MX2014007644A

MX2014007644A - Anticuerpos antagonistas del receptor de hormona de crecimiento humana y metodos para su uso.

Info

Publication number: MX2014007644A
Application number: MX2014007644A
Authority: MX
Inventors: Riggers Javier Fernando Chaparro; Sara Iva Siebel; Edward Derrick Pascua; Chia-Yang Lin
Original assignee: Rinat Neuroscience Corp
Priority date: 2011-12-22
Filing date: 2012-12-10
Publication date: 2014-09-26
Also published as: HK1204328A1; US9249224B2; AU2012356206A1; CA2859472A1; BR112014014824A2; IL233119A0; SG11201402828XA; CN104169301A; ZA201404735B; IN2014CN04652A; EP2794659A1; KR20140102710A; US20140356359A1; WO2013093707A1; RU2014123030A; JP2015502975A

Abstract

La presente invención proporciona anticuerpos antagonistas que se unen a los receptores de hormona de crecimiento (GHR); la invención se refiere además a métodos terapéuticos para el uso de estos anticuerpos para reducir los Niveles de IGF-1 y/o para el tratamiento y/o prevención de enfermedades asociadas con IGF-1 excesivo, incluyendo el tratamiento de la acromegalia, gigantismo, cáncer, nefropatía diabética, artritis e inflamación pulmonar.

Description

ANTICUERPOS ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR DE HORMONA DE CRECIMIENTO HUMANA Y MÉTODOS PARA SU USO CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos de longitud completa o porciones de unión de antigeno de los mismos, que antagonizan la actividad del receptor de hormona de crecimiento humano (GHR). Más específicamente, la invención se refiere a composiciones que comprenden anticuerpos de GHR antagonistas y métodos para utilizar estos anticuerpos como un medicamento. Los anticuerpos GHR antagonistas pueden utilizarse terapéuticamente a niveles IGF-1 inferiores en plasma y/o tejido, y pueden utilizarse en la prevención y/o tratamiento de cáncer, neuropatía diabética, artritis, inflamación pulmonar y trastornos de crecimiento, que incluye acromegalia y gigantismo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La hormona de crecimiento (somatotropina) (GH) es una proteína de 22 kDa que se sintetiza y se secreta por la pituitaria anterior. Kopchick et al., 2002, Endocrine Reviews, 23(5):623-646. Las funciones de la GH como un regulador endocrino central de crecimiento ambos actúan directamente en los tejidos y estimulando la liberación del factor-1 de crecimiento tipo insulina (IGF-) por el hígado y otros tejidos. Okada et al., 2001 , Trends in Molecular Medicine 7(3):126-132. A su vez, IGF-1 actúa en tejidos para estimular el crecimiento corporal.

La GH señala a través del receptor de hormona de crecimiento (GHR), una proteina transmembrana de paso simple sin actividad tirosina cinasa intrínseca. El receptor de hormona de crecimiento (GHR) es un receptor de citosina de clase 1. Waters et al., 2006, Journal of Molecular Endocrinology, 36, 1-7. La señalización de la GHR implica el papel de al menos tres trayectorias principales, STATs, MAPK, y PI3-cinasa/Akt. El entendimiento actual de la señalización de la GHR es que el GHR existe como un homo dímero constitutivo, con transducción de señal por la realineación inducida por ligando de las sub-unidades de receptor. Brown, R. J. et al., 2005, Nature Struct. Mol. Biol. 12:814-821. En la presente, el mecanismo por el cual la unión de la GH se convierte en el GHR predimerizado inactivo en su conformación de señalización activa es incierta. Yang et al., 2008, Mol. Endocrinol 22(4):978-988. La interacción de la GH con el GHR dimerizado se media por dos sitios de unión asimétricos en la GH, cada uno con afinidad distinta. Yang et al., 2008.

Los GHR se distribuyen ubicuamente. Aunque se identifica originalmente el tejido hepático, se sabe que están presentes en hígado, hueso, riñon, tejido adiposo, músculo, ojo, cerebro, y corazón, así como también tejido inmune como las células B, linfocitos, bazo, y timo. Los antagonistas de la GHR tal como Pegvisomant (SOMAVERT®), se han desarrollado para su uso como fármacos para tratar, por ejemplo, acromegalia, (Kopchick et al., 2002).

Los niveles anormalmente altos de la GH se han asociado con varios trastornos. Los dos trastornos clásicos los cuales se provocan directamente por altos niveles de la GH son acromegalia y gigantismo. Los cambios asociados con acromegalia incluyen engrasamiento del vello corporal, engrasamiento y oscurecimiento de la piel, agrandamiento e hiperactividad de las glándulas sebáceas y sudoríparas de tal manera que los pacientes se quejan frecuentemente de la transpiración excesiva y el olor corporal ofensivo, crecimiento excesivo de la mandíbula, proliferación cartilaginosa de la laringe provocando un engrasamiento de la voz, y el alargamiento de la lengua. Además, el exceso de la GH en estos pacientes es responsable de la proliferación de cartílago articular que puede experimentar necrosis y erosión y proliferación fibrosa endoneural que provoca neuropatías periféricas. El exceso de la GH también incrementa la reabsorción tubular de fosfato y conduce a hiperfosfatemia leve. Muchos de estos síntomas también se ven en pacientes con gigantismo.

Los tratamientos actuales para acromegalia y gigantismo típicamente tratan de disminuir los niveles de IGF-1 en plasma y/o tejido a través de ya sea la destrucción de la pituitaria o tratamiento con fármacos. El papel de IGF-1 en los trastornos mediados por la GH, tales como acromegalia y gigantismo es bien conocido. Melmed et al., 1994, Amer. J. ed. 97:468- El tratamiento actual para acromegalia y gigantismo incluye ablación de la pituitaria, tratamiento por radiación, mesilato de bromocriptino, análogos de somatostatina, y Pegvisomant. La ablación de la pituitaria es un procedimiento quirúrgico y, como cualquier procedimiento quirúrgico, se asocia con un riesgo significativo de complicaciones incluyendo la muerte. Existen riesgos asociados con el tratamiento por radiación de la pituitaria también. Además, la eficacia del tratamiento por radiación puede retrasarse durante varios años. Además, estas modalidades de tratamiento no son específicas contra la parte de la pituitaria que produce la GH y puede afectar adversamente tejido adyacente también. El mesilato de bromocriptina es un fármaco tipo dopamina que suprime la producción de la GH. Recientemente, la octreótida, un análogo de somatostatina de acción prolongada también se ha utilizado para tratar pacientes con acromegalia y gigantismo el cual es refractario a cirugía, radiación, y/o mesilato de bromocriptina. Los análogos de somatostatina inhiben la secreción de insulina y a largo plazo y se asocian con un riesgo incrementado de resistencia a la insulina, la secreción de insulina alterada, y diabetes. Baldelli et al., 2003, Clin. Endocrinol. (Oxf). 59(4):492-499. Pegvisomant es un antagonista de la GH que comprende un análogo de la GH humano PEGilado producido recombinantemente. El tratamiento con pegvisomant implica actualmente dosificación diaria subcutáneamente.

Aunque los anticuerpos de la GHR anti-humano se han descrito, ha sido difícil identificar los anticuerpos monoclonales que específicamente se unen a ambos de la GHR de primate humano y no humano, que son de alta afinidad y tienen alta especificidad, y tienen una actividad antagonista potente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un anticuerpo antagonista de alta afinidad para el GHR humano que también se une específicamente a la GHR de primate no humano haría un agente terapéutico superior. La unión de alta afinidad acoplada con la unión a la GHR de mono cynomolgus resulta en una terapia con una frecuencia de dosificación reducida comparada con pegvisomant sin efecto en la secreción de insulina la cual puede utilizar ambas para la evaluación preclínica de seguridad, actividad, y/o perfil farmacocinético de estos dominios de enlace en primates y, en la forma idéntica, como fármacos en humanos. Esta invención se refiere a anticuerpos antagonistas que interactúan selectivamente con, e inhiben la función de la GHR humano, y también específicamente se unen al GHR de mono cynomolgus.

En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo antagonista aislado el cual interactúa con el GHR y, cuando se administra a un individuo, reduce los niveles de IGF-1 en plasma y/o tejido del individuo. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo humano, humanizado, o quimérico.

En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo antagonista de la GHR aislado que se une específicamente a la GHR humana y de mono cynomolgus y, cuando se administra a un sujeto, reduce un nivel de IGF-1 en la sangre del sujeto.

En algunas modalidades, el anticuerpo antagonista de la GHR puede comprender una región de unión de antígeno que compite con el anticuerpo monoclonal de SS1 para unirse a la GHR humana. En algunas modalidades, el anticuerpo antagonista de la GHR puede reconocer un epítope que es el mismo como o se traslapa con el epítope en el GHR humano reconocido por el anticuerpo monoclonal de SS1. En algunas modalidades, el anticuerpo antagonista de la GHR puede unirse a la GHR humana con una disociación de equilibrio constante o menos de alrededor de 10 nM. En algunas modalidades, el anticuerpo puede unirse a la GHR humana con una constante disociación de equilibrio de menos de alrededor de 250 nM, menos de alrededor de 100 nM, o menos de alrededor de 10 nM.

En algunas modalidades, el anticuerpo antagonista de la GHR puede comprender una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera.

En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo antagonista de la GHR aislado que se une específicamente a la GHR y comprende una región variable de cadena pesada (VH) complementaria que determina una región (CDR1) que comprende la Secuencia de aminoácidoss de SEQ ID NO: 1 , 15 0 16, una CDR2 de VH que comprende la Secuencia de aminoácidoss de SEQ ID NO: 1 4 ó 115, una CDR3 de VH que comprende la Secuencia de aminoácidoss de SEQ ID NO: 118, una región variable de cadena ligera CDR1 (VL) que comprende la Secuencia de aminoácidoss de SEQ ID NO: 99, una CDR2 de VL que comprende la Secuencia de aminoácidoss de SEQ ID NO: 5, y una CDR3 de VL que comprende la Secuencia de aminoácidoss de SEQ ID NO: 106.

