CN118043355A

CN118043355A - 具有改进的亲和力的gfral拮抗型抗体及其用途

Info

Publication number: CN118043355A
Application number: CN202280064331.4A
Authority: CN
Inventors: 芮敬武; 李范容; 丁钟元
Original assignee: Daegu Gyeongbuk Institute of Science and Technology
Current assignee: Daegu Gyeongbuk Institute of Science and Technology
Priority date: 2021-09-24
Filing date: 2022-09-05
Publication date: 2024-05-14

Abstract

本发明涉及具有改进的亲和力的GFRAL拮抗型抗体及其用途，更具体地，本发明涉及具有改进的亲和力的抗GFRAL抗体或其抗原结合片段，其包含特定序列的重链CDR和轻链CDR。所述具有改进的亲和力的抗GFRAL抗体表现出比传统抗GFRAL抗体更高的对GFRAL蛋白的结合能力，因此有望有效地用于改善或治疗癌症相关的厌食或恶病质综合征以及化疗抗癌药物的副作用。

Description

具有改进的亲和力的GFRAL拮抗型抗体及其用途

技术领域

本公开涉及具有改进的亲和力的GFRAL拮抗型抗体及其用途。

背景技术

自1975年制造出第一个单克隆抗体以来，抗体疗法于1994年首次启动，使用了抗体对抗原具有强结合亲和力的特性，治疗性抗体在药品中增长最快。截至2007年，全球治疗性抗体市场价值270亿美元，2011年和2016年分别稳步增长447亿美元和577亿美元。基于这一增长，抗体药物在2014年占全球药物销售额的10％，而在2016年在销售额前十的药物中，抗体药物占据了六席。与现有的基于化学合成的治疗剂相比，抗体药物由于其高结合特异性和体内稳定性而被证明具有相对较少的副作用和出色的治疗疗效，抗体药物开发领域作为下一代新药研发的关键领域备受关注。除此之外，由于对抗体药物开发过程至关重要的聚合物蛋白的表达、生产、纯化和工程化技术的快速发展以及临床试验的高成功率，抗体药物有望成为下一代治疗剂。

癌症相关的厌食-恶病质综合征(CACS)是指一种过度分解代谢状态，其特征是持续性厌食和体重减轻，导致肌肉和脂肪分解增加、营养代谢失衡以及基础代谢率增加，从而导致整体身体功能下降。这种CACS是癌症患者死亡的重要原因之一，并且是能够预测阴性治疗结果的最重要的独立预后因素。此外，由于化疗、放疗或手术等治疗，伴随着营养摄入受到限制，导致对治疗的反应率低，难以进行有效治疗，这是降低患者生存率和生活质量的主要原因。尽管如此，CACS仍被低估了，尽管仍有未满足的医疗需求，但在这一点上很难指望用一般的食欲刺激剂和肌肉合成刺激剂进行有效治疗。

生长分化因子15(GDF15)是一种参与免疫应答和代谢的细胞因子，在体内具有多种功能。在正常情况下，GDF15在大多数组织中以低浓度表达，并在肝、肾、心脏和肺等组织损伤期间显著增加。2007年，发现GDF15是通过前列腺癌患者体内的厌食诱导恶病质的物质，并且前列腺癌患者血液中GDF15的浓度增加了正常人的10-100倍，这表明癌症患者的厌食引起的体重减轻与GDF15浓度之间存在明显的相关性。2016年，发现GDF15是诱导各种癌中的恶病质的主要细胞因子，通过在患有各种癌症恶病质的小鼠模型中增加体重和减轻肌肉和脂肪组织的损失证实了GDF15抗体对恶病质的改进作用。

2015年，发现GDF15的表达在化疗(如顺铂)治疗后作为副作用增加，而厌食和恶病质增加对化疗的耐药性。2017年，发现GDF15通过受体GFRAL抑制食欲，GDF15单独或顺铂治疗后GDF15的信号传导过程是GFRAL依赖性的。GFRAL及其共受体RET在细胞内传输信号，并在后脑、最后区(AP)和孤束核(NTS)区域特异性表达，这些区域位于抗体药物可进入的血脑屏障之外。

因此，通过施用铂类抗癌药物(如顺铂)，抗GFRAL抗体可以通过改善经受CACS的癌症患者的厌食以及由体重增加和骨骼肌代谢增加来减少对化疗的耐药性，从而有助于提高癌症患者的健康和延长寿命。

发明内容

技术目标

本公开的目的是提供具有改进的亲和力的抗GFRAL抗体或其抗原结合片段。

本公开的另一目的是提供编码具有改进的亲和力的抗GFRAL抗体或其抗原结合片段的核酸分子、包含所述核酸分子的重组表达载体以及转化有所述重组表达载体的细胞。

本公开的另一目的是提供用于预防、改善或治疗癌症相关的厌食-恶病质综合征(CACS)的组合物，所述组合物包含具有改进的亲和力的抗GFRAL抗体或其抗原结合片段作为活性成分。

