ITMI20081742A1 - Uso di peptidi nella terapia antiangiogenica relativa a patologie tumorali - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
"USO DI PEPTIDI NELLA TERAPIA ANTIANGIOGENICA RELATIVA A
PATOLOGIE TUMORALI"
CAMPO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione riguarda l'uso di peptidi derivanti dalla sequenza intracellulare del recettore c-Met nella terapia antiangiogenica relativa a patologie tumorali.
BACKGROUND DELL'INVENZIONE
Il c-Met à ̈ il recettore ad attività tirosina-kinasica per il fattore di crescita degli epatociti (HGF). Entrambi sono espressi in numerosi tessuti, sebbene la loro espressione sia confinata rispettivamente a livello delle cellule epiteliali e mesenchimali.
L' interazione di HGF con il suo recettore conferisce alle cellule un fenotipo invasivo e, quando inappropriatamente attivato, induce tumorigenesi e disseminazione metastatica.
II recettore Met à ̈ una glicoproteina formata da due subunità (alfa e beta) legate insieme da un ponte disolfuro .
Il dominio extracellulare à ̈ implicato nell'interazione con il ligando, mentre il dominio intracellulare possiede attività tirosin kinasica.
In seguito al legame con HGF, si verifica l'attivazione del recettore attraverso la sua dimerizzazione e l'auto/trans fosforilazione dei residui di tirosina.
In particolare, vengono dapprima fosforilate due tirosine presenti nel loop catalitico (Y1234 e Y1235), portando alla piena attivazione kinasica del recettore; successivamente vengono fosforilate altre due tirosine (Y1349 e Y1356) nella coda C-terminale.
Queste ultime fanno parte di una sequenza consensus che agisce come docking site per differenti trasduttori e adattatori intracellulari e media quindi l'accoppiamento del recettore con diversi effettori, quali il complesso GRB2/Sos, PI3K, STAT3. La sostituzione delle Y1349 e Y1356 con F (Phe) non modifica l'attività tirosina kinasica del recettore, ma abolisce completamente diverse risposte biologiche, tra cui la proliferazione, la migrazione e l'invasione cellulare.
Alla luce delle attuali conoscenze circa il meccanismo d'azione del recettore Met e del suo ligando, sono stati sintetizzati diversi peptidi derivanti dalla sequenza intracellulare del recettore stesso, aventi attività inibitoria nei confronti di specifiche vie intracelluari . Questi ultimi sono oggetto della domanda di brevetto internazionale WO 95/01376.
Diversi studi in vitro ed in vivo presenti nella letteratura scientifica hanno dimostrato che la proteina PI3K Ã ̈ capace di legare la forma attivata del recettore Met. In particolare il sito di legame di PI3K Ã ̈ rappresentato da due tirosine contenute nel dominio citosolico di Met (Tyrl349 e Tyrl356).
Questi residui sono stati utilizzati per generare fosfopeptidi (oggetto della domanda di brevetto WO 95/01376) capaci di interferire con il legame tra il recettore Met e PI3K e di inibire quindi le risposte biologiche ad esso correlate.
Nella domanda di brevetto suddetta à ̈ stato dimostrato che questo peptide à ̈ in grado di interagire con diversi trasduttori del segnale, e di interferire con i processi biologici responsabili della proliferazione, migrazione ed invasione cellulare.
In particolare, l'inibizione del legame tra la forma attiva del recettore ed i diversi adattatori molecolari risulta un'ottima strategia per inibire la mitogenesi e, quindi, la proliferazione delle cellule tumorali.
Gli autori della domanda di brevetto descrivono, pertanto, l'uso del peptide per il trattamento di patologie neoplastiche attraverso l'inibizione della mitogenesi e motogenesi delle cellule tumorali.