En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo antagonista de la GHR aislado que se une específicamente al receptor de hormona de crecimiento (GHR) y comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una VH que determina complmentariamente una región (CDR1), una CDR2 de VH, y una CDR3 de VH de la secuencia de VH de SEQ ID NO: 8; y una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR1 de VL, una CDR2 de VL, y una CDR3 de VL.

En algunas modalidades, la VL puede comprender una CDR1 , una CDR2 de VL, y una CDR3 de VL de la secuencia de VL de SEQ ID NO. 7.

En algunas modalidades, el anticuerpo puede comprender una CDR1 de VH que comprende la Secuencia de aminoácidoss de SEQ ID NO: 1 , 15 0 16. una CDR2 de VH que comprende la Secuencia de aminoácidoss de SEQ ID NO: 2 ó 17, una CDR3 de VH que comprende la Secuencia de aminoácidoss de SEQ ID NO: 3, una CDR1 de VL que comprende la Secuencia de aminoácidoss de SEQ ID NO: 4, una CDR2 de VL que comprende la Secuencia de aminoácidoss de SEQ ID NO: 5, y una CDR3 de VL que comprende la Secuencia de aminoácidoss de SEQ ID NO: 6.

En algunas modalidades, el anticuerpo puede comprender una VH que comprende la Secuencia de aminoácidoss de SEQ ID NO: 8 o una variante de la misma con una o varias sustituciones de aminoácidos conservadoras en residuos que no se encuentran dentro de una CDR, y una VL que comprende la Secuencia de aminoácidoss de SEQ ID NO: 7 o una variante de la misma con una o varias sustituciones de aminoácidos en aminoácidos que no se encuentran dentro de una CDR.

En algunas modalidades, el anticuerpo además puede comprender una región constante inmunológicamente inerte. En algunas modalidades, el anticuerpo puede tener un isotipo que se selecciona del grupo que consiste de lgG2, lgG2Aa , lgG4, \gG4Ab< lgG4ac, lgG4 S228P, \gG4ííb S228P e lgG4¿c S228P. En algunas modalidades, la región constante puede ser Fe aglicosilado.

En algunas modalidades, el anticuerpo puede comprender una cadena pesada que comprende la Secuencia de aminoácidoss de SEQ ID NO: 134 ó 133, y una cadena ligera que comprende la Secuencia de aminoácidoss de SEQ ID NO: 135.

La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos antagonistas de la GHR descritos en la presente.

La invención también proporciona líneas celulares que producen recombinantemente cualquiera de los anticuerpos antagonistas de la GHR descritos en la presente.

La invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los anticuerpos antagonistas de la GHR descritos en la presente. La invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera de cualquiera de los anticuerpos antagonistas de la GHR descritos en la presente.

La invención también proporciona kits que comprenden una cadena efectiva de cualquiera de los anticuerpos antagonistas de la GHR descritos en la presente.

También se proporcionan métodos para identificar un anticuerpo que se une específicamente a la GHR de humano y de mono cynomolgus. En algunas modalidades, el método comprende: poner en contacto un anticuerpo que se une específicamente a la GHR humana con un polipéptido que comprende la Secuencia de aminoácidoss de SEQ ID NO: 145, y determina la unión del anticuerpo al polipéptido. En algunas modalidades, el método además puede comprender seleccionar un anticuerpo que se une específicamente a la Secuencia de aminoácidoss de SEQ ID NO: 145. En algunas modalidades, la determinación de la unión puede llevarse a cabo utilizando, por ejemplo, una ELISA, un biosensor, o una columna de afinidad.

También se proporcionan métodos para reducir un nivel de factor-1 de crecimiento tipo insulina (IGF-1) en sangre de un individuo en necesidad del mismo, que comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de los anticuerpos antagonistas de la GHR descritos en la presente. También se proporcionan anticuerpos antagonistas de la GHR para su uso en reducir un nivel de IGF-1 en sangre de un individuo en necesidad del mismo. En algunas modalidades, el nivel de IGF-1 se reduce al menos alrededor de 40% comparado con el nivel de IGF-1 antes de la administración. En algunas modalidades, el nivel de IGF-1 se reduce al menos alrededor de 60% comparado con un nivel de IGF-1 antes de la administración.

En algunas modalidades, el anticuerpo antagonista de la GHR puede administrarse parenteralmente.

También se proporcionan métodos para tratar una enfermedad asociada con la expresión de IGF-1 excesiva en un individuo que comprende administrar al sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva de cualquiera de los anticuerpos antagonistas de la GHR descritos en la presente. También se proporcionan anticuerpos antagonistas de la GHR para uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad asociada con IGF-1 excesivo. En algunas modalidades, la enfermedad es acromegalia. En algunas modalidades, la enfermedad es gigantismo. En algunas modalidades, la enfermedad es nefropatía diabética. En algunas modalidades, la enfermedad es artritis. En algunas modalidades, la enfermedad es inflamación pulmonar.

En algunas modalidades, la enfermedad es cáncer. En algunas modalidades, el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer de colon, cáncer gástrico, glioblastoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de riñon, cáncer oral, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer de piel, leucemia, linfoma, y mieloma múltiple. El cáncer de piel puede ser, por ejemplo, melanoma.

En algunas modalidades, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento o avance tumoral en un individuo que tiene un tumor, que comprende administrar al sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva de cualquiera de los anticuerpos antagonistas de la GHR descritos en la presente. También se proporcionan anticuerpos antagonistas de la GHR para uso en la inhibición de crecimiento o avance tumoral en un individuo que tiene un tumor.

En algunas modalidades, la invención proporciona un método de inhibición de metástasis de células cancerígenas en un individuo, que comprende administrar al sujeto en necesidad del mismo una cantidad efectiva de cualquiera de los anticuerpos antagonistas de la GHR descritos en la presente. También se proporcionan anticuerpos antagonistas de la GHR para uso en inducir la regresión tumoral.

En algunas modalidades, la invención proporciona un método para inducir la regresión tumoral en un individuo que tiene un tumor, que comprende administrar al sujeto en necesidad del mismo cualquiera de los anticuerpos antagonistas de la GHR descritos en la presente. También se proporcionan anticuerpos antagonistas de la GHR para su uso en la inducción de regresión tumoral.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos, péptidos, y aptámeros que antagonizan la función de la GHR extracelular que incluye su interacción con la GH. Más específicamente, la invención se refiere a métodos para preparar anticuerpos de la GHR antagonistas, composiciones que comprenden estos anticuerpos, y métodos para utilizar estos anticuerpos como un medicamento. Los anticuerpos de la GHR antagonistas pueden utilizarse para disminuir los niveles de IGF-1 de plasma, y pueden utilizarse en la prevención y/o tratamiento de trastornos relacionados con la GH, que incluyen, por ejemplo, gigantismo, acromegalia, nefropatía diabética, artritis, inflamación pulmonar, y ciertos cánceres.

Técnicas Generales La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, las cuales se encuentran dentro de la experiencia del arte. Tales técnicas se explican completamente en la literatura, tales como, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Célula Biology. A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Célula Culture (R.l. Freshney, ed., 1987); Introduction to Célula y Tissue Culture (J.P. Mather y P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Célula y Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, y D.G. Newell, eds., 1993- 1998) J. Wiley y Sons; Métodos in Enzymology (Academic Press, Inc.); Hybook of Experimental Immunology (D.M. Weir y C.C. BlackweII, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller y M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullís et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley y Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway y P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow y D. Lañe (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The antibodies (M. Zanetti y J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).

Definiciones Los siguientes términos, a menos que se indique de otra manera, debe entenderse que tienen los siguientes significados: El término "molécula aislada" (en donde la molécula por ejemplo es un polipéptido, un polinucleótido, o un anticuerpo) es una molécula que por virtud de su origen o fuente de derivación (1 ) no se asocia con componentes asociados naturalmente que acompañan en su estado nativo, (2) se encuentra sustancialmente libre de otras moléculas de las mismas especies (3) se expresa por una célula de unas especies diferentes, o (4) no se presenta en la naturaleza. Por lo tanto, una molécula que se encuentra químicamente sintetizada, o expresada en un sistema celular diferente de la célula desde la cual se origina naturalmente, será "aislada" de sus componentes asociados naturalmente. Una molécula también puede encontrarse sustancialmente libre de componentes asociados naturalmente por aislamiento, utilizando técnicas de purificación bien conocidas en el arte. La pureza u homogeneidad de la molécula puede someterse a ensayo por varios medios bien conocidos en el arte. Por ejemplo, la pureza de una muestra de polipéptido puede someterse a ensayo utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción del gel para visualizar el polipéptido que utiliza las técnicas bien conocidas en el arte. Para ciertos propósitos, la mayor resolución puede proporcionarse al utilizar HPLC u otro medio bien conocido en el arte para la purificación.