本公开的另一目的是提供用于预防、改善或治疗由抗癌药物引起的厌食或恶病质的组合物，所述组合物包含具有改进的亲和力的抗GFRAL抗体或其抗原结合片段作为活性成分。

技术方案

为了实现上述目的，本公开提供了具有改进的亲和力的抗GFRAL抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含具有由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列的重链CDR1、具有由SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的重链CDR2和具有由SEQID NO:3表示的氨基酸序列的重链CDR3，所述轻链可变区包含具有由SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列的轻链CDR1、具有由SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列的轻链CDR2和具有由SEQ IDNO:6表示的氨基酸序列的轻链CDR3。

此外，本公开提供了具有改进的亲和力的抗GFRAL抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含具有由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列的重链CDR1、具有由SEQ ID NO:7表示的氨基酸序列的重链CDR2和具有由SEQ ID NO:8表示的氨基酸序列的重链CDR3，所述轻链可变区包含具有由SEQ ID NO:9表示的氨基酸序列的轻链CDR1、具有由SEQ ID NO:10表示的氨基酸序列的轻链CDR2和具有由SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列的轻链CDR3。

此外，本公开提供了编码具有改进的亲和力的抗GFRAL抗体或其抗原结合片段的核酸分子。

此外，本公开提供了包含所述核酸分子的重组表达载体。

此外，本公开提供了转化有所述重组表达载体的细胞。

此外，本公开提供了用于预防或治疗癌症相关的厌食-恶病质综合征(CACS)的药物组合物，所述药物组合物包含具有改进的亲和力的抗GFRAL抗体或其抗原结合片段作为活性成分。

此外，本公开提供了用于预防或改善癌症相关的厌食-恶病质综合征(CACS)的保健功能食品组合物，所述保健功能食品组合物包含具有改进的亲和力的抗GFRAL抗体或其抗原结合片段作为活性成分。

此外，本公开提供了用于预防或治疗由抗癌药物引起的厌食或恶病质的药物组合物，所述药物组合物包含具有改进的亲和力的抗GFRAL抗体或其抗原结合片段作为活性成分。

此外，本公开提供了用于预防或改善由抗癌药物引起的厌食或恶病质的保健功能食品组合物，所述保健功能食品组合物包含具有改进的亲和力的抗GFRAL抗体或其抗原结合片段作为活性成分。

有益效果

本公开涉及具有改进的亲和力的GFRAL拮抗型抗体及其用途，更具体地，本公开涉及包含特定序列的重链CDR和轻链CDR并具有改进的亲和力的抗GFRAL抗体或其抗原结合片段。与传统的抗GFRAL抗体相比，具有改进的亲和力的抗GFRAL抗体显示出更高的对GFRAL蛋白的结合能力，因此预期其可用于改善或治疗癌症相关的厌食-恶病质综合征以及化疗抗癌药物的副作用。

附图说明

图1显示了使用传统抗GFRAL抗体来增强与GFRAL结合能力的三种类型的转变方法。共进行了3种类型的突变，其中第一种突变在与GFRAL结合的位点的氨基酸序列中具有修饰，第二种突变在不与GFRAL结合的位点的氨基酸序列中具有修饰，而第三种突变在scFv-Fc位点中具有随机修饰。

图2显示了通过多噬菌体酶联免疫吸附测定确定噬菌体库与GFRAL的结合能力的结果。该结果是通过进行总共6次选淘(panning)得出的，并根据与小鼠和人GFRAL的结合能力进行了分离。

图3显示了在对小鼠GFRAL进行单噬菌体酶联免疫吸附测定后鉴定两种单克隆对GFRAL的结合能力的结果。进行6次选淘后，作为通过在最终选择的抗体中用单克隆抗体分离来鉴定对GFRAL的结合能力的结果，确定大约100种抗体中的两种抗体对小鼠GFRAL的结合能力高于现有A11的结合能力。

图4显示了在对人GFRAL进行单噬菌体酶联免疫吸附测定后鉴定两种单克隆对GFRAL的结合能力的结果。进行6次选淘后，作为通过在最终选择的抗体中用单克隆抗体分离来鉴定对GFRAL的结合能力的结果，确定大约100种抗体中的两种抗体对人GFRAL的结合能力高于现有A11的结合能力。

