KR20210150981A - Gfral 길항 항체 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 GFRAL 길항 항체 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게, 본 발명은 특정 서열의 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR을 포함하는 항-GFRAL 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대한 것이다. 상기 항-GFRAL 항체는 암 관련 식욕 부진 또는 악액질 증후군 및 화학요법 항암제 부작용 개선 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
Description
본 발명은 GFRAL 길항 항체 및 이의 용도에 대한 것이다.
1975년 최초의 단일클론항체를 도출한 이래로 항원에 대한 강한 결합 친화력을 가지는 항체의 특성을 이용하여 1994년 처음 항체치료제가 출시되었고, 치료용 항체는 의약품 중에서 가장 빠른 성장을 기록하고 있다. 2007년 기준 치료용 항체의 세계 시장 규모는 270억 달러이며 2011년 447억 달러, 2016년 577억 달러로 지속적인 성장을 보이고 있다. 이러한 성장을 바탕으로 2014년도 기준 전 세계 의약품 매출 중 항체의약품의 매출 비중은 10%를 기록했으며, 2016년 매출 상위 10대 의약품 중 6개가 항체 의약품이다. 화학 합성물질을 기반으로 한 기존 치료제들에 비해 항체의약품들은 높은 결합 특이성 및 인체 내 안정성으로 인해 상대적으로 부작용이 적고 치료 효능은 우수한 것으로 증명되고 있으며, 항체의약품 개발 분야는 신약 연구개발의 차세대 핵심 분야로 각광 받고 있다. 이와 함께 항체의약품 개발 과정에 필수적인 고분자 단백질 발현, 생산, 정제 및 공학 기술 등의 비약적인 발전과 임상 실험 성공률이 높아 항체의약품은 차세대 치료제로 자리 잡을 것으로 보인다.
암 관련 식욕 부진 또는 악액질 증후군 (CACS, Cancer-related anorexia-cachexia syndrome)은 지속적인 식욕 부진 및 체중 감소를 특징으로 한 과도한 이화 상태를 의미하며, 이로 인해 근육 및 지방 분해의 증가, 영양학적 대사 불균형, 기초 대사량의 증가 등을 초래하여 전체적인 신체 기능 저하를 불러온다. 이러한 CACS는 암 환자에서 중요한 사망 원인 중 하나이며 부정적인 치료 결과를 예측할 수 있는 가장 중요한 독립 예후 인자이다. 나아가 항암화학요법이나 방사선치료 또는 수술 등의 치료로 인한 영양섭취 제한 등이 동반되어 치료에 대한 반응율이 낮고 효율적인 치료의 진행도 어려워져 결과적으로 환자의 생존율이나 삶의 질을 저하시키는 주요 원인이다. 그럼에도 불구하고 CACS는 과소평가되고 있으며, 미충족 의료 수요가 남아있지만 현재 일반적인 식욕촉진제, 근육 합성 촉진제 등으로는 효과적인 치료를 기대하기 어려운 상황이다.
GDF15(Growth differentiation factor 15)는 면역 반응, 대사 작용 등에 관여하여 생체 내에서 다양한 기능을 하는 사이토카인이다. 정상적인 상황에서 GDF15는 대부분의 조직에서 저농도로 발현되며 간, 신장, 심장 및 폐와 같은 조직의 손상 시에 그 수치가 크게 증가한다. 2007년 전립선암 환자의 체내에서 식욕부진을 통한 악액질을 유도하는 물질이 GDF15이며, 전립선암 환자의 경우 혈액 내 GDF15의 농도가 정상인의 10~100배로 증가하며 암 환자들의 식욕부진을 통한 체중 감소와 GDF15 농도 사이에 분명한 상관관계가 있음이 밝혀졌다 (Nature medicine 2007; 12(10); 1333-40). 2016년 GDF15가 다양한 암종에서 악액질을 유도하는 주요 사이토카인임이 밝혀졌으며 GDF15 항체는 다양한 암 악액질 마우스 모델에서 체중 증가와 근육, 지방 조직의 손실을 완화하며 악액질 개선 효과를 보였다 (Journal of cachexia, sarcopenia and muscle 2016; 7: 467-482).
