TW202020159A - 人源化抗人pd-l1單克隆抗體及其製備方法和用途 - Google Patents

人源化抗人pd-l1單克隆抗體及其製備方法和用途 Download PDF

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Abstract

本發明涉及一種人源化抗人PD-L1單克隆抗體及其製備方法和用途。本發明提供的人源化抗人PD-L1單克隆抗體對PD-L1具有高親和性、高特異性，能夠刺激T細胞分泌細胞因子，特異地解除PD-L1的免疫負調節作用，並且這種抗體的作用不是通過直接阻斷PD-1與PD-L1相互作用實現的，呈現了新的免疫檢查點活性調節機制。因而，本發明提供的功能性人源化抗人PD-L1單克隆抗體，可通過調節PD-L1信號通路來激活T細胞，進而實現腫瘤免疫治療的目的。

Description

人源化抗人PD-L1單克隆抗體及其製備方法和用途
本發明屬腫瘤免疫療法和分子免疫學領域，尤其是涉及一種人源化抗人PD-L1單克隆抗體。本發明還涉及該人源化抗人PD-L1單克隆抗體的製備方法及其用途。
人類獲得性免疫系統通過體液免疫（B細胞介導）和細胞免疫（T細胞介導）兩大機制抵禦外界感染和內部病發。T細胞作為免疫系統中的重要一員，在腫瘤免疫治療中發揮著巨大的作用。從傳統的細胞因子類藥物到最近興起的免疫檢查點抑制劑治療都是通過直接或間接的激活T細胞來達到消除腫瘤的目的（Esther et al, physiol, 25(2):85-101, 2010; Drew, Nature Reviews Cancer 12:252-264, 2012）。
T細胞激活需要兩級信號。第一級信號，也稱為主要刺激信號，是通過TCR識別特異性MHC呈遞的抗原來實現的，這種信號是抗原特異性的。另外，T細胞的激活還會受到第二級刺激信號，也稱為共刺激信號或者共抑制信號對T細胞活性的調節(Jennifer et al, Annu Rev Immunol, 27:591-619, 2009)。這類免疫刺激或抑制性分子稱作免疫檢查點。免疫檢查點療法就是通過調節共刺激或共抑制信號來控制T細胞活性，讓高活性的T細胞去殺傷腫瘤細胞從而達到治療癌症的目的(Suzanne et.al, Cancer Cell 27(4):450-461, 2015)。這些藥物的抗腫瘤機制不同於以往的任何藥物，既不是單純地針對腫瘤，也不是簡單地調節免疫細胞，而是特異性地針對腫瘤微環境中關鍵免疫逃逸機制，通過改善腫瘤免疫微環境來控制和清除腫瘤；所以這種療法的研發成功將腫瘤免疫推向前所未有的高度，而且為今後的腫瘤免疫基礎以及臨床研究帶來了巨大的革新以及深遠影響。
程序性死亡受體1（PD-1）是一種重要的免疫抑制分子，屬T細胞調節因子CD28/PD-L1家族中的一員。目前已經有針對PD-1的抗體藥物，包括默克在2014年上市的Keytruda和百時美施貴寶在2015年上市的Opdivo。PD-1/PD-L1靶點連續創造歷史，2017年Opdivo首次進入TOP10、Keytruda首次進入TOP20。目前兩個抗體藥物在2017年的銷售額分別是56.86億美元和38.09億美元。
程序性死亡受體-配體1（PD-L1）是PD-1的配體之一（另一個配體是PD-L2）。PD-L1是大小約為40kDa的第一性跨膜蛋白和PD-1一樣也是一個重要的免疫檢查點分子。PD-L1配體具有相當的腫瘤特異性，在腫瘤微環境中誘導表現，並且參與腫瘤微環境的免疫調節。PD-L1和PD-1結合傳導共抑制信號降低T細胞的活性和增生，從而促使腫瘤細胞逃脫T細胞監控和殺傷（Dong et al, Nat Med; 8:793-800, 2002）。阻斷PD-L1配體或者PD-1受體均可以修復進行中的腫瘤免疫反應。這一療法針對腫瘤免疫逃逸的關鍵分子機制，所以可以針對多種腫瘤，獲得很好的療效，同時副作用較小。
PD-L1單克隆抗體藥物能夠特異性阻斷PD-1和PD-L1的結合從而減弱或封閉PD-L1對T細胞負調節信號的傳導，增強T細胞對各種抗原的免疫反應。目前PD-L1單克隆抗體藥物已在臨床試驗階段用於治療多種人類癌症，包括非小細胞肺癌，黑色素瘤，結腸直腸癌，腎細胞癌，卵巢癌，前列腺癌，胃癌，乳腺癌（Julie et al., N Engl Med 366: 2455-2465, 2012）。
2016年5月19日FDA批准了第一個PD-L1抗癌抗體藥物的上市，它來自羅氏旗下基因泰克的PD-L1抗體atezolizumab（商品名Tecentriq）用於治療晚期膀胱癌。這標誌著該免疫檢查點在腫瘤免疫療法的臨床階段成功可行。而且，隨著臨床前實驗驗證針對不同免疫調節因子的單克隆抗體在協同治療癌症方面的能力（Mace et al, Journal for ImmunoTherapy of cancer 3:366,2015; Lussier et al, Journal for ImmunoTherapy of Cancer 3:21, 2015）, PD-L1單克隆抗體已與不同免疫抑制分子的單克隆抗體或者小分子化合物形成組合療法在進行針對不同癌症的臨床實驗。
目前上市有三種PD-L1單克隆抗體藥物，被批准應用於不同的適應症。免疫檢查點類單克隆抗體在人體內也存在不同程度的副反應，包括可在某些患者中誘導免疫原性，過度抑制檢查點信號可能引起自身免疫病（Claire et al, JAMA Oncol, 2(10):1346-1353, 2016），以及不同PD-L1單克隆抗體會具有不同程度的可開發性。因此，尚需開發新的能夠阻斷PD-L1與PD-1蛋白結合的功能性抗體。
本發明一方面提供了一種人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，所述抗體或其片段能特異性結合PD-L1，其特徵在於，不直接阻斷PD1與PD-L1相互作用實現免疫抑制的解除。
在一些實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，其包含重鏈可變區，所述重鏈可變區胺基酸序列選自與SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 16 具有至少80%同一性的胺基酸序列。
本發明另一方面提供了一種人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，其包含重鏈可變區，所述重鏈可變區胺基酸序列選自與SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 16 具有至少80%同一性的胺基酸序列。
在一些實施例中，所述重鏈可變區胺基酸序列選自與SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 16 具有至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。
本發明提供了人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區胺基酸序列選自與SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 16 具有至少80%同一性的胺基酸序列；以及所述輕鏈可變區胺基酸序列選自與SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23 或SEQ ID NO: 24至少具有80%同一性的胺基酸序列。
在一些實施例中，所述重鏈可變區胺基酸序列選自與SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 16 具有至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。
在一些實施例中，所述輕鏈可變區胺基酸序列選自與SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23 或SEQ ID NO: 24至少具有81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列。
在一些實施例中，所述重鏈可變區胺基酸序列選自與SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 16 所示序列存在替換、插入或缺失至多20個胺基酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，所述重鏈可變區胺基酸序列選自與SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 16 所示序列存在替換、插入或缺失1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸殘基的胺基酸序列。
在一些實施例中，所述重鏈可變區胺基酸序列選自與SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 16 所示序列存在至多20個保守胺基酸取代的胺基酸序列。在一些實施例中，所述重鏈可變區胺基酸序列選自與SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 16 所示序列存在至多20個、18個、16個、14個、12個、10個、8個、6個、4個、2個或1個保守胺基酸取代的胺基酸序列。
在一些實施例中，所述輕鏈可變區胺基酸序列選自與SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23 或SEQ ID NO: 24所示序列存在替換、插入或缺失至多20個胺基酸殘基的胺基酸序列。在一些實施例中，所述輕鏈可變區胺基酸序列選自與SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23 或SEQ ID NO: 24所示序列存在替換、插入或缺失1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個胺基酸殘基的胺基酸序列。
在一些實施例中，所述輕鏈可變區胺基酸序列選自與SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23 或SEQ ID NO: 24 所示序列存在至多20個保守胺基酸取代的胺基酸序列。在一些實施例中，所述輕鏈可變區胺基酸序列選自與SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23 或SEQ ID NO: 24 所示序列存在至多20個、18個、16個、14個、12個、10個、8個、6個、4個、2個或1個保守胺基酸取代的胺基酸序列。
在一個實施例中，所述重鏈可變區胺基酸序列選自：SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 16。
在另一個實施例中，所述輕鏈可變區胺基酸序列選自：SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23 或SEQ ID NO: 24。
在一個實施例中，所述重鏈可變區胺基酸序列選自：SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 16；以及所述輕鏈可變區胺基酸序列選自：SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23 或SEQ ID NO: 24。
