CN113039207B - 人源化抗人pd-l1单克隆抗体及其制备方法和用途 - Google Patents

人源化抗人pd-l1单克隆抗体及其制备方法和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN113039207B
CN113039207B CN201980075384.4A CN201980075384A CN113039207B CN 113039207 B CN113039207 B CN 113039207B CN 201980075384 A CN201980075384 A CN 201980075384A CN 113039207 B CN113039207 B CN 113039207B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ser
human
variable region
chain variable
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201980075384.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113039207A (zh
Inventor
殷刘松
周铁林
方卓
米艳玲
吴瑃辰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Jinsirui Science and Technology Biology Corp
Original Assignee
Nanjing Jinsirui Science and Technology Biology Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Jinsirui Science and Technology Biology Corp filed Critical Nanjing Jinsirui Science and Technology Biology Corp
Publication of CN113039207A publication Critical patent/CN113039207A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113039207B publication Critical patent/CN113039207B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及一种人源化抗人PD‑L1单克隆抗体及其制备方法和用途。本发明提供的人源化抗人PD‑L1单克隆抗体对PD‑L1具有高亲和性、高特异性，能够刺激T细胞分泌细胞因子，特异地解除PD‑L1的免疫负调节作用，并且这种抗体的作用不是通过直接阻断PD‑1与PD‑L1相互作用实现的，呈现了新的免疫检查点活性调节机制。因而，本发明提供的功能性人源化抗人PD‑L1单克隆抗体，可通过调节PD‑L1信号通路来激活T细胞，进而实现肿瘤免疫治疗的目的。

