the tocaine-inducing polypeptide is incubated with the test compound for a period of time. After the reaction, filter with a nitrocellulose filter or the like, wash with an appropriate amount of buffer, and measure the radioactivity remaining on the filter with a liquid scintillation counter or the like.
  • a compound that inhibits the binding of the inflammatory site force-inducing polypeptide and the protein that interacts with it can be selected using the obtained binding inhibition of the label as an index. Whether or not the compound is an antagonist or antagonist can be confirmed by other screening methods described in this section.
  • the protein that can specifically bind is an antibody, it can be obtained according to the description in "4. Antibody against inflammatory site force-in-inducing polypeptide”.
  • Specific binders can usually be labeled with various substances so that their behavior can be detected.
  • the protein can be labeled by using a conventional method described in, for example, “Molecular Cell Biology Basic Experimental Method” (Takeichi Nanae, et al., 1994).
  • various substances include chemiluminescent substances, enzymes, fluorescent substances, colored beads, radioisotopes, elements, metals, and piotin. Specific examples are shown below, but are not limited to these! /.
  • Examples of chemiluminescent substances include luminol and attalizium esters.
  • enzymes include j8-galatatosidase and alkaline phosphatase peroxidase.
  • Examples of the fluorescent substance include papium cryptate, FITC (fluorescein i sothiocyanate), and RITC (tetramethylrhodamm isothiocyanate).
  • Examples of colored beads include protein A beads, wheat germ agglutinin (WG A) beads, and streptavidin beads.
  • Radioisotopes include, for example, 14 C, 1251, and 3 H.
  • An element refers to a lanthanide element such as Pylum.
  • Examples of metals include ferritin and colloidal gold.
  • Example 1 [0140] Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
  • Example 1
  • vascular endothelial cells have important functions for inducing inflammatory reactions such as leukocyte infiltration and secretion of site force in. Therefore, in order to find a gene that is expressed in vascular endothelial cells and plays an important role in the inflammatory reaction, it is first expressed in vascular endothelial cells by stimulation of tumor necrosis fa ctor (TNF) ⁇ , which is a typical inflammatory site force-in.
  • TNF tumor necrosis fa ctor
  • HEPES solution manufactured by Cambrex BioScience Walkersville
  • trypsin ⁇ The cells were collected using This is centrifuged at 230 x g for 5 minutes at room temperature, suspended in a cell banker (manufactured by Toji Field Co., Ltd.) to a cell concentration of 4.5 x 10 5 cells Zml, and 1 ml each is dispensed into a serum tube. After that, the sample stored frozen at 80 ° C was used as a stock for the following experiments.
  • DEPC diethylpyrocarbonate
  • the following DNA microarray analysis includes an expressed sequence tag (EST) prepared using 12 types of cDNA from human organs as templates in Microarray Bar Corded Slide Type 7 Star (hereinafter Type 7 Star: Amersham Biosciences).
  • EST expressed sequence tag
  • a self-made DNA microarray and Kazusa human cDNA nylon microarray KDR Array: Kiki Kenji Enetas Co., Ltd.
  • KDR Array Kiki Kenji Enetas Co., Ltd.
  • Type 7 Star was equipped with 2 spots of each PCR fragment.
  • RNA2 above a
  • 5 mu ⁇ a in the template Message Amp aRNA Kit (Ambion, Inc.) amplifying the mRNA according's instruction manual attached using (aRNA reduction) was.
  • the analysis using the KDR array was performed according to the following procedure.
  • the mixture was heated at 70 ° C for 10 minutes and then rapidly cooled on ice.
  • ImMdCTP Prepared by diluting 10 mM of dnvitrogen 100-fold) 0.2 / zl, ll lTBq / mmol, 370MbqZml [ ⁇ - 33 P] dCTP (manufactured by Amersham Biosciences) 10 ⁇ l is added, incubated at 42 ° C for 2 minutes, and 2 / z of SuperScript II reverse transcriptase is added, then at 42 ° C for 1 hour Incubated.
  • hybridization was performed on two KDR arrays for each sample of TNF- ⁇ treatment 0, 1, 4, and 24 hours. Then remove the KDR array from the vial and wash 2 x SS C, 1% SDS, 68 ° C, 15 min twice, 0.1 x SSC, 1% SDS, 68 ° C, 15 min wash 2
  • the KDR array was exposed to an imaging plate (IP: manufactured by Fuji Film) for 1, 4, and 7 days, and the radioactivity of the KDR array transferred to the IP was analyzed using the Fluoro® Image Analyzer FLA3000G (Fuji Film Obtained as image data.
  • the image data was used to grid each spot using the image analysis software ArrayGauge (Fuji Film Co., Ltd.), and the radioactivity was numerically calculated and stored in a text file. Next, it was obtained by analyzing both microarrays.
  • the text data of numerical data of each spot is integrated using GeneSpring (Agilent), a microarray data analysis software, and the signal intensity of TNF—a 1, 4, and 24 hour processing is calculated for each spot.
  • the signal ratio interrupted by the signal intensity of time treatment (TNF- ⁇ untreated), that is, how many times the expression changes after treatment time 1, 4, 24 hours by TNF- ⁇ treatment, is calculated on the microarray in Type 7 Star 2 Spot X sample with fluorescent labeling (Cy3, Cy5) replaced Data of 3 spots out of 4 spots
  • the spots where the signal intensity ratio is 2 or more, that is, the expression is more than doubled at any point after 1, 4, and 24 hours are extracted from the data of both arrays analyzed in parallel. did.
  • analysis was performed on BioSCOUT (Lion) and Ensembl, the European Bioinformatics Institute (EBI) and Sanger Institute Institute's public database.
  • TNFUP tissue force-in-inducing polypeptide
  • TNFUP-0072 there are two TNFUP-0072 (TNFUP-0072; SEQ ID NO: 5, TNFUP-0072B; SEQ ID NO: 13), and six TNFUP-0142 (TNFUP-0142; SEQ ID NO: 11, TNFUP- SEQ ID NO: 15, TNFUP—0142 C; SEQ ID NO: 17, TNFUP—0142D; SEQ ID NO: 19, TNFUP—0142E; SEQ ID NO: 21, TNFUP—0142F; SEQ ID NO: 23).
  • NBI National Center for Biotechnology Information
  • TNFUP—0064 is interferon—induced protein 44—like (IFI44L)
  • TNF UP—0072 is TNFAIP3 interacting protein 1 (TNIP1)
  • TNFUP—0113 is TBC1 domain family, member 4 (TBC1D4)
  • TNFUP— 0142 were SON DNA binding proteins (SON)
  • RNA interference RNA interference
  • Whether or not the 142 up-regulated genes extracted from the DNA microarray analysis of Example 1 have an important function in inflammation in endothelial cells was determined by knocking down each gene with small interfering RNA (siRNA). The following procedure was used to verify whether the induction of adhesion molecule expression in HUVEC can be suppressed by chick stimulation. That gene that is the target of the siRNA where expression of adhesion molecules is suppressed by s iRNA Becomes an inflammatory site force-in-inducing polynucleotide candidate.
  • siRNA small interfering RNA
  • siRNA for functional screening of inflammatory site force-inducing polypeptides using RNAi, in vitro transcription synthesis of siRNA was performed using the CUGA7 in vitro siRNA Synthesis Kit (manufactured by Tubon Gene). In addition, among the siRNAs synthesized this time, the remarkable adhesion molecule expression inhibitory effect was confirmed in Example 2d) described later, and the inflammatory site force-in induction was confirmed to have a novel function by the analysis of Example 3 described later.
  • Table 1 shows examples of siRNA for polypeptide 6 gene, target sequences of negative control siRNA and positive control siRNA, oligo DNA sequence for synthesis and siRNA to be synthesized. Specific siRNA synthesis and preparation were performed as follows.
  • the open reading frame (OR F) is extracted from the full-length mRNA sequence, and if there is a splicing 'variant, only the base sequence of the common part is extracted. It was.
  • siRNA sense strand 3 'overhang 2 base part and siRNA double strand part 19 base part from the base sequence extracted as shown in the examples in Table 1 and Table 2 below
  • select 23 regions consisting of 2 bases of the siRNA antisense strand 3 'overhang, 4 regions for each gene, and use instructions for CUGA7 in vitro siRNA Synthesis Kit
  • the target sequence 3 ' is supplemented with a complementary sequence of the promoter sequence of T7 RNA polymerase (5'—CTATAGTGAGTCGTATTA-3 ′), or a sense strand-enhanced oligo DNA such as sequence 25-52 and Antisense strand-type oligo DNA was designed and chemically synthesized (manufactured by Sigma Science Co., Ltd.).
  • SEQ ID NO: 25-30 are TNFU P-0013, SEQ ID NO: 31-32 «TNFUP-0064, SEQ ID NO: 33-3 ⁇ 3 ⁇ 4TNFUP-0072, 36 «TNFUP_0113, [J number 37—38 ⁇ TNFUP 011 4 and SEQ ID NO: 39-42 are base sequences of siRNA synthesis oligo DN A for TNFUP-0142.
  • SEQ ID NOs: 45 and 46 are intercelluler adhesion molecule (I CAM) 1; SEQ ID NOs: 47 and 48 are vascular cell adhesion molecule (VCAM) 1; eye tl ⁇ U number 49, 50 ⁇ E-selectin; U number 51, 52 ⁇ or positive control against tumor necrosis factor receptorl (TNFR1) And the siRNAs of SEQ ID NOS: 43 and 44 are Blast searches against GenBank! / This is the base sequence of the negative control siRNA oligo DNA having the sequence in the target region.
  • oligo DNAs designed for the 142 genes and control genes detected in Example 1 above, including these, were used as a cage and the CUGA7 in vitro siRNA Synthesis Kit kit included some instructions in the instructions for use.
  • SiRNA was subjected to in vitro transcription synthesis and purification by a modified method. The modification is to suppress the interferon response elicited by cells transfected with in vitro transcribed s iRNA by removing the 5'-terminal phosphate group. Kim et al. (Nature Biotechnology, 2004, 22, ⁇ 321— 325) is an improvement on the method reported.
  • siRNAs are synthesized by the above method using oligo DNAs having the sequences of SEQ ID NOs: 25 to 52, those having the sequences shown in the siRNA sequences in Tables 1 and 2 are synthesized.
  • siRNA Name double strand region, SEQ ID NO:
  • subculture set A manufactured by Cell Applications
  • subculture set A manufactured by Cell Applications
  • the cells in 1 culture flask that became confluent after passage of passage 7 to passage 8 were removed using subculture set A, and centrifuged at 20 OX g for 5 minutes.
  • Cells suspended in a 2 ml cell bunker manufactured by Toji Field
  • stored frozen in two serum tubes each 1 ml were used as stocks in the following experiments.
  • siRNA synthesized in a) above was transfected into the cells of each well in b) using the Targefect-siRNA transcription kit (manufactured by Targeting Systems) by the following operation.
  • 92 siRNAs per analysis 3 positive control siRNAs (ICAM-1, VCAM-1, E-selectin), and 3 negative control siRNAs for 96 siRNAs (for ICAM-1 measurement) , VCAM-1 measurement, E-Selectin measurement) 96-well plate was subjected to transfection.
  • the culture supernatant of the 96-well microplate in which the cells in b) above are cultured is extracted with an 8-spin type aspirator, and immediately, the siRNA mixture of each well of the 96-well PCR plate is removed using an 8-strip micropipette.
  • fresh endothelial cell growth medium was added 100 by 1 with an 8 micropipette for 16 hours.
  • each tool of the VCAM-1 plate is loaded with 30 ngZ 1 TNF- ⁇ dilution 1 (final concentration 1 OngZml)! ] 18. 5 hours, and E—selectin measurement plate.
  • 30 ngZ 1 TNF diluted solution 50 / z l (final concentration lOngZml) to each well 2.5 hours, CO concentration 5%
  • each adhesion molecule expressed on the HUVEC surface was detected on a microplate by a method simulating an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using a monoclonal antibody that recognizes the adhesion molecule. Specifically, remove the supernatant from the 96-well microplate that was incubated after siRNA transfection in c) above, and immediately remove the methanol: ethanol (3: 1 mix ratio) fixative solution for 100 1 hour at room temperature. Fix by standing, wash 3 times with 0.05% Tween-20 containing PBS using a plate washer, and then 100% PBS containing 1% BSA.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • HRP horse ladish peroxidase
  • siRNAs corresponding to 18 genes showed an inhibitory effect on the expression of either IC AM 1, VCAM-1, E-selectin, and were determined to be positive.
  • the 18 genes that were genes were selected as candidate inflammatory site force-in-inducing polynucleotides.
  • T NFUP—0013 SEQ ID NO: 1
  • TNFUP_0064 SEQ ID NO: 3
  • TNFUP_0072 SEQ ID NO: 5
  • TNFUP— 0113 SEQ ID NO: 7
  • TNFUP— 6 genes of 0114 SEQ ID NO: 9
  • TN FUP— 0142 SEQ ID NO: 11
  • Example 2d In order to confirm the reproducibility of the primary screening results described in Example 2d), for the 21 siRNAs that showed response, the number of analyzes was increased by 4 series (4 uels), and reanalysis was performed in the same manner as in Example 2. As a result, most of the inhibitory effect of siRNA detected in the primary screening on adhesion molecule expression was reproduced.
  • Figures 1 to 3 show a total of 9 genes out of 21 siRNAs that were able to reproduce the effect of suppressing the expression of adhesion molecules in this secondary screening and that were judged to be highly related to inflammation in b) and c) below. Results are shown for two siRNAs and negative and positive control siRNAs.
  • the vertical axis in the figure shows the absorbance at 490 nm when each siRNA was transfected, and the shaded column is d) the siRNA that was positive for the effect of suppressing the expression of the relevant adhesion molecule in the primary screening.
  • the gray column indicates that the adhesion molecule is not positive but is positive for other adhesion molecules, and the white and black columns indicate the data for the negative control and positive control siRNA, respectively.
  • Each data shows the average value of the 4well data, and the error bar shows the standard deviation of the 4well data.
  • ICAM-1 the data of positive control siRNA (ICAMl-si) was also estimated, and in this batch, it was considered that ICAM-1 was detected higher than usual. Although it is a little difficult to resist, negative control 50 ⁇ ⁇ with 3 siRNAs against TNFUP-0013 (TNFUP-0013—1, 3, 4) and siRNA against TNFUP-0064 (TNFUP—0064—4) In addition, the absorbance of 490! 1111 showed an approximately 40% decrease in expression suppression effect. In addition, siRNA against TNFUP-0114 (TNFUP-0114-3) showed about 30% inhibition of expression.
  • TNFUP-0142 the ability to suppress only about 30% of the siRNA (TNF UP-0014-3) of the two siRNAs that were found to be suppressed by the primary screening.
  • One siRNA (TN FUP-0142 — In 2), a suppression effect of about 40% was observed.
  • siRNA against TNFUP-0064 (TNFUP —0064—4), siRNA against TNFUP-0114 (TNFUP—0114-3), and two siRNA against TNFUP—0142 (TNFUP—0142— 2 and 3) showed a 50% or greater decrease in the expression suppression effect at 490 nm absorbance than the negative control siRNA.
  • the siRNA against TNFUP-0072 (TNFUP 0072-2) is slightly less effective than these About 50% of the inhibitory effect was observed.
  • TNFUP-0013-3, 4 two of the three siRNAs against TNFUP_0013 (TNFUP-0013-3, 4), whose inhibitory effect was detected in the primary screening, were absorbed at 490 nm more than the negative control siRNA. About 50% decrease in expression suppression effect was shown.
  • siRNA against TNFUP-0072 (TNFUP-0072-2), siRNA against TNFUP-0113 (TNFUP- 0113-4), and siRN A against TNFUP-0114 (TNFUP-0114-3) showed a suppression effect of 50% or more. It was.
  • TNFUP-0142 one of the two siRNAs (TNFUP-0142-2), which was found to have an inhibitory effect in the primary screening, was found to have an inhibitory effect of 50% or more.
  • TNFUP-0013, the corresponding gene of siRNA shown in FIGS. 1 to 3, is ICAM-1 and E-selectin
  • TNFUP-0064 is ICAM-1 and VCAM-1
  • TNFU P-0072 is VCAM-1.
  • TNFUP—0114 is ICAM-1 and VCAM—1
  • E—selectin and TNFUP—0142 can be involved in inducing expression of ICA M-1, VCAM-1 and E—selectin It was judged that the property was high, and it became clear that it was a so-called inflammatory site force-in-inducing polynucleotide.
  • the cells were cultured until the final state. Next included in the Targefect-siRNA transfection kit kit SolnA 8 1, SolnB 5 ⁇ 1 and 4500 mg / l glucose-containing DMEM 987 ⁇ 1 mixed with 21 siRNAs that were positive in Example 2d) or negative control, positive control siRNA (each lOOngZ 1) Incubate at 37 ° C for 25 minutes after adding to 1, and replace this with 2 ml of HUVEC culture supernatant. Immediately 30 minutes under conditions of 5% CO concentration and 37 ° C
  • cDNA was synthesized using the oligoscript dT primer with the Superscript First Strand System (manufactured by Invitrogen) according to the instruction manual, and this was synthesized using the QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen (Elution of cDNA with 30 1 elution buffer), and 1 PCR reaction in each reaction was used as a template.
  • PCR primer was used at a concentration of 0.2 ⁇ in SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biotechnology).
  • TNFUP-00 13 SEQ ID NO: 53-54
  • TNFUP-0064 SEQ ID NO: 55-56
  • TNFUP—0072 SEQ ID NO: 57-58
  • TNFUP—0113 SEQ ID NO: 59-60
  • TNFUP—0114 SEQ ID NO: 61 — 62
  • TNFUP— 0142 SEQ ID NO: 63—64.
  • PCR primers for adhesion molecules are ICAM-1: SEQ ID NO: 65-66, VCAM-1: SEQ ID NO: 67-68, E-selec tin: SEQ ID NO: 69—70, and PCR primers for the endogenous control gene are ⁇ —actm: eyes G ⁇ 'J number 71 — /' 2, glyderaidehy e—3—pho spnate dehydrogenas e (GAPDH): SEQ ID NO: 73— 74 (see Table 3). Then, using the obtained amplification curve GeneAmp 5700 SDS software (Applied Biosystems), Ct value of each well was obtained, and each siRNA was tranfected into samples!
  • Example 3a) -c) was 6 genes that were judged to be highly related to inflammation (inflammatory site force-in-inducing polypeptide)
  • Fig. 4 a-b, Fig. 5 a- b, and Fig. 6 a-- show the changes in mRNA expression of each adhesion molecule and the target gene of each siRNA when 9 siRNAs for the encoded gene) are transfected.
  • siRNAs shown in Fig. 4a, Fig. 5a, and Fig. 6a have a small range of variation in the expression of adhesion molecule mRNA
  • negative siRNAs are shown in most siRNAs shown in Figs. 4 to 6.
  • the difference between the expression level and the ACt value was 1 or more, that is, a 50% decrease in expression was observed, and the results of Example 2d) and Example 3a) were reproduced at the mRNA level.
  • siRNA for TNFUP-0064 (TNFUP-0064-4), siRNA for TNFUP-0072 (TNFUP-0072-2;), siRNA against TNFUP-0114 (TNFUP) — 0114— 3), 2 siRNAs against TNFUP— 0142 (TNFUP— 0142— 2, 3) showed an expression decrease of more than 50%.
  • Fig. 6a For E-selectin mRNA expression (Fig. 6a), three siRNAs against TNFUP-0013 (TNFUP 0013- 1, 3, 4) and siRNA against TNFUP 0113 (TN In siRNA (TNFUP-0114-3) against FUP-0113-4) and TNFUP-0114, an expression decrease of 50% or more was observed. In addition, siRNA against TNFUP-0072 (TNFUP-0072-2) and one of the two siRNAs against TNFUP-0142 (TNFUP-0142-2)! It was.
  • siRNAs against these 6 genes knock down the mRNA expression of the target gene with a negative control difference of 1 or more, that is, 50% or more. It was also confirmed that.
  • Example 2d It was verified whether 21 siRNAs that were positive in the primary screening of Example 2d) actually suppress the adhesion between white blood cells induced by TNFa and HUVEC. Specifically, in accordance with the procedure of Example 2a), culture was prepared on 4 black clear bottom 96-well microplates (BD Bioscience) coated with ushi collagen type I. Next, in each of the 21 siRNAs (l OOngZ At 1) dispensed into 96-well format sterilized microtubes, 16.41 (1.64 g) of Targefect—siRNA transfection kit contains SolnA 164 1 SolnB Dulbecc o's modified Eagle's medium containing 5 1 and 4500mgZl glucose (DMEM: Sigma-Aldrich) 20.
  • DMEM Sigma-Aldrich
  • T lymphocyte cultured cells MOLT-4, Jurkat
  • monocyte cultured cells THP-1, U937
  • RPMI1640 medium Sigma Aldrich
  • FBS fetal bovine serum
  • the supernatant of each well of the above-mentioned TNF-treated microplate is extracted with an 8-type aspirator, and immediately 100 1 (5 X 10 5 cells) of fluorescently labeled white blood cells are collected in each microwell.
  • the plate was added using an 8 micropipette and incubated at 37 ° C for 1 hour.
  • TNFUP— 0064— 4 is MOLT— 4 ⁇ Jur kat ⁇ TNFUP— 0114— 3 is U937 and MOLT— 4 ⁇ Jurkat ⁇ TNFUP— 0142— 2 is MOLT— 4 ⁇ Jurkat, TNFUP-0142-3 has been shown to inhibit MOLT-4 adhesion by more than 50%, and TNFUP-0064, TNFUP-0114, and TNFUP-0142 have at least three adhesions to the white blood cells examined this time.
  • TNFUP-0013, TNFUP-0072, and TNFUP-0113 have a strong force that does not show an adhesion-suppressing effect with the siRNA. Because of the fact that this was proved and the mode of adhesion suppression was different depending on the combination of siRNA and white blood cell type in this analysis, white blood cells of either other white blood cells or peripheral blood not used this time There is a good possibility that this is related to the adhesion.
  • TNFUP-0013 is a gene related to the expression of IC AM-1 and E-selectin
  • TNFUP-0064 is related to the expression of IC AM-1 and VCAM-1 and Genes related to adhesion of spherical cells (MOLT-4, Jurkat)
  • TNFUP-0072 is a gene related to the expression of VCAM-1 and E-selectin
  • TNFUP-0113 is a gene related to the expression of E-selectin
  • TNFUP-0114 is associated with the expression of ICAM-1, VCAM-1 and E-selectin and with the adhesion of monocytic cells (U937)
  • T lymphocyte cells MOLT-4, Jurkat
  • TNFUP-0142 is a gene related to the expression of ICAM-1, VCAM-1 and E-selectin and to the adhesion of T lymphocyte cells (MOLT-4, Jurkat). It became power.
  • SEQ ID NO: 1 is the gene sequence of TNFUP-0013.
  • SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence encoded by the gene sequence of TNFUP-0013.
  • SEQ ID NO: 3 is the gene sequence of TNFUP-0064.
  • SEQ ID NO: 4 is the amino acid sequence encoded by the gene sequence of TNFUP 0064.
  • SEQ ID NO: 5 is the gene sequence of TNFUP-0072.
  • SEQ ID NO: 6 is the amino acid sequence encoded by the gene sequence of TNFUP-0072.
  • SEQ ID NO: 7 is the gene sequence of TNFUP-0113.
  • SEQ ID NO: 8 is the amino acid sequence encoded by the gene sequence of TNFUP-0113.
  • SEQ ID NO: 9 is the gene sequence of TNFUP-0114.
  • SEQ ID NO: 10 is the amino acid sequence encoded by the gene sequence of TNFUP-0114.
  • SEQ ID NO: 11 is the gene sequence of TNFUP-0142.
  • SEQ ID NO: 12 is the amino acid sequence encoded by the gene sequence of TNFUP-0142.
  • SEQ ID NO: 13 is the gene sequence of TNFUP-007 2B, which is a splicing variant of TNFUP-0072.
  • SEQ ID NO: 14 is the amino acid sequence encoded by the gene sequence of TNFUP-007 2B, which is a splicing variant of TNFUP-0072.
  • SEQ ID NO: 15 is the gene sequence of TNFUP-014 2B, which is a splicing variant of TNFUP-0142.
