CN108076629A

CN108076629A - 一种用于治疗、预防或改善主动脉病的gm-csf负调节剂

Info

Publication number: CN108076629A
Application number: CN201680018300.XA
Authority: CN
Inventors: 铃木亨
Original assignee: University of Leicester
Current assignee: University of Leicester
Priority date: 2015-02-25
Filing date: 2016-02-19
Publication date: 2018-05-25
Anticipated expiration: 2036-02-19
Also published as: US20180028613A1; AU2016225276A1; US10933119B2; GB201503139D0; CN108076629B; JP2018512389A; EP3261660A2; JP6683723B2; AU2016225276B2; WO2016135456A2; WO2016135456A3; GB201513390D0; EP3261660B1; CA2977594A1

Abstract

本发明涉及主动脉病，并且具体来说，涉及用于诊断和治疗主动脉病的组合物和方法。

Description

一种用于治疗、预防或改善主动脉病的GM-CSF负调节剂

技术领域

背景技术

主动脉病指的是主动脉的疾病。主动脉夹层和壁内血肿包括涉及主动脉壁分离的潜在危急生命的主动脉病(1-6)。这两种病况的区别在于主动脉内膜的撕裂，这存在于前者经典形式的主动脉夹层中，造成血液流入主动脉壁中，而不存在于伴有局限于主动脉壁内的出血的后者形式的壁内血肿中。这种主动脉病目前被理解成一种连续体，其中后者是前者的变异和前兆病况(7-9)。在过去十年中已经在对遗传学基础(例如ACTA2)(10,11)、临床/流行病学方面(例如IRAD)(4,5)以及生物化学方法(例如平滑肌生物标志物)(5,6)的了解方面取得了进展，但是基础机制仍不清楚，这大部分是因为缺乏可靠的动物模型。

在了解主动脉疾病的机制方面的最新进展源于对遗传学上脆性的马凡氏(Marfan)主动脉的标志性研究，所述研究已经证实TGFβ和它的下游细胞内激酶信号转导通路在发病机制中起核心作用(12-14)。相反，炎症通路被认为是在典型的老年患者中所看到的动脉粥样硬化/退行性主动脉中主动脉病况的一个主要的组成部分(15,16)。这些不同的主动脉病况在机制以及基础过程的相对影响方面的共性和差异才刚刚开始被揭示。

因此需要提供用于诊断和治疗主动脉病的改进的组合物和方法。

发明内容

在本研究中，本申请的发明人试图阐明主动脉夹层/壁内血肿的基础机制以及了解所述病况的触发机制。Krüppel样因子6(KLF6)是一种转录因子，它已经被证实在巨噬细胞中稳固地表达(17)，并且调节包括肝(18)、肾(19)以及心脏(D.S.，未公开数据)在内的多种器官的炎症性纤维化疾病。本申请的发明人假设这种因子可能调节构成主动脉疾病的基础的致病机制，并且观测到当经受主动脉炎症时，巨噬细胞中的KLF6有缺陷的小鼠表现出主动脉夹层/壁内血肿。

惊人的是，本申请的发明人发现炎性细胞因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)在这种病况的发病中起核心作用。此外，施用针对GM-CSF的中和抗体惊人地防止了这些小鼠中的病况。相反，向野生型小鼠施用细胞因子与主动脉炎症的组合足以诱发所述病况，这表明了一般作用。在临床上，患有主动脉夹层的患者显示出所述细胞因子的循环水平升高，所述细胞因子也在夹层的主动脉中表达。GM-CSF因此是导致主动脉夹层/壁内血肿的关键调节分子，并且拮抗这种细胞因子将引起治疗利用(例如使用GM-CSF拮抗剂的主动脉稳定)。GM-CSF也用作诊断性生物标志物。

因此，根据本发明的第一个方面，提供了一种粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)负调节剂，所述调节剂用于治疗、预防或改善主动脉病。

在第二个方面，提供了一种在受试者中治疗、预防或改善主动脉病的方法，所述方法包括向需要这样的治疗的受试者施用治疗有效量的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)负调节剂。

优选的是，所述GM-CSF负调节剂用于治疗、预防或改善选自由以下各项组成的组的主动脉病性病况：主动脉夹层；主动脉壁内血肿进展或复发；主动脉瘤扩大、炎症和/或破裂；以及主动脉炎(即主动脉炎症)。在一个实施方案中，所述GM-CSF负调节剂可以用于维持治疗以在已经接受急性主动脉夹层的初次手术修正的受试者中预防复发性主动脉夹层。在另一个实施方案中，所述GM-CSF负调节剂可以用于维持治疗以在患有慢性主动脉夹层，即腹部夹层的受试者中预防主动脉夹层进展，其中手术是不太有利的，这是因为截瘫风险较高。

粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或集落刺激因子2(CSF2)是由巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、NK细胞、内皮细胞以及成纤维细胞分泌的单体糖蛋白并且充当细胞因子。它是一种白细胞生长因子，并且GM-CSF经由信号转导和转录激活因子STAT5和STAT3进行信号转导。人类GM-CSF的DNA序列(基因库号：NC_000005.10)的一个实施方案在本文作为SEQID No:1提供，如下所示：-

ACACAGAGAGAAAGGCTAAAGTTCTCTGGAGGATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCTGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCAGCACGCAGCCCTGGGAGCATGTGAATGCCATCCAGGAGGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTAGAGACACTGCTGCTGAGATGGTAAGTGAGAGAATGTGGGCCTGTGCCTAGGCCACCCAGCTGGCCCCTGACTGGCCACGCCTGTCAGCTTGATAACATGACATTTTCCTTTTCTACAGAATGAAACAGTAGAAGTCATCTCAGAAATGTTTGACCTCCAGGTAAGATGCTTCTCTCTGACATAGCTTTCCAGAAGCCCCTGCCCTGGGGTGGAGGTGGGGACTCCATTTTAGATGGCACCACACAGGGTTGTCCACTTTCTCTCCAGTCAGCTGGCTGCAGGAGGAGGGGGTAGCAACTGGGTGCTCAAGAGGCTGCTGGCCGTGCCCCTATGGCAGTCACATGAGCTCCTTTATCAGCTGAGCGGCCATGGGCAGACCTAGCATTCAATGGCCAGGAGTCACCAGGGGACAGGTGGTAAAGTGGGGGTCACTTCATGAGACAGGAGCTGTGGGTTTGGGGCGCTCACTGTGCCCCGAGACCAAGTCCTGTTGAGACAGTGCTGACTACAGAGAGGCACAGAGGGGTTTCAGGAACAACCCTTGCCCACCCAGCAGGTCCAGGTGAGGCCCCACCCCCCTCTCCCTGAATGATGGGGTGAGAGTCACCTCCTTCCCTAAGGCTGGGCTCCTCTCCAGGTGCCGCTGAGGGTGGCCTGGGCGGGGCAGTGAGAAGGGCAGGTTCGTGCCTGCCATGGACAGGGCAGGGTCTATGACTGGACCCAGCCTGTGCCCCTCCCAAGCCCTACTCCTGGGGGCTGGGGGCAGCAGCAAAAAGGAGTGGTGGAGAGTTCTTGTACCACTGTGGGCACTTGGCCACTGCTCACCGACGAACGACATTTTCCACAGGAGCCGACCTGCCTACAGACCCGCCTGGAGCTGTACAAGCAGGGCCTGCGGGGCAGCCTCACCAAGCTCAAGGGCCCCTTGACCATGATGGCCAGCCACTACAAGCAGCACTGCCCTCCAACCCCGGTGAGTGCCTACGGCAGGGCCTCCAGCAGGAATGTCTTAATCTAGGGGGTGGGGTCGACATGGGGAGAGATCTATGGCTGTGGCTGTTCAGGACCCCAGGGGGTTTCTGTGCCAACAGTTATGTAATGATTAGCCCTCCAGAGAGGAGGCAGACAGCCCATTTCATCCCAAGGAGTCAGAGCCACAGAGCGCTGAAGCCCACAGTGCTCCCCAGCAGGAGCTGCTCCTATCCTGGTCATTATTGTCATTATGGTTAATGAGGTCAGAGGTGAGGGCAAACCCAAGGAAACTTGGGGCCTGCCCAAGGCCCAGAGGAAGTGCCCAGGCCCAAGTGCCACCTTCTGGCAGGACTTTCCTCTGGCCCCACATGGGGTGCTTGAATTGCAGAGGATCAAGGAAGGGAGGCTACTTGGAATGGACAAGGACCTCAGGCACTCCTTCCTGCGGGAAGGGAGCAAAGTTTGTGGCCTTGACTCCACTCCTTCTGGGTGCCCAGAGACGACCTCAGCCCAGCTGCCCTGCTCTGCCCTGGGACCAAAAAGGCAGGCGTTTGACTGCCCAGAAGGCCAACCTCAGGCTGGCACTTAAGTCAGGCCCTTGACTCTGGCTGCCACTGGCAGAGCTATGCACTCCTTGGGGAACACGTGGGTGGCAGCAGCGTCACCTGACCCAGGTCAGTGGGTGTGTCCTGGAGTGGGCCTCCTGGCCTCTGAGTTCTAAGAGGCAGTAGAGAAACATGCTGGTGCTTCCTTCCCCCACGTTACCCACTTGCCTGGACTCAAGTGTTTTTTATTTTTCTTTTTTTAAAGGAAACTTCCTGTGCAACCCAGATTATCACCTTTGAAAGTTTCAAAGAGAACCTGAAGGACTTTCTGCTTGTCATCCCCTTTGACTGCTGGGAGCCAGTCCAGGAGTGAGACCGGCCAGATGAGGCTGGCCAAGCCGGGGAGCTGCTCTCTCATGAAACAAGAGCTAGAAACTCAGGATGGTCATCTTGGAGGGACCAAGGGGTGGGCCACAGCCATGGTGGGAGTGGCCTGGACCTGCCCTGGGCCACACTGACCCTGATACAGGCATGGCAGAAGAATGGGAATATTTTATACTGACAGAAATCAGTAATATTTATATATTTATATTTTTAAAATATTTATTTATTTATTTATTTAAGTTCATATTCCATATTTATTCAAGATGTTTTACCGTAATAATTATTATTAAAAATATGCTTCTACTTG

[SEQ ID No:1]

人类GM-CSF的蛋白质序列(基因库号：AAA52578.1；144个氨基酸)的一个实施方案在本文作为SEQ ID No:2提供，如下所示：-

MWLQSLLLLGTVACSISAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE

[SEQ ID No:2]

如实施例3中所述并且如图3a、图3b、以及图10a中所示，与对照巨噬细胞相比，在源自于KLF6fl/fl；LysM Cre小鼠的骨髓的巨噬细胞中，GM-CSF水平显示出响应于AngII刺激的最大增加。在施用CaCl₂和输注AngII的实验条件下，从KLF6fl/fl；LysM Cre小鼠的主动脉获得的巨噬细胞显示出GM-CSF表达显著增加，并且在源自于这些小鼠的骨髓的巨噬细胞中，也是如此。此外，如实施例4中所述并且如图4中所示，使用中和抗体阻断了GM-CSF的作用，除了IL-6的血清水平之外，所述中和抗体还消除了主动脉夹层/壁内血肿(图4a、图4b)以及GM-CSF受体α、MMP9、F4/80和IL-6的表达。GM-CSF因此是为KLF6fl/fl；LysM Cre小鼠中的主动脉表型所需的。如表4中所示，当GM-CSF被中和抗体耗尽时，循环粒细胞和淋巴细胞的数目不受影响。因此，基于这些结果，对GM-CSF进行操作在本模型中不影响循环白细胞的数目，至少在观测期(14天)期间是这样的。