Description

人源化抗人PD-L1单克隆抗体及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于肿瘤免疫疗法和分子免疫学领域，尤其是涉及一种人源化抗人PD-L1单克隆抗体。本发明还涉及该人源化抗人PD-L1单克隆抗体的制备方法及其用途。
背景技术
人类获得性免疫系统通过体液免疫(B细胞介导)和细胞免疫(T细胞介导)两大机制抵御外界感染和内部病发。T细胞作为免疫系统中的重要一员，在肿瘤免疫治疗中发挥着巨大的作用。从传统的细胞因子类药物到最近兴起的免疫检查点抑制剂治疗都是通过直接或间接的激活T细胞来达到消除肿瘤的目的(Esther et al,physiol,25(2):85-101,2010；Drew,Nature Reviews Cancer 12:252-264,2012)。
T细胞激活需要两级信号。第一级信号，也称为主要刺激信号，是通过TCR识别特异性MHC呈递的抗原来实现的，这种信号是抗原特异性的。另外，T细胞的激活还会受到第二级刺激信号，也称为共刺激信号或者共抑制信号对T细胞活性的调节(Jennifer et al,AnnuRev Immunol,27:591-619,2009)。这类免疫刺激或抑制性分子称作免疫检查点。免疫检查点疗法就是通过调节共刺激或共抑制信号来控制T细胞活性，让高活性的T细胞去杀伤肿瘤细胞从而达到治疗癌症的目的(Suzanne et.al,Cancer Cell 27(4):450-461,2015)。这些药物的抗肿瘤机制不同于以往的任何药物，既不是单纯地针对肿瘤，也不是简单地调节免疫细胞，而是特异性地针对肿瘤微环境中关键免疫逃逸机制，通过改善肿瘤免疫微环境来控制和清除肿瘤；所以这种疗法的研发成功将肿瘤免疫推向前所未有的高度，而且为今后的肿瘤免疫基础以及临床研究带来了巨大的革新以及深远影响。
程序性死亡受体1(PD-1)是一种重要的免疫抑制分子，属于T细胞调节因子CD28/PD-L1家族中的一员。目前已经有针对PD-1的抗体药物，包括默克在2014年上市的Keytruda和百时美施贵宝在2015年上市的Opdivo。PD-1/PD-L1靶点连续创造历史，2017年Opdivo首次进入TOP10、Keytruda首次进入TOP20。目前两个抗体药物在2017年的销售额分别是56.86亿美元和38.09亿美元。
程序性死亡受体-配体1(PD-L1)是PD-1的配体之一(另一个配体是PD-L2)。PD-L1是大小约为40kDa的第一性跨膜蛋白和PD-1一样也是一个重要的免疫检查点分子。PD-L1配体具有相当的肿瘤特异性，在肿瘤微环境中诱导表达，并且参与肿瘤微环境的免疫调节。PD-L1和PD-1结合传导共抑制信号降低T细胞的活性和增生，从而促使肿瘤细胞逃脱T细胞监控和杀伤(Dong et al,Nat Med；8:793-800,2002)。阻断PD-L1配体或者PD-1受体均可以修复进行中的肿瘤免疫反应。这一疗法针对肿瘤免疫逃逸的关键分子机制，所以可以针对多种肿瘤，获得很好的疗效，同时副作用较小。
PD-L1单克隆抗体药物能够特异性阻断PD-1和PD-L1的结合从而减弱或封闭PD-L1对T细胞负调节信号的传导，增强T细胞对各种抗原的免疫反应。目前PD-L1单克隆抗体药物已在临床试验阶段用于治疗多种人类癌症，包括非小细胞肺癌,黑色素瘤，结肠直肠癌,肾细胞癌，卵巢癌，前列腺癌，胃癌，乳腺癌(Julie et al.,N Engl Med 366:2455-2465,2012)。
2016年5月19日FDA批准了第一个PD-L1抗癌抗体药物的上市，它来自罗氏旗下基因泰克的PD-L1抗体atezolizumab(商品名Tecentriq)用于治疗晚期膀胱癌。这标志着该免疫检查点在肿瘤免疫疗法的临床阶段成功可行。而且，随着临床前实验验证针对不同免疫调节因子的单克隆抗体在协同治疗癌症方面的能力(Mace et al,Journal forImmunoTherapy of cancer 3:366,2015；Lussier et al,Journal for ImmunoTherapy ofCancer 3:21,2015),PD-L1单克隆抗体已与不同免疫抑制分子的单克隆抗体或者小分子化合物形成组合疗法在进行针对不同癌症的临床实验。
目前上市有三种PD-L1单克隆抗体药物，被批准应用于不同的适应症。免疫检查点类单克隆抗体在人体内也存在不同程度的副反应，包括可在某些患者中诱导免疫原性，过度抑制检查点信号可能引起自身免疫病(Claire et al,JAMA Oncol,2(10):1346-1353,2016)，以及不同PD-L1单克隆抗体会具有不同程度的可开发性。因此，尚需开发新的能够阻断PD-L1与PD-1蛋白结合的功能性抗体。
发明内容
本发明一方面提供了一种人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段，所述抗体或其片段能特异性结合PD-L1，其特征在于，不直接阻断PD1与PD-L1相互作用实现免疫抑制的解除。
在一些实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段，其包含重链可变区，所述重链可变区氨基酸序列选自与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16具有至少80％同一性的氨基酸序列。
本发明另一方面提供了一种人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段，其包含重链可变区，所述重链可变区氨基酸序列选自与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16具有至少80％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述重链可变区氨基酸序列选自与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ IDNO:16具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
本发明提供了人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区氨基酸序列选自与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16具有至少80％同一性的氨基酸序列；以及所述轻链可变区氨基酸序列选自与SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQID NO:24至少具有80％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述重链可变区氨基酸序列选自与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ IDNO:16具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述轻链可变区氨基酸序列选自与SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQID NO:24至少具有81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述重链可变区氨基酸序列选自与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ IDNO:16所示序列存在替换、插入或缺失至多20个氨基酸残基的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述重链可变区氨基酸序列选自与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示序列存在替换、插入或缺失1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸残基的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述重链可变区氨基酸序列选自与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ IDNO:16所示序列存在至多20个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述重链可变区氨基酸序列选自与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示序列存在至多20个、18个、16个、14个、12个、10个、8个、6个、4个、2个或1个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述轻链可变区氨基酸序列选自与SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQID NO:24所示序列存在替换、插入或缺失至多20个氨基酸残基的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述轻链可变区氨基酸序列选自与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示序列存在替换、插入或缺失1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸残基的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述轻链可变区氨基酸序列选自与SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQID NO:24所示序列存在至多20个保守氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述轻链可变区氨基酸序列选自与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24所示序列存在至多20个、18个、16个、14个、12个、10个、8个、6个、4个、2个或1个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述重链可变区氨基酸序列选自：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ IDNO:16。
在另一个实施方案中，所述轻链可变区氨基酸序列选自：SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQID NO:24。
在一个实施方案中，所述重链可变区氨基酸序列选自：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ IDNO:16；以及所述轻链可变区氨基酸序列选自：SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24。
在一些实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段，其重链可变区和轻链可变区选自以下组合：
所述重链可变区为与SEQ ID NO:9至少80％同一性的氨基酸序列，以及所述轻链可变区为与SEQ ID NO:17至少80％同一性的氨基酸序列；
所述重链可变区为与SEQ ID NO:10至少80％同一性的氨基酸序列，以及所述轻链可变区为与SEQ ID NO:18至少80％同一性的氨基酸序列；
所述重链可变区为与SEQ ID NO:11至少80％同一性的氨基酸序列，以及所述轻链可变区为与SEQ ID NO:19至少80％同一性的氨基酸序列；
所述重链可变区为与SEQ ID NO:12至少80％同一性的氨基酸序列，以及所述轻链可变区为与SEQ ID NO:20至少80％同一性的氨基酸序列；
所述重链可变区为与SEQ ID NO:13至少80％同一性的氨基酸序列，以及所述轻链可变区为与SEQ ID NO:21至少80％同一性的氨基酸序列；
所述重链可变区为与SEQ ID NO:14至少80％同一性的氨基酸序列，以及所述轻链可变区为与SEQ ID NO:22至少80％同一性的氨基酸序列；
所述重链可变区为与SEQ ID NO:15至少80％同一性的氨基酸序列，以及所述轻链可变区为与SEQ ID NO:23至少80％同一性的氨基酸序列；或
所述重链可变区为与SEQ ID NO:16至少80％同一性的氨基酸序列，以及所述轻链可变区为与SEQ ID NO:24至少80％同一性的氨基酸序列。
在一些优选的实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段，其重链可变区和轻链可变区选自以下组合：
所述重链可变区为与SEQ ID NO:9至少85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列，以及所述轻链可变区为与SEQ ID NO:17至少85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；
所述重链可变区为与SEQ ID NO:10至少85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列，以及所述轻链可变区为与SEQ ID NO:18至少85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；
所述重链可变区为与SEQ ID NO:11至少85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列，以及所述轻链可变区为与SEQ ID NO:19至少85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；
所述重链可变区为与SEQ ID NO:12至少85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列，以及所述轻链可变区为与SEQ ID NO:20至少85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；
所述重链可变区为与SEQ ID NO:13至少85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列，以及所述轻链可变区为与SEQ ID NO:21至少85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；
所述重链可变区为与SEQ ID NO:14至少85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列，以及所述轻链可变区为与SEQ ID NO:22至少85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；
所述重链可变区为与SEQ ID NO:15至少85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列，以及所述轻链可变区为与SEQ ID NO:23至少85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；或
所述重链可变区为与SEQ ID NO:16至少85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列，以及所述轻链可变区为与SEQ ID NO:24至少85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段，其重链可变区和轻链可变区选自以下组合：
所述重链可变区为SEQ ID NO:9以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:17；
所述重链可变区为SEQ ID NO:10以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:18；
所述重链可变区为SEQ ID NO:11以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:19；
所述重链可变区为SEQ ID NO:12以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:20；
所述重链可变区为SEQ ID NO:13以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:21；
所述重链可变区为SEQ ID NO:14以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:22
所述重链可变区为SEQ ID NO:15以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:23；
所述重链可变区为SEQ ID NO:16以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:24；
或上述每组序列中存在至多20个、18个、16个、14个、12个、10个、8个、6个、4个、2个或1个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段，其重链可变区和轻链可变区选自以下组合：
