KR101646726B1

KR101646726B1 - 환형 폴리 ｆｔｐ 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101646726B1
Application number: KR1020130095552A
Authority: KR
Inventors: 이상경; 벨로 자가디쉬
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2013-08-12
Filing date: 2013-08-12
Publication date: 2016-08-09
Also published as: KR20150019119A

Abstract

본 발명은 모노머(monomeric) FTP가 고리화(cyclization)된 환형 폴리 FTP 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 환형 폴리 FTP는 모노머 FTP와 비교하여 Fas 또는 FasL에 대한 결합 친화도가 현저하게 우수하다. 또한, 본 발명의 환형 폴리 FTP는 지방세포 또는 지방 조직의 대식세포(adipose tissue macrophages, ATMs)에서 발생하는 Fas-유도된 아팝토시스(apoptosis)를 억제할 뿐 아니라, Fas-유도된 친-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 및 케모카인(chemokine)의 생산을 억제한다. 따라서, 본 발명의 환형 폴리 FTP를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물은 Fas-관여된 질환, 질병 또는 상태(예를 들어, 비만-유발 질환 또는 Fas-관여된 피부 또는 모발 질환)의 개선 또는 치료에 매우 효과적으로 적용될 수 있다.

Description

환형 폴리 ＦＴＰ 및 이의 용도{Cyclized poly Fas Targeting Peptides and Uses Thereof}

본 발명은 최소 3개 이상의 모노머(monomeric) FTP가 고리화(cyclization)된 환형 폴리 FTP 및 이의 용도에 관한 것이다.

비만 및 이와 관련된 병적 상태(Morbidities)

지난 몇 십년 동안, 인간 비만의 발생률은 개발 도상국 뿐 아니라 전 세계적으로 놀라운 속도로 퍼져 전염병 수준에 도달하였다(1, 2). WHO(World Health Organization)의 최근 보고들에 따르면, 수십억 명의 성인들이 과체중이고 3억 명이 비만이며, 개입하여 조절되지 않는다면 상기 숫자는 수년 내에 현저하게 증가할 것으로 예측되고 있다(3, 4).

비만은 에너지 소비량(expenditure)보다 증가된 에너지 소모(consumption)에 따라 증가된 체질량 지수(> 30 kg/m²)의 결과이다. 비만과 관련된 병적 상태는 제2형 당뇨병(type II diabetes, T2D), 지방간(hepatic steatosis), 이상지질혈증(dyslipidemia), 고혈압, 신경퇴행(neurodegeneration) 및 특정 타입의 암(5-8)을 포함하며, 수명 단축에 심대한 영향을 끼친다. 비만과 관련된 사망률 및 동반상병들(co-morbidities)은 저체중 집단과 관련된 사망률 및 동반상병들보다 더 높다(3). 제2형 당뇨병은 전 세계적인 사망원인 중 5번째로 높다(9). 약 75%의 비만 환자들이 지방간을 가지고 이들 중 20% 이상이 악화된 간 질환인 지방간염으로 고통받는 것으로 알려져 있다(10). 상술한 사실들은 약물 개발 과정에서 비만 합병증에 대한 중요성과 함께 비만 문제를 다루기 위한 의학 관리 및 관련 치료법의 필요성을 함축하고 있다.

비만 및 염증

비만은 천연 상태에서 과도한 영양 섭취(HFD, high fat diet)에 따른 대사 작용에 의해 유도되는 낮은 수준의 만성 염증과 연관되어 있다. 잉여 대사 시그널에 대한 반응 과정에서 지방세포 같은 대사성 세포들은 손상을 견딜 뿐 아니라 염증 프로그램을 작동시킨다. 이러한 시작과 함께, 시간이 지남에 따라 계속되는 경우 염증에 대한 완벽한 플랫폼이 설정되어 최종적으로 대사 항상성을 파괴한다(4, 11-12).

대사성 반응 기관인 지방 조직은 과도한 영양 섭취(High fat dieting)로 인한 증대된 대사 시그널에 따라 여러 가지 친-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 및 케모카인의 생산을 증가시켜 주요 염증의 시작점(origination)으로 전환된다. 원래, 지방조직은 IL-1β 및 TNF-α 같은 사이토카인들 및 CCL2(MCP-1), CCL3, CCL4, CCL5 및 CCL8 같은 케모카인들을 적절하게 낮은 레벨로 생산한다(13-16). 내피세포들은 부착 분자들의 증가된 발현 및 혈관 투과성의 증가에 따라 반응하여 사이토카인들을 방출하고 화학주성인자들(chemoattractants)은 면역세포들을 상기 지방 조직으로 유도한다(도 1; 15). T-세포, 비만세포(mast cells) 및 대식세포들 같은 침윤된 면역세포들은 낮은 수준의 적당한 염증 조건을 지속적인 만성 염증 상태로 조정한다. 염증 반응의 결과로서, 상기 지방 조직 내 상기 침윤된 대식세포들은 ATMs(adipose tissue macrophages)로 불리고 있다.

인간 및 설치류 모두에서, 지방 조직 내 ATMs는 비만의 심각성 및 체중을 증가시킨다. CCL2-CCR2 축(axis)은 염증이 유발된 지방 조직으로의 ATM 회귀(recruitment) 과정에 포함된 중추적인 화학주성 시그널로 간주되고 있지만, 최근 연구들은 이와는 다른 CCL3/CCL4/ CCL5/CCL8-CCR5 상호작용이 ATM 회귀에 기여한다는 사실을 보여준다(15, 16, 17). ATMs이 지방 조직으로 들어가면, 대부분이 활성화되어 친-염증성 사이토카인들을 생산한다. 천연에서 조직 대식세포들은 표현형적으로 이질성을 나타내기 때문에 "M1 또는 전통적으로 활성화된" 친-염증성 대식세포 또는 "M2 또는 선택적으로 활성화된" 비-염증성(non-inflammatory) 대식세포로 분류되고 있다. M1은 인터페론 감마(IFN-γ) 및 TNF-α에 의해 활성화되는 해로운 대식세포들로 인슐린 저항성과 연관된 친-염증성 사이토카인을 생산하고 주로 비만성 지방 조직과 관련되어 있다. 반면에, M2 대식세포는 IL-4, IL-10 및 IL-13에 의해 활성화되고 일반적으로 마른 지방 조직과 연관되어 있다. 전체적으로, M1 대식세포들은 만성 염증 및 조직 손상을 촉발하는 경향이 있는 반면에 M2 대식세포는 조직 염증을 해소하고 상처 치유를 증대시키는 경향이 있다(18-20). 또한, 지속적인 영양분 스트레스와 관련된 비만 인자는 M2의 M1 극성화(polarization)로의 쉬프트를 증가시킨다. 상기 극성화 쉬프트의 결과로서, 비만 조직에서 IL-10, 아르기나제(arginase)-1 및 Mgl2 같은 M2 인자들의 감소와 함께 TNF-α, IL-6, iNOS, MCP-1 및 IL-1β 같은 M1 ATM-연관된 친-염증성 분자들의 발현이 현저하게 증가한다. 상술한 M1 사이토카인들이 더 많은 면역 세포들을 지방 조직으로 이끌고 회귀시켜 끝나지 않는 해로운 사이클을 초래한다(도 1). 인간 및 설치류 모두에서, ATM 수는 체중에 비례하여 증가하고 배출된 염증성 사이토카인들도 인슐린 저항성에 양성으로 기여하기 위해 증가한다. 대식세포의 지방 조직으로의 회귀와 관련된 CCR2, CCL2 및 CCR5을 타겟팅하는 넉-아웃 연구들은 지방 조직으로의 침윤할 수 없는 대식세포의 손상이 인슐린 저항성 및 지방간을 완화시키는 것으로 보고하였다(15, 16, 17).

ATMs과 비교하여 지방세포에 의해 생산되는 사이토카인의 상대적인 양이 불분명할지라도, 지방세포도 TNF-α, IL-6, IL-8(KC; IL-8의 마우스 유사체), MCP-1 및 IL-1β 같은 염증성 사이토카인들을 생산한다(20). 지방세포와 ATMs 간의 크로스-톡(cross-talk)은 서로 상승작용을 통해 염증 환경을 증대시키고 오토크라인(autocrine)/파라크라인(paracrine) 시그널링을 통해 지방세포에서 인슐린 시그널링에 직접적으로 영향을 미치고 엔도크라인(endocrine) 시그널링을 통해 전신성(systemic) 인슐린 저항성을 야기함으로써 염증과 인슐린 저항성 간의 연결점을 제공한다(15-16).

비만-연관된 염증 및 인슐린 저항성의 기작

비만 지방 조직에서 염증은 NF-κB 및 JNK(c-Jun N-terminal kinase) 경로를 촉발시켜 인슐린 저항성을 유도한다. 상술한 경로들은 NF-κB를 활성화시킬 뿐 아니라 상기 활성화의 결과물인 TNF-α를 포함하는 친-염증성 자극들에 의해 활성화된다. 이와는 별도로, 상술한 2개의 경로들은 TLRs(toll-like receptors)에 의해서도 활성화될 뿐 아니라, 비만 조건에서 증대되는 프리 지방산(free fatty acids, FFAs)에 의해서 활성화된다(21, 22). 지방 조직으로부터 배출된 FFAs은 TNF-α에 의해 지방세포에서 유도되고 증가된 지방분해(lipolysis)로 인해 발생된다(23).

전체적으로, NF-κB의 비만-유도된 활성화 효과는 IL-6, IL-10, TNF-α, IL-1β, MCP-1, IL-8(KC; IL-8의 마우스 유사체), 레지스틴(resistin), PAI-1, 등과 같은 NF-κB 유전자 산물들의 합성을 통해 1차적으로 전사 레벨에서 기능하고 매개되는 데, 이는 인슐린 저항성을 초래하는 인슐린 수용체의 자가인산화(autophosphorylation) 및 다운스트림 시그널링의 직접적 또는 간접적 억제를 야기한다(11, 13, 20). 이와 대조적으로, JNK 활성화 효과는 특정 세린 잔기들에 대한 IRS(insulin receptor substrates)의 인산화를 초래하는 세린/트레오닌 키나제들을 통해 이루어진다. IRS의 특정 세린 잔기들에서의 인산화는 인슐린 수용체 키나제에 대한 친화성을 감소시킴으로써 IRS의 타이로신 인산화를 억제하여 인슐린 시그널의 전달을 감소시킨다(24, 25).

지방조직 염증과 간 인슐린 저항성/지방증(steatosis) 간의 연결

지방 조직은 체내 다른 조직 및 기관에 영향을 미칠 수 있는 다양한 인자들을 분비하는 거대한 엔도크라인 기관이다. 간 및 근육 같은 글루코오스 항상성 과정에 포함된 기관들은 항상 크로스-톡을 한다(9). 비만 지방 조직으로부터 염증성 사이토카인 및 FAAs의 과다-분비는 간 및 근육 대사 불균형의 주된 원인이다.

지방 조직 염증은 간 인슐린 저항성 및 지방간과 연관되어 있어 치료받지 않는 경우 종종 간염으로 알려진 보다 악화된 염증 상태로 진행된다(26, 27). 비만 지방 조직에서 ATMs의 회귀 증가는 여러 가지 친-염증성 사이토카인들의 생산을 초래한다. 이들 중, IL-6는 지방 조직 염증과 간 인슐린 저항성 및 간염 간의 연결점을 제공하는 가능한 후보로 여겨지고 있다. 이전에 보고된 인 비트로 연구들은 간세포에 IL-6의 처리가 인슐린 저항성을 유도한다는 것을 명확하게 보였다. 인 비보에서, IL-6는 C57BL/6J 마우스에서 IRS-1의 307번째 세린 잔기를 인산화시키고 음성 인슐린 시그널링 조절자인 SOCS-3를 활성화시킨다(28-32).

IL-6 시그널링 효과 외에도, 지방세포에서 인슐린 저항성의 결과로서 지방분해 속도가 증가하여 FAAs의 간으로의 증가된 운반을 초래하여 간 인슐린 저항성/지방증에 기여하는 간 트리글리세라이드 함량을 증가시킨다(26, 27).

비만-연관된 염증에서 Fas(CD95)의 역할

Fas(CD95)-매개된 아팝토시스 시그널링

세포사멸 수용체로 알려진 Fas(CD95)는 TNF(tumor necrosis factor) 수용체 수퍼패밀리의 한 멤버로 FasL(CD178)과 함께 활성화되어 여러 세포 타입에서 아팝토시스를 유도한다(33). Fas 활성화-매개된 PCD(programmed cell death)는 Fas-연관된 사멸 도메인을 가지는 단백질(FADD)로 불리우는 어댑터 분자에 의존적이다. 3합체화(trimerisation)을 통해 Fas 수용체는 FADD를 회귀시켜 카스파제(caspase)-8의 단백질 분해성 자가절단(FLICE)을 개시시키고 최종적으로 이펙터(effector) 카스파제인 카스파제-3의 활성화를 이끌어 아팝토시스를 초래한다(34). Fas-매개된 아팝토틱 시그널의 실행은 FADD에 대한 친화성을 가지는 FILCE 억제 단백질(FLIP)에 의해 억제될 수 있고, Fas는 FLICE와 FADD에 대한 결합 경쟁을 한다. 따라서, 아팝토시스의 최종 결과는 FLICE가 FADD와 상호작용하는 지 여부에 따라 결정된다(35).

Fas-매개된 비-아팝토틱 염증 시그널링

아팝토시스에서의 역할(기능)이 잘 정립되어 있는 TNF-α와는 다르게, TNF 수퍼패밀리의 한 멤버로서 Fas는 어떤 타입의 세포들에서 비-아팝토틱 시그널링을 유도하는 것으로 알려져 있다(도 2; 36, 37). Fas 활성화는 대식세포, 성숙한 지방세포, 평활근 세포 등과 같은 여러 다른 종류의 세포에서 IL-6, IL-8(KC), IL-1α, IL-1β, MCP-1 및 TNF-α 같은 여러 사이토카인들의 생산을 촉발하는 것으로 보여졌다(38-44). 아팝토시스를 유도하는 것과는 별도로, Fas 활성화는 케모카인 및 사이토카인 발현 및 호중구 회귀에도 포함되는 것으로 밝혀졌다.

Fas-매개된 비-아팝토틱 시그널링에 포함된 정확한 기작에 대해 거의 알려진 바가 없을 지라도, FLIP는 아팝토틱 시그널링과 비-아팝토틱 시그널링 간의 스위치로서 기능하는 것으로 보인다(45, 46). Fas 시그널의 강도에 따라, FLIP는 아팝토틱 시그널을 회피하여 비-아팝토틱 경로로 향한다. 보다 더 강한 Fas 시그널은 FLIP이 회피 경로로 지시하는 것을 막아 아팝토틱 경로가 활성화되어 아팝토시스를 초래한다(47).

Fas의 2가지 효과들을 구별할 수 있게 하는 다른 인자는 FasL과 함께 라이게이션(ligation)을 통해 Fas 수용체의 내재화(internalization)를 통하여 효과적인 다운스트림 시그널링을 초래한다. 아마도, 수용체-매개된 엔도사이토시스(endocytosis)는 아팝토시스를 초래하는 카스파제 케스케이드의 효과적인 활성화를 위해 필요할 것이다(비-아팝토틱 경로에는 필요하지 않음; 48).

지방세포에서 Fas 시그널링

Fas 수용체는 3T3-L1 지방전구세포(preadipocytes)에서 고발현되고 성숙하는 과정동안 감소한다. 하지만, 성숙 지방세포에서 여전히 의미있는 수준으로 발현된다(49).

재조합 막-결합된 FasL을 이용한 성숙한 지방세포에서의 Fas 활성화는 비-아팝토틱 시그널링을 유도한다. FasL의 처리에 의해 성숙한 지방세포는 IL-6, IL-8 및 MCP-1 같은 여러 가지 친-염증성 사이토카인들을 생산한다. Fas 활성화는 인슐린-자극된 글루코오스 섭취를 감소시켰는 데, 이는 Akt의 단백질 및 mRNA 발현 상의 감소와 연관되어 있었다. 총 Akt 및 인산화된 형태들 모두가 하향-조절되었는데, 이는 성숙한 지방세포에서 Fas 활성화가 세포의 Akt 양을 감소시킴으로써 인슐린 민감성(sensitivity)을 파괴시킨다는 것을 의미한다. 상술한 효과들 외에도, 지방세포에서 Fas-FasL 상호작용은 지방 분해도 유도하여 인 비보 조건에서 순환 시스템(circulatory system)으로 증가된 FFAs의 배출을 초래함으로써 총 체내 인슐린 저항성을 야기한다(49-51).