图5显示鉴定两种单克隆的每个CDR位点的氨基酸序列的结果。在鉴定了这两种单克隆的氨基酸序列后，发现序列中发生了突变(以红色示出)。

图6显示了通过报告基因测定进行的在GFRAL/RET/荧光素酶过表达细胞中由单克隆scFv-Fc A11、M3和M4引起的荧光素酶表达减少的结果。进行报告基因测定以确定所选择的两种单克隆抗体M3和M4是否抑制GFRAL的信号传导机制，证明M3和M4比现有的A11更能抑制GFRAL的信号传导机制。

图7示出了通过密度测定法从图6的结果中比较A11和M3的数值结果。基于上述结果，作为量化GFRAL抑制程度的结果，发现50％抑制作用所需的抗体浓度对于传统A11为1.959μg/mL，对于M3为1.034μg/mL，表明以较小的量抑制了GFRAL信号。

图8示出了通过密度测定法从图6的结果中比较A11和M4的数值结果。基于上述结果，作为量化GFRAL抑制程度的结果，发现50％抑制作用所需的抗体浓度对于传统A11为1.959μg/mL，对于M4为1.354μg/mL，表明以较小的量抑制了GFRAL信号。

图9显示了通过报告基因测定鉴定在GFRAL/RET/荧光素酶过表达细胞中由人IgG抗体制成的A11、M3和M4引起的荧光素酶表达减少的结果。选择的两种单克隆抗体M3和M4由人IgG抗体制成，并进行与图6相同的实验以观察是否获得相同的结果。发现由人IgG抗体制成的M3-IgG和M4-IgG对GFRAL信号传导机制的抑制是传统A11的5倍。

图10示出了通过密度测定法从图9的结果中比较A11和M3的数值结果。基于上述结果，作为量化GFRAL抑制程度的结果，发现50％抑制作用所需的抗体浓度对于传统A11-IgG为29.08μg/mL，对于M3-IgG为4.889μg/mL，表明以约5倍小的量抑制了GFRAL信号。

图11示出了通过密度测定法从图9的结果中比较A11和M4的数值结果。基于上述结果，作为量化GFRAL抑制程度的结果，发现50％抑制作用所需的抗体浓度对于传统A11-IgG为29.08μg/mL，对于M4-IgG为2.259μg/mL，表明以10倍小的量抑制了GFRAL信号，并且相比M3-IgG，以2倍小的量抑制了GFRAL信号。

图12显示了在同种异体移植物小鼠肿瘤模型中鉴定单克隆M3和M4缓解顺铂的体重减轻作用的结果。将10mpk的顺铂灌输到通过接种黑色素瘤癌症细胞制备的肿瘤模型小鼠中，以诱导癌症恶病质。观察作为癌症恶病质典型症状的体重减轻的结果发现，在注射顺铂后10天，重链降低了30％。为了鉴定抗GFRAL抗体的癌症恶病质缓解作用，与单独用顺铂处理的组相比，在用顺铂和抗体处理的组中在单克隆抗体M3-IgG的情况下显示出13％的增加作用，在M4-IgG中显示出10％的增加作用。

图13显示了在同种异体移植物小鼠肿瘤模型中鉴定单克隆M3和M4对顺铂的食欲降低作用的缓解的结果。作为确定食欲下降(这是癌症恶病质的典型症状之一)的结果，发现顺铂注射组的食物摄入量减少。为了鉴定抗GFRAL抗体对癌症恶病质的缓解作用，与单独用顺铂处理的组相比，在用顺铂和抗体处理的组中，在单克隆抗体M3-IgG的情况下显示出12％的增加作用，在M4-IgG中显示出7％的增加作用。

图14显示了在同种异体移植物小鼠肿瘤模型中鉴定单克隆M3和M4对顺铂的eWAT脂肪量减少作用的缓解的结果。作为鉴定eWAT脂肪量减少的结果，在顺铂注射组中观察到eWAT脂肪量降低。为了鉴定抗GFRAL抗体对癌症恶病质的缓解作用，与单独用顺铂处理的组相比，在用顺铂和抗体处理的组中，在单克隆抗体M3-IgG的情况下显示出90％的增加作用，在M4-IgG中显示出30％的增加作用。

图15显示了在同种异体移植物小鼠肿瘤模型中鉴定单克隆M3和M4对顺铂的iWAT脂肪量减少作用的缓解的结果。作为鉴定iWAT脂肪量减少的结果，在顺铂注射组中观察到iWAT脂肪量降低。为了鉴定抗GFRAL抗体对癌症恶病质的缓解作用，与单独用顺铂处理的组相比，在用顺铂和抗体处理的组中，在单克隆抗体M3-IgG的情况下显示出17％的增加作用，在M4-IgG中显示出40％的增加作用。