所述重链可变区为SEQ ID NO:9以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:17；
所述重链可变区为SEQ ID NO:10以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:18；
所述重链可变区为SEQ ID NO:11以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:19；
所述重链可变区为SEQ ID NO:12以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:20；
所述重链可变区为SEQ ID NO:13以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:21；
所述重链可变区为SEQ ID NO:14以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:22
所述重链可变区为SEQ ID NO:15以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:23；或
所述重链可变区为SEQ ID NO:16以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:24。
在一个优选的实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段，其重链可变区和轻链可变区选自以下组合：
所述重链可变区为SEQ ID NO:9以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:17；
所述重链可变区为SEQ ID NO:12以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:20；
所述重链可变区为SEQ ID NO:14以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:22；
所述重链可变区为SEQ ID NO:15以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:23；
或上述每组序列中存在至多20个、18个、16个、14个、12个、10个、8个、6个、4个、2个或1个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一个更优选的实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段，所述重链可变区和轻链可变区选自以下组合：
所述重链可变区为SEQ ID NO:9以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:17；
所述重链可变区为SEQ ID NO:12以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:20；
所述重链可变区为SEQ ID NO:14以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:22；或
所述重链可变区为SEQ ID NO:15以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:23。
在一个优选方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段，所述重链可变区和轻链可变区选自以下组合：
所述重链可变区为SEQ ID NO:9以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:17；
所述重链可变区为SEQ ID NO:12以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:20；
或上述每组序列中存在至多20个、18个、16个、14个、12个、10个、8个、6个、4个、2个或1个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一个更优选的实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段，所述重链可变区和轻链可变区选自以下组合：
所述重链可变区为SEQ ID NO:9以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:17；或
所述重链可变区为SEQ ID NO:12以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:20。
在一些实施方案中，本发明的人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段与PD-L1之间的解离常数KD小于约3nM。在另一个实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段与PD-L1之间的解离常数KD小于约2nM、约1.9nM、约1.8nM、约1.7nM、约1.6nM、约1.5nM、约1.4nM、约1.3nM、约1.2nM、约1.1nM、约1nM、约0.9nM、约08nM、或约0.7nM。在一个优选实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段与PD-L1之间的解离常数KD小于约1nM、约0.9nM、约08nM、或约0.7nM。在一个实施的方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段与PD-L1之间的解离常数KD约3nM至约0.8nM。在一个优选地实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段与PD-L1之间的解离常数KD约2nM至约1nM。在另一个优选实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段与PD-L1之间的解离常数KD约1nM至约0.8nM。
在一些实施方案中，所述本发明的人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段特异性地解除PD-L1的免疫负调节，激活T细胞分泌细胞因子。
本发明提供一种人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段，所述抗体或其片段能特异性结合PD-L1，其特征在于，不直接阻断PD1与PD-L1相互作用实现免疫抑制的解除。在一些实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段能激活T细胞分泌细胞因子。在一些实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段能激活T细胞分泌IL-2。在另一些方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段能激活T细胞分泌IFN-γ。
在一些实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区基酸序列选自与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16具有至少80％同一性的氨基酸序列；所述轻链可变区氨基酸序列选自与SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23或SEQID NO:24至少具有80％同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段，其重链可变区和轻链可变区选自以下组合：
所述重链可变区为SEQ ID NO:9以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:17；
所述重链可变区为SEQ ID NO:10以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:18；
所述重链可变区为SEQ ID NO:11以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:19；
所述重链可变区为SEQ ID NO:12以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:20；
所述重链可变区为SEQ ID NO:13以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:21；
所述重链可变区为SEQ ID NO:14以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:22；
所述重链可变区为SEQ ID NO:15以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:23；
所述重链可变区为SEQ ID NO:16以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:24；
或上述每组序列中存在至多20个、18个、16个、14个、12个、10个、8个、6个、4个、2个或1个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一个优选实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段，其重链可变区和轻链可变区选自以下组合：
所述重链可变区为SEQ ID NO:9以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:17；
所述重链可变区为SEQ ID NO:10以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:18；
所述重链可变区为SEQ ID NO:11以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:19；
所述重链可变区为SEQ ID NO:12以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:20；
所述重链可变区为SEQ ID NO:13以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:21；
所述重链可变区为SEQ ID NO:14以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:22；
所述重链可变区为SEQ ID NO:15以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:23或
所述重链可变区为SEQ ID NO:16以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:24。
在另一个优选的实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段，其重链可变区和轻链可变区选自以下组合：
所述重链可变区为SEQ ID NO:9以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:17；
所述重链可变区为SEQ ID NO:12以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:20；
或上述每组序列中存在至多20个、18个、16个、14个、12个、10个、8个、6个、4个、2个或1个保守氨基酸取代的氨基酸序列。
在一个更优选的实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段，其重链可变区和轻链可变区选自以下组合：
所述重链可变区为SEQ ID NO:9以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:17或
所述重链可变区为SEQ ID NO:12以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:20。
在上述任何实施方案中，本发明提供的人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其片段可包含1个、2个、3个、4个或5个保守修饰的氨基酸取代。优选地，本发明的抗体或其片段包含1个、2个或3个保守修饰的氨基酸取代。
本发明提供的人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其片段，其可以包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区。在一些实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段的轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的恒定区。
本发明提供的人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其片段是单克隆抗体、单域抗体、scFv、Fab片段、Fv片段、F(ab)'片段、F(ab')2片段、双特异性抗体、免疫缀合物或其组合。
在上述任何实施方案中，本发明提供的人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其片段可包含：人重链恒定区或其变体，所述变体至多包含20个保守修饰的氨基酸取代；和/或人轻链恒定区或其变体，所述变体至多包含20个保守修饰的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述变体可包含至多10个保守修饰的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述变体可包含至多5个保守修饰的氨基酸取代。在一些实施方案中，所述变体可包含至多3个保守修饰的氨基酸取代。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的多核苷酸，其编码本发明的人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段。
在一个实施方案中，多核苷酸包含编码本发明所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体的重链可变区的重链编码序列，和编码本发明所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体的轻链可变区的轻链编码序列。
在另一方面，本发明提供了表达载体，包含所述的多核苷酸。
在另一方面，本发明提供了宿主细胞，其包含所述表达载体。
在一个实施方案中，所述宿主细胞为HEK293-6E细胞。
在另一方面，本发明提供所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段、所述多核苷酸、所述表达载体或所述宿主细胞在制备用于抗肿瘤的药物中的用途。
在另一方面，本发明提供了所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段、所述多核苷酸、所述表达载体或所述宿主细胞用于治疗肿瘤的用途。
在另一方面，本发明提供了所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段、所述多核苷酸、所述表达载体或所述宿主细胞用于治疗肿瘤。
在另一方面，本发明提供了抗肿瘤药物组合物，其包含有效量的所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段，和药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，本发明提供了用于在有需要的受试者中增强抗肿瘤应答的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段。在另一个实施方案中，本发明提供了用于在有需要的受试者中减少肿瘤或抑制肿瘤细胞的生长的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段。在另一个实施方案中，本发明提供了用于在有需要的受试者中治疗肿瘤的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段。
本发明中所述肿瘤选自由以下组成的组：淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、神经胶质瘤、乳腺癌、肺癌、肠癌、骨癌、卵巢癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、胃癌(stomach cancer)、睾丸癌、唾液腺癌、甲状腺癌、胸腺癌、上皮癌、头或颈癌、胃癌(gastric cancer)、胰腺癌或其组合，优选为乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、肾癌、黑素瘤、膀肮癌和胰腺癌。进一步优选为结肠癌、胰腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、膀肮癌和肾癌。