因此，在一个实施方案中，所述GM-CSF负调节剂可以被配置成：-

(i)改变用于实现GM-CSF信号转导的GM-CSF受体或信号转导分子的构象状态，这是例如通过使该巨噬细胞受体的活性构象不稳定和/或将所述受体维持在它的无活性构象，从而防止它结合它的天然配体，即GM-CSF来实现的；

(ii)与用于实现GM-CSF信号转导的GM-CSF受体结合并且防止、减少或削弱该受体处的传递；

(iii)将由所述负调节剂与GM-CSF受体、或与GM-CSF本身结合所激活的下游信号转导通路下调或去激活；

(iv)减少、防止或削弱GM-CSF的转录、翻译或表达；

(v)抑制GM-CSF的合成或从细胞内储备的释放；和/或

(vi)增加GM-CSF的降解速率。

应当了解的是，机制(i)至(vi)中的每一种均引起涉及GM-CSF的受体/信号转导分子处的传递和其活性的降低，从而负调节GM-CSF信号转导。用于GM-CSF信号转导的受体也被称为分化簇116，即CD116。它是由α链和β链构成的异二聚体。α亚基含有GM-CSF的结合位点，并且β链参与信号转导。这两个亚基的缔合引起受体激活。

在一个优选的实施方案中，所述负调节剂包含抗GM-CSF抗体或其抗原结合片段。应当了解的是，抗GM-CSF抗体是本领域技术人员公知的并且是可商购获得的，例如可商购自R&D系统公司(R&D Systems)或圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology,Inc.)。在一个实施方案中，抗GM-CSF抗体(如实施例中所用)是小鼠GM-CSF抗体(单克隆大鼠IgG2A克隆#MP122E9；目录号：MAB415，可获自R&D系统公司)。在另一个实施方案中，所述抗GM-CSF抗体是目录号：sc-377039(来自圣克鲁斯生物技术公司)。尽管抗GM-CSF抗体是已知的并且用于治疗类风湿性关节炎，但是完全意外的是，这样的抗GM-CSF抗体还可以用于治疗主动脉病和本文所述的相关疾病。

优选的是，所述抗GM-CSF抗体或其抗原结合片段特异性结合SEQ ID No:2或其变体或片段。

由来自R&D系统公司的GM-CSF抗体识别的表位是未知的。然而，来自圣克鲁斯公司的GM-CSF抗体(目录号：sc-377039)结合人类来源的GM-CSF的C末端处氨基酸115-144(TQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE；SEQ ID No:3)之间定位的表位。因此，优选的是，所述抗GM-CSF抗体或其抗原结合片段特异性结合SEQ ID No:3、或其变体或片段。

所述抗体或其抗原结合片段可以是一价的、二价的或多价的。优选的是，所述抗体或其抗原结合片段是分离的或纯化的。

在一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含多克隆抗体、或其抗原结合片段。所述抗体或其抗原结合片段可以是在兔、小鼠或大鼠中产生的。

在另一个优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含单克隆抗体或其抗原结合片段。优选的是，本发明的抗体是人类抗体或人源化抗体。

如本文所用的术语“人类抗体”可以意指抗体，如单克隆抗体，它包含与对SEQ IDNo:2、或其变体或片段表现出免疫特异性的特定人类抗体中存在的序列基本上相同的重链CDR氨基酸序列和轻链CDR氨基酸序列。当与参考序列相比时，与重链CDR或轻链CDR基本上相同的氨基酸序列表现出相当大量的序列同一性。这样的同一性明确已知或可被认为代表特定人类抗体的氨基酸序列。基本上相同的重链CDR氨基酸序列和轻链CDR氨基酸序列可以具有例如氨基酸的微小修饰或保守取代。这样的人类抗体维持它选择性结合SEQ ID No:2或其变体或片段的功能。

术语“人类单克隆抗体”可以包括例如通过重组方法产生，如通过噬菌体文库、通过淋巴细胞或通过杂交瘤细胞产生的具有基本上或完全人类CDR氨基酸序列的单克隆抗体。

术语“人源化抗体”可以意指来自非人类物种(例如小鼠或兔)的抗体，所述抗体的蛋白质序列已经被修饰以增加它们与在人类中天然产生的抗体的相似性。

所述抗体可以是重组抗体，即使用重组DNA技术产生的人类抗体。

术语“抗原结合区”可以意指抗体中对它的靶抗原具有特异性结合亲和力的区域，所述靶抗原例如SEQ ID No:2的肽、或其变体或片段。优选的是，所述片段是表位，优选地是SEQ ID No:3或其变体或片段。所述结合区可以是高变CDR或其功能部分。术语CDR的“功能部分”可以意指CDR内对靶抗原显示出特异性亲和力的序列。CDR的功能部分可以包含特异性结合SEQ ID No:2或其片段的配体。

应当了解的是，根据本发明的负调节剂(在本文被统称为“药剂”)可以用于单药治疗(例如单独使用抗体或其抗原结合片段)以用于治疗、改善或预防主动脉病。或者，根据本发明的药剂可以用作用于治疗、改善、或预防主动脉病的已知治疗的助剂或与其组合使用，所述已知治疗诸如抗高血压剂(β阻断剂)和镇痛。

根据本发明的药剂可以被组合成具有许多不同的形式的组合物，这特别取决于所述组合物待被使用的方式。因此，例如，所述组合物可以呈粉剂、片剂、胶囊、液体、软膏剂、乳膏剂、凝胶、水凝胶、气溶胶、喷雾剂、胶束溶液、透皮贴剂、脂质体悬浮液或任何其它合适的形式的形式，所述形式可以向需要治疗的人或动物施用。应当了解的是，根据本发明的药物的媒介物应当是由待接受它的给药的受试者良好耐受，并且优选地使得能够向心脏递送所述药剂的媒介物。

包含本发明的药剂的药物可以多种方式使用。举例来说，可能需要口服施用，在这种情况下，所述药剂可以被包含在可以例如以片剂、胶囊或液体的形式口服摄入的组合物内。包含本发明的药剂和药物的组合物可以通过吸入(例如鼻内)施用。组合物也可以被配制用于局部使用。举例来说，乳膏剂或软膏剂可以施用于皮肤，例如与心脏相邻的皮肤。

根据本发明的药剂和药物也可以被并入到缓慢释放设备或延迟释放设备内。这样的设备可以例如被插入在皮肤上或皮肤下，并且所述药物可以在数周内或甚至数月内释放。所述设备可以被定位在至少与治疗部位，即心脏相邻处。在需要用根据本发明使用的药剂进行长期治疗并且通常将需要频繁施用(例如至少每天注射)时，这样的设备可能是特别有利的。

在一个优选的实施方案中，可以通过注射到血流中或直接注射到需要治疗的部位中来向受试者施用根据本发明的药剂和药物。举例来说，可以至少在与心脏相邻处注射所述药物。注射可以是静脉内的(推注或输注)或皮下的(推注或输注)、或真皮内的(推注或输注)。

应当了解的是，所需要的药剂(例如抗GM-CSF抗体)的量由它的生物活性和生物利用度决定，这进而取决于施用方式、药剂的生理化学特性、以及它是用作单药治疗还是用于联合治疗中。施用的频率还将受所述药剂在正接受治疗的受试者体内的半衰期的影响。待施用的最佳剂量可以由本领域技术人员确定，并且将随所使用的具体药剂、药物组合物的强度、施用方式、以及主动脉病的进展而变。取决于所治疗的具体受试者的另外的因素将使得需要调整剂量，包括受试者的年龄、体重、性别、饮食、以及施用时间。

一般来说，每公斤体重0.001μg至每公斤体重10mg的日剂量的根据本发明的药剂可以用于治疗、改善、或预防主动脉病，这取决于使用哪种药剂。更优选的是，药剂的日剂量是每公斤体重0.01μg至每公斤体重1mg，更优选地每公斤体重0.1μg至每公斤体重100μg，并且最优选地每公斤体重约0.1μg至每公斤体重10μg。

所述药剂可以在主动脉病发病之前、期间或之后施用。日剂量可以作为单次施用(例如单次每日注射)给予。或者，所述药剂可能需要在一天内施用两次或更多次。举例来说，药剂可以作为两次(或更多次，这取决于所治疗的主动脉病的严重程度)0.07μg至700mg的日剂量施用(即假定70公斤的体重)。接受治疗的患者可以在醒来时服用第一剂量，然后在晚上(如果按照两次剂量方案)或之后以每3小时一次或每4小时一次的时间间隔服用第二剂量。或者，可以使用缓慢释放设备以向患者提供根据本发明的药剂的最佳剂量而不需要施用重复剂量。

用于小鼠的剂量是300微克/小鼠或12mg/kg，每隔一天一次，持续2周，通过腹膜内注射给予。基于在人类中使用静脉内MOR103(1.0mg/kg或1.5mg/kg)(每周一次，持续4周)以及使用皮下马威利姆单抗(mavrilimumab)(100mg)(每隔一周一次，持续12周)进行的成功研究，每周一次或每隔一周一次静脉内或皮下施用75mg-100mg是优选的。

已知的程序，如由制药工业常规使用的那些(例如体内实验、临床试验等)可以用于形成根据本发明的药剂的特定制剂和精确的治疗方案(如药剂的日剂量和施用频率)。

因此，在本发明的第三个方面，提供了一种主动脉病治疗药物组合物，所述组合物包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)负调节剂；以及任选的药学上可接受的媒介物。

在第四个方面，本发明还提供了一种用于制备根据第三个方面的药物组合物的方法，所述方法包括将治疗有效量的GM-CSF负调节剂与药学上可接受的媒介物组合。

所述负调节剂优选地是抗体或其抗原结合片段，优选地是抗GM-CSF抗体。

“受试者”可以是脊椎动物、哺乳动物、或家畜。因此，根据本发明的药物可以用于治疗任何哺乳动物，例如牲畜(例如马)、宠物，或可以用于其它兽医应用。最优选的是，所述受试者是人类。

负调节剂的“治疗有效量”是任何量，当向受试者施用时，所述量是治疗主动脉病疾病或产生所期望的作用所需的药剂的量。

举例来说，所使用的负调节剂的治疗有效量可以是约0.001ng至约1mg，并且优选地是约0.01ng至约100ng。优选的是，负调节剂的量是约0.1ng至约10ng，并且最优选地，约0.5ng至约5ng的量。