2015년 시스플라틴과 같은 화학항암제를 처리하였을 때의 부작용으로 GDF15 발현이 증가하고 식욕 부진과 악액질 증상을 통해 항암치료에 대한 저항성을 증가시킨다는 것이 알려졌다 (PLoS One 2015; 10(1); e0115372). 2017년 GDF15가 수용체 GFRAL을 통해 식욕을 억제한다는 사실이 밝혀졌으며, GDF15 단독처리 혹은 시스플라틴 처리 후 GDF15의 신호전달 과정은 GFRAL 의존적으로 작용한다는 것이 밝혀졌다 (Nature 2017; 550(7675); 255-259). GFRAL은 공동 수용체인 RET와 함께 세포 내부로 신호를 전달하며, 항체의약품의 접근이 가능한 뇌혈관 장벽 바깥쪽인 후뇌(hindbrain) AP(Area postrema), NTS(Nucleus tractus solitaris) 지역에 특이적으로 발현한다.
이에, 항 GFRAL 항체는 시스플라틴과 같은 백금항암제 투여로 인해 CACS를 겪는 암환자의 식욕부진 현상을 개선하고, 이에 따른 체중 증가와 골격근 대사량 증가를 통해 항암화학요법에 대한 저항성을 줄여 암 환자의 복지 증가 및 생명 연장에 기여할 수 있다.
본 발명의 목적은 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암 관련 식욕 부진 또는 악액질 증후군 (CACS, Cancer-related anorexia-cachexia syndrome) 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 항암제로 인한 식욕 부진 또는 악액질 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암 관련 식욕 부진 또는 악액질 증후군 (CACS, Cancer-related anorexia-cachexia syndrome) 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암 관련 식욕 부진 또는 악액질 증후군 (CACS, Cancer-related anorexia-cachexia syndrome) 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 항암제로 인한 식욕 부진 또는 악액질 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 항암제로 인한 식욕 부진 또는 악액질 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 GFRAL 길항 항체 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게, 본 발명은 특정 서열의 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR을 포함하는 항-GFRAL 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 대한 것이다. 상기 항-GFRAL 항체는 암 관련 식욕 부진 또는 악액질 증후군 및 화학요법 항암제 부작용 개선 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
도 1은 에폭시 비드와 항원 GFRAL (마우스 및 인간)을 이용한 파지 디스플레이 방법을 도시하여 나타낸 것이다.
도 2는 산성 버퍼를 이용한 용출 후 파지 디스플레이 각 라운드별 박테리오파지 라이브러리의 GFRAL에 대한 결합력을 다중 파지 효소결합 면역흡착 분석법을 통해 확인한 결과이다.
도 3은 리간드 GDF15를 이용한 용출 후 파지 디스플레이 각 라운드별 박테리오파지 라이브러리의 GFRAL에 대한 결합력을 다중 파지 효소결합 면역흡착 분석법을 통해 확인한 결과이다.
도 4는 단일 파지 효소결합 면역흡착 분석법 진행 후 GFRAL에 대한 결합력을 확인한 4가지 단일 클론의 결과이다.
도 5는 4가지 단일 클론의 CDR 부위별 아미노산 서열을 확인한 결과이다.
도 6은 4가지 단일 클론을 단백질로 발현, 정제 후 GFRAL에 대한 결합력을 효소결합 면역흡착 분석법을 통해 확인한 결과이다.
도 7은 단일 클론 A11이 GFRAL에 결합함을 면역세포화학법으로 확인한 결과이다.
도 8은 상업용 항체가 GFRAL에 결합함을 면역세포화학법으로 확인한 결과이다.
도 9는 단일 클론 A11의 GFRAL에 대한 결합력을 표면 플라스몬 공명을 통해 확인한 결과이다.
도 10은 GFRAL/RET/Luciferase 과발현 세포에서 단일 클론 A11에 의한 luciferase 발현 감소를 리포터 어세이를 통해 확인한 결과이다.
도 11은 GFRAL/RET 과발현 세포에서 단일 클론 A11에 의한 pERK 발현 감소를 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과이다.
도 12는 도 11의 결과를 densitometry를 통해 수치상으로 나타낸 결과이다.
도 13은 마우스 모델에서 단일 클론 A11에 의한 시스플라틴의 체중 감소 효과 완화를 확인한 결과이다.
도 14는 마우스 모델에서 단일 클론 A11에 의한 시스플라틴의 식욕 감소 효과 완화를 확인한 결과이다.
도 15는 마우스 모델에서 시스플라틴에 의해 변화한 GDF15의 농도를 확인한 결과이다.