在一些实施方案中，本文公开的抗体和其片段可以通过选自以下的至少一种路径施用至受试者：胃肠外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸腔内、鼓室内、子宫内、膀胱内、玻璃体内、快速注射、结膜下、经阴道、经直肠、经颊、舌下、鼻内、肿瘤内和经皮肤。
在一些实施方案中，本发明中公开的人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段可以与一种或多种另外的治疗剂组合施用至有需要的受试者。在一些实施方案中，可以在向受试者施用另外的治疗剂之前、期间和/或之后将抗体和其片段施用至受试者。在一些实施方案中，另外的治疗剂是化学治疗剂、放射治疗剂、细胞因子、抗血管生成药物、抗体或其片段或指示待治疗的疾病的任何其他另外的治疗剂。在一些实施方案中，当一起施用时，无论是同时施用还是依序施用，人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段和另外的治疗剂均显示出治疗性协同作用。在一些实施方案中，人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段和另外的治疗剂以单独的制剂施用。在另一些实施方案中，人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段和另外的治疗剂以相同的制剂施用。在一些实施方案中，本文提供的人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段增强一种或多种另外的治疗剂的免疫调节作用。在另一些实施方案中，一种或多种另外的治疗剂增强人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段的作用。
在一些实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段与其他免疫检查点抑制剂联用协同刺激免疫反应。在另一些实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段与能阻断PD-1与PD-L1相互作用的免疫检查点抗体的联用协同刺激免疫反应。在一些实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段与另一种PD-L1抗体联用协同刺激免疫反应。在另一些实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段与另一种PD-1抗体联用协同刺激免疫反应。在一个具体实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段与atezolizumab(商品名：Tecentriq)联用协同刺激免疫反应，能激活T细胞分泌细胞因子。在一个具体实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段与atezolizumab联用协同刺激免疫反应，能激活T细胞分泌IL-2。在一个具体实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段与atezolizumab联用协同刺激免疫反应，能激活T细胞分泌IFN-γ。
在一些实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段与其他免疫检查点抑制剂联用协同抑制肿瘤生长。在一些实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段与另一种PD-L1抗体联用协同抑制肿瘤生长。在另一些实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段与另一种PD-1抗体联用协同抑制肿瘤生长。在一些具体实施方案中，所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段与atezolizumab联用协同抑制肿瘤生长。在另一些具体实施方案中，所述人源化PD-L1单克隆抗体或其功能片段与pembrolizumab(商品名：Keytruda)联用协同抑制肿瘤生长。在一些实施方案中，所述低剂量的人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段与低剂量的另一种PD-L1抗体或PD-1抗体联用协同抑制肿瘤生长。所述肿瘤选自结肠癌、胰腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、膀肮癌和肾癌，优选地，所述肿瘤选自结肠癌。
在另一方面，本发明提供了一种制备所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段的方法，包括：
(1)对鼠源抗体进行人源化，获得所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段的轻链和重链的可变区编码序列；以及
(2)用所述可变区编码序列进行重组抗体生产，获得功能性所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段。
本发明提供了针对PD-L1的解除抑制性抗体，通过增强T细胞对各种抗原的免疫反应来进行肿瘤免疫治疗。并且这种抗体的作用不是通过直接阻断PD-1与PD-L1相互作用实现的，呈现了新的免疫检查点活性调节机制。
本发明提供的人源化抗人PD-L1单克隆抗体对PD-L1具有高亲和性、高特异性，能够刺激T细胞分泌细胞因子，例如特异地解除PD-L1的免疫负调节，激活T细胞分泌细胞因子。因而，本发明提供的功能性人源化抗人PD-L1单克隆抗体，可通过调节PD-L1信号通路来激活T细胞，进而实现肿瘤免疫治疗的目的。
附图简要说明
图1.人源化抗人PD-L1的单克隆抗体亲和力测定:嵌合抗体(图1A)、AH01946(图1B)、AH01947(图1C)、AH01950(图1D)、AH01963(图1E)、AH01964(图1F)、AH02029(图1G)、AH02030(图1H)、AH02033(图1I)；
图2.人源化抗人PD-L1单克隆抗体细胞活性功能检测：具体为对照阳性抗体Tecentriq(图2A)、对照阴性抗体人IgG(图2B)、AH01946(图2C)、AH01950(图2D)、AH01963(图2E)、AH02029(图2F)；
图3.纯化单克隆抗体热稳定性分析，具体为人源化抗人PD-L1单克隆抗体热稳定性ELISA分析(40℃处理1-2周)：嵌合抗体-0/7/14天-ELISA(图3A)、AH01946-0/7/14天-ELISA(图3B)、AH01950-0/7/14天-ELISA(图3C)、AH01963-0/7/14天-ELISA(图3D)、AH02029-0/7/14天-ELISA(图3E)；
图4.纯化单克隆抗体热稳定性分析，具体为人源化抗人PD-L1单克隆抗体热稳定性ELISA分析(不同温度条件下处理20分钟)：嵌合抗体-ELISA(图4A)、AH01946-ELISA(图4B)、AH01950-ELISA(图4C)、AH01963-ELISA(图4D)、AH02029-ELISA(图4E)；
图5.纯化单克隆抗体热稳定性分析，具体为人源化抗人PD-L1单克隆抗体热稳定性nr-SDS分析(40℃处理2周)：AH01946-0/14天(图5A)、AH01950-0/14天(图5B)、AH01963-0/14天(图5C)、AH02029-0/14天(图5D)；
图6.纯化单克隆抗体热稳定性分析，具体为人源化抗人PD-L1单克隆抗体热稳定性SEC-HPLC分析(40℃处理1-2周)：AH01946-0/7/14天(图6A)、AH01950-0/7/14天(图6B)、AH01963-0/7/14天(图6C)、AH02029-0/7/14天(图6D)；
图7.纯化单克隆抗体成药性检测分析，具体为人源化抗人PD-L1单克隆抗体氧化加压/脱酰胺加压试验后ELISA分析：AH01946(图7A)、AH01950(图7B)、AH01963(图7C)、AH02029(图7D)；
图8.纯化单克隆抗体成药性检测分析，具体为人源化抗人PD-L1单克隆抗体脱酰胺加压试验后c-IEF分析：AH01946(图8A)、AH01950(图8B)、AH01963(图8C)、AH02029(图8D)；
图9.单克隆抗体对细胞表面人/猴PD-L1结合FACS检测分析，具体为AH01946、AH02029、阴性对照抗体人IgG及阳性对照抗体Tecentriq对人PD-L1结合分析(图9A)；AH01946、AH02029及阴性对照抗体人IgG对猴PD-L1结合分析(图9B)；
图10.单克隆抗体对PD-1/PD-L1相互作用的影响分析，具体为AH01946、AH02029、阴性对照抗体人IgG及阳性对照抗体Tecentriq对PD-1/PD-L1结合影响的ELISA分析结果(图10A)；AH01946、AH02029、阴性对照抗体人IgG及阳性对照抗体Tecentriq对PD-1/PD-L1结合影响的FACS分析结果(图10B)；
图11.人源化抗人PD-L1单克隆抗体与Tecentriq联用的细胞活性功能验证，具体为AH01946、AH01950、AH01963、AH02029与Tecentriq联用与各抗体分子单独使用呈现的对T细胞IL-2(图11A)和IFN-γ(图11B)分泌量的比较，BLK为阴性对照组，即样本中不加任何抗体；
图12.人源化抗人PD-L1单克隆抗体与Tecentriq联用的细胞活性功能验证，具体为一系列梯度浓度的AH02029与固定浓度的Tecentriq联用，与各抗体分子单独使用呈现的对T细胞IL-2(图12A)和IFN-γ(图12B)分泌量的比较；
图13.人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其协同PD1抗体/PD-L1抗体对hPD1/PD-L1双靶点人源化小鼠MC38-hPD-L1结肠癌动物给药后的肿瘤体积增长趋势图线,hIgG作为阴性对照组(均值±标准差，*p<0.05，***p<0.001)；
图14.低剂量人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其协同PD1抗体/PD-L1抗体对hPD1/PD-L1双靶点人源化小鼠MC38-hPD-L1结肠癌动物给药后的肿瘤体积增长趋势图线，hIgG作为阴性对照组(均值±标准差，***p<0.001)。
具体实施方式
除非另有说明，本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术员通常所理解的含义。
本文所用的术语“抗体”指免疫球蛋白分子，其通常为由2个相同重链和2个相同轻链通过二硫键相互连接组成的四聚体。根据氨基酸序列的保守性差异，将重链和轻链分为位于氨基端的可变区(V)和位于羧基端的恒定区(C)。在重链和轻链的可变区内，分别有三个局部区域的氨基酸组成和排列顺序具有更高的变异程度，为抗体与抗原结合的关键位置，因而也称为互补决定区(CDR)。在本文中，三个重链互补决定区分别称为HCDR1、HCDR2和HCDR3，三个轻链互补决定区分别称为LCDR 1、LCDR2和LCDR3。一条重链和一条轻链的可变区相互作用形成了抗原结合部位(Fv)。根据它们重链恒定区的氨基酸序列，可将抗体分为不同类别。有五种主要类型的完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的一些可进一步分为亚类，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构象在本领域内是已知的。本发明旨在包括任何前述类或亚类的抗体。
本文使用的术语“抗体片段”意即抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗体片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。例如，能够结合PD-L1或其部分的抗体片段，包括但不限于sdAb(单域抗体)、Fab(例如，抗体经木瓜蛋白酶消化而得到)、F(ab’)2(例如，通过胃蛋白酶消化得到)、Fv或scFv(例如通过分子生物学技术得到)。
本文使用的术语“单克隆抗体”指均一的仅针对某一特定抗原表位的抗体。与典型地包括针对不同抗原决定簇(表位)的不同抗体的普通多克隆抗体制剂相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单个抗原决定簇。修饰语“单克隆”表示抗体的均一特征，不解释为需要通过任何特定方法产生的抗体。本发明的单克隆抗体优选通过重组DNA方法产生，或通过本文其它地方描述的筛选方法获得。
本文使用的术语“分离的多核苷酸”指非自然界中天然存在状态的多核苷酸，包括通过生物学技术从自然界(包括生物体内)分离出的多核苷酸，也包括人工合成的多核苷酸。分离的多核苷酸可以是基因组DNA、cDNA、mRNA或合成的其它RNA，或者它们的组合。本文提供了多个用于编码人源化抗PD-L1单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列，需要指出的是，本领域技术人员可以根据本文所提供的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列，基于密码子简并性，设计出与以上提供的核苷酸序列不完全相同的核苷酸序列，但都编码相同的氨基酸序列。这些经改动的核苷酸序列也包括在本发明的范围内。
本文中所用的氨基酸残基/位置“修饰”，指相对于初始氨基酸序列的一级氨基酸序列变化，其中变化来自于涉及所述氨基酸残基/位置的序列的改变。例如，典型的修饰包括用另一个氨基酸替换(如，保守或非保守替换)(在所述位置上的)残基、在所述残基/位置相邻位上插入一个或多个(一般少于5或3个)氨基酸、和缺失所述残基/位置。“氨基酸替换”、或其变化，指在预先确定的(初始)氨基酸序列中，用不同的氨基酸残基代替现有的氨基酸残基。相对于含初始(或“野生型”)氨基酸序列的多肽，修饰一般优选会产生变体多肽的至少一种生理生化活性的改变。例如，对于抗体，改变的生理生化活性可以是针对靶分子的结合亲和力、结合能力和/或结合效果。“保守氨基酸取代”指本领域技术人员已知的氨基酸取代，进行这种取代通常不改变所得到的分子的生物学活性。一般而言，本领域技术人员公认在多肽非必需区的单个氨基酸取代基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等，Molecular Biology ofthe Gene(基因的分子生物学)，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页(第四版，1987))。这样的例示性取代优选依照以下所示的取代来进行：
例示性保守氨基酸取代
原残基 保守取代
Ala(A) Gly；Ser
Arg(R) Lys；His
Asn(N) Gln；His
Asp(D) Glu；Asn
Cys(C) Ser；Ala
Gln(Q) Asn
Glu(E) Asp；Gln
Gly(G) Ala
His(H) Asn；Gln
Ile(I) Leu；Val
Leu(L) Ile；Val
Lys(K) Arg；His
Met(M) Leu；Ile；Tyr
Phe(F) Tyr；Met；Leu
关于肽或多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。可以本领域技术范围内的多种方式进行序列对比以测定百分比氨基酸序列同一性，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定测量对比的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大对比所需的任何算法。
当涉及多核苷酸时，本文所用的术语“载体”指用于将核苷酸编码信息转移到宿主细胞内的任一种分子(例如，核酸、质粒或病毒等)。术语“表达载体”或“表达盒”指适于在宿主细胞内表达目的基因(待表达核苷酸序列)的载体，通常包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分。
本文所用的术语“宿主细胞”指已经或者能够用核酸序列转化并从而表达所选的目的基因的细胞。该术语包括亲本细胞的后代，无论该后代与原来的亲本细胞在形态或基因组成上是否相同，只要后代存在所选目的基因即可。常用的宿主细胞包括细菌、酵母、哺乳动物细胞等。
本文所用的术语“转染”指外来或外源DNA被细胞摄入，该技术可用于将一种或多种外源DNA部分导入适宜的宿主细胞。可通过理化方法(例如通过氯化钙处理)诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态，即“感受态”。
本文所提及配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时，“特异性”结合是指在蛋白和/或其它生物试剂的异质群体中确定是否存在所述蛋白例如PD-1的结合反应。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著量与样品中存在的其它蛋白结合。