如本文所提到的“药学上可接受的媒介物”是任何已知的化合物或已知化合物的组合，它们是为本领域技术人员所知可用于配制药物组合物。

在一个实施方案中，所述药学上可接受的媒介物可以是固体，并且所述组合物可以呈粉剂或片剂的形式。固体药学上可接受的媒介物可以包括一种或多种物质，所述物质也可以用作调味剂、润滑剂、增溶剂、助悬剂、染料、填充剂、助流剂、压缩助剂、惰性粘合剂、甜味剂、防腐剂、染料、包衣、或片剂崩解剂。所述媒介物也可以是封装材料。在粉剂中，所述媒介物是微细的固体，它与根据本发明的微细的活性剂混合。在片剂中，所述活性剂可以合适的比例与具有所需的压缩特性的媒介物混合并且被压制成所期望的形状和尺寸。粉剂和片剂优选地含有高达99％的活性剂。合适的固体媒介物包括例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石粉、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、低熔点蜡以及离子交换树脂。在另一个实施方案中，所述药物媒介物可以是凝胶并且所述组合物可以呈乳膏剂等形式。

然而，所述药物媒介物可以是液体，并且所述药物组合物呈溶液的形式。液体媒介物用于制备溶液、悬浮液、乳液、糖浆、酏剂以及加压组合物。可以将根据本发明的活性剂溶解或悬浮在药学上可接受的液体媒介物，如水、有机溶剂、这两者的混合物或药学上可接受的油或脂肪中。所述液体媒介物可以含有其它合适的药物添加剂，如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、助悬剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或渗透压调节剂。用于口服施用和肠胃外施用的液体媒介物的合适实例包括水(部分含有上述添加剂，例如纤维素衍生物，优选地羧甲基纤维素钠溶液)、醇(包括一元醇和多元醇，例如二醇)和它们的衍生物、以及油(例如分馏椰子油和花生油)。对于肠胃外施用，所述媒介物也可以是油性酯，如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。无菌液体媒介物可用于肠胃外施用的无菌液体形式组合物中。用于加压组合物的液体媒介物可以是卤化烃或其它药学上可接受的推进剂。

作为无菌溶液或悬浮液的液体药物组合物可以通过例如肌内、鞘内、硬膜外、腹膜内、静脉内以及特别是皮下注射来利用。所述药剂可以被制备成无菌固体组合物，所述组合物在施用时可以使用无菌水、盐水、或其它适当的无菌可注射介质来溶解或悬浮。

本发明的药剂和组合物可以无菌溶液或悬浮液的形式口服施用，所述无菌溶液或悬浮液含有其它溶质或助悬剂(例如足以使所述溶液等渗的盐水或葡萄糖)、胆汁盐、阿拉伯树胶、明胶、脱水山梨糖醇单油酸酯、聚山梨酸酯80(与环氧乙烷共聚的山梨糖醇和它的酐的油酸酯)等。根据本发明使用的药剂还可以液体或固体组合物形式口服施用。适用于口服施用的组合物包括固体形式，如丸剂、胶囊、颗粒剂、片剂、和粉剂；以及液体形式，如溶液、糖浆、酏剂、和悬浮液。可用于肠胃外施用的形式包括无菌溶液、乳液、以及悬浮液。

如本文所述，在受试者患有主动脉病病况的情况下，GM-CSF升高。这些研究结果表明它可以用作诊断工具或生物标志物。

因此，在第五个方面，提供了粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或其变体或片段用作用于检测或诊断主动脉病的生物标志物的用途。

优选的是，SEQ ID No:2或其变体或片段用作合适的生物标志物，它可以被检测。优选的是，SEQ ID No:2、或其变体或片段用作可以由抗体或抗原结合片段，优选地是根据第一个方面使用的抗体或抗原结合片段结合的表位。

本发明还提供了一种用于诊断患有主动脉病的患者的试剂盒。

因此，根据本发明的第六个方面，提供了一种用于诊断患有主动脉病或对其有易感性的受试者或用于提供受试者的病况的预后的试剂盒，所述试剂盒包括：-

(i)用于在从测试受试者获得的样品中检测粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、或其变体或片段的浓度的检测装置，以及

(ii)来自没患主动脉病的个体的样品中GM-CSF的浓度的参考，

其中所述试剂盒被配置成鉴定来自所述测试受试者的身体样品中GM-CSF的浓度与所述参考相比的差异，从而表明所述测试受试者患有主动脉病或对其有易感性，或提供所述受试者的病况的不良预后。

根据第七个方面，提供了一种用于诊断患有主动脉病或对其有易感性的受试者、或用于提供受试者的病况的预后的方法，所述方法包括分析从受试者获得的身体样品中粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或其变体或片段的浓度；以及将该浓度与没患主动脉病的个体的GM-CSF浓度的参考相比较，其中来自所述测试受试者的身体样品中GM-CSF的浓度与所述参考相比的差异表明所述受试者患有主动脉病或对其有易感性，或提供所述受试者的病况的不良预后。

所述受试者可以是兽医学关注的任何动物，例如猫、狗、马等。然而，优选的是，所述受试者是哺乳动物，如男性或女性人类。

优选的是，从所述受试者获取样品，并且可以在测定中测量粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或其变体或片段的浓度。所述试剂盒可以包括用于从所述测试受试者获得所述样品的样品提取装置。所述样品提取装置可以包括针或注射器等。

已经证实，GM-CSF存在于体液和器官液体中。然而，所述样品可以是其中被分泌有GM-CSF的任何身体样品，例如它可以是淋巴或间质液。所述样品可以是尿液样品或血液样品。所述血液样品可以是静脉的或动脉的。

所述试剂盒可以包括用于容纳所提取的样品的样品收集容器。应当了解的是，可以在从受试者获取“新鲜”身体样品，如血液之后立即分析它们的GM-CSF水平。或者，在进行GM-CSF测定之前，可以将血液储存在低温，例如储存在冰箱中或甚至冷冻。然后可以在日后将样品解冻和分析。

可以对全血进行GM-CSF的测量。然而，在进行测定之前可以对血液进行进一步处理。举例来说，可以添加抗凝剂，如柠檬酸盐(如柠檬酸钠)、水蛭素、肝素、PPACK、或氟化钠。因此，所述样品收集容器可以容纳抗凝剂以防止血液样品凝结。或者，可以将血液样品离心或过滤以制备血浆或血清级分，它可以用于分析。因此，优选的是，在血浆或血清样品中分析或测定GM-CSF或变体或片段。优选的是，在体外从取自受试者的血清样品或血浆样品测量GM-CSF浓度。

如实施例中所述，本申请的发明人监测在输注AngII以诱发主动脉炎症下KLF6fl/fl；LysM Cre小鼠的GM-CSF的浓度，并且将它与对照巨噬细胞中的GM-CSF浓度相比较。他们证实，患有通过输注AngII所诱发的主动脉病的小鼠的GM-CSF浓度有统计显著性增加。因此，与参考对照值相比，浓度的差异优选地是增加，这指示了主动脉病。

应当了解的是，主动脉病患者的GM-CSF浓度在很高程度上取决于许多因素，例如所述疾病已经进展到什么程度、以及受试者的年龄和性别。还将了解的是，没患主动脉病的个体的GM-CSF浓度可能在一定程度上波动，但是在一段给定的时间内平均来说，浓度趋于基本上恒定。此外，应当了解的是，一组没患主动脉病的个体的GM-CSF浓度可能不同于另一组没患所述疾病的个体的GM-CSF浓度。然而，本领域技术人员将知道如何测定没患主动脉病的个体的GM-CSF的平均浓度，并且这被称为GM-CSF的‘正常’浓度。正常浓度对应于上述的参考值。

可以通过多种技术从身体样品中提取GM-CSF，然后检测。检测可以通过免疫测定(例如ELISA)，例如使用已经被预先包被到基质，如微板上的对GM-CSF具有特异性的单克隆抗体来实现。可以将标准品和样品施加到孔中并且存在的任何GM-CSF由固定化的抗体结合。在洗去任何未结合的物质之后，然后可以将人类GM-CSF的酶联单克隆抗体施加到孔中。在进行洗涤以去除任何未结合的抗体-酶试剂之后，可以将底物溶液施加到孔中并且颜色与在初始步骤中结合的GM-CSF的量成比例地显现。然后可以停止显色，并且测量颜色的强度。用于检测GM-CSF的合适的测定可以如由R&D系统公司所提供。

根据本发明的试剂盒包括用于测定身体样品中GM-CSF的浓度的装置。所述试剂盒可以包括其中可以容纳用于测定来自测试受试者的样品中GM-CSF的浓度的装置的容器。所述试剂盒还可以包括使用说明书。

因此，所述试剂盒可以包括在已经从受试者获得样品之后测定所述样品中GM-CSF的浓度的检测装置。

所述参考值可以通过测定统计显著性数量的对照样品(即来自没患主动脉病的受试者的样品)来获得。因此，根据本发明的试剂盒的参考可以是用于测定目的的对照样品。

所述检测装置可以包括适用于测定样品中GM-CSF的浓度的测定。所述试剂盒或方法可以包括使用可以与所述测定相比较的阳性对照和/或阴性对照。举例来说，所述试剂盒可以包括来自患有(即阳性对照)或没患(即阴性对照)主动脉病的个体的样品中GM-CSF的浓度的参考。

所述试剂盒还可以包括可以检测的标记。术语“标记”可以意指可以与抗体或其抗原结合片段连接的部分。部分可以用于例如治疗程序或诊断程序。标记包括例如可以与抗GM-CSF抗体或其片段连接并且用于监测所述抗体与GM-CSF或其片段的结合的部分。如本文所述，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合SEQ ID No:2或其变体或片段。

诊断标记包括例如可以由分析方法检测的部分。分析方法包括例如定性程序和定量程序。定性分析方法包括例如免疫组织化学和间接免疫荧光。定量分析方法包括例如免疫亲和程序，如放射免疫测定、ELISA或FACS分析。分析方法还包括体外成像程序和体内成像程序这两者。可以由分析手段检测的诊断标记的具体实例包括酶、放射性同位素、荧光染料、化学发光标记、以及生物素。

标记可以直接与抗GM-CSF抗体或其抗原结合片段连接或与特异性结合本发明的分子的二级结合剂连接。这样的二级结合剂可以是例如二抗。二抗可以是多克隆的或单克隆的，并且是人类、啮齿类动物或嵌合来源的。

在另一个方面，提供了一种用于治疗患有主动脉夹层的患者的抗GM-CSF抗体，其中以在所述患者的血液中实现治疗有效抗体水平的方式向所述患者施用所述抗体。

在另一个方面，提供了一种治疗患者的主动脉夹层的方法，所述方法是通过测量与正常相比血液中GM-CSF水平升高的存在，然后用抗GM-CSF抗体治疗所述患者来实现的。

所述患者可能已经被诊断为患有主动脉夹层并且需要持续治疗以防止所述疾病进一步进展。所述患者可能已经接受主动脉夹层的手术治疗并且需要持续治疗以防止所述疾病复发。

在另一个方面，提供了一种诊断患有主动脉夹层或有患主动脉夹层的风险的患者的方法，所述方法包括分析患者样品中GM-CSF的浓度以及将该浓度与已知代表主动脉夹层的风险升高的GM-CSF的参考浓度相比较。

