KR20120094867A - 미니-ＰＥＧ가 접합된 항-ｆｌｔ-1 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암, 류마티스 관절염과 같이 비정상적 또는 과도한 혈관신생 현상으로 인해 발생하는 질환을 효과적으로 치료할 수 있으면서도, 환자들의 치료 편의를 높일 수 있는 혈관신생 질환의 예방 또는 치료를 목적으로 8-아미노-3,6-디옥사옥타노익산(8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid; mini-PEG)가 접합된 항-flt-1 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 조성물, 특히 경구투여용 혈관신생 억제제에 관한 것이다. 본 발명에 따른 혈관내피세포 성장인자 수용체(VEGFR)-1(flt-1)을 타겟으로 하는 신규한 D형의 미니 PEG가 접합된 항-flt-1 펩타이드는 기존의 VEGF 또는 VEGFR을 타겟으로 하는 약제에 비해 효과적으로 혈관내피세포 성장인자와 그의 수용체간의 결합을 억제하며, 경구 투여시에도 비경구 투여시와 거의 동일한 항 혈관신생(angiogenesis) 효과를 나타냄으로서, 혈관신생으로 인해 유발되는 여러 질환의 경구 투여가 가능한 치료제로 사용할 수 있다.

Description

미니-ＰＥＧ가 접합된 항-ｆｌｔ-1 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 조성물{Composition for angiogenesis inhibiting comprising mini-PEGylated anti-flt-1 peptide}

본 발명은 암, 류마티스 관절염과 같이 비정상적 또는 과도한 혈관신생 현상으로 인해 발생하는 질환을 효과적으로 치료할 수 있으면서도, 환자들의 치료 편의를 높일 수 있는 혈관신생 질환의 예방 또는 치료를 목적으로 한 약학 조성물에 관한 것이다.

기존 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 과정인 혈관신생(angiogenesis) 현상은 고형 암의 성장과 전이, 류머티즘, 당뇨성 망막증, 다양한 염증질환의 발달 등과 같은 많은 질병을 가속화시킨 다고 알려져 있다(Kohn, E.C. et al.(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 1307; Folkman, J. et al.(1987) Science 235, 442; Risau, W.(1997) Nature 386, 671). 혈관신생은 혈액을 통한 원활한 영양분 공급을 가능하게 하고 전이암의 이동 통로를 제공하기 때문에, 특히 암의 성장과 전이에 필수적인 역할을 한다(Hanahan, D. et al. (1996) Cell 86, 353; Skobe, M.,et al. (1997) Nature Med. 3, 1222). 그러므로 혈관신생은 암의 성장뿐 아니라 악성종양의 한 지표가 되는 암의 전이에 꼭 필요한 단계가 된다.

혈관 내피세포 성장 호르몬(vascular endothelial cell growth factor, VEGF)은 혈관내피세포 표면에만 존재하는 두 가지 수용체(VEGFR1 및 VEGFR2)와의 결합을 통해 다양한 생물학적 활성을 보이는 가장 강력한 혈관신생 유도인자 중 하나이다. 혈관신생에 관여하는 다른 다양한 인자들과 비교해 볼 때, 혈관내피세포 성장호르몬은 진화상으로 고정된 당단백질의 하나로 혈관형성(vasculogenesis)와 혈관신생(angiogenesis) 과정 모두에서 중심적인 기능을 한다. 또한, 세포 내 칼슘 유입이나 단백질 분해효소의 활성화 촉진, 또는 혈관 투과성 증대와 같은 혈관신생에 필수적인 다양한 세포신호전달과 생리 반응을 유도한다(Thomas, K. A. (1996) J. Biol. Chem. 271, 603).

이에 VEGF를 타겟으로 하는 각종 약제가 이미 개발 혹은 개발 중에 있으며, 암 질환, 눈의 황반퇴화(macular degeneration)와 같은 인간에게서 발생하는 VEGF-의존적 질환에서 좋은 임상적 데이터를 내고 있다. 예를 들어, 인간에게 적합한 항-VEGF 항체인 베바시주맙(Bevacizumab)은 대사성 대장암의 치료를 위한 첫 번째 항-혈관형성적 약품으로 미국 FDA의 승인을 받았으며, 폐 및 신장 세포 암 치료에도 효과가 있다고 알려져 있다. 또한 항-VEGF RNA 앱타머(aptamer)인 페갑타닙(pegaptanib)은 노화와 관계된 황반퇴화(AMD) 질환에 걸린 환자들에게 투여했을 때 시력상실을 감소시키는 효과가 있는 것으로 드러났으며, VEGF 수용체(VEGFR)를 타겟으로 하는 제재인 키메라이즈드(chimerized) 항-KDR 항체와 같은 VEGF-트랩(Trap) 및 flt-1(VEGF receptor 1)의 합성 리보자임(ribozyme) 또한 고향 종양 및 암의 치료 효과에 대한 임상 1 또는 2기 단계를 거치고 있는 중이다.

따라서, 위와 같이 혈관내피세포 성장인자(VEGF)와 그의 수용체(VEGFR)간의 결합을 효과적으로 저해할 수 있는 물질은 각 수용체를 통한 신호전달 연구에 중요한 기능을 할 것인바, 특히 비정상적이거나 과도한 혈관형성 및 혈관신생으로 인해 발생하는 여러 가지 관련 질병을 치료제 개발을 위한 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있을 것이다.

이에 본 발명자들은 혈관내피세포 성장인자 수용체(VEGFR)-1(flt-1)을 타겟으로 하는 신규한 D형의 미니-PEG가 접합된 항-flt-1 펩타이드가 기존의 VEGF, PlGF 또는 VEGFR을 타겟으로 하는 약제에 비해 효과적으로 혈관내피세포 성장인자 또는 태반성장인자와 그의 수용체간의 결합을 억제하며, 경구 투여시에도 비경구 투여시와 거의 동일한 항 혈관신생(angiogenesis) 효과를 나타낸다는 사실을 최초로 규명함으로서, 본 발명에 따른 6개의 아미노산으로 구성된 항-flt-1 펩타이드(hexapeptide)가 혈관신생으로 인해 유발되는 질환의 치료제로 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 혈관신생으로 유도되는 여러 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있도록, 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 펩타이드와 미니-PEG(8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid; mini-PEG)의 결합체를 유효성분으로 함유하는 경구투여도 가능한 효과적인 혈관신생 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드(peptide)와 미니-PEG(8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid; mini-PEG)의 결합체를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 D형(form)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 혈관내피세포 성장인자(VEGF) 또는 태반성장인자(PlGF)와 혈관내피세포 성장인자 수용체(VEGFR)-1(flt-1)과의 결합을 억제 또는 방해할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 비정상적 또는 과도한 혈관신생으로 인한 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 질환은 암, 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 홍색증, 증식성 망막증, 건선, 혈우병성 관절, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 류마티스 관절염, 골관절염, 자가면역 질환, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 캣 스크래치 질환, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병, 염증 및 신경퇴행성 질환으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 경구용 제제 또는 주사제용 제제일 수 있다.