在一些實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，其重鏈可變區和輕鏈可變區選自以下組合： 所述重鏈可變區為與SEQ ID NO: 9 至少80%同一性的胺基酸序列，以及所述輕鏈可變區為與SEQ ID NO: 17至少80%同一性的胺基酸序列； 所述重鏈可變區為與SEQ ID NO: 10至少80%同一性的胺基酸序列，以及所述輕鏈可變區為與SEQ ID NO: 18至少80%同一性的胺基酸序列； 所述重鏈可變區為與SEQ ID NO: 11至少80%同一性的胺基酸序列，以及所述輕鏈可變區為與SEQ ID NO: 19至少80%同一性的胺基酸序列； 所述重鏈可變區為與SEQ ID NO: 12至少80%同一性的胺基酸序列，以及所述輕鏈可變區為與SEQ ID NO: 20至少80%同一性的胺基酸序列； 所述重鏈可變區為與SEQ ID NO: 13至少80%同一性的胺基酸序列，以及所述輕鏈可變區為與SEQ ID NO: 21至少80%同一性的胺基酸序列； 所述重鏈可變區為與SEQ ID NO: 14至少80%同一性的胺基酸序列，以及所述輕鏈可變區為與SEQ ID NO: 22至少80%同一性的胺基酸序列； 所述重鏈可變區為與SEQ ID NO: 15至少80%同一性的胺基酸序列，以及所述輕鏈可變區為與SEQ ID NO: 23至少80%同一性的胺基酸序列；或 所述重鏈可變區為與SEQ ID NO: 16至少80%同一性的胺基酸序列，以及所述輕鏈可變區為與SEQ ID NO: 24至少80%同一性的胺基酸序列。
在一些較佳的實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，其重鏈可變區和輕鏈可變區選自以下組合： 所述重鏈可變區為與SEQ ID NO: 9 至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的胺基酸序列，以及所述輕鏈可變區為與SEQ ID NO: 17至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的胺基酸序列； 所述重鏈可變區為與SEQ ID NO: 10 至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的胺基酸序列，以及所述輕鏈可變區為與SEQ ID NO: 18至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的胺基酸序列； 所述重鏈可變區為與SEQ ID NO: 11至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的胺基酸序列，以及所述輕鏈可變區為與SEQ ID NO: 19至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的胺基酸序列； 所述重鏈可變區為與SEQ ID NO: 12至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的胺基酸序列，以及所述輕鏈可變區為與SEQ ID NO: 20至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的胺基酸序列； 所述重鏈可變區為與SEQ ID NO: 13至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的胺基酸序列，以及所述輕鏈可變區為與SEQ ID NO: 21至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的胺基酸序列； 所述重鏈可變區為與SEQ ID NO: 14至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的胺基酸序列，以及所述輕鏈可變區為與SEQ ID NO: 22至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的胺基酸序列； 所述重鏈可變區為與SEQ ID NO: 15至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的胺基酸序列，以及所述輕鏈可變區為與SEQ ID NO: 23至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的胺基酸序列；或 所述重鏈可變區為與SEQ ID NO: 16至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的胺基酸序列，以及所述輕鏈可變區為與SEQ ID NO: 24至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的胺基酸序列。
在一個實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，其重鏈可變區和輕鏈可變區選自以下組合： 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 9以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 17； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 10以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 18； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 11以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 19； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 12以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 20； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 13以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 21； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 14以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 22； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 15以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 23； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 16以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 24； 或上述每組序列中存在至多20個、18個、16個、14個、12個、10個、8個、6個、4個、2個或1個保守胺基酸取代的胺基酸序列。
在一個實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，其重鏈可變區和輕鏈可變區選自以下組合： 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 9以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 17； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 10以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 18； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 11以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 19； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 12以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 20； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 13以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 21； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 14以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 22 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 15以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 23；或 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 16以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 24。
在一個較佳的實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，其重鏈可變區和輕鏈可變區選自以下組合： 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 9以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 17； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 12以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 20； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 14以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 22； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 15以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 23； 或上述每組序列中存在至多20個、18個、16個、14個、12個、10個、8個、6個、4個、2個或1個保守胺基酸取代的胺基酸序列。
在一個更佳的實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，所述重鏈可變區和輕鏈可變區選自以下組合： 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 9以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 17； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 12以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 20； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 14以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 22；或 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 15以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 23。