当用“给予”和“治疗”提及动物、人、实验对象、细胞、组织、器官或生物液时，是指将外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受治疗者、细胞、组织、器官或生物液接触。“给予”和“治疗”可指例如治疗方法、药动学方法、诊断方法、研究方法和实验方法。治疗细胞包括让试剂与细胞接触以及让试剂与流液接触，其中所述流液与细胞接触。“给予”和“治疗”还意味着例如通过试剂、诊断剂、结合组合物或通过其他细胞对细胞进行体外和离体治疗。
提及药物组合物时，本文所使用的术语“有效量的”指可对人和/或动物产生功能或活性且可被人和/或动物所接受的量。“药学上可接受的载体”指用于给药的载体，包括各种赋形剂、稀释剂和缓冲剂等，这些物质适合于人和/或动物给药而无过度的不良副反应，同时适合于维持位于其中的药物或活性剂的活力。
除非另外特别说明，否则单数的使用包括复数。除非另外特别说明，否则词语“一个(a)”或“一个(an)”意指“至少一个”。除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。短语“至少一个”的含义等同于短语“一个或多个”的含义。此外，术语“包括(including)”以及其他形式诸如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。此外，除非另外特别说明，否则术语诸如“要素”或“组分”包括包含一个单元的元素或组分以及包含多于一个单元的元素和组分。
本文所用术语“约”是指数值在由本领域一般技术人员所测定的具体值的可接受误差范围内，所述数值部分取决于怎样测量或测定(即测量体系的限度)。例如，在本领域每一次实行中“约”可意味着在1内或超过1的标准差。或者，“约”或“基本上包含”可意味着至多20％的范围，优选地至多10％的范围。此外，特别对于生物学系统或过程而言，该术语可意味着至多一个数量级或数值的至多5倍。除非另外说明，否则当具体值在本申请和权利要求中出现时，“约”或“基本上包含”的含义应该假定为在该具体值的可接受误差范围内。
下面将结合具体实施例对本发明的一些方面进行详细描述。除非另有说明，下文描述的实施例的方法和材料均为可以通过市场购买获得的常规产品。
实施例1鼠源抗人PD-L1抗体人源化
1)从杂交瘤细胞中分离得到多核苷酸序列，测序得到鼠源抗人PD-L1抗体mPD-L1Ab抗体序列(CDR区域采用下划线显示)(参见例如SEQ ID NOs:1-2)
Figure GDA0003747330650000141
2)抗人PD-L1抗体CDR移植质粒构建
选择IMGT human V gene(F+ORF+in-frameP)数据库，根据比对选择同源性最高的人Germline抗体序列作为人源化接收载体，将鼠抗体中三个重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，三个轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3分别转入相应位置，并且分析翻译后修饰位点(PTM)见表1。序列分析显示N99,W35,M37三个位点是翻译后修饰的热点(参见例如SEQ ID NOs:3-4)。
Figure GDA0003747330650000142
表1：翻译后修饰位点风险分析
Figure GDA0003747330650000143
Figure GDA0003747330650000151
3)设计噬菌体文库CBM、5BM(灰色底纹)构建抗人PD-L1抗体mPD-L1Ab VH-VL的Phage-Fab和FASEBA-Fab质粒，筛选人源化抗体回复突变位点(参见例如SEQ ID NOs:5-8)。
mPD-L1Ab_CBM
Figure GDA0003747330650000152
mPD-L1Ab_5BM
Figure GDA0003747330650000153
3)采用Biacore 8K测定方法对原核表达抗体产物亲和力排序及其VH/VL序列(表2)，选择抗人PD-L1抗体亲和力最高的序列进行真核系统表达。
表2：单克隆抗体人源化回复突变筛选，具有最高亲和力的抗体亲和力排序
Figure GDA0003747330650000154
Figure GDA0003747330650000161
呈现最高亲和力的10条抗体序列如下(参见例如SEQ ID NOs:9-24)：
Figure GDA0003747330650000162
Figure GDA0003747330650000171
Figure GDA0003747330650000181
实施例2：人源化抗体重组生产
选中的抗体VH、VL序列经密码子优化后，连接在5’端分泌信号肽后，与人抗体IgG1重链、kappa轻链恒定区序列相连接，分别克隆到pTT5表达载体中制备成为可以在哺乳动物细胞内表达并分泌的人抗体DNA序列。质粒采用PEI共转染HEK293-6E悬浮培养细胞，进行瞬时表达。转染时，细胞密度维持在1×106细胞/mL，PEI:DNA比例为3:1。细胞在37℃5％CO2培养箱中105转/分钟震荡培养。转染24小时后，加入0.5％Trypton N-1。5天后，收集细胞培养上清用于抗体纯化。纯化之前，将管道和蛋白A柱用0.2M NaOH去热原。将柱用含有0.05MTris和1.5M NaCl(pH8.0)的缓冲液重新平衡。随后将收获的细胞培养物上清液，使用2×上述缓冲液1:1稀释并过滤除菌。将过滤的上清液和蛋白A柱室温孵育2小时，用并1×上述缓冲液洗涤柱后，使用无菌0.1M柠檬酸钠(pH3.5)洗脱IgG，收集了洗脱液并用九分之一体积的无菌1M Tris-HCl(pH9)中和。在无菌条件下，将所述产品缓冲液交换为PBS(pH7.4)以除去任何的洗脱缓冲液并浓缩所述样品。浓缩之后，使用1.43的消光系数Ec(0.1％)通过OD280nm对抗体进行定量。
纯化的抗体通过BioRad电泳系统用10％预制胶(GenScript)通过SDS-PAGE来分析。将所述凝胶用Estain2.0(GenScript)染色并通过比较染色带与Protein Ladder(GenScript)来估计分子大小和纯度(表3)。
表3：人源化抗体重组生产
Figure GDA0003747330650000182
Figure GDA0003747330650000191
实施例3：人源化单克隆抗体的亲和力测定
以10μl/min流速的HBS-EP缓冲液平衡芯片表面5分钟，随后以10μl/min的流速注射“NHS+EDC”的1:1混合液420秒来活化芯片。将稀释在10mM醋酸钠缓冲液中的捕获抗体(Goat anti-mouse IgG)以10μl/min流速注射约420秒，进行耦联，然后最后以10μl/min的流速注射乙醇胺420秒进行表面封闭。
以HBS-EP缓冲液作为样品进行三个预循环来平衡芯片使基线稳定，10μl/min流速注射稀释在HBS-EP缓冲液中的抗体30秒(通过调整捕获时间来控制抗体和抗原结合信号在～100RU，0～5min之间)，缓冲液平衡1min。以30μl/min流速注射低浓度抗原2.5nM PD-L1-HIS 240/300秒，抗原与抗体发生结合，之后30μl/min流速注射缓冲液720/600秒进行解离。100μl/min流速注射50mM HCl共三次，每次15s进行再生，一次循环结束。改变抗原浓度(如5nM PD-L1-HIS)进行下一个梯度浓度的循环测定直到所有梯度浓度(2.5nM、5nM、10nM、20nM、40nM、80nM PD-L1-HIS)及重复浓度(如10nM PD-L1-HIS)测定结束。
实验数据经过双扣减(对照通道及零浓度)后，在Biacore 8K evaluationsoftware中进行“1:1结合”模型的拟合。使用Biacore 8K测定抗体针对PD-L1-HIS重组蛋白的亲和力。
如图1和表4所示，特异性针对人PD-L1的人源化单克隆抗体(AH01946，AH01947,AH01950,AH01963,AH01964,AH02029，AH02030,AH02033对PD-L1-HIS的亲和力由Biacore测得均达到nM级。这些结果表明，本发明筛选到的抗体具有非常高的亲和力。
表4人源化抗人PD-L1-HIS的单克隆抗体亲和力测定
Figure GDA0003747330650000192
实施例4：人源化抗人PD-L1单克隆抗体的细胞活性功能验证
在混合淋巴细胞反应中，通过试剂盒(Miltenyl Biotec)从人的外周血单核细胞中分别分离单核细胞和CD4+T细胞，并将单核细胞诱导为树突状细胞。实验时，每孔含有104个同种异体的树突状细胞，5×104个CD4+T细胞和不同浓度的抗体样品工作液，最终工作体积是200μl。以未加抗体孔作为背景对照，人源无关IgG1抗体作为阴性对照，抗PD-L1抗体作为阳性对照。37℃及5％CO2条件下，孵育72小时后，从每孔中取上清检测IL-2含量(Cisbio的HTRF检测试剂盒)。
如图2：在共培养系统中加入不同梯度稀释的抗PD-L1抗体克隆，在不直接影响PD-1/PD-L1相互作用的情况下，抗PD-L1抗体克隆与表达在靶细胞上的PD-Ll的结合，从而激活CD4+T细胞并释放细胞因子IL-2。与Tecentriq相比，这些测试的克隆均接近或超过到其功能(表5)。
表5人源化抗人PD-L1单克隆细胞细胞激活反应
Figure GDA0003747330650000201
实施例5：人源化抗人PD-L1单克隆抗体的成药性评价
AH01946,AH01950,AH01963,AH02029以及嵌合抗体五个抗体按200ml体系表达，得到5mg以上，内毒素控制在3EU/mg水平的纯化抗体样品供后续实验所需。
1.热稳定性检测
1.1差示扫描荧光DSF方法检测样品变性温度Tm值
表6人源化抗人PD-L1单克隆抗体Tm检测
Figure GDA0003747330650000202
检测结果显示(表6)，AH01946,AH01950,AH01963,AH02029的Tm都在70℃以上，AH02029呈现Tm 77.9℃。
1.2热稳定性检测实验设置
A.抗体样品浓度>5mg/ml进行耐久试验。
抗体样品在40℃分别处理，然后离心去除沉淀，再用ELISA评估残留的抗体量。(40℃处理7天(D7)，14天(D14)分别检测，每次检测同时用存放于-80℃未处理的样品(D0)做对照)(图3)
B.抗体样品浓度>5mg/ml进行高温试验。
抗体样品在温度梯度条件下分别处理20分钟，然后离心去除沉淀，再用ELISA评估残留的抗体量。(温度梯度包括：室温、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、-80℃)(图4)
ELISA结果显示出AH01946,AH01950,AH01963,AH02029都具有较好的热稳定性，处理后的抗体与对照条件相比曲线吻合度很高，对人源PD-L1蛋白的识别能力没有受到影响。尤其是AH01946,AH02029在耐久试验中，AH01946,AH01963在高温试验中，不同条件处理后的样品与对照D0或者-80℃ELISA曲线十分一致。
C.耐久试验处理样品送测SEC-HPLC和nr-SDS。
结果如表7和图5所示，经过热处理的各个抗体样品nr-SDS纯度检测没有出现大量碎片，AH01946,AH02029的抗体处理后的样品抗体主峰超过77％。表8和图6显示抗体样品SEC-HPLC纯度检测未发现热处理导致抗体大量聚集。
表7人源化抗人PD-L1单克隆抗体热处理前后nr-SDS纯度检测
Figure GDA0003747330650000211
表8人源化抗人PD-L1单克隆抗体热处理前后SEC-HPLC纯度检测
Figure GDA0003747330650000212
2.成药性实验
基于抗体氨基酸序列的分析和翻译后修饰热点的预测，抗人PD-L1单克隆抗体CDR区域预测存在N99(VH,天冬酰胺脱酰胺基),W35(VH，氧化)、M37(VL,氧化)三个翻译后修饰的热点(表1)。人源化后的抗人PD-L1单克隆抗体分别进行下列加压实验：
A.氧化加压试验：抗体分子转入20mM醋酸铵溶液中(pH5.0)，加入AAPH(2,2’-azobis(2-amidinopropane))(50:1)40℃避光处理24小时。
B.去酰胺化加压实验：抗体分子置于PBS溶液中(pH9)，48h，40℃
来判断氧化修饰/去酰胺修饰对抗体分子的抗原识别能力的影响。
结果显示(表9-10)，质谱检测覆盖率都达到了95％左右，得到可信的结果。AH01946，AH01950，AH01963和AH02029四组样品氧化加压实验前后没有检测到在W35(VH)和M37(VL)位点的的氧化修饰。AH01946，AH01950，AH01963和AH02029四组样品，在对照组(0h)样品中，都检测到99号位的N有较高比例脱酰胺修饰，而实验组(pH9-48h)中N99号位点只检测到脱酰胺的肽，未检测到没有发生修饰的肽。证明N99位点存在很高的脱酰胺修饰可能性。
表9.成药性检测分析:人源化抗人PD-L1单克隆抗体氧化加压试验后质谱检测
Figure GDA0003747330650000213
Figure GDA0003747330650000221
表10.成药性检测分析:人源化抗人PD-L1单克隆抗体脱酰胺加压试验后质谱检测
Figure GDA0003747330650000222
Figure GDA0003747330650000231
ELISA验证结果显示(图7)，AH01946，AH01950，AH01963和AH02029抗体分子在氧化加压处理和脱酰胺处理条件下，仍然保持较好的抗原结合能力。
去酰胺化加压后处理的抗体样品采用cIEF来判断脱酰胺化加压后抗体分子的电荷变化情况(表11和图8)。结果显示在脱酰胺化加压的极端条件下抗体分子发生了电荷变化，酸峰成分明显增加。结合质谱检测的结果，判断抗体分子中氨基酸脱酰胺的比例在增加。但是这种变化没有对抗体分子与抗原的识别产生重大影响，处理前后抗体与抗原识别的能力没有发生变化，ELISA曲线吻合度非常高。
表11.成药性检测分析:人源化抗人PD-L1单克隆抗体脱酰胺加压试验后cIEF检测
Figure GDA0003747330650000232
Figure GDA0003747330650000241
实施例6：人源化抗人PD-L1单克隆抗体的交叉识别能力检测
通过上述比较分析，人源化抗人PD-L1单克隆抗体AH01946、AH02029被选中制备稳定表达细胞系，并进一步确认抗体分子对人和猴来源的PD-L1的识别能力，作为在动物体内药物代谢和毒性检测实验的依据。
表达人或者猴PD-L1的CHO细胞和阴性对照的母细胞，用PBS清洗3次。在96孔板中加入2.5×105个检测细胞和起始浓度300nM，3倍梯度稀释的纯化抗体100ul，4℃孵育1小时。随后用PBS清洗细胞3次，添加100μl iFluor标记的山羊抗人IgG，4℃孵育45分钟。最后用PBS清洗细胞3次，用FACS BD Calibur读取信号。如图9A，AH01946、AH02029抗体和人PD-L1细胞系都表现出强结合能力，呈现与Tecentriq对照抗体相当的结合水平，EC50约为0.5nM(表12)。
表12.抗体对细胞表面人PD-L1结合的FACS检验
Tecentriq AH01946 AH02929 Human IgG
Bottom 238.1 216.7 214.7 166
Top 1400 843.9 787.5 190.7
LogEC<sub>50</sub> -0.273 -0.3002 -0.3205 ～-1.824
HillSlope 1.329 1.496 2.078 ～92.15
EC<sub>50</sub>(nM) 0.5334 0.501 0.4781 ～0.01498
Span 1162 627.2 572.7 24.67
同时，利用猴PD-L1过表达的CHO细胞检验抗体与猴PD-L1的交叉识别结合。如图9B，AH01946、AH02029抗体和猴PD-L1细胞系都表现出强结合能力，EC50约为3.3nM。
表13.抗体对细胞表面猴PD-L1结合的FACS检验
AH01946 AH02929 Human IgG
Bottom 63.39 166.9 215.7
Top 1991 1645 247.7
LogEC<sub>50</sub> 0.5178 0.5319 ～1.286
HillSlope 0.6424 1.114 ～55.86
EC<sub>50</sub>(nM) 3.295 3.403 ～19.32
Span 1928 1478 32
实施例7：人源化抗人PD-L1单克隆抗体对PD-1/PD-L1相互作用的影响
将ELISA板(Nunc)用100μl/孔的PBS中0.5μg/ml的重组人PD-1蛋白在4℃下包被过夜。用PBS-T(0.05％吐温)洗涤板，并将其用200μl/孔的含1％BSA的PBST在37℃封闭0.5小时。随后弃去封闭液，首个测试孔加入10μg/ml待测纯化抗体50μl，并按照3倍梯度稀释，共计11个测试浓度梯度。然后每孔添加50μl生物素标记的PD-L1-Fc(浓度为0.3μg/ml)，在37℃孵育1小时。将板用PBST洗涤3次，并用100μl/孔的抗生物素蛋白链霉亲和素-HRP(SA-HRP，GenScript)37℃孵育10分钟。最后将板用PBST洗涤5次，然后加入TMB显色液(GenScript)并在室温下在黑暗中孵育15分钟。通过加入50μl的1M HCl终止液(Sigma)终止反应。使用酶标仪在450nm下读板。如图10A，Tecentriq抗体表现的IC50＝129.6ng/ml；AH01946、AH02029抗体对PD-L1和PD-1的结合没有出现阻断效果，反而具有促进作用，其中AH01946抗体的EC50为21.89ng/ml,AH02029抗体的EC50为17.05ng/ml。