La suddetta domanda di brevetto non ipotizza, suggerisce o dimostra l'effetto di questo peptide sui meccanismi che innescano 1'angiogenesi , ovvero la formazione di nuovi vasi sanguigni all'interno di una massa tumorale. La domanda di brevetto non ipotizza, suggerisce o dimostra, altresì, che il peptide possa avere un effetto inibitorio sulla morfogenesi e migrazione delle cellule endoteliali. Infatti, la domanda di brevetto descrive esclusivamente l'effetto inibitorio esercitato dal peptide sulla mitogenesi e motogenesi delle cellule tumorali .
L'intervento sullo sviluppo di nuovi vasi sanguigni che si formano a seguito dello sviluppo di una massa tumorale à ̈ una delle vie di trattamento delle patologie neoplastiche attualmente esplorate.
Il targeting vascolare ha in sé un vantaggio: le cellule endoteliali, infatti, a differenza di quelle tumorali, difficilmente vanno incontro a mutazioni e questa loro caratteristica le rende un bersaglio di elezione per la terapia antitumorale.
La terapia antiangiogenica classica, attualmente impiegata, Ã ̈ basata sull 'utilizzo di anticorpi monoclonali (ad esempio il Bevacizumab) contro il VEGF (fattore di crescita dell'endotelio vascolare - vascular endothelial growth factor).
La terapia classica fondata sugli anticorpi monoclonali presenta problemi legati all'instaurarsi di una resistenza agli anticorpi che porta, nel tempo, ad un'inefficacia dei farmaci impiegati.
Il problema alla base della presente invenzione à ̈ di mettere a disposizione una terapia antiangiogenica efficace nel prevenire e contrastare lo sviluppo di vasi sanguigni nelle patologie tumorali, alternativa a quelle già note ed in grado di superare gli inconvenienti relativi all<1>insorgere di una resistenza alla somministrazione degli anticorpi monoclonali.
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione riguarda l'uso di un peptide avente da 1 a 20 amminoacidi, preferibilmente da 8 a 12 amminoacidi, di sequenza generale (I):
XN-YVXV-XC
(I)
in cui YVXV Ã ̈ SEQ.ID.No.1;
XNe Xcsono ciascuno sequenze da 0 a 16 amminoacidi; per l'uso nell'inibizione o riduzione della migrazione e morfogenesi HGF-dipendenti di cellule endoteliali umane implicate nella formazione di vasi sanguigni collegati allo sviluppo di patologie tumorali.
Vantaggiosamente, l'invenzione riguarda l'impiego del peptide di formula (I) per inibire o ridurre 1'angiogenesi collegata alla formazione, crescita e sostentamento di cellule tumorali.
Il peptide di formula (I) può, quindi, essere utilizzato nella terapia antiangiogenica relativa a patologie tumorali, permettendo di superare lo svantaggio dell'insorgenza di resistenze collegate alla somministrazione di anticorpi monoclonali.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
L'invenzione verrà descritta in dettaglio qui di seguito con riferimento anche alle annesse figure, in cui:
la Figura 1 mostra l'effetto inibitorio del peptide sulla migrazione di cellule HUVE in risposta al gradiente chemiotattico HGF (10 ng/ml);
La Figura 2 mostra l'effetto inibitorio del peptide sull'organizzazione tubulare indotta da HGF;
la Figura 3 mostra l'effetto inibitorio in vivo del peptide sulla neoangiogenesi indotta da HGF, rilevato attraverso il dosaggio del contenuto emoglobinico dei pellet di matrigel;
la Figura 4 mostra pellet di matrigel in cui, in presenza del peptide, si osserva l'inibizione dell'angiogenesi indotta da HGF.
La Figura 5 mostra la colorazione istologica dei pellet di matrigel:
A-B (lOx-2Ox): Sezione istologica di pellet prelevati da topi trattati con HGF 50 ng/pellet; Ã ̈ possibile osservare aree vascolarizzate, in cui sono presenti cellule ematiche ed infiltrato infiammatorio.