Un "anticuerpo" es una molécula de inmunoglobulina capaz de un unirse específicamente a un objetivo, tal como carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno, ubicado en la región variable de la molécula de immunoglobulina. Como se utiliza en la presente, el término abarca no solamente los anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también, a menos que se especifique lo contrario, cualquier porción de unión de antígeno del mismo que compita con el anticuerpo intacto para la unión específica, a menos que se especifique lo contrario, las proteínas de fusión que comprenden una porción de unión de antígeno, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de ¡mmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antigeno. Las porciones de unión de antígeno incluyen, por ejemplo sin limitación, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, anticuerpos de dominio (dAbs, por ejemplo, anticuerpos de tiburón y camélidos), fragmentos que incluyen regiones determinantes complementarias (las CDR), anticuerpos de fragmento variable de cadena simple (ScFv), maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv, y polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión de antígeno específico al polipéptido. Un anticuerpo incluye un anticuerpo de cualquier clase tal como IgG, IgA, o IgM (o subclase de los mismos), y el anticuerpo no necesita ser de cualquier clase particular. Dependiendo de la Secuencia de aminoácidoss de anticuerpo de la región constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, y varias de éstas pueden ser divididas adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG^ lgG2l lgG3, lgG4, IgA! e lgA2. Las regiones constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gama, y mu, respectivamente. Las estructuras de subunidad y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas se conocen bien.

Una "región variable" de un anticuerpo se refiere a la región variable del anticuerpo de cadena ligera o la región variable del anticuerpo de cadena pesada, ya sea solo o en combinación. Como se conoce en el arte, cada una de las regiones variables de la cadena pesada y ligera consiste de cuatro regiones de estructura (FR) conectadas por tres regiones de determinación complementaria (CDR) también conocidas como regiones hipervariables, y contribuyen a la formación del sitio de unión de antígeno de anticuerpos. Si se desean variantes de una región variable objeto, particularmente con sustitución en residuos de aminoácidos fuera de una región CDR (es decir, en la región de estructura), la sustitución de aminoácidos apropiada, de preferencia, la sustitución de aminoácidos conservadora, puede identificarse al comparar la región variable objeto con las regiones variables de otros anticuerpos que contienen secuencias de la CDR1 y CDR2 en la misma clase canónica como la región variable objeto (Chothia y Lesk, J Mol Biol 196(4). 901-917, 1987).

Como se conoce en el arte, una "región constante" de un anticuerpo se refiere a la región constante del anticuerpo de cadena ligera o la región constante del anticuerpo de cadena pesada, ya sea sola o en combinación.

Una "región de determinación complementaria" o "CDR" de un dominio variable son los residuos de aminoácidos dentro de la región variable que se identifican de acuerdo con las definiciones de Kabat, Chothia, la acumulación de ambas de las definiciones de Kabat, Chothia, extendidas, AbM, de contacto, y/or conformacional o cualquier método de Determinación de la CDR bien conocido en el arte. Las CDR de anticuerpo pueden identificarse como regiones hipervariables definidas originalmente por Kabat et al. Véase, por ejemplo, Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C. Las posiciones de las CDR también pueden identificarse como estructuras de bucle originalmente descritas por Chothia y otros. Véase, por ejemplo, Chothia et al., 1989, Nature 342.877-883. Otros procedimientos para la identificación de la CDR incluye la "definición de AbM", la cual es un compromiso entre Kabat y Chothia y se deriva utilizando el software de modelado de anticuerpo de AbM de Oxford Molecular (ahora Accelrys®), o la "definición de contacto" de las CDR basada en los contactos de antígeno observados, establecidos en MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 262:732-745. En otro procedimiento, referido en la presente como la "definición conformacional" de las CDR, las posiciones de las CDR pueden identificarse como los residuos que hacen contribuciones entálpicas a la unión de antigeno. Véase, por ejemplo, Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166. Aún otras definiciones de límite de la CDR pueden no seguir estrictamente uno de los procedimientos anteriores, aunque no obstante se traslapa con al menos una porción de las CDR de Kabat, aunque pueden acortarse o alargarse en luz de hallazgos de predicción o experimentales que los residuos particulares o grupos de residuos no impacten significativamente la unión de antígeno. Como se utiliza en la presente, una CDR puede denominarse como las CDR definidas por cualquier procedimiento conocido en el arte, que incluye combinaciones de procedimientos. Los métodos utilizados en la presente pueden utilizar las CDR definidas de acuerdo con cualquiera de estos procedimientos. Para cualquier modalidad dada que contiene más de una CDR, las CDR pueden definirse de acuerdo con cualquiera de las definiciones de Kabat, Chothia, extendidas, AbM, de contacto, y/o conformacionales.

El término "anticuerpo monoclonal" (Mab) se refiere a un anticuerpo que se deriva de una copia o clon simple, que incluye por ejemplo, cualquier clon eucariótico, procariótico o fago, y no el método por el cual se produce. De preferencia, un anticuerpo monoclonal de la invención existe en una población homogénea o sustancialmente homogénea.

Como se utiliza en la presente, el anticuerpo "humanizado" se refiere a formas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) que son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina, o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos de unión-antígeno) que contienen secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. De preferencia, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en la cuales los residuos de una CDR del receptor se remplazan por residuos de una CDR de las especies no humanas (anticuerpo donador) tal como un ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad, y capacidad deseadas.

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una Secuencia de aminoácidoss la cual corresponde a aquel de un anticuerpo producido por un humano y/o se ha elaborado utilizando cualquiera de las técnicas para elaborar anticuerpos humanos como se describe en la presente. Esta definición de un anticuerpo humano específicamente incluye un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión de antígeno no humano.

El término "anticuerpo quimérico" se pretende para denominar los anticuerpos en los cuales la secuencias de región variable se derivan de una especie y las secuencias de región constante se derivan de otra especie, tal como un anticuerpo en el cual las secuencias de región variable se derivan de un anticuerpo de ratón y las secuencias de región constante se derivan de un anticuerpo humano.

El término "epítope" se refiere a aquella porción de una molécula capaz de reconocerse y unirse por un anticuerpo en una o más de las regiones de unión de antígeno de anticuerpo. Los epítopes a menudo consisten de una agrupación de superficie de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y tienen características estructurales tridimensionales específicas, asi como características de carga específicas. En algunas modalidades, el epítope puede ser un epítope de proteína. Los epítopes de proteína pueden ser lineales o conformacionales. En un epítope lineal, todos los puntos de interacción entre la proteina y la molécula de interacción (tal como un anticuerpo) se presentan linealmente a lo largo de la Secuencia de aminoácidoss primaria de la proteína. Un "epítope no lineal" o "epítope conformacional" comprende polipéptidos no contiguos (o aminoácidos) dentro de la proteína antigénica a la cual se une un anticuerpo específico al epítope. El término "epítope antigénico" como se utiliza en la presente, se define como una porción de un antígeno al cual el anticuerpo puede unirse específicamente como se determina por cualquier método bien conocido en el arte, por ejemplo, por inmunoensayos convencionales. Una vez que un epítope deseado de un antigeno se determina, es posible generar anticuerpos para aquel epítope, por ejemplo, utilizando las técnicas descritas en la presente especificación. Alternativamente, durante el proceso de descubrimiento, la generación y caracterización de anticuerpos pueden elucidar información acerca de los epitopes deseables. A partir de esta información, es posible entonces seleccionar competitivamente los anticuerpos para unirse al mismo epítope. Un procedimiento para lograr esto es conducir los estudios de competencia y competencia cruzada para encontrar los anticuerpos que compiten en forma cruzada entre sí para unirse a la GHR, por ejemplo, los anticuerpos compiten para unirse al antígeno.

Como se utiliza en la presente, el término "GHR" se refiere a cualquier forma de la GHR y variantes del mismo que retienen al menos parte de la actividad de la GHR. A menos que se indique en forma diferente, tal como por referencia específica a la GHR humana, la GHR incluye todas las secuencias nativas de especies de mamíferos de la GHR, por ejemplo, humano, canino, felino, equino, y bovino. Una GHR ejemplar se encuentra como Número de Acceso Genbank AAA52555 (SEQ ID NO: 140).

Como se utiliza en la presente, un "anticuerpo antagonista de la GHR" se refiere a un anticuerpo que es capaz de inhibir la actividad biológica de la GHR y/o trayectorias corriente abajo mediadas por la señalización de la GHR. Un anticuerpo antagonista de la GHR abarca anticuerpos que bloquean, antagonizan, suprimen o reducen (a cualquier grado incluyendo significativamente) actividad biológica de la GHR, incluyendo trayectorias corriente abajo mediadas por la señalización de la GHR, tal como la interacción y/u obtención de la GH de una respuesta celular a GH. Para propósitos de la presente invención, se entenderá explícitamente que el término "anticuerpo antagonista de la GHR" abarca todos los términos identificados previamente, títulos y estados funcionales y características por lo que la GHR misma, una actividad biológica de la GHR (incluyendo pero no limitada a su habilidad para mediar cualquier aspecto de la expresión del factor 1 de crecimiento tipo insulina (IGF-1)), o las consecuencias de la actividad biológica, se nulifican sustancialmente, disminuyen, o se neutralizan en cualquier grado significativo. En algunas modalidades, un anticuerpo antagonista de la GHR se une a la GHR e impide la interacción con la GH. En algunas modalidades, un anticuerpo antagonista de la GHR se une a la GHR e impide la dimerización de la GHR. Ejemplos de anticuerpos antagonistas de la GHR se proporcionan en la presente.

Como se utiliza en la presente, el término "clínicamente significativo" significa al menos un 15% de reducción en los niveles de suero de IGF-1 en humanos o al menos un 15% de reducción en IGF-1 de suero total en ratones. Es claro que las mediciones en plasma o suero pueden servir como sustitutos para la medición de niveles en sangre.

Los términos "polipéptido", "oligopéptido", "péptido" y "protema" se utilizan intercambiablemente en la presente para denominar cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, de preferencia, relativamente cortas (por ejemplo, 10-100 aminoácidos). La cadena puede ser lineal o ramificada, puede comprender aminoácidos modificados, y/o puede interrumpirse por no aminoácidos. Los términos también abarcan una cadena de aminoácidos que se ha modificado naturalmente o por intervención; por ejemplo, formación de unión de disulfuro, gliclosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente marcador. También se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (que incluyen, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en el arte. Se entiende que los polipéptidos pueden presentarse como cadenas simples o cadenas asociadas.