  • SEQ ID NO: 16 is the amino acid sequence encoded by the gene sequence of TNFUP-014 2B, which is a splicing variant of TNFUP-0142.
  • SEQ ID NO: 17 is the gene sequence of TNFUP-014 2C, which is a splicing variant of TNFUP-0142.
  • SEQ ID NO: 18 is the amino acid sequence encoded by the gene sequence of TNFUP-014 2C, which is a splicing variant of TNFUP-0142.
  • SEQ ID NO: 19 is the gene sequence of TNFUP-014 2D, which is a splicing variant of TNFUP-0142.
  • SEQ ID NO: 20 is the amino acid sequence encoded by the gene sequence of TNFUP-014 2D, which is a splicing variant of TNFUP-0142.
  • SEQ ID NO: 21 is the gene sequence of TNFUP-0142E, a splicing variant of TNFUP-0142.
  • SEQ ID NO: 22 is the amino acid sequence encoded by the gene sequence of TNFUP-014 2E, which is a splicing variant of TNFUP-0142.
  • SEQ ID NO: 23 is the gene sequence of TNFUP-014 2F, which is a splicing variant of TNFUP-0142.
  • SEQ ID NO: 24 is the amino acid sequence encoded by the gene sequence of TNFUP-014 2F, which is a splicing variant of TNFUP-0142.
  • SEQ ID NO: 25 is the base sequence of oligo DNA for sense strand synthesis of siRNA (TNFUP-0013-1) for TNFUP-0013.
  • SEQ ID NO: 26 is the base sequence of oligo DNA for antisense strand synthesis of siRNA against TNFUP-0013 (TNFUP-0013-1).
  • SEQ ID NO: 27 is the base sequence of oligo DNA for sense strand synthesis of siRNA (TNFUP-0013-3) for TNFUP-0013.
  • SEQ ID NO: 28 is the base sequence of oligo DNA for antisense strand synthesis of siRNA against TNFUP-0013 (TNFUP-0013-3).
  • SEQ ID NO: 29 is the base sequence of oligo DNA for synthesizing sense strand of siRNA (TNFUP-0013-4) for TNFUP-0013.
  • SEQ ID NO: 30 is the base sequence of oligo DNA for antisense strand synthesis of siRNA against TNFUP-0013 (TNFUP-0013-4).
  • SEQ ID NO: 31 is the base sequence of the oligo DNA for sense strand synthesis of siRNA against TNFUP-0064 (TNFUP-0064-4).
  • SEQ ID NO: 32 is the base sequence of the oligo DNA for antisense strand synthesis of siRNA against TNFUP-0064 (TNFUP-0064-4).
  • SEQ ID NO: 33 is the base sequence of oligo DNA for sense strand synthesis of siRNA against TNFUP-0072 (TNFUP-0072-2).
  • SEQ ID NO: 34 is the base sequence of the oligo-DNA for antisense strand synthesis of siRNA against TNFUP-0072 (TNFUP-0072-2).
  • SEQ ID NO: 35 is the base sequence of oligo DNA for sense strand synthesis of siRNA against TNFUP-0113 (TNFUP-0113-4).
  • SEQ ID NO: 36 is the base sequence of oligo-DNA for antisense strand synthesis of siRNA against TNFUP-0113 (TNFUP-0113-4).
  • SEQ ID NO: 37 is the base sequence of oligo DNA for synthesizing sense strand of siRNA against TNFUP-0114 (TNFUP-1 0114-3).
  • SEQ ID NO: 38 is the base sequence of oligo DNA for antisense strand synthesis of siRNA against TNFUP-0114 (TNFUP-1 0114-3).
  • SEQ ID NO: 39 is the base sequence of oligo DNA for synthesizing sense strand of siRNA (TNFUP-0142-2) against TNFUP-0142.
  • SEQ ID NO: 40 is the base sequence of oligo DNA for antisense strand synthesis of siRNA against TNFUP-0142 (TNFUP-10142-2).
  • SEQ ID NO: 41 is the base sequence of an oligo DNA for sense strand synthesis of siRNA against TNFUP-0142 (TNFUP-1 0142-3).
  • SEQ ID NO: 42 is the base sequence of oligo DNA for antisense strand synthesis of siRNA against TNFUP-0042 (TNFUP-10142-2).
  • SEQ ID NO: 43 is the base sequence of the sense strand oligo DNA of negative control siRNA (N. Ctrl—si).
  • SEQ ID NO: 44 is the base sequence of the oligo DNA for antisense strand of negative control siRNA (N. Ctrl—si).
  • SEQ ID NO: 45 is the base sequence of the oligo DNA for the sense strand of the positive control siRNA (ICAM 1 si) for ICAM 1.
  • SEQ ID NO: 46 is the base sequence of the oligo DNA for antisense strand of positive control siRNA (ICAM 1 -si) for ICAM-1.
  • SEQ ID NO: 47 is the base sequence of the sense strand oligo DNA of VCAM 1 positive control siRNA (VCAM 1 si).
  • SEQ ID NO: 48 is the base sequence of the oligo DNA for antisense strand of positive control siRNA (VCAM 1 si) against VCAM 1.
  • SEQ ID NO: 49 is the base sequence of the sense strand oligo DNA for positive control siRNA against E—selectin (E—selectin si).
  • SEQ ID NO: 50 is the base sequence of oligo-DNA for antisense strand of positive control siRNA against E-selectin (E-selectin si).
  • SEQ ID NO: 51 is the base sequence of the sense strand oligo DNA for positive control siRNA against TNFR1 (TNFR1-si).
  • SEQ ID NO: 52 is the base sequence of the antisense DNA for the antisense strand of the positive control siRNA (TNFR1-si) for TNFR1.
  • SEQ ID NO: 53 is the nucleotide sequence of PCR primer for quantification of TNFUP-0013.
  • SEQ ID NO: 54 is the base sequence of PCR primer for quantification of TNFUP-0013.
  • SEQ ID NO: 55 is the nucleotide sequence of PCR primer for quantification of TNFUP-0064.
  • SEQ ID NO: 56 is the base sequence of PCR primer for quantification of TNFUP-0064.
  • SEQ ID NO: 57 is the base sequence of PCR primer for quantification of TNFUP-0072.
  • SEQ ID NO: 58 is the base sequence of PCR primer for quantification of TNFUP-0072.
  • SEQ ID NO: 59 is the base sequence of PCR primer for quantification of TNFUP-0113.
  • SEQ ID NO: 60 is the base sequence of PCR primer for quantification of TNFUP-0113.
  • SEQ ID NO: 61 is the nucleotide sequence of PCR primer for quantification of TNFUP-0114.
  • SEQ ID NO: 62 is the base sequence of PCR primer for TNFUP-0114 quantification.
  • SEQ ID NO: 63 is the base sequence of PCR primer for quantification of TNFUP-0142.
  • SEQ ID NO: 64 is the base sequence of PCR primer for quantification of TNFUP-0142.
  • SEQ ID NO: 65 is the base sequence of PCR primer for ICAM-1 quantification.
  • SEQ ID NO: 66 is the base sequence of PCR primer for ICAM-1 quantification.
  • SEQ ID NO: 67 is the nucleotide sequence of a PCR primer for quantification of VCAM-1.
  • SEQ ID NO: 68 is the base sequence of PCR primer for VCAM-1 quantification.
  • SEQ ID NO: 69 is the base sequence of the PCR primer for E-selectin quantification.
  • SEQ ID NO: 70 is the base sequence of PCR primer for E-selectin quantification.
  • SEQ ID NO: 71 is the base sequence of the PCR primer for quantifying J3 actin.
  • SEQ ID NO: 72 is the base sequence of the PCR primer for ⁇ -actin quantification.
  • SEQ ID NO: 73 is the base sequence of the PCR primer for quantification of GAPDH.
  • SEQ ID NO: 74 is the base sequence of the PCR primer for GAPDH quantification.

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Abstract

　　抗炎症薬を得るための簡便なスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法に用いるポリペプチドは、細胞接着分子の発現に関与しており、血管内皮細胞の白血球への接着において重要な役割を果たしていることから、該ポリペプチドの発現量及びその機能を評価することにより、血管内皮細胞接着抑制物質をスクリーニングすることができる。

Description

明 細 書
抗炎症剤のスクリーニング方法
技術分野
[0001] 本発明は、血管内皮細胞接着抑制物質、及び抗炎症剤のスクリーニング方法に関 する。
背景技術
[0002] 種々の炎症性疾患は、白血球の炎症巣への集積，浸潤が原因となって引き起こさ れる。白血球がリンパ節あるいは炎症巣へ集積 '浸潤するためには、それが、まず、 血管内皮細胞に接着する必要がある。この接着の過程は、以下の 3つの段階： 1)血 管内皮細胞上での白血球のローリング、 2) 白血球の活性化、及び 3)血管内皮細胞 への白血球の強い接着、を含む。最初に起こるローリング (段階 1) )は、炎症性サイト 力インにより血管内皮細胞上に誘導 ·発現される細胞接着分子の 1つである E— sele ctinと、白血球上に発現しているシァリルルイス X(sLeX)糖鎖抗原との結合により、 引き起こされることが明らかとなっている。その後に起こる活性化 (段階 2) )、及び強 い接着 (段階 3))は、白血球上に発現しているインテグリン、及び炎症性サイト力イン により血管内皮細胞上に誘導'発現される細胞接着分子 VCAM— 1 (Vascular Ce 11 Adhension Molecule 1)又は細胞接着分子 ICAM— 1 (Intercellular Adhe nsion Molecule - l)t 、われる免疫グロブリン'スーパーファミリ一に属する細胞接 着分子により引き起こされることが明らかとなっている (非特許文献 1)。
[0003] また、このような様々な細胞接着分子の発現が種々の炎症性病変局所にお!、て亢 進していることも報告されており、そしてそれらが慢性炎症の病態形成に関与してい ることが明ら力となっている。
[0004] これらの現象は、その病変部位にお!、て白血球の浸潤を伴う炎症性疾患、例えば 、慢性関節リウマチ、全身性エリトマト一デス、多発性硬化症、橋本甲状腺炎、結節 性動脈周囲炎、潰瘍性大腸炎等で起こっていると考えられる。また、これらの現象は 、白血球の浸潤を伴うアレルギー性疾患の原因となることが知られて 、る。
[0005] 以上のことから、炎症部位にぉ 、て炎症性サイト力インにより誘導される種々の細胞 接着分子の発現を抑制すれば、白血球の炎症巣への集積'浸潤を阻止でき、これに より炎症性疾患の治療が可能になると考えられる。
非特許文献 1 : Molecular Medicine, 1995年、第 32卷、 p. 90
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明の課題は、細胞接着分子の発現抑制及び血管内皮細胞の白血球細胞へ の接着抑制、という新規な作用機構を有する、従来の抗炎症剤によっては治療困難 であった種々の炎症性疾患及び自己免疫疾患に対して高!、治療効果をもつ有用な 物質を得るための簡便なスクリーニング系を提供することである。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者等は、鋭意研究の結果、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞 (HUVEC)に炎症 性サイト力インの一種である TNF— aの添加によって発現が誘導された遺伝子とし て見出された遺伝子のうち 6つの遺伝子力 ICAM— 1や VCAM— 1等の細胞接着 分子の発現、または血管内皮細胞が白血球細胞との接着に関与していることを見出 すことより、本発明を完成させた。これらの遺伝子がコードするポリペプチドの発現量 を減少させる、もしくは該ポリペプチドの有する機能を阻害するような物質は、血管内 皮細胞と白血球の接着を抑制する物質であり、これらの物質は新規のメカニズムに 基づく抗炎症薬になると考えられる。
即ち、本発明によれば、
[1]
(1)血管内皮細胞と、被験物質とを接触させる工程、及び
(2)下記のいずれかに記載の遺伝子の発現量を測定する工程を含む血管内皮細胞 接着抑制物質のスクリーニング方法：
1)配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21又は 23で表される塩基配列力 らなる DNA、または
2)配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21又は 23で表される塩基配列力 らなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、炎症性サイト力イン の存在下にお!/、て (a)細胞接着分子の発現誘導機能、及び Z又は (b)血管内皮細 胞と白血球細胞との接着誘導機能を有するポリペプチドをコードするもの、
[2]
(1)血管内皮細胞と、被験物質とを接触させる工程、及び
(2)下記のいずれかに記載のポリペプチドの発現量を測定する工程を含む血管内皮 細胞接着抑制物質のスクリーニング方法：
1)配列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22又は 24で表されるアミノ酸配 列からなるポリペプチド、または
2)配列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22又は 24で表されるアミノ酸配 列において、 1〜： L0個のアミノ酸が欠失、置換、及び Z又は付加されたアミノ酸配列 を有し、かつ、炎症性サイト力インの存在下において (a)細胞接着分子の発現誘導 機能、及び Z又は (b)血管内皮細胞と白血球細胞との接着誘導機能を有するポリべ プチド、
[3]
被験物質非存在下よりも前記遺伝子又はポリペプチドの発現量を減少させる被験 物質を、選択する工程をさらに含む、上記 [1]または [2]に記載の血管内皮細胞接 着抑制物質のスクリーニング方法、
[4]
(1)上記 [1]に記載の遺伝子を含む発現ベクターで形質転換され、前記遺伝子に よってコードされたポリペプチドを発現している細胞と、被験物質とを接触させる工程
(2)白血球を上記細胞に接触させる工程、及び
(3)白血球と上記細胞との接着量を測定する工程を含む、
血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法、
[5]
被験物質非存在下よりも白血球と上記細胞との接着量を減少させる被験物質を、 選択する工程をさらに含む、上記 [4]記載の血管内皮細胞接着抑制物質のスクリー ユング方法、
[6] (1)上記 [1]に記載の遺伝子を含む発現ベクターで形質転換され、前記遺伝子に よってコードされたポリペプチドを発現している細胞と、被験物質とを接触させる工程 、及び
(2)細胞接着分子の発現量を測定する工程を含む、
血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法、
[7]
被験物質非存在下よりも細胞接着分子の発現量を減少させる被験物質を、選択す る工程をさらに含む、上記 [6]記載の血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング 方法、
[8]
(1)上記 [2]に記載のポリペプチドと、被験物質とを、標識した前記ポリペプチドの 特異結合体の存在下で、接触させる工程、及び
(2)前記ポリペプチドと前記特異結合体の結合量を測定する工程を含む、 血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法、
[9]
被験物質非存在下よりも特異結合体の結合量を減少させる被験物質を、選択する 工程をさらに含む、上記 [8]記載の血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方 法、
[10]
前記細胞接着分子が ICAM— 1、 VCAM— 1、及び E— selectinからなる群から 選択される 、ずれかである、上記 [ 1]から [9] 、ずれかに記載のスクリーニング方法、 [11]
炎症性サイト力インを接触させる工程をさらに含む、上記 [1]から [10]いずれかに 記載のスクリーニング方法、
[12]
血管内皮細胞接着抑制物質を抗炎症薬として選択するものである上記 [1]〜[11] の!、ずれかに記載のスクリーニング方法、が提供される。
発明の効果 [0008] 本発明のスクリーニング方法を用いれば、血管内皮細胞と白血球細胞との接着を 抑制することにより抗炎症作用を示す、従来にない抗炎症剤の探索が可能となる。 図面の簡単な説明
[0009] [図 1]実施例 2d)の一次スクリーニング (Cell— ELISA)において、 ICAM— 1、 VCA M—l、そして E— selectinの何れかの発現抑制効果を示した siRNAについて、 Cel 1 ELISAにて実験数を 4系列に増やし、 ICAM 1の発現抑制効果を再評価した（ 実施例 3a)：二次スクリーニング)。本グラフは、実施例 3a)_c)の実験結果により炎症 性サイト力イン誘導ポリヌクレオチドであると判断された 6遺伝子をターゲットとした 9つ の siRNA (斜線または灰色のカラム)、陰性コントロール siRNA (白色カラム)、そして 陽性コントロール siRNA (黒色カラム)の二次スクリーニング結果を示す。各カラムは 4 系列の解析により得られた 490nmの吸光度の平均値を示し、エラーバーはその標 準偏差を示す。尚、斜線のカラムは一次スクリーニングで ICAM— 1の発現抑制で陽 性反応を示した siRNA、また灰色のカラムは他の接着分子で陽性を示した siRNA であることを表す。
[図 2]実施例 2d)の一次スクリーニング (Cell— ELISA)において、 ICAM— 1、 VCA M—l、そして E— selectinの何れかの発現抑制効果を示した siRNAについて、 Cel 1 ELISAにて実験数を 4系列に増やし、 VCAM 1の発現抑制効果を再評価した (実施例 3a)：二次スクリーニング)。本グラフは、実施例 3a)— c)の実験結果により炎 症性サイト力イン誘導ポリヌクレオチドであると判断された 6遺伝子をターゲットとした 9 つの siRNA (斜線または灰色のカラム)、陰性コントロール siRNA (白色カラム)、そし て陽性コントロール siRNA (黒色カラム)の二次スクリーニング結果を示す。各カラムは 4系列の解析により得られた 490nmの吸光度の平均値を示し、エラーバーはその標 準偏差を示す。尚、斜線のカラムは一次スクリーニングで VCAM— 1の発現抑制で 陽性反応を示した siRNA、また灰色のカラムは他の接着分子で陽性を示した siRN Aであることを表す。
[図 3]実施例 2d)の一次スクリーニング (Cell— ELISA)において、 ICAM— 1、 VCA M—l、そして E— selectinの何れかの発現抑制効果を示した siRNAについて、 Cel 1 ELISAにて実験数を 4系列に増やし、 E— selectinの発現抑制効果を再評価し た (実施例 3a)：二次スクリーニング)。本グラフは、実施例 3a)—c)の実験結果により 炎症性サイト力イン誘導ポリヌクレオチドであると判断された 6遺伝子をターゲットとし た 9つの siRNA (斜線または灰色のカラム)、陰性コントロール siRNA (白色カラム)、 そして陽性コントロール siRNA (黒色カラム)の二次スクリーニング結果を示す。各カラ ムは 4系列の解析により得られた 490nmの吸光度の平均値を示し、エラーバーはそ の標準偏差を示す。尚、斜線のカラムは一次スクリーニングで E— selectinの発現抑 制で陽性反応を示した siRNA、また灰色のカラムは他の接着分子で陽性を示した si RNAであることを表す。
[図 4]実施例 2d)の一次スクリーニング (Cell— ELISA)において、 ICAM— 1発現抑 制効果を示した siRNAについてその抑制効果を定量的 PCRにより mRNA発現レべ ルで評価した。本グラフは、実施例 3a)— c)の実験結果により炎症性サイト力イン誘 導ポリヌクレオチドであると判断された 6遺伝子の siRNAのうち ICAM— 1の発現抑 制を示した 7つの siRNA (斜線カラム）、陰性コントロール siRNA (白色カラム)、そして 陽性コントロール siRNA (黒色カラム)の結果を示す。尚、アスタリスク（ * )は陰性コン トロール siRNAと比較して Δ Ctの差で 1以上の減少 (50%以上の発現減少)を示した ことを表す。 a. ICAM— 1の mRNA発現レベル（A Ct値）を評価した。 b. aの各 si RNAがそのターゲットとなる遺伝子をノックダウンするかを mRNA発現レベル（ Δ Ct 値)で評価した。