도 16은 마우스 모델에서 단일 클론 A11에 의한 시스플라틴의 지방량 감소 효과 완화를 확인한 결과이다.
도 17은 마우스 모델에서 단일 클론 A11에 의한 시스플라틴의 근육량 감소 효과 완화를 확인한 결과이다.
도 18은 마우스 모델에서 단일 클론 A11에 의한 시스플라틴의 활성 억제를 면역조직화학법을 통해 확인한 결과이다.
도 19는 동종이식 마우스 종양모델에서 단일 클론 A11에 의한 시스플라틴의 체중 감소 효과 완화를 확인한 결과이다.
도 20은 동종이식 마우스 종양모델에서 단일 클론 A11에 의한 시스플라틴의 식욕 감소 효과 완화를 확인한 결과이다.
도 21은 동종이식 마우스 종양모델에서 시스플라틴에 의해 변화한 GDF15의 농도를 확인한 결과이다.
도 22는 동종이식 마우스 종양모델에서 단일 클론 A11에 의한 시스플라틴의 지방량 감소 효과 완화를 확인한 결과이다.
도 23은 동종이식 마우스 종양모델에서 단일 클론 A11에 의한 시스플라틴의 근육량 감소 효과 완화를 확인한 결과이다.
도 2는 산성 버퍼를 이용한 용출 후 파지 디스플레이 각 라운드별 박테리오파지 라이브러리의 GFRAL에 대한 결합력을 다중 파지 효소결합 면역흡착 분석법을 통해 확인한 결과이다.
도 3은 리간드 GDF15를 이용한 용출 후 파지 디스플레이 각 라운드별 박테리오파지 라이브러리의 GFRAL에 대한 결합력을 다중 파지 효소결합 면역흡착 분석법을 통해 확인한 결과이다.
도 4는 단일 파지 효소결합 면역흡착 분석법 진행 후 GFRAL에 대한 결합력을 확인한 4가지 단일 클론의 결과이다.
도 5는 4가지 단일 클론의 CDR 부위별 아미노산 서열을 확인한 결과이다.
도 6은 4가지 단일 클론을 단백질로 발현, 정제 후 GFRAL에 대한 결합력을 효소결합 면역흡착 분석법을 통해 확인한 결과이다.
도 7은 단일 클론 A11이 GFRAL에 결합함을 면역세포화학법으로 확인한 결과이다.
도 8은 상업용 항체가 GFRAL에 결합함을 면역세포화학법으로 확인한 결과이다.
도 9는 단일 클론 A11의 GFRAL에 대한 결합력을 표면 플라스몬 공명을 통해 확인한 결과이다.
도 10은 GFRAL/RET/Luciferase 과발현 세포에서 단일 클론 A11에 의한 luciferase 발현 감소를 리포터 어세이를 통해 확인한 결과이다.
도 11은 GFRAL/RET 과발현 세포에서 단일 클론 A11에 의한 pERK 발현 감소를 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과이다.
도 12는 도 11의 결과를 densitometry를 통해 수치상으로 나타낸 결과이다.
도 13은 마우스 모델에서 단일 클론 A11에 의한 시스플라틴의 체중 감소 효과 완화를 확인한 결과이다.
도 14는 마우스 모델에서 단일 클론 A11에 의한 시스플라틴의 식욕 감소 효과 완화를 확인한 결과이다.
도 15는 마우스 모델에서 시스플라틴에 의해 변화한 GDF15의 농도를 확인한 결과이다.
도 16은 마우스 모델에서 단일 클론 A11에 의한 시스플라틴의 지방량 감소 효과 완화를 확인한 결과이다.
도 17은 마우스 모델에서 단일 클론 A11에 의한 시스플라틴의 근육량 감소 효과 완화를 확인한 결과이다.
도 18은 마우스 모델에서 단일 클론 A11에 의한 시스플라틴의 활성 억제를 면역조직화학법을 통해 확인한 결과이다.
도 19는 동종이식 마우스 종양모델에서 단일 클론 A11에 의한 시스플라틴의 체중 감소 효과 완화를 확인한 결과이다.
도 20은 동종이식 마우스 종양모델에서 단일 클론 A11에 의한 시스플라틴의 식욕 감소 효과 완화를 확인한 결과이다.
도 21은 동종이식 마우스 종양모델에서 시스플라틴에 의해 변화한 GDF15의 농도를 확인한 결과이다.