所述患者可能已经被诊断为患有主动脉夹层并且需要持续治疗以防止所述疾病进一步进展。所述患者可能已经接受主动脉夹层的手术治疗并且需要持续治疗以防止所述疾病复发。所述患者样品可以包括血液样品。

应当了解的是，本发明延及任何核酸或肽或其变体、衍生物或类似物，它包含本文所提到的序列中的任一个的基本上的氨基酸序列或核酸序列或由本文所提到的序列中的任一个的基本上的氨基酸序列或核酸序列组成，包括其变体或片段。术语“基本上的氨基酸/核苷酸/肽序列”、“变体”以及“片段”可以是与本文所提到的序列中的任一个的氨基酸/核苷酸/肽序列具有至少40％序列同一性，例如与被标示为SEQ ID No:2(即GM-CSF蛋白质)的序列具有40％同一性等的序列。

还设想了与所提到的序列中的任一个具有大于50％，更优选地大于65％、70％、75％的序列同一性，并且仍更优选地大于80％的序列同一性的氨基酸/多核苷酸/多肽序列。优选的是，所述氨基酸/多核苷酸/多肽序列与所提到的序列中的任一个具有至少85％同一性，更优选地与本文所提到的序列中的任一个具有至少90％、92％、95％、97％、98％，并且最优选地至少99％的同一性。

本领域技术人员将了解如何计算两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的同一性百分比。为了计算两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的同一性百分比，首先必须准备进行这两个序列的比对，继而计算序列同一性值。两个序列的同一性百分比可以取不同的值，这取决于：-(i)用于比对所述序列的方法，例如ClustalW、BLAST、FASTA、Smith-Waterman(在不同的程序中实现)、或根据三维比较的结构比对；以及(ii)由比对方法使用的参数，例如局部比对或全局比对、所使用的对得分矩阵(例如blosum62、pam250、gonnet等)、以及空位罚分，例如函数形式和常数。

在已经进行比对的情况下，存在计算两个序列之间的同一性百分比的许多不同的方式。举例来说，可以用同一性的数目除以：(i)最短序列的长度；(ii)比对的长度；(iii)序列的平均长度；(iv)非空位位置的数目；或(iv)不包括突出端的等同位置的数目。此外，应当了解的是，同一性百分比也具有强烈的长度依赖性。因此，一对序列越短，则可以期望偶然出现的序列同一性越高。

因此，应当了解的是，准确比对蛋白质序列或DNA序列是一个复杂的过程。普及的多重比对程序ClustalW(Thompson等,1994,Nucleic Acids Research,22,4673-4680；Thompson等,1997,Nucleic Acids Research,24,4876-4882)是用于产生根据本发明的蛋白质或DNA的多重比对的优选的方式。用于ClustalW的合适的参数可以如下：对于DNA比对：空位开放罚分＝15.0，空位延伸罚分＝6.66，并且矩阵＝同一性。对于蛋白质比对：空位开放罚分＝10.0，空位延伸罚分＝0.2，并且矩阵＝Gonnet。对于DNA和蛋白质比对：ENDGAP＝-1，并且GAPDIST＝4。本领域技术人员将了解的是，可能需要改变这些参数和其它参数以进行最佳的序列比对。

优选的是，两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的同一性百分比的计算然后可以根据这样的比对被计算为(N/T)×100，其中N是序列共有相同的残基的位置数，并且T是所比较的包括空位在内，但是不包括突出端的位置的总数。因此，用于计算两个序列之间的同一性百分比的最优选的方法包括(i)使用clustalw程序，使用一组合适的参数，例如如上文所述来准备序列比对；以及(ii)将n和t的值插入到下式中：-序列同一性＝(N/T)×100。

用于鉴定相似序列的替代方法将是本领域技术人员已知的。举例来说，基本上相似的核苷酸序列将由与本文所示的核酸序列中的任一个或它们的互补序列在严格条件下杂交的序列编码。通过严格条件，我们意指在约45℃在3×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，核苷酸与和过滤器结合的DNA或RNA杂交，继而在约20℃-65℃在0.2×ssc/0.1％SDS中进行至少一次洗涤。或者，基本上相似的多肽可以与本文所示的序列有至少1个，但是少于5个、10个、20个、50个或100个氨基酸不同。

由于遗传密码的简并，因此很明显，本文所述的任何核酸序列可以改变或变化而基本上不影响由其编码的蛋白质的序列，以提供其功能变体。合适的核苷酸变体是具有由于在序列内编码相同氨基酸的不同密码子的取代，从而产生沉默变化而发生改变的序列的那些变体。其它合适的变体是具有同源核苷酸序列，但是包含序列的全部或部分的那些变体，它们由于编码具有与所取代的氨基酸具有相似的生物物理特性的侧链的氨基酸的不同密码子的取代以产生保守变化而发生改变。举例来说，小的非极性、疏水性的氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、以及甲硫氨酸。大的非极性、疏水性的氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸以及酪氨酸。极性的中性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺以及谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括赖氨酸、精氨酸以及组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。因此将了解哪些氨基酸可以被具有相似的生物物理特性的氨基酸置换，并且本领域技术人员将已知编码这些氨基酸的核苷酸序列。

本文所述的所有特征(包括任何所附权利要求、摘要以及附图)和/或如此所公开的任何方法或工艺的所有步骤可以与上述方面中的任一个组合成任何组合，除了其中这些特征和/或步骤中的至少一些相互排斥的组合之外。

附图说明

为了更好地理解本发明以及说明本发明的实施方案如何可以被实施，现在将通过举例方式对附图进行参考，其中：-

图1示出了KLF6杂合敲除小鼠的主动脉瘤和炎症。(a)在野生型(WT)同窝小鼠(n＝11)和KLF6杂合敲除小鼠(KLF6+/-，n＝10)中通过在施用CaCl₂的情况下将AngII输注2周所诱导的代表性主动脉(肾下主动脉：井号，肾上主动脉：星号)。通过EVG(上图，a和c)和H&E染色(下图，b和d)对肾下主动脉(b)和肾上主动脉(c)进行的组织病理学分析。(d)在施用CaCl₂的情况下将AngII输注2周之前[(-)，n＝3]和之后(CaCl₂+AngII，WT：n＝10；K6+/-：n＝8)在野生型(WT)同窝小鼠与KLF6杂合敲除小鼠(K6+/-)之间肾下主动脉直径的定量。*P<0.05，司图顿氏t检验(Student's t-test)。(e)野生型同窝小鼠和KLF6杂合敲除小鼠的EVG染色的主动脉(b)的加框区域中巨噬细胞(绿色：Mac3；蓝色：DAPI)的免疫荧光染色。(f)在施用CaCl₂的情况下输注AngII之前[(-)，n＝3]和之后(CaCl₂+AngII，n＝5)来自野生型(WT)同窝小鼠和KLF6杂合敲除小鼠(K6+/-)的主动脉中MMP9、F4/80以及IL-6的RNA表达水平，所述表达水平是使用实时PCR研究的并且通过GAPDH mRNA归一化。*P<0.05，曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)。(g)与接受PBS-脂质体施用的小鼠(n＝5)相比，氯膦酸盐-脂质体对主动脉表型(n＝4)的抑制作用，这是通过EVG(左图，a和b)；H&E(中图，c和d)；以及F4/80染色(右图，e和f，免疫组织化学)来分析的。(h)来自接受氯膦酸盐-脂质体或PBS-脂质体施用的小鼠的肾下主动脉直径的定量(*P<0.05，司图顿氏t检验，每组n＝4只或5只小鼠)。结果来自三次独立实验。所有值被表示为平均值±s.e.m；

图2示出了KLF6的骨髓缺陷显示主动脉夹层/壁内血肿和炎症的表型。(a)在施用CaCl₂和输注AngII的情况下KLF6fl/fl对照小鼠(n＝19)与KLF6fl/fl；LysMCre小鼠(n＝22)之间的存活率曲线。(b)在施用CaCl₂的情况下将AngII输注2周之后KLF6fl/fl对照小鼠(a)和KLF6fl/fl；LysMCre小鼠(b)的代表性主动脉(肾下主动脉：井号，肾上主动脉：星号)。与KLF6fl/fl对照小鼠相比，在施用CaCl₂的情况下将AngII输注2周之后通过EVG(上图，a和c)和H&E染色(下图，b和d)在KLF6fl/fl；LysMCre小鼠中所观测到的肾下主动脉(c)和肾上主动脉(d)的代表性组织病理学分析。(e)在施用CaCl₂的情况下将AngII输注2周之前[(-)，n＝3]和之后(CaCl₂+AngII，n＝5)肾下主动脉直径的定量。(f)在施用CaCl₂的情况下将AngII输注2周之后KLF6fl/fl小鼠(n＝7)和KLF6fl/fl；LysMCre小鼠(n＝9)的IL-6的血浆浓度。*P<0.05，司图顿氏t检验(e、f)。(g)在施用CaCl₂的情况下将AngII输注2周之前[(-)，n＝3]和之后(CaCl₂+AngII，n＝5)在来自KLF6fl/fl小鼠和KLF6fl/fl；LysMCre小鼠的主动脉中，使用实时PCR研究IL-6的RNA表达水平并且通过GAPDH mRNA归一化。(h)在经受AngII刺激(10μM)3小时的骨髓源性巨噬细胞中研究IL-6、CCR2、TNFα、IL-1β、iNOS以及MCP-1的RNA表达水平(每组n＝3只小鼠)。(i)在施用CaCl₂的情况下将AngII输注2周之后KLF6fl/fl小鼠和KLF6fl/fl；LysMCre小鼠的主动脉、外周血液、脾脏以及骨髓中CD11b+Ly6Chi-细胞的群体。结果代表三次独立实验。所有值被表示为平均值±s.e.m。*P<0.05，曼-惠特尼检验(g、h)；

图3示出了GM-CSF是巨噬细胞中KLF6的直接靶标。(a)在AngII刺激(10μM)3小时的情况下来自KLF6fl/fl小鼠和KLF6fl/fl；LysMCre小鼠的骨髓(BM)源性巨噬细胞之间与IL-6/STAT3炎症通路相关的基因的RT2profiler PCR阵列分析。箭头指示GM-CSF。基因的列表，所述基因在用AngII(10μM)刺激3小时的来自KLF6fl/fl小鼠和KLF6fl/fl；LysMCre小鼠的BM源性巨噬细胞之间显示出一致的变化。(b)从KLF6fl/fl小鼠[假手术；(-)，n＝3；CaCl₂+AngII；n＝3]和KLF6fl/fl；LysMCre小鼠[假手术；(-)，n＝3；CaCl₂+AngII；n＝6]获得的主动脉巨噬细胞中GM-CSF的mRNA表达。N.D.指示未检出。(c)在0天(n＝3)、3天(n＝3)、7天(n＝3)以及14天(n＝4)KLF6fl/fl小鼠和KLF6fl/fl；LysMCre小鼠的主动脉中GM-CSF的mRNA表达。(d)KLF6fl/fl；LysMCre小鼠的主动脉中巨噬细胞(红色；F4/80，b)、GM-CSF(绿色，c)以及核(蓝色；DAPI，d)的免疫组织化学，其中对肾下主动脉进行EVG染色(a)。(e)在施用CaCl₂的情况下将AngII输注2周之后KLF6fl/fl小鼠(n＝8)与KLF6fl/fl；LysMCre小鼠(n＝4)之间的血浆GM-CSF浓度。结果代表三次独立实验。所有值被表示为平均值±s.e.m。*P<0.05，曼-惠特尼检验；