图16显示了在同种异体移植物小鼠肿瘤模型中鉴定单克隆M3和M4对顺铂的四头肌质量减少作用的缓解的结果。作为鉴定四头肌质量减少的结果，在顺铂注射组中观察到四头肌质量降低。为了鉴定抗GFRAL抗体对癌症恶病质的缓解作用，与单独用顺铂出处理的组相比，在用顺铂和抗体处理的组中，在单克隆抗体M3-IgG的情况下显示出9％的增加作用，在M4-IgG中显示出4％的增加作用。

图17显示了在同种异体移植物小鼠肿瘤模型中鉴定单克隆M3和M4对顺铂的腓肠肌质量减少作用的缓解的结果。作为鉴定腓肠肌质量减少的结果，在顺铂注射组中观察到腓肠肌质量的降低。为了鉴定抗GFRAL抗体对癌症恶病质的缓解作用，与单独用顺铂处理的组相比，在用顺铂和抗体处理的组中，在单克隆抗体M3-IgG的情况下显示出10％的增加作用，在M4-IgG中显示出9％的增加作用。

图18显示了在同种异体移植物小鼠肿瘤模型中鉴定单克隆M3和M4对顺铂的比目鱼肌质量减少作用的缓解的结果。作为鉴定比目鱼肌质量减少的结果，在顺铂注射组中观察到比目鱼肌质量的降低。为了鉴定抗GFRAL抗体对癌症恶病质的缓解作用，与单独用顺铂处理的组相比，在用顺铂和抗体处理的组中，在单克隆抗体M3-IgG的情况下显示出20％的增加作用，在M4-IgG中显示出40％的增加作用。

具体实施方式

本公开提供了具有改进的亲和力的抗GFRAL抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含具有由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列的重链CDR1、具有由SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的重链CDR2和具有由SEQ ID NO:3表示的氨基酸序列的重链CDR3，所述轻链可变区包含具有由SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列的轻链CDR1、具有由SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列的轻链CDR2和具有由SEQ ID NO:6表示的氨基酸序列的轻链CDR3。

此外，具有由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10表示的氨基酸序列的CDR列于下表1中。

表1

本文中使用的术语“抗体”是指蛋白质分子，其包括与特定抗原具有免疫反应性的免疫球蛋白分子并用作特异性识别抗原的受体，并且其可包括例如单克隆抗体、多克隆抗体、全长抗体和抗体片段等。此外，术语“抗体”可包括二价或双特异性分子(如双特异性抗体)、双链抗体(diabodies)、三链抗体(triabodies)或四链抗体(tetrabodies)。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上相同的抗体群体中获得的单一分子组成的抗体分子，并且此类单克隆抗体表现出对特定表位的单一结合特性和亲和力，而多克隆抗体可与多个表位结合。如本文所用，术语“全长抗体”是指具有两条全长轻链和两条全长重链的结构，每条轻链通过二硫键与重链连接。重链恒定区具有gamma(γ)、mu(μ)、alpha(α)、delta(δ)和epsilon(ε)型，并具有gamma1(γ1)、gamma2(γ2)、gamma3(γ3)、gamma4(γ4)、alpha1(α1)和alpha2(α2)作为亚类。轻链的恒定区具有kappa(κ)型和lambda(λ)型。IgG是一种亚型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。

如本文所用，术语“重链”可包括全长重链及其片段等，其包含具有足以赋予针对抗原的特异性的可变结构域序列的氨基酸序列的可变区VH以及三个恒定区CH1、CH2和CH3。此外，如本文所用，术语“轻链”可包括全长轻链及其片段等，其包含具有足以赋予针对抗原的特异性的可变结构域序列的氨基酸序列的可变区VL以及恒定区CL。

如本文所用，术语“片段”、“抗体片段”和“抗原结合片段”可互换使用，指本公开的抗体中具有抗体的抗原结合功能的任何片段。示例性抗原结合片段包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv。

本公开的抗体或其抗原结合片段可包括本文所述抗体的序列，以及其生物等效物，只要其可表现出特异性结合GFRAL的能力。例如，可以对抗体的氨基酸序列进行额外的修饰，以进一步改进抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。这些修饰包括例如，抗体的氨基酸序列残基的删除、插入和/或置换。这些氨基酸突变基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，如疏水性、亲水性、电荷和大小。根据对氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型的分析，可以注意到精氨酸、赖氨酸和组氨酸都是带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸具有相似的大小；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有相似的形状。因此，基于此，精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸可能是生物功能等效物。