Como se conoce en la técnica, "polinucleótido" o "ácidos nucleico" como se utiliza intercambiablemente en la presente, se refiere a cadenas de nucleótidos de cualquier longitud, e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxiribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificadas, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda incorporarse en una ADN or ARN polimerasa. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales nucleótidos metilados y sus análogos. Si está presente, la modificación para la estructura de nucleótido puede impartirse antes o después del ensamble de la cadena. La secuencia de nucleótidos puede interrumpirse por componentes no nucleótidos. Un polinucleótido puede ser modificado adicionalmente después de la polimerización, tal como por conjugación con un componente marcador. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "caps", sustitución de uno o más de los nucleótidos que aparecen naturalmente con un análogo, modificaciones de internucleótido tal como por ejemplo, aquellos con enlaces no cargados (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamiratos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellos que contienen porciones colgantes, tales como por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, poli-L-lisina, etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.), aquellos que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellos que contienen alquilantes, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfanuméricos, etc.), asi como formas no modificadas de los polinucleótidos. Además, cualquiera de los grupos hidroxilo presentes ordinariamente en los azúcares pueden remplazarse, por ejemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protectores estándar, o activados para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales, o pueden conjugarse para soportes sólidos. La OH 5' y 3' terminal puede fosforilarse o sustituirse con aminas porciones de grupo de limitación orgánica desde 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden derivarse a grupos protectores estándar. Los polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares de ribosa o desoxirribosa que se conocen generalmente en el arte, incluyendo, por ejemplo, 2'-0-metil-, 2'-0-alil, 2'-fluoro- o 2' azido-ribosa, análogos de azúcar carbocíclicos, azúcares alfa o beta anoméricas, azúcares epiméricas tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares piranosa, azúcares furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos nucleósidos abásicos tales como metil ribosida. Uno o más de los enlaces de fosfodiéster pueden remplazarse por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen, pero no se limitan a, modalidades en donde el fosfato se remplaza por P(0)S("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (0)NR2 ("amidato"), P(0)R, P(0)OR', CO o CH2 ("formacetal"), en el cual cada R o R' es independientemente H o alquilo sustituido o sin sustituir (1-20 C) que contiene opcionalmente un enlace éter (-0-), arilo, alquinilo, ciclocalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todos los enlaces en un polinucleótido necesitan ser idénticos. La descripción precedente aplica a todos los polinucleótidos denominados en la presente, incluyendo ARN y ADN.

Como se utiliza en la presente, un anticuerpo "interactúa con" de la GHR cuando la constantes de disociación de equilibrio es igual o menor que 20 nM, de preferencia menor que alrededor de 6 nM, de mayor preferencia menor que alrededor de 1 nM, de mayor preferencia menor que alrededor de 0.2 nM, como se mide por los métodos descritos en la presente en el Ejemplo 2.

Un anticuerpo que "se une de preferencia" o "se une específicamente" (utilizado intercambiablemente en la presente) a un epitope es un término bien entendido en el arte, y los métodos para determinar tal enlace específico o preferencial también son bien conocidos en el arte. Una molécula se dice que muestra un "enlace específico" o "enlace preferencial" si reacciona o se asocia más frecuentemente, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con una célula o sustancia particular que lo hace con células o sustancias alternativas. Una anticuerpo "se enlaza específicamente" o "se enlaza de preferencia" a un objetivo si se une con mayor afinidad, avidez, más rápidamente, y/o con mayor duración que lo que une a otras sustancias. Por ejemplo, un anticuerpo que específica o preferentemente se une a un epitope de la GHR es un anticuerpo que une este epitope con mayor afinidad, avidez, más rápidamente, y/o con mayor duración que lo que se enlaza a otros epítopes de la GHR o epítopes sin GHR. También se entiende al leer esta definición que, por ejemplo, un anticuerpo (o porción o epitope) que específica o preferentemente se une al primer objetivo puede o no unirse específica o preferiblemente a un segundo objetivo. Como tal, "enlace específico" o "enlace preferencial" no requieren necesariamente (aunque puede incluirse) unión exclusiva. Generalmente, aunque no necesariamente, se hace referencia a los medios de unión de unión preferencial.

Como se utiliza en la presente, "sustancialmente puro" se refiere al material el cual es al menos 50% puro (es decir, libre de contaminantes), de más preferencia, al menos 90% puro, de más preferencia, al menos 95% puro, aún de más preferencia, al menos 98% puro, y de mayor preferencia, al menos 99% puro.

Una "célula huésped" incluye una célula individual o cultivo de células que pueden ser o ha sido un receptor para los vectores para incorporación de insertos de polinucleótido. Las células huésped incluyen progenie de una célula huésped simple, y la progenie puede no necesariamente ser completamente idéntica (en morfología o complemento de ADN genómico) a la célula madre original debido a la mutación natural, accidental, o deliberada. Una célula huésped incluye células transfectadas in vivo con uno o más polinucleótidos de esta invención.

Como se conoce en el arte, el término "región de Fe" se utiliza para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina. La "región de Fe" puede ser una región de Fe de secuencia nativa o una región de Fe variante. Aunque los límites de la región de Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina puede variar, la región de Fe de cadena pesada de IgG humano se define usualmente para el estirado de un residuo de aminoácido en posición Cys226, o de Pro230, para el término carboxilo del mismo. La numeración de los residuos en la región de Fe es aquella del índice de EU como en Kabat. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991. La región de Fe de una inmunoglobulina generalmente comprende dos dominios constantes, CH2 y CH3. Como se conoce en la técnica, una región de Fe puede estar presente en forma de dímero o monomérica. Como se conoce en la técnica, una región de Fe puede estar presente en forma de dímero o monomérica.

Como se utiliza en el arte, el "receptor Fe" y "FcR" describen un receptor que se une a la región de Fe de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR preferido es uno que une un anticuerpo de IgG (un receptor gama) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcvRII, y FCYRIII, incluyendo variantes alélicas y formas alternativamente empalmadas de estos receptores. Los receptores FcyRIl incluyen FcyRIIA (un "receptor de activación") y FcyRIIB (un "receptor de inhibición"), los cuales tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos. Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, 1991 , Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34; y de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41. "FcR" también incluye el receptor neonatal, FcRn, el cual es responsable de la transferencia de los IgG maternos a los fetos (Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587; y Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249).

El término "compite", como se utiliza en la presente con respecto a un anticuerpo, significa que un primer anticuerpo, o una porción de unión de antígeno del mismo, se une a un epítope en una forma suficientemente similar a la unión de un segundo anticuerpo, o una porción de unión de antígeno del mismo, de tal manera que el resultado de la unión del primer anticuerpo con su epítope cognado se disminuye detectablemente en la presencia del segundo anticuerpo comparado con la unión del primer anticuerpo en la ausencia del segundo anticuerpo. La alternativa, en donde la unión del segundo anticuerpo a su epítope también disminuye detectablemente en la presencia del primer anticuerpo, puede aunque no necesita ser el caso. Es decir, un primer anticuerpo puede inhibir la unión de un segundo anticuerpo a su epítope sin que el segundo anticuerpo inhiba la unión del primer anticuerpo a su epítope respectivo. Sin embargo, en donde cada anticuerpo inhibe detectablemente la unión del otro anticuerpo con su epítope cognado o ligando, ya sea al mismo, mayor o menor grado, los anticuerpos se dice que "compiten en forma cruzada" entre sí para la unión de sus epítopes respectivos. Ambos anticuerpos compiten y que compiten en forma cruzada se abarcan por la the presente invención. Independientemente del mecanismo por el cual tal competencia o competencia cruzada ocurre (por ejemplo, experimento estérico, cambio conformacional, o la unión a un epítope común, o porción del mismo), el técnico con experiencia puede apreciar, basado en las enseñanzas proporcionadas en la presente, que tales anticuerpos de competencia y/o competencia cruzada se abarcan y pueden ser útiles para los métodos descritos en la presente.

Una "región de Fe funcional" posee al menos una función efectora de una región de Fe de secuencia nativa. Las "funciones efectoras" ejemplares incluyen unión C1q; citotoxicidad dependiente de complemento; unión de receptor Fe; citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo; fagocitosis; regulación hacia abajo de os receptores de superficie celular (por ejemplo receptor de célula B), etc. Tales funciones efectoras generalmente requieren la región de Fe para combinarse con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y pueden evaluarse utilizando diversos ensayos conocidos en el arte para evaluar tales funciones efectoras de anticuerpo.

Una "región de Fe de secuencia nativa" comprende una Secuencia de aminoácidoss idéntica a la Secuencia de aminoácidoss de una región de Fe encontrada en la naturaleza. Una "región de Fe variante" comprende una Secuencia de aminoácidoss que difiere de aquella de una región de Fe de secuencia nativa en virtud de al menos una modificación de aminoácidos, aún retiene al menos una función efectora de la región de Fe de secuencia nativa. De preferencia, la región de Fe variante tiene al menos una sustitución de aminoácidos comparada con una región de Fe de secuencia nativa o con la región de Fe de un polipéptido madre, por ejemplo de alrededor de uno a alrededor de diez sustituciones de aminoácidos, y de preferencia, de alrededor de uno a alrededor de cinco sustituciones de aminoácidos en una región de Fe de secuencia nativa o en la región de Fe del polipéptido madre. La región de Fe variante en la presente poseerá de preferencia al menos alrededor de 80% de identidad de secuencia con una región de Fe de secuencia nativa y/o con una región de Fe de un polipéptido madre, y de mayor preferencia, al menos alrededor de 90% de identidad de secuencia con la misma, de mayor preferencia, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 96%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98%, al menos alrededor de 99% de identidad de secuencia con la misma.