또한, 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 경구용 제제는 캡슐제, 정제, 환제, 현탁제, 시럽제 및 산제로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 미니-PEG(8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid; mini-PEG)가 접합된 항-flt-1 펩타이드는 기존의 항-flt-1 펩타이드 보다 효과적으로 혈관내피세포 성장인자나 태반성장인자와 혈관내피세포 성장인자 수용체간의 결합을 막을 수 있는 혈관신생 억제제의 유효성분으로서, 본 발명자들은 기존의 L형의 펩타이드를 D형으로 변환시키고, 변형된 D형에 미니-PEG를 접합시켜 실험실(in vitro) 환경에서는 물론 생체 내(in vivo) 조건에서도 기존의 L형 펩타이드보다 뛰어나게 혈관 신생을 억제한다는 사실을 확인하였다. 또한 관절염 동물 모델에서 본 발명에 따른 펩타이드를 경구 투여를 할 경우, 비경구 투여의 경우와 거의 동일한 항 혈관신생 효과를 나타내며, 관절염 증상의 악화를 저하시키는 작용을 통해, 뛰어난 혈관신생 질환의 치료효과를 보장하면서도 경구 투여가 가능하여 환자의 편이를 한층 상승시킬 수 있다는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 D형 항-flt-1 펩타이드의 안정성 여부를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 미니-PEG가 접합된 올(all) D형의 펩타이드의 혈관내피세포에서의 모세혈관 형성 억제 효과를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 미니-PEG가 접합된 올(all) D형의 펩타이드의 HEVEC의 상처 이동(wounding migration) 및 주화성(chemotaxis) 억제 효과를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 미니-PEG가 접합된 올(all) D형의 펩타이드의 생체 내(in vivo)에서의 VEGF165로 유도된 혈관신생 억제 효과를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 미니-PEG가 접합된 올(all) D형의 펩타이드를 경구투여할 경우 나타나는 CIA(collagen-induced arthritis) 동물모델에서의 관절염 치료 효과를 확인한 사진 및 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 미니-PEG가 접합된 올(all) D형의 펩타이드의 대장 종양세포의 성장 억제 효과를 나타낸 사진 및 그래프이다

본 발명은 GNQWFI(Gly-Asn-Gln-Trp-Phe-Ile, 서열번호 1)의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와 미니-PEG(8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid; mini-PEG)의 결합체가 혈관신생을 억제하는 효과가 있음을 최초로 규명하였는바, 서열번호 1에 기재된 펩타이드와 미니 PEG의 결합체를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

혈관신생(angiogenesis)이란 기존의 혈관으로부터 새로운 모세혈관이 만들어지는 것을 뜻한다. 정상적인 생리조건에서는 거의 일어나지 않는 엄격히 조절되는 현상이나 수정난 발생과정에서 배아가 발달될 때와 성인의 경우 상처가 치유될 때 그리고 여성의 생식주기에서 생식기계통의 변화 등에서 일어난다. 성인의 경우 모세혈관의 내피세포는 상대적으로 잘 분열하지 않으며 분열속도는 보통 수개월 내지 수년이다. 혈관신생은 여러 종류의 세포와 수용성 인자 및 세포외 기질(extracellular matrix) 성분과의 상호작용에 의한 복잡한 과정으로 일어나며 아직 그 작용기작은 완전히 규명되어 있지 않다.

지금까지 밝혀진 일반적인 혈관신생 과정을 살펴보면, 먼저 혈관신생은 암세포에서 분비되는 혈관신생 유도인자(angiogenic factor)에 의해 시작된다. 이 유도인자는 혈관내피세포의 수용체와 결합하여 내피세포를 자극하게 되고 자극된 내피세포는 성장(proliferation), 침투(invasion), 이동(migration)과 분화(differentiation) 그리고 모세혈관형성 등 다양하고 복잡한 일련의 과정을 시작한다. 내피세포의 침투, 이동에는 조직 분해효소의 활성화 등이 필요하며 이는 암세포의 침투과정과 매우 유사하다. 혈관형성과정을 조절하는 많은 촉진인자와 억제인자들이 보고되었는데, 그 중에서도 혈관내피세포 성장인자(VEGF)가 혈관형성 촉진인자로 가장 널리 알려져 있으며 안지오스타틴(angiostatin)과 엔도스타틴(endostatin)이 혈관형성 억제인자로 가장 많이 알려져 있다.

혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)는 거의 모든 세포에서 분비되며, 종양의 침투성과 깊은 관계가 있다(Takahashi Y, Kitadai Y, Bucana CD et al., Cancer Res. 1995, 55(18):3964-3968). 혈관내피세포 수용체(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)는 혈관 내피세포에 일반적으로 존재하지만 신경세포, Kaposi's sarcoma, 조혈모세포 등에서 발현되며, VEGFR-1(flt-1), VEGFR-2(Kdr/flk-1), VEGFR-3(flt-4) 등 3종류가 있다. VEGFR에 VEGF가 결합되면 수용체 티로신(tyrosine) 잔기의 인산화와 함께 수용체 이중화(dimerization)작용으로 신호가 전달된다. VEGFR-1은 내피세포의 이동, VEGFR-2는 내피세포의 성장과 혈액유출 효과에 관여한다. 직접적인 혈관형성인자 외에도 비특이적 인자들인 aFGF, bFGF,TGF, EGF, PDGF(platelet-derived endothelial cell growth factor), angiogenin,IL-8, MIP, PF4, GRO 등이 혈관 형성에 관여한다고 알려져 있다(Moore BB, Arenberg DA, Addison CL et al., J Lab Clin Med. 1998, 132(2):97-103).

이에, 최근에는 VEGF의 발현 및 작용기전에 대한 연구와 함께 이를 조절하는 상위의 신호전달 과정을 저해함으로써 신생혈관형성을 억제할 수 있는 물질에 대한 연구가 활발하다. VEGF 수용체와 결합할 수 있는 특정 단백질이나 항체, 수용체 인산화 억제제와 같은 물질은 혈관 형성촉진인자의 활성을 감소시키는 바, 과도한 혈관신생으로 유도되는 질환 치료제의 후보물질로 개발되고 있으며, 이외에도 혈관내피세포의 고사를 유도하는 기전, 혈관형성 촉진인자나 내피세포의 생존인자들을 조절하는 간접인자들의 작용 억제, 체내에 존재하는 신생혈관 억제제의 활성을 증가시키는 방법들에 대한 연구들도 활발히 진행되고 있다.

또한, 태반성장인자(Placenta growth factor) PlGF는 VEGF의 동족체로서, VEGF와 서로 협력하여 암 발달을 촉발하는 신생혈관형성에 기여한다고 알려져 있다. 다만 VEGF와는 다르게 정상의 혈관생성에는 영향을 주지 않고 질환 조직에서의 혈관생성 과정에만 관여하여, PlGF 저해제는 다른 항혈관생성 치료제에서 나타나는 부작용 없이 종양의 성장을 저해할 수 있다는 장점이 있다. 또한 PlGF는 류마티스 관절염을 일으키는 중요 물질임을 밝혀진 바 있어(Seung - Ah Yoo , Hyung - Ju Yoon , Hyun -Sook Kim et al ., Arthritis & Rheumatism, 2009, 60(2):345-354), 류마티스 관절염 치료제의 훌륭한 분자적 타겟으로 평가받고 있다. PlGF 저해제인 TB-403(ThromobiGenics)은 나이관련황반병성(AMD) 및 당뇨병성 망막병증, 조숙아 망막병증과 같이 조절되지 않은 혈관 증식을 차단하는데 효과적인 것으로도 알려져 있다.

이에 본 발명자들은 비정상적 또는 과도한 혈관신생으로 인해 유도되는 질환의 예방 또는 치료를 위한 새로운 치료제를 개발하기 위해, 합성 펩타이드 무작위서열 혼합물(positional scanning synthetic peptide libraries)의 스크리닝을 통해 GNQWFI(Gly-Asn-Gln-Trp-Phe-Ile)의 아미노산 서열을 가진 새로운 항-flt-1 헥사펩타이드를 발견하였고, 이는 VEGFR(vascular endothelial cell growth factor receptor)1(flt-1)에 선택적으로 결합하여, VEGF 또는 PlGF와 VEGF 수용체인 flt-1간의 상호작용을 효과적으로 억제하여 궁극적으로 혈관신생 작용을 일어나지 못하게 한다는 사실을 발견하였다.