表14.抗体对人PD-1/PD-L1结合的ELISA检验
Tecentriq AH01946 AH02029 Human IgG
Bottom 0.09648 1.798 1.9 1.749
Top 2.154 3.005 3.004 1.935
LogEC<sub>50</sub> 2.113 1.34 1.232 ～3.459
HillSlope -1.991 1.219 1.356 ～-23.09
EC<sub>50</sub>(ng/ml) 129.6 21.89 17.05 ～2877
Span 2.058 1.207 1.104 0.1863
FACS检测中，表达人PD-1的CHO细胞和阴性对照的母细胞，用PBS清洗3次。在96孔板中加入2.5×105个检测细胞和起始浓度300nM，3倍梯度稀释的纯化抗体50ul，每孔添加50μl生物素标记的PD-L1-Fc(浓度为1.5μg/ml)，4℃孵育1小时。随后用PBS清洗细胞3次，添加100μl iFluor647标记的链霉亲和素(1μg/ml)，4℃孵育45分钟。最后用PBS清洗细胞3次，用FACS BD Calibur读取信号。结果如图10所示，在细胞水平，Tecentriq抗体表现的IC5026.86nM；AH01946、AH02029抗体对PD-L1和PD-1的结合具有促进作用，其中AH01946抗体的EC50为28.11nM,AH02029抗体的EC50为38.67nM。
表15.抗体对人PD-1/PD-L1结合的FACS检验
Tecentriq AH01946 AH02929 Human IgG
Bottom -437.1 7232 7418 5878
Top 6879 19350 24811 ～1.155e+006
LogEC<sub>50</sub> 1.429 1.449 1.587 ～-17.52
HillSlope -1.35 2.335 1.786 ～-0.1871
EC<sub>50</sub>(nM) 26.86 28.11 38.67 ～0.0
Span 7316 12118 17393 ～1.149e+006
这两株抗体没有对PD1-PD-L1的结合出现如同Tecentriq的抑制效果，反而随着浓度增加出现促进PD1-PDL1的结合，ELISA和FACS都验证了这一现象。这样的抗体与PD-L1结合后似乎锁死了一种失能状态的PD-L1，易于结合PD1但是不激活，同时占据结合位置，阻断了抑制效应。
实施例8：人源化抗人PD-L1单克隆抗体与Tecentriq联用的细胞活性功能验证
从人体外周血中分离单核细胞(PBMC)，然后使用pan monocyte分离试剂盒和CD4+T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotech Inc.)分别去提取单核细胞(Monocyte)和CD4+T细胞。将单核细胞分化成树突细胞(Dendritic Cells)并用LPS处理成熟。把成熟的DC铺在96孔板中，分别单独加入浓度为0.03μg/ml的Tecentriq、AH01946、AH01950、AH01963以及AH02029，或者Tecentriq与相应抗体的混合组分，孵育72小时后，使用Cisbio的HTRF原理的IL-2和IFN-gamma试剂盒去检测混合细胞上清中IL-2和IFN-gamma的含量。
图11A和B显示，与单独Tecentriq或单独抗PD-L1抗体相比，Tecentriq分别与AH01946、AH01950、AH01963以及AH02029联合刺激细胞IL-2以及IFN-gamma分泌量增加，具有一定的协同效应，特别是Tecentriq与AH02029联用，协同刺激细胞效果较好。
采用上述实验方法分别固定Tecentriq浓度0.01μg/ml，接着加入不同浓度的抗PD-L1的抗体克隆AH02029，以单独加入不同浓度Tecentriq以及AH02029的孔作为对照。对细胞活性功能进行验证，检测混合细胞上清中IL-2及IFN-gamma的含量。
如图12A和B所示，固定Tecentriq在低浓度，不足以激活MLR中细胞因子释放，使用抗PD-L1抗体AH02029能辅助完成细胞因子IL-2及IFN-gamma激发释放，表16和表17中0.01μg/ml Tecentriq与AH02029联合刺激IL-2、IFN-gamma的EC50分别为0.013μg/ml、0.0045μg/ml，且都能辅助0.01μg/ml Tecentriq分泌IL-2、IFN-gamma量由处于Bottom值提高到Top值。
表16.AH02029与Tecentriq联用刺激细胞分泌IL-2分析
Figure GDA0003747330650000261
表17.AH02029与Tecentriq联用刺激细胞分泌IFN-γ分析
Figure GDA0003747330650000262
实施例9：hPD1/PD-L1双靶点人源化小鼠MC38-hPD-L1结肠癌动物模型进行的PD-L1抗体、PD-L1抗体协同PD1抗体或协同PD-L1抗体的药效实验
将MC38-hPD-L1细胞接种于hPD1/PD-L1双靶点人源化小鼠的右侧皮下，待肿瘤生长到大约60-90mm3时按肿瘤体积挑选并随机分组，每组6只，共7组，分别为：hIgG1mg/kg组、AH01946 10mg/kg组、53C1F3D4(参见中国专利CN108239149A中方法制备)10mg/kg组、53C1F3D4 10mg/kg+AH01946 10mg/kg组、Tecentriq 10mg/kg+AH01946 10mg/kg组、Keytruda(默沙东；批号：R030484)5mg/kg组、Keytruda 5mg/kg+AH01946 10mg/kg组。小鼠经腹腔注射，每4天给药1次，连续给药4次，末次给药7天后结束实验。给药和观察期间每周测量2次小鼠体重和肿瘤体积，并记录测量值，计算肿瘤体积生长抑制率。
在实验过程中，所有动物在给药期间活动和进食状态良好，对各受试品耐受良好。如图13所示，在实验终点，hIgG组、AH01946组、53C1F3D4组、53C1F3D4+AH01946组、Tecentriq+AH01946组、Keytruda组、Keytruda+AH01946组肿瘤体积生长抑制率TGITV分别为23.1％、39.6％、86.8％、53.4％、72.5％和84.2％。
单次给予AH01946 10mg/kg或53C1F3D4 10mg/kg不具有显著的药效。但AH0194610mg/kg可以协同53C1F3D4和Tecentriq的药效，且AH01946与53C1F3D4联合用药和AH01946与Keytruda联合用药均得到对hPD1/PD-L1双靶点人源化小鼠MC38-hPD-L1结肠癌动物模型显著的有效性(p<0.001)。
实施例10：PD1/PD-L1双靶点人源化小鼠MC38-hPD-L1结肠癌动物模型进行的低剂量PD-L1抗体协同PD1抗体和PD-L1抗体的药效实验
将MC38-hPD-L1细胞接种于hPD1/PD-L1双靶点人源化小鼠的右侧皮下，待肿瘤生长到大约60-90mm3时按肿瘤体积挑选并随机分组，每组6只，共6组，分别为：hIgG 1mg/kg组、Keytruda 1mg/kg组、Keytruda 1mg/kg+AH01946 1mg/kg组、Keytruda 1mg/kg+AH0194610mg/kg组、Tecentriq10mg/kg组、Tecentriq10mg/kg+AH01946 1mg/kg组。小鼠经腹腔注射，每4天给药1次，连续给药4次，末次给药7天后结束实验。给药和观察期间每周测量2次小鼠体重和肿瘤体积，并记录测量值，计算肿瘤体积生长抑制率。
在实验过程中，所有动物在给药期间活动和进食状态良好，对各受试品耐受良好。如图14所示，在实验终点，hIgG组、Keytruda组、Keytruda+AH01946 1mg/kg组、Keytruda+AH01946 10mg/kg组、Tecentriq组、Tecentriq+AH01946 1mg/kg组肿瘤体积生长抑制率TGITV分别为8.0％、5.47％、60.2％、79.1％和82.5％。
单次给予Keytruda 1mg/kg或Keytruda 1mg/kg+AH01946 1mg/kg均不具有显著的药效。但AH01946 10mg/kg可以协同Keytruda1 mg/kg的药效，对hPD1/PD-L1双靶点人源化小鼠MC38-hPD-L1结肠癌动物模型具有一定的有效性(p＝0.07)。
序列表
<110> 南京金斯瑞生物科技有限公司
<120> 人源化抗人PD-L1单克隆抗体及其制备方法和用途
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 115
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 1
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Thr Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Phe Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Met Thr Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Ser Leu Phe Ala Ser Trp Gly His Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala
115
<210> 2
<211> 111
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 2
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr
20 25 30
Gly Asp Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 3
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Thr Trp His Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Ser Leu Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr
20 25 30
Gly Asp Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 5
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Thr Trp His Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Met Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Ser Leu Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr
20 25 30
Gly Asp Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 7
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Thr Trp His Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Phe Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Ser Leu Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr
20 25 30
Gly Asp Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser
85 90 95
Asn Glu Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 9
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Thr Trp His Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Ser Leu Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Thr Trp His Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Ser Leu Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 11
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Thr Trp His Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Ser Leu Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Thr Trp His Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Met Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Ser Leu Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Thr Trp His Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Ser Leu Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Thr Trp His Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Ser Leu Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 15
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Thr Trp His Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Ser Leu Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Thr Trp His Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Ser Leu Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 17
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr
20 25 30
Gly Asp Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 18
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr
20 25 30
Gly Asp Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 19
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr
20 25 30
Gly Asp Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 20
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr
20 25 30
Gly Asp Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 21
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr
20 25 30
Gly Asp Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 22
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr
20 25 30
Gly Asp Ser Phe Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 23
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr
20 25 30
Gly Asp Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 24
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Tyr
20 25 30
Gly Asp Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110