在一個較佳方案中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，所述重鏈可變區和輕鏈可變區選自以下組合： 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 9以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 17； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 12以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 20； 或上述每組序列中存在至多20個、18個、16個、14個、12個、10個、8個、6個、4個、2個或1個保守胺基酸取代的胺基酸序列。
在一個更佳的實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，所述重鏈可變區和輕鏈可變區選自以下組合： 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 9以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 17；或 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 12以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 20。
在一些實施例中，本發明的人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段與PD-L1之間的解離常數KD小於約3 nM。在另一個實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段與PD-L1之間的解離常數KD小於約2 nM、約1.9nM、約1.8nM、約1.7nM、約1.6nM、約1.5nM、約1.4nM、約1.3nM、約1.2nM、約1.1nM、約1nM、約0.9nM、約08nM、或約0.7nM。在一個較佳實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段與PD-L1之間的解離常數KD 小於約1nM、約0.9nM、約08nM、或約0.7nM。在一個實施的方案中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段與PD-L1之間的解離常數KD 約3nM至約0.8nM。在一個較佳地實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段與PD-L1之間的解離常數KD 約2nM至約1nM。在另一個較佳實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段與PD-L1之間的解離常數KD 約1nM至約0.8nM。
在一些實施例中，所述本發明的人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段特異性地解除PD-L1的免疫負調節，激活T細胞分泌細胞因子。
本發明提供一種人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，所述抗體或其片段能特異性結合PD-L1，其特徵在於，不直接阻斷PD1與PD-L1相互作用實現免疫抑制的解除。在一些實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段能激活T細胞分泌細胞因子。在一些實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段能激活T細胞分泌IL-2。在另一些方案中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段能激活T細胞分泌IFN-γ。
在一些實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區基酸序列選自與SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 16具有至少80%同一性的胺基酸序列；所述輕鏈可變區胺基酸序列選自與SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23 或SEQ ID NO: 24至少具有80%同一性的胺基酸序列。
在一個實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，其重鏈可變區和輕鏈可變區選自以下組合： 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 9以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 17； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 10以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 18； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 11以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 19； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 12以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 20； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 13以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 21； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 14以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 22； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 15以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 23； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 16以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 24； 或上述每組序列中存在至多20個、18個、16個、14個、12個、10個、8個、6個、4個、2個或1個保守胺基酸取代的胺基酸序列。
在一個較佳實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，其重鏈可變區和輕鏈可變區選自以下組合： 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 9以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 17； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 10以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 18； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 11以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 19； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 12以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 20； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 13以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 21； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 14以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 22； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 15以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 23或 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 16以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 24。
在另一個較佳的實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，其重鏈可變區和輕鏈可變區選自以下組合： 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 9以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 17； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 12以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 20； 或上述每組序列中存在至多20個、18個、16個、14個、12個、10個、8個、6個、4個、2個或1個保守胺基酸取代的胺基酸序列。
在一個更佳的實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，其重鏈可變區和輕鏈可變區選自以下組合： 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 9以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 17或 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 12以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 20。
在上述任何實施例中，本發明提供的人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其片段可包含1個、2個、3個、4個或5個保守修飾的胺基酸取代。較佳地，本發明的抗體或其片段包含1個、2個或3個保守修飾的胺基酸取代。