C-D (lOx-2Ox): Sezione istologica di pellet prelevati da topi trattati con HGF 50 ng/pellet e con peptide 10 Î1⁄4Îœ; le sezioni mostrano l'assenza di vascolarizzazione e una ridotta presenza di cellule infiammatorie.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL'INVENZIONE
Le sequenze peptidiche sono riportate per intero in coda alla descrizione secondo lo standard internazionale WIPO.ST.25 e sviluppate con il programma Patent-In 3.3. In una realizzazione preferita dell'invenzione il peptide di sequenza (I) Ã ̈ scelto tra i seguenti peptidi: Tyr* -Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr (SEQ.ID.NO.2); Tyr-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr (SEQ.ID.No.6); Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-Cys-Val-Ala (SEQ.ID.No.4); Tyr-Val-Asn-Val-Lys-Cys-Val-Ala (SEQ.ID.No.8) Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys (SEQ.ID.No.3); Tyr-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr-Val-Asn-Val-Lys (SEQ.ID.No.7); Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr-Val-Asn-Val-Lys (SEQ.ID.No.10); Tyr-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr* -Val-Asn-Val-Lys (SEQ.ID.No.il); Asp-Asp-Pro-Ser-Tyr* -Val-Asn-Val-Gln (SEQ.ID.No.5); Asp-Asp-Pro-Ser-Tyr-Val-Asn-Val-Gln (SEQ.ID.No.9), in cui Tyr* rappresenta un residuo di tirosina fosforilato.
I peptidi più preferiti sono scelti tra: Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr* -Val-Asn-Val-Lys (SEQ.ID.No.3); Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-Cys-Val-Ala (SEQ.ID.No.4); Asp-Asp-Pro-Ser-Tyr*-Val-Asn-Val-Gln (SEQ.ID.No.5); Tyr* -Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr (SEQ.ID.No.2), in cui Tyr* rappresenta un residuo di tirosina fosforilato.
II peptide può essere anche usato sotto forma di sali farmaceuticamente accettabili. Esempi di sali sono sali di metalli alcalini (ad esempio sali di sodio o potassio) e sali di ammonio; oppure sali di addizione acida, quali cloridrati o acetati.
I peptidi possono essere fosforilati oppure non fosforilati. La forma attiva dei peptidi à ̈ in genere fosforilata ma può essere vantaggioso somministrare un peptide in forma non fosforilata e lasciare che la fosforilazione avvenga all'interno del corpo del paziente. I peptidi non fosforilati possono, quindi, essere impiegati come prò-farmaci per la terapia antiangiogenica .
I peptidi possono essere sintetizzati secondo metodi standard della chimica sintetica, per esempio utilizzando un residuo di tirosina protetto e impiegando tecniche sintetiche in fase liquida o solida.
Dettagli dei metodi di sintesi dei peptidi possono essere trovati nella descrizione della domanda di brevetto WO 95/01376 che, perciò, non verranno ripetuti in questa sede.
I peptidi possono essere somministrati ad un paziente mediante qualsiasi via di somministrazione parenterale, quali per esempio la via sub-cutanea, intravenosa o intramuscolare.
La scelta del metodo di somministrazione, la dose e la frequenza, dipendono da una serie di fattori, per esempio l'età , il peso e le condizioni del paziente e lo scopo della somministrazione.
Tipicamente, il peptide à ̈ somministrato in una quantità compresa tra 10 e 1000 Î1⁄4g per dose, preferibilmente tra 50 e 500 Î1⁄4g per dose.
II peptide può essere formulato in una composizione farmaceutica. La composizione farmaceutica comprende anche un carrier farmaceuticamente accettabile ed un diluente.
In un'ulteriore forma di realizzazione, il peptide dell'invenzione può essere modificato mediante legame a sequenze necessarie per la sua internalizzazione ed il rilascio specifico nel compartimento cellulare. Tra queste vi sono, ad esempio, il dominio di internalizzazione di Antennapedia o il dominio basico della proteina Tat.
Tale modifica può essere effettuata mediante processi di sintesi noti che, perciò, non verranno qui descritti in ulteriori dettaglio.
PARTE SPERIMENTALE
Effetto del peptide sulla micrrazione di cellule endoteliali umane (HUVEC)
Sono stati allestiti saggi di chemiotassi in camere di Boyden, utilizzando come gradiente chemiotattico HGF, in presenza o assenza di concentrazioni micromolari del peptide .