[図 5]実施例 2d)の一次スクリーニング (Cell— ELISA)において、 VCAM— 1発現抑 制効果を示した siRNAについてその抑制効果を定量的 PCRにより mRNA発現レべ ルで評価した。本グラフは、実施例 3a)— c)の実験結果により炎症性サイト力イン誘 導ポリヌクレオチドであると判断された 6遺伝子の siRNAのうち VCAM— 1の発現抑 制を示した 5つの siRNA (斜線カラム）、陰性コントロール siRNA (白色カラム)、そして 陽性コントロール siRNA (黒色カラム)の結果を示す。尚、アスタリスク（ * )は陰性コン トロール siRNAと比較して Δ Ctの差で 1以上の減少 (50%以上の発現減少)を示した ことを表す。 a. ICAM— 1の mRNA発現レベル（A Ct値）を評価した。 b. aの各 si RNAがそのターゲットとなる遺伝子をノックダウンするかを mRNA発現レベル（ Δ Ct 値)で評価した。 [図 6]実施例 2d)の一次スクリーニング (Cell— ELISA)において、 E— selectin発現 抑制効果を示した siRNAについてその抑制効果を定量的 PCRにより mRNA発現レ ベルで評価した。本グラフは、実施例 3a)— c)の実験結果により炎症性サイト力イン 誘導ポリヌクレオチドであると判断された 6遺伝子の siRNAのうち E— selectinの発 現抑制を示した 8つの siRNA (斜線カラム）、陰性コントロール siRNA (白色カラム)、 そして陽性コントロール siRNA (黒色カラム)の結果を示す。尚、アスタリスク（ * )は陰 性コントロール siRNAと比較して Δ Ctの差で 1以上の減少 (50%以上の発現減少)を 示したことを表す。 a. ICAM— 1の mRNA発現レベル（A Ct値）を評価した。尚、サ ンプル数の関係上、解析が 2プレートに分かれたため、それぞれのプレートにおける データを分けて表記した。 b. aの各 siRNAがそのターゲットとなる遺伝子をノックダ ゥンするかを mRNA発現レベル（ Δ Ct値）で評価した。
[図 7]実施例 2d)の一次スクリーニング (Cell— ELISA)において、 ICAM— 1、 VCA M— 1、そして E— selectinの何れかの発現抑制効果を示した siRNAを HUVECに トランスフエクシヨンし、 TNF- aにより誘導される THP—1細胞との接着を抑制でき るかどうかを検討した (各実験数 4系列)。本グラフは、実施例 3a)— c)の実験結果に より炎症性サイト力イン誘導ポリヌクレオチドであると判断された 6遺伝子をターゲット とした 9つの siRNA (斜線のカラム)、陰性コントロール siRNA (白色カラム)、そして陽 性コントロール siRNA (黒色カラム)の解析結果を示す。 各カラムは 4系列の解析によ り得られた蛍光強度の平均値を示し、エラーバーはその標準偏差を示す。また、蛍 光強度が高 、ほど多くの THP— 1細胞が HUVECに接着して!/、ることを表して!/、る。 尚、アスタリスク（ * )は陰性コントロール siRNAと比較して 50%以上の接着抑制を示 したことを表す。 今回調べた siRNAの中で顕著な THP— 1細胞の接着抑制効果を 示すものは認められなかつた。
[図 8]実施例 2d) の一次スクリーニング (Cell— ELISA)において、 ICAM—1、 VCA M— 1、そして E— selectinの何れかの発現抑制効果を示した siRNAを HUVECに トランスフエクシヨンし、 TNF- aにより誘導される U937細胞との接着を抑制できる かどうかを検討した (各実験数 4系列)。本グラフは、実施例 3a)— c)の実験結果によ り炎症性サイト力イン誘導ポリヌクレオチドであると判断された 6遺伝子をターゲットとし た 9つの siRNA (斜線のカラム)、陰性コントロール siRNA (白色カラム)、そして陽性コ ントロール siRNA (黒色カラム)の解析結果を示す。 各カラムは 4系列の解析により得 られた蛍光強度の平均値を示し、エラーバーはその標準偏差を示す。また、蛍光強 度が高いほど多くの U937細胞が HUVECに接着していることを表している。尚、ァ スタリスク（ * )は陰性コントロール siRNAと比較して 50%以上の接着抑制を示したこ とを表す。
[図 9]実施例 2d)の一次スクリーニング (Cell— ELISA)において、 ICAM— 1、 VCA M— 1、そして E— selectinの何れかの発現抑制効果を示した siRNAを HUVECに トランスフエクシヨンし、 TNF- aにより誘導される MOLT— 4細胞との接着を抑制で きるかどうかを検討した (各実験数 4系列)。本グラフは、実施例 3a)— c)の実験結果 により炎症性サイト力イン誘導ポリヌクレオチドであると判断された 6遺伝子をターゲッ トとした 9つの siRNA (斜線のカラム)、陰性コントロール siRNA (白色カラム)、そして 陽性コントロール siRNA (黒色カラム)の解析結果を示す。 各カラムは 4系列の解析 により得られた蛍光強度の平均値を示し、エラーバーはその標準偏差を示す。また、 蛍光強度が高いほど多くの MOLT— 4細胞が HUVECに接着していることを表して いる。尚、アスタリスク（* )は陰性コントロール siRNAと比較して 50%以上の接着抑 制を示したことを表す。
[図 10]実施例 2d)の一次スクリーニング (Cell— ELISA)において、 ICAM— 1、 VCA M— 1、そして E— selectinの何れかの発現抑制効果を示した siRNAを HUVECに トランスフエクシヨンし、 TNF- aにより誘導される Jurkat細胞との接着を抑制できる かどうかを検討した (各実験数 4系列)。本グラフは、実施例 3a)— c)の実験結果によ り炎症性サイト力イン誘導ポリヌクレオチドであると判断された 6遺伝子をターゲットとし た 9つの siRNA (斜線のカラム)、陰性コントロール siRNA (白色カラム)、そして陽性コ ントロール siRNA (黒色カラム)の解析結果を示す。 各カラムは 4系列の解析により得 られた蛍光強度の平均値を示し、エラーバーはその標準偏差を示す。また、蛍光強 度が高いほど多くの Jurkat細胞が HUVECに接着していることを表している。尚、ァ スタリスク（ * )は陰性コントロール siRNAと比較して 50%以上の接着抑制を示したこ とを表す。 発明を実施するための最良の形態
[0010] 1.炎症性サイト力インによって発現が上昇するポリヌクレオチド
本発明のスクリーニング方法において使用することができる「炎症性サイト力インに よって発現が上昇するポリヌクレオチド」とは、ヒトおよび Zまたはヒト以外の哺乳動物 の、炎症性サイト力インの添加（炎症性サイト力イン処理）によって発現が上昇するポ リヌクレオチドを意味する。
[0011] 炎症性サイト力インとは、細菌やウィルス感染、腫瘍、組織損傷などに伴う炎症反応 に深く関与するサイト力インをさす。例えば、インターロイキン 1 (IL—1)、インターロイ キン6 (IL— 6)、ィンターロィキン8 (IL— 8)、TNF— a (腫瘍壊死因子）などが知ら れているが、好ましくは TNF— αである。
[0012] 炎症性サイト力イン処理によって発現が上昇するポリヌクレオチドは具体的には、配 列表の配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21又は 23で表される塩基配 列からなるポリヌクレオチドが含まれる。
[0013] なお、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、遺伝子 工学的手法により、上述した天然型のポリヌクレオチドの配列の一部を他のヌクレオ チドへの置換やヌクレオチドの欠失、付加などで改変したポリヌクレオチドを調製する ことができ、それらは後述する検定方法によって、天然型のポリペプチドと同様の機 能有する力否かが確認できる。このような天然型のヌクレオチド配列に一部のヌクレ ォチドが置換、欠失、もしくは付加されたヌクレオチド配列を有し、天然型の、ポリヌク レオチドと同等の活性を示すポリヌクレオチドもまた本発明のポリヌクレオチドに含ま れる。ヌクレオチド配列の改変は、例えば、制限酵素あるいは DNAェキソヌクレア一 ゼによる欠失導入、部位特異的変異誘発法による変異導入、変異プライマーを用い た PCR法によるヌクレオチド配列の改変、合成変異 DNAの直接導入などの方法に より行うことができる。炎症性サイト力イン処理によって発現量が変動するポリヌクレオ チドの具体 f列としては、酉己歹 U表の酉己歹 U番号 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21 又は 23で表される塩基配列のいずれかを含むこと力もなるポリヌクレオチドをその例 としてあげることができる力 これらに限定されない。なお、本発明における「ポリヌクレ ォチド」という用語には、 DNAのみならずその mRNAや cDNAも含むものとする。ま た、全長遺伝子や EST (expression sequence tag)も含むものとする。
[0014] なお、遺伝子工学的手法については、特に断りのない場合、公知の方法 (例えば、 Maniatis, T.ら, 'Molecular Cloning— A Laboratory Manual , Cold ¾prin g Harbor Laboratory, NY, 1982)に従って実施することが可能である。
[0015] 1. 1炎症性サイト力イン処理によって発現が上昇するポリヌクレオチドの特定方法 本発明の、炎症性サイト力イン処理によって発現が上昇するポリヌクレオチドは、炎 症性サイト力イン処理によって発現量が変動するポリヌクレオチドであり、血管内皮細 胞に炎症性サイト力イン処理することによって、発現の上昇を確認することができる。 具体的には、例えば後述する実施例 1に示す方法により、血管内皮細胞より全 RNA を調製した後、 DNAマイクロアレイ解析を行うことによって、特定することができる。
[0016] 解析の結果、炎症性サイト力イン処理したヒト臍帯静脈血管内皮細胞と炎症性サイ トカイン処理しないヒト臍帯静脈血管内皮細胞で、発現量が著しく異なるポリヌクレオ チドを、炎症性サイト力イン誘導ポリヌクレオチドとして特定することができる。そしてこ の特定されたポリヌクレオチドを以下、「炎症性サイト力イン誘導ポリヌクレオチド」とす る。
ここで「著しく異なる」とは、例えば、ァフィメトリックス社ゃアジレント社などから巿販 されている DNAマイクロアレイによる解析により、炎症性サイト力イン処理した場合の 遺伝子の mRNA量が炎症性サイト力イン未処理の場合と比べ、 2倍以上増加して ヽ ると判断される場合ゃァプライドシステム社など力も市販されているリアルタイム PCR システム（定量的 PCRシステム）にお 、て炎症性サイト力イン処理した場合の遺伝子 の mRNA量が炎症性サイト力イン未処理の場合に比べ Δ CT値の差で 1以上の場合 、すなわち、 mRNA量が 2倍以上増加している場合等をいう。
[0017] こうして特定された炎症性サイト力イン誘導ポリヌクレオチドとしては具体的には配 列表の配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21又は 23で表される塩基配 列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。
[0018] 1. 2炎症性サイト力イン誘導ポリヌクレオチド
上記 1. 1において特定されたポリヌクレオチドの他に、それぞれのポリヌクレオチド とストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズし、炎症性サイト力インによって発現が上 昇するポリヌクレオチドも本発明のポリヌクレオチドに含めることができる。このようにし て特定されたポリヌクレオチドも「炎症性サイト力イン誘導ポリヌクレオチド」 t 、う。す なわち、本発明の炎症性サイト力イン誘導ポリヌクレオチドは、以下の 1)又は 2)のい ずれか一つに記載のポリヌクレオチドである。
1)配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21又は 23で表される塩基配列力 らなる DNA、
2)配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21又は 23で表される塩基配列力 らなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、炎症性サイト力イン の存在下にお!/、て (a)細胞接着分子の発現誘導機能、及び Z又は (b)血管内皮細 胞と白血球細胞との接着誘導機能を有するポリペプチドをコードするもの。
[0019] 本発明にお 、て、「ストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズする」とは、例えば、巿 販のハイブリダィゼーシヨン溶液 Express Hybridization Solution (クロンテック（C lontech)社製）中、 68°Cでハイブリダィズすること、または、 DNAを固定したフィルタ 一を用いて 0. 7- 1. 0Mの NaCl存在下 68°Cでハイブリダィゼーシヨンを行なった後 、 0. 1 2倍濃度の SSC溶液（1倍濃度 SSCとは 150mM NaCl、 15mMクェン酸 ナトリウム力もなる）を用い、 68°Cで洗浄することにより同定することができる条件また はそれと同等の条件でノヽイブリダィズすることをいう。
[0020] 1. 3炎症性サイト力イン誘導ポリヌクレオチドの検定
炎症性サイト力イン誘導ポリヌクレオチドは、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞において炎 症性サイト力イン処理によって、処理しない場合に比べ発現量が著しく増加しており、 炎症性サイト力インによって引き起こされる細胞接着分子の発現、及び Z又は血管 内皮細胞と白血球細胞の接着の変化に影響を与えるポリヌクレオチドであり、細胞接 着分子の発現や血管内皮細胞と白血球細胞の接着に影響を及ぼす物質のスクリー ユング等に用いることができる。
[0021] 具体的な検定方法の例としては、まず特定された炎症性サイト力イン誘導ポリヌクレ ォチド断片をプローブとして、ヒト cDNAライブラリ一等から、コロニーハイブリダィゼ ーシヨン法等、公知の方法に従い、完全長 cDNAを取得する。この完全長 cDNAを 適当な細胞に導入して高発現させ、血管内皮細胞と白血球細胞の接着に影響が生 じる力否かを調べることにより検定することができる。
[0022] また、試験する遺伝子の全 RNAに対するアンチセンス核酸を、細胞に導入し、各 標的細胞の機能にどの様な影響が出るかを調べることもできる。また、遺伝子の発現 を抑制する他の方法としては二本鎖の単鎖 RNA (siRNA)を用いる方法を挙げるこ ともできる（「ジーンズ'アンド'デヴエロップメンッ（Genes and Developments)」）、 2001年 1月 15日、第 15卷、第 2号、 p. 188— 200)。例えば、 siRNAを文献記載の 方法に従って導入し、 siRNAの対象となる遺伝子の発現量及び細胞接着分子の発 現量を調べることができる。逆に、後述の「5.形質転換細胞の作製方法」に従って形 質転換細胞を作製し、細胞の有する機能、具体的には、細胞接着分子の発現量や 白血球との接着にどの様な影響が現れるかを検討することができる。
[0023] 1. 4炎症性サイト力イン誘導ポリペプチドの細胞接着分子の発現誘導機能
炎症性サイト力イン誘導ポリヌクレオチドの発現を抑制した血管内皮細胞では細胞 接着分子の発現量の低下が観察される。例えば、配列表の配列番号 1、 3、 5、 7、 9 、 11、 13、 15、 17、 19、 21又は 23で表される塩基酉己列力らなる DNA、または、酉己 列番号 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21又は 23で表される塩基配列力もな る DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、炎症性サイト力インの存 在下にお 1、て (a)細胞接着分子の発現誘導機能、及び Z又は (b)血管内皮細胞と 白血球細胞との接着誘導機能を有するポリペプチドをコードする DNAに対する siR NAを作製し、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞にトランスフエクシヨンした場合に、陰性コン トロールに比べて、 ICAM—1、 VCAM—1、及び E—セレクチンなどの細胞接着分 子のいずれか、もしくは複数の発現量を有意に低下させる。すなわち、炎症性サイト 力イン誘導ポリヌクレオチドの発現産物である、炎症性サイト力イン誘導ポリペプチド は細胞接着分子の誘導に重要な役割 (細胞接着分子の発現誘導機能)を果たして いる。
[0024] 1. 5炎症性サイト力イン誘導ポリペプチドによる血管内皮細胞の白血球との接着誘 導機能
炎症性サイト力イン誘導ポリヌクレオチドの発現を抑制させた血管内皮細胞では白 血球との接着量の低下が観察される [0025] 例えば、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞に、配列表の配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13 、 15、 17、 19、 21又は 23で表される塩基配列力もなる DNA、または、配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21又は 23で表される塩基酉己列力らなる DNAと ストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、かつ、炎症性サイト力インの存在下にお V、て (a)細胞接着分子の発現誘導機能、及び Z又は (b)血管内皮細胞と白血球細 胞との接着誘導機能を有するポリペプチドをコードする DNAに対する siRNAを作製 し、標的細胞にトランスフエクシヨンした場合に、陰性コントロールに比べて、白血球 細胞との接着量が有意に低下する。すなわち、炎症性サイト力イン誘導ポリヌクレオ チドの発現産物である、炎症性サイト力イン誘導ポリペプチドは血管内皮細胞の白血 球細胞との接着誘導に重要な役割 (血管内皮細胞の白血球との接着誘導機能)を果 たしている。
[0026] 2.炎症性サイト力イン誘導ポリペプチド
本発明の「炎症性サイト力イン誘導ポリペプチド」は、血管内皮細胞において細胞 接着分子の発現誘導や血管内皮細胞と白血球細胞の接着に影響する、本発明のス クリーニングに用いることができるポリペプチドを意味する。本発明における炎症性サ イト力イン誘導ポリペプチドは、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞において、炎症性サイト力 イン処理すると、処理しない場合に比べ発現量が著しく増加しており、血管内皮細胞 において細胞接着分子の発現誘導や血管内皮細胞と白血球細胞の接着に影響を 与える被験物質を検出するためのスクリーニング等に利用することができ、本発明の 炎症性サイト力イン誘導ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである。
[0027] 本発明の炎症性サイト力イン誘導ポリペプチドは、上記 1. 4及び 1. 5に示したよう な、細胞接着分子の発現誘導機能、及び Z又は血管内皮細胞の白血球細胞との接 着誘導に重要な役割を果たしている。本発明のスクリーニングに用いることができる 炎症性サイト力イン誘導ポリペプチドとは具体的には、以下の 1)または 2)のいずれか に記載のポリペプチドである。
1)酉己列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22又は 24で表されるアミノ酸 配列からなるポリペプチド、または
2)酉己列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22又は 24で表されるアミノ酸 配列において、 1〜： L0個のアミノ酸が欠失、置換、及び Z又は付加されたアミノ酸配 列を有し、かつ、炎症性サイト力インの存在下において (a)細胞接着分子の発現誘 導機能、及び Z又は (b)血管内皮細胞と白血球細胞との接着誘導機能を有するポリ ペプチド。
[0028] 2)のポリペプチドに ίま、酉己歹 IJ番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22又 ίま 2 4で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、（a)細胞接着分子の発現誘導機能、及び Z又は (b)血管内皮細胞と白血球細胞との接着誘導機能を有するポリペプチドが含 まれ、例えば、配列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22又は 24で表され るアミノ酸配列力もなるポリペプチドの N末端及び Z又は C末端に、適当なマーカー 配列等を付加したポリペプチド (すなわち、融合ポリペプチド)も、（a)細胞接着分子 の発現誘導機能、及び Z又は (b)血管内皮細胞と白血球細胞との接着誘導機能を 有する限り、含まれる。前記マーカー配列としては、ポリペプチドの発現の確認、細胞 内局在の確認、あるいは、精製等を容易に行なうための配列を用いることができ、例 えば、 FLAGェピトープ、へキサーヒスチジン'タグ、へマグノレチュン 'タグ、又は myc ェピトープなどを挙げることができる。
[0029] なお、本明細書中において「ポリペプチド」という言葉には、タンパク質、これに糖鎖 が付加されたもの、塩も含むものとする。
[0030] 3.炎症性サイト力イン誘導ポリペプチドの生産方法
炎症性サイト力イン誘導ポリペプチドは、 in vitroにて合成する、あるいはこのポリべ プチドをコードするポリヌクレオチドを用いて公知の遺伝子工学的手法により調製す ることがでさる。
[0031] 3. 1 in vitro合成方法
より具体的には、 目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現可能なベクタ 一に組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質およびエネルギー物質を含む 溶液中で合成する方法である。例えばロシュ'ダイァグノスティックス (Roche diagno sties)社製のラビッドトランスレーションシステム (RTS)が挙げられる力 これに限定 されない。 RTSを用いる場合を例に挙げると、 目的の遺伝子を T7プロモーターにより 制御される発現ベクターにクローニングし、これを in vitroの反応系に添加すると、最 初に铸型 DNAより T7RNAポリメラーゼにより mRNAが転写され、その後大腸菌溶 解液中のリボソーム等により翻訳が行われ、 目的のポリペプチドが反応液中に合成さ れる（Biochemica、 1、 20— 23 (2001)、 Biochemica、 2、 28— 29 (2001)。
[0032] 3. 2 公知の遺伝子工学的手法により調製する方法
形質転換細胞 (すなわち、他の原核生物、または真核生物の宿主細胞を、炎症性 サイト力イン誘導ポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換させることによって、 前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞）を、前記ポリペプチドの発現が可能 な条件下で培養し、タンパク質の分離及び精製に一般的に用いられる方法により、そ の培養物から目的タンパク質を分離及び精製することにより調製することができる。具 体的には、「5.形質転換細胞の作製方法」の項において詳述する。
[0033] 4.炎症性サイト力イン誘導ポリペプチドに対する抗体
炎症性サイト力イン誘導ポリペプチドに対する抗体は、炎症性サイト力イン誘導ポリ ペプチドまたはその一部を特異的に認識するものである。このような抗体としては、例 えば、炎症性サイト力イン誘導ポリペプチドのいずれかに結合する力 他のいかなる タンパク質とも結合しないような抗体を挙げることができる。このような抗体は、後述す る「6.スクリーニング方法」の項で記載するポリペプチドの発現を測定するスクリー- ング方法に使用できるほか、抗体を含む医薬組成物としても利用することができる。
[0034] 前記抗体は、常法を用いて (例えば、新生化学実験講座 1、タンパク質 p. 389
- 397, 1992)、抗原となるタンパク質、あるいはそのアミノ酸配列から選択される任 意のポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することに よって得ることができる。また、公知の方法（例えば、 Kohler and Milstein、 Nature 256、 495—497、 1975、 Kennet、 R. ed. 、 Monoclonal Antibody p. 365— 3 67、 1980、 Prenum Press, N. Y. )に従って、 目的のポリペプチドに対する抗体を 産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイプリドーマを榭 立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。
[0035] 抗体を作製するための抗原としては、 目的のポリペプチドまたはその少なくとも 6個 の連続した部分アミノ酸配列力 なるポリペプチド、ある 、はこれらに任意のアミノ酸 配列や担体が付加された誘導体を挙げることができる。 [0036] 前記抗原ポリペプチドは目的のポリペプチドを in vitroにて合成する、あるいは遺 伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、目 的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現可能なベクターに組み込んだ後
、転写と翻訳に必要な酵素、基質およびエネルギー物質を含む溶液中で合成する、 あるいは他の原核生物、または真核生物の宿主細胞を形質転換させることによって 該ポリヌクレオチドを発現させることにより、該ポリヌクレオチドを得ることが出来る。
[0037] 抗原となるポリペプチドは上記、「3.炎症性サイト力イン誘導ポリペプチドの生産」 の項に記載した方法によって製造することができる。
[0038] 上記のようにして得られる抗体は、 RIA法、 ELISA法、蛍光抗体法、受身血球凝集 反応法などの各種免疫学的測定法や免疫組織染色などに用いることができる。
[0039] 目的のポリペプチドと特異的に結合する抗体の例として、目的ポリペプチドと特異 的に結合するモノクローナル抗体を挙げることができる力 その取得方法は、以下に 記載する通りである。
[0040] モノクローナル抗体の製造にあたっては、一般に下記のような作業工程が必要であ る。すなわち、
(a)抗原として使用する生体高分子の精製、
(b)抗原を動物に注射することにより免疫した後、血液を採取しその抗体価を検定し て脾臓摘出の時期を決定してから、抗体産生細胞を調製する工程、
(c)骨髄腫細胞 (以下「ミエローマ」 、う）の調製、
(d)抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、
(e)目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、
(f)単一細胞クローンへの分割（クロー-ング）、
(g)場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイプリドーマの 培養、またはノ、イブリドーマを移植した動物の飼育、
(h)このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性、およびその認識特異 性の検討、あるいは標識試薬としての特性の検定、等である。
[0041] 以下、モノクローナル抗体の作製法を上記工程に沿って詳述する力 該抗体の作 製法はこれに制限されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞およびミエローマを使 用することちでさる。
[0042] (a) 抗原の精製