따라서 본 발명은 혈관내피세포 성장인자 뿐만 아니라 태반성장인자가 혈관내피세포성장인자 수용체와 결합하여 혈관신생 현상을 억제하는 항-flt-1 펩타이드를 제공함으로서, 이를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제제는 과도한 또는 비정상적인 혈관신생으로 인해 발생하는 각종 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

한편, 일반적으로 펩타이드를 포함하는 단백질의약품의 경우 성분의 배합 및 제조에 있어 고유한 문제를 지니고 있다. 일례로 바이오의약품은 그 크기와 구조로 인해 환자에게 전달시 면역반응 자극이 일어나기가 쉬운 단점이 있다. 또한 생체이용률이 특히 낮아 경구제형으로 개발하는데 큰 어려움을 겪고 있다. 생체이용률(bioavailability)이란 전신순환에 도달하는 투여약물의 분획을 말하는 것으로 화학적으로 변화되지 않은 형태로 전신순환에 요구되는 투여약물의 분획을 나타내는 바, 결과적으로 일정량의 약물이 나타내는 생리적인 효과를 말한다.

펩타이드 제재의 경우, 경구 투여시 위에서 분비되는 위액으로 인해 펩티드 결합이 파괴되어 쉽게 분해되며, 소화될 수 있어 반감기가 극히 짧아 생체 내에서 충분한 효능을 나타낼 수 없게 된다. 대표적으로 당뇨병 치료제로 전세계적으로 널리 사용되고 있는 인슐린 단백질의 경우, 경구용 제재의 생체이용률이 극히 낮아 어쩔 수 없이 주사제로 제조되고 있다. 이와 같이 합성의약품과 달리 단백질 의약품 분야의 경우 경구제형의 개발이 의약 개발에 있어 가장 큰 난점으로 남아 있는 실정이며, 이러한 어려움을 극복하기 위해 제약사 및 연구자들은 단백질의약품 전달에 있어 흡수촉진제(absortion enhancer) 또는 그 외의 별도의 전달기술 등을 개발하고 있는 실정이다.

그리하려 본 발명자들은 기존의 VEGF와 그의 수용체간의 결합을 억제하여 혈관 신생작용을 막는 효과를 지녔던 항-flt-1 펩타이드의 문제점으로 지적되었던 경구 투여에 따른 혈관신생 억제 효과의 저해 현상 및 반감기 감소 문제를 해결하고자, 비경구 투여시에 나타냈던 항-flt-1 효과를 경구 투여시에도 변함없이 지속시켜, 과도한 혈관 신생으로 인한 질병으로 고통 받고 있는 환자들과 의료진의 치료 편의를 높일 수 있는, 경구 투여에 적합한 항 혈관신생 억제제 개발을 위해 노력하였다.

그 결과, 본 발명자들은 그 자체만으로도 항 혈관신생 효과를 지니는 GNQWFI(Gly-Asn-Gln-Trp-Phe-Ile, 서열번호 1)의 아미노산 서열을 가진 헥사펩타이드에 미니-PEG(8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid; mini-PEG)을 접합시킨 펩타이드 결합체를 개발함을 물론, 본 발명에 따른 헥사펩타이드를 구성하는 6개의 아미노산을 기본 L형에서 D형으로 전환시켰을 경우, 기존의 L형에 비해 경구 투여시 항 혈관신생 억제 효과가 월등히 우수함을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열(GNQWFI)을 포함하는 펩타이드와 미니-PEG(8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid; mini-PEG)의 결합체를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 조성물이 포함된 경구투여용 혈관신생 억제제를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용한 미니-PEG는 세포융합에 널리 쓰이는 시약으로, 본 발명자들은 서열번호 1의 펩타이드에 미니-PEG를 접합함으로서 경구투여에 적합한 혈관신생 억제제를 제조하고자 하였다. 단백질의 아미노그룹에 미니-PEG를 부착하는 PEGylation은 단백질의 활용 가능한 총 아미노그룹 양이 줄어들어 총 전하가 감소하게 한다. 이는 면역생성 물질이 면역생성력을 갖지 않게 하는데 효율적인 용이한 방법이라고 판단된다. 생체는 그러한 과도한 전하에 반응하지 않기 때문에 총 배합물의 면역생성력이 덜해질 수 있다.

또한, 미니-PEG의 친수성도 면역생성력을 감소시킬 수 있다. 일단 미니-PEG물질이 단백질이 결합하면 물 분자를 끌어들이게 되는데 이러한 수화는 신체 면역체계가 이 분자를 외부물질로 인식할 가능성을 떨어뜨린다. 아울러 이 방식은 단백질을 더 안정적으로 만들 수 있다. 일반적으로 전신순환을 통한 대사 분해 및 수용체 매개 흡수를 감소시킴으로써 혈장-제거율을 감소시키기 때문에 단백질에 미니-PEG를 결합시키면 단백질 집합이 낮아지고, 단백질 흡수가 감소하며, 항원 및 면역성 에피토프(epitopes)에 대한 보호력이 형성된다. 또한 미니-PEG를 접합함으로서 약물이 신체에 흡수되는 것을 막을 수 있으며, 분자크기가 증가하기 때문에 단백질 약물의 표적형 전달도 가능하다. 작용부위에 선택적으로 약물을 전달할 때 거대분자(macromolecular) 전달체계를 이용할 수 있을 것이기 때문이다.

한편, 생물의 단백질을 구성하는 생명물질이면서 정밀화학, 의약품 등의 핵심 기초소재이기도 한 아미노산은 광학활성에 따라 L형(left-handed, 좌선형)과 D형(right-handed, 우선형)으로 분류되는데, 천연 아미노산은 L형으로 존재하며, D형은 비천연 아미노산에 해당된다. 광학활성이란 편광을 쪼였을 때 편광이 일정한 각도로 회전하는 현상인데, L형과 D형은 회전하는 방향이 서로 반대이며, D형이 우선형(right-handed) 이라는 이름을 가지게 된 것은 광선을 통과시켰을 때 오른쪽 나사처럼 회전되기 때문이다. 아미노산들이 무생물체에서 발견되었을 때나, 실험실에서 합성되었을 때, 아미노산의 각 종류들은 화학적으로 동일한 2 개의 형태로 나타난다. 반은 우선형(D형)이고, 반은 좌선형(L형)이다. 그러나 식물, 동물, 박테리아, 균류, 심지어 바이러스에 이르기까지, 살아있는 생물체에서의 아미노산은 모두 다 L-형이다.

기존에 혈관신생 억제제로 제조된 펩타이드의 경우, 천연 아미노산인 L형 아미노산의 펩티드 결합을 통해 생성된 펩타이드가 대부분이었다. 그러나 기존에 특정 생리활성이 알려진 L형 아미노산이라 할지라도, D형으로 전환시켰을 때 기존의 생리활성이 그대로 유지될 것인지 혹은 그 생리활성이 사라질 것인지, 아니면 더 뛰어난 생리활성을 나타낼 것인지, 혹은 전혀 다른 성질의 생리활성을 보일 것인지는 바이오의약 분야의 당업자라고 해도 실제로 그 용도를 확인하기 전까지는 예측할 수 없는 성질의 것이다.

실제로 분자식과 분자량이 같은 아미노산도 L형은 치료제로, D형은 살충제로 사용되는 예가 있을 만큼, 두 이성질체의 성질은 완전히 다를 수 있다. 물론 모든 아미노산의 경우가 이러한 경우처럼 반드시 상이한 화학적 성질을 가지는 것은 아닐 것이나, 그만큼 L형과 D형에 따른 아미노산의 성질은 예측불가능한 것이며, 각 아미노산에 따라 구체적인 양상이 다른 것이다.