도 22는 동종이식 마우스 종양모델에서 단일 클론 A11에 의한 시스플라틴의 지방량 감소 효과 완화를 확인한 결과이다.
도 23은 동종이식 마우스 종양모델에서 단일 클론 A11에 의한 시스플라틴의 근육량 감소 효과 완화를 확인한 결과이다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
한편, 서열번호 1 내지 서열번호 24로 표시되는 아미노산으로 이루어진 CDR들은 아래 표 1에 기재하였다.
| VH | VL | |||||
| CDR1 | CDR2 | CDR3 | CDR1 | CDR2 | CDR3 | |
| A8 | GFTFDDYA (서열번호 1) |
ISWNSGNI (서열번호 2) |
CAKDISYGSGSSFDY (서열번호 3) |
SSDVGGYNY (서열번호 4) |
GVT (서열번호 5) |
LSYAGSYNWV (서열번호 6) |
| A11 | GFTFSSYG (서열번호 7) |
ISYDGSNK (서열번호 8) |
CAKVTSGGDFWSGNYYYYMDV (서열번호 9) |
SLRDYY (서열번호 10) |
GKN (서열번호 11) |
NSRGSSNQWV (서열번호 12) |
| B9 | GGTFSSYA (서열번호 13) |
IIPIFGTA (서열번호 14) |
CARPMDRYSLTTPLAFDI (서열번호 15) |
SSDVGGYDY (서열번호 16) |
EVS (서열번호 17) |
SSYAGSNDLV (서열번호 18) |
| D12 | GYTFTGYY (서열번호 19) |
INPNSGGT (서열번호 20) |
CAKDQWLGHYGMDV (서열번호 21) |
QGISSS (서열번호 22) |
AAS (서열번호 23) |
QQTYHTPQT (서열번호 24) |
본 발명에서 용어, “항체”는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 그 예로, 단일 클론 항체, 다클론 항체, 전장항체(full-length antibody) 및 항체 단편을 모두 포함할 수 있다. 또한 상기 용어, “항체”는 이가(bivalent) 또는 이중 특이성 분자(예컨대, 이중특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 또는 테트라바디를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, “단일 클론 항체”는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일 클론 항체는 다클론 항체가 여러 개의 에피토프에 결합할 수 있는 것과 달리, 특정 에피토프에 대해 단일 결합성 및 친화도를 나타낸다. 본 발명에서 용어, “전장항체”는 2 개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다. IgG는 서브타입(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.
본 발명에서 용어, “중쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 VH 및 3 개의 불변 영역 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에서 용어, “경쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 VL 및 불변 영역 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, “단편”, “항체 단편” 및 “항원 결합 단편”은 항체의 항원결합 기능을 보유하는 본 발명의 항체의 임의의 단편을 지칭하는 것으로 호환적으로 사용된다. 예시적인 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 GFRAL에 특이적으로 결합하는 능력을 나타낼 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 리신과 히스티딘은 모두 양전하를 띈 잔기이고; 알라닌, 글리신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이점에 기초하여, 아르기닌, 라신과 히스티딘; 알라닌, 글리신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산 분자의 서열은 변형될 수 있으며, 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, "벡터"는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA 분자를 의미한다.
본 발명에서 있어서, “발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 앰피실린(Ampicillin), 카나마이신(Kanamycin), 제네티신(Geneticin; G418), 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(Hygromycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, CMV의 프로모터와 인핸서, 레트로바이러스의 LTR, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함될 수 있다.
본 발명의 항체를 발현하는 벡터는, 경쇄와 중쇄가 하나의 벡터에서 동시에 발현되는 벡터 시스템이거나 또는 경쇄와 중쇄를 각각 별도의 벡터에서 발현시키는 시스템 모두 가능하다. 후자의 경우, 두 벡터는 동시 형질전환(co-transfomation) 및 표적 형질전환(targeted transformation)을 통하여 숙주세포로 도입된다. 동시 형질전환은 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 각각의 벡터 DNA를 동시에 숙주세포로 도입한 뒤 경쇄와 중쇄를 모두 발현하는 세포를 선별하는 방법이다. 표적 형질전환은 경쇄(또는 중쇄)를 포함하는 벡터로 형질전환 된 세포를 선별하고 경쇄를 발현하는 선별된 세포를 중쇄(또는 경쇄)를 포함하는 벡터로 다시 형질전환 하여 경쇄 및 중쇄 모두를 발현하는 세포를 최종적으로 선별하는 방법이다.