일반적으로, FasL에 의한 Fas 시그널링은 NF-κB, JNK 및 ERK 경로들을 활성화시킬 수 있다. 지방세포에서 Fas 시그널링을 촉발시키는 것은 NF-κB 또는 JNK 경로들을 활성화시키는 데 실패하였지만, ERK 경로를 활성화시키는 것으로 보여졌다. 성숙한 지방세포에서 Fas 라이게이션을 통해 배출된 사이토카인들에 대한 기작은 불분명하고 확립되어 가는 중이다. 비-아팝토틱 Fas 시그널링은 다른 세포 및 조직에서 인슐린 기능을 손상시키는 것으로 알려진 상술한 3가지 경로들을 활성화시킬 수 있다(52, 53).

흥미롭게도, 지방세포에서 Fas 활성화에 따른 인슐린 시그널링 손상과 연관된 Akt의 감소는 상술한 3가지 경로들(ERK, JNK 또는 NF-κB)의 활성화와 서로 독립적이었지만, PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma) 단백질 레벨의 하향-조절과 연관되어 있었다. 확실히, PPARγ 단백질은 Akt의 프로모터 부위에 결합하는 데, 이를 통해 세포의 Akt 함량 감소 및 이와 연관된 인슐린 시그널링의 손상을 간접적으로 설명할 수 있다(51). 그리고, 성숙한 지방세포에서의 Fas 라이게이션을 통한 지방 분해는 ERK 시그널링 경로의 활성화 결과로 밝혀졌다(49).

비만 지방 조직에서 Fas-FasL 시그널링

Fas 발현은 db/db 마우스, ob/ob 마우스 및 고지방-식이된 야생형 마우스의 페리고나달(perigonadal) 지방 패드(fat pads)에서 현저하게 증가하였다. 유사하게도, 상기 발현은 비만 환자들에서 더 높은 것으로 보여졌으며 제2형 당뇨병 환자들에서 더 증가되었다. 흥미롭게도, FasL 발현 레벨도 비만 마우스의 지방 조직에서 더 높았다(50).

성숙한 지방세포에서 Fas-FasL 상호작용은 친-염증성 사이토카인들을 발생시키고 인 비트로에서 세포 내 Akt 함량의 감소시켜 지방 분해를 유도하며 인슐린 시그널링을 손상시킨다. 비만 지방 조직에서 증가된 Fas 발현의 역할을 규명하기 위해, Wueest 등(50)은 지방세포-특이적 Fas 넉-아웃 마우스(AFasKO)를 이용하였다. 4주 동안 HFD-식이된 AFasKO 마우스에서, 비만-연관된 여러 가지 변수들(parameters)이 야생형 마우스와 비교하여 현저하게 감소되었다. 야생형 마우스와 AFasKO 마우스 간의 체중 증가는 장간막(mesenteric) 지방 패드의 무게에서 차이가 있었을 뿐, 다르지 않았다. 하지만, 단식 글루코오스 레벨 같은 대사 변수들이 감소하였지만, 인슐린 레벨, FFAs, 트리글리세라이드 및 글라이세롤 레벨은 양 그룹에서 유사하였다. AFasKO 마우스는 더 높은 글루코오스 섭취, 감소된 지방 분해, 더 나은 글루코오스 레벨 및 인 비트로 결과들로 확증하는 인슐린 내성 테스트를 나타냈는데, 이는 Fas 활성화가 인슐린 저항성에 포함되어 있다는 것을 의미한다.

나아가, HFD 하의 AFasKO 마우스의 염증성 프로파일이 야생형 마우스와 비교하여 더 낮았다. 지방 조직 내 IL-6, MCP-1, CD11b 및 레지스틴 mRNA 레벨이 감소한 반면에, 아르기나제-1 및 IL-10의 mRNA 레벨은 증가되었다. 또한, 전신성IL-6 레벨은 야생형 마우스와 비교하여 AFasKO 마우스에서 감소하였다. IL-6는 FFAs 방출과 함께 간 인슐린 저항성 및 지방 분해와 연관되어 있기 때문에, AFasKO 마우스에서 IL-6의 감소는 지방간에 대한 보호와 함께 개선된 간 인슐린 민감성을 초래하였다. 상술한 결과들은 Fas-FasL 시스템은 비만-유도된 염증, 지방 및 간 인슐린 저항성, 전신성 인슐린 저항성 및 지방간의 드라이버라는 것을 강하게 제시한다.

비만 과정 동안 ATMs과 지방세포 간의 크로스-톡

Fas-FasL 시스템이 비만-연관된 합병증을 유발하는 데 관여한다는 사실을 정립한 후, 상기 시스템에 기여하는 플레이어들을 명확하게 하는 것이 매우 중요하다. 침윤된 ATMs 뿐 아니라 지방세포들은 표면 상에 Fas 및 FasL 모두를 발현한다. 따라서, Fas 및 FasL 모두가 염증 수용체의 풀(pool)에 기여하고 비만 지방 조직에서 관찰된 Fas 및 FasL 발현 증가를 담당한다(54). 국부적 인슐린 저항성 뿐 아니라 전신성 인슐린 저항성, 간 인슐린 저항성 및 지방간을 초래하는 지방 조직 염증과 연관된 여러 가지 사이토카인들은 지방세포 상의 Fas 활성화로 인해 발현 또는 생성되는 것으로 보여진다(도 3). 또한, Fas 수용체를 발현하는 침윤된 ATMs은 활성화에 따라 증가된 양의 TNF-α, IL-1β 및 KC(IL-8)를 생산하는 데, 이들은 상승적으로 지방 조직 염증에 기여한다. ATMs 상에 발현된 FasL도 지방세포를 자극하여 친-염증성 사이토카인을 발현하도록 하고 그 반대의 경우도 가능하다. 문제를(염증을) 더 악화시키기 위해, TNF-α 및 IL-1β 같은 분비된 산물들은 지방세포 상의 Fas의 발현을 상향-조절하여 Fas-FasL 시스템의 피드포워드 루프(feed forward loop)를 활성화시켜 상기 위치로 더 많은 ATMs을 회귀시킴으로써 최종적으로 낮은 수준의 가벼운 염증 위치를 만성 염증 위치로 변환시킨다. TNF-α는 지방세포에서 지방 분해를 증가시키는 것으로 알려져 있고, 이와 연관된 문제들을 야기하는 순환 시스템 및 간으로 과도한 FFAs의 배출을 초래한다(50).

항-염증 인자로서 PPARγ

PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma)는 지방세포 분화 및 성숙한 지방세포의 유지 모두에 중요한 핵 수용체이다(55-57). 지방 조직에서 우선적으로 발현되지만, 간 및 근육 같은 다른 글루코오스 항상성 유지 기관들도 PPARγ를 발현한다(56, 58). 지방세포에서의 PPARγ 활성화는 몸 전체의 인슐린 민감화(sensitization)를 유도하고 PPARγ의 대식세포-특이적 손실은 몸 전체의 인슐린 저항성 및 글루코오스 과민성(intolerance)을 유도한다(58-60). PPARγ의 지방 조직-특이적 마우스 넉-아웃은 HFD 식이에 따라 전신성 인슐린 저항성을 유발한다(61, 62). 지방 조직에서, 지방세포와 대식세포의 공동-존재(co-existence), 그리고 이들 간의 크로스-톡은 인슐린 저항성과 인슐린 민감성 상태 간에 존재하는 밸런스 유지에 핵심적이다. 공동-배양 실험들에서, 배양된 성숙 지방세포에서 PPARγ의 과다발현은 LPS-처리된 Raw264.7 세포에서 MCP-1, IL-6 및 TNF-α 같은 친-염증성 사이토카인들의 발현을 하향-조절하였는데, 이는 PPARγ의 항-염증 기능을 의미한다(58). 인 비트로 조건의 지방세포에서 Fas 활성화는 PPARγ의 발현을 하향-조절시키고, 상술한 결과들을 확증하는 결과로, HFD 식이 조건에서 PPARγ 발현이 비만 마우스에서 감소된다고 보고되었다(50). 지방 조직에서 상기 PPARγ 레벨의 활성화 또는 회복(restoration)이 염증의 회복 및 인슐린 민감성의 개선에 양성적으로 기여한다.

티아졸리딘디온(Thiazolidinediones, TZDs) 같은 PPARγ 활성인자들은 제2형 당뇨병에서 항-염증 약물로서 이용되고 있다(63-66). 상술한 TZDs이 어떻게 항-염증 효과들을 유도하는 지 정확하게 규명되어 있지 않을 지라도, 가장 그럴듯한 설명은 TZD-결합 PPARγ에 의한 일련의 NF-κB 및 JNK/활성화 단백질-1의 트랜스-억제(repression)를 통해 이루어진다는 것이다. 또한, 동일한 기작이 인 비보에서 일어나는 지 여부가 알려져 있지 않을 지라도(65, 67), TZD-결합 PPARγ가 유익한 효과를 나타내는 타겟 기관이 정확한 위치가 어디인지가 아직까지 이해되고 있는 추론이다. 따라서, 항-염증 특성들은 활성 1차 기작에 대해 오프-타겟(off-target)이고 특이적인 것처럼 보이는 데, 이는 염증을 방해하는 보다 직접적인 접근방법이 바람직할 것이라는 것을 의미한다(13).

FasL-매개된 호중구 회귀

Fas-FasL 시스템의 포함 외에도, FasL도 호중구 유인인자(attractant)로 기능하는 것으로 알려져 있다. 논란의 여지가 있을 지라도, 여러 연구들은 sFasL가 그 자체로 화학유인인자로서 기능할 수 있고 염증 위치로 호중구의 침윤을 이끈다는 것을 보여주었다(41, 68). 아직까지 완벽하게 이해되고 있지 않지만, 몇몇 연구들은 FasL이 IL-1β의 생산을 간접적으로 유도하여 호중구 유인인자로서 기능한다는 것을 제시하고 있다(41). 포괄적으로, 호중구를 끌어들이는 개별 요인으로서 FasL의 효과는 명확하지 않지만, Fas와 함께 FasL의 기능을 차단하는 것은 염증성 사이토카인을 생산하거나 또는 타겟 위치로 염증성 세포들을 회귀시키는 데 포함된 세포들 간의 크로스-톡을 어느 정도 억제한다.

비만-관련된 동반상병에서 지방세포 아팝토시스의 역할

지방 조직은 HFD 식이된 경우 지속적으로 리모델링을 거친다. 지방 조직 베드(fat tissue bed)의 증가와 함께, 연관된 지방세포 변형(특히, 아팝토시스 백분율)이 증가한다. 지방세포 사멸의 빈도는 C57Bl/6 마우스에서 < 0.1%의 베이스라인(0 weeks of 0주 HFD)으로부터 12주의 고지방 식이 후 16%까지 증가한다. 상기 증가율은 16주 동안의 고지방 식이 후 약 80%까지 현저하게 증가한다(69). 유사하게도, 비만 지방 조직에서 지방세포 사멸은 인간 환자에게서도 보고되었다(70). 흥미롭게도, 지방세포 사멸의 증가는 체중, 염증, 침윤된 ATMs 및 인슐린 저항성의 증가와 동시에 일어난다. 그리고, 지방세포 사멸은 죽은 지방세포 근처의 여러 ATMs의 주위에 형성되는 CLS(crown like structures)의 형성과 연관되어 있으며, 상기 CLS는 비만의 심각성에 따라 증가된다. 이러한 현상은 인간 및 설치류 모두에서 보고되어 있다(69, 70).

이전 연구에서, 지방세포 사멸이 ATMs의 회귀를 개시하는 것인지 또는 그 자체가 ATM 침윤의 결과인 지는 불분명한 상태였다. t-Bid(내인성 아팝토틱 경로와 외인성 아팝토틱 경로들 간의 친-아팝토틱(pro-apoptotic) 연결의 핵심 인자) 넉-아웃 마우스를 이용한 최근 연구들은 지방세포 사멸이 설치류 및 인간 모두에서 지방 조직으로 대식세포 침윤을 유도하는 주요 이벤트라는 것을 제안하였다. 동일한 그룹의 연구자들이 ATM 침윤의 억제와 함께 t-Bid의 유전적 비활성화에 의한 지방세포에서의 아팝토시스 억제도 염증을 억제하고 인슐린 민감성을 개선할 뿐 아니라 간 지방증으로부터 마우스를 보호한다는 것을 발견하였다(70).

염증 조건이 지방세포를 Fas-매개된 아팝토시스에 대해 민감화시킨다

성숙한 지방세포들은 Fas 활성화를 통해 비-아팝토틱 시그널링을 거치고 친-염증성 사이토카인들을 생산하는 대신에, Fas-매개된 아팝토시스에 대해 매우 높은 저항성을 가진다(50). 상기 과정의 이유들 중 하나는 지방전구세포로부터 지방세포로의 분화 과정에서 Fas의 발현이 더 낮아진다는 것이다(71). 하지만, 상기 시나리오는 염증 조건에 따라 변화한다. Fischer-Posovszky 등(71)은 성숙 지방세포에 TNF-α 및 IFN-γ 같은 염증성 사이토카인의 처리가 인 비트로에서 인간 지방세포 내 Fas 발현을 4배 정도 상향-조절한다는 것을 보고하였다. 더욱이, TNF-α 및 IFN-γ는 카스파제의 상향-조절을 통해 세포내 여러 포인트들에서 아팝토시스에 민감화를 유도한다. 또한, 상술한 염증성 사이토카인과 함께 APO-1 항체(FasL과 유사한 기능을 가짐)를 지방세포들에 처리하면 강력한 아팝토시스가 유도되었다. APO-1과 함께 상술한 사이토카인들의 개별 처리가 아팝토시스를 유도하기에 충분할 지라도, 상술한 사이토카인들이 APO-1과 조합하여 처리되는 경우 증대된 아팝토시스 효과를 야기하였다.

상술한 바와 같이, 비만 지방 조직의 아팝토틱 지수(apoptotic index, AI)가 매우 높고 비만-관련된 동반상병들의 병인학적 원인과 연관되어 있다. 또한, 높은 양의 TNF-α을 발현하는 염증-유발된 비만 지방 조직에서 Fas 활성화를 차단하는 것이 아팝토시스 속도를 조절할 수 있는 지 여부가 불명확하고 아팝토시스의 억제 하에서 Fas 활성화의 차단이 ATM 침윤 및 인슐린 저항성(지방 조직, 간 조직 및 전신성)을 감소시키고 간 지방증을 억제하는 지 여부도 불분명하다. 따라서, 이용가능한 정보를 토대로 연구자는 Fas가 지방 조직에서 염증 경로를 우선적으로 유도할 지라도 염증-민감화된 지방세포의 아팝토시스에 포함될 것이라는 가설을 세울 수 있다.

Fas 활성화를 차단하는 것이 비만-관련된 합병증들을 역전시킬 수 있는가?

이전에 공개된 결과들을 고려해볼 때, Fas가 지방세포 및 ATMs 모두를 통해 염증 분자들의 생산에 기여하는 중추적인 분자라는 것이 명확하다. 따라서, 유발된 염증이 지방세포를 민감화시켜 Fas-매개된 아팝토시스를 유도할 지라도, 이에 대한 증거 또는 명확한 인 비보 정보가 아직까지 유용하지 않다. 피드포워드 루프를 자극하고 격려하는 지방세포 염증 및 아팝토시스가 전체적으로 비만-연관된 동반상병들에 상승 작용적으로(synergistically) 기여한다. 공통적인 유발 인자(causative agent)인 Fas에 있어서, Fas 활성화를 차단하는 것이 비만 마우스에서 염증, 인슐린 저항성(T2D) 및 지방간을 역전시킴으로써 치료학적 효과를 나타내는 지 여부를 조사하는 것이 흥미로운 주제일 것이다.