Como se utiliza en la presente, el "tratamiento" es un procedimiento para obtener resultados clínicos benéficos o deseados. Para propósitos de esta invención, los resultados clínicos benéficos o deseados incluyen, pero no se limitan a uno o más de lo siguiente: reducir la incidencia o el mejoramiento de niveles aberrantes de IGF-1 que resultan de la producción de GH excesiva, y reducir la incidencia o mejoramiento de uno o más síntomas de acromegalia, gigantismo, o cáncer. La producción excesiva de GH se provoca por, por ejemplo, adenomas de la pituitaria, u otros tumores pituitarios, que incluyen tumores del pulmón, páncreas, glándulas adrenales u otras partes del cerebro.

La "reducción de incidencia" significa cualquiera para reducir la severidad (que puede incluir reducir la necesidad de y/o cantidad de (por ejemplo, expuesto a) otros fármacos y/o terapias generalmente utilizadas para este padecimiento), reducir la duración, y/o reducir la frecuencia. Como se entiende por aquellos con experiencia en el arte, los individuos pueden variar en términos de su respuesta al tratamiento, y, como tal, por ejemplo, un "método para reducirla incidencia" refleja administrar el anticuerpo antagonista de alfa-toxina basado en una expectativa razonable de que tal administración pueden provocar probablemente tal reducción en la incidencia en el individuo particular.

"Mejoramiento" significa una disminución o mejora de uno o más síntomas cuando se comparan con no administrar un anticuerpo antagonista del GHR. "Mejoramiento" también incluye el acortamiento o reducción en duración de un síntoma.

Como se utiliza en la presente, una "dosis efectiva" o "cantidad efectiva" de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para efectuar cualquiera o más resultados benéficos o deseados. Para el uso profiláctico, los resultados benéficos o deseados incluyen eliminar o reducir el riesgo, disminuir la severidad, o retardar la aparición de la enfermedad, incluyendo síntomas bioquímicos, histológicos y/o conductuales de la enfermedad, sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. Para uso terapéutico, los resultados benéficos o deseados incluyen resultados clínicos tales como reducir los niveles de IGF-1 en suero o uno o más síntomas de acromegalia, gigantismo, o cáncer, disminución de la dosis de otros medicamentos requeridos para tratar la enfermedad, mejorar el efecto de otro medicamento, y/o retardar el avance de la enfermedad de los pacientes. Una dosis efectiva puede administrarse en una o más administraciones. Para propósitos de esta invención, una dosis de fármaco efectiva, compuesto, o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para lograr el tratamiento profiláctico o terapéutico directa o indirectamente. Como se entiende en el contexto clínico, una dosis efectiva de un fármaco, compuesto, o composición farmacéutica puede o no lograrse junto con otro fármaco, compuesto, o composición farmacéutica. Por lo tanto, una "dosis efectiva" puede considerarse en el contexto de administrar uno o más agentes terapéuticos, y un agente simple puede considerarse para determinarse en una cantidad efectiva si, junto con uno o más de otros agentes, puede estar o se logra un resultado deseable.

Un "individuo" o un "sujeto" es un mamífero, de mayor preferencia, un humano. Los mamíferos también incluyen pero no se limitan a animales de granja, animales para deportes, mascotas, primates, caballos, perros, gatos, ratones y ratas.

Como se utiliza en la presente, "vector" significa un constructo, el cual es capaz de suministrar y, de preferencia, expresar uno o más genes o secuencias de interés en una célula huésped. Ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores virales, vectores de expresión de ADN o ARN desnudos, vectores de plásmido, cósmido o fago, vectores de expresión de ADN o ARN asociados con agentes de condensación catiónica, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas, y ciertas células eucarióticas, tales como células productoras.

Como se utiliza en la presente, "la secuencia de control de expresión" significa una secuencia de ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico. Una secuencia de control de expresión puede ser un promotor, tal como un constitutivo o un promotor inducible, o un mejorador. La secuencia de control de expresión se enlaza operablemente a la secuencia de ácido nucleico que se transcribe.

Como se utiliza en la presente, "portador farmacéuticamente aceptable" o "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier material el cual, cuando se combina con un ingrediente activo, permite al ingrediente retener actividad biológica y no es reactivo con el sistema inmune del sujeto. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los portadores farmacéuticos estándar tales como solución salina regulada con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsión de aceite/agua, y diversos tipos de agentes de humectación. Los diluyentes preferidos para la administración en aerosol o parenteral son la solución salina regulada con fosfato (PBS) o solución salina normal (0.9%). Las composiciones que comprenden tales portadores se formulan por métodos convencionales bien conocidos (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; y Remington, The Science y Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000).

El término "kencendido". como se utiliza en la presente, se refiere a la constante de índice para asociación de un anticuerpo a un antígeno. Específicamente, las constantes de índice (kencendido y kapagado) y las constantes de disociación de equilibrio se miden utilizando fragmentos de longitud completa y/o de anticuerpo de Fab (es decir, univalente) y GHR.

El término "kapagado", como se utiliza en la presente, se refiere a la constante de índice para disociación de un anticuerpo a partir del complejo de anticuerpo/antígeno.

El término "KD", como se utiliza en la presente, se refiere a la constante de disociación de equilibrio de una interacción de anticuerpo-antígeno.

Con referencia a "alrededor" un valor o parámetro en la presente incluye (y describe) modalidades que se dirigen a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción con referencia a "alrededor de X" incluye la descripción de "X". Los márgenes numéricos son inclusivos de los números que definen el margen.

Se entiende que siempre que las modalidades se describen en la presente con el lenguaje "que comprende", las modalidades análogas de otro modo se describen en términos de "que consiste de" y/o "que consiste esencialmente de" también se proporcionan.

En donde los aspectos o modalidades de la invención se describen en términos de un grupo Markush u otra agrupación de alternativas, la presente invención abarca no sólo el grupo completo listado como un todo, sino que cada miembro del grupo individulmente y todos los subgrupos posibles del grupo principal, sino también el grupo principal ausente de uno o más de los miembros de grupo. La presente invención también contempla la exclusión explícita de uno o más de cualquiera de los miembros de grupo en la invención reclamada.

A menos que se defina de otra forma, todas las técnicas y términos científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por alguien de experiencia ordinaria en el arte al cual esta invención pertenece. En caso de conflicto, se controlará la presente especificación, que incluye definiciones,. A través de esta especificación y reivindicaciones, la palabra "comprende" o variaciones tales como "comprenden" o "que comprende" se entenderá para implicar la inclusión de enteros establecidos o grupos de enteros pero no la exclusión de cualquier otro grupo o grupo de enteros. A menos que se requiera de otro modo por el contexto, términos singulares incluirán pluralidades y términos plurales incluirán el singular. Cualesquier ejemplos, después del término "p.e." o "por ejemplo" no se pretende que sean exhaustivos o imitantes.

Métodos y materiales ejemplares se describen en la presente, aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente pueden también utilizarse en la práctica o ensayo de la presente invención. Los materiales, métodos, y ejemplos son ilustrativos solamente y no pretenden ser limitantes.

Métodos para prevenir o tratar trastornos asociados con IGF-1 excesivo En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar o prevenir al menos un síntoma de un trastorno asociado con IGF-1 excesivo en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un anticuerpo antagonista del GHR. En algunas modalidades, el trastorno es acromegalia. En otras modalidades, el trastorno es gigantismo. En otras modalidades, el trastorno es cáncer.

En algunas modalidades, los métodos pueden implicar identificar un individuo en riesgo de una enfermedad asociada con IGF-1 excesivo. Adicíonalmente, los métodos pueden incluir evaluar un individuo para factores de riesgo para una enfermedad asociada con IGF-1 excesivo, evaluando un individuo para síntomas de enfermedad asociada con IGF-1 excesivo, o diagnosticar al individuo con enfermedad asociada con IGF-1 excesivo. En ciertas modalidades, los métodos pueden implicar las etapas de implementación en las cuales la enfermedad es acromegalia, gigantismo, o cáncer.

Ventajosamente, la administración terapéutica del anticuerpo resulta en disminución de IGF-1 en sangre. De preferencia, el IGF-1 en sangre es al menos alrededor de 10% menor que antes de la administración. De mayor preferencia, IGF-1 en sangre es al menos alrededor de 15% menor que antes de la administración del anticuerpo. De mayor preferencia, IGF-1 en sangre es al menos alrededor de 20% menor que antes de la administración del anticuerpo. Aún de mayor preferencia, IGF-1 en sangre es al menos 30% menor que antes de la administración del anticuerpo. Ventajosamente, el IGF-1 en sangre es al menos 40% menor que antes de la administración del anticuerpo. Más ventajosamente, el IGF-1 en sangre es al menos 50% menor que antes de la administración del anticuerpo. De mayor preferencia, el IGF-1 en sangre es al menos 60% menor que antes de la administración el anticuerpo. De mayor preferencia, el IGF-1 en sangre es al menos 70% menor que antes de la administración del anticuerpo.