또한, 본 발명은 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 세포는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 숙주 세포일 수 있으며, 예컨대, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주 세포를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조 방법에서 형질전환 세포의 배양은 관련 기술 분야에 공지된 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 통상의 기술자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 세포 배양은, 세포의 성장 방식에 따라 현탁배양과 부착배양, 배양방법에 따라 회분식, 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다.
또한, 본 발명은 상기 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암 관련 식욕 부진 또는 악액질 증후군 (CACS, Cancer-related anorexia-cachexia syndrome) 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 암 전이 예방 또는 치료용 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 될 수 있으며, 본 발명의 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화하여 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암 관련 식욕 부진 또는 악액질 증후군 (CACS, Cancer-related anorexia-cachexia syndrome) 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽, 음료 또는 환의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강식품조성물은 유효성분인 본 발명에 따른 조성물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물에 함유된 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 항암제로 인한 식욕 부진 또는 악액질 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 항암제로 인한 식욕 부진 또는 악액질 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
보다 바람직하게는, 상기 항암제는 시스플라틴(cisplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로람부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아(nitrosourea), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 타목시펜(tamoxifen), 탁솔(taxol), 트랜스플라티눔(transplatinum), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin) 및 메토트렉세이트(methotrexate)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 항암 보조제로서 사용될 수도 있다. 본 발명에서 항암 보조제란 항암제 투여시 유발되는 부작용을 개선할 수 있는 것을 의미한다. 즉, 본 발명의 항암 보조제를 항암제와 병용하여 투여함으로써, 항암제에 의해 유발되는 다양한 부작용들의 발생을 예방할 수 있다. 본 발명의 상기 보조제는 항암제와 동시에(simutaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있다. 상기 본 발명에 따른 항암 보조제의 투여 순서 즉, 항암제와 항암 보조제 중에서 어떤 것을 어느 시점에서, 동시에, 개별적 또는 순차적으로 투여할 것인지의 여부는 의사나 전문가에 의해 결정될 수 있다. 이러한 투여 순서는 많은 인자에 따라 달라질 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
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실시예
1> 세포배양
HEK-293FT 세포(인간 배아 신장)는 10% 우태아혈청, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지(Hyclone)에서 배양하고, Expi-293F 세포(인간 배아 신장)은 Expi-293 expression medium 배지(Gibco)에서 배양하였다.
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실시예
2> 파지 디스플레이 방법
Dynabeads M-270 에폭시 비드(#14301, Invitrogen)에 재조합 인간 GFRAL(#9647-GR, R&D systems) 또는 재조합 마우스 GFRAL(#9844-GR, R&D systems)을 결합시킨 후 인간 환자 유래 scFv 라이브러리를 이용한 파지 디스플레이를 진행하였다. 인간 GFRAL과 마우스 GFRAL에 대해 교차로 각각 2회의 패닝을 진행하였다. 파지를 상온에서 일반 비드에 1시간 반응시킨 후 결합하지 않은 상층액을 GFRAL 결합 비드에 2시간 반응시켰고, 3-8회 세척 후 GFRAL과 결합한 파지를 재조합 인간 GDF15 리간드(#8146-GD, R&D systems) 또는 산성 버퍼(0.1 M 글라이신-염화수소, pH 2.2)를 이용하여 용출하였다.
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실시예
3> 다중 클론 파지 효소결합 면역흡착 분석법
96 well half area plate(#3690, Corning)를 재조합 인간 GFRAL 또는 재조합 마우스 GFRAL, 또는 소혈청알부민과 4℃에서 밤새 반응시켜 코팅한 뒤 PBS를 이용하여 1회 세척하였다. 이후 5% 탈지우유가 포함된 PBS로 37℃에서 1시간 블로킹시켰다. 이후 라운드별 파지 라이브러리와 37℃에서 2시간 반응시킨 뒤 PBS를 이용하여 5회 세척하고, HRP가 접합된 항 파지 항체(#11973-MM05T-H, Sino Biological)와 37℃에서 1시간 반응시킨 후 PBS로 5회 세척하였다. 마지막으로 TMB를 이용하여 상온에서 10분간 발색시킨 뒤 정지 용액을 이용하여 발색을 정지시켰다. 이후 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 450nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
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실시예
4> 단일 클론 파지 효소결합 면역흡착 분석법
단일 클론 파지 획득을 위해 96 well deep well plate(#90060, Bioneer) 각 웰에 칼베니실린(#C1389, Sigma)이 50 ug/ml 농도로 포함된 SB 미디어를 분주하고 파지 라이브러리를 포함한 콜로니를 접종시켜 37℃, 250 rpm 조건에서 3시간 배양하였다. 이후 M13K07 헬퍼 파지를 1010 phage/ml 농도로 처리하고 같은 조건에서 2시간 더 배양하였다. 이후 카나마이신(#K4000, Sigma)을 70 ug/ml 농도로 처리하고 밤새 배양하였다. 파지 효소결합 면역흡착 분석법 진행시 블로킹 후 배양액 중 일부를 처리하였고 나머지 과정은 다중 클론 파지 효소결합 면역흡착 분석법과 동일하게 진행하였다.