Claims (16)

1.一种人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示以及所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
2.一种人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示以及所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。
3.如权利要求1或2所述的人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段与PD-L1之间的解离常数KD小于3nM。
4.分离的多核苷酸，其编码如权利要求1-3中任一项所述的人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段。
5.如权利要求4所述的多核苷酸，其包含编码所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段的重链可变区的重链编码序列，和编码所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段的轻链可变区的轻链编码序列。
6.表达载体，其包含如权利要求4或5所述的多核苷酸。
7.宿主细胞，其包含如权利要求6所述的表达载体。
8.如权利要求1-3中任一项所述的人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段、如权利要求4或5所述的多核苷酸、如权利要求6所述的表达载体或如权利要求7所述的宿主细胞在制备抗肿瘤药物中的用途。
9.如权利要求8所述的用途，其中所述肿瘤选自结肠癌、胰腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、膀胱癌和肾癌。
10.抗肿瘤药物组合物，其包含有效量的如权利要求1-3中任一项所述的人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段，和药学上可接受的载体。
11.如权利要求10所述的药物组合物，其中所述肿瘤选自结肠癌、胰腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、膀胱癌和肾癌。
12.如权利要求1-3中任一项所述的人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段能与另一种PD-L1抗体联用协同刺激免疫反应。
13.如权利要求1-3中任一项所述的人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段，其中所述抗体或其功能片段能与atezolizumab联用协同刺激免疫反应。
14.如权利要求12或13所述的人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段，其中所述刺激免疫反应是激活T细胞分泌细胞因子。
15.如权利要求1-3中任一项所述的人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段，其中低剂量的所述抗体或其片段与低剂量的另一种PD-L1抗体或PD-1抗体联用协同抑制肿瘤生长。
16.制备如权利要求1-3中任一项所述的人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段的方法，包括：
(1)对鼠源抗体进行人源化，获得所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段的轻链和重链的可变区编码序列；以及
(2)用所述可变区编码序列进行重组抗体生产，获得所述人源化抗人PD-L1单克隆抗体或其功能片段。
CN201980075384.4A 2018-11-16 2019-11-15 人源化抗人pd-l1单克隆抗体及其制备方法和用途 Active CN113039207B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2018113669356 2018-11-16
CN201811366935 2018-11-16
PCT/CN2019/118799 WO2020098785A1 (zh) 2018-11-16 2019-11-15 人源化抗人pd-l1单克隆抗体及其制备方法和用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113039207A CN113039207A (zh) 2021-06-25
CN113039207B true CN113039207B (zh) 2022-10-28