抗原としては、前記したような方法で調製した本発明の蛋白質またはその一部を使 用することができる。さらに、本発明により本発明の蛋白質の一次構造が明らかにさ れたので、当業者に周知の方法を用いて、本発明の蛋白質の部分ペプチドをィ匕学 合成し、これを抗原として使用することもできる。
[0043] (b) 抗体産生細胞の調製
工程 (a)で得られた抗原と、フロインドの完全または不完全アジュバント、またはカリ ミヨウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物とし ては、マウスが最も好適に用いられる力 これに限定されない。
[0044] マウス免疫の際の免疫原投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注 射、筋肉内注射いずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。
[0045] 免疫は、一回、または、適当な間隔で (好ましくは 1週間から 5週間間隔で)複数回 繰返し行なうことができる。その後、免疫した動物の血清中の抗原に対する抗体価を 測定し、抗体価が十分高くなつた動物を抗体産生細胞の供給原として用いれば、以 後の操作の効果を高めることができる。一般的には、最終免疫後 3〜5日後の動物由 来の抗体産生細胞を後の細胞融合に用いることが好ま 、。
[0046] ここで用いられる抗体価の測定法としては、放射性同位元素免疫定量法 (以下「RI A法」という）、固相酵素免疫定量法 (以下「ELISA法」という）、蛍光抗体法、受身血 球凝集反応法など種々の公知技術があげられるが、検出感度、迅速性、正確性、お よび操作の自動化の可能性などの観点から、 RIA法または ELISA法がより好適であ る。
[0047] 本発明における抗体価の測定は、例えば ELISA法によれば、以下に記載するよう な手順により行うことができる。まず、精製または部分精製した抗原を ELISA用 96穴 プレート等の固相表面に吸着させ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と 無関係なタンパク質、例えばゥシ血清アルブミン (以下「BSA」という）により覆い、該 表面を洗浄後、第一抗体として段階希釈した試料 (例えばマウス血清）に接触させ、 上記抗原に試料中のモノクローナル抗体を結合させる。さらに第二抗体として酵素標 識されたマウス抗体に対する抗体を加えてマウス抗体に結合させ、洗浄後該酵素の 基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定することにより、抗 体価を算出する。
[0048] (c) ミエローマの調製工程
ミエローマとしては、一般的にはマウス力 得られた株化細胞、例えば 8—ァザグァ -ン而性マウス（BALBZc由来）ミエローマ株 P3X63Ag8U. 1 (P3— Ul) [Yelton , D. Ε. et al. Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1 — 7 (1978) ]、 P3ZNSI Zl—Ag4—1 (NS— 1) [Kohler, G. et al. Europea n j. Immunology, 6, 511— 519 (1976) ]、 Sp2 Z〇— Agl4 (SP— 2) [Sh ulman, M. et al. Nature, 276, 269— 270 (1978) ]などを用! /、ること力 子ま しい。これらの細胞株は、適当な培地、例えば 8—ァザグァニン培地 [RPMI— 1640 培地にグルタミン、 2—メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、およびゥシ胎児血清（ 以下「FCS」という）をカ卩えた培地に 8—ァザグァニンをカ卩えた培地]、イスコフ改変ダ ノレべッコ培地 (Iscove，s Modified Dulbecco' s Medium；以下「IMDM」という)、 またはダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco' s Modified Eagle Medium;以下 「DMEM」という）で継代培養する力 細胞融合の 3から 4日前に正常培地 [例えば、 10% FCSを含む ASF104培地（味の素 (株)社製) ]で継代培養し、融合当日に 2 X 107以上の細胞数を確保しておく。
[0049] (d) 細胞融合
抗体産生細胞は、形質細胞、およびその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個 体のいずれの部位力 得てもよぐ一般には脾、リンパ節、末梢血、またはこれらを適 宜組み合わせたもの等力 得ることができる力 脾細胞が最も一般的に用いられる。
[0050] 最終免疫後、所定の抗体価が得られたマウス力 抗体産生細胞が存在する部位、 例えば脾臓を摘出し、抗体産生細胞である脾細胞を調製する。この脾細胞と工程 (c )で得られたミエローマを融合させる手段として現在最も一般的に行われているのは 、細胞毒性が比較的少なく融合操作も簡単なポリエチレングリコールを用いる方法で ある。この方法は、例えば以下の手順よりなる。
[0051] 脾細胞とミエローマとを無血清培地（例えば RPMI1640)、またはリン酸緩衝生理 食塩液（以下「PBS」と 、う）でよく洗浄し、脾細胞とミエローマの細胞数の比が 5： 1〜 10 : 1程度になるように混合し、遠心分離する。上清を除去し、沈澱した細胞群をよく ほぐした後、撹拌しながら lmlの 50% (wZv)ポリエチレングリコール (分子量 1000 〜4000)を含む無血清培地を滴下する。その後、 10mlの無血清培地をゆっくりとカロ えた後遠心分離する。再び上清を捨て、沈澱した細胞を適量のヒポキサンチン'アミ ノプテリン'チミジン (以下「HAT」 t 、う）液およびマウスインターロイキン 2 (以下「I L— 2」と 、う）を含む正常培地（以下「HAT培地」 t 、う）中に懸濁して培養用プレー ト（以下「プレート」という）の各ゥエルに分注し、 5%炭酸ガス存在下、 37°Cで 2週間 程度培養する。途中適宜 HAT培地を補う。
[0052] (e) ハイプリドーマ群の選択
上記ミエローマ細胞が、 8—ァザグァニン耐性株である場合、すなわち、ヒポキサン チン.グァニン.ホスホリボシルトランスフェラーゼ (HGPRT)欠損株である場合、融合 しなかった該ミエローマ細胞、およびミエローマ細胞どうしの融合細胞は、 HAT含有 培地中では生存できない。一方、抗体産生細胞どうしの融合細胞、あるいは、抗体産 生細胞とミエローマ細胞とのハイプリドーマは生存することができる力 抗体産生細胞 どうしの融合細胞には寿命がある。従って、 HAT含有培地中での培養を続けること によって、抗体産生細胞とミエローマ細胞とのハイプリドーマのみが生き残り、結果的 にハイプリドーマを選択することができる。
[0053] コロニー状に生育してきたノヽイブリドーマについて、 HAT培地力 アミノプテリンを 除いた培地 (以下「HT培地」という）への培地交換を行う。以後、培養上清の一部を 採取し、例えば、 ELISA法により抗体価を測定する。
[0054] 以上、 8 ァザグァニン耐性の細胞株を用いる方法を例示した力 その他の細胞株 もハイプリドーマの選択方法に応じて使用することができ、その場合使用する培地組 成も変化する。
[0055] (e) クローニング
工程 (b)の記載と同様の方法で抗体価を測定することにより、特異的抗体を産生す ることが判明したハイプリドーマを、別のプレートに移しクローユングを行う。このクロー ユング法としては、プレートの 1ゥエルに 1個のハイプリドーマが含まれるように希釈し て培養する限界希釈法、軟寒天培地中で培養しコロニーを回収する軟寒天法、マイ クロマ-ュピレーターによって 1個ずつの細胞を取り出し培養する方法、セルソーター によって 1個の細胞を分離する「ソータクローン」などが挙げられるが、限界希釈法が 簡便でありよく用いられる。
[0056] 抗体価の認められたゥエルについて、例えば限界希釈法によるクローユングを 2〜 4回繰返し、安定して抗体価の認められたものを本発明のモノクローナル抗体産生ハ イブリドーマ株として選択する。
[0057] (f) ハイプリドーマ培養によるモノクローナル抗体の調製
クロー-ングを完了したノヽイブリドーマは、培地を HT培地力 正常培地に換えて培 養される。大量培養は、大型培養瓶を用いた回転培養、あるいはスピナ一培養で行 われる。この大量培養における上清を、ゲル濾過等、当業者に周知の方法を用いて 精製することにより、本発明の蛋白質に特異的に結合するモノクローナル抗体を得る ことができる。また、同系統のマウス（例えば、上記の BALBZc)、あるいは NuZNu マウスの腹腔内で該ノ、イブリドーマを増殖させることにより、本発明のモノクローナル 抗体を大量に含む腹水を得ることができる。精製の簡便な方法としては、市販のモノ クローナル抗体精製キット (例えば、 MAbTrap GIIキット；フアルマシア社製)等を利 用することもできる。力べして得られるモノクローナル抗体は、目的のポリペプチドに対 して高 ヽ抗原特異性を有する。
[0058] (g) モノクローナル抗体の検定
力べして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプおよびサブクラスの決定は以下 のように行うことができる。まず、同定法としてはォクテル口-一（Ouchterlony)法、 ELISA法、または RIA法が挙げられる。ォクテル口-一法は簡便ではある力 モノク ローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。一方、 ELISA法また は RIA法を用いた場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに第 二次抗体として各種ィムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用い ることにより、モノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能で ある。また、さらに簡便な方法として、市販の同定用のキット（例えば、マウスタイパー キット;バイオラッド社製)等を利用することもできる。 [0059] さらに、タンパク質の定量は、フォーリンロウリー法、および 280nmにおける吸光度 [1. 4 (OD280) =ィムノグロブリン lmgZml]より算出する方法により行うことができ る。
[0060] このようにして得られる本発明のモノクローナル抗体は、その特異性を利用した目 的のポリペプチドの検出や分離精製に用いることができる。
[0061] 5.形質転換細胞の作製方法
本発明のスクリーニングに用いるため、もしくは目的のポリペプチドを産生するため に有用である形質転換細胞は、炎症性サイト力イン誘導ポリヌクレオチドを、適当な ベクター DNAに組込んだ後、宿主細胞 (原核細胞、真核細胞）を形質転換させて作 製することができる。
[0062] 目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの製造方法は、特に限定されるもの ではないが、例えば、（I) PCRを用いた方法、（Π)常法の遺伝子工学的手法 (すなわ ち、 cDNAライブラリーで形質転換した形質転 ·から、所望の cDNAを含む形質 転 ·を選択する方法)を用いる方法、又は (ΠΙ)化学合成法などを挙げることがで きるが、好ましくは PCRを用いた方法である。以下、各製造方法について、順次、説 明する。
[0063] (I) PCRを用 V、た方法
PCRを用いた方法では、例えば、以下の手順により、 目的のポリペプチドをコード するポリヌクレオチドを製造することができる。すなわち、 目的のポリペプチドを産生す る能力を有するヒト細胞又は組織力も mRNAを抽出する。次いで、 目的のポリべプチ ドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて、 目的のポリペプチドに相当す る mRNAの全長を挟むことのできる 2個 1組のプライマーセット、あるいは、その一部 の mRNA領域を挟むことのできる 2個 1組のプライマーセットを作成する。逆転写酵 素 ポリメラーゼ連鎖反応 (RT— PCR)を行なうことにより、 目的のポリペプチドの全 長 cDNA又はその一部を得ることができる。
[0064] より詳細には、まず、 目的のポリペプチドの産生能力を有する細胞又は糸且織 (例え ば、脾臓)から、 目的のポリペプチドをコードする mRNAを含む総 RNAを既知の方 法により抽出する。抽出法としては、例えば、グァ-ジン'チオシァネート 'ホット'フエ ノール法、グァ-ジン'チオシァネート グァ-ジン'塩酸法、又はグァ-ジン'チオシ ァネート塩ィ匕セシウム法等を挙げることができる力 グァ-ジン ·チオシァネート塩ィ匕 セシウム法を用いることが好ましい。 目的のポリペプチドの産生能力を有する細胞又 は糸且織は、例えば、 目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその一部を 用いたノーザンブロッテイング法、あるいは、 目的のポリペプチドに特異的な抗体を用 いたウェスタンブロッテイング法などにより特定することができる。
[0065] 続ヽて、抽出した mRNAを精製する。 mRNAの精製は常法に従えばよぐ例えば 、 mRNAをオリゴ (dT)セルロースカラムに吸着後、溶出させること〖こより精製すること ができる。所望により、ショ糖密度勾配遠心法等により mRNAを更に分画することも できる。また、 mRNAを抽出しなくても、市販されている抽出精製済みの mRNAを用 いることもできる。次に、精製された mRNAを、例えば、ランダムプライマー、オリゴ dT プライマー、及び Z又はカスタム合成したプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を 行ない、第 1鎖 cDNAを合成する。この合成は、常法によって行なうことができる。得 られた第 1鎖 cDNAを用い、 目的ポリヌクレオチドの全長又は一部の領域を挟んだ 2 つのプライマーを用いて PCRを実施し、 目的とする cDNAを増幅することができる。 得られた DNAをァガロースゲル電気泳動等により分画する。所望により、前記 DNA を制限酵素等で切断し、接続することによって目的とする DNA断片を得ることもでき る。また、ゲノム DNAから目的とする DNA断片を得ることもできる。
[0066] (II)常法の遺伝子工学的手法を用いる方法
常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、例えば、以下の手順により、 目的の ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを製造することができる。まず、前記の PCR を用いた方法で調製した mRNAを铸型として、逆転写酵素を用いて 1本鎖 cDNAを 合成した後、この 1本鎖 cDNAから 2本鎖 cDNAを合成する。その方法としては、例 えば、 S1ヌクレアーゼ法（Efstratiadis, A.ら， Cell, 7, 279— 288, 1976)、 Land 法（Land, H.ら， Nucleic Acids Res. 9, 2251— 2266, 1981)、 O. Joon Yoo 法 (Yoo, O. J.ら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1049— 1053, 1983)、 又は Okayama— Berg法（Okayama, H.及び Berg, P. Mol. Cell. Biol. 2, 161 - 170, 1982)などを挙げることができる。 [0067] 次に、前記 2本鎖 cDNAを含む組換えプラスミドを作製した後、大腸菌（例えば、 D H5ひ株）に導入して形質転換させ、例えば、テトラサイクリン又はアンピシリンに対す る薬剤耐性を指標として、組換体を選択する。宿主細胞の形質転換は、例えば、宿 主細胞が大腸菌の場合には、 Hanahanの方法（Hanahan, D. J. Mol. Biol. 166 , 557- 580, 1983)、すなわち、 CaCl、 MgCl、又は RbClを共存させて調製した
2 2
コンビテント細胞に、前記組換え DNA体をカ卩える方法により実施することができる。 なお、ベクターとしては、プラスミド以外にもラムダ系などのファージベクターを用いる ことちでさる。
[0068] このようにして得られる形質転 ·から、 目的の cDNAを有する形質転 ·を選択 する方法としては、例えば、以下に示す (A)合成オリゴヌクレオチドプローブを用いる スクリーニング法、（B) PCRにより作製したプローブを用いるスクリーニング法、（C) 他の動物細胞で目的ポリペプチドを産生させてスクリーニングする方法、（D)目的の ポリペプチドに対する抗体を用いて選択する方法、又は (E)セレクティブ'ハイブリダ ィゼーシヨン'トランスレーション系を用いる方法を採用することができる。
[0069] (A)合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング法では、例えば、以下の 手順により、 目的の cDNAを有する形質転換株を選択することができる。すなわち、 目的ポリペプチドの全部又は一部に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプロ ーブ (32P又は33 Pで標識する）として、形質転赚の DNAを変性固定した-トロセル ロースフィルターとハイブリダィズさせ、得られた陽性株を検索して、これを選択する。 なお、プローブ用のオリゴヌクレオチドを合成する場合には、コドン使用頻度を用いて 導いたヌクレオチド配列とすることもできるし、あるいは、考えられるヌクレオチド配列 を組合せた複数個のヌクレオチド配列とすることもできる。後者の場合には、イノシン を含ませてその種類を減らすことができる。
[0070] (B) PCRにより作製したプローブを用いるスクリーニング法では、例えば、以下の手 順により、 目的の cDNAを有する形質転換株を選択することができる。すなわち、 目 的ポリペプチドの一部に対応するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの各 オリゴヌクレオチドを合成し、これらを組合せて PCRを行ない、 目的ポリペプチドの全 部又は一部をコードする DNA断片を増幅する。ここで用いる铸型 DNAとしては、 目 的ポリペプチドを産生する細胞の mRNAより逆転写反応にて合成した cDNA、又は ゲノム DNAを用いることができる。このようにして調製した DNA断片を、例えば、 32P 又は 33Pで標識し、これをプローブとして用いてコロニーハイブリダィゼーシヨン又は プラークハイブリダィゼーシヨンを行なうことにより、 目的の cDNAを有する形質転換 株を選択する。
[0071] (C)他の動物細胞で目的ポリペプチドを産生させてスクリーニングする方法では、例 えば、以下の手順により、 目的の cDNAを有する形質転換株を選択することができる 。すなわち、形質転 ·を培養し、ポリヌクレオチドを増幅させ、そのポリヌクレオチド を動物細胞にトランスフ タトし、ポリヌクレオチドにコードされたポリペプチドを細胞表 面に産生させる。なお、この場合、自己複製可能で転写プロモーター領域を含むプ ラスミド、あるいは、動物細胞の染色体に組み込まれ得るようなプラスミドのいずれを 用いることもできる。 目的のポリペプチドに対する抗体を用いて、 目的のポリペプチド を検出することにより、元の形質転換株の中から、 目的の cDNAを有する形質転換 株を選択する。
[0072] (D)目的のポリペプチドに対する抗体を用いて選択する方法では、例えば、以下の 手順により、 目的の cDNAを有する形質転換株を選択することができる。すなわち、 予め、 cDNAを発現ベクターに組込み、形質転換株の細胞表面でポリペプチドを産 生させ、 目的のポリペプチドに対する抗体及び前記抗体に対する 2次抗体を用いて 、所望のポリペプチド産生株を検出し、 目的の cDNAを有する形質転換株を選択す る。
[0073] (E)セレクティブ'ハイブリダィゼーシヨン'トランスレーション系を用いる方法では、例 えば、以下の手順により、 目的の cDNAを有する形質転換株を選択することができる 。すなわち、形質転^ から得られる cDNAを、ニトロセルロースフィルタ一等にブロ ットし、 目的のポリペプチドの産生能力を有する細胞力も別途調製した mRNAをノヽィ ブリダィズさせた後、 cDNAに結合した mRNAを解離させ、回収する。回収された m RNAを適当なポリペプチド翻訳系、例えば、アフリカッメガエルの卵母細胞へ注入し たり、あるいは、ゥサギ網状赤血球ライゼート又は小麦胚芽等の無細胞系を用いて、 ポリペプチドに翻訳させる。 目的のポリペプチドに対する抗体を用いて検出して、 目 的の cDNAを有する形質転換株を選択する。
[0074] 得られた目的の形質転換株より目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを 採取する方法は、公知の方法（例えば、 Maniatis, T.ら， "Molecular Cloning - A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982)に従 つて実施することができる。例えば、細胞よりプラスミド DNAに相当する画分を分離し 、得られたプラスミド DNAから cDNA領域を切り出すことにより行なうことができる。
[0075] (III)化学合成法を用 、た方法
化学合成法を用いた方法では、例えば、化学合成法によって製造した DNA断片 を結合することによって、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを製造する ことができる。各 DNAは、 DNA合成機 [例えば、 Oligo 1000M DNA Synthesize r (Beckman社製）、又は 394 DNA/RNA Synthesizer (Applied Biosystems 社製)など]を用いて合成することができる。また、目的のポリペプチドをコードするポ リヌクレオチドは、目的のポリペプチドの情報に基づいて、例えば、ホスファイト 'トリェ ステノレ法（Hunkapiller, M.ら， Nature, 10, 105— 111, 1984)等の常法【こ従!ヽ 、核酸の化学合成により製造することもできる。なお、所望アミノ酸に対するコドンは、 それ自体公知であり、その選択も任意でよぐ例えば、利用する宿主のコドン使用頻 度を考慮して、常法に従って決定することができる（Crantham, R.ら， Nucleic Aci ds Res. 9, 43 - 74, 1981)。更に、これら塩基配列のコドンの一部改変は、常法に 従 、、所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した 部位特異的突然変異誘発法（site specific mutagenesis) (Mark, D. F.ら， Pro c. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662— 5666, 1984)等により実施すること力 Sで きる。
[0076] このようにして得られる DNAの配列決定は、例えば、マキサム ギルバートの化学 修飾法（Maxam, A. M.及び Gilbert, W. "Methods in Enzymology", 65, 49 9 - 559, 1980)ゃジデォキシヌクレオチド鎖終結法（Messing, J.及び Vieira, J. Gene, 19, 269— 276, 1982)等により行なうこと力 Sできる。
[0077] 原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli)や枯草菌（Bacillus subtilis)などが挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させる には、宿主と適合し得る種由来のレブリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んで いるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベクターとしては、形質 転換細胞に表現形質 (表現型)の選択性を付与することができる配列を有するものが 好ましい。
[0078] 例えば、大腸菌としては K12株などがよく用いられ、ベクターとしては、一般に pBR 322や pUC系のプラスミドが用いられる力 これらに限定されず、公知の各種菌株、 およびベクターがいずれも使用できる。
[0079] プロモーターとしては、大腸菌においては、トリプトファン (trp)プロモーター、ラクト ース（lac)プロモーター、トリプトファン 'ラタトース（tac)プロモーター、リポプロテイン（ lpp)プロモーター、ポリペプチド鎖伸張因子 Tu (tufB)プロモーター等が挙げられ、 どのプロモーターも目的のポリペプチドの産生に使用することができる。
[0080] 枯草菌としては、例えば 207— 25株が好ましぐベクターとしては pTUB228 (Oh mura、 K. et al. (1984)J. Biochem. 95、 87— 93)など力 ^用!ヽられる力 これに 限定されるものではない。枯草菌の a アミラーゼのシグナルペプチド配列をコード する DNA配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。
[0081] 真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物 細胞としては、例えば、サルの細胞である COS細胞（Gluzman、 Y. (1981) Cell 2 3、 175— 182、 ATCC : CRL— 1650)やチャイニーズ'ノ、ムスター卵巣細胞（CHO 細胞、八丁じじ：じ0^— 61)のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（1；1：1&111)、 G. and Chas in、 L. A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77、 4126— 4220)等力 く用 いられている力 これらに限定されない。
[0082] 脊椎動物細胞の発現プロモーターとしては、通常発現しょうとする遺伝子の上流に 位置するプロモーター、 RNAのスプライス部位、ポリアデニルイ匕部位、および転写終 結配列等を有するものを使用でき、さらにこれは必要により複製起点を有してもよい。 該発現べクタ一の例としては、サイトメガロウィルス初期プロモーターを有する pCR3 . 1 (インビトロジェン社製）、 SV40の初期プロモーターを有する pSV2dhfr (Subra mani、 S. et al. (1981) Mol. Cell. Biol. 1、 854— 864)等力 ^挙げられる力 これ に限定されない。 [0083] 宿主細胞として、 COS細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、 S V40複製起点を有し、 COS細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロ モーター、転写終結シグナル、および RNAスプライス部位を備えたものを用いること ができる。該発現べクタ一は、ジェチルアミノエチル（DEAE)—デキストラン法 (Lut hman、H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res. 11、 1295— 130 8)、リン酸カルシウム— DNA共沈殿法（Graham、 F. L. and van der Eb、 A. J. ( 1973) Virology 52、 456— 457)、および電気パルス穿孔法（Neumann, E. et al . (1982) EMBO J. 1、 841— 845)などにより COS糸田胞に取り込ませること力 Sでき、 力べして所望の形質転換細胞を得ることができる。また、宿主細胞として CHO細胞を 用いる場合には、発現ベクターと共に、抗生物質 G418耐性マーカーとして機能する neo遺伝子を発現し得るベクター、例えば pRSVneo (Sambrook、J. et al. (1989) ： 'Molecular Cloning A Laboratory Manual し old Spring Harbor Laborat ory、 NY)や pSV2neo (Southern、 P. J. and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1、 327— 341)などをコ 'トランスフエタトし、 G418而性のコロニーを選択す ることにより、 目的のポリペプチドを安定に産生する形質転換細胞を得ることができる