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실시예
5> 고성능 액체 크로마토그래피를 이용한 정제방법
GFRAL에 결합력을 가지는 단일 클론의 scFv 서열은 pFUSE 벡터(#pfuse hg1fc2, InvivoGen)를 기반으로 구성된 발현 벡터로 sfiI 제한효소를 이용해 옮겨진 후 Expi293F 세포 내로 형질주입되었다. 형질주입은 ExpiFectamine 293 Transfection Kit(#A14524, Gibco)를 사용하여 진행하였다. Expi293F 세포를 500 ml 플라스크에 약 2.5×106 세포/ml 밀도로 배양하고, Opti-MEM(#31985-070, Gibco) 배지 하에 ExpiFectamine 293 Reagent, scFv를 발현하는 벡터를 혼합하여 처리한 후 37℃, 125rpm 조건에서 밤새 배양하였다. 다음날 ExpiFectamine 293 Transfection Enhancer 1과 2를 처리한 후 3일 동안 더 배양하여 scfv-Fc 형태의 항체가 생성되도록 하였다. 그 후 상등액을 AKTA prime plus(GE healthcare) 정제기와 IgG 분리 칼럼(#17-0404-01, GE healthcare)을 이용하여 정제하였다. 20 mM 인산 나트륨 버퍼(pH 7.4)로 칼럼에 항체를 결합시킨 후 0.1 M 글라이신-염화수소 버퍼(pH 2.7)로 용출하는 과정을 진행하였다. 그 후 Amicon Ultra-4-30K(#UFC803024, Millipore)로 농축하였고 Spin-X filter (#8160, Corning)으로 멸균하였다. 내독소는 내독소 제거칼럼(#88274, Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 제거하였고 농도는 BCA 키트(#23227, Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 측정하였다.
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실시예
6> 항체 효소결합 면역흡착 분석법
96 well half area plate를 재조합 인간 GFRAL 또는 재조합 마우스 GFRAL, 또는 소혈청알부민과 4℃에서 밤새 반응시켜 코팅한 뒤 1차 항체로 클론 scFv-Fc 항체를, 2차 항체로 HRP 접합된 항 인간 IgG 항체(#Ab97225, Abcam)를 사용하여 효소결합 면역흡착 분석법을 진행하였다.
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실시예
7>
HEK
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293FT
세포로의 형질주입
HEK-293FT 세포를 6 웰 플레이트에 약 1×106 세포/웰 밀도로 접종하고, Opti-MEM 배지 하에 Lipofectamine 2000 Reagent(#11668-027, Thermo Fisher Scientific), GFRAL을 발현하는 벡터(#OHu31183D, GenScript), RET를 발현하는 벡터(#HG11997-CF, Sino Biological)를 1:1의 비율로 혼합하여 처리한 후 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날 상등액을 제거하고 10% 우태아혈청이 첨가된 신선한 배지로 교체하였다. 이후 ERK 신호전달 과정에 luciferase가 발현하도록 하는 벡터를 주입한 후 37℃에서 밤새 배양 및 다음날 상등액을 제거하고 10% 우태아혈청이 첨가된 신선한 배지로 교체하는 과정을 추가로 진행하였다.