Fas 활성을 차단하기 위한 펩타이드 모방체(peptidomimetics)

비만 조건 하의 지방 조직에서 Fas 활성을 차단하는 것은 비만-연관된 합병증들을 해결하는 데 이로운 것처럼 보인다. 효과적으로 Fas 활성을 억제하기 위해, 강력한 억제제들을 개발하는 것이 중요하다. 항-Fas 항체, 용해성 FasL, 면역글로블린의 Fc 부위와 융합된 Fas 수용체들 등과 같은 거대분자들이 있지만, 여러 가지 한계점들(limitations)을 가진다(72, 73): (a) 크기가 크다; (b) 마우스에 주입되는 경우 항상 면역 반응을 유발; (c) 낮은 생체이용률(bioavailability); (d) 낮은 안정성; (e) 고비용; (f) 부작용을 포함하는 심각한 위험도(때때로, 생명과의 연관성). 한편, 모 Fas-FasL 단백질의 2차 구조로부터 개발된 작은 펩타이드들은 상기 단백질의 기능을 모방하여 Fas 시그널링을 억제할 수 있다. 더욱이, 상기 펩타이드들은 필요에 따라 핸들링, 변형 및 설계하기가 용이하다. Fas-FasL 시그널을 차단할 수 있는 펩타이드 모방체는 Hasegawa 등(74)에 의해 개발되었고, 이는 Fas 수용체와 상호작용하는 FasL의 KP7 루프로부터 유래되었다. KP7 루프로부터 유래된 여러 가지 펩타이드들 중에서, 6번째 펩타이드 서열이 가장 우수한 억제제로 확인되어 KP7-6 펩타이드로 명명되었다. KP7-6 펩타이드는 FasL 뿐 아니라 Fas에도 친화도를 가지고 무엇보다 중요하게도 Fas-FasL 활성 억제에 특이적일 뿐 아니라 TNF 수용체 수퍼패밀리의 가장 밀접한 다른 멤버들에게 조차도 영향을 미치지 않는다. 따라서, 본 발명자들은 상기 펩타이드를 선택하여 비만-관련된 합병증들을 치료하기 위한 치료 펩타이드라는 것을 증명하기 위해 지방세포에서 Fas-FasL-매개된 염증 경로를 억제하고 비만 마우스에서 염증 조건을 개선할 수 있는 지 여부를 테스트하였다.

FTP(KP7-6 펩타이드)의 특징들

FasL 뿐 아니라 Fas에 결합하는 중요한 특징 외에도, FTP(Fas targeting peptide)는 선택적인 억제제로서 Fas-FasL 시그널을 선택적으로 억제하는 매우 독특한 펩타이드이다. FTP는 ERK 시그널링 경로를 억제하는 반면에 NF-κB 경로를 선택적으로 촉발할 뿐 아니라 JNK 경로에는 전혀 영향을 미치지 않는다는 점에서 FTP는 선택적인 차단제이고 완벽한 Fas 억제제는 아니다(도 4). FTP는 "YCDEHFCY"의 펩타이드 서열을 가진 약 1 kDa의 펩타이드로, 내부 시스테인 잔기는 이황화 결합을 통해 상기 펩타이드의 고리화를 가능하게 한다(74).

펩타이드의 중합반응(polymerization)

펩타이드 모방체의 가장 중요한 특징들 중 하나는 실험 내용에 따라 변형하고 설계하기 용이하다는 것이다. 펩타이드의 중합반응은 결합 친화도를 증가시켜 기능적 최종 활성을 증대시키는 다가성 효과(multivalency; 다중 수용체-상호작용 에피토프)를 가지도록 허용하기 때문에, 면역글로블린의 Fc 단편과의 융합된 수용체를 얻기 전에 다가성을 가지도록 시도되었다(75-77). 거대분자들이 다양한 단점들을 가질 지라도, 작은 펩타이드들도 체외로 쉽게 배출되고 짧은 반감기를 가진다는 점에서 여러 가지 단점들을 가진다. 따라서, 최적 크기의 펩타이드의 조절된 중합이 유익할 것이다.

이전 연구에 따르면, 연구자들은 촉매제(catalyzing agent)로서 DMSO(dimethyl sulfide)를 이용하여 시스테인을 가지는 펩타이드들을 중합시켰다(78-80). DMSO는 자유 -SH 그룹의 산화를 도와 이황화 결합을 발생시킴으로써 폴리머를 생산한다. 폴리(TAT) 및 폴리(올리고-아르기닌) 폴리머들은 각각 20-30% DMSO를 이용한 반응을 통해 각각 C-TAT-C 및 C-9R-C 모노머들부터 제조되었다(78, 79). 형성된 폴리머의 크기는 펩타이드의 용해도(solubility)에 의존적이긴 하지만, 중합 반응에 이용된 시스테인의 위치 및 모노머의 개시 농도에도 의존적이다. 지방세포에서 효율을 증가시키고 알려지지 않은 Fas-FasL-유도된 염증 경로들을 억제하는 효과를 분석하기 위해 FTP에 DMSO-기반된 중합 반응 방법을 적용하여 폴리(FTP)를 제조하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 종래의 FTP(Fas targeting peptide)와 동일한 기능을 가지거나 또는 더욱 우수한 기능을 가지는 물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 최소 3개 이상의 모노머(monomeric) FTP가 고리화(cyclization)된 폴리 FTP(구체적으로는, 펜타머 FTP)가 모노머 FTP와 비교하여 Fas 또는 FasL에 대한 결합 친화도가 현저하게 우수하여 Fas-관여된 질환, 질병 또는 상태(예를 들어, 비만-유발 질환 또는 Fas-관여된 피부 또는 모발 질환)의 개선 또는 치료에 적용될 수 있다는 것을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 환형 폴리 FTP(cyclized poly Fas targeting peptide)를 제공한다.

본 발명의 다른 목적은 비만-유발 질환, 질병 또는 상태의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 Fas-관여된 피부 또는 모발 질환, 질병 또는 상태의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 FTP(Fas targeting peptide; 서열목록 제1서열)가 고리화(cyclization)된 환형 폴리 FTP(cyclized poly Fas targeting peptide)로, 상기 환형 폴리 FTP는 Fas(fatty acid synthase) 또는 FasL(Fas ligand)과 결합(interaction)하는 것을 특징으로 하는 폴리 FTP를 제공한다.

본 발명자들은 종래의 FTP(Fas targeting peptide)와 동일한 기능을 가지거나 또는 더욱 우수한 기능을 가지는 물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 최소 3개 이상의 모노머(monomeric) FTP가 고리화(cyclization)된 폴리 FTP(구체적으로는, 펜타머 FTP)가 모노머 FTP와 비교하여 Fas 또는 FasL에 대한 결합 친화도가 현저하게 우수하여 Fas-관여된 질환, 질병 또는 상태(예를 들어, 비만-유발 질환 또는 Fas-관여된 피부 또는 모발 질환)의 예방 또는 치료에 적용될 수 있다는 것을 발견하였다.

Fas(CD95/Apo-1) 및 이의 특이적 리간드인 FasL(CD95L)은 각각 TNF 수용체 및 TNF 리간드 수퍼패밀리(TNF ligand superfamily, TNFSF)에 속하는 단백질의 멤버이다. Fas와 FasL 간의 상호작용은 Fas-발현 타겟(예컨대, 지방세포)에서 세포 사멸을 초래하는 세포내 이벤트들의 캐스케이드(cascade)를 촉발시킨다. Fas는 비장, 림프관, 간, 폐, 신장 및 난소 같은 다양한 조직들에서 항상 발현되는 45 kDa의 제1형 막 단백질이다. FasL은 40 kDa의 제2형 막 단백질로 림프기관(lymphoid organs) 및 면역-관련 조직들에서 주로 발현된다. FasL은 막-결합된 형태 또는 단백질 분해(proteolysis)를 통해 배출되는 17 kDa 수용성 형태로 Fas-발현 세포들의 세포 분해(cytolysis)를 유도할 수 있지만, 막-결합된 형태가 Fas-자극 능력이 더욱 우수하다. 또한, Fas 수용체 및 FasL은 아팝토시스 및 비-아팝토시스에 대한 시그널링에 모두 관여한다(Wajant et al., Cytokine & Growth Fac. Rev., 14:53-66(2003)).

Fas-FasL 시스템은 여러 기관에서 면역 반응, 염증, 감염, 종양형성(neoplasia) 또는 실질세포(parenchymal cells)의 사멸에 관여되어 있다. 상기 Fas-FasL 시스템의 손상은 림프구 아팝토시스를 억제하여 림프구 증식 및 자가면역질환을 초래한다(Nagata et al. supra; Biancone, L. et al., J Exp Med 186: 147-152(1997); Krammer, P. H. Adv Immunol 71: 163-210(1999); Seino, K. et al., J Immunol 161: 4484-4488(1998); 및 Famularo, G., et al., Med Hypotheses 53: 50-62(1999)). 따라서, Fas-매개된 아팝토시스는 조직-특이적 기관 손상(예컨대, 간 손상)에 핵심적인 구성요소이다.

치료 타겟으로서 Fas-FasL 시스템의 조절을 위하여, 항체를 이용한 FasL에 대한 중화 연구들이 다양한 동물 모델들에서 실시되었다(Okuda, Y. et al., Biochem Biophys Res Commun, 275: 164-168(2000)). 하지만, 항체 같은 거대분자를 이용한 방법들은 다음과 같은 치명적인 단점을 가진다: (a) 대량생산의 어려움; (b) 고-생산 비용; (c) 특정 조직(예컨대, 뇌)으로의 적용 상 난점; 및 (d) 중화항체의 필요성. 이를 극복하기 위해, 작은 분자 억제제들에 대한 개발이 시급히 요구되고 있다.

본 발명자들은 항체 같은 거대 분자들의 Fas-FasL 시스템 억제 효과를 가질 뿐 아니라 수용체에 대한 높은 리간드 결합 친화도를 가지는 펩타이드 모방체(peptidomimetics; 폴리 FTP)를 개발하였다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 예를 들어 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques; Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)) 또는 액상 합성 기술(US 등록특허 제5,516,891호)에 따라 제조될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "펩타이드 모방체(peptidomimetics)"는 펩타이드의 활성을 모방(mimic)하는 분자(예를 들어, 펩타이드)로, 종래의 펩타이드의 변형 또는 펩토이드(peptoids; 펩타이드 백본 상의 질소 원자에 사이드 체인이 부가된 형태) 또는 β-펩타이드 같이 펩타이드를 모방하도록 고안된 유사 시스템을 디자인함으로써 제조될 수 있다. 통상적으로, 펩타이드 모방체는 변형된 화학 구조를 통해 안정성 또는 생물학적 활성이 증가되도록 디자인될 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 펩타이드 모방체(peptidomimetics)는 'Fas 모방체(mimetic)'이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "Fas 모방체(Fas mimetics)"는 Fas 펩타이드로부터 유래된 펩타이드를 의미하고 Fas 활성(특히, Fas-매개된 시그널링)을 억제한다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드 모방체는 Fas 또는 FasL과 결합하여 Fas-매개된 시그널링을 억제한다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드 모방체는 최소 3개 이상의 모노머 FTP(monomeric Fas targeting peptide)가 고리화(cyclization)를 통해 연결된 환형 폴리 FTP이며, 보다 구체적으로는 3-10개의 모노머 FTP가 고리화를 통해 연결된 환형 폴리 FTP이고, 보다 더 구체적으로는 3-7개의 모노머 FTP가 고리화를 통해 연결된 환형 폴리 FTP이며, 가장 구체적으로는 5개의 모노머 FTP가 고리화를 통해 연결된 환형 폴리 FTP이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "환형 폴리 FTP(cyclized poly Fas targeting peptide)"는 서열목록 제1서열의 모노머 FTP 내 시스테인 잔기가 다른 모노머 FTP의 시스테인 잔기와 이황화 결합(disulfide bridge)을 통해 연결되어 이루어진 환형(cyclized) 펩타이드로, 예를 들어 트리머 FTP로 이루어진 환형 폴리 FTP 및 펜타머 FTP로 이루어진 환형 폴리 FTP를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 환형 펩타이드의 제조 방법은 고상 합성 및 다른 방법들(Burgess, et al.(1996) in Solid phase syntheses of peptidomimetics(American Chemical Society, Washington DC.) pp. ORGN-157; Goodman & Shao, Pure Appl. Chem. 68: 1303-1308(1996); Hanessian, et al., Tetrahedron 53: 12789-12854(1997); Koskinen & Hassila, Acta Chem. Scand. 50: 323-327(1996); Kuhn, et al., Tetrahedron 53: 12497-12504(1997); Waid, et al., Tetrahedron Lett. 37: 4091-4094(1996); 및 Zuckermann, Curr. Opin. Struct. Biol. 3: 580-584(1993))을 이용하여 당업계에서 용이하게 실시할 수 있다. 또한, 환형으로 강제된 작은 펩타이드(cyclically constrained small peptides)의 말단에 방향족 아미노산 잔기들(aromatic residues)을 위치시키는 것이 모방체의 활성 증가에 유리하다(Takasaki, et al., Nat. Bio technol. 15: 1266-1270(1997); Zhang, et al., Nature Biotech nol. 14, 472-475(1996)).

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 환형 폴리 FTP를 형성하는 고리화(cyclization)는 하나의 FTP 내 시스테인 잔기가 다른 FTP 내 시스테인 잔기와 이황화 결합을 통해 연결되어 최소 3개 이상의 FTP들 간의 연결을 통해 형성되며, 보다 구체적으로는 3-7개의 FTP 간의 고리화를 통해 형성되고, 보다 더 구체적으로는 5개의 FTP 간의 고리화를 통해 형성된다(참고: 도 5a).

본 발명의 환형 폴리 FTP는 다가성(multivalency)을 가지기 때문에 모노머 FTP와 비교하여 높은 결합 상수 및 해리 상수, 그리고 매우 높은 결합 친화도를 나타냈다(참고: 도 6a 및 도 6b).

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 환형 폴리 FTP의 Fas 또는 FasL에 대한 결합 상수(association constant, K_a)는 모노머(monomeric) FTP의 Fas 또는 FasL에 대한 결합 상수보다 2배 이상 높다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 환형 폴리 FTP의 Fas 또는 FasL에 대한 해리 상수(dissociation constant, K_d)는 모노머 FTP의 Fas 또는 FasL에 대한 결합 상수보다 1.5배 이상 높다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 환형 폴리 FTP의 Fas 또는 FasL에 대한 결합 친화도(binding affinity, K_D)는 모노머 FTP의 Fas 또는 FasL에 대한 결합 친화도보다 10배 이상 높다.

상술한 바와 같이, TNF 수용체 패밀리에 속하는 수용체들은 염증 시그널링 뿐 아니라 아팝토시스와도 연관되어 있다. Fas-매개된 아팝토시스는 자가-반응성(self-reactive) 림프구를 사멸시켜 자가면역성(autoimmunity)을 유발할 뿐 아니라 Fas 시그널닝은 변형된(transformed) 세포 및 바이러스-감염된 세포를 제거하기 위한 면역 감시 기능(immune surveillance)에 중요하다. 또한, 올리고머화된 FasL과 Fas의 결합은 Fas의 세포질 도메인(사멸 도메인(death domain)으로 알려짐)에 결합하는 시그널링 어댑터(예를 들어, FAF, FADD, DAX, 등)를 활성화시켜 카스파제 단백질 분해 캐스케이드를 활성화시킴으로써 아팝토틱 시그널링을 활성화시킨다. 먼저, 카스파제-8 및 카스파제-10이 활성화되어 다운스크림 카스파제들(예컨대, 카스파제-3, 카스파제-7, 등)을 절단시켜 세포 사멸을 초래한다. 상기 카스파제들은 핵 라민(nuclear lamins)을 절단하여 핵의 정상 구조를 붕괴시킬 뿐 아니라 또 다른 기질인 DFF(DNA fragmentation factor)를 통해 염색체를 분해시킨다. 다른 카스파제 기질들은 세포 골격(cytoskeleton) 구조, 세포주기 조절 및 여러 시그널링 경로들에도 포함된다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 환형 폴리 FTP는 지방세포 또는 지방 조직의 대식세포(adipose tissue macrophages, ATMs)에서 발생하는 Fas-유도된 아팝토시스(apoptosis)를 억제한다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 환형 폴리 FTP는 염증 조건에 따라 증가된 절단 카스파제-3의 레벨을 감소시킨다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르며, 본 발명의 환형 폴리 FTP는 ERK(extracellular signal-regulated kinase)의 인산화를 억제하여 ERK 시그널링 경로를 차단한다.