[0084] 昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、鱗翅類ャガ科の Spodoptera frugip erdaの卵巣細胞由来株化細胞（Sf— 9または Sf— 21)や Trichoplusia niの卵細胞 由来 High Five細胞（Wickham、 T. J. et al、 (1992) Biotechnol. Prog. I : 39 1 - 396)などが宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウィルストランスファーベクター としてはオートグラファ核多角体ウィルス (AcNPV)のポリヘドリンタンパク質のプロモ 一ターを利用した PVL1392Z1393がよく用いられる（Kidd、 I. M. and V. C. Em ery (199 5)The use of baculoviruses as expression vectors. Applied Bioch emistry and Biotechnology 42、 137— 159)。この他にも、バキュロウィルスの P 10や同塩基性タンパク質のプロモーターを利用したベクターも使用できる。さらに、 AcNPVのエンベロープ表面タンパク質 GP67の分泌シグナル配列を目的タンパク 質の N末端側に繋げることにより、組換えタンパク質を分泌タンパク質として発現させ ることも可能である（Zhe— mei Wang、 et al. (1998) Biol. Chem. 379、 167—1 74)。
[0085] 真核微生物を宿主細胞とした発現系としては、酵母が一般によく知られており、そ の中でもサッカロミセス属酵母、例えばノ ン酵母 Saccharomyces cerevisiaeや石 油酵母 Pichia pastorisが好ましい。該酵母などの真核微生物の発現ベクターとして は、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Bennetzen、J. L. and Hall, B. d. (1982)J. Biol. Chem. 257、 3018— 3025)や酸性フォスファターゼ 遺伝子のプロモーター（Miyanohara、 A. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci . USA 80、 1— 5)などを好ましく利用できる。また、分泌型タンパク質として発現させ る場合には、分泌シグナル配列と宿主細胞の持つ内在性プロテアーゼあるいは既知 のプロテアーゼの切断部位を N末端側に持つ組換え体として発現することも可能で ある。例えば、トリプシン型セリンプロテア一ゼのヒトマスト細胞トリプターゼを石油酵母 で発現させた系では、 N末端側に酵母の αファクターの分泌シグナル配列と石油酵 母の持つ ΚΕΧ2プロテアーゼの切断部位をつなぎ発現させることにより、活性型トリ プターゼが培地中に分泌されることが知られている（Andrew, L. Niles、 et al. (19 98) Biotechnol. Appl. Biochem. 28、 125— 131)。
[0086] 上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従って培養することができ、前記 培養により細胞内、または細胞外に目的のポリペプチドが生産される。前記培養に用 いることのできる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を 適宜選択することができる。例えば、 COS細胞の場合には、例えば、 RPMI- 1640 培地又はダルベッコ修正イーグル最小必須培地（DMEM)等の培地に、必要に応じ て牛胎仔血清 (FBS)等の血清成分を添加した培地を使用することができる。また、 2 93— EBNA細胞の場合には、牛胎仔血清 (FBS)等の血清成分を添加したダルべ ッコ修正イーグル最小必須培地（DMEM)等の培地に G418を加えた培地を使用す ることがでさる。
[0087] 上記培養により、形質転換体の細胞内または細胞外に産生される組換え体は、 目 的とするポリペプチドの物理的性質やィ匕学的性質などを利用した各種の公知の分離 操作法により分離 ·精製することができる。該方法としては、具体的には例えば、通常 のタンパク沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、 吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ-ティクロマトグラフィー 、高速液体クロマトグラフィー（HPLC)などの各種液体クロマトグラフィー、透析法、こ れらの組合せなどを例示できる。また、発現させる組換えタンパク質に 6残基力もなる ヒスチジンを繋げることにより、ニッケルァフィユティーカラムで効率的に精製すること ができる。上記方法を組み合わせることにより容易に高収率、高純度で目的のポリべ プチドを大量に製造できる。また、精製したポリペプチドの分子量は質量分析器、 SD S— PAGE等通常の方法で決定することができる。なお、スプライシングバリアントが 存在する可能性もあるが、 目的のポリペプチドと同一の機能 (生物活性)を有する限り においてこれらのポリペプチドも目的のポリペプチドに含まれる。
[0088] 前記形質転換細胞を培養することにより、前記細胞の内外に生産される目的のポリ ペプチドは、前記ポリペプチドの物理的性質や生化学的性質等を利用した各種の公 知の分離操作法により、分離精製することができる。具体的には、例えば、 目的のポ リペプチドを発現した細胞を培養し、これらをバッファーに懸濁した後、ホモジナイズ し、遠心分離することにより、 目的のポリペプチドを含む画分を得ることができる。得ら れた画分を可溶化した後、通常のタンパク質沈殿剤による処理、限外濾過、各種液 体クロマトグラフィー [例えば、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマト グラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、ァフィ-ティクロマトグラフィー、又は高 速液体クロマトグラフィー (HPLC)等]、若しくは透析法、又はこれらの組合せ等によ り、 目的のポリペプチドを精製することができる。なお、細胞膜画分を可溶化する際に は、できるだけ緩和な可溶化剤（例えば、 CHAPS、 Triton X— 100、又はジキト- ン等)を用いることにより、可溶ィ匕後も受容体の特性を保持することができる。
[0089] 目的のポリペプチドは、マーカー配列とインフレームで融合して発現させることによ り、ポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、又は精製等が容易になる。前記 マーカー配列としては、例えば、 FLAGェピトープ、へキサーヒスチジン'タグ、へマ ダルチュン'タグ、又は mycェピトープなどを挙げることができる。また、マーカー配列 と目的のポリペプチドとの間に、プロテアーゼ（例えば、ェンテロキナーゼ、ファクター Xa、又はトロンビンなど）が認識する特異的なアミノ酸配列を挿入することにより、マ 一力一配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去することが可能である。例え ば、ムスカリンアセチルコリン受容体とへキサーヒスチジン'タグとをトロンビン認識配 列で連結した報告がある（Hayashi, M. K.及び Haga, T. J. Biochem. 120, 12 32 - 1238, 1996)。
[0090] 6.本発明のスクリーニング方法
本発明のスクリ一-ング方法に使用するポリペプチドは、血管内皮細胞に炎症性サ イト力インの一種である TNF— aの添カ卩によって発現量が上昇した遺伝子がコード するポリペプチドとして見出されたものである。実施例にも示すように ICAM— 1、 VC AM— 1、 E—セレクチン等の細胞接着分子の発現誘導や血管内皮細胞の白血球 細胞との接着に関って 、ることがわ力る。
[0091] したがって、該ポリペプチドの機能を抑制する物質は、細胞接着分子の発現を抑制 し、ひいては血管内皮細胞が白血球細胞と接着することを阻害する物質 (以下、「血 管内皮細胞接着抑制物質」という）となる。このような物質は、血管内皮細胞と白血球 細胞の接着を阻害するので、これらが原因とされる炎症性疾患、自己免疫疾患、喘 息、乾癬、移植における拒絶反応、関節リウマチなどにも適応できるが、炎症性疾患 への適応が最も好ましい。
[0092] また、該ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも 一つの発現量を測定することによって抗炎症薬のスクリーニングをすることができる。
[0093] 本スクリーニング方法に用いられる「被験物質」とは、本発明のスクリーニング方法 で本発明の該ポリペプチドの機能を促進又は抑制する効果を調べる対象となる物質 をいう。被験物質としては、化合物、微生物の代謝産物、植物や動物組織の抽出物 、それらの誘導体またはそれらの混合物等が挙げられる。また、本発明の該ポリヌク レオチドの発現量を増加するように設計された核酸またはその誘導体 (アンチセンス オリゴヌクレオチド、リボザィム、 siRNA等を含む）を、被験物質として使用することも 可能である。被験物質の投与量や濃度は適宜設定するか、または例えば希釈系列 を作成するなどして複数種の投与量を設定してもよぐ個体、液体等適当な状態で投 与することができ、適当なバッファーに溶解したり、安定化剤等を加えてもよい。培養 細胞を用いるスクリーニング方法の場合には、培地に添加して培養することができる 。培地に添加する場合には培養開始時カゝら添加してもよいし、培養途中で添加して も良ぐまた、添加の回数も 1回に限らない。被験物質存在下で培養する期間も適宜 設定してよいが、好ましくは 30分力も 48時間である。哺乳動物個体に被験物質を投 与する場合は、被験物質の物性等により経口投与、静脈注射、腹腔内注射、経皮投 与、皮下注射等の投与形態を使い分ける。また、投与から、検体を得るまでの時間は 適当に選択することができる。
[0094] 本スクリーニング方法に用いられる細胞としては炎症性サイト力イン誘導ポリべプチ ドを発現し、血管内皮細胞または血管内皮細胞に由来する細胞、もしくは TNF— a 等の炎症性サイト力インによる刺激により血管内皮細胞に生じる同様の炎症性反応 が発現する細胞であれば、特に制限されず用いることができる。またヒトと同じ反応を 示せば細胞の動物種に制限されず使用できる。具体的には、本発明である炎症性 サイト力イン誘導ポリペプチドを安定発現するヒト血管内皮細胞株、もしくはレトロウイ スルベクターなどで炎症性サイト力イン誘導ポリペプチドを強制発現させたヒト臍帯静 脈血管内細胞 (HUVEC)ゃヒト微小血管内皮細胞 (HMEC— 1)などを血管内皮細 胞用培地（Cell Applications社製）ある!/ヽは 10%牛胎児血清（FBS)を含む MCD B131培地 (インビトロジェン社製を)で培養したものが使用できる。
[0095] 本スクリーニング方法を実施するにあたって血管内皮細胞を使用する場合におい ては、生体内の炎症状態を再現するため、培養細胞に刺激を加えることが望ましい。 具体的には、炎症性サイト力イン、 LPS,百日咳毒素などを培地中に添加する方法 が挙げられる。炎症性サイト力インとしては、細菌やウィルス感染、腫瘍、組織損傷な どに伴う炎症反応に深く関与するサイト力インをさす。例えば、インターロイキン 1 (IL — 1)、インターロイキン 6 (IL— 6)、腫瘍壊死因子 (TNF—ひ）などが挙げられるが、 好ましくは腫瘍壊死因子 (TNF— α )である。
[0096] 本実施態様のための試料を調製するための材料としては、被験物質存在下または 非存在下で培養した培養細胞の全細胞抽出液または核抽出画分が用いられ得るが 、全細胞抽出液が好適である。全細胞抽出液は、必要により高速遠心することにより 不溶性の物質を除去した後、 ELISAZRIA用試料やウェスタンブロット用試料の調 製工程に供される。
[0097] 6. 1 発現量の測定を利用したスクリーニング方法 炎症性サイト力イン誘導ポリペプチドは、血管接着分子の発現を誘導させることによ り血管内皮細胞に白血球細胞との細胞接着を誘導する。したがって、該ポリペプチド の発現量を減少させる物質は血管内皮細胞接着抑制能を有する物質である。これら の物質は具体的には以下の工程を含むスクリーニング方法によって取得することが できる。
A— 1.遺伝子の発現量を測定する場合
(1)血管内皮細胞と、被験物質とを接触させる工程、及び
(2)下記のいずれかに記載の遺伝子の発現量を測定する工程を含む血管内皮細胞 接着抑制物質のスクリーニング方法：
1)配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21又は 23で表される塩基配列力 らなる DNA、または
2)配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21又は 23で表される塩基配列力 らなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、炎症性サイト力イン の存在下にお!/、て (a)細胞接着分子の発現誘導機能、及び Z又は (b)血管内皮細 胞と白血球細胞との接着誘導機能を有するポリペプチドをコードするもの。
A— 2.ポリペプチドの発現量を測定する場合
(1)血管内皮細胞と、被験物質とを接触させる工程、及び
(2)下記のいずれかに記載のポリペプチドの発現量を測定する工程を含む血管内皮 細胞接着抑制物質のスクリーニング方法：
1)酉己列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22又は 24で表されるアミノ酸酉己 列からなるポリペプチド、または
2)酉己列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22又は 24で表されるアミノ酸酉己 列において、 1〜： L0個のアミノ酸が欠失、置換、及び Z又は付加されたアミノ酸配列 を有し、かつ、炎症性サイト力インの存在下において (a)細胞接着分子の発現誘導 機能、及び Z又は (b)血管内皮細胞と白血球細胞との接着誘導機能を有するもの。 B.形質転換細胞を用いる場合
(1) 1)配列番号1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21又は 23で表される塩基配 列からなる DNA、または 2)配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21又は 23で表される塩基配列力 らなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、炎症性サイト力イン の存在下にお!/、て (a)細胞接着分子の発現誘導機能、及び Z又は (b)血管内皮細 胞と白血球細胞との接着誘導機能を有するポリペプチドをコードするもの、を含む発 現ベクターで形質転換され、前記遺伝子によってコードされたポリペプチドを発現し ている細胞と、被験物質とを接触させる工程、及び
(2)前記遺伝子の発現量を測定する工程を含む、
血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法。
[0099] 6. 1. 1 ポリヌクレオチドの測定方法
本発明のスクリーニング方法の実施態様としては、炎症性サイト力イン誘導ポリヌク レオチドを指標にして検出する方法がある。このようなポリヌクレオチドとしては、配列 表の配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21及び 23に示す配列の全部 もしくは一部の配列を有するポリヌクレオチドが挙げられる。下記の方法に従って、該 ポリヌクレオチドを測定することができる。
[0100] 本発明の方法において用いられる培養細胞は、被験物質を添加しない場合には目 的とするポリヌクレオチドの 、ずれか一つを発現可能な条件であれば、 、かなる条件 で培養してもよい。例えば、該培養細胞について確立された培養条件が知られてお り、該条件下において該細胞が目的とするポリヌクレオチドを発現する場合は、該条 件で培養してよい。
[0101] ポリヌクレオチドを測定するにあたっては、まず全 RNAの抽出が必要となる。 RNA の抽出方法としては、チォシアン酸グァ-ジン'塩ィ匕セシウム超遠心法、チォシアン 酸グァ-ジン.ホットフエノール法、グァ-ジン塩酸法、酸性チォシアン酸グァ-ジン' フエノール'クロ口ホルム法（Chomczynskiゝ P. and Sacchiゝ N. 、 (1987) Anal. Biochem. 、 162、 156— 159)などを採用しうる力 酸性チォシアン酸グァ-ジン' フエノール'クロ口ホルム法が好適である。また、市販の RNA抽出用試薬 (例えば、 IS OGEN (二ツボンジーン製）、 TRIZOL試薬（Invitrogen社製）等を試薬に添付のプ ロトコールに従って用いることもできる。
[0102] 得られた全 RNAは、必要に応じてさらに mRN Aのみに精製して用いるのが好まし い。精製方法は特に限定されないが、真核細胞の細胞質に存在する mRNAの多く は、その 3'末端にポリ（A)配列を持つことが知られているので、この特徴を利用して 例えばピオチン化したオリゴ（dT)プローブに mRNAを吸着させ、さらにストレプトァ ビジンを固定ィ匕した常磁性粒子に、ピオチン Zストレプトアビジン間の結合を利用し て mRNAを捕捉し洗浄操作の後、 mRNAを溶出することにより、 mRNAを精製する ことができる。また、オリゴ（dT)セルロースカラムに mRNAを吸着させて、次にこれを 溶出して精製する方法も採用し得る。さらにショ糖密度勾配遠心法などにより、 mRN Aをさらに分画することもできる。ただし、本発明の方法のためには、これら mRNAの 精製工程は必須ではなぐ炎症性サイト力イン誘導ポリペプチドをコードするポリヌク レオチドの発現の検出が可能である限りにお 、て、全 RN Aをその後の工程に用いる ことちでさる。
[0103] スクリーニング方法に含まれる工程において、炎症性サイト力イン誘導ポリヌクレオ チドの発現量の測定方法としては、 RT—PCR法、リボヌクレアーゼ保護アツセィ、ラ ンオン'アツセィ、遺伝子チップ等の固相化試料を用いた核酸ノヽイブリダィゼーシヨン に従って実施することができる力 特に RT—PCRを用いて実施することが望ましい。
[0104] まず本発明の炎症性サイト力イン誘導ポリペプチドの mRNAを铸型とする逆転写酵 素反応を行ってから、 PCRを実施して特異的に DNA断片を増幅する。この方法に おいて、 目的のヌクレオチド配列を特異的に増幅するためには、 目的の mRNAの特 定の部分配列に相補的なアンチセンスプライマーと、該アンチセンスプライマーから 逆転写酵素により生成される cDNAの配列中の特定の部分配列に相補的なセンス プライマーが用いられる。 RT— PCRは市販のキット（例えば、 RNA PCRキット AM V ver2. 1：タカラバィォ社製）を用いて、キットに添付のマニュアルに従って行なうこ とができるが、以下の方法でもできる。
[0105] 逆転写酵素反応および PCRの両方に用いられるアンチセンスプライマーは、実質 的に本発明の炎症性サイト力イン誘導ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのヌ クレオチド配列のアンチセンス配列中の、連続した 15ヌクレオチドから 40ヌクレオチド 、好ましくは少なくとも 18ヌクレオチドから 30ヌクレオチド、更に好ましくは 23ヌクレオ チドから 30ヌクレオチドのヌクレオチド配列からなる。 [0106] 一方、 PCRにおいて用いられるセンスプライマーの配列は、本発明の炎症性サイト 力イン誘導ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列にぉ 、て、上 記アンチセンスプライマーの相補鎖にあたる配列中の最も 5'末端側の位置よりもさら に 5 '末端側領域に存在する配列中の連続した 15から 40ヌクレオチド、好ましくは 18 力も 35ヌクレオチド、更に好ましくは 21から 30ヌクレオチドの任意の部分配列力もな る。ただし、センスプライマーとアンチセンスプライマーに互いに相補的な配列が存在 すると、プライマー同士がアニーリングすることにより非特異的な配列が増幅され、特 異的なポリヌクレオチド検出の妨げとなるおそれがあるので、そのような組み合わせを 避けたプライマーの設計を行うことが好ま 、。
[0107] これらアンチセンスプライマーおよびセンスプライマーには、いずれも上記で規定し たそれらヌクレオチド配列の 5'末端に、本発明の炎症性サイト力イン誘導ポリべプチ ドをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列とは無関係のヌクレオチド配列がリ ンカーとして付加されていてもよい。ただし、特異的なポリヌクレオチド検出の妨げと ならないよう、該リンカ一は反応中に反応液内の核酸と非特異的アニーリングを起こ さないようなものであることが好ましい。 RT—PCRの反応は常法により行なうことがで きる。なお、 RT— PCRによる検出のための試料は、通常ポリ (A) +RNAにまで精製 されている必要はない。
[0108] PCR終了後、反応液を電気泳動し、 目的の大きさのバンドが増幅されているか否 かを検出する。定量的検出を行うためには、予め段階希釈した cDNAクローンを標 準の铸型 DNAとして同条件で PCRを実施し、定量的検出が可能な温度サイクル数 を定めておくか、または、例えば 5サイクル毎に一部反応液をサンプリングしてそれぞ れ電気泳動を行う。また例えば PCR反応時に放射標識 dCTPを用いることにより、バ ンド中に取り込まれた放射能の量を指標に定量を行うこともできる。ポリヌクレオチド 定量の信頼性を高めた方法として、上記 RT—PCR法を改良した競合 RT—PCR法 (Souaze et al. (1996) BioTechniques 21、 280— 285)や、 TaqManPCR法（ Heid et al. (1996) Genom. Res. 6、 986— 994)なども禾 可能である。
[0109] 被験物質存在下で培養した細胞由来の試料と、被験物質非存在下で培養した細 胞由来の試料との間で検出結果を比較し、その結果、 目的のポリヌクレオチドの発現 量を低下させた被験物質は、本発明の該ポリペプチドの機能を抑制する物質であり 、該ポリペプチドの発現に起因する血管内皮細胞の接着を抑制することから抗炎症 剤の治療または予防剤となり得る。
[0110] 6. 1. 2 ポリペプチドの測定方法
また、本発明のスクリーニング方法の別の実施態様としては、炎症性サイト力イン誘 導ポリペプチド (タンパク質)を検出する方法がある。具体的には下記の態様によって 、該ポリペプチドの発現量を測定することができる。
[0111] ポリペプチド発現量の測定方法の好適な態様として、抗体を利用した方法につい て説明する。なお、このとき使用する抗体は、上述の「4.炎症性サイト力イン誘導ポリ ペプチドに対する抗体」の記載に従って作製することができる。まず、試料中のポリべ プチドを 96穴プレートや 384穴プレート等のマルチウエルプレートのゥエル内底面や メンブレン等に固相化しておいてから、炎症性サイト力イン誘導ポリペプチドを特異的 に認識する抗体を用いた検出が行われる。このうち、 96穴プレートや 384穴プレート 等のマルチウエルプレートを用いるのは一般に固相酵素免疫定量法 (ELISA法)や 放射性同位元素免疫定量法 (RIA法）と呼ばれる方法である。一方、メンブレンに固 相化する方法としては、試料のポリアクリルアミド電気泳動を経てメンブレンにポリべ プチドを転写する方法 (ウェスタンプロット法) 、または直接メンブレンに試料または その希釈液を染み込ませる、 V、わゆるドットブロット法やスロットブロット法が挙げられ る。
[0112] (1)試料の調製
本実施態様のための試料を調製するための材料としては、被験物質存在下または 非存在下で培養した培養細胞の全細胞抽出液または核抽出画分が用いられ得るが 、全細胞抽出液が好適である。全細胞抽出液は、必要により高速遠心することにより 不溶性の物質を除去した後、 ELISAZRIA用試料やウェスタンブロット用試料の調 製工程に供される。
[0113] ELISAZRIA用試料としては、例えば被験物質存在下または非存在下で培養し た培養細胞の全細胞抽出液をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希釈したものを用 いる。ウェスタンプロット用（電気泳動用）試料は、例えば被験物質存在下または非存 在下で培養した培養細胞の全細胞抽出液をそのまま使用するか、緩衝液で適宜希 釈して、 SDS—ポリアクリルアミド電気泳動用の 2—メルカトルエタノールを含むサン プル緩衝液 (シグマ社製等）と混合する。ドット Zスロットプロットの場合は、例えば被 験物質存在下または非存在下で培養した培養細胞の全細胞抽出液そのもの、また は緩衝液で適宜希釈したものを、ブロッテイング装置を使用するなどして、直接メンブ レンへ吸着させる。
[0114] (2)試料の固相化
上記のようにして得られた試料中のポリペプチドを特異的に検出するためには、試 料を免疫沈降法、リガントの結合を利用した方法等によって、沈殿させ、固相化せず に検出することもできるし、そのまま検出する該試料を固相化することもできる。ポリべ プチドを固相化する場合において、ウェスタンブロット法、ドットブロット法またはスロッ トブロット法に用いられるメンブレンとしては、ニトロセルロースメンブレン（例えば、ノ ィォラッド社製）、ナイロンメンブレン（例えば、ハイボンド一 ECL (アマシャム'フアル マシア社製)）、またはポリビ-リデン 'ジフルオリド (PVDF)メンブレン (例えば、バイ ォラッド社製)等が挙げられる。
[0115] 電気泳動後のゲルからメンブレンにポリペプチドを移す、いわゆるブロッテイング方 法としては、ウエット式ブロッテイング法（CURRENT PROTOCOLS IN IMMUN OLOGY volume 2 ed by J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Mar gulies, E. M. Shevach, W. Strober)、セミドライ式ブロッテイング法（上記 CU RRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY volume 2参照）等を挙げること ができる。ドットプロット法やスロットプロット法のための器材も市販されている（例えば 、 ノ ィォ'ドット (バイオラッド)）。