En algunas modalidades, administración terapéutica del anticuerpo antagonista del GHR resulta ventajosamente en incidencia reducida y/o mejoramiento de uno o más síntomas de acromegalia que incluyen, por ejemplo, sin limitación, los niveles de IGF-1 excesivos, sudor intenso, olor corporal ofensivo, engrosamiento de la piel, oscurecimiento de la piel, piel grasosa, pequeñas evaginaciones cutáneas (marcas en la piel), fatiga, debilidad muscular, engrasamiento de la voz debido al agrandamiento de las cuerdas bucales y los senos y/o proliferación cartilaginosa de la laringe, ronquidos severos, apnea del sueño, visión deteriorada, dolor de cabeza, lengua alargada, dolor de espalda, dolor en las articulaciones, movilidad limitada en las articulaciones, irregularidad del ciclo menstrual, disminución del deseo sexual, disfunción eréctil, agrandamiento de las manos, agrandamiento de los pies, rasgos faciales más grandes y ensanchadas, protuberancia de la mandíbula inferior, de modo que los dientes inferiores se extienden más allá de los superiores (prognatismo), agrandamiento del hígado, agrandamiento del corazón, agrandamiento de los ríñones, agrandamiento del bazo, aumento de tamaño del tronco (tronco de barril), aumento del vello corporal grueso, procesamiento inadecuado de los azúcares en la dieta, diabetes, presión arterial alta, incremento de calcio en la orina, cálculos renales, cálculos biliares, inflamación de la glándula tiroides (bocio), enfermedad cardiaca, artritis, crecimientos precancerosos (pólipos) en el colon, síndrome del túnel carpiano, hipopituitarismo, fibroides uterinos, neuropatías periféricas que resultan de proliferación fibrosa endoneural, necrosis/o erosión de cartílago articular proliferado, hiperfosfatemia, y compresión de la médula espinal.

Un individuo que sufre de acromegalia puede tratarse con un anticuerpo antagonista del GHR. Un individuo adecuado para la terapia de anticuerpo de antagonista del GHR se selecciona utilizando indicadores de criterio y pronóstico clínico de acromegalia que se conocen bien en el arte. El diagnóstico o evaluación de acromegalia se establece bien en el arte. La evaluación de la severidad de acromegalia puede realizarse basada en las pruebas conocidas en el arte, que incluyen, por ejemplo sin limitación, mediciones de niveles de IGF-1 en sangre, mediciones de crecimiento de hormona antes y después de la exposición a glucosa oral, y formación de imágenes de resonancia magnética (MRI) del cerebro para detectar tumor pituitario. En algunas modalidades, mejorar, controlar, reducir la incidencia de, o retardar el desarrollo o avance de acromegalia y/o síntomas de acromegalia se mide al probar los niveles de IGF-1 en sangre.

En algunas modalidades, la administración terapéutica del anticuerpo antagonista del GHR ventajosamente resulta en incidencia reducida y/o mejoramiento de uno o más síntomas de gigantismo que incluyen, por ejemplo sin limitación, niveles de IGF-1 excesivos, crecimiento excesivo en altura, crecimiento excesivo de músculo, crecimiento excesivo de órganos, retraso de la pubertad, visión doble, dificultad con la visión periférica, prominencia frontal, mandíbula prominente, dolor de cabeza, aumento de la sudoración, menstruación irregular, manos grandes, pies grandes, dedos gruesos, dedos de los pies gruesos, liberación de la leche materna, engrosamiento de los rasgos faciales, debilitamiento, insuficiencia suprarenal, diabetes insípida, hipogonadismo, e hipotiroidismo.

Un individuo que sufre de gigantismo puede tratarse con un anticuerpo antagonista del GHR. Un individuo adecuado para la terapia de anticuerpo antagonista del GHR se selecciona utilizando indicadores de criterio y pronóstico clínico de gigantismo que se conocen en el arte. El Diagnóstico o evaluación de gigantismo se establece bien en el arte. La evaluación de la severidad de gigantismo puede realizarse basado en pruebas conocidas en el arte, que incluyen, por ejemplo sin limitación, tomografía computarizada (CT) o exploración de MRI de la cabeza para detectar el tumor pituitario, medición de la hormona de crecimiento antes y después de la exposición a glucosa oral, medición de los niveles de prolactina en sangre, medición de los niveles de IGF-1 en sangre, medición de los niveles de cortisol en sangre, medición de los niveles de estradiol en sangre, medición de los niveles de testosterona en sangre, y medición de los niveles de la hormona tiroides. En algunas modalidades, el mejoramiento, control, reducción de incidencia de, o el retardo de desarrollo avance de gigantismo y/o síntomas de gigantismo se miden al medir los niveles de IGF-1 en sangre.

Con respecto a todos los métodos descritos en la presente, con referencia a los anticuerpos antagonistas del GHR también se incluyen composiciones que comprenden uno o más agentes adicionales. Estas composiciones pueden comprender además excipientes adecuados, tales como excipientes farmacéuticamente aceptables que incluyen reguladores, los cuales son bien conocidos en el arte. La presente invención puede utilizarse sola o en combinación con otros métodos convencionales de tratamiento.

El anticuerpo antagonista del GHR puede administrarse a un individuo mediante cualquier ruta adecuada. Debe ser aparente para una persona con experiencia en el arte que los ejemplos descritos en la presente no se pretende que sean limitantes sino ilustrativos de las técnicas disponibles. Por consiguiente, en algunas modalidades, el anticuerpo antagonista del GHR se administra a un individuo de acuerdo con métodos conocidos, tales como administración intravenosa, por ejemplo, como un bolo o por infusión continua sobre un periodo de tiempo, por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, transdérmica, subcutánea, intra-articular, sublingualmente, intrasinovial, mediante insuflación, rutas intratecal, oral, de inhalación o tópica. La administración puede ser sistémica, por ejemplo, administración intravenosa, o localizada. Los nebulizadores comercialmente disponibles para formulaciones liquidas, que incluyen nebulizadores por chorro y nebulizadores ultrasónicos son útiles para la administración. Las formulaciones líquidas pueden ser polvo nebulizado y liofilizado directamente puede nebulizarse después de la reconstitución. Alternativamente, el anticuerpo antagonista del GHR puede ser en aerosol utilizando una formulación de fluorocarburo y un inhalador de dosis medida, o inhalado como un polvo liofilizado o molido.

En algunas modalidades, un anticuerpo antagonista del GHR se administra mediante técnicas de suministro local sitio específicas u objetivo. Ejemplos de técnicas de suministro local sitio específicas u objetivo incluyen diversas fuentes de depósito implantable del anticuerpo antagonista del GHR o catéteres de suministro local, tales como catéteres de infusión, catéteres permanentes, o catéteres de aguja, injertos sintéticos, envolturas adventiciales, derivaciones stents u otros dispositivos implantables, portadores sitio específicos, inyecciones directas o aplicación directa. Véase, por ejemplo, la Publicación de PCT No. WO 00/53211 y Patente de los Estados Unidos No. 5,981 ,568.

Diversas formulaciones de un anticuerpo antagonista del GHR pueden utilizarse para la administración. En algunas modalidades, el anticuerpo antagonista del GHR puede administrarse puro. En algunas modalidades, anticuerpo antagonista del GHR y un excipiente farmacéuticamente aceptable puede estar en diversas formulaciones. Los excipientes farmacéuticamente aceptables se conocen en el arte, y son sustancias relativamente inertes que facilitan la administración de una sustancia farmacológicamente efectiva. Por ejemplo, un excipiente puede dar forma o consistencia, o actuar como un diluyente. Los excipientes adecuados incluyen pero no se limitan a agentes estabilizantes, agentes de humectación y emulsificantes, sales para variar la osmolaridad, agentes de encapsulamiento, reguladores, y mejoradores de penetración de la piel. Los excipientes así como las formulaciones para el suministro de fármaco parenteral y no parenteral se establecen en Remington, The Science y Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000).

En algunas modalidades, estos agentes se formulan para administración por inyección (por ejemplo, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intramuscularmente, etc.). Por consiguiente, estos agentes pueden combinarse con vehículos farmacéuticamente aceptables tales como solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, y similares. El régimen de dosificación particular, es decir, dosis, sincronización, y repetición, dependerán del individuo particular y del historial médico del individuo.

Un anticuerpo antagonista del GHR puede administrarse utilizando cualquier método adecuado, que incluye por inyección (por ejemplo, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intramuscularmente, etc.). Los anticuerpos del GHR también pueden administrarse mediante inhalación, como se describe en la presente. Generalmente, para administración de anticuerpos del GHR, una dosificación candidata inicial puede ser alrededor de 2 mg/kg. Para el propósito de la presente invención, una dosificación diaria típica puede variar de alrededor de cualquiera de 3 pg/kg a 30 pg/kg a 300 pg/kg a 3 mg/kg, a 30 mg/kg, a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados en lo anterior. Por ejemplo, la dosificación de alrededor de 1 mg/kg, alrededor de 2.5 mg/kg, alrededor de 5 mg/kg, alrededor de 10 mg/kg, y alrededor de 25 mg/kg pueden utilizarse. Para las administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento se sostiene hasta que se presenta una supresión de síntomas deseada o hasta que se logran niveles terapéuticos suficientes, por ejemplo, para reducir los niveles de IGF-1 en sangre. Un régimen de dosificación ejemplar comprende administrar una dosis inicial de alrededor de 2 mg/kg, seguida por una dosis de mantenimiento semanal de alrededor de 1 mg/kg del anticuerpo del GHR, o seguida por una dosis de mantenimiento de alrededor de 1 mg/kg cada dos semanas. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles, dependiendo del patrón de decaimiento farmacocinético que el profesional desee alcanzar. Por ejemplo, en algunas modalidades, la dosificación de una a cuatro veces por semana se contempla. En otras modalidades, se contempla la dosificación una vez al mes o una vez cada dos meses o cada tres meses. El avance de esta terapia se monitorea fácilmente por técnicas y ensayos convencionales. El régimen de dosificación (incluyendo el anticuerpo antagonista del GHR utilizado) puede variar con el tiempo.