Come si può osservare in Figura 1, il peptide si à ̈ dimostrato capace di ridurre la migrazione HGF-dipendente di cellule endoteliali umane.
Effetto del peptide sulla morfogenesi in vitro
Uno dei test per valutare la capacità tubulo-formativa delle cellule endoteliali su una matrice di Matrigel à ̈ la morfogenesi in vitro. E' stata quindi valutata la capacità del peptide di inibire la formazione di strutture simil-capillari.
In particolare à ̈ stata confrontata l'attività tubuloformativa promossa dal fattore pro-angiogenico HGF con quella prodotta da HGF addizionato al peptide in esame. La presenza del peptide riduce l'attività tubuloformativa in maniera significativamente evidente, come si può osservare in Figura 2.
Effetto antiangiogenico del peptide in vivo
L'effetto inibitorio del peptide sull'angiogenesi in vivo à ̈ stato valutato mediante l'utilizzo del Matrigel sponge Assay. In questo saggio 1'angiogenesi à ̈ indotta dall'inoculo sottocute nei fianchi di topi C57BL di un pellet di matrigel, arricchito con fattori proangiogenici (VEGF, TNF a). Nel nostro caso il peptide à ̈ stato aggiunto in concentrazioni micromolari al matrigel ed à ̈ stato valutato il suo effetto inibitorio sulla neovascolarizzazione indotta da 50 ng/pellet di HGF. Il risultato à ̈ espresso come contenuto totale di emoglobina ricavata dai singoli pellet.
In presenza del peptide si assiste ad una drammatica riduzione della neoangiogenesi HGF-indotta, come si può osservare nelle Figure 3, 4 e 5.
SEQUENCE LISTING
<110> Multimedica Holding S.p.A.
<120> Use of peptides for antiangiogenic therapy associated with tumoral pathologies
<13 0> 21 .M0348 .12 .IT.1
<16 0> 11
<17 0> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 4
<212 > PRT
<2 13> Artificial
<220>
<223 > synthesized artif icially
<22 0>
<22 1> VARIANT
<222> (1) ..(1)
<223 > phosphorylated or not phosphorylated
<220>
<22 1> VARIANT
<222 > (3) ..(3)
<223 > asparagine or histidine
<4 00> 1
Tyr Val Xaa Val
1
<210> 2
<211> 8
<212 > PRT
<213> Artificial
<220>
<223> synthesized artificially <22 0>
<22 1> MOD_RES
<222 > (1) ..(1)
<223 > PHOSPHORYLATION
<4 00> 2
Tyr Val His Val Asn Ala Thr Tyr 1 5
<210 > 3
<211> 12
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> synthesized artificially <220>
<221> MODJRES
<222 > (1).. (1)
<223 > PHOSPHORYLATION
<220>
<221> MOD_RES
<222 > (8).. (8)
<223> PHOSPHORYLATION
<4 00> 3
Tyr Val His Val Asn Ala Thr Tyr Val Asn Val Lys 1 5 10
<210> 4
<211> 8
<2 12> PRT
<213 > Artificial
<22 0>
<223 > synthesized artificially
<220>
<22 1> MOD_RES
<222 > (1) ..(1)
<223 > PHOSPHORYLATION
<40 0> 4
Tyr Val Asn Val Lys Cys Val Ala
1 5
<210 > 5
<211> 9
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223 > synthesized artificially
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5).. (5)
<223> PHOSPHORYLATION
<400> 5
Asp Asp Pro Ser Tyr Val Asn Val Gin
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<22 0>
<223 > synthesized artificially
<400> 6
Tyr Val His Val Asn Ala Thr Tyr
1 5
<210> 7
<211> 12
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223 > synthesized artificially
<400 > 7
Tyr Val His Val Asn Ala Thr Tyr Val Asn Val Lys 1 5 10
<210> 8
<211 > 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> synthesized artificially
<4 00> 8
Tyr Val Asn Val Lys Cys Val Ala
1 5
<210> 9
<2 11> 9
<2 12> PRT
<2 13> Artificial