또한, 상기 염증 시그널링은 비만과 밀접하게 연관되어 있다. 과도한 영양 로드(load)는 낮은 수준의 만성 염증을 유발하지만, 오랫동안 지속되는 경우 대사 항상성을 파괴하여 세포내 다양한 염증-관련 반응(예컨대, NF-κB 및 JNK 시그널링 경로)을 촉발시킨다. 그 결과, 지방세포와 지방 조직 내 ATMs 간의 크로스-톡은 상승 작용(synergistic effects)을 통해 상기 염증 상태를 더욱 악화시킴으로써 지방세포에서 인슐린 시그널링에 직접적으로 영향을 미치고 엔도크라인 시그널링을 통해 전신성(systemic) 인슐린 저항성을 야기시킨다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 환형 폴리 FTP는 Fas-유도된 친-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 및 케모카인(chemokine)의 생산을 억제한다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 상기 Fas-유도된 친-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 및 케모카인(chemokine)은 TNF(tumor necrosis factor)-α, iNOS(inducible NO synthase), IL(interleukin)-1β, IL-6, IL-8, MCP(monocyte chemotatic protein)-1, CCL(chemokine ligand)3, CCL5, CCL5 및 CCL8을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 환형 폴리 FTP는 M1 타입 대식세포를 감소시키고 M2 타입 대식세포를 증가시킨다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 환형 폴리 FTP는 Fas-촉발된 인슐린 저항성을 억제한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 환형 폴리 FTP(cyclized poly Fas targeting peptide)의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 비만-유발 질환, 질병 또는 상태의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 환형 폴리 FTP를 유효성분으로 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 JNK(Jun-NH₂ terminal kinase), p38 MAPK(mitogen activated protein kinase) 및 NF-κB(p65 nuclear factor-κB)의 인산화를 억제시킬 뿐 아니라, CD11c, CCR5 또는 CD11b의 발현을 억제시킨다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 아르기나제(arginase)-1 또는 IL-10의 발현을 증가시킬 뿐 아니라, PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma) 또는 포스포-Akt(phospho-Akt)의 세포내 레벨을 증가시킨다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 지방세포에서 CLS(crown like structure)의 형성을 억제한다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 혈청 FFA(free fatty acids), 지질 축적(lipid accumulation) 및 트리글리세라이드(triglyceride) 함량을 감소시킨다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "비만-유발 질환, 질병 또는 상태(obesity-associated diseases, disorders or conditions)"는 비만과 관련된 동반상병(co-morbidities)으로 Fas 시그널링의 증가로 인해 유발되는 병적 상태(pathological conditions)를 의미하며, 예를 들어 비정상적 림프구 증식 및 자가면역성을 초래하는 림프구 아팝토시스와 관계된 병적 상태, 피부 및 다른 기관에서의 노화 및 세포 사멸 등을 포함한다. Fas 시그널링의 증가로 유발되는 병적 상태이기 때문에, 상기 비만-유발 질환, 질병 또는 상태는 Fas 또는 FasL, 또는 양자에 모두 결합하여 Fas 활성을 낮춤으로써 개선 또는 치료될 수 있다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의해 개선 또는 치료될 수 있는 비만-유발 질환, 질병 또는 상태는 염증, 인슐린 저항성, 글루코오스 과민성, 제2형 당뇨병, 지방간, 간염, 이상지질혈증, 고혈압, 류마티스 관절염, 쇼그랜 증후군(Sjogren's syndrome), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 안구 질환(ocular disorders), 신장 외상(renal injury or trauma), HIV(human immunodeficiency virus) 감염, 노화, 암, 이식 거부 및 자가면역질환(autoimmune diseases)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적 유효량"은 상기 비만-유발 질환, 질병 또는 상태의 개선 또는 치료를 위해 상술한 환형 폴리 FTP의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다. 본 명세서에서 언급되는 용어 "치료(treatment)"는 유효물질을 투여하여 발생된 질환, 질병 또는 상태의 심각성 또는 재발 가능성을 낮추는 것을 의미하고, 본 명세서에서 사용되는 용어 "예방(preventing)"은 상기 질환, 질병 또는 상태의 발생 가능성을 낮추는 것을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 점막(transmucosal) 투여, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사가 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 약 25-1,000 /체중(50 kg)이고, 보다 구체적으로는 약 100-750 mg/체중(50 kg)이며 보다 더 구체적으로는 약 250-500 mg/체중(50 kg)이지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 환형 폴리 FTP(cyclized poly Fas targeting peptide)의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 Fas-관여된 피부 또는 모발 질환, 질병 또는 상태의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

Fas 수용체 복합체는 각질세포(keratinocyte)에서 아팝토시스를 유발하는 것으로 알려져 있다(Sayama, et al., J. Invest. Dermatol., 103: 330-334(1994); 및 Trautmann et al., JCI(2000)). Fas 수용체 시스템의 활성화를 통해 각질세포 아팝토시스의 유도는 상피 장벽(epidermal barriers)을 파괴하여 T 림프구의 침윤을 초래하여 직접적인 각질세포의 사멸을 야기한다. 또한, 상기 Fas-매개된 각질세포 사멸은 다른 피부병인 TEN(toxic epidermal necrolysis)에 관여되어 있는 것도 알려져 있다(Viard, I., et al., Science, 282: 490-493(1998)). 따라서, Fas 기능 억제는 각질세포 및 모낭(hair follicles) 아팝토시스를 차단하고 습진 같은 염증을 포함하는 피부 상태(skin conditions)을 치료할 수 있다.

Fas는 HF(hair follicle) 각질세포에서 상향-조절된다(Sharov et al., Cancer Res., 64: 6266-6270(2004)). Sharov 등(2004)은 사이클로포스파미드 처리에 의해 유발되는 HF 각질세포에서의 Fas 상향-조절은 이의 억제제(예컨대, FasL-중화 항체)에 의해 부분적으로 억제된다는 것을 보고하였다. 따라서, 본 발명의 조성물(Fas-FasL 시스템 조절 또는 억제능)은 Fas-관여된 피부 또는 모발 질환, 질병 또는 상태의 예방 또는 치료에 적용될 수 있다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 Fas-관여된 피부 또는 모발 질환, 질병 또는 상태는 백반증(vitiligo), 건선, TEN(toxic epidermal necrolysis; 라이엘 증후군), 습진성 피부염, 반구진성 발진(macropapular rashes), 주사비(rosacea), 모발세포-관여 질환 및 약물-유도된 피부 질환을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 모발세포-관여 질환은 원형탈모증(alopecia areata), 전두탈모증(alopecia totalis), 전신탈모증(alopecia universalis), 두부탈모증(ophiasis), 남성탈모(androgenic alopecia), 휴지기 탈모(telogen effluvium), 모공성 편평태선(lichen planopilaris), 화학치료-유도된 탈모 및 방사선 치료-유도된 탈모을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 화학치료-유도된 탈모는 사이클로포스파미드, 클로메틴, 무스틴, 닥티노마이신, 다우노루비신, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에토포시드, vp16, 이포스파미드, 이리노테칸, 미토잔트론, 미톡산트론, 파클리탁셀, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 겜시타빈 및 카르보플라틴 처리에 의해 유도된다.

본 명세서의 Fas-관여된 피부 또는 모발 질환, 질병 또는 상태의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에서 사용되는 용어 "약제학적 유효량"은 상기 Fas-관여된 피부 또는 모발 질환, 질병 또는 상태의 개선 또는 치료를 위해 상술한 환형 폴리 FTP의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다. 본 명세서에서 언급되는 용어 "치료(treatment)"는 유효물질을 투여하여 발생된 질환, 질병 또는 상태의 심각성 또는 재발 가능성을 낮추는 것을 의미하고, 본 명세서의 용어 "예방(preventing)"은 상기 질환, 질병 또는 상태의 발생 가능성을 낮추는 것을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 국소 투여, 경피 투여, 피하 주입 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사가 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 약 0.0005-1,000 mg/kg이다.

또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 펩타이드류와 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 모노머(monomeric) FTP가 고리화(cyclization)된 환형 폴리 FTP 및 이의 용도에 관한 것이다.

(b) 본 발명의 환형 폴리 FTP는 모노머 FTP와 비교하여 Fas 또는 FasL에 대한 결합 친화도가 현저하게 우수하다.

(c) 또한, 본 발명의 환형 폴리 FTP는 지방세포 또는 지방 조직의 대식세포(adipose tissue macrophages, ATMs)에서 발생하는 Fas-유도된 아팝토시스(apoptosis)를 억제할 뿐 아니라, Fas-유도된 친-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 및 케모카인(chemokine)의 생산을 억제한다.

(d) 따라서, 본 발명의 환형 폴리 FTP를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물은 Fas-관여된 질환, 질병 또는 상태(예를 들어, 비만-유발 질환 또는 Fas-관여된 피부 또는 모발 질환)의 개선 또는 치료에 매우 효과적으로 적용될 수 있다.