[0116] 一方、 ELISA法 ZRIA法で検出 ·定量を行うためには、専用の 96穴プレート（例え ば、ィムノプレート 'マキシソープ (ヌンク社製)等）に試料またはその希釈液 (例えば 0 . 05%アジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（以下「PBS」という）で希釈し たもの）を入れて 4°Cから室温でー晚、または 37°Cで 1から 3時間静置することにより、 ゥエル内底面にポリペプチドを吸着させて固相化する。
[0117] (3)検出 抗体は、それを直接標識するか、または該抗体を一次抗体とし、該抗体を特異的に 認識する (抗体を作製した動物由来の抗体を認識する)標識二次抗体と協同で検出 に用いられる。
[0118] 標識の種類として好ましいものは酵素（アルカリホスファターゼまたは西洋ヮサビぺ ルォキシダーゼ)またはピオチン (ただし二次抗体のピオチンにさらに酵素標識ストレ ブトアビジンを結合させる操作が加わる）である力 これらに限定されない。標識二次 抗体 (または標識ストレプトアビジン)を使用する方法のための、予め標識された抗体 (またはストレプトアビジン）は種々のものが市販されている。 RIAの場合は 1125等の 放射性同位元素で標識された抗体を用い、測定は液体シンチレーシヨンカウンター 等を用いて行う。
[0119] これら標識された酵素の活性を検出することにより、抗原であるポリペプチドの量が 測定される。アルカリホスファターゼまたは西洋ヮサビペルォキシダーゼの場合、そ れら酵素の触媒により発色する基質や発光する基質が市販されている。
[0120] 発色する基質を用いた場合、ウェスタンプロット法やドット Zスロットプロット法にお いては目視で検出できる。 ELISA法においては、好ましくは市販のマイクロプレート リーダーを用いて各ゥエルの吸光度 (測定波長は基質により異なる）を測定すること により定量する。また好ましくは上記（3)において抗体作製のために使用した抗原の 希釈系列を調製し、これを標準抗原試料として他の試料と同時に検出操作を行って 、標準抗原濃度と測定値をプロットした標準曲線を作成することにより、他の試料中 の抗原濃度を定量することが可能である。
[0121] 一方、発光する基質を使用した場合は、ウェスタンプロット法やドット Zスロットプロ ット法にぉ 、ては X線フィルムまたはイメージングプレートを用いたオートラジオグラフ ィーや、インスタントカメラを用いた写真撮影により検出することができ、デンシトメトリ 一やモレキュラー.イメージヤー Fxシステム (バイオラッド社製)等を利用した定量も可 能である。また、 ELISA法で発光基質を用いる場合は、発光マイクロプレートリーダ 一 (例えば、ノィォラッド社製)を用いて酵素活性を測定する。
[0122] (4)測定操作
i)ウェスタンブロット、ドットブロットまたはスロットブロットの場合 まず、抗体の非特異的吸着を阻止するため、予めメンブレンをそのような非特異的 吸着を阻害する物質 (スキムミルク、カゼイン、ゥシ血清アルブミン、ゼラチン、ポリビ ニルピロリドン等）を含む緩衝液中に一定時間浸しておく操作 (ブロッキング)を行う。 ブロッキング溶液の組成は、例えば 5%スキムミルク、 0. 05力ら 0. 1%ツイーン 20 を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS)またはトリス緩衝生理食塩水 (TBS)が用いられ る。スキムミルクの代わりに、ブロックエース（大日本製薬）、 1から 10%のゥシ血清ァ ルブミン、 0. 5から 3%のゼラチンまたは 1%のポリビュルピロリドン等を用いてもよい 。ブロッキングの時間は、 4°Cで 16から 24時間、または室温で 1から 3時間である。
[0123] 次に、メンブレンを 0. 05力ら 0. 1% Tween20を含む PBSまたは TBS (以下「洗浄 液」と 、う）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した後、上記（3)記載の方法で 作製された抗体をブロッキング溶液で適宜希釈した溶液中に一定時間浸して、抗体 をメンブレン上の抗原に結合させる。このときの抗体の希釈倍率は、例えば上記 3)記 載の組換え抗原を段階希釈したものを試料とした予備のウェスタンブロッテイング実 験を行って決定することができる。この抗体反応操作は、好ましくは室温で 2時間行う 。抗体反応操作終了後、メンブレンを洗浄液で洗浄する。ここで、用いた抗体が標識 されたものである場合は、ただちに検出操作を行うことができる。未標識の抗体を用 いた場合には、引き続いて二次抗体反応を行う。標識二次抗体は、例えば市販のも のを使用する場合はブロッキング溶液で 2000から 20000倍に希釈して用いる（添付 の指示書に好適な希釈倍率が記載されている場合は、その記載に従う）。一次抗体 を洗浄除去した後のメンブレンを二次抗体溶液に室温で 45分から 1時間浸し、洗浄 液で洗浄してから、標識方法に合わせた検出操作を行う。洗浄操作は、例えばまず メンブレンを洗浄液中で 15分間振盪してから、洗浄液を新しいものに交換して 5分間 振盪した後、再度洗浄液を交換して 5分間振盪することにより行う。必要に応じてさら に洗浄液を交換して洗浄してもよ 、。
[0124] ii) ELISA/RIA
まず、上記（2)の方法で試料を固相化させたプレートのゥ ル内底面への抗体の 非特異的吸着を阻止するため、ウェスタンプロットの場合と同様、予めブロッキングを 行っておく。ブロッキングの条件については、ウェスタンブロットの項に記載した通り である。
[0125] 次に、ゥエル内を 0. 05力ら 0. 1% Tween20を含む PBSまたは TBS (以下「洗浄 液」と 、う）で洗浄して余分なブロッキング溶液を除去した後、上記（3)記載の方法で 作製された抗体を洗浄液で適宜希釈した溶液を分注して一定時間インキュベーショ ンし、抗体を抗原に結合させる。このときの抗体の希釈倍率は、例えば上記（3)記載 の組換え抗原を段階希釈したものを試料とした予備の ELISA実験を行って決定する ことができる。この抗体反応操作は、好ましくは室温で 1時間程度行う。抗体反応操 作終了後、ゥエル内を洗浄液で洗浄する。ここで、用いた抗体が標識されたものであ る場合は、ただちに検出操作を行うことができる。未標識の抗体を用いた場合には、 引き続いて二次抗体反応を行う。標識二次抗体は、例えば市販のものを使用する場 合は洗浄液で 2000から 20000倍に希釈して用いる（添付の指示書に好適な希釈倍 率が記載されている場合は、その記載に従う）。一次抗体を洗浄除去した後のゥエル に二次抗体溶液を分注して室温で 1から 3時間インキュベーションし、洗浄液で洗浄 してから、標識方法に合わせた検出操作を行う。洗浄操作は、例えばまずゥエル内に 洗浄液を分注して 5分間振盪してから、洗浄液を新しいものに交換して 5分間振盪し た後、再度洗浄液を交換して 5分間振盪することにより行う。必要に応じてさらに洗浄 液を交換して洗浄してもよ ヽ。
[0126] また本発明において、いわゆるサンドイッチ法の ELISAは例えば以下に記載する 方法により実施することができる。まず、本発明の炎症性サイト力イン誘導ポリべプチ ドのアミノ酸配列のいずれか一つにおいて、親水性に富む領域を 2箇所選んで、そ れぞれの領域中のアミノ酸 6残基以上力 なる部分ペプチドを合成し、該部分べプチ ドを抗原とした 2種類の抗体を取得する。このうち一方の抗体を上記 (4)記載のように 標識しておく。標識しな力つた方の抗体は、上記（2)記載の方法に準じて 96穴 ELIS A用プレートのゥエル内底面に固相化する。ブロッキングの後、試料液をゥエル内に 入れて常温で 1時間インキュベーションする。ゥエル内を洗浄後、標識した方の抗体 希釈液を各ゥエルに分注してインキュベーションする。再びゥエル内を洗浄後、標識 方法に合わせた検出操作を行う。
[0127] (5)判定 被験物質存在下で培養した細胞由来の試料と、被験物質非存在下で培養した細 胞由来の試料との間で検出結果を比較し、その結果該ポリペプチドの産生量を低下 させた被験物質は、対象とするポリペプチドの機能を抑制する物質であり、該ポリべ プチドの発現に起因する血管内皮細胞の接着を抑制することから抗炎症剤の治療ま たは予防剤となり得る。
[0128] 6. 2 機能の測定によるスクリーニング
炎症性サイト力イン誘導ポリペプチドは、炎症性サイト力イン刺激による細胞接着分 子の発現誘導活性、及び Z又は血管内皮細胞と白血球細胞との接着誘導活性を有 する。したがって、該ポリペプチドの機能を抑制する物質は血管内皮細胞接着抑制 能を有する物質である。これらの物質は具体的には以下の工程を含むスクリーニング 方法によって取得することができる。
[0129] A. 白血球への接着を利用したスクリーニング方法
(1) 1)配列番号1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21又は 23で表される塩基 配列からなる DNA、または
2)配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21又は 23で表される塩基配列力 らなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、炎症性サイト力イン の存在下にお!/、て (a)細胞接着分子の発現誘導機能、及び Z又は (b)血管内皮細 胞と白血球細胞との接着誘導機能を有するポリペプチドをコードするもの、 を含む発現ベクターで形質転換され、前記ポリペプチドを発現している細胞と、被験 物質とを接触させる工程、
(2)白血球を上記細胞に接触させる工程、及び
(3)白血球と上記細胞との接着量を測定する工程。
[0130] B.細胞接着分子の発現誘導活性を利用したスクリーニング方法
(1) 1)配列番号1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21又は 23で表される塩基配 列からなる DNA、または
2)配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21又は 23で表される塩基配列力 らなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、 TNF— αの存在下 にお!/、て (a)細胞接着分子の発現誘導機能、及び Z又は (b)血管内皮細胞と白血 球細胞との接着誘導機能を有するポリペプチドをコードするもの、を含む発現べクタ 一で形質転換され、前記ポリペプチドを発現している細胞と、被験物質とを接触させ る工程、及び
(2)細胞接着分子の発現量を測定する工程を含む、
血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法。
具体的には、培養上清に被験物質をカ卩ぇ適当な時間培養し、 intercelluler adhe sion molecule (ICAM)— 1、 vascular cell adhesion molecule (VCAM)— 1そ して E— selectinなど炎症時に血管内皮細胞に惹起される接着分子の発現を指標 に評価する。細胞表面の各接着分子の発現は、内皮細胞を培養器から剥がした後、 各接着分子に対する蛍光標識したモノクローナル抗体 (BDバイオサイエンス社製） で染色し、フローサイトメーターを用いた手法で検出することができる。また別法して、 各接着分子を認識するモノクローナル抗体を用いた enzyme— linked immunosor bent assay (ELISA)を摸した方法にてマイクロプレートウエル上で直接定量するこ ともできる。具体的には 96穴マイクロプレート上で被験物質を添加した状態で適当な 時間培養した内皮細胞の培養上清を取り除き、内皮細胞をメタノール:エタノール（3 ： 1混合比）の固定液で固定し、 1 %牛血清アルブミン (BSA：シグマ社製)含 PBSに てブロッキングした後に内皮細胞を抗ヒト ICAM—1、抗 VCAM— 1、抗 E— selecti nマウス IgGlモノクローナル抗体（BDバイオサイエンス社製）を 0. 1%BSA含 PBS の希釈液で反応させ、 0. 05%Tween— 20含 PBSで洗浄した後再び 1%牛血清ァ ルブミン（BSA:シグマ社製）含 PBSにてブロッキングした後に、 0. 1%BSA含 PBS で希釈した horse ladish peroxidase (HRP)標識抗マウス IgG抗体（Kirkegaard& Perry Laboratories社製）を反応させた後 0. 05%Tween—20含 PBSで洗浄し、 HRPをペルォキシダーゼ用発色キット O (住友ベークライト社製)を用いて使用説明 書のプロトコールにしたがって、各マイクロプレートウエルの 490nmの吸光度を測定 することにより内皮細胞表面の各接着分子の発現を定量することができる。また培養 上清中に分泌された遊離性の接着分子も Quantikine ELISAキット（R&D Syste ms社製)で添付の使用説明書にしたがって測定することもできる。以上の方法にお V、てコントロール (被験物質未添加）細胞と比較して、何れかの接着分子の発現が減 少した被験物質が本発明の炎症性サイト力イン誘導ポリペプチドの機能を抑制する 物質であると判定することができる。
[0132] 一方、白血球細胞と血管内皮細胞の接着を測定する方法は、 96穴マイクロプレー ト上で被験物質を添カ卩した状態で適当な時間培養した細胞に Vybrant Cell Adhes ion Assay Kitを用いて使用説明書に従い蛍光標識した Tリンパ球系培養細胞 (M 01/1—4、 &1;など）、単球系培養細胞（1¾? 1 U937など）あるいはヒト末梢 静脈血から分離した白血球細胞を添加し、洗浄後内皮細胞に接着した白血球細胞 の蛍光を蛍光マイクロプレートリーダーで測定することにより定量できる。以上の方法 において、コントロール (被験物質未添加）細胞と比較して、何れかの白血球細胞の 接着を減少させた被験物質が本発明の炎症性サイト力イン誘導ポリペプチドの機能 を抑制する物質であると判定することができる。
[0133] 6. 3 特異結合体を利用したスクリーニング方法
ここで、特異結合体とは炎症性サイト力イン誘導ポリペプチドと特異的に結合できる ようなタンパク質 (抗体を含む)、アブタマ 低分子化合物等が含まれる。 炎症性 サイト力イン誘導ポリペプチドは、細胞の内外において、直接的もしくは間接的に他 のタンパク質と結合することにより、その活性を調節していると考えられる。したがって 、該ポリペプチドとかかるタンパク質の結合を阻害する物質は血管内皮細胞接着を 調節する物質の可能性が高い。これらの物質は具体的には以下の工程を含むスクリ 一二ング方法によって取得することができる。
(1) 1)酉己列番号 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22又は 24で表されるァミノ 酸配列からなるポリペプチド、または
2)配列番号 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22又は 24で表されるアミノ酸配 列において、 1〜： L0個のアミノ酸が欠失、置換、及び Z又は付加されたアミノ酸配列 を有し、かつ、炎症性サイト力インの存在下において (a)細胞接着分子の発現誘導 機能、及び Z又は (b)血管内皮細胞と白血球細胞との接着誘導機能を示すポリぺプ チド、のいずれかと、被験物質とを、標識した前記ポリペプチドの特異結合体の存在 下で、接触させる工程、及び
(2)前記ポリペプチドと前記特異結合体の結合量を測定する工程を含む、 血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法。
[0134] 特異的に結合できるタンパク質を得る方法としては、例えば、精製した炎症性サイト 力イン誘導ポリペプチドを用いて、これに結合するタンパク質のァフィユティー精製を 行う方法が挙げられる。具体的な方法の一例を示せば、炎症性サイト力イン誘導ポリ ペプチドにヒスチジン 6個よりなる配列をァフィユティータグとして融合したものを作製 して、これを細胞の抽出液（予めニッケルーァガロースカラムにチャージして、この力 ラムを素通りした画分）と 4°Cで 12時間インキュベートし、次いで、この混合物に別途 ニッケル—ァガロース担体をカ卩えて 4°Cで 1時間インキュベートする。ニッケル—ァガ ロース担体を洗浄バッファーで十分洗浄した後、 lOOmMイミダゾールをカ卩えることに より、炎症性サイト力イン誘導ポリペプチドと特異的に結合する細胞抽出液中のタン パク質を溶出させて精製し、この構造を決定する。このようにして、炎症性サイト力イン 誘導ポリペプチドと直接結合するタンパク質、および炎症性サイト力イン誘導ポリぺプ チドとの結合活性は持たな！ヽが、炎症性サイト力イン誘導ポリペプチドに直接結合す るタンパク質と複合体を形成することにより間接的に炎症性サイト力イン誘導ポリぺプ チドに結合するタンパク質が精製できる [実験医学別冊、バイオマニュアルシリーズ 5 「転写因子研究法」 PP215— 219 (羊土社刊）]。
[0135] 別の方法としては、ファーウェスタンプロット法 [実験医学別冊、「新遺伝子工学ノヽ ンドブック」 P76— 81 (羊土社刊）]や、酵母や哺乳類動物細胞を用いたツーハイプリ ッドシステム法 [実験医学別冊、「新遺伝子工学ノヽンドブック」 P66— 75 (羊土社刊）、 「チェックメイト 'マンマリアン 'ツーハイブリッドシステム」（プロメガ社製） ]によるクロー ニングも可能である力 これらの方法に限定されない。
[0136] これらの方法により、本発明の炎症性サイト力イン誘導ポリペプチドと直接もしくは間 接的に相互作用するタンパク質の cDNAが得られれば、炎症性サイト力イン誘導ポリ ペプチドと該タンパク質との相互作用を阻害する物質のスクリーニングに利用するこ とができる。具体的には、まず、炎症性サイト力イン誘導ポリペプチドを発現させた形 質転換細胞等の細胞等を破砕して調整したライセート (好ましくは炎症性サイト力イン 誘導ポリペプチドの精製標品）を調製する。緩衝液、イオン、及び/又は pHのような スクリーニング条件を最適化し、最適化したバッファ一中で、ライセートと、炎症性サイ トカイン誘導ポリペプチドと相互作用するタンパク質の標識体とを、試験化合物と共に 一定時間インキュベーションする。反応後、ニトロセルロースフィルタ一等で濾過し、 適量のバッファーで洗浄した後、フィルターに残存する放射活性を液体シンチレーシ ヨンカウンタ一等で測定する。得られた標識体の結合阻害を指標に、炎症性サイト力 イン誘導ポリペプチドと、これと相互作用するタンパク質の結合を阻害する化合物を 選択することができる。なお、この化合物力 ァゴニスト又はアンタゴ-ストであるかに ついては、この項に記載の他のスクリーニング方法などにより確認することができる。
[0137] なお、特異的に結合できるタンパク質が抗体である場合は「4.炎症性サイト力イン 誘導ポリペプチドに対する抗体」の記載に従えば、取得することができる。
[0138] 炎症性サイト力イン誘導ポリペプチドと該タンパク質との結合が間接的であり、何ら かの別の因子を介しているような場合には、例えば該因子を含むような細胞抽出液 存在下で、同様に上記スクリーニングを行う。この場合には、該因子に対して作用す るような物質も選択される可能性がある。
[0139] 特異結合体については、通常はその挙動を検出可能とするため種々の物質で標 識されうる。タンパク質を標識するには、例えば「分子細胞生物学基礎実験法」（南江 堂堀江武一ら 1994年)等に記載されている常法を用いることにより行うことができる。 種々の物質としては化学発光物質、酵素、蛍光物質、着色ビーズ、放射性同位元素 、元素、金属類、ピオチンが挙げられる。以下に具体例を示すがこれらに限定される ものではな!/、。化学発光物質とは例えばルミノールやアタリジ-ゥムエステルなどをさ す。酵素とは例えば j8 -ガラタトシダーゼやアルカリホスファターゼゃペルォキシダー ゼなどをさす。蛍光物質とは例えばユウ口ピウムクリプテートや FITC (fluorescein i sothiocyanate)や RITC (tetramethylrhodamm isothiocyanate)なと す。 着色ビーズとは例えばプロテイン Aビーズ、 wheat germ agglutinin (WG A)ビー ズ、ストレプトアビジンビーズなどをさす。放射性同位元素とは例えば14 Cや1251や3 Hな どをさす。元素とは例えばユウ口ピウムなどのランタ-ド元素をさす。金属類とは例え ばフェリチンや金コロイドなどをさす。
[0140] 以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより何ら限 定されるものではない。 実施例 1
[0141] DNAマイクロアレイ解析による炎症性サイト力イン誘導ポリヌクレオチド候補の探索 血管内皮細胞は白血球の浸潤、サイト力インの分泌などの炎症反応の誘導に重要な 機能を有している。そこで血管内皮細胞に発現しかつ炎症反応に重要な役割を果た す遺伝子を見出すため、まず代表的な炎症性サイト力インである tumor necrosis fa ctor (TNF) αの刺激により血管内皮細胞で発現上昇する遺伝子を以下の手順 で DNAマイクロアレイ解析により探索した。
[0142] a) TNF- α刺激血管内皮細胞の全 RNAの調製
購入した冷凍保存ヒト臍帯静脈血管内皮細胞 (HUVEC： Cambrex BioScience Walkersville社製)を添付の使用説明書に従い、血管内皮細胞用基礎培地 (EGM 2： Cambrex BioScienceWalkersville社製;)に EGM— 2添カ卩因子セット (Camb rex BioScienceWalkersville社製）を添カ卩した 15mlの培養液（以下 EGM— 2)に て 75cm2培養フラスコ中で 37°C、 CO濃度 5%条件下でコンフルェントな状態まで
2
培養し、 30mM HEPES緩衝液（以下 HEPES液： Cambrex BioScienceWalkers ville社製）、 0. 025%トリプシン Ζθ. 01% EDTA液（以下トリプシン液： Cambrex BioScienceWalkersville社製)、トリプシン中和液 (Cambrex BioScienceWalker sville社製)を用いて細胞を回収した。これを 230 X g、室温で 5分間遠心分離し、 4. 5 X 105細胞 Zmlの細胞濃度になるようにセルバンカー（十慈フィールド株式会社製 )に懸濁し、 1mlずつセラムチューブに分注した後— 80°Cで冷凍保存したものをスト ックとして以下の実験に用いた。そのストックした細胞 4本を各 15mlの EGM— 2に再 懸濁し、 75cm2底面積の培養フラスコに播種し、 1日毎に培養上清を新鮮な 15mlの EGM— 2と交換し、コンフルェントな状態に達するまで培養を続けた。次に細胞を H EPES液、トリプシン液、トリプシン中和液により細胞を剥がし、細胞を 230 X g、室温 で 5分間遠心分離し、 10mlの EGM— 2を加え 2. 5mlずつ 17. 5mlの EGM— 2の 入った 15cmシャーレ 4枚に分注し、細胞がコンフルェントな状態になるまで 1日ごと に培養上清を 20mlの新鮮な EGM— 2と交換しながら 37°C、 CO濃度 5%の条件下
2
で培養を続けた。細胞がコンフルェントになったシャーレ 3枚の培養上清を recombi nant humanTNF- a (GT社製）を 20 gZmlの濃度になるように 0. l%bovine s erum albumin (BS A :シグマアルドリッチ社製）を含むリン酸緩衝液（PBS)に溶解 した液 10 μ 1を 20mlの EGM— 2に加えたもの（TNF— a最終濃度 lOngZml)に交 換し、 37°C、 CO濃度 5%の条件下で 1時間、 4時間、 24時間培養した後、培養上
2
清を取り除き 10mlの PBSで洗浄した後 TRIzol試薬（Invitrogen社製）を 12ml加え 、直ちにセルスクレーパーを使って細胞を溶解し、その細胞溶解液を 15ml遠心チュ ーブに移し 80°Cで凍結保存した。尚、残りのシャーレ 1枚分の細胞はコントロール 用の TNF— α未処理の細胞（0時間処理）として、 TNF— αを含む EGM— 2の代わ りに 20mlの新鮮な EGM— 2をカ卩え、直ちに上記の方法にて細胞溶解液を調製し、 — 80°C保存した。その後室温で細胞溶解液を融解させた後、 TRIzol試薬添付の使 用説明書に従い全 RNA精製を行った。尚、 RNAは 500 μ 1の diethylpyrocarbona te (DEPC)処理水で溶解した。
b) DNAマイクロアレイ解析
以下の DNAマイクロアレイ解析は、 Microarray Bar Corded Slide Type 7 Sta r (以下 Type 7 Star :アマシャムバイオサイエンス社製)に 12種類のヒト臓器由来の cDNAをテンプレートに調製した expressed sequence tag (EST)を含む約 5000 配列の PCR断片（長さ約 500塩基対）を Array Spotter Generation ΠΙ (モレキュ ラーダイナミクス社製)を用いてスポッティングした自家作製の DNAマイクロアレイ及 びかずさヒト cDNAナイロンマイクロアレイ（以下 KDRアレイ：力ケンジエネタス社製） を用いて実施した。尚、 Type 7 Starには、各 PCR断片を 2スポットずつ搭載した。
Type 7 Starにおける解析は以下の手順にて実施した。上記 a)の全 RNA2. 5 μ § をテンプレートにして Message Amp aRNA Kit (Ambion社製）を用いて添付の使 用説明書に従い mRNAを増幅（aRNA化）した。次にマイクロアレイ 1枚につき TNF α処理 0、 1、 4、 24時間それぞれの aRNAを 1 μ g使用し、 Atlas Glass Fluores cent Labeling (Clontech社製）により添付の使用説明書に従い cDN Aィ匕及び Cy 3標識または Cy5標識した後、 TNF— a処理 0時間（コントロール)の Cy3標識 cDN Aと TNF— α処理 1、 4、 24時間の Cy5標識 cDNAの組み合わせとまた逆に TNF— α処理 0時間（コントロール）の Cy5標識 cDNAと TNF— α処理 1、 4、 24時間の Cy 3標識 cDNAの組み合わせ（計 6種類の組み合わせ）で cDNAをミックスし、 MinElu te PCR Purification Kit (Qiagen社製）にて精製した。そして精製した標識 cDN Aの各混合液 50 μ 1、 Hybridization Buffer Version 2 (アマシャムバイオサイェン ス社製） 50 μ 1、そしてホルムアミド 100 μ 1を混合し、マイクロアレイ自動ハイブリダィ ゼーシヨン'洗浄装置 Automatic Slide Processor (ASP) (アマシャムバイオサイエ ンス社製)を用いて使用説明書に従い各組み合わせの混合液 1種類につき 1枚のマ イクロアレイ (計 6枚）に対してハイブリダィゼーシヨンおよび洗浄を行った。これらマイ クロアレイを Array Scanner Generation III (モレキュラーダイナミクス社製）でスキ ャユングしマイクロアレイの Cy3、 Cy5の蛍光シグナルをそれぞれ画像データとして 取得した。さらに取得した画像データについて、画像解析ソフトウェア ArrayVison (I maging Research社製）を用いて各スポットをグリッディングし、 Cy3、 Cy5の両蛍光 シグナルの強度を数値ィ匕し、この数値ィ匕データをテキストファイルに保存した。