图4示出了GM-CSF是为主动脉夹层/壁内血肿所需的。(a)在施用CaCl₂的情况下将AngII输注2周之后接受抗GM-CSF中和抗体(b，抗GM-CSF，n＝8)或对照IgG抗体(a，n＝10)的施用的KLF6fl/fl；LysMCre小鼠的代表性主动脉。在接受抗GM-CSF抗体施用的小鼠与接受抗对照IgG施用的小鼠之间肾下主动脉直径的定量(b，抗GM-SCF；n＝7，抗对照IgG；n＝9)和IL-6的血浆浓度(c，n＝5或6)。*P<0.05，司图顿氏t检验。(d)在接受抗GM-CSF抗体施用的小鼠或接受抗对照IgG施用的小鼠的主动脉中，使用实时PCR研究GM-CSFRα、MMP9、F4/80以及IL-6的RNA表达水平，然后通过GAPDH mRNA归一化(每组n＝5只小鼠)。(e)在野生型小鼠中施用CaCl₂和输注AngII的情况下接受重组GM-CSF(n＝26)或PBS(n＝19)施用的小鼠的存活率曲线。(f)在施用CaCl₂和输注AngII的情况下接受重组GM-CSF(b)或PBS(a)施用4周的野生型小鼠的代表性主动脉(肾下主动脉：井号，肾上主动脉：星号)。(g)通过EVG染色对肾下主动脉(上图，a和c)和肾上主动脉(下图，b和d)进行的组织病理学分析。(h)接受重组GM-CSF施用的小鼠或接受PBS施用的小鼠[假手术；(-)，n＝3，CaCl₂+AngII；n＝5]之间肾下主动脉直径的定量。(i)在进行或不进行CaCl₂施用和AngII输注的情况下将重组GM-CSF或PBS输注2周之后的血浆GM-CSF浓度(每组n＝3只-5只小鼠)。(j)在来自接受重组GM-CSF或PBS施用的小鼠的主动脉中，使用实时PCR研究F4/80和IL-6的RNA表达水平，然后用GAPDH mRNA归一化[假手术；(-)，n＝3，CaCl₂+AngII；n＝5]。结果来自三次独立实验。所有值被表示为平均值±s.e.m。*P<0.05，曼-惠特尼检验(d、h、j)以及单因素方差分析和邓恩氏事后检验(Dunn's post test)(i)；

图5示出了在患有急性主动脉夹层的患者中GM-CSF增加。(a)健康志愿者(健康对照，n＝12)和患有主动脉瘤(AAA，n＝3)、冠状动脉疾病(CAD，n＝11)或主动脉夹层(n＝10)的患者的血浆GM-CSF浓度。(b)夹层的降主动脉(加框区域，a)中CD68(红色，c)、GM-CSF(绿色，d)以及DAPI(蓝色，e)的免疫荧光染色和EVG染色(b)；

图6示出了本模型中动脉瘤上的主动脉夹层/壁内血肿。(a)经受CaCl₂施用和AngII输注的切除的胸腹主动脉的外观。请注意，壁内血栓形成存在于肾上区域中。(b)病变主动脉的示意图。(c)通过弹性纤维万吉森染色法(Elastica van Gieson)染色的横截面组织切片。请注意，a-e对应于主动脉的同一些水平(a)。a：肾下腹主动脉的横截面(CaCl₂施用水平)。b：在肾动脉的水平上。c：肾上水平，其中内膜-中膜层显示撕裂。d和e：内膜中膜撕裂以外的肾上胸降主动脉。(d)在肾上水平(c)上的高倍放大横截面。存在内膜-中膜撕裂和假腔/附壁血栓形成；

图7示出了动脉瘤主动脉中巨噬细胞的显著浸润。(a)与KLF6fl/fl小鼠(左图，a和b)相比，在KLF6fl/fl；LysMCre小鼠(右图，c和d)的主动脉中通过免疫荧光染色(虚线，绿色，Mac3)将浸润的巨噬细胞可视化。(b)KLF6fl/fl；LysMCre小鼠的病变主动脉(a)中巨噬细胞(b，绿色，Mac3)、pSTAT3(c，红色)以及核(d，DAPI，蓝色)的免疫荧光染色；

图8示出了TGFβ介导的通路的参与。野生型(WT)同窝小鼠和KLF6+/-小鼠(a)以及KLF6fl/fl小鼠和KLF6fl/fl；LysM Cre小鼠(c)的主动脉中TGFβ1相关因子的mRNA表达水平，所述表达水平是使用实时PCR分析的，通过GAPDH mRNA归一化。每组n＝5。所有值被表示为平均值±s.e.m。野生型(WT)同窝小鼠和KLF6+/-小鼠(b)以及KLF6fl/fl小鼠和KLF6fl/fl；LysM Cre小鼠(d)在施用CaCl₂的情况下将AngII输注2周之前(-)和之后(CaCl₂+AngII)主动脉中pSmad2、Smad2、pERK1/2、ERK1/2、pSTAT3、STAT3或GAPDH的蛋白质印迹分析；

图9示出了LysM Cre对外周血液中的中性粒细胞和树突状细胞的作用。在假手术(-)或在施用CaCl₂的情况下将AngII输注2周(CaCl₂+AngII)之后KLF6fl/fl小鼠和KLF6fl/fl；LysMCre小鼠的外周血液中Ly6G+中性粒细胞(a、c)和谱系-CD11c+树突状细胞(DC)(b、d)的群体和定量。(e)在假手术(-)或在施用CaCl₂的情况下将AngII输注2周(CaCl₂+AngII)之后从KLF6fl/fl小鼠和KLF6fl/fl；LysMCre小鼠的骨髓中分离的中性粒细胞中研究IL-1β、TNFα、IL-6以及IL-8的RNA表达水平。每组n＝5。所有值被表示为平均值±s.e.m；

图10示出了GM-CSF受巨噬细胞中的KLF6调节。用AngII(10mM)、TNFα(10ng ml-1)以及IL-1β(20ng ml-1)刺激所示时间的来自KLF6fl/fl小鼠(n＝4)和KLF6fl/fl；LysMCre小鼠(n＝4)的骨髓源性巨噬细胞的GM-CSF的mRNA表达(a)和培养基中GM-CSF的浓度(b)。(c)用空逆转录病毒构建体(E)或表达KLF6的逆转录病毒构建体(KLF6)感染来自KLF6fl/fl小鼠的巨噬细胞。在用AngII(10mM)、TNFα(10ng ml-1)以及IL-1β(20ng ml-1)刺激后3小时收获总RNA。(d)在来自KLF6fl/fl小鼠(n＝3)的巨噬细胞中使用或不使用AngII(10mM)、TNFα(10ng ml-1)以及IL-1β(20ng ml-1)处理3小时的情况下，用染色质提取物使用针对KLF6的抗体或对照(CTL)IgG进行ChIP测定。结果代表三次独立实验。所有值被表示为平均值±s.e.m。相比于KLF6fl/fl小鼠，*p<0.05。p值是通过曼-惠特尼检验(a、b、d)以及通过单因素方差分析和邓恩氏事后检验(c)来计算的；

图11示出了在野生型小鼠中GM-CSF施用对主动脉夹层的浓度依赖性作用。(a)在将所示浓度的重组GM-CSF或PBS输注2周后的主动脉。(b)在将所示浓度的重组GM-CSF或PBS输注2周后的血浆GM-CSF浓度。每组n＝3-5。所有值被表示为平均值±s.e.m；

图12示出了在野生型小鼠中GM-CSF施用对主动脉夹层的长期作用。(a)在野生型小鼠中在施用CaCl₂和输注AngII的情况下将重组GM-CSF(每天每公斤10mg)或PBS施用2周或4周的情况下的代表性主动脉。(b)在野生型小鼠中在施用CaCl₂和输注AngII的情况下将重组GM-CSF(每天每公斤10mg)或PBS输注2周或4周后的血浆GMCSF浓度。每组n＝4-5。所有值被表示为平均值±s.e.m.；并且

图13示出了LysM Cre对主动脉中的中性粒细胞和树突状细胞的作用。在假手术(-)或在施用CaCl₂的情况下将AngII输注2周(CaCl₂+AngII)之后KLF6fl/fl小鼠和KLF6fl/fl；LysMCre小鼠的主动脉中Ly6G+中性粒细胞(a、c)和CD11c+MHC+树突状细胞(DC)(b、d)的群体和定量。每组n＝3-4。所有值被表示为平均值±s.e.m。

具体实施方式

实施例

材料和方法

小鼠

杂合KLF6+/-小鼠(C57BL/6)最初是由Tarocchi等(50)产生的。为了产生巨噬细胞特异性KLF6敲除小鼠，使KLF6fl/fl小鼠(C57BL/6；129Sv)与LysM Cre小鼠(C57BL/6，杰克逊实验室公司(Jackson laboratory))杂交(51)。仅使用作为野生型小鼠的10周至13周大和C57BL/6的雄性小鼠(CLEA日本公司(CLEA Japan))。所有的动物实验均由东京大学(University of Tokyo)动物实验伦理委员会批准并且严格遵守东京大学的动物实验指南。

鼠类主动脉夹层/壁内血肿模型

为了诱发主动脉夹层/壁内血肿，对腹主动脉进行CaCl₂的主动脉周施用，继而进行AngII的两周输注(2000ng kg-1min-1)(40)。详细来说，在10周至13周大时使小鼠麻醉并且进行剖腹术。使肾动脉与髂动脉的分叉之间的腹主动脉与周围腹膜后位结构分离，并且向肾下主动脉的外表面施用0.5M的CaCl₂。在假手术对照小鼠中用NaCl(0.9％)代替CaCl₂。在15分钟后用0.9％无菌盐水冲洗主动脉并且闭合切口。

GM-CSF的巨噬细胞耗尽和操作

在诱发主动脉夹层之前的2天和之后的7天向野生型小鼠腹膜内注射110mg kg-1的氯膦酸盐脂质体或等体积的PBS脂质体。通过腹膜内注射每隔一天施用针对GM-CSF的中和抗体(300μg，R&D系统公司)或对照抗大鼠IgG抗体(Equitech Bio公司)一次。在诱发主动脉夹层后将重组鼠类GM-CSF(每天每公斤10μg、50μg、100μg，派普泰克公司(PeproTech))施用两周或四周。