도 1은 비만 지방 조직에서 염증의 특징을 보여주는 도면이다. HFD(high fat diet; 영양분 스트레스)는 지방세포 및 지방 조직 내 대식세포(M2)의 활성화를 유도하여 IL-1β, TNF-α, 그리고 CCR2⁺ 및 CCR5⁺ 대식세포를 지방 조직으로 유인하는 일련의 케모카인들의 생산을 초래한다. 침윤된 대식세포는 염증성 사이토카인들의 생산에 의해 M2에서 M1 극성화로 쉬프트되어 지방 조직 내 M1 대 M2 비율을 증가시킬 뿐 아니라 전화된 염증 환경(milieu)을 셋팅시킨다. 사이토카인과 함께 침윤된 대식세포는 지방세포를 자극하여 MCP-1 레벨의 증가를 유도하는 Fas 및 FasL 분자들을 제공함으로써 순환(circulatory) 시스템으로부터 더 많은 대식세포를 유인한다. 이러한 지속적인 악순환과 함께, 만성 염증 조건이 유발되어 자극된 JNK 및 NF-κB 경로들을 통해 증대된 CLS, 증가된 지방 분해, 그리고 인슐린 저항성을 초래한다.
도 2는 Fas 시그널링을 나타내는 도면이다. Fas는 카스파제 활성화를 통한 전통적인 아팝토틱 시그널링과 FasL과의 상호작용을 통해 IL-8, IL-6, MCP-1, IL-1β, TNF-α, 등과 같은 사이토카인들의 생산을 야기하는 비-전통적인 염증성 시그널링을 모두 유도하는 것으로 알려져 있다.
도 3은 지방 조직과 간 사이의 크로스-톡을 보여주는 도면이다. HFD에 의해 발생된 영양물질 스트레스는 증가된 M1 대식세포, Fas 및 FasL의 발현 증가 및 IL-6, IL-1β, TNF-α 같은 염증성 사이토카인의 생산 증가와 함께 지방 조직 리모델링을 야기한다. 대식세포에 의한 TNF-α의 생산 증가는 지방세포에서 지방 분해를 유도하여 FFA(free fatty acids)의 과도한 배출을 초래한다. 따라서, 생산된 FFA, TNF-α 및 IL-6는 문맥(portal vein)으로 배출되어 간 인슐린 저항성 및 지방간을 야기한다.
도 4는 FTP(Fas targeting peptide)에 의한 항-아팝토틱 기작을 보여주는 도면이다(Hasegawa et. al., 1994, PNAS). Jurkat 세포에서 Fas 활성화는 ERK 경로를 촉발시켜 아팝토시스를 유도하지만, JNK 또는 NF-κB 시그널링에는 변화가 없다. FasL에 의한 Fas 활성화는 FTP의 존재 하에서 ERK 시그널링을 억제하지만, NF-κB 경로(항-아팝토틱 유전자들의 발현 증가)를 활성화시킨다. 따라서, FTP는 항-아팝토틱 기능을 활성화시키는 유일한 경로로서 선택적 차단제(blocker)/활성제(activator)인 펩타이드 모방체(peptidomimetics)이다.
도 5는 pFTP(poly FTP)의 합성 및 고리화(cyclization)을 보여주는 도면이다. 도 5a는 DMSO의 존재 하에서 모노머 FTP 펩타이드의 시스테인을 이용하여 폴리 FTP(pFTP)의 중합 반응을 도식적으로 보여주는 도면이다. 도 5b는 DMSO-매개된 산화적 중합 반응을 통해 합성된 FTP의 폴리머들을 검출한 MALDI-TOF 데이터이다. 위쪽 패널은 중합 반응을 통해 합성된 모든 멀티머(multimers)을 보여주는 결과하고 아래쪽 패널은 투석과 저분자량 펩타이드들의 제거 후 정제된 pFTP 펩타이드들을 보여주는 결과이다. 도 5c는 펩타이드들의 고리화를 확인하기 위해 다른 간격의 배양 시간으로 실시된 DTNB 반응에 의한 자유 티올기의 백분율을 측정한 결과이다. 투석 데이터는 10일 째에 시료를 취해 더 작은 펩타이드들을 제거하기 위한 투석을 실시한 결과이다. 데이터는 3개의 독립적인 실험들로부터 얻어진 평균값±표준편차를 의미한다.
도 6은 Fas 및 FasL과 pFTP의 상호작용을 조사한 SPR(spin plasmon resonance) 분석 결과이다. 도 6a 및 도 6b는 각각 센서 칩(좌측 패널)에 부착된 FasL 및 Fas 수용체와 다른 농도의 pFTP 간의 상호작용을 보여주는 대표적인 센소그램(sensograms)이다. 우측 패널은 고정된 FasL(6a) 또는 Fas 수용체(6b)와 mFTP 또는 pFTP의 상호작용을 비교한 대표적인 센소그램을 의미한다. pFTP는 폴리 FTP이고 mFTP는 모노머 FTP를 나타내고, 모든 펩타이드들은 자연 상태에서 고리화되어 있다.
도 7은 Jurkat 세포에서 pFTP의 세포독성 효과와 항-아팝토틱 활성을 보여주는 결과이다. 도 7a는 다양한 농도의 FTP 및 pFTP를 jurkat 세포에 처리한 후 세포 생존율(cell viability)를 측정 및 비교한 결과이다. 데이터는 3개의 독립적인 실험들로부터 얻어진 평균값±표준편차를 의미한다. 도 7b는 아넥신 V 염색을 이용하여 jurkat 세포에서 발생한 아팝토시스를 분석한 결과로, 500 μM의 펩타이드(FTP 또는 pFTP)의 처리 또는 무처리 하에서 막-결합된 FasL(1.5 ng/ml)의 처리에 따른 아팝토시스의 백분율을 보여주는 히스토그램(histograms)으로 제시된다. 도 7c는 FasL 처리(1.5 ng/ml)에 따른 jurkat 세포의 아넥신 V 염색을 통해 분석된 FTP, pFTP 및 스크램블 펩타이드(scrFTP) 간의 아팝토시스 억제를 백분율로 표시하여 비교한 그래프이다. 그래프는 3개의 독립적인 실험들로부터 얻어진 평균값±표준편차로 제시된다(*p<0.05).
도 8은 pFTP에 의한 아팝토시스의 조절 기작을 보여주는 도면이다. 다양한 시간 동안 pFTP(1000 μM)의 처리 또는 무처리 하에서 다양한 시간 동안 막-결합된 FasL(1.5 ng/ml)의 처리에 따라 jurkat 세포에서 촉발된 IκB-α(8a) 및 ERK(8b)의 인산화를 측정한 웨스턴 블랏팅 결과이다. 도 8c는 예상되는 pFTP에 의한 아팝토시스 억제 기작을 보여주는 도식적인 도면이다. Fas 수용체에 결합한 FasL 리간드는 JNK, ERK 및 NF-κB 같은 아팝토틱 조절인자들을 유도하고(좌측 경로), pFTP가 처리된 경우에 FasL 또는 Fas 수용체에 결합하거나 또는 모두에 결합하여 시그널을 왜곡하여 아팝토시스를 차단한다(우측 경로). 막-결합된 FasL에 의한 ERK의 활성화는 jurkat 세포에서 pFTP에 의해 억제되고 pFTP의 존재 또는 부존재 하에서 FasL 처리에 따른 NF-κB 경로의 활성화는 일어나지 않는다.
도 9a는 성숙 3T3-L1 지방세포에서 펩타머(pentameric) 및 트리머(trimeric) FTP에 의한 FasL-유도된 친-염증성 사이토카인 생산의 억제를 보여주는 결과이다. 좌측 패널은 IL-6, IL-8(KC) 및 MCP-1의 증가된 생산을 유도하는 막-결합된 FasL(2.0 ng/ml)의 ELISA 결과들(빨간색 박스)을 보여주는 도면이고, 우측 패널은 pFTP(500 μM)에 의한 사이토카인들의 억제를 보여주는 그래프 결과이다. 그래프는 다양한 처리 농도의 FTP, pFTP 및 스크램블 펩타이드(scrFTP)에 의한 FasL-유도된 사이토카인 생산 억제에 대한 백분율로 표시된 결과이다. 도면 내 데이터는 최소 4개 이상의 독립적인 실험들로부터 얻어진 평균값±표준편차로 제시된다. *대조군과 비교하여 p<0.05; #*FasL 처리와 비교하여 p<0.05; 및 #** FasL 처리와 비교하여 p<0.01. 9b는 FasL 처리에 의해 활성화된 지방세포에서 사이토카인 생산의 억제 상에 트리머 FTP(tFTP)의 효과를 측정한 결과이다. 데이터는 3개의 독립적인 실험들로부터 얻어진 평균값±표준편차로 제시된다. *FasL 처리와 비교하여 p<0.05; #*tFTP 처리와 비교하여 p<0.05; 및 #**tFTP 처리와 비교하여 p<0.01.
도 10은 FasL-촉발된 성숙3T3-L1 성숙 지방세포에서 pFTP에 의한 PPARγ 및 Akt 레벨의 회복을 보여주는 결과이다. 도 10a는 FasL(2 ng/ml) 처리에 의해 3T3-L1 성숙 지방세포에서 활성화된 PPARγ 발현의 억제 및 500 μM pFTP 또는 스크램블 펩타이드(scrFTP)에 의한 FasL 활성의 억제를 보여주는 웨스턴 블랏팅 결과이다. 실험은 최소 3번 이상 실시하였다. 도 10b는 막-결합된 FasL과 함께 pFTP의 처리 또는 무처리에 따른 Akt 발현을 측정한 정량적 실-시간(quantitative real-time) PCR 결과를 보여주는 막대 그래프이다. 막대 그래프는 3개의 독립적인 실험들로부터 얻어진 평균값±표준오차로 제시된다. *대조군과 비교하여 p<0.05; #*FasL 처리와 비교하여 p<0.05; 및 #** FasL 처리와 비교하여 p<0.01.
도 11은 비만 마우스로부터 유래된 복강내 대식세포에서 pFTP에 의한 FasL-유도된 친-염증성 사이토카인 생산의 억제 효과를 나타내는 도면이다. 좌측 패널은 막-결합된 FasL(10 ng/ml)-촉발된 TNF-α, IL-8(KC) 및 IL-1β의 증가된 생산을 보여주는 ELISA 결과들이고 우측 패널의 그래프는 500 μM의 pFTP 또는 스크램블 펩타이드(scrFTP)에 의한 사이토카인들의 억제 효과를 보여주는 결과이다. 우측 패널의 그래프들은 다양한 농도의 pFTP에 따른 FasL-유도된 사이토카인 생산의 억제를 백분율로 나타낸 것이다. 데이터는 최소 4개 이상의 독립적인 실험들로부터 얻어진 평균값±표준편차이다. *대조군과 비교하여 p<0.05; #*FasL 처리와 비교하여 p<0.05; 및 #** FasL 처리와 비교하여 p<0.01.
도 12는 비만 마우스에서 알렉스(Alexa)-488 표지된 pFTP의 생체-분포(bio-distribution)를 관찰한 결과이다. 도 12a는 비만 마우스에 복강내 단일 주입 후 알렉사-488 표지된 pFTP(500 μg)의 위치를 조사한 엑스-비보(ex-vivo) 결과이다. 주요 기관들은 마우스로부터 분리되었으며 주입 24시간 후 알렉사-488 표지된 pFTP의 형광을 측정하였다. 도 12b는 지방 조직의 조직 절편들에서 알렉사-488 표지된 pFTP(녹색 형광)의 존재를 확인한 결과이다. 도 12c는 지방 조직 절편들에서 알렉사-488 표지된 pFTP(녹색 형광)과 CD11b-PE 항체-염색된 지방 조직 대식세포(빨간색 형광) 간의 상호작용을 관찰한 결과이다.
도 13은 pFTP 처리 계획을 나타내는 개략적인 도면이다. 4-주령된 수컷 C57Bl/6 마우스를 2주 동안 정상 식이(nornal chow diet, NCD)로 인-하우스(in-house) 조건에 적응시킨 후, 상기 마우스는 6주 차부터 60% HFD(high fat diet)로 8주 동안 식이되었다. 마우스는 체중에 따라 3개의 그룹들(대조군, scrFTP 및 pFTP 처리 그룹)도 분류되었다. 스크램블 펩타이드 및 pFTP 펩타이드(350 μg/마우스)가 4-5주 동안 매일 각 그룹의 마우스에 복강내 주입되었다. 이후, 여러 가지 치료학적 변수들이 분석되었다.
도 14는 지방 조직에서 염증성 구성요소들에 대한 pFTP 처리 효과를 조사한 결과이다. 도 14a는 대조군 또는 스크램블 펩타이드-처리된 그룹과 비교하여 pFTP-처리된 비만 마우스의 지방 조직에서 염증성 시그널링 경로들의 감소를 보여주는 결과이다. 좌측 상단 패널은 pFTP 또는 스크램블 펩타이드 처리 후 비만 마우스의 지방 조직에서 인산화된 (p)-JNK, p-p38 MAPK, p-NF-κB p65 및 이들의 총 단백질에 대한 웨스턴 블랏 결과이다. 도 14a 및 도 14b 내 그래프들은 염증성 사이토카인들(14a 우측 패널 및 아래쪽 패널), 염증성 면역세포 마커들(도 14b 상단 패널), 그리고 항-염증성 사이토카인 및 M2 대식세포 마커(14b 아래쪽 패널)의 발현을 측정한 정량적 실-시간 PCR 결과이다. mRNA 레벨은 베타-액틴 레벨을 이용하여 표준화시켰다. 데이터는 그룹 당 6-8마리의 마우스로부터 얻어진 평균값±표준오차이다: *p<0.05; 및 **p<0.01. 도 14b 내 중간 패널은 Mac-3 항체를 이용한 지방 조직 절편 염색 결과로 pFTP-처리된 마우스(좌측)에서 대식세포 침윤의 감소를 보여준다. 우측 그래프는 10개의 현미경 필드(microscopic fields) 당 Mac-3 양성 세포의 총 수를 보여준다: **p<0.01.
도 15는 pFTP-처리된 비만 마우스의 지방 조직에서 증가된 인슐린 시그널링을 보여주는 결과이다. 도 15a는 스크램블 펩타이드 또는 pFTP 펩타이드 처리된 비만 마우스의 지방 조직에서 PPARγ 발현을 조사한 면역블랏(immunoblots) 결과이다. 우측 패널은 베타-액틴으로 표준화시킨 PPARγ 레벨의 밀도계측 판독 그래프이다: *대조군과 비교하여 p<0.05. 도 15b는 스크램블 펩타이드 또는 pFTP 펩타이드 처리된 비만 마우스의 지방 조직에서 Akt의 인산화, 총 Akt 및 베타-액틴발현을 조사한 면역블랏 결과이다. 우측 패널은 총 Akt 레벨로 표준화시킨 pAkt 레벨의 밀도계측 판독 그래프이다: *대조군과 비교하여 p<0.05.
도 16은 3T3-L1 성숙 지방세포에서 Fas-매개된 아팝토시스를 민감화시키는 염증에 대한 pFTP 억제 효과를 보여주는 결과이다. 도 16a 및 도 16b는 pFTP(500 μM)를 처리 또는 처리하지 않은 20% LPS-처리된 Raw-CM(raw-conditioned medium)의 존재 하에서 Fas 활성화에 따른 3T3-L1 성숙 지방세포 내 절단된 카스파제-3 레벨을 보여주는 면역블랏(16a) 및 이의 세포 생존률(16b)을 보여주는 결과이다. Raw-CM은 Raw264.7 세포에 LPS(200 ng/ml)를 20시간 동안 처리하여 제조하였다. CM(complete media)은 10% FBS 및 1% 항생제로 구성된다. 데이터는 3개의 독립적인 실험들로부터 얻어진 평균값±표준오차이다: *대조군과 비교하여 p<0.05; #*FasL + 20% LPS-처리된 Raw-CM + pFTP-처리된 시료와 비교하여 p<0.05; 및 #**FasL + 20% LPS-처리된 Raw-CM + pFTP-처리된 시료와 비교하여 p<0.01. 도 16c는 20% FasL-처리된 복강내 Mac-CM(macrophage conditioned medium)의 존재 하에서 FasL 처리에 따른 3T3-L1 지방세포 내 아팝토시스 정도를 백분율로 표시한 아넥신 V 염색 결과이다: *대조군과 비교하여 p<0.001; 및 #*FasL + 20% FasL-처리된 Mac-CM + pFTP-처리된 시료와 비교하여 p<0.01.
도 17은 pFTP-처리된 비만 마우스의 지방 조직에서 감소된 아팝토틱 레벨을 보여주는 결과이다. 도 17a는 NCD-식이된 대조군 마우스와 비교하여 HFD-식이된 비만 마우스의 지방 조직에서 IFN-γ 및 TNF-α 레벨의 증가를 보여주는 정량적 시-시간 PCR 결과이다. 데이터는 4-6마리의 마우스로부터 얻어진 평균값±표준오차이다: *NCD-대조군과 비교하여 p<0.05; 및 #*HFD-대조군과 비교하여 p<0.05. 도 17b는 스크램블 펩타이드 또는 pFTP 펩타이드로 처리된 HFD-유도된 비만 마우스의 지방 조직에 대한 TUNEL 염색 결과이다. 우측 패널은 10개의 현미경 필드 당 TUNEL 양성 세포들의 총 수를 보여준다: *대조군과 비교하여 p<0.01. 도 17c는 대조군, pFTP 펩타이드 또는 스크램블 펩타이드로 처리된 비만 마우스의 지방 조직에서 절단된 카스파제-3 레벨을 검출한 면역블랏 결과이다. 우측 패널은 베타-액틴으로 표준화시킨 절단된 카스파제-3 레벨의 밀도계측 판독 그래프이다: *대조군과 비교하여 p<0.05. 도 17d는 F4/80 면역염색(immunostaining)을 통해 평가된 비만 지방 조직에서 죽은 지방세포 주위의 CLS(crown like structure) 형성을 보여주는 결과이다. 우측 패널은 10개의 현미경 필드 당 CLS의 총 수를 보여준다: *대조군과 비교하여 p<0.05.
도 18은 비만 마우스에서 전신성 염증 레벨 상에 pFTP 처리 효과를 조사한 결과로, pFTP-처리된 비만 마우스의 혈청 내 염증성 사이토카인(IL-6, MCP-1 및 IL-8(KC))의 감소를 보여준다. 데이터는 6마리의 마우스로부터 얻어진 평균값±표준편차이다: *대조군과 비교하여 p<0.01.
도 19는 비만 마우스에서 순환 대사 변수들 상의 pFTP 처리 효과를 조사한 결과이다. 도 19a는 대조군, scrFTP 및 pFTP 처리된 비만 마우스에서의 ipGTT(intra-peritoneal glucose tolerance test) 결과이다. 대조군, scrFTP 및 pFTP 그룹으로부터 얻어진 평균 GT 커브는 좌측 패널에 플롯팅되었다. GT 커브의 면적이 각 마우스로부터 계산되어 평균값이 우측 패널에 제시되어 있다. 결과들은 6마리 마우스로부터 얻어진 데이터에 기초하여 평균값±표준오차를 의미한다: *대조군과 비교하여 p<0.05; 및 **대조군과 비교하여 p<0.01. 도 19b는 처리 그룹에 따른 단식 혈장 인슐린 레벨을 나타낸다. 도 19c 및 도 19d는 각각 FFA 레벨 및 혈청 트리글리세라이드 레벨을 보여준다. 결과들은 6마리 마우스로부터 얻어진 데이터에 기초하여 평균값±표준오차를 의미한다: *대조군과 비교하여 p<0.05; 및 **대조군과 비교하여 p<0.01.
도 20은 비만 마우스에서 지방간에 대한 pFTP 처리 효과를 관찰한 결과이다. 도 20a는 H&E(hematoxylin and eosin)-염색된 간 절편들에 대한 대표적인 현미경 사진으로 지방간을 확인시켜준다. 도 20b는 대조군, scrFTP 펩타이드 및 pFTP 펩타이드-처리된 비만 마우스에서의 간 트리글리세라이드 레벨을 측정한 결과이다. 데이터는 그룹 당 6마리 마우스로부터 얻어진 평균값±표준편차로 제시된다: *대조군과 비교하여 p<0.05.
도 21은 비만 마우스에서 체중 및 음식 섭취에 대한 pFTP 처리 효과를 측정한 결과이다. 체중(21a 및 21b) 및 음식 섭취(21c)는 4-5주 동안 pFTP 펩타이드 또는 스크램블 펩타이드 처리한 후 비만 마우스에서 측정하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

실험재료

Fas-타겟팅 펩타이드(FTP; YCDEHFCY)는 Peptron(대전, 대한민국)으로부터 합성되었다. 알파-사이아노-4-하이드록시 신남산 매트릭스(α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid matrix), MALDI-TOF 분석용 트리플루로아세트산(trifluroacetic acid) 및 DTNB은 sigma(St. Louis, MO)로부터 구매하였다. 막-결합된 FasL는 Upstate로부터 구매하였고, DMEM, RPMI, FBS, FCS, 페니실린-스트렙토마이신 항생제 및 알렉사(alexa)-488 형광 다이는 Invitrogen으로부터 구매하였다. 웨블턴 블랏팅을 위한 항체들은 특별히 다른 회사로 언급되지 않는 한 cell signaling technologies로부터 구매하였다. 면역조직화학을 위한 항체들은 Abcam으로부터 구매하였다. TUNEL 어세이 키트는 Roche(Germany)로부터 구매하였다.

폴리 Fas 타겟팅 펩타이드(pFTP)의 합성

pFTP의 합성은 종래의 DMSO-매개된 Fas 타겟팅 펩타이드(YCDEHFCY)의 산화적 중합에 의해 실시하였다. 응축 반응(condensation)은 30% DMSO를 포함하는 PBS(phosphate buffered saline; pH 7.4)에서 125 mM의 FTP를 이용하여 10일 동안 지속적인 교반을 통해 실시하였다. 상기 반응 동안, 5 μl의 시료들이 24시간의 간격으로 취해져 HEPES 완충액을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight)를 이용하여 분석되었다. MALDI-TOFF에 의해 다른 크기의 폴리머 형성을 확인한 후, 더 작은 분자적 펩타이드들은 3.5 kDa의 분자량 컷-오프(MwCo)를 가지는 투석막을 이용한 투석(PBS, pH 7.4)으로 제거되었다. 정제된 펩타이드들이 수집되어 진공-동결 건조기(Freezone 4.5, Labconco corporation, Kansas City, MO)를 이용하여 동결건조되었다.

MALDI-TOF에 의해 중합된 펩타이드들의 분자량을 결정하기 위해, 본 발명자들은 알파-사이아노-4-하이드록시 신남산(CHCA; 분자량, 189.04 Da)을 이용하였다. 상기 매트릭스는 0.1% TFA(trifluroacetic acid)를 포함하는 50:50 물/아세토니트릴(acetonitrile)로 구성된 매트릭스 용액에서 제조되었다. 매트리스 용액(1 ml)에 10 mg의 CHCA 매트릭스가 첨가되어 1분 동안 볼텍싱(vortexing)시키고 용해되지 않은 매트릭스는 30초 동안의 고속원심분리를 통해 제거한 후, 용해된 매트릭스 상층액을 수득하였다. 펩타이드 시료들(5 μl)이 동량의 매트릭스와 혼합되어 MALDI-TOF로 분석되었다.

DTNB 방법을 이용한 펩타이드 내 자유 티올(free thiol; -SH) 그룹의 결정

형성된 pFTP가 천연 상태에서 고리 형태인지 여부를 분석하기 위해 자유 -SH 그룹들이 결정되었는 데, 고리(cyclic) pFTP는 자유 -SH 그룹을 가지지 않는다. 정제된 pFTP 펩타이드(25 g) 또는 자유 -SH 그룹을 가지는 FTP(5 μg; pFTP의 몰 당량), 그리고 자유 -SH 그룹을 가지지 않는 9R(5 μg; pFTP의 몰 당량)이 2 μl의 DTNB[(5, 5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid); 100 mM)]와 함께 190 μl의 PBS(pH 7.4)를 포함하는 개별 튜브에 첨가되어 잘 혼합된 후, 상온 암조건 하에서 15분 동안 반응시켰다. 흡광도가 412 nm에서 측정되었으며, 자유 -SH 그룹의 백분율이 FTP 펩타이드들에 대해서 계산되었다. 더 적은 양의 자유 -SH 그룹은 더 많은 펩타이드들의 고리화(cyclization)를 나타낸다. 유사하게도, 모든 펩타이드들(모노머 FTP, pFTP 및 스크램블(scrambled) FTP(scrFTP; 폴리머 형태))이 천연 상태에서 고리 형태였으며, 고리화된 펩타이드들만이 모든 인 비트로 및 인 비보 실험들에서 이용되었다.