<220>
<223 > synthesized artificially
<4 00> 9
Asp Asp Pro Ser Tyr Val Asn Val Gin 1 5
<210> 10
<211> 12
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220 >
<223> synthesized artificially <220>
<221> MOD_RES
<222> (1).. (1)
<223> PHOSPHORYLATION
<4 00> 10
Tyr Val His Val Asn Ala Thr Tyr Val Asn Val Lys 1 5 10
<210 > 11
<211> 12
<212 > PRT
<213 > Artificial
<22 0>
<223 > synthesized artificially
<22 0>
<22 1> M0D_RES
<222 > (8). .(8)
<223 > PHOSPHORYLATION
<400> 11
Tyr Val His Val Asn Ala Thr Tyr Val Asn Val Lys 1 5 10
Claims (9)
- RIVENDICAZIONI 1. Peptide, o un suo sale farmaceuticamente accettabile, avente da 1 a 20 amminoacidi, preferibilmente da 8 a 12 amminoacidi, di sequenza generale (I): XN-YVXV-XC (I) in cui YVXV Ã ̈ SEQ.ID.No.l; XNe Xcsono ciascuno sequenze da 0 a 16 amminoacidi; per l'uso nell'inibizione o riduzione della migrazione e morfogenesi HGF-dipendenti di cellule endoteliali umane implicate nella formazione di vasi sanguigni collegati allo sviluppo di patologie tumorali.
- 2. Peptide secondo la rivendicazione 1, per l'uso nell'inibizione o riduzione dell'angiogenesi collegata alla formazione, crescita e sostentamento di cellule tumorali.
- 3. Peptide secondo la rivendicazione 1 per l'uso nella terapia antiangiogenica relativa a patologie tumorali.
- 4. Peptide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 1 alla 3, essendo scelto nel gruppo costituito da: Tyr* -Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr (SEQ.ID.No.2); Tyr-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr (SEQ.ID.NO.6); Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-Cys-Val-Ala (SEQ.ID.No.4); Tyr-Val-Asn-Val-Lys-Cys-Val-Ala (SEQ.ID.No.8); Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys (SEQ.ID.No.3); Tyr-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr-Val-Asn-Val-Lys (SEQ.ID.No.7); Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr-Val Asn-Val-Lys (SEQ.ID.No.10); Tyr-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys (SEQ.ID.No.il); Asp-Asp-Pro-Ser-Tyr*-Val-Asn-Val-Gln (SEQ.ID.No.5); Asp-Asp-Pro-Ser-Tyr-Val-Asn-Val-Gln (SEQ.ID.No.9), in cui Tyr* rappresenta un residuo di tirosina fosforilato.
- 5. Peptide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 1 alla 4 avente una sequenza scelta nel gruppo costituito da Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr*-Val-Asn-Val-Lys (SEQ.ID.No.3); Tyr*-Val-Asn-Val-Lys-Cys-Vai-Ala (SEQ.ID.No.4); Asp-Asp-Pro-Ser-Tyr*-Val-Asn-Val-Gln (SEQ.ID.No.5); Tyr*-Val-His-Val-Asn-Ala-Thr-Tyr (SEQ.ID.No.2), in cui Tyr* rappresenta un resìduo di tirosina fosforilato.
- 6. Peptide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 1 alla 5 ulteriormente modificato mediante legame a sequenze necessarie per la sua internalizzazione ed il rilascio specifico nel compartimento cellulare.
- 7. Peptide secondo la rivendicazione 6, in cui dette sequenze di internalizzazione sono il dominio di Antennapedia o il dominio basico della proteina Tat.
- 8. Formulazione farmaceutica comprendente il peptide secondo una qualsiasi delle rivendicazioni dalla 1 alla 7 insieme ad eccipienti farmaceuticamente accettabili.
- 9. Formulazione secondo la rivendicazione 8 per l'uso nella somministrazione parenterale.
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2008
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