Family

ID=70730658

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980075384.4A Active CN113039207B (zh) 2018-11-16 2019-11-15 人源化抗人pd-l1单克隆抗体及其制备方法和用途

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20220073618A1 (zh)
EP (1) EP3882269A4 (zh)
CN (1) CN113039207B (zh)
TW (1) TW202020159A (zh)
WO (1) WO2020098785A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114380913B (zh) * 2022-03-24 2022-06-21 上海济煜医药科技有限公司 一种全人源抗pd-l1抗体及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017220989A1 (en) * 2016-06-20 2017-12-28 Kymab Limited Anti-pd-l1 and il-2 cytokines
CN108239149A (zh) * 2016-12-25 2018-07-03 南京传奇生物科技有限公司 高亲和力、高特异性、多抗原识别表位的具有更高功能性的抗人pd-l1抗体
CN108752476A (zh) * 2016-03-04 2018-11-06 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 一种pdl-1抗体、其药物组合物及其用途

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201134488A (en) * 2010-03-11 2011-10-16 Ucb Pharma Sa PD-1 antibodies
JP7082055B2 (ja) * 2015-12-22 2022-06-07 ノバルティス アーゲー 抗癌治療における組み合わせ使用のためのメソテリンキメラ抗原受容体（ｃａｒ）およびｐｄ－ｌ１阻害剤に対する抗体
CN105968200B (zh) * 2016-05-20 2019-03-15 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 抗人pd-l1人源化单克隆抗体及其应用
JP7267921B2 (ja) * 2017-01-06 2023-05-02 クレシェンド・バイオロジックス・リミテッド プログラム細胞死（ｐｄ－１）に対するシングルドメイン抗体
WO2019129211A1 (en) * 2017-12-28 2019-07-04 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Antibodies and variants thereof against pd-l1

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108752476A (zh) * 2016-03-04 2018-11-06 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 一种pdl-1抗体、其药物组合物及其用途
WO2017220989A1 (en) * 2016-06-20 2017-12-28 Kymab Limited Anti-pd-l1 and il-2 cytokines
CN108239149A (zh) * 2016-12-25 2018-07-03 南京传奇生物科技有限公司 高亲和力、高特异性、多抗原识别表位的具有更高功能性的抗人pd-l1抗体

Also Published As

Publication number Publication date
EP3882269A1 (en) 2021-09-22
TW202020159A (zh) 2020-06-01
US20220073618A1 (en) 2022-03-10
CN113039207A (zh) 2021-06-25
WO2020098785A1 (zh) 2020-05-22
EP3882269A4 (en) 2022-10-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6927639B2 (ja) ヒトクローディン−１８．２を結合する抗体およびその使用
EP3341020B1 (en) Pd-l1 (&#34;programmed death-ligand 1&#34;) antibodies
JP2024023225A (ja) 抗体－サイトカイングラフト化タンパク質及び癌の治療における使用方法
JP2020521481A (ja) Ｆｌｔ３に特異的な抗体およびその使用
KR20180004277A (ko) Pdl-1 항체, 그 약학적 조성물 및 그 용도
BR112020022595A2 (pt) anticorpos específicos para gucy2c e usos dos mesmos
TW201039845A (en) Treatment with a humanized anti-EGFR igG1 antibody and irinotecan
US20220363754A1 (en) Anti-tigit antibodies and application thereof
US20210332137A1 (en) Combination therapy for cancer
WO2019076277A1 (zh) 抗pd-1抗体和抗lag-3抗体联合在制备治疗肿瘤的药物中的用途
CN113166248B (zh) 人源化抗人ox40单克隆抗体及其制备方法和用途
CN112513088B (zh) 抗ox40抗体、其抗原结合片段及其医药用途
MX2014007644A (es) Anticuerpos antagonistas del receptor de hormona de crecimiento humana y metodos para su uso.
KR20230144596A (ko) 항 cd112r 항체 및 그의 용도
CN113039207B (zh) 人源化抗人pd-l1单克隆抗体及其制备方法和用途
US20230030597A1 (en) Methods of treating cancer by the use of pd-1 axis inhibitors and anti-periostin antibodies
CN112513084B (zh) 人源化抗人ctla4单克隆抗体及其制备方法和用途
CN115515980A (zh) C19 c38双特异性抗体
CN114761434B (zh) Pd-1抗体及其制备方法与应用
CN114929741A (zh) 针对lif的抗体及其用途
CN116829591A (zh) 针对cd112r的抗体及其用途
CN116284406A (zh) 一种pd-1结合蛋白及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20210625

Assignee: Nanjing vigorous Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: NANJINGJINSIRUI SCIENCE & TECHNOLOGY BIOLOGY Corp.

Contract record no.: X2023990000155

Denomination of invention: Humanized anti-human PD-L1 monoclonal antibody and its preparation method and use

Granted publication date: 20221028

License type: Exclusive License

Record date: 20230116