また、 KDRアレイによる解析は以下の手順で解析した。上記 a)の TNF—ひ処理 0 、 1、 4、 24時間の全 RNAそれぞれ 17 μ gと dT25オリゴマー 8 μ gを混合し、全量 18 . 8 1になるように DEPC処理蒸留水でメスアップし、 70°C10分間加熱後氷上で急 冷した。これに Superscript First -Strand Synthesis System for RT— PCR(I nvitrogen社製）添付の 5 X 1st Strand Buffer 10 μ 1、 0. 1M dithiothreitol (D TT) 5 1、キットに添付外の dATP、 dGTP、 dTTP (各々 Invitrogen社製）をそれぞ れ 10mMを含む混合液 4 1、 0. ImMdCTP dnvitrogen社製 10mMを 100倍希 釈して調製） 0. 2 /z l、 l l lTBq/mmol, 370MbqZml[ α— 33P]dCTP (アマシャ ムバイオサイエンス社製） 10 μ 1を添カ卩し、 42°Cで 2分間インキュベートし、 SuperScr ipt II逆転写酵素を 2 /z 1カ卩えた後 42°Cで 1時間インキュベートした。次に MinElute PCR Purification Kit (Qiagen社製）により添付の使用説明書に従い精製し、これ に lOmgZml Cot- 1 DNA (Invitrogen社製） 2. 5 1、 1 gZ 1ポリアデュル酸 (シグマアルドリッチ社製）： L 1をカ卩え、 100°C、 5分間の熱変性後にあら力じめ 68°C に暖めておいた PerfectHyb Hybridization Solution (東洋紡社製） 420 1に加 え 68°C、 30分間インキュベートした。同時に 8枚の KDRアレイを一枚ごとに容量 5ml 、胴径 16. 5mm φ、全高 45mmのガラス製バイアル瓶（マイティバイアル：テックジャ ム社製） 1本に丸めて入れ、これに 3cmの長さのガラス棒を入れ、各バイアル瓶に 20 0 μ 1の PerfectHyb Hybridization Solutionをカ卩え、このバイアル瓶をハイブリダ ィゼーシヨンボトノレ (Robbins社製)に直列に入れ、 Micro Hybrization Incubator (Robbins社製）でローテーションしながら 68°Cで 30分間プレハイブリダィゼーシヨン を行った。その後、バイアル瓶の PerfectHyb Hybridization Solutionを捨て、こ れにインキュベートを完了した33 P標識 cDNAを混合した PerfectHyb Hybridizati on Solutionを KDRアレイ 1枚につき 200 1加え、プレハイブリダィゼーシヨンと同 様の方法でローテーションを行いながら 68°Cでー晚インキュベートしハイブリダィズし た。尚、 TNF— α処理 0、 1、 4、 24時間の各サンプルにっき 2枚の KDRアレイにハ イブリダィゼーシヨンを行った。その後バイアル瓶から KDRアレイを取り出し、 2 X SS C, 1 %SDS, 68°C, 15分間の洗浄を 2回、 0. 1 X SSC, 1 %SDS, 68°C, 15分間 の洗浄を 2回実施し、 KDRアレイをイメージングプレート (IP :富士フィルム社製）に 1 、 4、 7日間露光し、 IPに転写された KDRアレイの放射活性をフルォ口'イメージアナ ライザ一 FLA3000G (富士フィルム社製）にて画像データとして取得した。そしてそ の画像データを用いて画像解析ソフトウェア ArrayGauge (富士フィルム社製）により 各スポットをグリッディングしてその放射活性を数値ィ匕し、テキストファイルに保存した 次に両マイクロアレイの解析により得られた各スポットの数値データのテキストファイル をマイクロアレイデータ解析ソフトウェアである GeneSpring (Agilent社製）を用いて データを統合し、各スポットについて TNF— a 1、 4、 24時間処理のシグナル強度を TNF— α θ時間処理 (TNF— α未処理）のシグナル強度で割り込んだシグナル比 すなわち TNF— α処理により処理時間 1 , 4, 24時間後に何倍発現変動するかを算 出し、 Type 7 Starにおいてマイクロアレイ上の 2スポット Xサンプルの蛍光標識（Cy 3、 Cy5)を入れ換えたデータ計 4スポットのうち 3スポット以上のデータで、またかずさ アレイの場合は併行して解析したアレイ 2枚分の両方のデータで 1、 4、 24時間後に 何れかの点でシグナル強度比が 2以上すなわち 2倍以上発現上昇しているスポットを 抽出した。さらに抽出されたスポットの PCR断片の配列をクエリーとして、 BioSCOU T (Lion社製)そして European Bioinformatics Institute (EBI)と Sanger Instit uteの公共データベースである Ensemblを対象に解析した結果、 2倍以上発現上昇 していると判定されたスポットは、重複を除くと最終的に計 142の遺伝子に集約され た。そしてデータベース上力 全長 mRNA配列などの情報を取得し、これらに" TNF UP—通し番号"という形で IDを付けた。尚、これらの 142遺伝子のうち後述の実施例 2、 3の解析にて新規の機能が見出されたことにより本発明の対象とした炎症性サイト 力イン誘導ポリペプチドをコードする遺伝子は、 TNFUP— 0013 (配列番号 1)、 TN FUP_0064 (配列番号 3)、 TNFUP_0072 (配列番号 5)、 TNFUP_0113 (配 列番号 7)、 TNFUP— 0114 (配列番号 9)、 TNFUP— 0142 (配列番号 11)の 6遺 伝子である。このとき、 TNFUP— 0072については 2つ（TNFUP— 0072 ;配列番 号 5、 TNFUP— 0072B ;配列番号 13)の、また TNFUP— 0142については 6つ（T NFUP— 0142 ;配列番号 11、 TNFUP— 0142B ;配列番号 15、 TNFUP— 0142 C ;配列番号 17、 TNFUP— 0142D ;配列番号 19、 TNFUP— 0142E ;配列番号 2 1、 TNFUP— 0142F;配列番号 23)のスプライシングバリアントが存在していた。そ してデータベース検索の結果、これら 6遺伝子の遺伝子名は公共データベースであ る National Center for Biotechnology Information (NCBI)の Entrez Gene上 では、 TNFUP— 0013は¾)1：0116 ^1 type III domain containing 3B (FNDC3 B)、 TNFUP— 0064は interferon— induced protein 44— like (IFI44L)、 TNF UP— 0072は TNFAIP3 interacting protein 1 (TNIP1)、 TNFUP— 0113は、 TBC1 domain family, member 4 (TBC1D4)、 TNFUP— 011^¾nicastrin (N CSTN)、そして TNFUP— 0142は SON DNA binding protein (SON)であった
実施例 2
RNA干渉 (RNAi)を利用した炎症性サイト力イン誘導ポリペプチドの機能的スクリー ニング (一次スクリーニング）
実施例 1の DNAマイクロアレイ解析カゝら抽出された 142の発現上昇遺伝子が内皮 細胞において炎症に重要な機能を有するかを、 small interfering RNA(siRNA) で各遺伝子をノックダウンすることにより、 TNF—ひの刺激で HUVECに生じる接着 分子の発現誘導を抑制できるかどうかを指標に以下の手順にて検証した。すなわち s iRNAにより接着分子の発現が抑制された場合その siRNAのターゲットとなる遺伝子 が炎症性サイト力イン誘導ポリヌクレオチド候補となる。
a) siRNAの調製
RNAiを利用した炎症性サイト力イン誘導ポリペプチドの機能的スクリーニングのため に、 CUGA7 in vitro siRNA Synthesis Kit (-ツボンジーン社製）を用いて siRN Aの in vitro転写合成を実施した。尚、今回合成した siRNAのうち後述の実施例 2d )で顕著な接着分子発現抑制効果を認めかつ後述の実施例 3の解析により新規の機 能を持つことが確証された炎症性サイト力イン誘導ポリペプチド 6遺伝子に対する siR NA、また陰性コントロール siRNA及び陽性コントロールの siRNAのターゲット配列、 合成用オリゴ DNA配列および合成される siRNAの配列を表 1に例として示す。具体 的な siRNAの合成 ·調製は以下の通りに行った。実施例 lb)で見出された発現上昇 遺伝子（142遺伝子）について、全長の mRNA配列から open reading frame (OR F)を抜き出し、またスプライシング 'バリアントがある場合はその共通部分の塩基配列 のみを抜き出した。次に下記の表 1及び表 2の例に示されるように抜き出した塩基配 列から siRNAセンス鎖 3'オーバーハング 2塩基部分と siRNAの 2本鎖部分（表中の double strand region) 19塩基部分そして siRNAアンチセンス鎖 3'オーバーハン グ部分の 2塩基部分からなる 23塩基の領域（表中の Target Sequence：ターゲット 配列）を各遺伝子につき 4領域選び出し、 CUGA7 in vitro siRNA Synthesis Ki tの使用説明書に従いターゲット配列の 3'に T7 RNAポリメラーゼのプロモーター配 列の相補配列（5'— CTATAGTGAGTCGTATTA— 3')を付カ卩した表 1、または 配列 25— 52を例とするセンス鎖铸型オリゴ DNAとアンチセンス鎖铸型オリゴ DNA をデザインしィ匕学合成（シグマジヱノシス社製）した。尚、配列番号 25— 30は TNFU P— 0013、配列番号 31— 32«TNFUP—0064、配列番号 33— 3^¾TNFUP— 0072、
Figure imgf000052_0001
36«TNFUP_0113,酉己歹 [J番号 37— 38ίま TNFUP一 011 4、そして配列番号 39 -42は TNFUP— 0142に対する siRNA合成用オリゴ DN A の塩基配列である。また、配列番号 45, 46は intercelluler adhesion molecule (I CAM) 一 1、配列番号 47, 48は vascular cell adhesion molecule (VCAM) 一 1 、目 tl歹 U番号 49, 50ίま E— selectin、酉己歹 U番号 51, 52ίま tumor necrosis factor re ceptorl (TNFR1)に対する陽性コントロール siRNA合成用オリゴ DNA (その産物 の siRNAが高 ゾックダウン効果を持つことをあら力じめ確認済）そして配列番号 43 , 44は GenBankに対する Blast検索で!/、ずれの遺伝子にもヒットしな 、ようにデザィ ンした 19塩基の配列をターゲット領域に持つ陰性コントロール siRN A用オリゴ DNA の塩基配列である。これらを含む前述の実施例 1で検出された 142遺伝子とコント口 ール遺伝子に対してデザインした全てのオリゴ DNAを铸型として用いて CUGA7 in vitro siRNA Synthesis Kitキットにより使用説明書に一部の改変をカ卩えた方法で siRNAを in vitro転写合成および精製を実施した。改変とは in vitro転写合成した s iRNAをトランスフエクシヨンした細胞に誘発されるインターフェロン応答を 5'端のリン 酸基を取り除くことにより抑えるもので、 Kimら（Nature Biotechnology, 2004, 22 , ρ321— 325)が報告した手法に改良をカ卩えた方法である。具体的には同キットの 標準プロトコールの半量にて in vitro転写反応及びヌクレアーゼ反応を実施した後、 その 50 μ 1の反応液に 7 μ 1の StrataClean Resin (Stratagene社製）を加えボルテ ックスミキサーにて攪拌後 1分間室温で静置し、 12000rpmで室温 1分間遠心し、上 清を MicroSpin G— 25 (アマシャムバイオサイエンス社製）で精製後、これに 20uni ts (2 μ 1)の calf intestinal, alkaline phosphatase (CIP： New England Biolabs 社製）と 6 μ 1の 10 X reaction buffer (CIPに添付）及び 2 μ 1の RNase Free蒸留水 をカロえ（全量 60 1)、タッピングにより攪拌後 37°C1時間インキュベートし、 40 1の R Nase Free蒸留水をカ卩え、最後に CUGA7 in vitro siRNA Synthesis Kitのプロ トコールに従い siRNAのフ ノール'クロ口ホルム精製を行った。その後分光光度計 を用いて siRNAの濃度測定を行い RNA Free蒸留水で 100ngZ 1に調製した。 尚、これらの配列番号 25から 52の配列のオリゴ DNAを使用し上記の方法で siRNA を合成した場合、表 1及び表 2の siRNA Sequenceに示す配列のものが合成される
[表 1]
Figure imgf000054_0001
n6lie/900Zdf/IJd £9 096 /900 OAV コント口一ル用 siRNA
siRNA合 fif用
Target Sequence siRNA Sequence
オリゴ DNA
,„¾τ . antisense , , , , sense
siRNA Name , double strand region ， 配列番号
overhung ： overhung
陰性コントロー
N.Ctrl-si gatgcgaacta cgagta tt - 3 ' 43 gaugcgaacuaucgaguacuu
44 uucuacgcuuqauagcucaug 陽性コント口—ル
ICAMl-si 5 ' - ga cagtgaccatc tacagc tC - 3 ' 45 - cagugaccaucuacagcuuuu
46 - cugucacugguagaugucgaa
VCAMl-si aa gaaggtggctctgtgacc tg - 3 47 gaagguggcucugugaccaug
48 uucuuccaccgagacacuqau
E-selectin- ca gctctcactttggtgct tc - 3 49 gcucucacuuuggugcuucuc
50 gucgagagugaaaccacgaag
TFNRl-si 5 ' - aa gaaccagtaccggcattat tg -3 51 - gaaccaguaccggca-uuau g
52 - uuc ugg cauggccguaaua
[0147] b)機能的スクリーニング用 HUVECの培養 ·調製
購入した冷凍保存 HUVEC (Cell Applications社製)を使用説明書に従い、ゥシ コラーゲン I型がコーティングされた底面積 75cm2の培養フラスコ（住友ベークライト 社製）中で内皮細胞増殖培地 (Cell Applications社製）により CO濃度 5%、 37°C
2
の条件下で培養し、コンフルェントになった状態の細胞をサブカルチャーセット A (C ell Applications社製)を用いて細胞を剥がして継代培養を開始し、培養フラスコ 1 本分の細胞を 2本に継代した場合を 1代として、 7代力 8代継代した後コンフルェン トになった 1本分の培養フラスコの細胞をサブカルチャーセット Aを用いて剥がし、 20 O X gで 5分間遠心後 2mlのセルバンカー（十慈フィールド社製）に浮遊させ、これを 1 mlずつ 2本のセラムチューブに冷凍保存した細胞をストックとして以下の実験に用い た。冷凍保存したストック 1本分の細胞を 15mlの培地が入ったゥシコラーゲン I型コー ティング底面積 75cm2培養フラスコにカ卩ぇ 6時間から 18時間後 25mlの新鮮な培地と 交換して 3日間培養し、コンフルェントになった細胞をサブカルチャーセット Aを用い て回収し、 200 X gで 5分間遠心後 1 X 105細胞/ mlの細胞濃度になるように内皮細 胞増殖培地で浮遊液を調製した。これをゥシコラーゲン I型がコーティングされた 96 穴マイクロプレート（住友ベークライト社製）の各ゥエルに 100 1 (1 X 104細胞）ずつ 分注した。これを 18時間から 24時間培養した後、各ゥエルの細胞は 95— 100%コン フルェントな状態に達した。尚、一次スクリーニング 1回の解析つき上記 96穴マイクロ プレートを ICAM— 1解析用、 VCAM— 1解析用そして E— selectin解析用の計 3 枚調製した。
[0148] c) siRNAのトランスフエクシヨン
上記 b)の各ゥエルの細胞に上記 a)で合成した siRNAを Targefect— siRNA tran sfection kit (TargetingSystems社製）を用いて以下の操作によりトランスフエクシ ヨンした。尚、スクリーニング 1回の解析につき 92の siRNA、 3つの陽性コントロール si RNA(ICAM— 1、 VCAM— 1、 E— selectin用）、そして陰性コントロール siRNA 計 96の siRNAについて 3枚（ICAM— 1測定用、 VCAM— 1測定用、 E— Selectin 測定用）の 96穴プレートに対してトランスフエクシヨンを実施した。
lOOng/ Ιの siRNAlつ【こつさ 96穴 PCRプレートの 1ウエノレ【こ 3. 1 ^ 1 (0. 31 ;z g) ずつ分注し、これに同キットに含まれている SolnA 120 1、 SolnB 75 1と 4500m gZlグルコース含 Dulbecco' s modified Eagle's medium (DMEM：シグマアルド リッチ社製） 14. 8mlの混合液を siRNAが入った PCRプレートの各ゥエルにつき 155 μ 1ずつ加え、 ABsolute QPCR Seal (ABgene社製）にて PCRプレートをシールし たのち転倒混和し、マイクロプレート用遠心機により混合液をスピンダウンした後 25 分間 37°Cでインキュベートした。そして上記 b)の細胞を培養した 96穴マイクロプレー トの培養上清を 8連タイプのァスピレータにより抜きとり、直ちに 8連マイクロピペットを 用いて 96穴 PCRプレートの各ゥエルの siRNAの混合液を 51 μ 1ずつ（各ゥエルにつ き 0. l /z gの siRNAに相当）を加え、 30分間 37°Cでインキュベートした。その後直ち に新鮮な内皮細胞増殖培地を 100 1ずつ 8連マイクロピペットでカ卩え、 16時間 CO
2 濃度 5%、 37°Cの条件下でインキュベートした。その後各ゥエルの上清を 126 1取り 除き、 75 1の新鮮な内皮細胞増殖培地を加え上清の全量を 100 1とし、 ICAM- 1測定用プレート及び VCAM— 1測定用プレートは 8時間、 E— selectin測定用プレ ートは 16時間同条件でインキュベーションを継続した。その後 ICAM— 1用のマイク 口プレートの各ゥエルに 0. 75ngZmlの濃度に内皮細胞増殖培地で希釈したヒト TN F— a (GT社製）を 50 1 (最終濃度 0. 25ngZml)を加えて 18. 5時間、 VCAM— 1測定用プレートの各ゥヱルには 30ngZ 1の TNF— α希釈液を 1 (最終濃度 1 OngZml)力！]え 18. 5時間、そして E— selectin測定用プレート各ゥエルには 30ngZ 1の TNF—ひ希釈液を 50 /z l (最終濃度 lOngZml)加え 2. 5時間、 CO濃度 5%
2
、 37°Cの条件下でインキュベートした。
d)じ ell enzyme— linked immunosorbent assay (じ ell— ELIsAノ
次に接着分子を認識するモノクローナル抗体を用いた enzyme— linked immun osorbent assay (ELISA)を模した方法にてマイクロプレート上で HUVEC表面に 発現する各接着分子の検出を行った。具体的には上記 c)で siRNAをトランスフエク シヨン後インキュベートした 96穴マイクロプレートの上清を取り除き、直ちにメタノール ：エタノール（3： 1混合比）の固定液を 100 1カ卩ぇ 1時間室温で静置することにより固 定し、プレートウォッシャーを使用して 0. 05%Tween— 20含 PBSで 3回洗浄した後 1%BSA含 PBSを 100 μ 1カ卩ぇ 30分間室温でブロッキングした後に上清を取り除き、 抗ヒト ICAM— 1、抗 VCAM— 1、抗 E— selectinマウス IgGlモノクローナル抗体（B Dバイオサイエンス社製)を 0. 1%BSA含 PBSで 500倍希釈 (最終濃度 1 μ g/ml) した液を対応したマイクロプレートの各ゥエルに 100 μ 1ずつ加え 30分間室温で抗体 を反応させ、マイクロプレートウォッシャーを使用して 0. 05%Tween— 20含 PBSで 4回洗浄した。その後再び 1%BSA含 PBS100 μ 1で 30分間室温にてブロッキングし 上清を取り除いた後に、 0. 1%BSA含 PBSで 1000倍希釈 (最終濃度 1 /z gZml)し 7 horse ladish peroxidase (HRP)標識饥マウス IgG几体 (Kirkegaard & Perry Laboratories社製）を 100 μ 1カ卩えて反応させた後、マイクロプレートウォッシャーを 使用して 0. 05%Tween— 20含 PBSで 5回洗浄し、上清を完全に取り除いた後 HR Pをペルォキシダーゼ用発色キット O (住友ベークライト社製)を用いて使用説明書の プロトコールに従って発色反応を行 、、各マイクロプレートウエルの 490nmの吸光度 を測定し内皮細胞表面の各接着分子の発現を評価した。すなわち、吸光度が低け れば接着分子の発現がより強く抑制されていることを示す。さらに ICAM— 1、 VCA M— 1、 E— selectin解析用プレートそれぞれで 92の siRNAにおける 490nmの吸光 度の平均値 (mean)と標準偏差 (SD)を算出じ' mean— 2 X SD"以下の吸光度を示 す siRNAを陽性と判定した。その結果 18遺伝子に対応する 21の siRNAが IC AM 1、 VCAM- 1, E— selectinの何れかの発現抑制効果を示し、陽性と判定され、 その対応遺伝子である 18遺伝子を炎症性サイト力イン誘導ポリヌクレオチドの候補と して選択した。
実施例 3
[0150] 炎症性サイト力イン誘導ポリヌクレオチド候補の検証
上記実施例 2d)にて陽性と判定された 21の siRNAの効果を以下の手順にて再検 証した。この再検証により結果として炎症性サイト力イン誘導ポリヌクレオチドとして T NFUP— 0013 (配列番号 1)、 TNFUP_0064 (配列番号 3)、 TNFUP_0072 ( 配列番号 5)、 TNFUP— 0113 (配列番号 7)、 TNFUP— 0114 (配列番号 9)、 TN FUP— 0142 (配列番号 11)の 6遺伝子が絞り込まれた。
[0151] a) Cell— ELISAによる接着分子発現抑制の再現性（二次スクリーニング）
実施例 2d)に記載の一次スクリーニングの結果の再現性を確認するため、陽性反 応を示した 21の siRNAについて 4系列（4ゥエル）ずつに解析数を増やし、実施例 2 と同一の方法で再解析を行った。その結果、一次スクリーニングで検出された siRNA の接着分子発現抑制効果の殆どが再現された。
図 1から 3は 21の siRNAのうちこの二次スクリーニングで接着分子の発現抑制効果 が再現され、さらに後述の b)、 c)で炎症に高い関連性を持つと判断された 6遺伝子 に対する計 9つの siRNAと陰性および陽性コントロール siRNAにおける結果を示す 。尚、図の縦軸は各 siRNAをトランスフエクシヨンした場合の 490nmの吸光度を示し 、斜線のカラムは d)の一次スクリーニングにおいて該当する接着分子の発現抑制効 果が陽性であった siRNAであることを示す。また灰色のカラムは該当の接着分子で 陽性ではないが、他の接着分子で陽性であったものを示し、白色、黒色のカラムはそ れぞれ陰性コントロール、陽性コントロールの siRNAにおけるデータを示す。また各 データは 4ゥエルのデータの平均値を示し、エラーバーは 4ゥエルのデータの標準偏 差を示す。
ICAM— 1の発現（図 1)については陽性コントロール siRNA(ICAMl— si)のデー タカも推測すると本バッチのアツセィでは ICAM—1が通常よりも高く検出されたと考 えられるため、 siRNAによる抑制効果が若干わ力りにくいが、 TNFUP—0013に対 する 3つの siRNA(TNFUP— 0013— 1, 3, 4)、 TNFUP— 0064に対する siRNA (TNFUP— 0064—4)で陰性コントロール50^^\ょりも490!1111吸光度で約40%減 少の発現抑制効果を示した。また、 TNFUP— 0114に対する siRNA (TNFUP—0 114— 3)では約 30%の発現抑制が認められた。さらに TNFUP— 0142については 一次スクリーニングで抑制効果を検出した 2つの siRNAのうち一方の siRNA (TNF UP— 0142— 3)で 30%程度の抑制効果しか現れなかった力 一方の siRNA (TN FUP—0142— 2)で約 40%の抑制効果が認められた。
VCAM— 1の発現（図 2)については、 TNFUP— 0064に対する siRNA (TNFUP —0064— 4)、 TNFUP— 0114に対する siRNA (TNFUP— 0114— 3)、 TNFUP —0142に対する 2つの siRNA (TNFUP— 0142— 2, 3)で陰性コントロール siRN Aよりも 490nm吸光度で 50%以上減少の発現抑制効果を示した。 TNFUP— 0072 に対する siRNA (TNFUP 0072— 2)についてはこれらに比べ効果が若干弱いも のの約 50%の抑制効果が認められた。
さらに E— selectinの発現（図 3)については、一次スクリーニングで抑制効果を検出 した TNFUP_0013に対する 3つの siRNAのうち 2つ（TNFUP— 0013— 3, 4)に おいて陰性コントロール siRNAよりも 490nm吸光度で約 50%減少の発現抑制効果 を示した。また TNFUP— 0072に対する siRNA(TNFUP— 0072— 2)、 TNFUP —0113に対する siRNA (TNFUP— 0113—4)、 TNFUP— 0114に対する siRN A (TNFUP— 0114— 3)で 50%以上の抑制効果が認められた。そして TNFUP— 0142については一次スクリーニングで抑制効果を検出した 2つの siRNAのうち一方 の siRNA (TNFUP— 0142— 2)で 50%以上の抑制効果が認められた。
これらの結果から図 1から 3に示される siRNAの対応遺伝子である TNFUP— 0013 は ICAM— 1と E— selectin, TNFUP— 0064は ICAM - 1と VCAM - 1、 TNFU P— 0072は VCAM—1と E— selectin、 TNFUP— 0113«E— selectin、 TNFUP —0114は ICAM— 1と VCAM— 1及び E— selectinそして TNFUP— 0142は ICA M— 1と VCAM— 1及び E— selectinの発現誘導に関わる可能性が高 、と判断され 、いわゆる炎症性サイト力イン誘導ポリヌクレオチドであることが明ら力となった。
b)定量的 PCRによる遺伝子変動の評価
実施例 2d)にて陽性であった 21の siRNAにより各接着分子の発現が mRNAレべ ルで変動しているかどうか、さらにその siRNAがターゲットとしている遺伝子が実際に ノックダウンされているかを以下の手順で定量的 PCRにより評価した。上記 a)にて 8 代継代培養した後に凍結保存した HUVECのストック 1本分の細胞を 15mlの内皮細 胞増殖培地が入ったゥシコラーゲン I型でコーティングされた 75cm2底面積の培養フ ラスコに加え 6時間から 18時間 CO濃度 5%、 37°Cの条件で培養した後、 25mlの新
2