本發明提供的人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其片段，其可以包含人源 IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變異體的重鏈恒定區。在一些實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段的輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變異體的恒定區。
本發明提供的人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其片段是單克隆抗體、單域抗體、scFv、Fab片段、Fv片段、F(ab)'片段、F(ab')2片段、雙特異性抗體、免疫綴合物或其組合。
在上述任何實施例中，本發明提供的人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其片段可包含：人重鏈恒定區或其變異體，所述變異體至多包含20個保守修飾的胺基酸取代；和/或人輕鏈恒定區或其變異體，所述變異體至多包含20個保守修飾的胺基酸取代。在一些實施例中，所述變異體可包含至多10個保守修飾的胺基酸取代。在一些實施例中，所述變異體可包含至多5個保守修飾的胺基酸取代。在一些實施例中，所述變異體可包含至多3個保守修飾的胺基酸取代。
在一個實施例中，本發明提供了分離的多核苷酸，其編碼本發明的人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段。
在一個實施例中，多核苷酸包含編碼本發明所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體的重鏈可變區的重鏈編碼序列，和編碼本發明所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體的輕鏈可變區的輕鏈編碼序列。
在另一方面，本發明提供了表現載體，包含所述的多核苷酸。
在另一方面，本發明提供了主體細胞，其包含所述表現載體。
在一個實施例中，所述主體細胞為HEK293-6E細胞。
在另一方面，本發明提供所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段、所述多核苷酸、所述表現載體或所述主體細胞在製備用於抗腫瘤的藥物中的用途。
在另一方面，本發明提供了所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段、所述多核苷酸、所述表現載體或所述主體細胞用於治療腫瘤的用途。
在另一方面，本發明提供了所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段、所述多核苷酸、所述表現載體或所述主體細胞用於治療腫瘤。
在另一方面，本發明提供了抗腫瘤醫藥組合物，其包含有效量的所述人源化抗人PD-L1 單克隆抗體或其功能片段，和醫藥上可接受的載劑。
在一個實施例中，本發明提供了用於在有需要的個體中增強抗腫瘤應答的方法，所述方法包括向個體施用治療有效量的本發明的人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段。在另一個實施例中，本發明提供了用於在有需要的個體中減少腫瘤或抑制腫瘤細胞的生長的方法，所述方法包括向個體施用治療有效量的本發明的人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段。在另一個實施例中，本發明提供了用於在有需要的個體中治療腫瘤的方法，所述方法包括向個體施用治療有效量的本發明的人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段。
本發明中所述腫瘤選自由以下組成的組：淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、神經膠質瘤、乳腺癌、肺癌、腸癌、骨癌、卵巢癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、胃癌(stomach cancer)、睾丸癌、唾液腺癌、甲狀腺癌、胸腺癌、上皮癌、頭或頸癌、胃癌(gastric cancer)、胰腺癌或其組合，較佳為乳腺癌、肺癌、胃癌、腸癌、腎癌、黑素瘤、膀肮癌和胰腺癌。進一步較佳為結腸癌、胰腺癌、胃癌、非小細胞肺癌、黑素瘤、膀肮癌和腎癌。
在一些實施例中，本文公開的抗體和其片段可以通過選自以下的至少一種路徑施用至個體：胃腸外、皮下、肌肉內、靜脈內、關節內、支氣管內、腹內、囊內、軟骨內、腔內、體腔內、小腦內、腦室內、結腸內、宮頸內、胃內、肝內、心肌內、骨內、骨盆內、心包內、腹膜內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、脊柱內、滑膜內、胸腔內、鼓室內、子宮內、膀胱內、玻璃體內、快速注射、結膜下、經陰道、經直腸、經頰、舌下、鼻內、腫瘤內和經皮膚。
在一些實施例中，本發明中公開的人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段可以與一種或多種另外的治療劑組合施用至有需要的個體。在一些實施例中，可以在向個體施用另外的治療劑之前、期間和/或之後將抗體和其片段施用至個體。在一些實施例中，另外的治療劑是化學治療劑、放射治療劑、細胞因子、抗血管生成藥物、抗體或其片段或指示待治療的疾病的任何其他另外的治療劑。在一些實施例中，當一起施用時，無論是同時施用還是依序施用，人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段和另外的治療劑均顯示出治療性協同作用。在一些實施例中，人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段和另外的治療劑以單獨的製劑施用。在另一些實施例中，人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段和另外的治療劑以相同的製劑施用。在一些實施例中，本文提供的人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段增強一種或多種另外的治療劑的免疫調節作用。在另一些實施例中，一種或多種另外的治療劑增強人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段的作用。
在一些實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段與其他免疫檢查點抑制劑聯用協同刺激免疫反應。在另一些實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段與能阻斷PD-1與PD-L1相互作用的免疫檢查點抗體的聯用協同刺激免疫反應。在一些實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段與另一種PD-L1抗體聯用協同刺激免疫反應。在另一些實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段與另一種PD-1抗體聯用協同刺激免疫反應。在一個具體實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段與atezolizumab（商品名：Tecentriq）聯用協同刺激免疫反應，能激活T細胞分泌細胞因子。在一個具體實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段與atezolizumab聯用協同刺激免疫反應，能激活T細胞分泌IL-2。在一個具體實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段與atezolizumab聯用協同刺激免疫反應，能激活T細胞分泌IFN-γ。
在一些實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段與其他免疫檢查點抑制劑聯用協同抑制腫瘤生長。在一些實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段與另一種PD-L1抗體聯用協同抑制腫瘤生長。在另一些實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段與另一種PD-1抗體聯用協同抑制腫瘤生長。在一些具體實施例中，所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段與atezolizumab聯用協同抑制腫瘤生長。在另一些具體實施例中，所述人源化PD-L1單克隆抗體或其功能片段與pembrolizumab（商品名：Keytruda）聯用協同抑制腫瘤生長。在一些實施例中，所述低劑量的人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段與低劑量的另一種PD-L1抗體或PD-1抗體聯用協同抑制腫瘤生長。所述腫瘤選自結腸癌、胰腺癌、胃癌、非小細胞肺癌、黑素瘤、膀肮癌和腎癌，較佳地，所述腫瘤選自結腸癌。
在另一方面，本發明提供了一種製備所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段的方法，包括： 對鼠源抗體進行人源化，獲得所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段的輕鏈和重鏈的可變區編碼序列；以及 用所述可變區編碼序列進行重組抗體生產，獲得功能性所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段。
本發明提供了針對PD-L1的解除抑制性抗體，通過增強T細胞對各種抗原的免疫反應來進行腫瘤免疫治療。並且這種抗體的作用不是通過直接阻斷PD-1與PD-L1相互作用實現的，呈現了新的免疫檢查點活性調節機制。
本發明提供的人源化抗人PD-L1單克隆抗體對PD-L1具有高親和性、高特異性，能夠刺激T細胞分泌細胞因子，例如特異地解除PD-L1的免疫負調節，激活T細胞分泌細胞因子。因而，本發明提供的功能性人源化抗人PD-L1單克隆抗體，可通過調節PD-L1信號通路來激活T細胞，進而實現腫瘤免疫治療的目的。
除非另有說明，本發明所用的技術和科學術語具有與業內熟習此項技術者通常所理解的含義。
本文所用的術語“抗體”指免疫球蛋白分子，其通常為由2個相同重鏈和2個相同輕鏈通過二硫鍵相互連接組成的四聚體。根據胺基酸序列的保守性差異，將重鏈和輕鏈分為位於氨基端的可變區(V)和位於羧基端的恒定區(C)。在重鏈和輕鏈的可變區內，分別有三個局部區域的胺基酸組成和排列順序具有更高的變異程度，為抗體與抗原結合的關鍵位置，因而也稱為互補決定區(CDR)。在本文中，三個重鏈互補決定區分別稱為HCDR1、HCDR2和HCDR3，三個輕鏈互補決定區分別稱為LCDR1、LCDR2和LCDR3。一條重鏈和一條輕鏈的可變區相互作用形成了抗原結合部位(Fv)。根據它們重鏈恒定區的胺基酸序列，可將抗體分為不同類別。有五種主要類型的完整抗體：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，並且這些中的一些可進一步分為亞類，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同類別的免疫球蛋白的亞單位結構和三維構象在業內是已知的。本發明旨在包括任何前述類或亞類的抗體。