此外，本发明提供了编码具有改进的亲和力的抗GFRAL抗体或其抗原结合片段的核酸分子。

如本文所用，术语“核酸分子”具有综合含义，包括DNA(gDNA和cDNA)和RNA分子、以及作为核酸分子基本构建块的核苷酸，所述核苷酸不仅包括天然核苷酸，还包括具有经修饰的糖或碱基位点的类似物。可对编码本公开的重链可变区和轻链可变区的核酸分子的序列进行修饰，所述修饰包括核苷酸的添加、删除、或非保守置换或保守置换。

此外，本发明提供了包含所述核酸分子的重组表达载体。

本文使用的术语“载体”是指用于携带克隆基因(或另一段克隆DNA)的自我复制DNA分子。

本文使用的术语“表达载体”是指包含如下的重组DNA分子：所期望的编码序列和对使可操作地连接的编码序列在特定宿主有机体中表达而言至关重要的适当的核酸序列。表达载体可优选地包含一个或多个选择标记。所述标记是具有可通过常规化学手段进行常规选择的性质的核酸序列，包括可将转化细胞与非转基因细胞区分开的任何基因。实例包括但不限于抗生素抗性基因，如氨苄青霉素、卡那霉素、遗传霉素(G418)、博来霉素、潮霉素和氯霉素，并且其可由本领域技术人员适当地选择。

为了表达本公开的DNA序列，载体中可使用任何非常不同的表达调控序列。有用的表达调控序列的例子可包括例如，SV40或腺病毒的早期和晚期启动子，CMV、LTR、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统的启动子和增强子，以及逆转录病毒的T3和T7启动子，噬菌体λ(phage lambdas)的主要操纵子和启动子结构域，fd编码蛋白的调控区域，3-磷酸甘油酸激酶或其他乙二醇酯酶的启动子，磷酸酶的启动子(例如Pho5)，酵母α杂交系统的启动子，和其他已知调控原核细胞或真核细胞或其病毒中基因表达的组成序列和衍生物序列，及其中几种的组合。

表达本公开的抗体的载体可以是其中轻链和重链在单个载体中同时表达的载体系统，也可以是其中轻链和重链在不同载体中表达的系统。在后一种情况下，通过共转化和靶向转化将两种载体引入宿主细胞。共转化是将编码轻链和重链的每种载体DNA同时引入宿主细胞，然后筛选同时表达轻链和重链的细胞的方法。靶向转化是如下方法：筛选已用包含轻链(或重链)的载体转化的细胞，然后用包含重链(或轻链)的载体再次转染所筛选的表达轻链的细胞，最后筛选同时表达轻链和重链的细胞。

此外，本发明提供了转化有重组表达载体的细胞。

能够稳定和连续克隆和表达本公开的载体的细胞可以是本领域已知的任何宿主细胞，包括例如芽孢杆菌属中的菌株，如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)；以及原核宿主细胞，如链霉菌(Streptomyces)、假单胞菌(Pseudomonas)(例如，恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida))、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、或葡萄球菌(Staphylococcus)(例如，肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus))，但不限于此。

抗体或其抗原结合片段的制备方法中的转基因细胞培养可以根据相关技术领域中已知的合适培养基和培养条件来进行。本领域技术人员可以根据所选菌株以容易调整调整的方式来处理该培养过程。细胞培养根据细胞生长类型分为悬浮培养和贴壁培养，根据培养类型分为分批、分批补料和连续培养方法。用于培养的培养基必须充分满足具体菌株的要求。

此外，本公开提供了一种用于预防或治疗癌症相关的厌食-恶病质综合征(CACS)的药物组合物，所述药物组合物包含具有改进的亲和力的抗GFRAL抗体或其抗原结合片段作为活性成分。

本公开的药物组合物可另外包含药学上可接受的运载体，所述药学上可接受的运载体通常用于制剂，包括但不限于乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。本公开的药物组合物除上述成分外还可进一步包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂。

本公开的药物组合物可以口服或胃肠外给予，在胃肠外给予的情况下，可以通过静脉输注、皮下输注、肌内输注、腹腔输注、内皮给予、局部给予、鼻内给予、肺内给予和直肠给予进行给予。当口服给予时，由于蛋白质或肽被消化，因此用于口服给予的组合物可以被配制成对活性剂进行包衣或保护其免于在胃中降解，并且本公开的组合物可以通过可将活性物质运输到靶细胞的任何装置进行给予。

本公开的药物组合物的适当剂量基于诸如配制方法，给予方式，患者年龄、体重、性别、状况、食物、给予时间、给予途径、排出率和响应灵敏度等因素而变化，通常熟练的医师可以容易地确定和开出所需治疗或预防的有效剂量。

本公开的药物组合物可以通过使用药学上可接受的运载体和/或赋形剂进行配制，根据本公开所属领域的技术人员易于实施的方法制备为单位体积形式或引入多体积容器中进行制备。在这种情况下，制剂可以是处于油或水性介质中的溶液、悬浮液或乳液形式，或者可以是提取物、酸制剂、栓剂、粉即、颗粒基、片剂或胶囊的形式，并且可以另外包含分散剂或稳定剂。