바이오센서 분석

타겟에 대한 FTP 또는 pFTP의 직접 결합은 이중 채널 SPR 장치(Reichert, Depew, NY)를 이용하여 평가하였다. Fas 수용체 또는 Fas 리간드 단백질(Millipore)은 0.1 M EDAC[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride] 및 0.05 M NHS(N-hydroxysuccinimide)로 이루어진 혼합물을 주입하여 자유 아민기 커플링시키고 1 M 에타놀아민(ethanolamine, pH 8.5)로 잔여 활성화된 카르복실 그룹을 퀀쳐링함으로써 센서 칩 표면에 고정화시킨다. 2차 레퍼런스 세포도 유사하게 처리되지만, 타겟 단백질이 제외되었다. 모든 워킹(working) 펩타이드 희석액들은 0.5% DMSO를 포함하는 전기영동 완충액(running buffer)에서 제조되었으며, 30 μl/min의 유속으로 3분(결합 시간; association time) 동안 주입된 후, 3분의 해리 상(dissociation phase)에 종속되었다. 비특이적인 백그라운드 결합은 SPR_V4017 데이터 획득 및 정렬 프로그램(Data Acquisition and Alignment Program; Reichert, Depew, NY)을 이용하여 각 센소그램(sensogram)으로부터 감해졌다. 결합 속도(Binding rates) 및 상수들은 넓은 범위의 유속에 독립적이었다. 가장 적합한 동력학적 변수들은 Scrubber2(Biologic Software, Australia)를 이용한 포괄적 조정 분석(global fitting analysis)에 의해 얻어졌다.

세포독성 어세이

펩타이드 중합에 따른 독성 효과들은 CCK-8 어세이를 이용하여 조사하였다. 간략하게는, 펩타이드 처리 24시간 전에 5×10⁴개의 jurkat 세포들이 96-웰 플레이트에 분주되었다. 다음날, 다른 농도의 FTP 및 pFTP가 10% FBS 및 1% 항생제를 포함하는 DMEM에서 배양된 세포들에 세 쌍(triplicate)으로 처리되어 12시간 동안 배양되었다. 이후, 10 μl의 CCK-8 시약이 각 웰에 첨가되어 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 흡광도가 450 nm에서 측정되었다. 목(mock) 처리에 대한 흡광도를 100% 세포 생존률(cell viability)로 간주되고 다른 처리 그룹들에서의 생존률은 상기 목 처리 그룹과 비교하여 계산하였다.

아팝토시스 어세이

아팝토틱 세포는 BD Biosciences로부터 상업적으로 구매된 키트를 이용하여 아팝토시스 초기에 세포막 상에 발현되는 포스파티딜세린(phosphatidylserine)에 대한 아넥신 V-PE 결합을 통해 검출되었다. 간략하게는, 1×10⁵개의 jurkat 세포들이 펩타이드 시료들의 존재 또는 부존재 하에서 막-결합된 FasL(1.5 ng/ml)와 4시간 동안 배양되었다. 이후, 상기 세포들이 세척되고 칼슘, PE-컨쥬게이션된 아넥신 V 및 PI(propidium iodide)를 포함하는 완충액에서 10분 동안 재현탁되었다. 세포들은 FACS(Becton Dickinson)를 이용하여 분석하였다. 초기 아팝토틱 세포들은 아넥신 V-양성 세포 대 PI-음성 세포의 백분율로서 표현되었다.

시그널링 기작의 결정

아팝토시스 동안 Fas 시그널링에 포함된 다운스트림 분자들은 pFTP의 존재 또는 부존재 하에서 웨스턴 블랏을 이용하여 조사하였다. Jurkat 세포(1×10⁶/웰)가 6-웰 플레이트에서 12시간 동안 배양되고 펩타이드가 처리되지 않거나 또는 1,000 μM의 pFTP로 2시간 동안 처리된 후, 지정된 기간 동안 1.5 ng/ml의 FasL로 처리되었다. 이후, 세포들을 냉장 PBS로 세척하고 RIPA 용해 완충액을 처리하였다. 세포 용해물(15-30 μg)을 12% SDS/PAGE에 전기영동시키고 나이트로셀룰로오스 막으로 옮긴 후, 항-포스포-IκBα, 항-IκBα, 항-포스포-ERK 1/2, 항-ERK2 및 항-β-액틴 항체(Cell Signaling Technology, Beverly, MA)를 이용하여 프로빙되었다.

복강내 대식세포의 분리

복강내 대식세포는 8-10주 동안 60% HFD-식이된 비만 마우스로부터 분리하였다. 복부 멸균 후 5% FBS를 포함하는 7.5 ml의 냉장 PBS(pH 7.4)를 비만 마우스의 복강 내로 주입시킨 후, 상기 마우스를 안락사시켰다. 복강액(peritoneal fluid)을 냉장 멸균 50 ml 폴리프로필렌 튜브에 수득하였다. 상기 동일 과정을 총 5번 동안 반복하여 수득량(yield)을 최대화시켰다. 대식세포는 4℃에서 3,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 농축시켰다. 상기 얻어진 세포들은 DMEM 완전 배지로 한 번 세척된 후 2×10⁶ 세포/ml의 농도로 플레이팅되었다. 플레이팅하고 2시간 후, 결합되지 않은 세포들을 제거하였으며, 이를 완전히 제거하기 위해 세밀하게 세척하였다. 복강내 대식세포들은 DMEM 완전 배지에서 배양시키고 부착된 지 12시간 후 다른 형태의 실험들에 이용하였다.

지방세포 배양

3T3-L1 지방세포는 10% FCS 및 항생제(Invitrogen)가 보충된 25 mM 글루코오스(고농도 글루코오스)를 포함하는 DMEM(Invitrogen)에서 배양하였다. 컨플루언스(confluence)에 도달하고 48시간 후(day 0, D0), 세포 분화를 유도하기 위해 세포에 500 μM 메틸이소부틸크산틴(methylisobutylxanthine), 1 μM 덱사메타손(dexamethasone), 1.7 μM 인슐린 및 10 μM 트로글리타존(모두 Sigma)의 혼합물을 처리하였다. 2일 후(D2), 상기 배지가 인슐린(0.5 μM)을 포함하는 고농도-글루코오스 배양 배지로 바뀌었다. 추가적인 2일 배양 후(D4), 상기 배지는 인슐린을 포함하지 않는 배양 배지로 대체되었다. 상기 배양 배지는 하루에 한 번씩 교체되었으며, 4일 후(D8) 5.5 mM 글루코오스(저농도-글루코오스)를 포함하는 배양 배지로 대체되었다. 실험을 실시하기 전에, 상기 세포들은 최소 2일 동안 저농도 글루코오스-포함 배지에서 유지되었다. 막-결합된 Fas 리간드(Upstate; Lake Placid, NY)가 2 ng/ml의 농도로 저농도-글루코오스 혈청-결핍 배지에 첨가되고 펩타이드의 첨가 또는 부재 하에서 12시간 동안 추가적으로 반응되었다. FasL-촉발된 지방세포 아팝토시스 실험들에서, 3T3-L1 세포들은 상술한 보충물의 동일 농도 하에서 완전 배지(10% FCS 및 1% 항생제를 포함하는 DMEM)를 이용하는 일반적인 방법으로 성숙 지방세포로 분화되었다. 또한, FasL은 10% FCS 및 1% 항생제를 포함하는 DMEM을 포함하는 완전 배지 하에서 12시간 동안 처리되었다. 상술한 과정은 3T3-L1이 혈청 부족에 약간 민감하기 때문에 혈청 부족으로 인한 아팝토시스 또는 잘못된 아팝토틱 표시를 회피하기 위해 실시하였다.

Raw264.7 또는 대식세포 조건 배지(conditioned medium)

Raw264.7 대식세포주로부터 염증성 조건 배지(inflamed condition media)를 제조하기 위해, 1.5×10⁵ 세포들이 12-웰 플레이트에 분주되고 12시간 후, 200 ng/ml LPS가 DMEM 완전 배지에 20시간 동안 처리되었다. 상층액이 수거되어 Raw-조건 배지(Raw-CM)로서 새로이 이용되었다.

복강내 대식세포 조건 배지는 8-10주 동안 60% HFD-식이된 비만 마우스로부터 분리된 복강내 대식세포를 이용하여 제조하였다. 아팝토시스 실험들을 위한 염증성 조건 배지를 제조하기 위해, 10⁶ 세포들이 48-웰 플레이트에 분주되어 24시간 후에 10 ng/ml의 막-결합된 FasL을 처리하였다. 18시간 후, 상층액을 수거하여 고속원심분리를 이용하여 세포 찌꺼기(cell debris)를 제거하고 상층액을 다시 수득하여 대식세포 조건 배지(Mac-CM)로 이용하였다.

동물 실험

모든 과정들은 한양대학교 동물실험윤리위원회에 의해 승인된 가이드라인 및 프로토콜에 따라 실시하였다. 4-주령된 수컷 C57BL/6 마우스(20-22 g의 체중)가 Orient Bio(Korea)로부터 구매되었다. 구매 후 2주 동안, 상기 마우스는 조건에 적응시키고 6주까지 정상 식이(normal chow diet, NCD)에 따라 임의적으로 식이되었다. 이후, 마우스는 8주 동안 60% HFD-식이로 전환되어 40-42 g의 체중을 가지는 비만 마우스가 되었을 때 상기 마우스들을 유사한 체중 분포를 가지는 3가지 그룹(대조군, pFTP 및 스크램블 펩타이드 처리군)으로 분류하였다. 고지방 식이(high fat feeding) 4주 후, 펩타이드 처리가 60% HFD 식이와 동시에 시작되었다. 도 13은 동물 유지, 펩타이드의 치료학적 처리 및 분석의 시간 라인 및 프로토콜을 설명해 준다.

면역조직화학에 의한 지방 조직의 분석

부고환 지방 조직 주위의 작은 부위가 다른 처리 그룹들로부터 수집되어 2일 동안 포르말린에 고정되었다. 2일 후, 상기 조직들이 세척되고 파라핀-임베드된(embedded) 블락들이 절편화를 위해 제조되었다. 절편들이 자일렌 베스(bath)에서 5분 동안 두 번에 걸쳐서 파라핀을 제거한 후, 100%, 90% 및 80% 에탄올, 그리고 증류수와 연속적으로 반응시켜 재수화시켰다. 상기 절편들은 습도 조건에서 해당 항체들로 4℃에서 염색되었다. 다음날, 상기 조직이 세척되어 DAPI로 카운터 염색되었고, 이의 이미지들이 Nikon Eclipse TE 2000-E 형광 현미경(Japan)을 이용하여 얻어졌다. 양성 형광 세포들이 동일 배율의 10개의 연속적인 시야(visual fields)에서 카운팅되었다.

TUNEL 어세이

아팝토틱 DNA 파괴를 검출하기 위한 TUNEL(terminal DNA transferase-mediated dUTP nick end labeling) 어세이가 아팝토시스 검출 키트(Roche Applied Sciences, Germany)를 이용하여 실시되었다. 부고환 지방 조직의 주위 부분이 다른 처리 그룹들로부터 수집되어 2일 동안 포르말린에 고정되었다. 2일 후, 상기 조직들이 세척되고 파라핀-임베드된(embedded) 블락들이 절편화를 위해 제조되었다. 절편들이 자일렌 베스(bath)에서 5분 동안 두 번에 걸쳐서 파라핀을 제거한 후, 100%, 90% 및 80% 에탄올, 그리고 증류수와 연속적으로 반응시켜 재수화시켰다. 상기 절편들은 37℃에서 30분 동안 프로티나제 K(40 μg/ml)가 처리된 PBS에서 30분 동안 반응시킨 후, 두 번에 걸쳐서 PBS에서 5분 동안 재-반응시켰다. TUNEL 반응은 제조자의 지시에 따라 상기 절편을 TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase) 및 FITC-표지된 뉴클레오타이드를 포함하는 TUNEL 반응 혼합물과 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 실시하였다. 상기 조직이 세척되어 DAPI로 카운터 염색되었고, 이의 이미지들이 Nikon Eclipse TE 2000-E 형광 현미경(Japan)을 이용하여 얻어졌다. TUNEL-양성 세포들이 동일 배율의 10개의 연속적인 시야(visual fields)에서 카운팅되었다.

실-시간(real-time) PCR

총 RNA는 the RNAiso 키트(Takara)를 이용하여 지방 조직으로부터 얻어졌다. 총 RNA(1 g)가 iScript TM cDNA 합성 키트(Bio-rad)를 이용하여 cDNA로 역전사되었다. 실-시간 PCR은 유전자-특이적 프라이머(표 1)를 이용한 SYBR premix Ex Taq perfect real time(Takara)을 이용하여 500 ng의 합성된 cDNA로 실시하였다. RT-PCR은 7500 Real-Time PCR system(Applied Biosystems)을 이용하여 다음과 같이 실시하였다: (a) 전변성 단계, 95℃에서 10분; (b) 증폭 단계(40 사이클), 한 사이클 당 95℃에서 15초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 30초를 실시하고 95℃에서 1분, 55℃에서 30초 및 95℃에서 30초. 대조군 시료에 대한 배수 변화(fold change)는 CT, ΔCT 및 ΔΔCT 값을 이용하여 계산되었다. GAPDH RNA는 내적 대조군으로서 이용되었다.

프라이머 서열.

유전자	GenBank 접근번호	서열(5'->3')	Tm(℃)
Akt-2	NM_001110208	FP- ACGTGGTGAATACATCAAGACC RP- GGGCCTCTCCTTATACCCAAT	60
IL-6	NM_031168	FP- TCTATACCACTTCACAAGTCGGA RP- GAATTGCCATTGCACAACTCTTT	60
IL-8 (KC)	NM_011339.2	FP- TGTTGAGCATGAAAAGCCTCTAT RP- AGGTCTCCCGAATTGGAAAGG	60
IL-10	NM_010548.2	FP- GCTGGACAACATACTGCTAACC RP- ATTTCCGATAAGGCTTGGCAA	60
IL-1β	NM_008361.3	FP- TTCAGGCAGGCAGTATCACTC RP- GAAGGTCCACGGGAAAGACAC	60
TNF-α	NM_013693.2	FP- CAGGCGGTGCCTATGTCTC RP- CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG	60
MCP-1	NM_011333.3	FP- TAAAAACCTGGATCGGAACCAAA RP- GCATTAGCTTCAGATTTACGGGT	60
CD11b	NM_001082960.1	FP- GGGAGGACAAAAACTGCCTCA RP- ACAACTAGGATCTTCGCAGCAT	60
CD11c	NM_021334.2	FP- GTGCTGAGTTCGGACACAGT RP- AGAGGCCACCTATTTGGTTAGTb	60
CCR5	NM_009917.5	FP- ATGGATTTTCAAGGGTCAGTTCC RP- CTGAGCCGCAATTTGTTTCAC	60
아르기나제-1	NM_007482.3	FP- TTGGGTGGATGCTCACACTG RP- GTACACGATGTCTTTGGCAGA	60
IFN-γ	NM_008337.3	FP- ACAGCAAGGCGAAAAAGGATG RP- TGGTGGACCACTCGGATGA	60

약어: FP, 정방향 프라이머; RP, 역방향 프라이머; 및 Tm, 녹는점.

대사 연구들

ipGTT(intra peritoneal glucose tolerance test)를 위해, 마우스를 하룻밤 동안 단식시킨 후 체중(g) 당 2 mg 글루코오스를 복강내 주입하였다. 혈액을 0-, 15-, 45-, 및 120-분에 지각있는 마우스의 꼬리 정맥으로부터 수득하였다. 글루코오스는 Accu-Check active blood glucose monitoring system(Roche)을 이용하여 측정하였다.

단백질 및 지질 분석

6시간 단식 후 혈장 인슐린, 세포 배양(IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α 및 MCP-1) 유래된 상층액, 혈청 IL-6, IL-8 및 MCP-1을 포함하는 대사 매개인자들 및 염증 매개인자들의 혈청 어세이들은 상업적으로 유용한 마우스 인슐린(Crystal Chem Inc, Downers Grove, IL), IL-1β, IL-6, IL-8(Invitrogen), TNF-α 및 MCP-1(eBioscience) ELISA 키트들을 이용하여 측정하였다. 간 및 혈청 트리글리세라이드 및 FFA 레벨은 상업적으로 유용한 어세이들을 이용하여 측정하였다: 트리글리세라이드-SL 어세이(Diagnostic Chemicals Ltd) 및 NEFA C(Wako Chemicals).