组织学分析和免疫组织化学

将来自小鼠的主动脉包埋于石蜡中，然后制备5μm厚的连续切片以用于弹性纤维万吉森(EVG)染色和苏木精/伊红(HE)染色。使用具有参考比例尺的EVG染色的主动脉的数字图像来进行直径的绝对测量。按照由东京大学医院研究伦理委员会批准的方案，在知情同意的情况下，从正接受手术主动脉修复的患者获得人类主动脉组织。从所述主动脉获得石蜡包埋的切片以进行EVG染色和免疫组织化学。对于免疫组织化学，在脱蜡和封闭之后，将连续切片与以下抗体一起孵育：用于小鼠的巨噬细胞的Mac-3(1:200稀释；大鼠；BDPharmingen公司)或F4/80(1:100；大鼠；Serotec公司)和CD68(1:50；小鼠；丹科公司(DAKO)，用于人类)、以及GM-CSF(1:100，兔；艾博抗公司(Abcam)，用于小鼠；以及1:50；兔；Acris公司，用于人类)或p-STAT3(1:200；兔；细胞信号转导技术公司(Cell SignalingTechnology))，然后是生物素化的二抗(1:200；丹科公司)。对于检测，使用抗链霉亲和素缀合的AlexFluor 488或AlexFluor 594(1:200；英杰公司(Invitrogen))。在最后一系列洗涤之后将核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(1:5,000；西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))染色。

从主动脉、脾脏、骨髓以及血液进行细胞制备

将主动脉切碎成3mm至4mm的碎片并且放置在于Accumax的基础溶液(创新细胞技术公司(Innovative Cell Technologies))中含有II型胶原酶(1.25mg ml-1，沃辛顿公司(Worthington))和猪胰腺弹性蛋白酶(50μg ml-1，沃辛顿公司)的1ml消化溶液中。在室温下在搅拌下将主动脉组织消化1小时。在消化之后，以2000rpm将细胞在FACS缓冲液(于PBS中5％的FCS)中洗涤5分钟。使用CD11b微珠，根据制造商的说明书(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec))分离主动脉巨噬细胞。将脾脏匀浆并且通过细胞过滤器以获得单细胞悬浮液。从5周至6周大的小鼠的股骨和胫骨获得骨髓源性细胞。将血液采集在肝素包被的小瓶中，然后在室温下添加1.2％的葡聚糖，持续45分钟。通过自动化血液分析仪(XT-2000i，希森美康公司(Sysmex))对外周白细胞进行计数。使用中性粒细胞分离试剂盒，根据制造商的说明书(美天旎生物技术公司)从骨髓分离中性粒细胞。从脾脏、骨髓以及血液的单细胞悬浮液，在冰上使用ACK裂解缓冲液将红细胞分别裂解5分钟、3分钟以及2分钟。将细胞以2000rpm离心5分钟以去除ACK裂解缓冲液，然后将单细胞悬浮液在FACS缓冲液中重悬和洗涤，继而以2000rpm离心5分钟。

细胞培养

从KLF6fl/fl小鼠或KLF6fl/fl；LysM Cre小鼠的股骨和胫骨制备骨髓源性细胞以评估GM-CSF在巨噬细胞中的作用。在RetroNectin(5μg/cm²，宝生物公司(Takara Bio.))存在下通过KLF6的逆转录病毒构建体(pMXs-KLF6)诱导KLF6过表达。

流式细胞术

在冰上使用针对鼠类CD16/32抗原的抗体(eBioscience公司)将鼠类Fc受体阻断15分钟，之后洗涤细胞，然后重悬在100l的FACS缓冲液中。在室温下添加APC-CD11b[M1/70]、PerCP-Cy5.5-Ly-6c[HK1.4]、APC-Cy7-Ly6G[1A8]或APC-CD11c[N418]的与荧光染料缀合的抗体(全部来自BioLegend公司)，持续30分钟-45分钟。使用FITC-CD3e[145-2C11]、FITC-Ly6G[RB6-8C5]、FITC-CD11b[M1/70]、FITC-CD45R/B220[RA3-6B2]以及FITC-Ly76[Ter-119](红系谱系标记)作为谱系标记。将相应的同种型对照抗体以与所关注的抗体相同的浓度添加到样品中。在孵育之后，将样品洗涤三次并且通过FACSverse(BD Pharmingen公司)分析。使用含有单色染色的主动脉巨噬细胞的阳性样品进行补偿。如由低前向散射所限定的碎片和死细胞被排除在分析之外。使用FlowJo(Tree Star公司)分析数据。

染色质免疫沉淀

使用染色质免疫沉淀试剂盒(Active Motif公司)，根据制造商的说明书进行ChIP分析。简单地说，使用或不使用AngII(10μM)、TNFα(10ng ml-1)以及IL-1β(20ng ml-1)将骨髓源性巨噬细胞刺激3小时，之后与1％甲醛交联10分钟。通过超声处理将染色质剪切成200个-1000个碱基对的平均尺寸(Covaris公司)。使用抗KLF6抗体(圣克鲁斯生物技术公司)和兔IgG抗体(圣克鲁斯生物技术公司)进行免疫沉淀。使用以下引物进行跨越KLF结合元件的GM-CSF启动子区的PCR扩增：正向：5'-AAGCCCTTCCAAGAACTGGC-3'(SEQ ID NO:4)和反向：5'-GGCCCCTCAAAAAGGAGAGG-3'(SEQ ID NO:5)。

将KLF6募集通过输入DNA归一化并且与使用KLF6抗体的对照组相比较。

RNA分离和定量实时PCR

使用RNeasy小量提取试剂盒(快而精公司(Qiagen))或RNAlater(快而精公司)，根据制造商的说明书提取培养细胞、主动脉巨噬细胞、骨髓源性中性粒细胞或鼠类主动脉样品的总RNA。使用Superscript III(英杰公司)，根据制造商的说明书将0.5μg-1μg的RNA逆转录。每20μl含有SYBR绿I主混合物(SYBR green I master)(罗氏公司(Roche))的反应体积使用2μl的所得cDNA进行实时PCR反应。使用GAPDH作为内参。使用经过AngII(10μM，3小时)刺激的骨髓源性巨噬细胞，用IL-6/STAT炎症通路的84种相关基因进行RT2profilerPCR阵列(快而精公司)。在LightCycler 480实时PCR系统(罗氏公司)上，根据制造商的推荐程序进行PCR。实时PCR引物示于表5中。

蛋白质印迹分析

将小鼠主动脉标本用含有蛋白酶抑制剂复合物(罗氏公司)和磷酸酶抑制剂(罗氏公司)的裂解缓冲液(T-PER，赛默科技公司(Thermo Scientific))匀浆。使用BCA蛋白质测定试剂盒(皮尔斯公司(Pierce))测定蛋白质浓度，并且通过10％NuPAGE(英杰公司)解析五微克的蛋白质，然后转移到聚偏二氟乙烯膜。使用一抗探测印迹：pSmad2(1:400稀释)、pERK1/2(1:3,000)、pSTAT3(1:3,000)、Smad2(1:1,000)、ERK1/2(1:3,000)或pSTAT3(1:3,000)(全部都是兔抗体，从细胞信号转导技术公司获得)和抗GAPDH抗体(Ambion公司)。将膜洗涤并且与相应的辣根过氧化物酶缀合的二抗(细胞信号转导技术公司)一起孵育。通过ECLplus(赛默科技公司)检测蛋白质条带并且GAPDH用作蛋白质上样的内参。

酶联免疫吸附测定

使用可商购获得的quantikine ELISA试剂盒(R&D系统公司)，根据制造商的说明书测定患有或没有主动脉夹层/壁内血肿的小鼠或人类的IL-6、MCP-1以及GM-CSF的血浆水平。健康志愿者和患有主动脉瘤、冠状动脉疾病或患有主动脉夹层的患者的血清是按照由东京大学医院研究伦理委员会批准的方案在知情同意的情况下获得的。人类受试者的基线特征示于表6中。

统计分析

所有数据被表示为平均值±s.e.m。在通过F检验分析检验正态性之后，使用司图顿氏t检验(双尾)针对参数数据或使用曼-惠特尼检验针对非参数数据确定两组之间的统计学差异。对于含有多个时间点的数据，进行同一时间点的两组比较。当比较多组时，通过克鲁斯凯-沃利斯(Kruskal-Wallis)非参数单因素方差分析和邓恩氏事后检验分析数据。使用卡普兰-迈耶法(Kaplan-Meier method)建立存活率曲线并且通过对数秩检验比较。使用Biomath(biomath.info/power)计算小鼠实验的统计功效。所有样本量等于或大于推荐的最小组大小。使用Prism 6.0(GraphPad软件公司)分析所有数据。小于0.05的P值被认为具有显著性。

结果

实施例1：KLF6杂合敲除小鼠的伴有炎症的主动脉瘤

本申请的发明人最初发现以杂合方式耗尽KLF6的小鼠在经受主动脉炎症[在局部施用氯化钙(CaCl₂)的情况下将血管紧张素II(AngII)输注两周]时表现出主动脉瘤加重的表型(被定义为外主动脉直径增加大于50％而主动脉壁保留)(21,22)。组织学研究结果显示主动脉腔扩张而主动脉壁脆弱以及进一步纤维化组织沉积，伴有巨噬细胞(Mac3阳性细胞)的显著浸润(图1a-e)。在机制上，在主动脉中看到基质金属蛋白酶-9(MMP9，作为血管重塑的标志物)(23)、F4/80(作为巨噬细胞的标志物)(24,25)以及IL-6(作为炎症的标志物)(16,26-30)的表达增加(图1f)。

由于在这些小鼠的病变主动脉中看到免疫细胞的显著浸润，因此使用氯膦酸盐耗尽巨噬细胞，这消除了主动脉表型而几乎不存在巨噬细胞浸润(图1g、h)。因此，包括巨噬细胞的免疫细胞对于该模型中的主动脉重塑是重要的。

实施例2：KLF6fl/fl；LysMCre小鼠表现出主动脉夹层/血肿

由于KLF6缺陷小鼠的主动脉病况似乎涉及巨噬细胞的炎症响应失调，因此进一步产生骨髓特异性KLF6缺陷小鼠(KLF6fl/fl；LysM Cre小鼠)，所述小鼠显示出与对照小鼠相比骨髓谱系中的KLF6表达特异性减少70％。经受主动脉炎症的KLF6fl/fl；LysM Cre小鼠显示出与在杂合敲除小鼠中所看到的表型相似的腹主动脉瘤加重的表型，但是有趣的是，还显示出肾上主动脉夹层/壁内血肿，这被定义为主动脉内壁分离和血肿形成而对于夹层来说伴有内膜撕裂(3)(图6)。该病变也显示出纤维化组织沉积，伴有Mac3阳性巨噬细胞的浸润(图2b-e和图7a、b)，从而确认了KLF6缺陷中的主动脉表型与炎症响应的干扰有关。死亡的小鼠是死于主动脉破裂，这最有可能继发于主动脉夹层/壁内血肿(图2a)。