특히, 여러 아미노산의 결합으로 이루어진 펩타이드의 경우는, 구성 아미노산 각각의 이성질체의 종류에 따라 그 펩타이드가 가지는 화학적 성질은 충분히 변화될 수 있는 것이라고 할 수 있다.

이에, 본 발명자들은, 본 발명의 일실시예에 따르면, 그 자체로서 항 혈관신생 효과를 지닌 본 명세서의 서열번호 1에 기재된 펩타이드의 구성 아미노산 6개를 L형에서 D형으로 전환시켜 화학적으로 합성한 7개의 서로 다른 D형의 항-flt-1 펩타이드를 제조하였다; gNQWFI (1D), GnQWFI (2D), GNqWFI(3D), GNQwFI (4D), GNQWfI (5D), GNQWFi (6D), gnqwfi(모두(all) D형)(대문자는 L형, 소문자는 D형 아미노산을 나타냄). 그런 후 ELISA에 기초한 결합 어세이(ELISA-based binding assay)를 이용해 이들의 억제 효과를 테스트하였다. 그 결과 1D, 6D 및 올(all) D 펩타이드가 오리지널 L형 펩타이드와 비교하여, 용량 의존적으로 수용체 flt-1과의 결합을 블로킹함을 확인할 수 있었으며(실시예 1 참조), 그리하여 본 발명자들은 GNQWFI의 모든 아미노산의 L형 구조를 D형으로 전환한 헥사펩타이드의 항 혈관신생 억제효과를 확인하고, 이를 토대로 후속 실험을 진행하였다.

이에, 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명자들은 생체 내(in vivo)에서 본 발명에 따른 펩타이드의 혈관신생 억제 활성을 실험하였다. 마우스의 복부에 여러 샘플들을 피하 주사한 후, 맥관 구조의 형성을 수량화하기 위해 헤모글로빈의 양을 측정한 결과, 모든 아미노산이 D형인 본 발명의 아미노산 배열을 가진 펩타이드 및 미니-PEG가 접합된 펩타이드의 경우, 오리지널 L형의 펩타이드와 비교하여 더 낮은 헤모글로빈이 검출되었는 바, 보다 탁월한 혈관신생 억제 효과를 확인할 수 있었다. 더불어 미니-PEG가 접합된 본 발명에 따른 D형 펩타이드가 신혈관화 저해 뿐만 아니라 대식세포 침투 현상 또한 억제하는 활성이 있음을 발견하였다(실시예 2 참조).

또한, 본 발명자들은 본 발명에 따른 펩타이드가 혈관신생으로 유발되는 질병에 걸린 동물 모델에 경구 투여될 경우 치료 효과가 있을 것인지에 대한 실험을 진행하였다. 대상 질환으로는 류마티스 관절염을 선택하였고, 오리지널 L형과 본 발명에 따른 미니-PEG가 접합된 D형 펩타이드를 마우스에게 경구 투여한 결과, 오리지널 L형 펩타이드와 비교하여 뚜렷한 부작용도 없이 발톱 염증 등을 현저하게 억제하는 등 탁월한 미니-PEG-D형 펩타이드의 류마티스 관절염 치료 효과를 확인할 수 있었다(실시예 3 참조).

또 다른 본 발명의 일실시예에 따르면, 실험실 상에서(in vitro) 인간 내피세포인 HUVECs의 생존과 증식에 대한 본 발명에 따른 펩타이드의 활성을 실험한 결과, 모든 아미노산이 D형인 펩타이드, 미니-PEG를 결합한 모든 아미노산이 D형인 본 발명에 따른 펩타이드가 VEGF₁₆₅로 유도되는 관-유사 구조의 형성을 유의미하게 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, PlGF로 유도되는 관 형성도 모든 아미노산이 D형인 펩타이드, 미니-PEG를 결합한 모든 아미노산이 D형인 본 발명에 따른 아미노산 배열의 펩타이드가 효과적으로 그 생성을 억제함을 발견하였다. 더불어 PlGF와 VEGF로 유도되는 상처로 인한 HUVECs의 이동(wounding migration) 및 주화성(chemotaxis) 또한 탁월하게 억제됨을 확인하였다(실시예 4 참조).

또한, 본 발명에 따른 펩타이드들의 비정상적이며 과도한 혈관신생으로 인해 유발되는 대표적인 질병인 암 질환에 대한 활성 확인 실험을 실시한 결과, 대장 종양세포의 전이 및 성장 억제 효과를 확인할 수 있었다(실시예 5 참조).

그리하여, 본 발명자들은 상기의 실험 결과들을 토대로, 본 발명에 따른 D형 항-flt-1 펩타이드에 미니-PEG를 접합시킨, PEG화된 D형 항-flt-1 펩타이드를 마우스에 경구 투여하였을 때, 성공적으로 콜라겐으로 유도되는 관절염(CIA) 마우스의 증세 악화가 억제됨을 확인할 수 있었고, 암 세포 성장 억제 효과 또한 확인하였으며, 더불어 뛰어난 혈관신생 억제 효과를 확인할 수 있었는 바, 본 발명에 따른 펩타이드가 류마티스 관절염, 암 질환을 포함한 혈관형성-의존적 질환을 치료하는 데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 판단하였다.

그러므로, 본 발명은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 D형의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 조성물을 제공할 수 있으며, 특별히 경구투여가 가능한 혈관신생 억제용 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드와 미니-PEG가 접합된 결합체를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 펩타이드는 D형인 것을 특징으로 할 수 있다.

더불어 본 발명에 따른 상기 펩타이드들DL 태반성장인자(PlGF) 및 혈관내피세포 성장인자(VEGF)로 유도되는 혈관형성을 탁월하게 억제한다는 사실을 확인하였는바, Q본 발명은 태반성장인자(PlGF) 또는 혈관내피세포 성장인자(VEGF)와 혈관내피세포성장인자 수용체(VEGFR)간의 결합을 억제 또는 방해할 수 있다는 효과가 있다.

그리하여 본 발명의 혈관신생 억제용 조성물은 비정상적 또는 과도한 혈관신생으로 인한 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

상기 혈관신생으로 인한 질환으로는 이에 제한되지는 않으나, 암, 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 홍색증, 증식성 망막증, 건선, 혈우병성 관절, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 류마티스 관절염, 골관절염, 자가면역 질환, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 캣 스크래치 질환, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병, 염증 및 신경퇴행성 질환 등을 포함할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 펩타이드들은 생체내 안정성이 높고, 반감기가 24시간 이상 증가된 탁월한 혈관신생 억제제를 제공할 수 있으며, 이러한 혈관신생 억제제는 비정상적 또는 과도한 혈관신생으로 유도되는 다양한 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다.

상기 치료란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 치료란 용어는 치료하는이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 혈관신생 질환의 치료또는 치료요법은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 혈관신생 질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,

(2) 혈관신생 질환의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,

(3) 혈관신생 질환을 경감시킴.

(4) 혈관신생 질환의 재발을 예방함, 및

(5) 혈관신생 질환의 증상을 완화함(palliating)

또한, 본 발명에 따른 서열번호 1에 기재된 D형 펩타이드와 미니-PEG의 결합체는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.

[화학식 1]

또한, 본 발명에 따른 펩타이드는 조성물 총 부피에 대하여 1~500μM의 농도로 포함될 수 있으며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 조성물을 제공할 수 있고, 상기 조성물은 혈관신생 억제를 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 혈관신생 억제용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 본 발명에 따른 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.