本文使用的術語“抗體片段”意即抗體的抗原結合片段及抗體類似物，其通常包括至少部分母體抗體(parental antibody)的抗原結合區或可變區(例如一個或多個CDR)。抗體片段保留母體抗體的至少某些結合特異性。例如，能夠結合PD-L1或其部分的抗體片段，包括但不限於sdAb（單域抗體）、Fab (例如，抗體經木瓜蛋白酶消化而得到)、F(ab’)2 (例如，通過胃蛋白酶消化得到)、Fv或scFv (例如通過分子生物學技術得到)。
本文使用的術語“單克隆抗體”指均一的僅針對某一特定抗原表位的抗體。與典型地包括針對不同抗原決定簇(表位)的不同抗體的普通多克隆抗體製劑相比，每種單克隆抗體針對抗原上的單個抗原決定簇。修飾語“單克隆”表示抗體的均一特徵，不解釋為需要通過任何特定方法產生的抗體。本發明的單克隆抗體較佳通過重組DNA方法產生，或通過本文其它地方描述的篩選方法獲得。
本文使用的術語“分離的多核苷酸”指非自然界中天然存在狀態的多核苷酸，包括通過生物學技術從自然界(包括生物體內)分離出的多核苷酸，也包括人工合成的多核苷酸。分離的多核苷酸可以是基因組DNA、cDNA、mRNA或合成的其它RNA，或者它們的組合。本文提供了多個用於編碼人源化抗PD-L1單克隆抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的核苷酸序列，需要指出的是，業內熟習此項技術者可以根據本文所提供的重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列，基於密碼子簡並性，設計出與以上提供的核苷酸序列不完全相同的核苷酸序列，但都編碼相同的胺基酸序列。這些經改動的核苷酸序列也包括在本發明的範圍內。
本文中所用的胺基酸殘基/位置“修飾”，指相對於初始胺基酸序列的一級胺基酸序列變化，其中變化來自於涉及所述胺基酸殘基/位置的序列的改變。例如，典型的修飾包括用另一個胺基酸替換 (如，保守或非保守替換)（在所述位置上的）殘基、在所述殘基/位置相鄰位上插入一個或多個(一般少於5或3個) 胺基酸、和缺失所述殘基/位置。“胺基酸替換”、或其變化，指在預先確定的（初始）胺基酸序列中，用不同的胺基酸殘基代替現有的胺基酸殘基。相對於含初始(或“野生型”)胺基酸序列的多肽，修飾一般較佳會產生變異體多肽的至少一種生理生化活性的改變。例如，對於抗體，改變的生理生化活性可以是針對靶分子的結合親和力、結合能力和/或結合效果。“保守胺基酸取代”指業內熟習此項技術者已知的胺基酸取代，進行這種取代通常不改變所得到的分子的生物學活性。一般而言，業內熟習此項技術者公認在多肽非必需區的單個胺基酸取代基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等，Molecular Biology of the Gene(基因的分子生物學)，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁(第四版，1987))。這樣的例示性取代較佳依照以下所示的取代來進行：
例示性保守胺基酸取代
Figure 108141549-A0304-0001
關於肽或多肽序列的“百分比 (%) 胺基酸序列同一性”定義為對比序列並在必要時引入缺口以獲取最大百分比序列同一性後，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分，候選序列中與特定肽或多肽序列中的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分率。可以業內的多種方式進行序列對比以測定百分比胺基酸序列同一性，例如使用公眾可得到的計算機軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體。業內熟習此項技術者可決定測量對比的適宜參數，包括對所比較的序列全長獲得最大對比所需的任何算法。
當涉及多核苷酸時，本文所用的術語“載體”指用於將核苷酸編碼信息轉移到主體細胞內的任一種分子 (例如，核酸、質體或病毒等)。術語“表現載體”或“表現盒”指適於在主體細胞內表現目的基因(待表現核苷酸序列)的載體，通常包括目的基因、啟動子、終止子、標記基因等部分。
本文所用的術語“主體細胞”指已經或者能夠用核酸序列轉化並從而表現所選的目的基因的細胞。該術語包括親本細胞的後代，無論該後代與原來的親本細胞在形態或基因組成上是否相同，只要後代存在所選目的基因即可。常用的主體細胞包括細菌、酵母、哺乳動物細胞等。
本文所用的術語“轉染”指外來或外源DNA被細胞攝入，該技術可用於將一種或多種外源DNA部分導入適宜的主體細胞。可通過理化方法(例如通過氯化鈣處理)誘導細胞，使其處於最適攝取和容納外來DNA的生理狀態，即“感受態”。
本文所提及配體/受體、抗體/抗原或其它結合對時，“特異性”結合是指在蛋白和/或其它生物試劑的異質群體中確定是否存在所述蛋白例如PD-1的結合反應。因此，在所指定的條件下，特定的配體/抗原與特定的受體/抗體結合，並且並不以顯著量與樣品中存在的其它蛋白結合。
當用“投予”和“治療”提及動物、人、實驗對象、細胞、組織、器官或生物液時，是指將外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受治療者、細胞、組織、器官或生物液接觸。“投予”和“治療”可指例如治療方法、藥動學方法、診斷方法、研究方法和實驗方法。治療細胞包括讓試劑與細胞接觸以及讓試劑與流液接觸，其中所述流液與細胞接觸。“投予”和“治療”還意味著例如通過試劑、診斷劑、結合組合物或通過其他細胞對細胞進行體外和離體治療。
提及醫藥組合物時，本文所使用的術語“有效量的”指可對人和/或動物產生功能或活性且可被人和/或動物所接受的量。“醫藥上可接受的載劑”指用於投予的載劑，包括各種賦形劑、稀釋劑和緩沖劑等，這些物質適合於人和/或動物投予而無過度的不良副反應，同時適合於維持位於其中的藥物或活性劑的活力。
除非另外特別說明，否則單數的使用包括複數。除非另外特別說明，否則詞語“一個(a)”或“一個(an)”意指“至少一個”。除非另外說明，否則“或”的使用意指“和/或”。短語“至少一個”的含義等同於短語“一個或多個”的含義。此外，術語“包括(including)”以及其他形式諸如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。此外，除非另外特別說明，否則術語諸如“要素”或“組分”包括包含一個單元的元素或組分以及包含多於一個單元的元素和組分。
本文所用術語“約”是指數值在由本領域一般技術人員所測定的具體值的可接受誤差範圍內，所述數值部分取決於怎樣測量或測定(即測量體系的限度)。例如，在本領域每一次實行中“約”可意味著在1內或超過1的標準差。或者，“約”或“基本上包含”可意味著至多20％的範圍，較佳地至多10%的範圍。此外，特別對於生物學系統或過程而言，該術語可意味著至多一個數量級或數值的至多5倍。除非另外說明，否則當具體值在本申請和申請專利範圍中出現時，“約”或“基本上包含”的含義應該假定為在該具體值的可接受誤差範圍內。
下面將結合具體實例對本發明的一些方面進行詳細描述。除非另有說明，下文描述的實例的方法和材料均為可以通過市場購買獲得的常規產品。
實例 1 鼠源抗人 PD-L1 抗體人源化
1). 從雜交瘤細胞中分離得到多核苷酸序列，測序得到鼠源抗人PD-L1抗體mPD-L1Ab抗體序列(CDR區域採用下劃線顯示) (參見例如SEQ ID NOs: 1-2)
Figure 108141549-A0304-0002
Figure 108141549-A0304-0003
2.) 抗人PD-L1抗體CDR移植質體構建
選擇IMGT human V gene (F+ORF+in-frameP) 數據庫，根據比對選擇同源性最高的人Germline抗體序列作為人源化接收載體，將鼠抗體中三個重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2和HCDR3，三個輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3分別轉入相應位置，並且分析翻譯後修飾位點(PTM)見表1。序列分析顯示N99, W35, M37三個位點是翻譯後修飾的熱點(參見例如SEQ ID NOs: 3-4)。
Figure 108141549-A0304-0004
Figure 108141549-A0304-0005
表1：翻譯後修飾位點風險分析
Figure 108141549-A0304-0006
3)  . 設計噬菌體文庫CBM、5BM (灰色底紋)構建抗人PD-L1抗體mPD-L1Ab VH-VL的Phage-Fab和FASEBA-Fab質體，篩選人源化抗體回復突變位點(參見例如SEQ ID NOs: 5-8)。
mPD-L1Ab_CBM
Figure 108141549-A0304-0007
Figure 108141549-A0304-0008
mPD-L1Ab_5BM
Figure 108141549-A0304-0009
Figure 108141549-A0304-0010
3). 採用Biacore 8K測定方法對原核表現抗體產物親和力排序及其VH/VL序列(表2)，選擇抗人PD-L1抗體親和力最高的序列進行真核系統表現。
表2：單克隆抗體人源化回復突變篩選，具有最高親和力的抗體親和力排序
Figure 108141549-A0304-0011
呈現最高親和力的10條抗體序列如下(參見例如SEQ ID NOs: 9-24)：
Figure 108141549-A0304-0012
Figure 108141549-A0304-0013
Figure 108141549-A0304-0014
Figure 108141549-A0304-0015
Figure 108141549-A0304-0016
Figure 108141549-A0304-0017
Figure 108141549-A0304-0018
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Figure 108141549-A0304-0020
Figure 108141549-A0304-0021
Figure 108141549-A0304-0022
Figure 108141549-A0304-0023
Figure 108141549-A0304-0024
Figure 108141549-A0304-0025
Figure 108141549-A0304-0026
Figure 108141549-A0304-0027
實例 2 ：人源化抗體重組生產
選中的抗體VH、VL序列經密碼子優化後，連接在5’端分泌信號肽後，與人抗體IgG1重鏈、kappa輕鏈恒定區序列相連接，分別克隆到pTT5表現載體中製備成為可以在哺乳動物細胞內表現並分泌的人抗體DNA序列。質體採用PEI共轉染HEK293-6E懸浮培養細胞，進行瞬時表現。轉染時，細胞密度維持在1×106 細胞/mL，PEI:DNA比例為3:1。細胞在37℃ 5% CO2 培養箱中105轉/分鐘震盪培養。轉染24小時後，加入0.5% Trypton N-1。5天后，收集細胞培養上清用於抗體純化。純化之前，將管道和蛋白A柱用0.2M NaOH去熱原。將柱用含有0.05M Tris和1.5M NaCl（pH8.0）的緩衝液重新平衡。隨後將收穫的細胞培養物上清液，使用2×上述緩衝液1:1稀釋並過濾除菌。將過濾的上清液和蛋白A柱室溫孵育2小時，用並1×上述緩衝液洗滌柱後，使用無菌0.1M檸檬酸鈉（pH3.5）洗脫IgG，收集了洗脫液並用九分之一體積的無菌1M Tris-HCl（pH9）中和。在無菌條件下，將所述產品緩衝液交換為PBS（pH7.4）以除去任何的洗脫緩衝液並濃縮所述樣品。濃縮之後，使用1.43的消光係數Ec（0.1%）通過OD280nm對抗體進行定量。