保健功能食品组合物可以粉末、颗粒、片剂、胶囊、糖浆、饮料或丸剂的形式提供，所述保健功能食品组合物除了根据本公开的组合物(其为活性成分)外还可以与其他食品或食品添加剂组合使用，并且可以根据常规方法适当使用。活性成分的混合量可以根据其使用目的(例如预防、保健或治疗)适当确定。

保健功能食品组合物中包含的抗体或其抗原结合片段的有效剂量可根据药物组合物的有效剂量使用，但在为了健康和卫生或为了健康控制而长期摄入的情况下，其可能低于上述范围，并且可以确定活性成分的用量可以超出上述范围，因为其在安全性方面没有问题。

对保健食品的种类没有具体限制，如肉类、香肠、面包、巧克力、糖果、零食、甜食、披萨、拉面、其他面条、口香糖、包括冰淇淋在内的乳制品、各种汤、饮料、茶、饮品、酒精饮料和维生素复合物。

此外，本发明提供了用于预防或治疗由抗癌药物引起的厌食或恶病质的药物组合物，所述药物组合物包含具有改进的亲和力的抗GFRAL抗体或其抗原结合片段作为活性成分。

此外，本发明提供了用于预防或改善由抗癌药物引起的厌食或恶病质的保健功能食品组合物，所述保健功能食品组合物包含具有改进的亲和力的抗GFRAL抗体或其抗原结合片段作为活性成分。

更优选地，抗癌药物可以是但不限于选自以下中的任一种或多种：顺铂、奥沙利铂、卡铂、丙卡巴肼、氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝脲、放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、博莱霉素、普卡霉素、丝裂霉素、依托泊苷、他莫昔芬、紫杉醇、反式铂(transplatinum)、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和甲氨蝶呤。

此外，本公开的抗GFRAL抗体或其抗原结合片段可用作抗癌辅助剂。如本文所用，抗癌辅助剂是指能够改善抗癌药物给予后引起的副作用的物质。换句话说，通过将本公开的抗癌辅助剂与抗癌药物联合给予，能够防止抗癌药物引起的各种副作用的发生。本公开的辅助剂可以与抗癌药物同时、单独或顺序给予。根据本公开的抗癌辅助剂的给予顺序，即是否在任何时间点同时、单独或顺序给予抗癌药物或抗癌辅助剂，可由医生或专业人员确定。这种给予顺序可能因许多因素而异。

实施例

在下文中，将通过示例实施方式更详细地描述本公开。这些示例实施方式仅用于更详细地说明本公开，对本领域的技术人员来说，根据本公开的主旨，本公开的范围不受这些示例实施例限制是显而易见的。

<实施例1>细胞培养

HEK-293FT细胞(人胚肾)在补充有10％的胎牛血清、1％的青霉素和链霉素的DMEM培养基(Hyclone)中培养，Expi-293F细胞(人胚肾)在Expi-293表达培养基(Gibco)中培养。

<实施例2>多克隆噬菌体酶联免疫吸附测定

通过在4℃下与重组人GFRAL或重组小鼠GFRAL或牛血清白蛋白反应过夜来包覆96孔半区板(#3690，Corning)，然后使用PBS洗涤一次。之后，在37℃下用含5％脱脂乳的PBS进行1小时的封闭。此后，在37℃下进行与噬菌体库的反应，每轮2小时，使用PBS洗涤5次，然后在37℃下HRP缀合的抗噬菌体抗体(#11973-MM05T-H，Sino Biological)反应1小时，然后用PBS洗涤5次。最后，在室温下使用TMB显色10分钟，然后使用终止液终止显色。此后，使用酶标仪在450nm波长下测量吸光度。

<实施例3>单克隆噬菌体酶联免疫吸附测定

为了获得单克隆噬菌体，在96孔深孔板(#90060，Bioneer)的每个孔中分配浓度为50μg/mL的含羧苄青霉素(#C1389，Sigma)的SB培养基，接种包含噬菌体库的菌落，并在37℃和250rpm下培养3小时。之后，以10¹⁰噬菌体/mL的浓度处理M13K07辅助噬菌体，并在相同条件下再培养2小时。此后，以70μg/mL的浓度进行卡那霉素(#K4000，Sigma)处理，然后培养过夜。在进行噬菌体酶联免疫吸附测定时，一些培养基在封闭后进行处理，其余过程与多克隆噬菌体酶联免疫吸附测定相同。