통계적 분석

데이터는 지시된 바와 같이 평균값±표준오차(SEM) 또는 표준편차(SD)로 제시된다. 두 그룹 간의 평균값 차이는 이중-꼬리 Student's 테스트로 평가되었다. 두 개 이상의 그룹들 간의 평균값 차이는 ANOVA로 결정되었다. P < 0.05은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

실험결과

pFTP의 합성 및 고리화(cyclization)

다가성(multivalency)은 전체적인 활성을 증가시켜 수용체에 대한 리간드 내 추가적인 결합 친화도를 부여하는 중요한 특징이다. FTP의 결합가(valency) 및 결합 친화도를 증가시키기 위해, 본 발명자들은 펩타이드를 중합시켰다. FTP 펩타이드 내 시스테인 잔기의 존재는 DMSO-기반 FTP의 중합 반응을 용이하게 실시할 기회를 제공하였다(도 5a). 합성된 펩타이드들의 분자량은 MALDI-TOF를 이용하여 결정되었다(도 5b). 30% DMSO의 존재 하에서 실시된 펩타이드 중합 반응에서 나타난 결과들은 모노머(단일 FTP 펩타이드, 약 1.07 kDa)부터 펜타머(5개의 FTP 펩타이드, 약 5.2 kDa)까지 다른 크기의 폴리펩타이드들을 초래했다. 상기 합성된 펩타이드들은 크기 적으로 유의하게 더 컸기 때문에 펩타이드의 중합을 확인시켜 주었으며, 원형(original) FTP와 비교하여 더 높은 결합가를 가진다는 것을 간접적으로 보여준다. 더 많은 결합가를 가지는 폴리펩타이드들을 유지하기 위해, 본 발명자들은 3.5 kDa 분자량 컷-오프를 가지는 투석 백을 이용한 투석을 통해 더 작은 모노머, 다이머 그리고 대부분의 트리머 펩타이드들도 제거하였다. 더 작은 양의 트리머 펩타이드와 함께 많은 양의 펜타머 펩타이드의 존재를 확인하기 위해 최종적으로 얻어진 펩타이드들을 MALDI-TOF로 다시 한번 분석하였다(도 5b). 상기 투석된 폴리 FTP(pFTP)가 본 연구에서의 모든 실험들에 이용되었다.

산화적 DMSO-매개된 중합 반응을 통해 얻어진 펩타이드의 고리화(cyclization)는 DTNB(엘만 시약)를 이용하여 테스트하였다. DTNB 반응은 약15-20% 자유 티올기의 존재를 나타냈는데, 이는 펩타이드의 나머지 80-85%가 고리 형태라는 것을 의미한다(도 5c). 따라서, 상술한 결과들은 FTP 펩타이드들이 폴리 FTP(pFTP)로 성공적으로 전화되어 천연 상태에서 고리 형태로 존재한다는 것을 명확하게 보여준다.

FTP와 pFTP의 결합 친화도 비교

FTP보다 5배 높은 결합가(Fas 또는 FasL 결합 에피토프)를 가진 pFTP는 결합 활성(avidity)으로 인해 Fas 및 FasL 분자 모두에 대해 증가된 친화도를 가질 것으로 예측되었다. 이를 확인하기 위해, 본 발명자들은 SPR(surface plasmon resonance) 분석을 실시하여 Fas 및 FasL에 대한 FTP 및 pFTP의 결합 동력학(kinetics)을 조사하였다. FasL이 센서 칩에 고정화되고 다른 농도의 FTP 또는 pFTP가 표면에 처리되어 결합 동력학을 조사하였다. pFTP의 결합 상수(association constant, K_a) 및 해리 상수(dissociation constant, K_d)는 각각 2.1849×10³M^-1S^-1 및 4.7×10^-3S^-1이었고, FTP의 K_a 및 K_d는 각각 1.2440×10³M^-1S^-1 및 3.1×10^-3S^-1으로 계산되었다. 최종적으로, pFTP 및 FTP의 결합 친화도(binding affinity, K_D; K_d/K_a)는 각각 2.1 ± 8 μM 및 25.2 ± 4 μM이었다(도 6a).

본 발명자들은 Fas 수용체를 센서 칩에 고정화시키고 다른 농도의 pFTP 및 FTP를 처리하여 동력학을 조사함으로써 Fas 수용체에 대한 친화도를 테스트하였다. pFTP의 K_a 및 K_d는 각각 260×10³M^-1S^-1 및 1.5×10^-3S^-1이었고, FTP의 K_a 및 K_d는 각각 27×10³M^-1S^-1 및 1.6×10^-3S^-1으로 계산되었다. 최종적인 pFTP 및 FTP의 결합 친화도(K_D)는 각각 5.9 ± 10 μM 및 55 ± 4 μM이었다(도 6b).

pFTP의 해리 상수 뿐 아니라 결합 친화도는 상술한 결합 실험(Fas 또는 FasL)에서 FTP와 비교하여 보다 더 우수하였다.

pFTP와 FTP의 특징 비교

중합 반응을 통해 pFTP의 크기 및 분자량이 현저하게 증가된다. pFTP가 그 자체로 세포독성을 유도하는 지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 다른 양(100-1,000 μM)의 FTP 또는 pFTP으로 처리된 jurkat 세포에서 CCK-8 어세이를 실시하였다. FTP 또는 pFTP는 jurkat 세포에서 어떠한 세포독성을 나타내지 않았을 뿐 아니라 둘 간의 유의한 차이도 보이지 않았다(도 7a).

합성된 pFTP가 FTP의 기본 특징인 아팝토틱 억제를 가지는 지 여부를 확인하기 위해, 본 발명자들은 jurkat 세포에서 FasL-유도된 아팝토시스에 대한 억제능을 조사하였다. 아넥신 V 염색 결과는 pFTP가 막-결합된 FasL-유도된 아팝토시스를 70%까지 억제할 수 있고 상기 효과는 농도-의존적이라는 것을 보여줬다(도 7b 및 도 7c). pFTP가 더 높은 농도에서 더 우수한 억제 활성을 나타냈을 지라도(750 및 1,000 μM), FTP와 비교하여 pFTP-처리된 세포에서의 아팝토틱 억제는 100, 250 및 500 μM 농도에서 현저하게 더 높았지만(P < 0.01) 그 차이가 통계학적 분석을 통해 유의한 차이는 아닌 것으로 확인되었다. 종합해 보면, 상술한 결과들은 모노모 FTP의 활성과 비교하여 중합화(polymerization)는 pFTP의 아팝토틱 억제 활성에 영향을 미치는 것이 아니라 오히려 더 증가시킨다는 것을 의미한다.

pFTP에 의한 아팝토시스 억제 기작

FTP는 아팝토시스를 억제하는 독특한 경로를 가지는 매우 특이적인 펩타이드로, 세포 사멸과 연관되어 있는 ERK 시그널링 경로를 차단(81)하는 동시에 항-아팝토틱 구성요소들(components)의 조절과 관련되어 있는 NF-κB 경로를 활성화시킨다(82-84). 따라서, FTP는 관련 경로들의 선택적인 차단제 및 활성제이다(74). pFTP가 아팝토시스를 억제하는 기작을 조사하고 FTP의 독특한 특징을 보유하고 있는 지 여부를 테스트하기 위해, 본 발명자들은 jurkat 세포에서 ERK(ERK의 인산화) 및 NF-κB(IκB-α의 인산화) 시그널링 경로를 조사하였다. IκB-α의 일시적인 인산화를 유도하는 FTP(74)와는 달리, pFTP는 FasL의 존재 하에서 테스트된 시간 포인트(FasL 처리 후 0-120분)에서 IκB-α의 인산화를 유도하지 않았다(도 8a). 한편, pFTP는 테스트된 모든 시간 포인트(FasL 처리 후 0-120분)에서 ERK의 인산화를 현저하게 차단하였다(도 8b). 따라서, 상술한 결과들은 FTP의 특징과 비교하였을 때 pFTP는 차단제일 뿐이고 Fas-FasL 시스템과 관련된 경로를 촉발하는 것이 아니며 NF-κB 경로를 조절하는 FTP와 다르다는 것을 나타낸다(도 8c).

3T3-L1 성숙 지방세포에서 FasL-유발된 친-염증성 사이토카인의 억제

3T3-L1 성숙 지방세포에서 Fas-매개된 친-염증성 사이토카인 생산을 촉발하는 경로들이 아직까지 불분명하다. 하지만, 다른 인슐린 반응 조직들에서 비-아팝토틱 Fas 시그널링은 ERK, JNK 및 NF-κB 경로들을 활성화시킬 수 있다. 이에, 본 발명자들은 pFTP가 FasL-유발된 3T3-L1 성숙 지방세포에서 IL-8(KC; IL-8의 마우스 유사체), MCP-1 및 IL-6 같은 친-염증성 사이토카인의 생산을 차단할 수 있는 지 여부를 ELISA로 테스트하였다. 3T3-L1 성숙 지방세포에 막-결합된 FasL(2 ng/ml)의 12시간 처리는 친-염증성 사이토카인의 생산을 현저하게 유도하였다. IL-6 생산은 FasL 처리에 의해 약 3배 정도 증가(p<0.001)하였으나 pFTP-처리된 시료들에서는 유의하게 감소하였다(p<0.01). 사이토카인 생산의 억제는 pFTP 농도-의존적이었으며, 최대 80% 억제가 pFTP-처리된 시료들에서 관찰되었다(도 9a 및 도 9d). 선택적 차단제인 FTP-처리된 시료는 FasL-처리된 지방세포에서 IL-6 생산 억제를 나타내지 않았다. 더욱이, IL-8(KC) 및 MCP-1(각각, 약 1.8배 및 3.5배 증가) 같은 다른 사이토카인들의 생산도 Fas 처리에 의해 증가하였지만, pFTP-처리된 시료들에서는 뚜렷하게 감소하였다(도 9a 및 도 9b). 최대 75%의 IL-8 및 MCP-1 억제가 관찰되었고, 상기 억제는 pFTP 농도-의존적이었다. 스크램블 펩타이드 및 FTP는 지방세포에서 FasL-유도된 친-염증성 사이토카인들의 생산을 억제하지 못 했다. 상술한 데이터는 완벽한 차단제로서 pFTP가 FasL-처리된 성숙 지방세포에서 친-염증성 사이토카인 생산을 억제할 수 있는 반면에 선택적 차단제로서 FTP는 FasL-처리된 성숙 지방세포에서 염증성 사이토카인 생산을 억제할 수 없기 때문에, 지방세포에서 Fas-유도된 염증을 억제하는데 이용될 수 없다는 것을 보여준다. 이를 토대로, 본 발명자들은 이후 3T3-L1 성숙 지방세포(인 비트로) 실험 및 비만 마우스 모델에서 FasL-유도된 시그널들을 억제하기 위해 pFTP만을 사용하였다.

Fas-활성화된 지방세포에서 pFTP에 의한 PPARγ 및 Akt 발현 회복

3T3-L1 성숙 지방세포에서 Fas 활성화는 PPARγ의 감소를 통해 Akt의 세포내 함량을 하향-조절시킴으로써 인슐린 민감성을 왜곡시킨다. 성숙 지방세포에 FasL 처리는 PPARγ 레벨을 현저하게 하향-조절하였다. 즉, pFTP(500 μM) 처리된 시료를 이용한 웨스턴 블랏 분석은 FasL-처리된 시료들과 비교하여 PPARγ의 레벨이 뚜렷하게 더 높다는 것을 보여줬다. 상술한 결과들은 pFTP가 Fas 활성화를 억제하고 PPARγ 레벨을 회복시킨다는 것을 명확하게 보여준다(도 10a). PPARγ는 지방세포에 의한 인슐린-유도된 글루코오스 섭취(uptake)에서 핵심적인 연결점인 Akt의 발현에 매우 중요한 역할을 수행한다. 성숙 지방세포에 FasL 처리는 Akt 발현을 약 63%까지 유의하게 감소시켰지만, pFTP 처리(500 μM)는 FasL에 의한 Fas 활성화를 억제하였을 뿐 아니라 Akt 발현을 약 75%까지 현저하게 회복시켰다(p < 0.01; 도 10b). 따라서, 상기 데이터는 pFTP는 성숙 지방세포에서 Fas-매개된 염증 경로를 억제하는 것 이외에도 Fas-촉발된 인슐린 저항성에 관여하는 구성요소들 또는 분자들을 억제할 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 당업자는 Akt가 인슐린 민감성과 연관되어 있고 이의 하향-조절이 인슐린 시그널링을 손상시키기 때문에 pFTP가 성숙 지방세포에서 Akt 레벨을 회복시킴으로써 Fas-유도된 인슐린 저항성을 간접적으로 억제할 수 있다고 추론하여 결론지을 수 있다.

비만 마우스로부터 유래된 복강내 대식세포에서 FasL-촉발된 친-염증성 사이토카인 생산의 억제

비만 마우스의 지방 조직은 지방세포와 함께 침윤된 대식세포의 니케(niche)로서 기능하고 이들의 숫자는 마른 마우스와 비교하여 비만 마우스에서 현저하게 더 높다. 따라서, 비만 지방 조직에서 대식세포와 지방세포는 공존한다(co-exist). 이에, 본 발명자들은 비만 마우스-유래된 복강내 대식세포에서 FasL 효과와 Fas 활성화에 의한 염증성 사이토카인 생산을 조사하였다. 지방세포와 유사하게도, Fas 활성화는 대식세포에서 아팝토시스를 유도하는 것이 아니라 염증성 사이토카인 생산을 촉발하였다. 본 발명자들은 막-결합된 FasL(10 ng/ml)을 복강내 대식세포에 처리하는 경우에 비만 조건에서 항상 증가하고 인슐린 저항성 및 제2형 당뇨병과 관련되어 있는 TNF-α, IL-1β 및 MCP-1의 발현이 증가한다는 것을 발견하였다. TNF-α 레벨은 대조군 세포와 비교하여 의미있게 증가(250 ± 37 pg/ml; p < 0.01)하였지만, pFTP-처리된 시료에서는 현저하게 감소하였다(도 11). 또한, IL-8(KC) 및 IL-1β의 생산도 FasL-처리된 시료에서 뚜렷하게 증가하였고 pFTP 처리에 의해 감소하였다(도 11). 사이토카인 생산의 억제는 pFTP 농도-의존적이었다. FasL-촉발된 사이토카인 생산의 최대 70-80% 억제가 pFTP 처리에 의해 관찰되었고 동시에 스크램블 펩타이드(scrFTP) 처리구에서는 억제 효과가 관찰되지 않았다. 상술한 결과들은 완벽한 차단제로서 pFTP가 성숙 지방세포에서 친-염증성 사이토카인 생산을 억제할 뿐 아니라 비만 마우스-유래된 복강내 대식세포에서도 사이토카인 생산을 효과적으로 억제한다는 것을 의미한다.

비만 마우스에서 알렉사-488 표지된 pFTP의 생체-분포(bio-distribution)

pFTP가 성숙 지방세포 뿐 아니라 대식세포에서 Fas 활성화를 억제할 수 있다는 사실을 확인한 후, 본 발명자들은 HFD-유도된 비만 마우스에서 비만-관련된 동반상병들에 대한 pFTP의 항-Fas 치료학적 효능을 테스트하였다. 이를 위한 예비 단계로서, 본 발명자들은 비만 마우스의 다양한 기관에서 pFTP 위치(localization)를 조사하였다. 비만 마우스에 500 μg의 알렉사-488 표지된 pFTP의 정맥 내 주입은 pFTP가 지방 조직 및 간에서 많은 부분이 축적되고 작은 양이 폐에서도 관찰된다는 것을 나타냈다. 한편, 스크램블 FTP(scrFTP)는 지방 조직에서 매우 소량으로 침착되었다(도 12a). 상기 펩타이드가 지방 조직에 위치할 지라도 pFTP의 세포 표면 결합을 확인하고 pFTP가 상호작용하는 세포 타입을 결정하기 위해, 본 발명자들은 지방 조직 절편 연구들(sectioning studies)을 실시하였다. Fas 및 FasL이 염증 및 인슐린 저항성에 광범위하게 포함된 지방세포 및 침윤된 지방 조직 대식세포(ATMs) 모두에서 발현되기 때문에, 본 발명자들은 pFTP가 상기 세포들과 상호작용하는 지 여부를 체크하였다. 형광 현미경 결과들은 pFTP가 커다란 반지-형태(signet-ring shaped) 백색 지방세포에 뚜렷하게 결합한다는 것을 나타냈고, 이는 지방세포 표면에서의 pFTP와 Fas의 상호작용을 의미한다(도 12b). 또한, 지방 조직 절편에서 scrFTP의 존재 또는 결합을 조사한 경우에 본 발명자들은 펩타이드 결합의 존재 또는 세포들과의 상호작용을 검출하지 못 했다. 둘째로, 본 발명자들은 pFTP가 지방 조직 대식세포에서도 Fas/FasL과 상호작용하는 지 여부를 확인하고자 하였다. 이에, 본 발명자들은 지방조직 대식세포를 상업적으로 이용가능한 CD11b-PE 항체로 염색하고 알렉사-488 표지된 pFTP의 존재를 조사하였다. 형광 현미경 분석을 통해, 본 발명자들은 pFTP가 지방 조직 대식세포와도 결합할 수 있다는 것을 확인하였다(도 12c).