純化的抗體通過BioRad電泳系統用10%預製膠（GenScript）通過SDS-PAGE來分析。將所述凝膠用Estain2.0 (GenScript)染色並通過比較染色帶與Protein Ladder（GenScript）來估計分子大小和純度 (表3)。
表3：人源化抗體重組生產
Figure 108141549-A0304-0028
實例 3 ：人源化單克隆抗體的親和力測定
以10μl/min流速的HBS-EP緩衝液平衡芯片表面5分鐘，隨後以10μl/min的流速注射“NHS + EDC”的1:1混合液420秒 來活化芯片。將稀釋在10mM醋酸鈉緩衝液中的捕獲抗體（Goat anti-mouse IgG）以10μl/min流速注射約420秒，進行耦聯，然後最後以10 μl/min的流速注射乙醇胺420秒進行表面封閉。
以HBS-EP緩衝液作為樣品進行三個預循環來平衡芯片使基線穩定，10 μl/min流速注射稀釋在HBS-EP緩衝液中的抗體30秒（通過調整捕獲時間來控制抗體和抗原結合信號在～100RU，0~5 min之間），緩衝液平衡1 min。以30 μl/min流速注射低濃度抗原2.5 nM PD-L1-HIS  240 / 300秒，抗原與抗體發生結合，之後30 μl/min流速注射緩衝液720 / 600秒進行解離。100 μl/min流速注射50 mM HCl共三次，每次15 s進行再生，一次循環結束。改變抗原濃度（如5nM PD-L1-HIS）進行下一個梯度濃度的循環測定直到所有梯度濃度（2.5 nM、5 nM 、10 nM、20 nM、40 nM、80 nM PD-L1-HIS）及重複濃度（如10 nM PD-L1-HIS）測定結束。
實驗數據經過雙扣減(對照通道及零濃度)後，在Biacore 8K evaluation software中進行“1:1 結合”模型的擬合。使用Biacore 8K測定抗體針對PD-L1-HIS重組蛋白的親和力。
如圖1和表4所示，特異性針對人PD-L1的人源化單克隆抗體(AH01946，AH01947，AH01950，AH01963，AH01964, AH02029，AH02030，AH02033對PD-L1-HIS的親和力由Biacore測得均達到nM級。這些結果表明，本發明篩選到的抗體具有非常高的親和力。
表4. 人源化抗人PD-L1-HIS的單克隆抗體親和力測定
Figure 108141549-A0304-0029
實例4 ：人源化抗人 PD-L1 單克隆抗體的細胞活性功能驗證
在混合淋巴細胞反應中，通過套組（Miltenyl Biotec)從人的外周血單核細胞中分別分離單核細胞和CD4+ T細胞，並將單核細胞誘導為樹突狀細胞。實驗時，每孔含有104個同種異體的樹突狀細胞，5
Figure 02_image001
104 個CD4+ T細胞和不同濃度的抗體樣品工作液，最終工作體積是200 μl。以未加抗體孔作為背景對照，人源無關IgG1抗體作為陰性對照，抗PD-L1抗體作為陽性對照。37℃及5% CO2條件下，孵育72小時後，從每孔中取上清檢測IL-2含量（Cisbio的HTRF檢測套組）。
如圖2：在共培養系統中加入不同梯度稀釋的抗PD-L1抗體克隆，在不直接影響PD-1 / PD-L1相互作用的情況下，抗PD-L1抗體克隆與表現在靶細胞上的PD-Ll的結合，從而激活CD4+ T細胞並釋放細胞因子IL-2。與Tecentriq相比，這些測試的克隆均接近或超過到其功能(表5)。
表5. 人源化抗人PD-L1單克隆細胞細胞激活反應
Figure 108141549-A0304-0030
實例 5 ：人源化抗人 PD-L1 單克隆抗體的成藥性評價
AH01946, AH01950, AH01963, AH02029以及嵌合抗體五個抗體按200ml體系表現，得到5mg以上，內毒素控制在3 EU/mg水平的純化抗體樣品供後續實驗所需。
1. 熱穩定性檢測
1.1. 差示掃描熒光DSF方法檢測樣品變性溫度Tm值
表6. 人源化抗人PD-L1單克隆抗體Tm檢測
Figure 108141549-A0304-0031
檢測結果顯示(表6)，AH01946, AH01950, AH01963, AH02029的Tm都在70℃以上，AH02029呈現Tm 77.9℃。
1.2. 熱穩定性檢測實驗設置
A. 抗體樣品濃度>5 mg/ml進行耐久試驗。
抗體樣品在40℃分別處理，然後離心去除沈澱，再用ELISA評估殘留的抗體量。(40℃處理7天（D7），14天（D14）分別檢測，每次檢測同時用存放於-80℃未處理的樣品（D0）做對照) (圖3)
B. 抗體樣品濃度>5 mg/ml進行高溫試驗。 抗體樣品在溫度梯度條件下分別處理20分鐘，然後離心去除沈澱，再用ELISA評估殘留的抗體量。(溫度梯度包括：室溫、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、-80℃) (圖4)
ELISA結果顯示出AH01946, AH01950, AH01963, AH02029都具有較好的熱穩定性，處理後的抗體與對照條件相比曲線吻合度很高，對人源PD-L1蛋白的識別能力沒有受到影響。尤其是AH01946, AH02029在耐久試驗中，AH01946, AH01963在高溫試驗中，不同條件處理後的樣品與對照D0或者-80℃ ELISA曲線十分一致。
C. 耐久試驗處理樣品送測SEC-HPLC和nr-SDS。
結果如表7和圖5所示，經過熱處理的各個抗體樣品nr-SDS純度檢測沒有出現大量碎片，AH01946, AH02029的抗體處理後的樣品抗體主峰超過77%。表8和圖6顯示抗體樣品SEC-HPLC純度檢測未發現熱處理導致抗體大量聚集。
表7. 人源化抗人PD-L1單克隆抗體熱處理前後nr-SDS純度檢測
Figure 108141549-A0304-0032
表8. 人源化抗人PD-L1單克隆抗體熱處理前後SEC-HPLC純度檢測
Figure 108141549-A0304-0033
2. 成藥性實驗
基於抗體胺基酸序列的分析和翻譯後修飾熱點的預測，抗人PD-L1單克隆抗體CDR區域預測存在N99 （VH, 天門冬醯胺酸脫醯胺基）, W35(VH，氧化)、M37（VL, 氧化）三個翻譯後修飾的熱點(表1)。人源化後的抗人PD-L1單克隆抗體分別進行下列加壓實驗：
A. 氧化加壓試驗：抗體分子轉入20mM醋酸銨溶液中(pH5.0)，加入AAPH (2,2’-azobis (2-amidinopropane)) (50:1) 40℃避光處理24小時。
B. 去醯胺化加壓實驗：抗體分子置於PBS溶液中 (pH9)，48h，40℃來判斷氧化修飾/去醯胺修飾對抗體分子的抗原識別能力的影響。
結果顯示(表9-10)，質譜檢測覆蓋率都達到了95%左右，得到可信的結果。AH01946，AH01950，AH01963和AH02029四組樣品氧化加壓實驗前後沒有檢測到在W35（VH）和 M37（VL）位點的的氧化修飾。AH01946，AH01950，AH01963和AH02029四組樣品，在對照組（0h）樣品中，都檢測到99號位的N有較高比例脫醯胺修飾，而實驗組（pH9-48h）中N99號位點隻檢測到脫醯胺的肽，未檢測到沒有發生修飾的肽。證明N99位點存在很高的脫醯胺修飾可能性。
表9. 成藥性檢測分析: 人源化抗人PD-L1單克隆抗體氧化加壓試驗後質譜檢測
Figure 108141549-A0304-0034
表10. 成藥性檢測分析: 人源化抗人PD-L1單克隆抗體脫醯胺加壓試驗後質譜檢測
Figure 108141549-A0304-0035
ELISA驗證結果顯示（圖7），AH01946，AH01950，AH01963和AH02029抗體分子在氧化加壓處理和脫醯胺處理條件下，仍然保持較好的抗原結合能力。
去醯胺化加壓後處理的抗體樣品採用cIEF來判斷脫醯胺化加壓後抗體分子的電荷變化情況（表11和圖8）。結果顯示在脫醯胺化加壓的極端條件下抗體分子發生了電荷變化，酸峰成分明顯增加。結合質譜檢測的結果，判斷抗體分子中胺基酸脫醯胺的比例在增加。但是這種變化沒有對抗體分子與抗原的識別產生重大影響，處理前後抗體與抗原識別的能力沒有發生變化，ELISA曲線吻合度非常高。
表11. 成藥性檢測分析: 人源化抗人PD-L1單克隆抗體脫醯胺加壓試驗後cIEF檢測
Figure 108141549-A0304-0036
實例6 ：人源化抗人 PD-L1 單克隆抗體的交叉識別能力檢測
通過上述比較分析，人源化抗人PD-L1單克隆抗體AH01946、AH02029被選中製備穩定表現細胞株，並進一步確認抗體分子對人和猴來源的PD-L1的識別能力，作為在動物體內藥物代謝和毒性檢測實驗的依據。
表現人或者猴PD-L1的CHO細胞和陰性對照的母細胞，用PBS清洗3次。在96孔板中加入2.5
Figure 02_image001
105 個檢測細胞和起始濃度300nM，3倍梯度稀釋的純化抗體100ul，4℃孵育1小時。隨後用PBS清洗細胞3次，添加100μl iFluor標記的山羊抗人IgG，4℃孵育45分鐘。最後用PBS清洗細胞3次，用FACS BD Calibur讀取信號。如圖9A，AH01946、AH02029抗體和人PD-L1 細胞株都表現出強結合能力，呈現與Tecentriq對照抗體相當的結合水平，EC50 約為0.5 nM（表12）。
表12. 抗體對細胞表面人PD-L1結合的FACS檢驗
Figure 108141549-A0304-0037
同時，利用猴PD-L1過表現的CHO細胞檢驗抗體與猴PD-L1的交叉識別結合。如圖9B，AH01946、AH02029抗體和猴PD-L1 細胞株都表現出強結合能力，EC50 約為3.3 nM。
表13. 抗體對細胞表面猴PD-L1結合的FACS檢驗
Figure 108141549-A0304-0038
實例 7 ：人源化抗人 PD-L1 單克隆抗體對 PD-1/PD-L1 相互作用的影響
將ELISA板（Nunc）用100μl/孔的PBS中0.5μg/ml的重組人PD-1蛋白在4℃下包被過夜。用PBS-T（0.05%吐溫）洗滌板，並將其用200μl/孔的含1% BSA的PBST在37℃封閉0.5小時。隨後棄去封閉液，首個測試孔加入10μg/ml待測純化抗體50μl，並按照3倍梯度稀釋，共計11個測試濃度梯度。然後每孔添加50μl生物素標記的PD-L1-Fc（濃度為0.3 μg/ml），在37℃孵育1小時。將板用PBST洗滌3次，並用100μl/孔的抗生物素蛋白鏈黴親和素-HRP（SA-HRP，GenScript）37℃孵育10分鐘。最後將板用PBST洗滌5次，然後加入TMB顯色液（GenScript）並在室溫下在黑暗中孵育15分鐘。通過加入50μl的1M HCl終止液（Sigma）終止反應。使用酶標儀在450nm下讀板。如圖10A，Tecentriq抗體表現的IC50 =129.6 ng/ml; AH01946、AH02029抗體對PD-L1和PD-1的結合沒有出現阻斷效果，反而具有促進作用，其中 AH01946抗體的EC50 為21.89 ng/ml, AH02029抗體的EC50 為17.05 ng/ml。
表14. 抗體對人PD-1/PD-L1結合的ELISA檢驗
Figure 108141549-A0304-0039
FACS檢測中，表現人PD-1的CHO細胞和陰性對照的母細胞，用PBS清洗3次。在96孔板中加入2.5
Figure 02_image001