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실시예
8>
면역세포화학법
형질주입된 HEK-293FT 세포를 4웰 세포배양 슬라이드(#154526, Thermo Fisher Scientific)에 약 5×104 세포/웰 밀도로 접종하고 4% 파라포름알데하이드를 상온에서 10분 처리하여 고정하였다. 그 후 1% BSA, 5% 염소 혈청이 포함된 0.1% PBST(Tween 20)를 이용하여 1시간 동안 블로킹하였다. 그 후 1차 항체로 정제한 클론 항체 또는 상업용 GFRAL 항체(#Ab107719, Abcam)와 1시간 반응시켰다. PBST로 3-5회 세척 후 FITC가 결합된 항 인간 IgG 항체(#97224, Abcam) 또는 항 토끼 IgG 항체(#A11008, Invitrogen)와 1시간 반응시켰다. PBST로 3-5회 세척 후 DAPI가 포함된 PBS를 15분 처리하였다. 마운팅 진행 후 현미경으로 형광을 관찰하였다.
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실시예
9> 표면
플라스몬
공명분석법
인간 재조합 GFRAL에 대한 클론 항체의 결합 정도 측정을 위해 Biacore SPR system을 사용하였다. 인간 재조합 GFRAL을 리간드로 하여 20mM 소듐 아세테이트에 용해 후 pH 6.0 조건에서 아민 결합을 이용하여 PEG 칩에 고정시켰다. 그 후 결합 어세이는 pH 7.4 조건에서 PBS에 용해된 클론 항체를 분석물로 하여 진행하였고 30 ㎕/ml의 유속으로 주입되었다. 결합시간은 4분, 해리시간은 6분으로 진행하였으며, 센서 표면은 5-10 mM 수산화나트륨을 주입하여 재생하였다. 결합 곡선과 결합 상수 K a 및 해리 상수 K d , 그리고 평형 상수 K D 값은 Scrubber2 (Biologic Software) 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.
실험 결과 도 9와 같은 결합곡선을 나타내었으며, 결합 상수 K a 값은 5.556×10-5/M·s, 해리 상수 K d 값은 1.083×10-3/s, 그리고 평형 상수 K a 값은 K D = K d / K a 의 계산 방식을 통해 1.95 nM로 계산되었다.
<
실시예
10> 항체에 의한
luciferase의
발현 분석
형질주입된 HEK-293FT 세포를 96웰 플레이트에 약 7×104 세포/웰 밀도로 접종하고 2시간 동안 혈청결핍 상태로 유지하였고 이후 2시간 동안 클론 항체를 처리하여 반응시켰다. 그 후 5분 동안 인간 재조합 GDF15를 처리하고 luciferase 효소의 기질이 포함된 시약 (#E2610, Promega)을 사용하여 발광 정도를 측정하였다.
실험 결과 도 10과 같이, GDF15만을 처리하였을 때 발광값이 증가하였고 클론 A11 및 D12를 전처리한 실험군에서 처리 농도에 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
<
실시예
11> 항체에 의한
pERK의
발현 분석
형질주입된 HEK-293FT 세포를 24웰 플레이트에 약 2×105 세포/웰 밀도로 접종하고 2시간 동안 혈청결핍 상태로 유지하였고 이후 2시간 동안 클론 항체를 처리하여 반응시켰다. 그 후 5분 동안 인간 재조합 GDF15를 처리하고 PBS로 세척 후 세포를 수확하여 웨스턴 블랏을 진행하였다. 세포질 또는 세포막 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고, 니트로셀룰로오스 막으로 이동시켰다. 이후, 각각의 일차 항체와 배양하고, HRP가 접합된 이차 항체로 배양하였다. ECL 검출 시약(#34095, Thermo Fisher Scientific, #RPN2209, GE Healthcare)을 사용하여 이미지를 시각화하고 ECL 하이퍼 필름(AGFA, Morstel)을 사용하여 정량화하였다. 필름 내 이미지는 ImageJ 프로그램을 사용하여 수치화하였고 AAT Bioquest의 IC50 calculator를 통해 그래프로 나타내었다.
실험 결과 도 11과 같이, GDF15만을 처리한 실험군에서 pERK의 발현량이 증가하였고 클론 A11을 전처리한 실험군에서 pERK 발현량이 처리 농도에 의존적으로 감소하는 것을 확인하였고, IC50 값은 4.9 μg/ml로 측정되었다. 필름 내 이미지는 정량화하여 도 12와 같이 나타내었다.
<
실시예
12> 항체에 의한
시스플라틴의
부작용 완화 분석
8주령의 마우스에 시스플라틴을 10mg/kg의 농도로 주입하고 효능이 없는 대조군 항체 혹은 클론 A11을 10mg/kg 주입한 후 시스플라틴에 의해 유도되는 부작용이 완화되는지 확인하였다. 약물은 일주일에 두 번 간격으로 주입하였다.