Para el propósito de la presente invención, la dosificación apropiada de un anticuerpo antagonista del GHR dependerá del anticuerpo antagonista del GHR (o composiciones del mismo) empleada, el tipo y severidad de síntomas a tratarse, si el agente se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, previos a la terapia, el historial clínico del paciente y la respuesta al agente, los niveles de IGF-1 en sangre del paciente, la síntesis del paciente y la tasa de eliminación y síntesis del paciente para IGF-1 , la tasa de eliminación del paciente para el agente administrado y la discreción del médico tratante. Típicamente, el clínico administrará un anticuerpo antagonista del GHR hasta que se alcance una dosificación que logre el resultado deseado. La dosificación y/o frecuencia pueden variar sobre el curso del tratamiento. Las consideraciones empíricas, tales como vida media, generalmente contribuirán a la determinación de la dosificación. Por ejemplo, los anticuerpos que son compatibles con el sistema inmune humano, tales como los anticuerpos humanizados o anticuerpos completamente humanos, pueden utilizarse para prolongar la vida promedio del anticuerpo y para impedir que el anticuerpo sea atacado por el sistema inmune del huésped. La frecuencia de administración puede determinarse y ajustarse durante el curso de la terapia y es generalmente, pero no necesariamente, basada en tratamiento y/o supresión y/o mejora y/o retardo de síntomas, por ejemplo, los niveles de IGF-1 excesivos. Alternativamente, las formulaciones de liberación continua sostenidas de los anticuerpos antagonistas del GHR pueden ser apropiados. Diversas formulaciones y dispositivos para lograr la liberación sostenida se conocen en el arte.

En una modalidad, la dosificación para un anticuerpo antagonista puede determinarse empíricamente en individuos a quienes se les ha dado una o más administraciones de un anticuerpo antagonista. A los individuos se les dan dosificaciones incrementadas del anticuerpo antagonista del GHR. Para evaluar la eficacia, puede seguirse un indicador de la enfermedad.

La administración de un anticuerpo antagonista del GHR de acuerdo con el método de la presente invención puede ser continua o intermitente, dependiendo, por ejemplo, de la condición fisiológica del receptor, si el propósito de la administración es terapéutica o profiláctica y otros factores conocidos por los profesionales con experiencia. La administración de un anticuerpo antagonista del GHR puede ser esencialmente continua durante un periodo preseleccionado de tiempo o puede ser en una serie de dosis separadas.

En algunas modalidades, más de un anticuerpo antagonista puede estar presente. Al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco diferentes o más anticuerpos antagonistas pueden estar presentes. Generalmente, aquellos anticuerpos antagonistas del GHR pueden tener actividades complementarias que no se afectan adversamente entre si. Un anticuerpo antagonista del GHR también puede utilizarse junto con otros antagonistas del GHR o antagonistas de GH. Por ejemplo, uno o más de los siguientes antagonistas del GHR pueden utilizarse: una molécula anti-sentido dirigida a un GHR (que incluye molécula anti-sentido dirigida a un GHR de codificación de ácido nucleico), un compuesto inhibidor del GHR (por ejemplo, pegvisomant), y un análogo estructural del GHR. Un anticuerpo antagonista del GHR también puede utilizarse junto con otros agentes que sirven para mejorar y/o complementar la eficacia de los agentes.

Las formulaciones terapéuticas del anticuerpo antagonista del GHR utilizadas de acuerdo con la presente invención se preparan para almacenar al mezclar un anticuerpo o péptido que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables (Remington, The Science y Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes, o estabilizadores aceptables son no tóxicos para receptores en las dosificación y concentraciones empleadas, y pueden comprender reguladores tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; sales tales como cloruro de sodio; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de amonio octadecildimetilbenzilo; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; alcohol de fenol, butilo o bencilo; alquilparabenos, tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciciohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menor que alrededor de 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de, suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trealosa o sorbitol; contraiones que forman sales tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).

Liposomas que contienen el anticuerpo antagonista del GHR se preparan por métodos conocidos en el arte, tales como se describe en Epstein, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); y Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,485,045 y 4,544,545. Liposomas con tiempo de circulación mejorado se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 5,013,556. Los liposomas particularmente útiles pueden generarse por el método de evaporación de fase inversa con una composición de lípido que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada de PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado.

Los ingredientes activos también pueden atraparse en microcapsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y cápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-particulas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington, The Science y Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000).

Las preparaciones de liberación sostenida pueden prepararse. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices se encuentran en la forma de artículos configurados, por ejemplo películas, o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli(alcohol vinílico)), poliláctidos (Patente de los Estados Unidos No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y 7 etill-L-glutamato, acetato de etilen-vinilo no degradable, copolímeros de ácido glicólico-ácido láctico degradable tal como el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido glicólico-ácido láctico y acetato de leuprolida), isobutirato de acetato de sacarosa, y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

Las formulaciones a utilizarse para administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue fácilmente por, por ejemplo, filtración a través de membranas de filtración estéril. Las composiciones de anticuerpo antagonista del GHR terapéuticas se colocan generalmente en un contenedor que tiene una lumbrera de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o frasco que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.

Las composiciones de acuerdo con la presente invención pueden estar en una forma de dosificación unitaria tal como tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, gránulos, soluciones o suspensiones, o supositorios, para administración oral, parenteral o rectal, o administración por inhalación o insuflación.

Para preparar las composiciones sólidas tales como tabletas, el ingrediente activo principal se mezcla con un portador farmacéutico, por ejemplo, ingredientes de tableta convencional, tales como almidón de maíz, lactosa, sacarosa, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato de magnesio, fosfato de dicalcio o gomas, y otros diluyentes farmacéuticos, por ejemplo agua, para formar una composición de preformulación sólida que contiene una mezcla homogénea de un compuesto de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable no tóxica del mismo. Cuando se hace referencia a estas composiciones de preformulación como homogéneas, significa que el ingrediente activo se dispersa eventualmente a través de la composición de modo que la composición pueda subdividirse fácilmente en formas de dosificación unitarias igualmente efectivas tales como tabletas, pildoras y cápsulas. Esta composición de preformulación sólida se subdivide entonces en formas de dosificación unitarias del tipo descrito en lo anterior que contienen de 0.1 a alrededor de 500 mg del ingrediente activo de la presente invención. Las tabletas o pildoras de la composición novedosa pueden revestirse o de otra forma estar compuestas para proporcionar una forma de dosificación que proporcione la ventaja de acción prolongada. Por ejemplo, la tableta o pildora puede comprender un componente de dosificación interna y uno de dosificación externa, la última estando en la forma de una envoltura sobre el primero. Los dos componentes pueden separarse por una capa entérica que sirve para resistir la desintegración en el estómago y permite al componente interior pasar intacto en el duodeno o para retrasarse en la liberación. Una variedad de materiales puede utilizarse para tales capas entéricas o revestimientos, tales materiales incluyen un número de ácidos poliméricos y mezclas de ácidos poliméricos con tales materiales como shellac, alcohol cetílico y acetato de celulosa.

Los agentes tensioactivos adecuados incluyen, en particular, agentes no iónicos, tales como polioxietilensorbitanos (por ejemplo Tween™ 20, 40, 60, 80 u 85) y otros sorbitanos (por ejemplo Span™ 20, 40, 60, 80 u 85). Las composiciones con un agente tensioactivo estarán comprendidas convencionalmente entre 0.05 y 5% del agente tensioactivo, y pueden estar entre 0.1 y 2.5%. Se apreciará que otros ingredientes pueden agregarse, por ejemplo, manitol u otros vehículos farmacéuticamente aceptables, si es necesario.

Las emulsiones adecuadas pueden prepararse utilizando emulsiones grasas comercialmente disponibles, tales como Intralipid™, Liposyn™, Infonutrol™, Lipofundin™ y Lipiphysan™. El ingrediente activo puede ser ya sea disuelto en una composición de emulsión pre-mezclada o alternativamente puede disolverse en un aceite (por ejemplo, aceite de soya, aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de ajonjolí, aceite de maíz o aceite de almendras) y una emulsión formada al mezclar con fosfolípidos (por ejemplo, fosfolípidos de huevos, fosfolípidos de soya,, o lecitina de soya) y agua. Se apreciará que otros ingredientes pueden agregarse, por ejemplo, glicerol o glucosa, para ajusfar la tonicidad de la emulsión. Las emulsiones adecuadas típicamente contendrán hasta 20% de aceite, por ejemplo, entre 5 y 20%. La emulsión grasa puede comprender gotitas de grasa entre 0.1 y 1.0 pm, particularmente 0.1 y 0.5 pm, y tener un pH en el margen de 5.5 a 8.0.

Las composiciones de emulsión pueden ser aquellas preparadas al mezclar un anticuerpo antagonista del GHR con Intralipid™ o los componentes de los mismos (aceite de soya, fosfolípidos de huevo, glicerol y agua).

Composiciones para inhalación o insuflación incluyen soluciones y suspensiones en solventes acuosos u orgánicos farmacéuticamente aceptables, o mezclas de los mismos, y polvos. Las composiciones líquidas o sólidas pueden contener excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados como se establece en lo anterior. En algunas modalidades, las composiciones se administran por la ruta respiratoria oral o nasal para efecto local o sistémico. Las composiciones en solventes farmacéuticamente aceptables estériles preferiblemente pueden nebulizarse por el uso de gases. Las soluciones nebulizadas pueden respirarse directamente desde el dispositivo de nebulización o el dispositivo de nebulización puede conectarse a una máscara facial, tienda de campaña o máquina de respiración intermitente de presión positiva. La solución, suspensión o composiciones en polvo pueden administrarse, de preferencia en forma oral o nasal, a partir de dispositivos que suministran la formulación en una forma apropiada.