비만-관련된 합병증들의 병인학에 포함된 대부분의 중요 세포들과의 pFTP 간의 상호작용을 보여주는 상술한 결과들을 토대로, 본 발명자들은 지방세포 및 ATMs에서 Fas 활성을 억제하는 것이 비만-관련된 염증, 인슐린 저항성 및 지방간에 대한 치료학적 효과를 가진다는 가설을 세우고 테스트하였다.

pFTP-처리된 비만 마우스에서의 염증 프로파일

비만이 증대된 염증 경로들과 관련되어 있고, 이에 따라 증가된 염증성 사이토카인 생산을 초래한다는 것을 고려해볼 때, 본 발명자들은 비만-관련된 염증 경로들 및 결과적인 사이토카인의 생산량에 대한 pFTP 처리 효과를 조사하였다(도 13a). pFTP 펩타이드 처리는 지방 조직에서 현저하게 약화된 염증성 시그널링을 나타냈다. JNK(Jun-NH₂ terminal kinase), p38 MAPK(mitogen activated protein kinase) 및 NF-κB(p65 nuclear factor-κB)의 인산화는 대조군 및 스크램블 펩타이드 처리와 비교하여 pFTP-처리된 비만 지방 조직에서 감소하였다(도 14a). 예상한 바와 같이, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8(KC) 및 MCP-1 같이 관련 염증성 사이토카인들의 유전자 발현이 pFTP-처리 그룹에서 현저하게 감소하였다(도 14a). 상술한 데이터를 확증하기 위해, M1 타입 대식세포(CD11c), CCR5⁺(CCR5) 및 Mac-3⁺ 대식세포 같은 침윤된 면역세포 마커들 및 일반적인 백혈구(CD11b)의 발현 레벨이 pFTP-처리된 그룹들에서 감소하였다(도 14b). 흥미롭게도, 대조군 또는 스크램블 펩타이드 처리와 비교하여 pFTP-처리된 그룹들에서 CD11c, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 같은 유전자 발현과 관계된 M1 타입 대식세포는 현저하게 감소하였고, IL-10 및 아르기나제(arginase)-1 같은 유전자 발현과 관련된 M2 타입 대식세포는 증가되었다(도 14a 및 도 14b).

pFTP-처리된 비만 마우스에서 개선된 인슐린 시그널링

인슐린 시그널은 다운스트림 타겟인 Akt의 인산화를 통해 전달된다. 3T3-L1 지방세포에서의 인 비트로 결과들을 토대로, Fas 활성화는 PPARγ의 하향-조절을 통해 세포 내 인산화된 Akt 및 총 Akt 함량 모두의 감소를 유도하여 인슐린 시그널링을 손상시킨다. 본 발명자들의 인 비트로 결과들과 같은 맥락으로, 본 발명자들은 pFTP 처리가 비만 마우스의 지방 조직에서 PPARγ 레벨을 개선시킨다는 것을 발견하였다(도 15a). 또한, PPARγ 레벨 이외에도 Akt 레벨의 인슐린-촉발된 인산화가 대조군과 비교하여 pFTP-처리된 그룹에서 뚜렷하게 증가되었다(도 15b).

pFTP는 Fas 활성화에 의해 염증-민감화된 3T3-L1 성숙 지방세포 아팝토시스를 억제한다

인 비보 비만 상태에서 지방세포와 대식세포는 지방 조직에서 공존하고 대식세포는 염증 조건의 발생에 중요한 역할을 한다. 3T3-L1 성숙 지방세포에 대한 염증 효과를 조사하기 위해, 본 발명자들은 상기 조건을 모방하기 위해 Raw264.7 세포(대식세포주; Raw-CM)으로부터 LPS-유도된 염증성 사이토카인 조건 배지를 제조하였다. 20% Raw-CM 단독 처리는 절단된 카스파제-3 레벨을 유의하게 유도하지 않았지만 Raw-CM에 FasL을 추가하면 12시간 만에 절단된 카스파제-3 레벨을 현저하게 증가시켰다(도 16a). 또한, Raw-CM과 FasL의 처리는 12시간 후에 약 25% 정도 세포 생존률을 감소시켰다(도 16b). 종합해 보면, 상술한 데이터는 3T3-L1 성숙 지방세포에서 Fas 활성화가 아팝토시스를 유도하지 않을 지라도 염증 조건이 세포를 민감화시켜 Fas 활성화에 따라 아팝토시스에 직면하게 한다는 것을 명확하게 제시한다.

둘째로, 본 발명자들은 pFTP가 염증 조건 하에서 FasL-유도된 아팝토시스를 차단할 수 있는 지 여부를 조사하였다. 염증 조건(Raw-CM) 하에서 FasL과 pFTP(500 M)의 공동 처리는 절단된 카스파제-3 생성을 억제하였고 세포 생존률을 현저하게 개선시켰다. 그리고, Fas 활성화 및 아팝토시스의 역할을 보다 특이적으로 결정하기 위해, 본 발명자들은 FasL(10 ng/ml)로 복막-유래된 대식세포를 자극하여 염증 조건을 유발시켜 제조된 20% 조건 배지를 이용하여 FasL(2 ng/ml) 처리된 3T3-L1 성숙 지방세포 아팝토시스 상의 효과를 테스트하였다. 아넥신 V 염색 결과들은 약 3.5배 증가된 아팝토시스 결과를 나타냈고 상기 증가는 pFTP가 처리된 경우에 현저하게 억제되었다(도 16c).

종합해 보면, 상술한 데이터는 Fas 활성화가 지방세포에서 염증 환경의 발생에 포함될 뿐 아니라, 아팝토시스를 유도하는 조건을 이용한다는 것을 확실하게 지시한다.

pFTP-처리된 비만 마우스의 지방 조직에서 아팝토시스의 억제

지방세포의 아팝토시스는 염증, 인슐린 저항성 및 지방간 사이의 연결점이기 때문에, 아팝토시스의 억제는 매우 유익할 것이다. 염증-민감화된 지방세포의 아팝토시스에 포함된 Fas 기능과 관련하여, 본 발명자들은 pFTP가 아팝토틱 억제 효과를 가지는 지 여부를 테스트하였다. 또한, TNF-α와 IFN-γ는 개별적으로 또는 조합하여 지방세포를 Fas-매개된 아팝토시스에 민감화시킬 수 있다. 정량적 실-시간(quantitative real-time) PCR 결과에 따르면, 동일한 주령의 마른 마우스 그룹과 비교하여 비만 마우스 그룹의 지방 조직에서 TNF-α 및 IFN-γ의 발현이 증가하였다(도 17a). TNF-α 레벨이 pFTP-처리된 마우스의 지방 조직에서 측정된 경우에, mRNA 레벨이 대조군 또는 스크램블 펩타이드-처리된 그룹과 비교하여 약 40% 정도 감소하였다. 하지만, IFN-γ 레벨은 대조군, scrFTP-처리된 비만 마우스 그룹 또는 pFTP-처리된 비만 마우스 그룹 간에 어떠한 차이도 없었다(도 17a). 아팝토시스의 양을 동정하고 정량하기 위해, 본 발명자들은 다른 동물 그룹들로부터 유래된 지방 조직 표본에서 TUNEL 어세이를 실시하였다. 정성적 결과(TUNEL-양성 세포의 현미경 사진) 및 정량적 결과(10개의 필드 당 TUNEL-양성 세포의 수) 모두 pFTP-처리된 그룹의 아팝토시스가 명확하게 감소(p<0.05)하였음을 보여주었다. TUNEL-양성 세포들의 정량은 대조군과 비교하여 pFTP-처리된 그룹에서 20 ± 4.7% 감소를 나타냈다(도 17b). pFTP-처리된 시료의 아팝토시스 상의 감소를 추가적으로 확인하기 위해, 본 발명자들은 아팝토틱 시그널의 중요 이펙터(effector)인 카스파제-3의 활성화 레벨을 조사하였다. TUNEL 어세이 결과들과 일치하게도, 웨스턴 블랏을 통한 절단된 카스파제-3의 밀도계측 분석은 대조군 또는 스크램블 펩타이드 처리와 비교하여 pFTP-처리된 그룹에서 아팝토시스의 유의한 억제(25 ± 7.4%)가 확인되었다(도 17c).

지방세포의 아팝토시스는 대식세포의 침윤 및 죽은 지방세포 주위에 형성되는 CLS(crown like structurs)와 연관되어 있다. 죽은 지방세포의 수가 증가함에 따라 CLS 수도 증가한다. 이에, 본 발명자들은 3개의 그룹으로부터 얻어진 지방 조직 표본들의 CLS에서 대식세포 특이적 F4/80 항체를 이용한 면역조직화학 분석을 실시하여 CLS의 수를 측정하였다. pFTP-처리된 그룹에서 F4/80-양성 CLS 수는 대조군 그룹보다 더 적은 21 ± 6.3%였다(도 17d).

지방세포에서 pFTP에 의한 Fas 활성화 차단은 염증성 회로(circuits)를 간섭하여 전신성 인슐린 저항성을 억제한다

다음으로, 본 발명자들은 지방 조직에서 염증 로드의 감소와 함께 확인된 염증 시작점으로서의 지방 조직에서 전신성 염증 레벨 및 대사 변수들과 관련된 효과를 평가하였다. 지방 조직에서 사이토카인 생산의 현저한 감소는 전신성 레벨에서도 반영되었다. pFTP 처리하고 5주 후, 본 발명자들은 IL-6, IL-8(KC) 및 MCP-1의 순환(circulatory) 레벨이 대조군과 비교하여 각각 약 26 ± 4%, 30 ± 6% 및 34 ± 6% 정도 감소한다는 것을 발견하였다(도 18).

또한, 대사 변수들이 pFTP-처리된 그룹에서 개선되었다. 전신성 단식 인슐린(systemic fasting insulin; 28 ± 3%) 및 FFA(30 ± 7%) 레벨도 현저하게 감소하였으며 트리글리세라이드 레벨은 어느 정도 감소하였음을 확인하였다(각각, 도 19b, 도 19c 및 도 19d). 더욱이, ipGTT 결과들은 HFD-유도된 글루코오스 과민성이 pFTP 처리에 의해 약화된다는 것을 나타냈다(도 19a). 따라서, pFTP 처리는 전신성 염증 및 지질 프로파일의 감소를 초래하였고 HFD-유도된 비만 마우스에서 인슐린 민감성 및 글루코오스 과민성을 개선시켰다.

pFTP-처리된 비만 마우스에서 지방간의 개선

간 인슐린 저항성 및 지방간과 관련된 주요 후보물질은 IL-6과 FFA이다. 전신성 FFA 함량과 함께 IL-6 레벨의 전신성 지방 조직에서의 감소에 따라, 본 발명자들은 pFTP-처리된 마우스에서 간 상태를 체크하였다. 간 표본들에 대한 H&E 염색 현미경 사진은 지질 축적의 뚜렷한 감소를 나타냈다(도 20a). 또한, 간의 총 트리글리세라이드 함량도 현저하게 감소하였다(도 20b).

체중 및 음식물 섭취에 있어서 지방 조직에서 Fas 억제 효과

마우스를 4-5주의 pFTP 처리 기간을 포함하여 13주 동안 HFD 식이시킨 후, 본 발명자들은 pFTP에 의한 Fas 억제에 따른 염증 감소가 대조군 또는 스크램블 펩타이드 처리 그룹과 비교하여 체중은 약 10% 정도 줄었으나 음식물 섭취를 유의하게 변화시키지 않는다는 것을 확인하였다(도 21a 내지 도 21c).

결론

결론적으로, 본 발명자들의 실험 결과들은 가치있는 데이터 파일을 제공함으로써 Fas(CD95)가 비만-관련된 염증에서 중추적인 역할을 수행한다는 개념을 강화시킨다. 또한, Fas가 매우 우수한 치료학적 타겟이라는 가설을 통합하고 이에 대한 증거로서 본 발명자들은 지방 조직 내 지방세포 및 침윤된 대식세포에서 Fas 시그널링의 불활성화는 비만-관련된 동반상병들을 개선시킨다는 것을 보인다. 상기 과정에서, 본 발명자들은 강력한 Fas 억제제인 폴리 FTP를 개발하였는데, 상기 억제제는 염증, 인슐린 저항성 및 지방간 같은 HFD-유도된 비만 관련된 합병증들을 약화시킨다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 일 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> Cyclized poly Fas Targeting Peptides and Uses Thereof <130> PN130332 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fas Targeting Peptide <400> 1 Tyr Cys Asp Glu His Phe Cys Tyr 1 5

Claims

FTP(Fas targeting peptide)가 고리화(cyclization)된 환형 폴리 FTP(cyclized poly Fas targeting peptide)로서, 상기 환형 폴리 FTP는 서열목록 제1서열로 이루어진 FTP 5개의 고리화로 이루어진 것이고, Fas(fatty acid synthase) 또는 FasL(Fas ligand)과 결합(interaction)하는 것을 특징으로 하는 환형 폴리 FTP.
제 1 항에 있어서, 상기 고리화는 하나의 FTP 내 시스테인 잔기가 다른 FTP 내 시스테인 잔기와 이황화 결합을 통해 연결되어 형성되는 것을 특징으로 하는 환형 폴리 FTP.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 환형 폴리 FTP의 Fas 또는 FasL에 대한 결합 상수(association constant, K_a)는 모노머(monomeric) FTP의 Fas 또는 FasL에 대한 결합 상수보다 2배 이상 높은 것을 특징으로 하는 환형 폴리 FTP.
제 1 항에 있어서, 상기 환형 폴리 FTP의 Fas 또는 FasL에 대한 해리 상수(dissociation constant, K_d)는 모노머 FTP의 Fas 또는 FasL에 대한 결합 상수보다 1.5배 이상 높은 것을 특징으로 하는 환형 폴리 FTP.
제 1 항에 있어서, 상기 환형 폴리 FTP의 Fas 또는 FasL에 대한 결합 친화도(binding affinity, K_D)는 모노머 FTP의 Fas 또는 FasL에 대한 결합 친화도보다 10배 이상 높은 것을 특징으로 하는 환형 폴리 FTP.
제 1 항에 있어서, 상기 환형 폴리 FTP는 Fas-유도된 아팝토시스(apoptosis)를 억제하는 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 환형 폴리 FTP.
제 7 항에 있어서, 상기 Fas-유도된 아팝토시스(apoptosis)는 지방세포 또는 지방 조직의 대식세포(adipose tissue macrophages, ATMs)에서 일어나는 것을 특징으로 하는 환형 폴리 FTP.
제 1 항에 있어서, 상기 환형 폴리 FTP는 ERK(extracellular signal-regulated kinase) 시그널링 경로를 차단하는 것을 특징으로 하는 환형 폴리 FTP.
제 1 항에 있어서, 상기 환형 폴리 FTP는 Fas-유도된 친-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인 및 케모카인(chemokine)의 생산을 억제하는 것을 특징으로 하는 환형 폴리 FTP.
제 10 항에 있어서, 상기 Fas-유도된 친-염증성 사이토카인 및 케모카인은 TNF(tumor necrosis factor)-α, iNOS(inducible NO synthase), IL(interleukin)-1β, IL-6, IL-8 또는 MCP(monocyte chemotatic protein)-1인 것을 특징으로 하는 환형 폴리 FTP.
제 1 항에 있어서, 상기 환형 폴리 FTP는 M1 타입 대식세포를 감소시키고 M2 타입 대식세포를 증가시키는 것을 특징으로 하는 환형 폴리 FTP.
제 1 항에 있어서, 상기 환형 폴리 FTP는 Fas-촉발된 인슐린 저항성을 억제하는 것을 특징으로 하는 환형 폴리 FTP.
(a) 제 1 항, 제 2 항 및 제 4 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 환형 폴리 FTP(cyclized poly Fas targeting peptide)의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 염증, 인슐린 저항성, 글루코오스 과민성, 제2형 당뇨병, 및 지방간으로 구성된 군으로부터 선택되는 비만-유발 질환의 개선 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 14 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 JNK(Jun-NH₂ terminal kinase), p38 MAPK(mitogen activated protein kinase) 또는 NF-κB(p65 nuclear factor-κB)의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 14 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 CD11c, CCR5 또는 CD11b의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 14 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 아르기나제(arginase)-1 또는 IL-10의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 14 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma) 또는 포스포-Akt(phospho-Akt)의 세포내 레벨을 증가시키는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 14 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 Fas-유도된 절단 카스파제(cleaved capase)-3의 형성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 14 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 CLS(crown like structure)의 형성을 억제하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제 14 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 혈청 FFA(free fatty acids), 지질 축적(lipid accumulation) 또는 트리글리세라이드(triglyceride) 함량을 감소시키는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
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