105 個檢測細胞和起始濃度300nM，3倍梯度稀釋的純化抗體50ul，每孔添加50μl生物素標記的PD-L1-Fc（濃度為1.5 μg/ml），4℃孵育1小時。隨後用PBS清洗細胞3次，添加100μl iFluor647標記的鏈黴親和素(1 μg/ml），4℃孵育45分鐘。最後用PBS清洗細胞3次，用FACS BD Calibur讀取信號。結果如圖10所示，在細胞水平，Tecentriq抗體表現的IC50 26.86 nM; AH01946、AH02029抗體對PD-L1和PD-1的結合具有促進作用，其中 AH01946抗體的EC50 為28.11 nM, AH02029抗體的EC50 為38.67 nM。
表15. 抗體對人PD-1/PD-L1結合的FACS檢驗
Figure 108141549-A0304-0040
這兩株抗體沒有對PD1-PD-L1的結合出現如同Tecentriq的抑制效果，反而隨著濃度增加出現促進PD1-PDL1的結合，ELISA和FACS都驗證了這一現象。這樣的抗體與PD-L1結合後似乎鎖死了一種失能狀態的PD-L1，易於結合PD1但是不激活，同時佔據結合位置，阻斷了抑制效應。
實例 8 ：人源化抗人 PD-L1 單克隆抗體與 Tecentriq 聯用的細胞活性功能驗證
從人體外周血中分離單核細胞（PBMC），然後使用pan monocyte分離套組和CD4+ T細胞分離套組（Miltenyi Biotech Inc.）分別去提取單核細胞（Monocyte）和CD4+ T細胞。將單核細胞分化成樹突細胞（Dendritic Cells）並用LPS處理成熟。把成熟的DC鋪在96孔板中，分別單獨加入濃度為0.03μg/ml 的Tecentriq、AH01946、AH01950、AH01963以及AH02029，或者Tecentriq與相應抗體的混合組分，孵育72小時後，使用Cisbio的HTRF原理的IL-2和IFN-γ套組去檢測混合細胞上清中IL-2和IFN-γ的含量。
圖11A和B顯示，與單獨Tecentriq或單獨抗PD-L1抗體相比，Tecentriq分別與AH01946、AH01950、AH01963以及AH02029聯合刺激細胞IL-2以及IFN-γ分泌量增加，具有一定的協同效應，特別是Tecentriq與AH02029聯用，協同刺激細胞效果較好。
採用上述實驗方法分別固定Tecentriq濃度0.01μg/ml，接著加入不同濃度的抗PD-L1的抗體克隆AH02029，以單獨加入不同濃度Tecentriq以及AH02029的孔作為對照。對細胞活性功能進行驗證，檢測混合細胞上清中IL-2及IFN-γ的含量。
如圖12A和B所示，固定Tecentriq在低濃度，不足以激活MLR中細胞因子釋放，使用抗PD-L1抗體AH02029能輔助完成細胞因子IL-2及IFN-γ激發釋放，表16和表17中0.01μg/ml Tecentriq與AH02029聯合刺激IL-2、IFN-γ的EC50 分別為0.013μg/ml、0.0045μg/ml，且都能輔助0.01μg/ml Tecentriq分泌IL-2、IFN-γ量由處於Bottom值提高到Top值。
表16. AH02029與Tecentriq聯用刺激細胞分泌IL-2分析
Figure 108141549-A0304-0041
表17. AH02029與Tecentriq聯用刺激細胞分泌IFN-γ分析
Figure 108141549-A0304-0042
實例 9 ： hPD1/PD-L1 雙靶點人源化小鼠 MC38-hPD-L1 結腸癌動物模型進行的 PD-L1 抗體、 PD-L1 抗體協同 PD1 抗體或協同 PD-L1 抗體的藥效實驗
將MC38-hPD-L1細胞接種於hPD1/PD-L1雙靶點人源化小鼠的右側皮下，待腫瘤生長到大約60-90mm3 時按腫瘤體積挑選並隨機分組，每組6只，共7組，分別為：hIgG 1mg/kg組、AH01946 10mg/kg組、53C1F3D4（參見中國專利CN108239149A中方法製備） 10mg/kg組、53C1F3D4 10mg/kg+AH01946 10mg/kg組、Tecentriq 10mg/kg+AH01946 10mg/kg組、Keytruda（默沙東；批號：R030484） 5mg/kg組、Keytruda 5mg/kg+AH01946 10mg/kg組。小鼠經腹腔注射，每4天投予1次，連續投予4次，末次投予7天后結束實驗。投予和觀察期間每週測量2次小鼠體重和腫瘤體積，並記錄測量值，計算腫瘤體積生長抑制率。
在實驗過程中，所有動物在投予期間活動和進食狀態良好，對各受試品耐受良好。 如圖13所示，在實驗終點，hIgG組、AH01946組、53C1F3D4組、53C1F3D4+AH01946組、Tecentriq +AH01946組、Keytruda組、Keytruda +AH01946組腫瘤體積生長抑制率TGITV 分別為23.1%、39.6%、86.8%、53.4%、72.5%和84.2%。
單次投予AH01946 10mg/kg 或53C1F3D4 10mg/kg 不具有顯著的藥效。但AH01946 10mg/kg可以協同53C1F3D4和Tecentriq的藥效，且AH01946與53C1F3D4聯合用藥和AH01946與Keytruda聯合用藥均得到對hPD1/PD-L1雙靶點人源化小鼠MC38-hPD-L1結腸癌動物模型顯著的有效性（p>0.001）。
實例10 ： PD1/PD-L1 雙靶點人源化小鼠 MC38-hPD-L1 結腸癌動物模型進行的低劑量 PD-L1 抗體協同 PD1 抗體和 PD-L1 抗體的藥效實驗
將MC38-hPD-L1細胞接種於hPD1/PD-L1雙靶點人源化小鼠的右側皮下，待腫瘤生長到大約60-90mm3 時按腫瘤體積挑選並隨機分組，每組6只，共6組，分別為：hIgG 1 mg/kg組、Keytruda 1 mg/kg組、Keytruda 1 mg/kg+AH01946 1 mg/kg組、Keytruda 1 mg/kg+AH01946 10 mg/kg組、Tecentriq10mg/kg 組、Tecentriq10mg/kg+AH01946 1 mg/kg組。小鼠經腹腔注射，每4天投予1次，連續投予4次，末次投予7天后結束實驗。投予和觀察期間每週測量2次小鼠體重和腫瘤體積，並記錄測量值，計算腫瘤體積生長抑制率。
在實驗過程中，所有動物在投予期間活動和進食狀態良好，對各受試品耐受良好。如圖14所示，在實驗終點，hIgG組、Keytruda組、Keytruda +AH01946 1mg/kg組、Keytruda +AH01946 10mg/kg組、Tecentriq組、Tecentriq +AH01946 1 mg/kg組腫瘤體積生長抑制率TGITV 分別為8.0%、5.47%、60.2%、79.1%和82.5%。
單次投予Keytruda 1 mg/kg 或Keytruda 1 mg/kg+AH01946 1 mg/kg均不具有顯著的藥效。但AH01946 10mg/kg可以協同Keytruda1 mg/kg的藥效，對hPD1/PD-L1雙靶點人源化小鼠MC38-hPD-L1結腸癌動物模型具有一定的有效性（p=0.07）。
無
圖1. 人源化抗人PD-L1的單克隆抗體親和力測定: 嵌合抗體 (圖1A)、AH01946 (圖1B)、AH01947 (圖1C)、AH01950 (圖1D)、AH01963 (圖1E)、AH01964 (圖1F)、AH02029 (圖1G)、AH02030 (圖1H)、AH02033 (圖1I)； 圖 2. 人源化抗人PD-L1單克隆抗體細胞活性功能檢測：具體為對照陽性抗體Tecentriq (圖2A)、對照陰性抗體 人IgG (圖2B)、AH01946 (圖2C)、AH01950 (圖2D) 、AH01963 (圖2E)、AH02029 (圖2F)； 圖3.  純化單克隆抗體熱穩定性分析，具體為人源化抗人PD-L1單克隆抗體熱穩定性ELISA分析(40℃處理1-2周)：嵌合抗體-0/7/14天-ELISA (圖3A)、AH01946-0/7/14天-ELISA (圖3B)、AH01950-0/7/14天-ELISA (圖3C) 、AH01963-0/7/14天-ELISA (圖3D)、AH02029-0/7/14天-ELISA (圖3E)； 圖4. 純化單克隆抗體熱穩定性分析，具體為人源化抗人PD-L1單克隆抗體熱穩定性ELISA分析(不同溫度條件下處理20分鐘)：嵌合抗體-ELISA (圖4A)、AH01946-ELISA (圖4B)、AH01950-ELISA (圖4C) 、AH01963- ELISA (圖4D)、AH02029-ELISA (圖4E)； 圖5. 純化單克隆抗體熱穩定性分析，具體為人源化抗人PD-L1單克隆抗體熱穩定性nr-SDS 分析(40℃處理2周)：AH01946-0/14天(圖5A)、AH01950-0/14天(圖5B)、AH01963-0/14天(圖5C)、AH02029-0/14天(圖5D)； 圖6.  純化單克隆抗體熱穩定性分析，具體為人源化抗人PD-L1單克隆抗體熱穩定性SEC-HPLC分析(40℃處理1-2周)：AH01946-0/7/14天(圖6A)、AH01950-0/7/14天(圖6B) 、AH01963-0/7/14天(圖6C)、AH02029-0/7/14天(圖6D)； 圖7. 純化單克隆抗體成藥性檢測分析，具體為人源化抗人PD-L1單克隆抗體氧化加壓/脫醯胺加壓試驗後ELISA分析：AH01946 (圖7A)、AH01950 (圖7B)、AH01963 (圖7C)、AH02029 (圖7D)； 圖8. 純化單克隆抗體成藥性檢測分析，具體為人源化抗人PD-L1單克隆抗體脫醯胺加壓試驗後c-IEF分析：AH01946 (圖8A)、AH01950 (圖8B)、AH01963 (圖8C)、AH02029 (圖8D)； 圖9. 單克隆抗體對細胞表面人/猴PD-L1結合FACS檢測分析，具體為AH01946、AH02029、陰性對照抗體人 IgG及陽性對照抗體 Tecentriq對人PD-L1結合分析（圖9A）； AH01946、AH02029及陰性對照抗體人 IgG對猴PD-L1結合分析（圖9B）； 圖10. 單克隆抗體對PD-1/PD-L1相互作用的影響分析，具體為AH01946、AH02029、陰性對照抗體人 IgG及陽性對照抗體 Tecentriq對PD-1/PD-L1結合影響的ELISA分析結果（圖10 A）；AH01946、AH02029、陰性對照抗體人IgG及陽性對照抗體 Tecentriq對PD-1/PD-L1結合影響的FACS分析結果（圖10 B）； 圖11. 人源化抗人PD-L1單克隆抗體與Tecentriq聯用的細胞活性功能驗證，具體為AH01946、AH01950、AH01963、AH02029與 Tecentriq聯用與各抗體分子單獨使用呈現的對T細胞IL-2（圖11 A）和IFN-γ（圖11 B）分泌量的比較，BLK為陰性對照組，即樣本中不加任何抗體； 圖12. 人源化抗人PD-L1單克隆抗體與Tecentriq聯用的細胞活性功能驗證，具體為一系列梯度濃度的AH02029與固定濃度的Tecentriq聯用，與各抗體分子單獨使用呈現的對T細胞IL-2（圖12 A）和IFN-γ（圖12 B）分泌量的比較； 圖13. 人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其協同PD1抗體/PD-L1抗體對hPD1/PD-L1雙靶點人源化小鼠MC38-hPD-L1結腸癌動物投予後的腫瘤體積增長趨勢圖線，hIgG作為陰性對照組（均值±標準差，*p>0.05，***p>0.001）； 圖14. 低劑量人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其協同PD1抗體/PD-L1抗體對hPD1/PD-L1雙靶點人源化小鼠MC38-hPD-L1結腸癌動物投予後的腫瘤體積增長趨勢圖線，hIgG作為陰性對照組（均值±標準差，***p>0.001）。