실험 결과 도 13과 같이 시스플라틴에 의해 유도되는 체중 감소 효과가 A11에 의해 복구되는 것을 확인하였고, 도 14와 같이 식욕 감소 효과도 완화시킨다는 것을 확인하였다. 도 15에서 볼 수 있듯이 GDF15의 발현 정도는 대조군 그룹과 A11 처리 그룹에서 차이가 없었다. 구체적인 지방 및 근육의 무게 변화는 도 16과 도 17과 같이 정량하여 나타내었다. 도 18을 통해 A11의 효과가 마우스 뇌의 GFRAL의 작용을 억제함을 통해 나타난다는 것을 확인하였다.
<
실시예
13>
면역조직화학법
실시예 12에서 실험을 진행한 마우스를 관류고정하여 고정시킨 뇌 조직을 30um 두께로 냉동절편하였다. 절편한 조직은 1% BSA, 5% 염소 혈청이 포함된 0.1% PBST(Tween 20)를 이용하여 1시간 동안 블로킹한 후 1차 항체로 상업용 GFRAL 항체(#Ab107719, Abcam), c-Fos 항체(#sc-166940, Santa cruz biotechnology)와 1시간 반응시켰다. PBST로 5회 세척 후 Alexa fluor 488이 결합된 항 마우스 IgG 항체(#A11001, Invitrogen), Alexa fluor 594가 결합된 항 토끼 IgG 항체(#A11008, Invitrogen)와 1시간 반응시켰다. PBST로 5회 세척 후 DAPI가 포함된 PBS를 15분 처리하였다. 마운팅 진행 후 현미경으로 형광을 관찰하였다.
<
실시예
14> 동종이식 마우스 종양모델에서 항체에 의한
시스플라틴의
부작용 완화 분석
8주령의 마우스에 B16F10-Luc 세포를 약 1×106 세포 측량하여 주입한 후 암 크기가 일정 크기 이상 자란 뒤 시스플라틴을 10mg/kg의 농도로 주입하고 효능이 없는 대조군 항체 혹은 클론 A11을 10mg/kg 주입하여 항암치료 모델에서 시스플라틴에 의해 유도되는 부작용이 완화되는지 확인하였다. 약물은 일주일에 두 번 간격으로 주입하였다.
실험 결과 도 19와 같이 항암치료 상황에서 시스플라틴에 의해 유도되는 체중 감소 효과가 A11에 의해 복구되는 것을 확인하였고, 도 20과 같이 식욕 감소 효과도 완화시킨다는 것을 확인하였다. 도 21에서 볼 수 있듯이 GDF15의 발현 정도는 대조군 그룹과 A11 처리 그룹에서 차이가 없었다. 구체적인 지방 및 근육의 무게 변화는 도 22와 도 23과 같이 정량하여 나타내었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Daegu Gyeongbuk Institute of Science and Technology
<120> Anti-GFRAL antibody and use thereof
<130> ADP-2021-0263
<150> KR 10-2020-0067543
<151> 2020-06-04
<160> 24
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<220>
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<213> Artificial Sequence
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<400> 24
Gln Gln Thr Tyr His Thr Pro Gln Thr
1 5
Claims (12)
- 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR1, 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR2 및 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR1, 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR2 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산 분자.
- 제5항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현벡터.
- 제6항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암 관련 식욕 부진 또는 악액질 증후군 (CACS, Cancer-related anorexia-cachexia syndrome) 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암 관련 식욕 부진 또는 악액질 증후군 (CACS, Cancer-related anorexia-cachexia syndrome) 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 항암제로 인한 식욕 부진 또는 악액질 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 항암제는 시스플라틴(cisplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로람부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아(nitrosourea), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 타목시펜(tamoxifen), 탁솔(taxol), 트랜스플라티눔(transplatinum), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin) 및 메토트렉세이트(methotrexate)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항암제로 인한 식욕 부진 또는 악액질 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항-GFRAL 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 항암제로 인한 식욕 부진 또는 악액질 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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| US10174119B2 (en) | 2016-03-31 | 2019-01-08 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Binding proteins and methods of use thereof |
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2021
- 2021-05-28 KR KR1020210068874A patent/KR20210150981A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10174119B2 (en) | 2016-03-31 | 2019-01-08 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Binding proteins and methods of use thereof |
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