在机制上，KLF6fl/fl；LysM Cre小鼠显示出主动脉病变中IL-6的表达升高(图2g)和循环水平升高(图2f)。此外，从KLF6fl/fl；LysM Cre小鼠的骨髓获得的巨噬细胞表现出IL-6表达增加(图2h)以及IL-6下游STAT3的激活(图8d)。在来自KLF6fl/fl小鼠与KLF6fl/fl；LysM小鼠的巨噬细胞之间没有看到其它主要的促炎性细胞因子，如IL-1β、MCP-1或TNFα的表达差异(图2h)。通过流式细胞术分析来对这些小鼠的病变的主动脉中的免疫细胞进行表征，显示CD11b+Ly6Chi炎性单核白细胞的群体显著增加并且这一增加也在外周血液中被看到(图2i)。粒细胞(例如中性粒细胞；Ly6G+细胞)的数目或(亚)群在基础条件下或在CaCl2和AngII输注的环境下不受影响(表1和图9a、c)，如通过诸如IL-8或TNFα的炎性细胞因子表达所研究的中性粒细胞的功能活性(图9e)或树突状细胞(谱系-CD11c+细胞)的群体(图9b、d)在这些条件下也不受影响。综上所述，主动脉和循环中炎性单核白细胞的扩增选择性地与本实验模型和条件相关。

TGFβ是马凡氏主动脉病的发病机制中重要的分子(12,14,32-34)，它和它的下游信号转导通路(典型的pSmad-235和非典型的pERK1/212)在KLF6fl/fl；LysM Cre小鼠或杂合敲除小鼠中不受影响(图8a-d)，这表明TGFβ介导的通路不决定性地参与基础表型。

实施例3：GM-CSF是KLF6的下游靶标

随后使用RNA谱分析阵列分析来解决免疫细胞的靶分子和调节机制的描绘。值得注意的是，与对照巨噬细胞相比，源自于KLF6fl/fl；LysM Cre小鼠的骨髓的巨噬细胞中GM-CSF水平显示出响应于AngII刺激的最大增加(3.89倍)(图3a)。

惊人的是，在CaCl₂施用和AngII输注的实验条件下从KLF6fl/fl；LysM Cre小鼠的主动脉获得的巨噬细胞显示出GM-CSF的表达显著增加(图3b)，并且在源自于这些小鼠的骨髓的巨噬细胞中也是如此(图10a)。KLF6fl/fl；LysM Cre小鼠的主动脉中GM-CSF的表达从处理之后的三天起(在主动脉夹层发病之前)升高(图3c)。随后研究了巨噬细胞中KLF6的缺失是否影响GM-CSF的分泌以及进一步的全身循环水平。巨噬细胞和GM-CSF在KLF6fl/fl；LysM Cre小鼠的主动脉中共定位，并且GM-CSF由巨噬细胞响应于促炎性刺激显著产生(图3d和图10b)。在KLF6缺失的小鼠中GM-CSF的循环水平是至少73.3倍(图3e)。因此看来GM-CSF的响应显著增加是KLF6fl/fl；LysM Cre小鼠的主动脉的惊人的标志性特征。

本申请的发明人随后试图了解KLF6调节GM-CSF表达和分泌的基础机制。KLF6的过表达显著地削弱了巨噬细胞中由促炎性刺激诱导的GM-CSF表达(图10c)。在转录上，几个KLF结合位点存在于GM-CSF的启动子区中，KLF6由巨噬细胞中的激动性刺激处理募集到该启动子区(图10d)。这些结果证实，在机制上，GM-CSF是KLF6的直接靶标并且KLF6阻遏GM-CSF的表达。

实施例4：GM-CSF操作调节主动脉夹层/血肿

为了随后测试这些小鼠的主动脉夹层中对GM-CSF的需要，使用中和抗体阻断GM-CSF的作用，除了IL-6的血清水平(图4c)之外，所述中和抗体还消除了主动脉夹层/壁内血肿(图4a、b)以及GM-CSF受体α、MMP9、F4/80以及IL-6的表达(图4d)。GM-CSF因此是为KLF6fl/fl；LysM Cre小鼠中的主动脉表型所需的。

本申请的发明人进一步研究GM-CSF是否足以诱发主动脉病。在经受主动脉炎症(CaCl₂+AngII)的野生型小鼠中施用GM-CSF引起了主动脉夹层/壁内血肿，这确认了GM-CSF在所述病况的发病机制中的作用的一般性。小鼠由于主动脉病变而死于主动脉破裂并且显示所述病况的病理学特征(例如主动脉脆弱、内膜撕裂伴有血肿)(图4e-h)。然而，主动脉夹层/壁内血肿没有因单独施用GM-CSF而产生，即使是在GM-CSF的循环水平异常升高(至少180.9倍)的情况下(图11a、b)。由于AngII、CaCl₂或GM-CSF单独不足以诱发所述病况，因此看来主动脉炎症与GM-CSF输注的组合是为所述表型所必需的(图12a、b)。与此相一致，与单独的每一种措施相比，小鼠的GM-CSF的循环水平只有在用措施的组合处理时才显著升高(图4i)。注意到，这些升高的水平与KLF6fl/fl；LysM Cre小鼠的那些相当，这表明GM-CSF的水平大幅升高是必需的，但是不足以引起主动脉夹层/壁内血肿(图3e)。

最终，研究GM-CSF的操作是否影响外周白细胞的数目。在施用GM-CSF的情况下，在所述模型的早期阶段(5天)或晚期阶段(14天)中循环淋巴细胞的数目没有变化(表2和表3)。对于中性粒细胞，在早期阶段中外周血液中的数目显著增加，但是在GM-CSF施用14天时没有观测到差异。这在其中单独施用GM-CSF而没有引起主动脉表型的组中被类似地看到。虽然这些变化可能是由于外源性GM-CSF处理所引起的急性效应，但是这单独与所述表型无关。此外，当GM-CSF由中和抗体耗尽时，循环粒细胞和淋巴细胞的数目不受影响(表4)。基于这些结果，GM-CSF的操作在本模型中不影响循环白细胞的数目，至少在观测期(14天)期间是这样的。

实施例5：患有主动脉夹层的患者的GM-CSF上调

为了确认这些研究结果的临床相关性，在患有急性主动脉夹层的患者的血清中测量GM-CSF的循环水平，所述患者显示出显著增加，这与显示出显著更低(如果不可忽略不计的话)水平的患有冠状动脉疾病、主动脉瘤的患者或健康志愿者相反(图5a)。此外，在夹层的主动脉中炎症浸润(CD68+单核白细胞/巨噬细胞)和GM-CSF表达上调并且共定位(图5b)。因此，GM-CSF不仅在小鼠中，而且在人类病况中也与主动脉急性夹层有关。

讨论

本发明的研究结果证实GM-CSF是主动脉夹层/壁内血肿的鼠类模型中引起所述病况的关键调节分子，并且也与人类的所述病况有关。在小鼠中，通过中和抗体或外源性施用调节GM-CSF分别防止或诱导了该表型的发生。在人类中，在患有主动脉夹层的患者中看到血清GM-CSF水平和主动脉组织中细胞因子的表达升高。

GM-CSF是本申请的发明人的鼠类模型中主动脉夹层/壁内血肿表型的核心组分。先前的研究已经表明了GM-CSF在主动脉疾病的发病机制中的有限作用(36-39)。举例来说，缺乏smad3的小鼠表现出主动脉瘤形成的表型(39)并且GM-CSF被证实在发病机制中起关键的作用；然而，假定由于smad3是作为与马凡氏主动脉病相关的核心分子的TGFβ的下游靶标，因此该致病机制限于该遗传性主动脉病。所述研究结果证实，以独立于TGFβ-SMAD通路的方式激活GM-CSF通路足以在炎症和退行性主动脉的模型中触发该病况(氯化钙处理引起主动脉硬化以模拟如在动脉粥样硬化性人类主动脉中所看到的病况(40))，这反映了在人类的老年人中所看到的主动脉夹层/壁内血肿，并且应当与患有马凡氏综合征的年轻患者的遗传性主动脉病区别开。还已经证实GM-CSF组织表达在表现寇甘氏病(Cogan'sdisease)中的主动脉夹层的患者中增加(41)，所述寇甘氏病是一种明显自身免疫病况，其特征在于复发性角膜炎症(42)，这被认为是一个孤立的发现。

研究了对其它非巨噬细胞骨髓细胞的影响，显示树突状细胞(CD11c+MHCII+细胞)在KLF6缺陷的条件下在病变的主动脉中增加，但是在循环中没有增加，并且对循环中或主动脉组织中的中性粒细胞(Ly6G+细胞)没有影响(图9和图8)。

巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)也已经被表明是血管重塑的重要调节因子(43,44)。尽管M-CSF的作用的精确分子机制仍不清楚，但是鉴于在血管壁中不同的表达模式，设想与GM-CSF相比不同的作用。尽管M-CSF在生理条件下在内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞以及平滑肌细胞中组成型表达，但是相比之下，GM-CSF在基础条件下仅在这些细胞中以微量表达，但反而由炎症刺激(例如TNF)(45)或氧化低密度脂蛋白(LDL)胆固醇刺激(46)所诱导。在鼠类和人类病变中，M-CSF在健康动脉和与巨噬细胞和泡沫细胞含量相关的动脉粥样硬化病变这两者中均被检测到，并且与后者的斑块进展相关。相比之下，在健康人类动脉的平滑肌细胞和内皮细胞中仅看到微量水平的GM-CSF，但是在动脉粥样硬化发展和巨噬细胞积聚时升高(47)。基于这些观测结果，总的来说，虽然M-CSF是血管系统中的一种组成型表达的细胞因子，但是GM-CSF在病变的血管中被显著地诱导以调节包括所述的主动脉病的病理状况。

关于实验模型，大部分先前的研究已经使用单独的AngII输注作为诱发夹层表型的干预(16,48)。然而，该程序对于包括关于炎症的机制研究的限制是低再现性(小于30％)、需要长期输注AngII(超过4周)以及表型仅在具有特定的遗传背景(ApoE-/-或LDLR-/-小鼠)的老年小鼠(超过7个月至10个月大)中发生/表达。最值得注意的是，本模型可以在2周内以高再现性(至少70％)诱发主动脉夹层/壁内血肿，即使是在年轻的野生型小鼠中。

在机制上，该模型可能涉及由于韦德克瑟尔效应(Windkessel effect)的丧失而对肾上夹层部位施加的血液动力学应力(49)，这是因为肾下主动脉的硬化增加(例如在施用CaCl₂和连续输注AngII之后压力-直径曲线的向下移动)(40)，这显示动脉瘤的形成，当暴露于GM-CSF的炎症作用时，会在薄弱和脆弱的肾上主动脉中触发夹层/壁内血肿形成。由于主动脉瘤通常共同存在于患有夹层的患者中(4)，因此所述的动物模型和研究结果非常类似于在患者中所看到的病况。

综上所述，本文所述的研究结果表明GM-CSF是动脉粥样硬化和炎症性主动脉中主动脉夹层/壁内血肿(这通常在患有该病况的老年患者中看到)的一种重要的调节因子，并且可以用作诊断利用和治疗利用的潜在靶标(例如使用GM-CSF拮抗剂的主动脉稳定)以及诊断性生物标志物。