<实施例4>使用高效液相色谱的纯化方法

使用sfiI限制性酶将具有GFRAL结合能力的单克隆的scFv序列转移至基于pFUSE载体(#pfuse hg1fc2，InvivoGen)构建的表达载体，然后转染至Expi293F细胞。使用ExpiFectamine 293转染试剂盒(#A14524，Gibco)进行转染。将Expi293F细胞以约2.5×10⁶细胞/mL的密度培养在500mL烧瓶中，将ExpiFectamine 293试剂和表达scFv的载体混合并在Opti-MEM(#31985-070，Gibco)培养基存在下进行处理，然后在37℃和125rpm下培养过夜。第二天，ExpiFectamine 293转染增强剂1和2进行处理，并再培养3天以产生scfv-fc形式的抗体。然后使用AKTA prime plus(GE healthcare)纯化器和IgG分离柱(#17-0404-01，GE healthcare)对上清液进行纯化。用20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)将抗体结合至柱，然后用0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.7)进行洗脱过程。用Amicon Ultra-4-30K(#UFC803024，Millipore)进行浓缩，然后用Spin-X过滤器(#8160，Corning)进行灭菌。使用内毒素去除柱(#88274，Thermo Fisher Scientific)去除内毒素，并用BCA试剂盒(#23227，ThermoFisher Scientific)测量浓度。

<实施例5>抗体酶联免疫吸附测定

通过与重组人GFRAL或重组小鼠GFRAL或牛血清白蛋白在4℃下反应过夜来对96孔半区板进行包覆，然后使用克隆scFv-Fc抗体作为一抗以及HRP缀合的抗人IgG抗体(#Ab97225，Abcam)作为二抗进行酶联免疫吸附测定。

实验结果表明，如图2和图3所示，经过6次选淘后，通过从最终选择的抗体中以单克隆抗体分离，鉴定与GFRAL的结合能力，表明M3和M4抗体对小鼠GFRAL的结合能力高于对照克隆A11。此外，如图4所示，发现M3和M4抗体对人GFRAL的结合能力高于对照克隆A11。

<实施例6>通过转染到HEK-293FT细胞中制备GFRAL/RET-萤光素酶报告细胞

将HEK-293FT细胞接种在6孔板中，密度约为1×10⁶细胞/孔，在Opti-MEM培养基中以1:1的比率将Lipofectamine 2000试剂(#11668-027，Thermo Fisher Scientific)、表达GFRAL的载体(#OHu31183D，GenScript)和表达RET的载体(#HG11997-CF，Sino Biological)混合并进行处理，然后在37℃下培养过夜。第二天，移除上清液，替换为补充有10％胎牛血清的新鲜培养基。之后，注射在ERK信号传导过程中诱导荧光素酶表达的载体并在37℃下培养过夜，第二天移除上清液，并进一步进行用补充有10％胎牛血清的新鲜培养基替换的过程。

<实施例7>从单克隆scFv序列向人抗体IgG形式转化的方法

使用限制性酶将pFUSE载体中的单克隆的scFv序列转移到基于pcDNA3.3-TOPO载体(#K830001，Invitrogen)构建的表达载体中。使用ClaI限制性酶和NheI限制性酶将重链可变区插入重链恒定区1-重链恒定区3之前，使用ClaI限制性酶和BsiWI限制性酶将轻链可变区插入轻链恒定区之前，然后转染到Expi293F细胞中。使用ExpiFectamine 293转染试剂盒进行转染。将Expi293F细胞在500mL烧瓶中以约2.5×10⁶细胞/mL的密度培养，通过在Opti-MEM培养基存在下以1:1的比率混合ExpiFectamine 293试剂和表达IgG各链的载体来进行处理，然后在37℃和125rpm下培养过夜。第二天，ExpiFectamine 293转染增强剂1和2处理并再培养3天，以产生完整的IgG形式的抗体。

<实施例8>抗体对萤光素酶表达的分析

将经转染的HEK-293FT细胞接种到96孔板中，密度为约7×10⁴细胞/孔，在血清缺乏(serodeficient)状态下保持2小时，然后用克隆抗体处理和反应2小时。然后，人重组GDF15处理5分钟，使用包含萤光素酶底物的试剂(#E2610，Promega)测量发光程度。

如图6所示，实验结果表明，与对照克隆A11相比，当仅用GDF15处理时，发光值增加，在用M3或M4预处理的实验组中，发光值以处理浓度依赖的方式降低更多。如图7和图8所示，获得的IC50值对于对照克隆A11为1.959μg/mL，对于M3为1.034μg/mL，为1.354μg/mL，表明M3和M4抗体可以以比对照克隆A11更少的量抑制GFRAL信号传导。此外，如图9所示，当转换为人IgG形式时，与对照克隆A11-IgG相比，在用M3-IgG或M4-IgG预处理的实验组中，以处理浓度依赖的方式降低更多。如图10和图11所示，获得的IC50值对于对照克隆A11-IgG为29.08μg/mL，对于M3-IgG为4.889μg/mL，对于M4-IgG为2.259μg/mL，表明M3-IgG和M4-IgG抗体能够以比对照克隆A11-IgG少超过五分之一的量抑制GFRAL信号传导。