상기에서 약학적으로 유효한 양이란 상기 생리활성성분이 동물 또는 사람에게 투여되어 목적하는 생리학적 또는 약리학적 활성을 나타내기에 충분한 양을 말한다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 투여 대상의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 약학적으로 허용되는이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 특히 본 발명에 따른 조성물은 경구용 제제 또는 주사제용 제제로 제형화될 수 있는데, 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다.

경구 투여를 위한 경구용 제제는 캡슐제, 정제(섭취형 정제 또는 협측 정제 등), 환제, 현탁제, 시럽제, 산제, 트로키, 엘릭시르, 서스펜션 및 웨이퍼 등으로 제형화 될 수 있으며, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신)와 활탁제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 포함할 수 있다. 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 포함할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제 및/또는 감미제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 방부제, 수화제, 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제와 같은 보조제와 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 제제화 될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 비경구 경로를 통해서도 투여될 수 있으나, 특히 경구 투여하였을 경우, 다른 혈관신생 억제제와 비교하여 혈관신생 억제효과가 뛰어나므로 환자 및 의료진의 편의를 위해 손쉽게 경구 투여가 가능하다. 활성 성분의 투여량은 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 목적하는 효과를 상승시킬 수 있는 공지의 화합물과도 병행하여 투여할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여경로는 경구적으로 또는 정맥 내, 피하, 비강 내 또는 복강 내 등과 같은 비경구적으로 사람과 동물에게 투여될 수 있다. 경구 투여는 설하 적용도 포함한다. 비경구적 투여는 피하주사, 근육 내 주사 및 정맥 주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함한다.

본 발명의 조성물에 있어서, 본 발명에 따른 아미노산을 포함하는 펩타이드의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 성인을 기준으로 1회 투여시 100㎍ 내지 3,000㎎의 유효용량으로 하루에 수차례 반복 투여될 수 있다. 그러나 상기 펩타이드의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐 만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정될 수 있다. 따라서 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 펩타이드의 혈관신생 억제제 또는 혈관신생 관련 질환의 치료 또는 예방제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있으며, 본 발명에 따른 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명은 혈관신생으로 인한 질환의 증상을 개선 또는 예방할 수 있는 식품용 조성물을 제공할 수 있으며, 본 발명에 따른 상기 식품용 조성물은 비정상적 또는 과도한 혈관신생으로 인한 질환 증상의 개선 또는 예방에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.

본원에서 상기 식품이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.

본원발명에 따른 상기 식품용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

또한, 상기 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

또한, 본원발명에서 상기 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 혈관신생 관련 질환 증상의 개선 또는 예방용 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

나아가 상기 기술한 것 이외에 본원발명의 혈관신생 관련 질환 증상의 개선 또는 예방을 위한 식품용 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본원발명의 식품용 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 90중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 40중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100ml를 기준으로 0.001g 내지 2g, 바람직하게는 0.01g 내지 0.1g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.

그러므로 본 발명은 상기 본 발명의 혈관신생 억제용 조성물을 유효성분으로 함유하는 혈관형성에 의해 유발되는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 혈관신생 억제용 약제를 제공할 수 있으며, 본 발명에 따른 펩타이드를 혈관신생 형성이 비정상적으로 지속되는 사람을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생 억제 방법을 제공할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 참고예 >

항- flt -1 헥사펩타이드(hexapeptide)와 이의 이소폼 ( isoform ) 합성

작은 크기로 고안된 오리지날 항-flt-1 헥사펩타이드(original anti-flt-1 hexapeptide), GNQWFI(L-form; Gly-Asn-Gln-Trp-Phe-Ile) 및 이의 이소폼(D-form)은 이전에 보고된 것과 같은 방법으로 합성하였으며(Bae DG 등, Clin Cancer Res 2005;11:2651-61, Yoo SA 등, Arthritis Rheum, 2009;60:345-54), 그 후에 GNQWFI의 이소폼(모든 D-form)은 그의 안정성을 증대시키기 위하여 미니-PEG, 즉 도 1d의 화학구조식으로 표시되는 8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid를 접합시켰다. 또한 이들 펩타이드들은 펩트론(Peptron)사에 의뢰하여 합성하였다(Peptron Inc., Daejon, Korea).

면역조직화합법( Immunohistochemistry )

본 발명에 따른 펩타이드의 인비보(in vivo)활성을 확인하기 위하여 사용한 동물모델인 관절염에 걸린 마우스의 발목 관절(ankle joints), 종양 조직(tumor tissue) 및 매트리겔(matrigel)의 면역조직화학적 염색은 토끼 항-vWF 항체(Abcam, Cambridge, MA) 및 레트 항-마우스 MOMA-2 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)를 이용하여 수행하였으며, 이를 통해 각 조직에서의 내피세포 및 대식세포의 양을 확인하였다.

통계학적 분석

데이터들은 평균±표준편차의 값으로 나타내었으며, 그룹간의 수치적 데이터(numerical data)의 비교는 만-휘트니(Mann-Whitney) 대응(paired) 또는 비대응(unpaired) U 테스트에 의해 수행되었다. 또한 P값이 0.05 보다 작은 경우, 통계학적으로 유의미하다고 평가하였다.

< 실시예 1>

본 발명에 따른 미니- PEG 가 접합된 D형 펩타이드의 안정성 분석

본 발명자들은 화학적으로 합성된 7개의 서로 다른 D형의 항-flt-1 펩타이드인, gNQWFI (1D), GnQWFI (2D), GNqWFI(3D), GNQwFI (4D), GNQWfI (5D), GNQWFi (6D), gnqwfi(올(all) D형)를 제조하고(소문자로 표기된 것이 D형 아미노산을 나타냄), ELISA에 기초한 결합 어세이(ELISA-based binding assay)를 이용해 이들의 억제 효과를 확인해보고자 하였다.

우선 동물모델(16주령 수컷 Sprague Dawley rats)의 혈액을 채취하여 멸균된 원심분리 튜브(centribugation tubes)에 넣고 4℃에서 엉기게 하였다(clotted). 그런 후 4℃, 1500xg에서 10분간, 20000xg에서 20분간 총 2번 원심분리 하였다. 상층액(serum)은 멸균된 필터(0.22㎛; Millipore, Billerica, MA)에서 필터링했으며, 사용하기 전까지 소량으로 분주(aliquot)한 후 -70℃에서 보관하였다.

혈청에서의 각 펩타이드의 안정성을 평가하기 위하여, 항-flt-1 헥사펩타이드 및 변형된 D형 펩타이드(50㎍ PBS에서 100㎍)들은 이전 문헌(Yoo SA 등, J Immunol, 2005;174:5846-55)에 명시된 시간동안 37℃에서 필터링된 레트 혈청 50㎕과 함께 배양하였다. 배양된 샘플은 아세토니트릴(0.1% trifluoroacetate in H2O for equilibration, 0.1% trifluoroacetate in acetonitrile for elution)의 선형 농도구배(linear gradients)에 따른 C18 역상(reverse phase) HPLC에 의해 분획화하였다. 펩타이드의 양은 배양된 혈청, 배양되지 않은 펩타이드, 펩타이드 없이 배양된 혈청에 대해 각각의 피크(peak) 높이(height)와 위치(area)를 통해 측정하였다(Yoo SA 등, J Immunol, 2005;174:5846-55).