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Claims (21)

  1. 一種人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，所述抗體或其片段能特異性結合PD-L1，其特徵在於，不直接阻斷PD1與PD-L1相互作用實現免疫抑制的解除。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，其包含重鏈可變區，所述重鏈可變區胺基酸序列選自與SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 16 具有至少80%同一性的胺基酸序列。
  3. 一種人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，其包含重鏈可變區，所述重鏈可變區胺基酸序列選自與SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 16 具有至少80%同一性的胺基酸序列。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述的人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區胺基酸序列選自與SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 16 具有至少80%同一性的胺基酸序列；以及所述輕鏈可變區胺基酸序列選自與SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23 或SEQ ID NO: 24至少具有80%同一性的胺基酸序列。
  5. 如申請專利範圍第2項至第4項中任一項所述的人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，所述重鏈可變區胺基酸序列選自與SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 16 所示序列存在替換、插入或缺失至多20個胺基酸殘基的胺基酸序列。
  6. 如申請專利範圍第4項至第5項中任一項所述的人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，所述輕鏈可變區胺基酸序列選自與SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23 或SEQ ID NO: 24所示序列存在替換、插入或缺失至多20個胺基酸殘基的胺基酸序列。
  7. 如申請專利範圍第2項至第6項中任一項所述的人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，所述重鏈可變區胺基酸序列選自：SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 16。
  8. 如申請專利範圍第4項至第7項中任一項所述的人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，所述輕鏈可變區胺基酸序列選自：SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23 、SEQ ID NO: 24。
  9. 如申請專利範圍第4項至第 6項中任一項所述的人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，所述重鏈可變區和輕鏈可變區選自以下組合： 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 9以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 17； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 10以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 18； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 11以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 19； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 12以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 20； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 13以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 21； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 14以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 22； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 15以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 23； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 16以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 24； 或上述每組序列中存在至多20個、18個、16個、14個、12個、10個、8個、6個、4個、3個、2個或1個保守胺基酸取代的胺基酸序列。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，所述重鏈可變區和輕鏈可變區選自以下組合： 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 9以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 17； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 10以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 18； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 11以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 19； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 12以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 20； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 13以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 21； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 14以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 22； 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 15以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 23；或 所述重鏈可變區為SEQ ID NO: 16以及所述輕鏈可變區為SEQ ID NO: 24。
  11. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述的人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，所述抗體或其片段與PD-L1之間的解離常數KD 小於約3 nM。
  12. 分離的多核苷酸，其編碼如申請專利範圍第1項至第11項中任一項所述的人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段。
  13. 如請求項12所述的多核苷酸，其包含編碼所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體的重鏈可變區的重鏈編碼序列，和編碼所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體的輕鏈可變區的輕鏈編碼序列。
  14. 表現載體，其包含申請專利範圍第12項至第13項中任一項所述的多核苷酸。
  15. 主體細胞，其包含如申請專利範圍第14項所述的表現載體。
  16. 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項所述的人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段、申請專利範圍第12項至第13項中任一項所述的多核苷酸、申請專利範圍第14項所述的表現載體或申請專利範圍第15項所述的主體細胞在製備用於抗腫瘤的藥物中的用途。
  17. 抗腫瘤醫藥組合物，其包含有效量的如申請專利範圍第1項至第11項中任一項所述的人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，和醫藥上可接受的載劑。
  18. 如申請專利範圍第16項所述的用途或申請專利範圍17項所述的醫藥組合物，所述腫瘤選自結腸癌、胰腺癌、胃癌、非小細胞肺癌、黑素瘤、膀肮癌和腎癌。
  19. 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項所述的人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，所述抗體或其片段與另一種PD-L1抗體聯用協同刺激免疫反應；較佳地，所述抗體或其片段與atezolizumab聯用協同刺激免疫反應，能激活T細胞分泌細胞因子。
  20. 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項所述的人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段，低劑量的所述抗體或其片段與低劑量的另一種PD-L1抗體或PD-1抗體聯用協同抑制腫瘤生長。
  21. 製備如申請專利範圍第1項至第11項中任一項所述的人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段的方法，包括： 對鼠源抗體進行人源化，獲得所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段的輕鏈和重鏈的可變區編碼序列；以及 用所述可變區編碼序列進行重組抗體生產，獲得功能性所述人源化抗人PD-L1單克隆抗體或其功能片段。
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