总结

主动脉夹层和壁内血肿包括涉及主动脉壁分离的主动脉病。所述病况的基础机制尚不清楚。在此，本申请的发明人证实粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是该病况的触发分子。转录因子Krüppel样因子6(KLF6)骨髓特异性条件缺陷小鼠在经受主动脉炎症时表现出该主动脉表型。在机制上，KLF6下调了GM-CSF的表达和分泌。针对GM-CSF的中和抗体的施用防止了这些小鼠中的病况。相反，向野生型小鼠施用GM-CSF与主动脉炎症的组合足以诱导所述表型，这表明了作用的一般性质。此外，患有该病况的患者显示GM-CSF的循环水平大幅增加，所述GM-CSF也在夹层的主动脉中局部表达。GM-CSF因此是引起该主动脉病的关键调节分子，并且调节该细胞因子是用于所述病况的可利用的治疗策略。

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25 Ezekowitz,R.A.,Austyn,J.,Stahl,P.D.以及Gordon,S.《卡介苗激活的小鼠巨噬细胞的表面特性：甘露糖特异性内吞、Fc受体、以及抗原F4/80的表达降低伴随Ia的诱导(Surface properties of bacillus Calmette-Guerin-activated mousemacrophages.Reduced expression of mannose-specific endocytosis,Fc receptors,and antigen F4/80accompanies induction of Ia)》,J Exp Med 154,60-76(1981)。

26 Atreya,R.等《阻断白细胞介素6反式信号转导抑制慢性肠道炎症中T细胞对细胞凋亡的抗性：克罗恩氏病和实验性结肠炎的体内证据(Blockade of interleukin6trans signaling suppresses T-cell resistance against apoptosis in chronicintestinal inflammation:evidence in crohn disease and experimental colitis invivo)》,Nat Med 6,583-588(2000)。

27 Cheuk,B.L.和Cheng,S.W.《前列腺素E2、血栓素B2、以及白细胞介素-6的局部分泌可能在腹主动脉瘤破裂中起作用吗？(Can local secretion of prostaglandin E2,thromboxane B2,and interleukin-6play a role in ruptured abdominal aorticaneurysm？)》,World J Surg 32,55-61(2008)。

28 Dawson,J.等《主动脉瘤将白细胞介素-6分泌到循环中(Aortic aneurysmssecrete interleukin-6into the circulation)》,J Vasc Surg 45,350-356(2007)。

29 Dawson,J.,Cockerill,G.,Choke,E.,Loftus,I.以及Thompson,M.M.《主动脉瘤作为循环白细胞介素-6的来源(Aortic aneurysms as a source of circulatinginterleukin-6)》,Ann N Y Acad Sci 1085,320-323(2006)。

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40 Kimura,T.等《生腱蛋白C在小鼠中保护主动脉防止急性夹层(Tenascin Cprotects aorta from acute dissection in mice)》,Sci Rep 4,4051(2014)。

41 Weissen-Plenz,G.等《与寇甘氏综合征相关的主动脉夹层：血管结构完整性的有害丧失与巨噬细胞和平滑肌细胞中的GM-CSF过度刺激有关(Aortic dissectionassociated with Cogans's syndrome:deleterious loss of vascular structuralintegrity is associated with GM-CSF overstimulation in macrophages and smoothmuscle cells)》,J Cardiothorac Surg 5,66(2010)。

42 Kessel,A.,Vadasz,Z.以及Toubi,E.《寇甘氏综合征——发病机制、临床变异以及治疗方法(Cogan syndrome-Pathogenesis,clinical variants and treatmentapproaches)》,Autoimmun Rev 13,351-354(2014)。

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44 Brocheriou,I.等《M-CSF和GM-CSF对巨噬细胞表型的拮抗性调节：动脉粥样硬化中的启示(Antagonistic regulation of macrophage phenotype by M-CSF and GM-CSF:implication in atherosclerosis)》,Atherosclerosis 214,316-324(2011)。

45 Filonzi,E.L.,Zoellner,H.,Stanton,H.以及Hamilton,J.A.《人类动脉平滑肌细胞中粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和巨噬细胞集落刺激因子产生的细胞因子调节(Cytokine regulation of granulocyte-macrophage colony stimulating factor andmacrophage colony-stimulating factor production in human arterial smoothmuscle cells)》,Atherosclerosis 99,241-252(1993)。

46 Sakai,M.等《糖皮质激素通过抑制粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子的表达来抑制氧化LDL诱导的巨噬细胞生长(Glucocorticoid inhibits oxidized LDL-inducedmacrophage growth by suppressing the expression of granulocyte/macrophagecolony-stimulating factor)》,Arterioscler Thromb Vasc Biol 19,1726-1733(1999)。

47 Plenz,G.,Koenig,C.,Severs,N.J.以及Robenek,H.《在未病变和动脉粥样硬化人类冠状动脉中平滑肌细胞表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Smooth muscle cellsexpress granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in the undiseasedand atherosclerotic human coronary artery)》,Arterioscler Thromb Vasc Biol 17,2489-2499(1997)。

48 Saraff,K.,Babamusta,F.,Cassis,L.A.以及Daugherty,A.《在输注血管紧张素II的载脂蛋白E缺陷小鼠中主动脉夹层先于动脉瘤和动脉粥样硬化的形成(Aorticdissection precedes formation of aneurysms and atherosclerosis in angiotensinII-infused,apolipoprotein E-deficient mice)》,Arterioscler Thromb Vasc Biol23,1621-1626(2003)。

49 Cavalcante,J.L.,Lima,J.A.,Redheuil,A.以及Al-Mallah,M.H.《主动脉硬度：目前的了解和未来的方向(Aortic stiffness:current understanding and futuredirections)》,J Am Coll Cardiol 57,1511-1522(2011)。

50 Tarocchi,M.等《KLF6+/-小鼠中致癌物诱发的肝肿瘤再现了与p53通路失调相关的侵袭性人类肝细胞癌(Carcinogen-induced hepatic tumors in KLF6+/-micerecapitulate aggressive human hepatocellular carcinoma associated withp53pathway deregulation)》,Hepatology 54,522-531(2011)。

51 Clausen,B.E.,Burkhardt,C.,Reith,W.,Renkawitz,R.以及Forster,I.《使用LysMcre小鼠的巨噬细胞和粒细胞中的条件基因靶向(Conditional gene targeting inmacrophages and granulocytes using LysMcre mice)》,Transgenic Res 8,265-277(1999)。

Claims

1.一种粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)负调节剂，所述负调节剂用于治疗、预防或改善主动脉病。

2.根据权利要求1所述的供使用的GM-CSF负调节剂，其中所述GM-CSF负调节剂用于治疗、预防或改善选自由以下各项组成的组的主动脉病性病况：主动脉夹层；主动脉壁内血肿进展或复发；主动脉瘤扩大、炎症和/或破裂；以及主动脉炎。

3.根据权利要求1或2所述的供使用的GM-CSF负调节剂，其中所述GM-CSF负调节剂用于维持治疗以在已经接受急性主动脉夹层的初次手术修正的受试者中预防复发性主动脉夹层。

4.根据权利要求1或2所述的供使用的GM-CSF负调节剂，其中所述GM-CSF负调节剂用于维持治疗以在患有慢性主动脉夹层的受试者中预防主动脉夹层进展。

5.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的GM-CSF负调节剂，其中所述GM-CSF负调节剂被配置成：-

(i)改变用于实现GM-CSF信号转导的GM-CSF受体或信号转导分子的构象状态，这是例如通过使所述巨噬细胞受体的活性构象不稳定和/或将所述受体维持在它的无活性构象，从而防止它结合它的天然配体，即GM-CSF来实现的；

(ii)与所述用于实现GM-CSF信号转导的GM-CSF受体结合并且防止、减少或削弱所述受体处的传递；

(iii)将由所述负调节剂与所述GM-CSF受体、或与GM-CSF本身结合所激活的下游信号转导通路下调或去激活；

(iv)减少、防止或削弱GM-CSF的转录、翻译或表达；

(v)抑制GM-CSF的合成或从细胞内储备的释放；和/或

(vi)增加GM-CSF的降解速率。

6.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的GM-CSF负调节剂，其中所述负调节剂包括抗GM-CSF抗体或其抗原结合片段。

7.根据权利要求6中任一项所述的供使用的GM-CSF负调节剂，其中所述抗GM-CSF抗体或其抗原结合片段特异性结合SEQ ID No:2、或其变体或片段。

8.根据权利要求5或6所述的供使用的GM-CSF负调节剂，其中所述抗GM-CSF抗体或其抗原结合片段特异性结合SEQ ID No:3、或其变体或片段。

9.根据权利要求5至8中任一项所述的供使用的GM-CSF负调节剂，其中所述抗体或其抗原结合片段包括单克隆抗体或其抗原结合片段。

10.根据权利要求5至9中任一项所述的供使用的GM-CSF负调节剂，其中所述抗体是人类抗体或人源化抗体。

11.一种主动脉病治疗药物组合物，所述组合物包含根据权利要求1至10中任一项所述的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)负调节剂；以及任选的药学上可接受的媒介物。

12.一种用于制备根据权利要求11所述的药物组合物的方法，所述方法包括将治疗有效量的根据权利要求1至10中任一项所述的GM-CSF负调节剂与药学上可接受的媒介物组合。

13.粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或其变体或片段用作用于检测或诊断主动脉病的生物标志物的用途。

14.根据权利要求13所述的用途，其中SEQ ID No:2或其变体或片段用作生物标志物，所述生物标志物可以被检测。

15.根据权利要求13或14所述的用途，其中SEQ ID No:2或其变体或片段用作由权利要求5至10中任一项中所限定的抗体或抗原结合片段结合的表位。

16.一种用于诊断患有主动脉病、或对其有易感性的受试者、或用于提供所述受试者的病况的预后的试剂盒，所述试剂盒包括：-

(ii)来自没患主动脉病的个体的样品中GM-CSF的浓度的参考；

其中所述试剂盒被配置成鉴定所述来自所述测试受试者的身体样品中所述GM-CSF的浓度与所述参考相比的差异，从而表明所述测试受试者患有主动脉病或对其有易感性，或提供所述受试者的病况的不良预后。

17.一种用于诊断患有主动脉病或对其有易感性的受试者、或用于提供所述受试者的病况的预后的方法，所述方法包括分析从受试者获得的身体样品中粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、或其变体或片段的浓度；以及将所述浓度与没患主动脉病的个体的GM-CSF浓度的参考相比较，其中所述来自所述测试受试者的身体样品中所述GM-CSF的浓度与所述参考相比的差异表明所述受试者患有主动脉病或对其有易感性，或提供所述受试者的病况的不良预后。

18.根据权利要求16所述的试剂盒或根据权利要求17所述的方法，其中从所述受试者获得样品，并且在测定中测量所述粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、或其变体或片段的浓度。

19.根据权利要求16至18中任一项所述的试剂盒或方法，其中所述样品是尿液样品或血液样品。

20.根据权利要求16至19中任一项所述的试剂盒或方法，其中在血浆或血清样品中分析或测定所述GM-CSF或变体或片段。

21.根据权利要求16至20中任一项所述的试剂盒或方法，其中与所述参考对照值相比，所述浓度差异是增加，这指示主动脉病。

22.根据权利要求16至21中任一项所述的试剂盒或方法，其中通过免疫测定(例如ELISA)，使用对GM-CSF具有特异性的单克隆抗体来实现检测。