C18 역상 HPLC 프로파일로부터 분리된 피크 확인을 위해 모든 피크(분획)들은 수집되었으며, 감압 동결건조 하였고(lyophilizes), 이전 문헌(Yoo SA 등, J Immunol, 2005;174:5846-55)에 개시된 방법과 같이 질량분석기(mass spectrometry)를 이용해 분석하였다. 오리지널 항-flt-1 헥사펩타이드(100pM) 및 그의 D형 유도체(100pM), 컬럼 피크로부터 감압하여 동결건조된 샘플들은 4700 프로테오믹스 분석기 MALDI-TOF/TOF(TOF/TOF; Applied Biosystems)를 통해 분석하였으며, 모든 질량분석 스펙트라는 양성 리플렉터 모드(positive reflector mode)에서 기록되었다.

그 결과, 도 1A에서와 같이, 본 발명자들은 2D, 3D, 4D, 5D 항-flt-1 펩타이드가 그들의 억제 능력을 상당히 잃어버리는 반면, 1D, 6D 및 올(all) D 펩타이드의 경우 원래의 L형 펩타이드와 비교하여, 용량 의존적으로 수용체 flt-1과의 결합을 억제하는 활성이 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명자들이 레트 혈청에서 안정성을 증가시키는 D형 펩타이드의 종류를 C18 역상 HPLC를 통해 확인한 결과 도 1B에서와 같이, 올(all) D 펩타이드의 반감기는 2일 이상임을 알 수 있었으며, 오리지널 항-flt-1 펩타이드 및 6D 펩타이드 모두 30분 이하를 나타내어, 항-flt-1 펩타이드의 혈청 안정도를 증가시키는 데 하나의 아미노산의 변형만으로는 불충분함을 알 수 있었다. 도 1C에서는 오리지널 올(all) D 펩타이드에서 피크 b의 분자량이 모두 동일한 것으로 나타났는데, 이는 HPLC에서 나타난 피크 b는 질량분석기에서 로드된 펩타이드(100pM)와 정확하게 동일한 분자량을 보여주기 때문이다.

따라서 본 발명자들이 합성한 변형된 펩타이드들의 안정성과 억제능을 모두 고려하여, 올(all) D 펩타이드가 활성의 큰 손실 없이 뛰어나게 증가된 안정성을 가지는 것을 확인함에 따라, 이를 인 비보(in vivo) 시스템에서도 적용할 수 있는 가장 적절한 치료제임을 알 수 있었다. 따라서 본 발명자들은 올(all) D 항-flt-1 헥사펩타이드만을 선택하여 이후의 실험들을 진행하였고, mini-PEG(mini-PEG-all D)를 부가적으로 접합시켜 생체 내(in vivo) 안정성을 추가적으로 강화시키는 후속 조치를 적용하였다. 또한, mini-PEG-올(all) D 펩타이드의 화학적 구조는 도 1D에 나타내었다.

< 실시예 2>

본 발명에 따른 D형 항- flt -1 펩타이드의 VEGF ₁₆₅ 로 유도되는 혈관형성 억제 효과 분석

본 발명자들은 미니-PEG-올(all) D 샘플들이 인 비보(in vivo) 조건에서 좀 더 효과적으로 혈관형성을 차단할 수 있는지 실험하였다.

우선 본 발명자들은 L형, 올(all) D, 미니-PEG-올(all) D 항-flt-1가 매트리겔 플러그(Matrigel plug)가 식립된 마우스에서 VEGF₁₆₅로 유도되는 신혈관생성(neovascularization)에 대한 영향력을 비교하였다. VEGF₁₆₅(500ng/ml) 및 헤파린(9units/ml)를 포함한 매트리겔(500㎕)에 항-flt-1 펩타이드 L형, 올(all) D, 미니-PEG-올(all) D형 및 역 펩타이드(reverse peptide)를 포함하거나 포함하지 않은 샘플들을 7주령 C57BL/6 마우스의 피하(subcutaneously)에 각각 주사하였다(Kong JS 등, Arthritis Rheum, 2010;62:179-90).

14일 후, 마우스의 피부는 뒤로 뒤집어 매트리겔 플러그에 노출시켰다. 양적 차이점(quantitative differences)을 사진찍고 메모한 후, 헤모글로빈 레벨을 드라브킨 리젠트 키트(Drabkin reagent kit) 525(Sigma)를 이용하여 드라브킨의 방법(Drabkin's method)에 따라 측정하였다. 헤모글로빈 농도는 알려진 헤모글로빈 양의 평형 어세이(parallel assay)로부터 계산되어졌으며, 매트리겔 플러그는 파라핀으로 포매되었으며 H&E으로 염색하였다. 이동된 세포들은 200X 확대능의 광학 현미경하에서 카운트 되었다.

인 비보(in vivo)상에서 형성된 새로운 혈관(vessels)들은 H&E 염색된 풍부한 본래의 적혈구로 채워져 있었는데, 이는 매트리겔을 통한 기능적 맥관구조(vasculature)의 형성을 의미하는 것이다. 이러한 샘플들에서 혈관형성을 수량화하기 위하여 본 발명자들은 매트리겔의 헤모글로빈 양(hemoglobin contents)을 측정하였다. 도 4A에서와 같이, 미니-PEG-올(all) D가 처리된 매트리겔(n=15)에서 평균 헤모글로빈 양은 올(all) D를 포함한 매트리겔(n=12), L형 펩타이드(n=9)를 포함한 매트리겔의 것보다 훨씬 낮았다. 게다가 염색된 섹션들은 도 4B에서와 같이, 올(all) D-PEG-처리된 매트리겔이 올(all) D 및 역(reverse) 펩타이드들을 포함한 매트리겔의 것보다 이동된 세포의 레벨이 유의적으로 낮음을 보여주었다.

더불어 본 발명자들은 모든 D-미니-PEG 펩타이드의 첨가로 인한 효과가 세포의 타입에 따라 달라질 것인지 확인하였다. 그 결과, 도 4C에서와 같이 내피 세포로 대표되는 항-vWF(+) 세포의 빈도는 역 펩타이드를 처리한 겔과 비교하여, 미니-PEG-올(all) D 펩타이드를 처리한 겔에서 현저하게 감소하였다. 항-MOMA 항체(대식세포를 검출하기 위한 특정 항체)에 대해 양성인 세포의 수는 도 4D에서와 같이 유사한 패턴을 보였으며, 이는 미니-PEG-올(all) D 펩타이드가 신혈관생성 뿐만 아니라 대식세포 침투(infiltration)를 억제한다는 사실을 증명해주는 것이다.

종합적으로, 상기 데이터들을 통해 본 발명자들은 생체 내(in vivo)에서 상기 세 개의 모든 항-flt-1이 혈관형성을 감소시키는 작용이 있다는 것을 알 수 있었고, 나아가 미니(mini)-PEG-모든 D 펩타이드가 다른 펩타이드에 비해 항-혈관형성(anti-angiogenic) 활성이 더 우수한 것을 알 수 있었다.

< 실시예 3>

본 발명에 따른 D형 항- flt -1 펩타이드의 경구 투여에 따른 관절염 치료 효과 분석

본 발명에 따른 D형 펩타이드의 관절염 유발 동물 모델에서의 치료효과 분석 실험은 이미 보고된 문헌(Yoo SA 등, J Immunol, 2005;174:5846-55., Yoo SA 등, Arthritis Rheum, 2009;60:345-54., Kong JS 등, Arthritis Rheum, 2010;62:179-90)의 프로토콜을 차용하여 그에 따라 수행되었다.