<实施例9>在同种异体移植小鼠肿瘤模型中分析抗体对顺铂驱动的癌症恶病质诱导的缓解

将测量为1×10⁶细胞的B16F10-Luc细胞注射到8周龄的小鼠中，在癌症生长到一定大小后以10mg/kg的浓度注射顺铂，注射10mg/kg克隆A11作为对照，并注射具有癌症恶病质缓解功效的修饰抗体M3-IgG或M4-IgG，以确定顺铂引起的副作用是否在化疗模型中得到缓解。药物注射间隔为一周两次。

如图12所示的实验结果，发现与仅用顺铂处理的组相比，M3-IgG使在化疗情况下由顺铂引发的体重减轻效应恢复13％，M4-IgG使恢复10％；并且如图13所示，发现M3-IgG使食欲减轻效应缓解12％，M4-IgG使得缓解7％。脂肪和肌肉重量的具体变化如图14至图18所示被量化。结果，与单独用顺铂处理的组相比，M3-IgG和M4-IgG增加了脂肪量和肌肉量，特别是在比目鱼肌的情况下，发现与单独用顺铂处理的组相比，M3-IgG使肌肉量显著增加20％的和M4-IgG使其显著增加40％，从而鉴定了缓解由于癌症恶病质诱导引起的脂肪量和肌肉量减少的效果。

由于本公开的具体部分已在上面详细描述，本领域技术人员清楚这些具体描述仅仅是优选实施方式示例，并不限制本公开的范围。因此，本公开的实质范围将由所附权利要求及其等同物来界定。

Claims

1.一种具有改进的亲和力的抗GFRAL抗体或其抗原结合片段，所述抗GFRAL抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含具有由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列的重链CDR1、具有由SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列的重链CDR2和具有由SEQID NO:3表示的氨基酸序列的重链CDR3，所述轻链可变区包含具有由SEQ ID NO:4表示的氨基酸序列的轻链CDR1、具有由SEQ ID NO:5表示的氨基酸序列的轻链CDR2和具有由SEQ IDNO:6表示的氨基酸序列的轻链CDR3。

2.一种具有改进的亲和力的抗GFRAL抗体或其抗原结合片段，所述抗GFRAL抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含具有由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列的重链CDR1、具有由SEQ ID NO:7表示的氨基酸序列的重链CDR2和具有由SEQID NO:8表示的氨基酸序列的重链CDR3，所述轻链可变区包含具有由SEQ ID NO:9表示的氨基酸序列的轻链CDR1、具有由SEQ ID NO:10表示的氨基酸序列的轻链CDR2和具有由SEQ IDNO:6表示的氨基酸序列的轻链CDR3。

3.一种核酸分子，所述核酸分子编码根据权利要求1或权利要求2任一项所述的具有改进的亲和力的抗GFRAL抗体或其抗原结合片段。

4.一种重组表达载体，所述重组表达载体包含权利要求3所述的核酸分子。

5.一种转化有权利要求4所述的重组表达载体的细胞。

6.一种用于预防或治疗癌症相关的厌食-恶病质综合征(CACS)的药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1或权利要求2所述的具有改进的亲和力的抗GFRAL抗体或其抗原结合片段作为活性成分。

7.一种用于预防或改善癌症相关的厌食-恶病质综合征(CACS)的保健功能食品组合物，所述保健功能食品组合物包含根据权利要求1或权利要求2所述的具有改进的亲和力的抗GFRAL抗体或其抗原结合片段作为活性成分。

8.一种用于预防或治疗由抗癌药物引起的厌食或恶病质的药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1或权利要求2所述的具有改进的亲和力的抗GFRAL抗体或其抗原结合片段作为活性成分。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中，所述抗癌药物是选自于由以下药物所组成的组中的任一种或多种：顺铂、奥沙利铂、卡铂、丙卡巴肼、氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝脲、放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、博来霉素、普卡霉素、丝裂霉素、依托泊苷、他莫昔芬、紫杉醇、反式铂、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和甲氨蝶呤。

10.一种用于预防或改善由抗癌药物引起的厌食或恶病质的保健功能食品组合物，所述保健功能食品组合物包含根据权利要求1或权利要求2所述的具有改进的亲和力的抗GFRAL抗体或其抗原结合片段作为活性成分。