鮮な培地と交換し、 3日間の培養後コンフルェントになった細胞をサブカルチャーセ ット Aを用いて回収し、 200 X gで 5分間遠心後 1 X 105細胞/ mlの細胞濃度になる ように内皮細胞増殖培地で浮遊液を調製した。これをゥシコラーゲン I型でコーティン グされた 6穴培養プレート (住友ベークライト社製)の各ゥエルに 2ml (2 X 105細胞)ず つ分注し、 CO 5%、 37°Cの条件下でー晚インキュベートし 95— 100%コンフルェ
2
ントな状態まで培養した。次に Targefect—siRNA transfection kitキットに含まれ ている SolnA 8 1、 SolnB 5 μ 1と 4500mg/lグルコース含 DMEM 987 μ 1を混合 した液を実施例 2d)で陽性であった 21の siRNAまたは陰性コントロール、陽性コント ロール siRNA (各 lOOngZ 1) 20 1に加えた後、 25分間 37°Cでインキュベートし 、これを HUVECの培養上清 2mlと置換し直ちに CO濃度 5%、 37°Cの条件で 30分
2
間インキュベートした後、新鮮な内皮細胞増殖培地 2mlを加え CO濃度 5%、 37°C
2
の条件で 14— 15時間インキュベートした。そして培養上清を新鮮な内皮細胞増殖 培地 1. 9mlと置換し ICAM— 1測定用には培地置換より 10時間後に 5ngZmlTNF — αを 100 1 (最終濃度 0. 25ngZml)、 VCAM— 1測定用には培地置換より 10 時間後に 200ngZmlTNF— aを 100 1 (最終濃度 lOngZml)、 E— selectin用 には培地置換より 15. 5時間後に 200ngZmlTNF— αを 100 /z l (最終濃度 10ng Zml)添カ卩した。その後、 ICAM—1および VCAM—1測定の場合は 14時間、 E— s electin測定の場合は 2. 5時間 CO濃度 5%、 37°Cの条件下でインキュベートした
2
後、 RNeasy Micro Kit (Qiagen社製）を用いて添付の使用説明書に従い全 RNA を抽出した。次に各サンプルにっき全 RNAを 0. 5 g使用してオリゴ dTプライマー を用いてスーパースクリプトファーストストランドシステム（Invitrogen社製）によりその 使用説明書に従って cDNAを合成し、これを QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen社製）により精製し（30 1の溶出 bufferで cDNAを溶出）、そのうち 1反応 にっき 1 μ 1の cDNAをテンプレートに PCRプライマーを 0. 2 μ Μの濃度で SYBR G reen PCR Master Mix (アプライドバイオシステムズ社製）の標準プロトコ一ノレに準 じて反応液 (各反応はすべて 2系列ずつ）を調製し、 GeneAmp 5700 (アプライドバ ィォシステムズ社製）にて 95°C 10分間加熱後、 95°C 15秒間、 60°C 1分間の反応を 40回繰り返し増幅曲線を作成した。尚、今回使用した 21の siRNAに対応する 18遺 伝子の PCRプライマーうち、実施例 3a)—c)の解析により見出された炎症性サイト力 イン誘導ポリペプチドをコードする 6遺伝子に対する PCRプライマーは TNFUP— 00 13 :配列番号 53— 54、 TNFUP— 0064 :配列番号 55— 56、 TNFUP— 0072 :配 列番号 57— 58、 TNFUP— 0113 :配列番号 59— 60、 TNFUP— 0114 :配列番号 61— 62、 TNFUP— 0142 :配列番号 63— 64である。接着分子に対する PCRプラ ィマーはICAM—1 :配列番号65— 66、VCAM—1 :配列番号67— 68、 E— selec tin:配列番号 69— 70、そして内在性コントロール遺伝子に対する PCRプライマーは β— actm:目 G歹 'J番号 71— /'2、 glyderaidehy e— 3— pho spnate dehydrogenas e (GAPDH)：配列番号 73— 74である（表 3参照）。そして得られた増幅曲線力 Ge neAmp 5700 SDSソフトウェア（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて各ゥェ ルの Ct値を求め、各 siRNAをトランスフエクシヨンしたサンプルにつ!/、て GAPDHと β一 actinの Ctの平均値から各遺伝子における Ct値を差し引 、た Δ Ct値を求め、こ れと陰性コントロール siRNAをトランスフエクシヨンした場合の Δ Ct値と比較すること により各遺伝子の発現の変動を評価した。実施例 2d)で陽性であった 21の siRNAの データのうち実施例 3a) -c)の結果力 炎症への関連性が高いと判断された 6遺伝 子 (炎症性サイト力イン誘導ポリペプチドをコードする遺伝子）に対する 9つの siRNA をトランスフエクシヨンした場合の各接着分子および各 siRNAのターゲット遺伝子の mRNAの発現変動を図 4の a— b、図 5の a— b、そして図 6の a— bに示す。図 4a、図 5a、そして図 6aに示す一部の siRNAにお!/、て接着分子 mRNAの発現変動の幅が 小さいものが存在するものの、図 4から 6に示す殆どの siRNAにおいて陰性コント口 ールと A Ct値の差が 1以上すなわち 50%の発現減少が認められ、実施例 2d)、そし て実施例 3a)の結果が mRNAレベルでも再現された。
具体的に ICAM— 1の mRNA発現（図 4a)については、 TNFUP—0013〖こ対する3 つの siRNAのうち 2つ（TNFUP_0013— 1, 3)、 TNFUP— 0064に対する siRN A (TNFUP— 0064— 4)、 TNFUP— 0114に対する siRNA (TNFUP— 0114— 3 ；)、 TNFUP— 0142に対する 2つの siRNAのうち 1つ（TNFUP— 0142— 2)におい て 50%以上の発現減少が認められた。
また VC AM— 1の mRNA発現（図 5a)については、 TNFUP— 0064に対する siRN A (TNFUP— 0064— 4)、 TNFUP— 0072に対する siRNA (TNFUP— 0072— 2 ；)、 TNFUP— 0114に対する siRNA (TNFUP— 0114— 3)、 TNFUP— 0142に 対する 2つの siRNA (TNFUP— 0142— 2, 3)において 50%以上の発現減少が認 められた。
さらに E— selectinの mRNA発現（図 6a)については、 TNFUP— 0013に対する 3 つの siRNA(TNFUP 0013— 1, 3, 4)、 TNFUP 0113に対する siRNA (TN FUP— 0113— 4)、 TNFUP— 0114に対するsiRNA (TNFUP—0114— 3)にお いて 50%以上の発現減少が認められた。また、 TNFUP— 0072に対する siRNA ( TNFUP— 0072— 2)及び TNFUP— 0142に対する 2つの siRNAのうち 1つ（TNF UP— 0142— 2)にお!/、ては 50%近!、発現減少が認められた。
また図 4b、図 5b、そして図 6bに示されるように、これらの 6遺伝子に対する siRNAは そのターゲット遺伝子の mRNAの発現を陰性コントロールと Δ Ct値の差が 1以上す なわち 50%以上ノックダウンしていることも確認された。
よってこれらの 6遺伝子をその siRNAでノックダウンすることにより TNF— aで誘導さ れる接着分子の発現誘導が mRNAでも抑制されることが明らかとなり、これらの 6遺 伝子は血管内皮細胞の炎症反応に関連性が高い遺伝子 (炎症性サイト力イン誘導 ポリヌクレオチド)であることが再確認された。
[表 3]
Figure imgf000064_0001
c)白血球細胞 HUVEC接着解析
実施例 2d)の一次スクリーニングにて陽性であった 21の siRNAにより実際に TNF aにより誘発される白血球細胞と HUVECとの接着が抑えられるかどうかを検証し た。具体的には実施例 2a)の手順に従いゥシコラーゲン I型がコーティングされたブラ ッククリアボトム 96穴マイクロプレート 4枚 (BDバイオサイエンス社製）に培養'調製し た。次に 96穴フォーマットの滅菌済みマイクロチューブへ分注した 21の各 siRNA (l OOngZ At 1)に 16. 4 1 (1. 64 g)に Targefect— siRNA transfection kitに含 まれている SolnA 164 1 SolnB 102. 5 1と 4500mgZlグルコース含 Dulbecc o ' s modified Eagle's medium (DMEM :シグマアルドリッチ社製） 20. 2mlの混 合液を 820 1ずつ加え転倒混和し、スピンダウンした後 25分間 37°Cでインキュベー トした。そして HUVECを培養した 96穴マイクロプレートの培養上清を 8連タイプのァ スピレータにより抜きとり、直ちに 8連マイクロピペットを用いて上記の siRNAの混合 液を 51 μ 1ずつ（各ゥエルにつき 1 μ gの siRNAに相当する。また 1つの siRNAにつ き 4ゥエル X 4プレート計 16ゥエルに対し添カ卩した）を加え、 30分間 37°Cでインキュべ ートした。その後直ちに新鮮な内皮細胞増殖培地を 100 1ずつ 8連マイクロピペット でカロえ、 15時間 CO濃度 5%、 37°Cの条件下でインキュベートした。その後各ゥエル
2
の上清を 126 μ 1取り除き、 75 μ 1の新鮮な内皮細胞増殖培地を加え上清の全量を 1 00 μ 1とし、 9時間同条件でインキュベーションを継続した。その後 30ngZ μ 1の TNF — α希釈液を 50 /z l (最終濃度 lOngZml)カ卩ぇ 18時間、 CO濃度 5%、 37°Cの条
2
件下でインキュベートした。一方、 10%牛胎児血清（FBS)含 RPMI1640培地（シグ マアルドリッチ社製)で継代培養した Tリンパ球系培養細胞（MOLT— 4、 Jurkat)、 単球系培養細胞（THP— 1、 U937)それぞれ 7 X 107細胞を Vybrant Cell Adhesi on Assay Kitを用いて使用説明書に従い蛍光標識し、 FBS不含 RPMI1640培地 により 5 X 106細胞/ mlの濃度の浮遊液を調製した。そして上記の TNF—ひ処理後 のマイクロプレート各ゥエルの上清を 8連タイプのァスピレータにより抜きとり、直ちに 1 ゥエルにつき 100 1 (5 X 105細胞）の蛍光標識した各白血球細胞を各々のマイクロ プレートに 8連マイクロピペットを用いて添カ卩し、 37°Cで 1時間インキュベートした。次 に各ゥエルに FBS不含の RPMI1640培地 100 μ 1を加え直ぐに 8連ァスピレーターと 8連マルチマイクロピペットを用いて各ゥエルにつき 200 μ 1の FBS不含 RPMI1640 培地で 2回洗浄し、最後〖こ 200 1の PBSを加え、蛍光マイクロプレートリーダーによ り蛍光測定 (励起 Z蛍光： 485nmZ535nm)し、各 siRNAにおける 4系列（4ゥ ル） のデータの平均値を求めた。尚、この蛍光強度はマイクロプレートに残っている（HU VECに接着している）白血球細胞の数と比例する。そして、その蛍光強度が陰性コ ントロール siRNAにおける蛍光強度の 50%以下（50%以下の接着阻害）の場合を 陽性と判定した。図 7から 10は、解析した 21の siRNAのうち実施例 3a)— c)の結果 力 炎症性サイト力イン誘導ポリヌクレオチドと判断された 6遺伝子に対応する 9つの s iRNAまた陰性および陽性コントロール siRNAにおけるデータを示す。図 7から 10で 示されるように、今回解析した siRNAのうち TNFUP— 0064— 4が MOLT— 4^Jur katゝ TNFUP— 0114— 3が U937と MOLT— 4^Jurkatゝ TNFUP— 0142— 2が MOLT— 4^Jurkat、 TNFUP— 0142— 3が MOLT— 4の接着を 50%以上阻害す ることが示され、 TNFUP— 0064、 TNFUP— 0114、そして TNFUP— 0142の 3遺 伝子が少なくとも今回調べた白血球細胞との接着に関わっていることが明ら力となり、 炎症領域の血管内皮細胞で特に白血球の接着'浸潤の誘導に重要な役割を果たし ていることが示唆された。また、今回検討した細胞では TNFUP— 0013、 TNFUP —0072、そして TNFUP— 0113については、その siRNAで接着抑制効果は認め られなカゝつた力 上記 a) b)にて接着分子の発現を抑制する事が証明されたことや今 回の解析にて siRNAと白血球細胞種の組み合わせにより接着抑制の様式が異なつ ていたことから、今回用いなかった他の白血球細胞もしくは末梢血の何れかの白血 球の接着に関連して 、る可能性は十分考えられる。
[0154] d)炎症性サイト力イン誘導ポリヌクレオチド候補の検証の総括
今回の検証実験を総括すると少なくとも HUVECにおいて、 TNFUP— 0013は IC AM— 1と E— selectinの発現に関連する遺伝子、 TNFUP— 0064は IC AM— 1と VCAM— 1の発現に関連しかつ Tリンパ球系の細胞（MOLT— 4、 Jurkat)の接着 に関連する遺伝子、 TNFUP— 0072は VCAM— 1と E— selectinの発現に関連す る遺伝子、 TNFUP— 0113は E— selectinの発現に関連する遺伝子、 TNFUP— 0 114は ICAM— 1と VCAM— 1及び E— selectinの発現に関連しかつ単球系の細 胞 (U937)及び Tリンパ球系の細胞 (MOLT— 4、 Jurkat)の接着に関連する遺伝子 、 TNFUP— 0142は ICAM— 1と VCAM— 1及び E— selectinの発現に関連しか つ及び Tリンパ球系の細胞（MOLT— 4、 Jurkat)の接着に関連する遺伝子であるこ とが明ら力となった。
配列表フリーテキスト
[0155] 配列番号： 1は、 TNFUP— 0013の遺伝子配列である。
配列番号： 2は、 TNFUP— 0013の遺伝子配列のコードされるアミノ酸配列である。 配列番号： 3は TNFUP— 0064の遺伝子配列である。
配列番号： 4は、 TNFUP 0064の遺伝子配列のコードされるアミノ酸配列である。 配列番号： 5は、 TNFUP— 0072の遺伝子配列である。
配列番号： 6は、 TNFUP— 0072の遺伝子配列のコードされるアミノ酸配列である。 配列番号： 7は、 TNFUP— 0113の遺伝子配列である。
配列番号： 8は、 TNFUP— 0113の遺伝子配列のコードされるアミノ酸配列である。 配列番号： 9は、 TNFUP— 0114の遺伝子配列である。
配列番号： 10は、 TNFUP— 0114の遺伝子配列のコードされるアミノ酸配列である 配列番号： 11は、 TNFUP— 0142の遺伝子配列である。
配列番号： 12は、 TNFUP— 0142の遺伝子配列のコードされるアミノ酸配列である 配列番号： 13は、 TNFUP— 0072のスプライシングバリアントである TNFUP— 007 2Bの遺伝子配列である。
配列番号： 14は、 TNFUP— 0072のスプライシングバリアントである TNFUP— 007 2Bの遺伝子配列のコードされるアミノ酸配列である。
配列番号： 15は、 TNFUP— 0142のスプライシングバリアントである TNFUP— 014 2Bの遺伝子配列である。
配列番号： 16は、 TNFUP— 0142のスプライシングバリアントである TNFUP— 014 2Bの遺伝子配列のコードされるアミノ酸配列である。
配列番号： 17は、 TNFUP— 0142のスプライシングバリアントである TNFUP— 014 2Cの遺伝子配列である。
配列番号： 18は、 TNFUP— 0142のスプライシングバリアントである TNFUP— 014 2Cの遺伝子配列のコードされるアミノ酸配列である。
配列番号： 19は、 TNFUP— 0142のスプライシングバリアントである TNFUP— 014 2Dの遺伝子配列である。
配列番号： 20は、 TNFUP— 0142のスプライシングバリアントである TNFUP— 014 2Dの遺伝子配列のコードされるアミノ酸配列である。
配列番号： 21は、 TNFUP— 0142のスプライシングバリアントである TNFUP— 014 2Eの遺伝子配列である。 配列番号： 22は、 TNFUP— 0142のスプライシングバリアントである TNFUP— 014 2Eの遺伝子配列のコードされるアミノ酸配列である。
配列番号： 23は、 TNFUP— 0142のスプライシングバリアントである TNFUP— 014 2Fの遺伝子配列である。
配列番号： 24は、 TNFUP— 0142のスプライシングバリアントである TNFUP— 014 2Fの遺伝子配列のコードされるアミノ酸配列である。
配列番号： 25は、 TNFUP— 0013に対する siRNA (TNFUP— 0013— 1)のセンス 鎖合成用オリゴ DNAの塩基配列である。
配列番号： 26は、 TNFUP— 0013に対する siRNA (TNFUP— 0013— 1)のアン チセンス鎖合成用オリゴ DNAの塩基配列である。
配列番号： 27は、 TNFUP— 0013に対する siRNA (TNFUP— 0013— 3)のセンス 鎖合成用オリゴ DNAの塩基配列である。
配列番号： 28は、 TNFUP— 0013に対する siRNA (TNFUP— 0013— 3)のアン チセンス鎖合成用オリゴ DNAの塩基配列である。
配列番号： 29は、 TNFUP— 0013に対する siRNA (TNFUP— 0013-4)のセンス 鎖合成用オリゴ DNAの塩基配列である。
配列番号： 30は、 TNFUP— 0013に対する siRNA (TNFUP— 0013— 4)のアン チセンス鎖合成用オリゴ DNAの塩基配列である。
配列番号： 31は、 TNFUP— 0064に対する siRNA (TNFUP— 0064—4)のセンス 鎖合成用オリゴ DNAの塩基配列である。
配列番号： 32は、 TNFUP— 0064に対する siRNA (TNFUP— 0064—4)のアン チセンス鎖合成用オリゴ DNAの塩基配列である。
配列番号： 33は、 TNFUP— 0072に対する siRNA (TNFUP— 0072— 2)のセンス 鎖合成用オリゴ DNAの塩基配列である。
配列番号： 34は、 TNFUP— 0072に対する siRNA (TNFUP— 0072— 2)のアン チセンス鎖合成用オリゴ DNAの塩基配列である。
配列番号： 35は、 TNFUP— 0113に対する siRNA (TNFUP— 0113-4)のセンス 鎖合成用オリゴ DNAの塩基配列である。 配列番号： 36は、 TNFUP— 0113に対する siRNA (TNFUP— 0113— 4)のアン チセンス鎖合成用オリゴ DNAの塩基配列である。
配列番号： 37は、 TNFUP— 0114に対する siRNA (TNFUP一 0114— 3)のセンス 鎖合成用オリゴ DNAの塩基配列である。
配列番号： 38は、 TNFUP— 0114に対する siRNA (TNFUP一 0114— 3)のアン チセンス鎖合成用オリゴ DNAの塩基配列である。
配列番号： 39は、 TNFUP— 0142に対する siRNA (TNFUP— 0142 - 2)のセンス 鎖合成用オリゴ DNAの塩基配列である。
配列番号： 40は、 TNFUP— 0142に対する siRNA (TNFUP一 0142— 2)のアン チセンス鎖合成用オリゴ DNAの塩基配列である。
配列番号： 41は、 TNFUP— 0142に対する siRNA (TNFUP一 0142— 3)のセンス 鎖合成用オリゴ DNAの塩基配列である。
配列番号： 42は、 TNFUP— 0042に対する siRNA (TNFUP一 0142— 3)のアン チセンス鎖合成用オリゴ DNAの塩基配列である。
配列番号： 43は、陰性コントロール siRNA (N. Ctrl— si)のセンス鎖用オリゴ DNA の塩基配列である。
配列番号： 44は、陰性コントロール siRNA (N. Ctrl— si)のアンチセンス鎖用オリゴ DNAの塩基配列である。
配列番号： 45は、 ICAM 1に対する陽性コントロール siRNA (ICAM 1 si)のセン ス鎖用オリゴ DNAの塩基配列である。
配列番号： 46は、 ICAM - 1に対する陽性コントロール siRNA (ICAM 1 - si)のアン チセンス鎖用オリゴ DNAの塩基配列である。
配列番号： 47は、 VCAM 1に対する陽性コントロール siRNA (VCAM 1 si)のセ ンス鎖用オリゴ DNAの塩基配列である。
配列番号： 48は、 VCAM 1に対する陽性コントロール siRNA (VCAM 1 si)のァ ンチセンス鎖用オリゴ DNAの塩基配列である。
配列番号： 49は、 E— selectinに対する陽性コントロール siRNA (E— selectin si) のセンス鎖用オリゴ DNAの塩基配列である。 配列番号： 50は、 E— selectinに対する陽性コントロール siRNA (E— selectin si) のアンチセンス鎖用オリゴ DNAの塩基配列である。
配列番号： 51は、 TNFR1に対する陽性コントロール siRNA (TNFR1— si)のセンス 鎖用オリゴ DNAの塩基配列である。
配列番号： 52は、 TNFR1に対する陽性コントロール siRNA (TNFR1— si)のアンチ センス鎖用オリゴ DNAの塩基配列である。
配列番号 53は、 TNFUP— 0013定量用の PCRプライマーの塩基配列である。 配列番号 54は、 TNFUP— 0013定量用の PCRプライマーの塩基配列である。 配列番号 55は、 TNFUP— 0064定量用の PCRプライマーの塩基配列である。 配列番号 56は、 TNFUP— 0064定量用の PCRプライマーの塩基配列である。 配列番号 57は、 TNFUP— 0072定量用の PCRプライマーの塩基配列である。 配列番号 58は、 TNFUP— 0072定量用の PCRプライマーの塩基配列である。 配列番号 59は、 TNFUP— 0113定量用の PCRプライマーの塩基配列である。 配列番号 60は、 TNFUP— 0113定量用の PCRプライマーの塩基配列である。 配列番号 61は、 TNFUP— 0114定量用の PCRプライマーの塩基配列である。 配列番号 62は、 TNFUP— 0114定量用の PCRプライマーの塩基配列である。 配列番号 63は、 TNFUP— 0142定量用の PCRプライマーの塩基配列である。 配列番号 64は、 TNFUP— 0142定量用の PCRプライマーの塩基配列である。 配列番号 65は、 ICAM— 1定量用の PCRプライマーの塩基配列である。
配列番号 66は、 ICAM— 1定量用の PCRプライマーの塩基配列である。
配列番号 67は、 VCAM— 1定量用の PCRプライマーの塩基配列である。
配列番号 68は、 VCAM— 1定量用の PCRプライマーの塩基配列である。
配列番号 69は、 E— selectin定量用の PCRプライマーの塩基配列である。
配列番号 70は、 E— selectin定量用の PCRプライマーの塩基配列である。
配列番号 71は、 J3一 actin定量用の PCRプライマーの塩基配列である。
配列番号 72は、 β一 actin定量用の PCRプライマーの塩基配列である。
配列番号 73は、 GAPDH定量用の PCRプライマーの塩基配列である。
配列番号 74は、 GAPDH定量用の PCRプライマーの塩基配列である。

Claims

請求の範囲
[1] (1)血管内皮細胞と、被験物質とを接触させる工程、及び
(2)下記のいずれかに記載の遺伝子の発現量を測定する工程を含む血管内皮細胞 接着抑制物質のスクリーニング方法：
1)配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21又は 23で表される塩基配列力 らなる DNA、または
2)配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 17、 19、 21又は 23で表される塩基配列力 らなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、炎症性サイト力イン の存在下にお!/、て (a)細胞接着分子の発現誘導機能、及び Z又は (b)血管内皮細 胞と白血球細胞との接着誘導機能を有するポリペプチドをコードするもの。
[2] (1)血管内皮細胞と、被験物質とを接触させる工程、及び
(2)下記のいずれかに記載のポリペプチドの発現量を測定する工程を含む血管内皮 細胞接着抑制物質のスクリーニング方法：
1)酉己列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22又は 24で表されるアミノ酸酉己 列からなるポリペプチド、または
2)酉己列番号 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 22又は 24で表されるアミノ酸酉己 列において、 1〜： LO個のアミノ酸が欠失、置換、及び Z又は付加されたアミノ酸配列 を有し、かつ、炎症性サイト力インの存在下において (a)細胞接着分子の発現誘導 機能、及び Z又は (b)血管内皮細胞と白血球細胞との接着誘導機能を有するポリべ プチド。
[3] 被験物質非存在下よりも前記遺伝子又はポリペプチドの発現量を減少させる被験 物質を、選択する工程をさらに含む、請求項 1または 2に記載の血管内皮細胞接着 抑制物質のスクリーニング方法。
[4] (1)請求項 1に記載の遺伝子を含む発現ベクターで形質転換され、前記遺伝子によ つてコードされたポリペプチドを発現している細胞と、被験物質とを接触させる工程、
(2)白血球を上記細胞に接触させる工程、及び
(3)白血球と上記細胞との接着量を測定する工程を含む、
血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法。
[5] 被験物質非存在下よりも白血球と上記細胞との接着量を減少させる被験物質を、選 択する工程をさらに含む、請求項 4記載の血管内皮細胞接着抑制物質のスクリー- ング方法。
[6] (1)請求項 1に記載の遺伝子を含む発現ベクターで形質転換され、前記遺伝子によ つてコードされたポリペプチドを発現している細胞と、被験物質とを接触させる工程、 及び
(2)細胞接着分子の発現量を測定する工程を含む、
血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法。
[7] 被験物質非存在下よりも細胞接着分子の発現量を減少させる被験物質を、選択す る工程をさらに含む、請求項 6記載の血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング 方法。
[8] (1)請求項 2に記載のポリペプチドと、被験物質とを、標識した前記ポリペプチドの特 異結合体の存在下で、接触させる工程、及び
(2)前記ポリペプチドと前記特異結合体の結合量を測定する工程を含む、 血管内皮細胞接着抑制物質のスクリーニング方法。
[9] 被験物質非存在下よりも特異結合体の結合量を減少させる被験物質を、選択する 工程をさらに含む、請求項 8記載の血管内皮細胞接着抑制物質のスクリ一ユング方 法。
[10] 炎症性サイト力インを接触させる工程をさらに含む、請求項 1から 9のいずれか〖こ記 載のスクリーニング方法。
[11] 前記細胞接着分子が ICAM— 1、 VCAM 1、及び E— selectinからなる群から 選択されるいずれかである、請求項 1から 10のいずれかに記載のスクリーニング方法
[12] 血管内皮細胞接着抑制物質を抗炎症薬として選択するものである請求項 1から 11 のいずれかに記載のスクリーニング方法。
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