7~8주령의 수컷 DBA/1 마우스(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)는 보닌 타임 Ⅱ 콜라겐(bovine type II collagen, CII;Chondrex, Redmond, WA)으로 면역화(immunized) 되었으며, 최초 면역화(primary immunization) 이후 3주 후, 항-flt-1 펩타이드(100㎍)의 L형 또는 PEG-올(all) D형 펩타이드(100㎍)를 마우스에게 4주 동안 격일로 투여했으며, 대조군 마우스(control mice)에는 비클(vehicle)만을 투여했다. 관절염의 발병 및 중증도는 기존 문헌에서와 같이 외관검사(visual inspection)를 통해 확인하였다. 마우스는 조직학적 분석(histologis analysis)를 위해 49일째에 희생시켰고, 발(paws)과 발목(ankles)(면역작용 촉진제를 투여한 뒷발을 제외하고)을 수집하여, 염증, 관절에서의 활막 과다형성(synovial hyperplasia) 및 관절 파괴 정도를 표준 스코어링 프로토콜(0=없음, 1=매우 약함(week), 2=약함(mild), 3=보통(moderate), 4=심각함(severe)에 따라 평가하였다.

한편, 일반적으로 펩타이드를 구강 투여하였을 때, 그들의 부족한 내장 소화와 효소 분해에 대한 난점 때문에 생물학적 이용가능성(bioavailability)은 현저하게 줄어든다. 이러한 점을 고려하여 본 발명자들은 L형과 달리 D형이면서도 미니-PEG화 된(PEGylated) 본 발명에 따른 펩타이드를 경구 투여한 경우, 관절염 동물모델(in vivo)에서 생물학적 활성이 그대로 남아있는 것을 확인하고자 하였다.

그 결과, 도 5A에서와 같이, L형(100㎍)을 경구 투여한 경우 콜라겐-유도된 관절염의 악화를 유의미하게 억제하지 못하는 것으로 드러났다(최초 면역화 후 3주에서부터 4주간 격일로 투여한 경우). 그러나 미니-PEG-올(all) D 펩타이드(100㎍)를 격일로 경구 투여한 경우에는 마우스에서 관절염의 악화가 억제되는 것으로 나타났고, 이러한 결과는 피하 투여한 것과 비슷한 결과였다. 대조군의 관절은 H&E 염색을 통해 관절내 공간(articular space)이 염증 세포 및 스핀들-형태의 피브로블라스트-유사 활막세포(spindle-shaped fibroblast-like synoviocytes)로 채워져 있는 반면, 미니-PEG-올(all) D를 투여한 마우스의 관절은 이보다 적게 영향을 받았다(도 5B 참조).

표준 스코어링 프로토콜에 따라 조직학적 중증도를 평가하였을 때, 미니-PEG-올(all) D 펩타이드(100㎍)를 투여한 마우스의 발톱 및 발목은 염증 정도를 비롯하여 활막세포의 과형성, 뼈 파괴 정도가 비클(vehicle)만을 처리한 마우스의 것과 비교하여 미미한 것으로 알 수 있었다(도 5C 참조).

또한, vWF 및 MOMA 항원의 관절의 활막세포의 면역조직화학적 염색 결과, 비클을 처리한 마우스에서의 대식세포 침윤 및 신혈관화가 매우 심해진 것으로 드러난 반면(도 5D 참조), 미니-PEG-올(all) D 펩타이드를 투여한 마우스의 관절에서는 혈관형성 및 대식세포 침윤 현상이 오직 보통정도 임을 확인할 수 있었다.

이러한 실험 결과들을 통해 본 발명자들은, 도 1 내지 4에서 확인할 수 있듯이, 올(all) D-미니-PEG 펩타이드는 L형과 다르게 인 비보(in vivo) 상에서 관절염의 악화를 효과적으로 억제시키며, 경구 투여하였을 때에도 변함없이 혈관형성을 안정적으로 억제하는 탁월한 효과가 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 4>

인 비트로(in vitro)상에서의 본 발명에 따른 D형 항- flt -1 펩타이드의 혈관형성 억제 활성 분석

본 발명자들은 본 발명에 따른 항-flt-1 펩타이드 및 그의 변형된 D형 펩타이드들의 실험실상(In vitro)에서의 flt-1 리셉터(VEGFR1)에의 VEGF 결합 억제 활성을 평가하기 위하여 이전에 보고된 것과 같은 방식으로 ELISA를 이용하였다(Bae DG 등, Clin Cancer Res 2005;11:2651-61). 또한 본 실험에 사용될 내피세포(endothelial cells)로서 HUVECs(Human umbilical vein endothelial cells)를 선택하였다.

HUVECs은 이전에 보고된 문헌(Kong JS 등, Arthritis Rheum, 2010;62:179-90)에서의 같이 콜라게나아제 절단작용(collagenase digestion)을 통해 정상적 조건(normal-term)의 제대정맥(umbilical cord veins)에서 분리되었으며, 젤라틴이 코팅된 디쉬(gelatin-coated dishes)에서 20% FCS(fetal calf serum)를 포함한 M199 배지 하의 환경에서 성장하고 유지되었다.

본 발명에 따른 펩타이드들의 활성을 분석(HUVEC의 증식 및 생존율 분석, 모세관 형성 어세이 등)하기 위하여 이전에 보고된 문헌(Kong JS 등, Arthritis Rheum, 2010;62:179-90)에 나타난 방법을 활용하였다. 그리하여 HUVEC의 증식 및 생존은 [³H]-티미딘 검출 어세이(thymidine incorporation assay) 및 MTT 어세이를 통해 측정하였으며, 모세관 형성 어세이(capillary tube formation assay) 또한 실시하였으며, 내피세포의 주화성(chemotaxis) 및 상처 이동(wounding migration) 정도를 확인하였다.

HUVEC의 생존과 증식에 대한 미니-PEG-올(all) D 펩타이드의 효과를 확인한 결과, 도 2A에 나타난 바와 같이, L형, 올(all) D, 미니-PEG-올(all) D 펩타이드 100㎍을 HUVEC에 첨가한 후, 펩타이드들로 인한 비-특이적 세포독성의 가능성을 배제한 MTT 어세이를 통해 세포 생존력를 살펴보았을 때, 24시간 동안 아무런 영향이 발견되지 않았다. 또한, HUVEC으로의 VEGF₁₆₅으로 유도된 [3H]-티미딘 검출(thymidine incorporation)의 증가는 모든 세 개의 항-flt-1 펩타이드 유도체로 인하여 감소되지 않았다(도 2B 참조). 이는 HUVEC의 증식에 이러한 펩타이드들이 영향을 주지 못함을 의미하는 것이다.

한편, PlGF 또는 VEGF가 이의 수용체 flt-1에 접합하는 과정은 HUVEC의 관 형성(tube formation), 이동(migration) 및 주화성(chemotaxis)을 자극하는 중요 단계이다. 따라서 본 발명자들은 내피세포 관 형성, 이동 및 주화성을 미니-PEG-올(all) D 샘플들이 조절할 수 있는지 실험하였다. 그 결과 도 2C에서와 같이, VEGF₁₆₅로 유도되는 관-유사 구조(tube-like structures)들의 형성은 미니-PEG-올(all) D 펩타이드로 인해 현저하게 감소되었다. 또한 도 2D에서와 같이 PIGF로 유도되는 관 형성 또한 올(all) D 및 미니-PEG-올(all) D 항-flt-1 펩타이드 모두로 인해 완전히 차단되었다. 더불어, 도 3A에서와 같이 올(all) D 및 미니-PEG-올(all) D 펩타이드는 VEGF₁₆₅ 또는 PIGF로 유도되는 상처로 인한 HUVEC의 이동(migration in response to wounding)의 감소를 억제시켰으며, 도 3B에서와 같이 보이덴 챔버(Boyden chambers)에서의 VEGF₁₆₅ 또는 PIGF로 자극되어지는 HUVEC의 주화성은 미니-PEG-올(all) D 펩타이드로 인해 완벽하게 지연되었다.

종합적으로 상기 데이터들을 통해 본 발명자들은 실험실상에서(in vitro) 내피세포의 관 형성, 이동 및 주화성은 미니-PEG화된 올(all) D 항-flt-1 펩타이드를 통해 억제됨을 확인할 수 있었다.

< 실시예 5>

본 발명에 따른 미니- PEG -모든 D형 펩타이드의 대장암 치료효과 분석

본 발명에 따른 미니-PEG가 접합된 D형 펩타이드의 대장암에서의 치료 효과를 분석하기 위하여, 예전에 보고된 문헌(Bae DG 등, J Biol Chem, 2000;275:13588-96., Bae DG 등, Clin Cancer Res, 2005;11:2651-61)에서 기술된 바와 같이 CT-26 대장암 세포주를 피하에 주입하여 동물모델에서의 대장암을 유발하였으며, 그로부터 6주 후에 종양 질량을 측정하였으며 4% 파라포름알데하이드에서 고정하고, 파라핀으로 포매한 후, 종양 세포의 변화를 관찰하였다.

그 결과, 도 6A에서와 같이 미니-PEG-올(D) 펩타이드를 처리한 경우, 대조군를 투여한 마우스의 경우와 비교하여 유의미하게 종양의 크기가 줄어든 것을 발견할 수 있었으며, 도 6B에서와 같이 종양의 무게 또한 급격히 감소되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 도 6C에서와 같이, 항-vWF 항체(+) 및 항-MOMA 항체(+) 세포가 본 발명에 따른 펩타이드를 투여한 마우스의 암 세포에서는 거의 발견되지 않는다는 것을 알 수 있었다. 따라서, 상기의 결과들을 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 미니-PEG-올(D) 펩타이드가 종양세포의 성장을 비롯하여 전이를 늦추는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

< 실시예 6>

관절조직 내에서 미니- PEG -모든 D형 펩타이드의 위치 분석

관절조직 내에서 미니-PEG-올 D형 펩타이드의 분포 및 위치를 분석하기 위해, 콜라겐으로 관절염이 유도된 마우스에 Cy5로 표지된 미니-PEG-올 D형 펩타이드(500ug)을 피하 주사한 후, 상기 마우스로부터 펩타이드 주입후 0, 1, 4 및 24시간이 경과한 때에 혈액을 각각 채취하였다. 또한 혈액을 모두 채취한 마우스는 치사시킨 후, 관절조직, 간, 지라, 폐 및 신장을 분리하고 Maestro in vivo 형광 이미지 시스템(CRI Inc, Woburn, MA)을 이용하여 각 조직을 관찰하였다. 이때 대조군으로는 관절염을 유도하지 않은 정상 마우스를 사용하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, Cy5로 표지된 펩타이드를 주입 후 시간별로 수집한 혈액을 관찰한 결과, 혈청 내 Cy5의 신호는 1시간째가 가장 강한 신호를 보이는 것으로 나타났고 이후 4시간 까지 지속되는 것으로 나타났다(도 7a 참조). 또한, 마우스의 각 조직별 Cy5의 신호를 관찰한 결과 펩타이드 주입 후 24시간이 경과한 때에 신장, 지라, 간 및 폐에서 강한 신호가 관찰되었다(도 7b 참조). 아마도 이러한 결과를 주입된 펩아티드가 혈액을 통해 신체 각 조직으로 퍼져나간 것으로 생각된다.

또한, Cy5로 표지된 펩타이드가 관절염 마우스의 관절 조직에 축적되어 있는 것으로 나타났는데 이 결과는 관절염 증상 지수 분석과 잘 일치하는 것으로 나타났다. 즉, 관절염 증상이 심각한 곳에 본 발명의 펩타이드가 타겟팅하여 flt-1 수용체를 발현하는 염증세포와 축적된다는 것을 알 수 있었다(도 7c 참조).

< 실시예 7>

미니- PEG -모든 D형 펩타이드와 flt -1의 결합 분석

인시츄(in situ) 상에서 flt-1과 미니-PEG-올 D형 펩타이드의 결합을 측정하기 위해 QCM(quartz crystal microbalance; stanford research systems, Sunnyvale, CA)를 사용하였으며, 하기 수식(Sauerbrey equation)을 통해 결합정도를 분석하였다.

여기서, f_o 는 로드되지 않은 크리스탈의 진동주파수(5MHz)를 나타낸 것이고, A는 전극 사이의 활동 면적(1.267 cm²)을 나타낸 것이며, p_q는 진동자의 밀도(2.648g/cm3)을 나타낸 것이며, u_q 는 진동자의 비해 전단 계수(shear modulus)(2.947 x 10¹¹ g/cm/s²)인 것을 나타낸다.

금으로 코팅된 진동자 크리스탈은 20분 동안 UV 조사에 의해 일차적으로 세척하고 150ul의 유속 셀에 장치시켰고, 유속은 저압 액체 크로마토그래피 주입밸브 및 250ul의 주입 루프가 장착된 시린지 펌프(WPI, Sarasota, FL)를 사용하여 조절시켰다. 이후 각 샘플을 250ul의 주입 루프에 로딩하였고 10ul/min의 유속으로 흘려주었다. 로딩이 완료된 후 버퍼 용액으로 유속 셀을 세척시켰고, 10ug/ml의 티올-변형된 미니-PEG-올 D 항-flt-1 펩타이드를 진동자 크리스탈의 금 표면에 부착시켰고 0.1% BSA를 이용하여 블록킹시켰다. 이후 500ng/ml의 sflt-1을 상기 금 표면에 부착된 미니-PEG-올 D 항-flt-1 펩타이드 상에 흘려주어 반응시킴으로써 이들의 특이적 결합 정도를 분석하였다. 이때 대조군으로는 미니-PEG-올 D 펩타이드가 부착되지 않은 진동자 크리스탈 상에 0.1% BSA를 일차적으로 흡착시킨 후, sflt-1을 반응시킨 것을 사용하였다.

그 결과, 도 7d에 나타낸 바와 같이, 미니-PEG-올 D 펩타이드 상의 slft-1의 흡착은 -4.3Hz의 주파수변이를 유도하는 것으로 나타났고, 미니-PEG-올 D 펩타이드와 slft-1의 결합은 특이적 결합에 의한 것임을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University <120> Composition for angiogenesis inhibiting comprising PEGylated anti-flt-1 peptide <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-flt-1 peptide <400> 1 Gly Asn Gln Trp Phe Ile 1 5

Claims (7)

1. 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드(peptide)와 8-아미노-3,6-디옥사옥타노익산(8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid; mini-PEG)의 결합체를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 펩타이드는 D형(form)인 것을 특징으로 하는 혈관신생 억제용 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 펩타이드는 혈관내피세포성장인자(VEGR)와 혈관내피세포성장인자 수용체(VEGFR)와의 결합을 억제 또는 방해하는 것을 특징으로 하는 혈관신생 억제용 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 비정상적 또는 과도한 혈관신생으로 인한 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 특징으로 하는 혈관신생 억제용 조성물.
5. 제4항에 있어서,
   상기 질환은 암, 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 홍색증, 증식성 망막증, 건선, 혈우병성 관절, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 류마티스 관절염, 골관절염, 자가면역 질환, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 캣 스크래치 질환, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병, 염증 및 신경퇴행성 질환으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 혈관신생 억제용 조성물.
6. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 경구용 제제 또는 주사제용 제제인 것을 특징으로 하는 혈관신생 억제용 조성물.
7. 제6항에 있어서,
   상기 경구용 제제는 캡슐제, 정제, 환제, 현탁제, 시럽제 및 산제로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 혈관신생 억제용 조성물.

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