Anticuerpos antagonistas del GHR Los métodos de la invención utilizan un anticuerpo antagonista del GHR que bloquea, suprime o reduce (incluyendo reducir significativamente) la actividad biológica del GHR, incluyendo las trayectorias corriente abajo mediadas por la señalización del GHR. Un anticuerpo antagonista del GHR debe mostrar cualquiera de uno o más de las siguientes características: (a) unión a GHR; (b) bloquear la dimerización del GHR; (c) bloquear la interacción del GHR con GH; (d) bloquear o disminuir la fosforilación de STAT5 mediada por el GHR y/u otros eventos de señalización corriente abajo; (e) bloquear o disminuir la expresión IGF-1 mediada por el GHR; y (f) bloquear la interacción del GHR con aún otros para identificarse factores.

Para propósitos de esta invención, el anticuerpo de preferencia reacciona con el GHR en una forma que inhibe la función de señalización del GHR y la interacción de GH. En algunas modalidades, el anticuerpo antagonista del GHR específicamente reconoce el GHR primate humano y no humano. En algunas modalidades, el anticuerpo antagonista del GHR une el GHR primate humano y no humano.

Los anticuerpos útiles en la presente invención pueden abarcar anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fe, etc.), anticuerpos quiméricos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos heteroconjugados, cadena simple (ScFv), mutantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de dominio), anticuerpos humanizados, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de immunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida, que incluye variantes de glicosilación de anticuerpos, variantes de Secuencia de aminoácidoss de anticuerpos, y anticuerpos modificados covalentemente. Los anticuerpos pueden ser de murino, rata, humano, o cualquier otro origen (incluyendo anticuerpos quiméricos o humanizados).

En algunas modalidades, el anticuerpo antagonista del GHR es un anticuerpo monoclonal. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o humano.

Los anticuerpos antagonistas del GHR pueden hacerse por cualquier método conocido en el arte. Las técnicas generales para la producción de anticuerpos humanos y de ratón se conocen en la técnica y/o se describen en la presente.

Los anticuerpos antagonistas del GHR y fragmentos de los mismos pueden identificarse o caracterizarse utilizando métodos conocidos en el arte, por lo cual la reducción, mejora, o neutralización de la actividad biológica del GHR se detecta y/o se mide. En algunas modalidades, un anticuerpo antagonista del GHR se identifica al incubar un agente candidato con GHR y monitorear la unión y/o atender la reducción o neutralización de una actividad biológica del GHR. El ensayo de unión puede realizarse con polipéptidos del GHR purificados, o con células que se expresan naturalmente, o transfectadas para expresar, polipéptidos del GHR. En una modalidad, el ensayo de unión es un ensayo de unión competitivo, en donde la capacidad de un anticuerpo candidato para competir con un antagonista del GHR conocido para enlace del GHR se evalúa. El ensayo puede realizarse en diversos formatos, incluyendo el formato de ELISA. En algunas modalidades, un anticuerpo antagonista del GHR se identifica al incubar un anticuerpo candidato con GHR y monitorear el enlace. En algunas modalidades, una fosforilación de STAT5 se utiliza para identificar un anticuerpo antagonista del GHR. Por ejemplo, un anticuerpo candidato se incuba con el GHR que expresa células, y la fosforilación de STAT5 se monitorea.

Después de la identificación inicial, la actividad de un anticuerpo candidato antagonista del GHR además puede confirmarse y refinarse por bioensayo, conocido para probar las actividades biológicas objetivo. Alternativamente, los bioensayos pueden utilizarse para seleccionar directamente candidatos. Algunos de los métodos para identificar y caracterizar el anticuerpo antagonista del GHR se describen en detalle en los Ejemplos.

Los anticuerpos antagonistas del GHR de la invención muestran una o más de las siguientes características: (a) unión a GHR; (b) bloquear la dimerización del GHR; (c) bloquear la interacción del GHR con GH; (d) bloquear o disminuir la fosforilación de STAT5 mediada por el GHR; (e) bloquear o disminuir la expresión IGF-1 mediada por el GHR; y (f) bloquear la interacción del GHR con aún otros para identificarse factores. De preferencia, los anticuerpos del GHR tienen dos o más de estas características. De mayor preferencia, los anticuerpos tienen tres o más de las características. De mayor preferencia, los anticuerpos tienen cuatro o más de las características. De mayor preferencia, los anticuerpos tienen cinco o más de las características. De mayor preferencia, los anticuerpos tienen las seis características.

Los anticuerpos antagonistas del GHR pueden caracterizarse utilizando métodos bien conocidos en el arte. Por ejemplo, un método es para identificar el epítope al cual se une, o "mapear el epítope". Existen muchos métodos conocidos en el arte para mapear y caracterizar la ubicación de epitopes en proteínas, que incluyen la resolución de estructura de cristal de un complejo de anticuerpo-antígeno complex, ensayos de competición, ensayos de expresión de fragmentos de gen, y ensayos a base de péptido sintético, como se describe, por ejemplo, en el Capítulo 1 1 de Harlow y Lañe, Utilizando Anticuerpos, a Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, New York, 1999. En un ejemplo adicional, el mapeo de epítope puede u utilizarse para determinar la secuencia a la cual un anticuerpo antagonista del GHR se une. El mapeo de epítope se encuentra comercia Imente disponible de varias fuentes, por ejemplo, Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, The Netherlands). El epítope puede ser un epítope lineal, es decir, contenido en una sola extensión de aminoácidos, o un epítope conformacional formado por interacciones tridimensionales de aminoácidos que pueden no necesariamente contenerse en una sola extensión. Los péptidos de longitudes variables (por ejemplo, al menos 4-6 aminoácidos de longitud) pueden aislarse o sintetizarse (por ejemplo, recombinantemente) y utilizarse para enlazar ensayos con un anticuerpo antagonista del GHR. En otro ejemplo, el epítope al cual el anticuerpo antagonista del GHR se une puede determinarse en una selección sistemática al utilizar los péptidos traslapantes derivados de la secuencia del GHR determinando el enlace por el anticuerpo antagonista del GHR. De acuerdo con los ensayos de expresión del fragmento de gen, el marco de lectura abierta que codifica GHR se fragmenta ya sea aleatoriamente o por construcciones genéticas especificas y se determina la reactividad de los fragmentos expresados del GHR con el anticuerpo a probarse. Los fragmentos de gen pueden por ejemplo, producirse por PCR y después transcribirse y traducirse en proteína in vitro, en la presencia de aminoácidos radioactivos. El enlace del anticuerpo con los fragmentos del GHR radioactivamente etiquetados se determinan entonces por inmunoprecipitación y electroforesis en gel. Ciertos epitopes también pueden identificarse al utilizar grandes bibliotecas de secuencias de péptidos aleatorios desplegados en la superficie de las partículas de fago (bibliotecas de fago) o levadura (despliegue de levadura). Alternativamente, una biblioteca definida para traslapar los fragmentos de péptido pueden probarse para enlazar al anticuerpo de prueba en ensayo de unións simples. En un ejemplo adicional, la mutagénesis de un antígeno, experimentos de intercambio de dominio y mutagénesis de exploración de alanina pueden realizarse para identificar los residuos de identificación requeridos, suficientes, y/o necesarios para el enlace de epítope. Por ejemplo, los experimentos de cambio de dominio pueden realizarse utilizando un GHR mutante en el cual diversos fragmentos del polipéptido del GHR se han remplazado (intercambiado) con secuencias del GHR de otras especies, o una proteína cercanamente relacionada, aunque antigénicamente distinta. Al evaluar el enlace del anticuerpo al GHR mutante, la importancia del fragmento del GHR particular al enlace de anticuerpo puede evaluarse.

Aún otro método que puede utilizarse para caracterizar un anticuerpo antagonista del GHR es para utilizar ensayos de competencia con otros anticuerpos conocidos para unir al mismo antígeno, es decir, diversos fragmentos en GHR, para determinar si el anticuerpo antagonista del GHR se une al mismo epítope como otros anticuerpos. Los ensayos de competencia son bien conocidos por aquellos con experiencia en el arte.

La afinidad de unión (KQ) de un anticuerpo antagonista del GHR a GHR puede ser de alrededor de 0.001 a alrededor de 200 nM. En algunas modalidades, la afinidad de unión es cualquiera de alrededor de 200 nM, alrededor de 100 nM, alrededor de 50 nM, alrededor de 10 nM, alrededor de 1 nM, alrededor de 500 pM, alrededor de 100 pM, alrededor de 60 pM, alrededor de 50 pM, alrededor de 20 pM, alrededor de 15 pM, alrededor de 10 pM, alrededor de 5 pM, alrededor de 2 pM, o alrededor de 1 pM. En algunas modalidades, la afinidad de unión es menor que cualquiera de alrededor de 250 nM, alrededor de 200 nM, alrededor de 100 nM, alrededor de 50 nM, alrededor de 10 nM, alrededor de 1 nM, alrededor de 500 pM, alrededor de 100 pM, alrededor de 50 pM, alrededor de 20 pM, alrededor de 10 pM, alrededor de 5 pM, o alrededor de 2 pM.

Una forma de determinar la afinidad de unión de los anticuerpos a GHR es al medir la afinidad de unión de los fragmentos de Fab monofuncionales del anticuerpo. Para obtener fragmentos de Fab monofuncionales, un anticuerpo (por ejemplo, IgG) puede escindirse con papaína o expresarse recombinantemente. La afinidad de un fragmento de Fab del GHR de un anticuerpo puede determinarse por la resonancia de plasmón superficial (sistema de resonancia de plasmón superficial (SPR) Biacore3000™, Biacore, INC, Piscataway NJ) equipado con un chips de estreptavidina (SA) pre-inmovilizados utilizando regulador de ejecución de HBS-EP (HEPES 0.01M, pH 7.4, NaCI 0.15, EDTA 3 mM, 0.005% v/v de Tensioactivo P20). El GHR biotinilado puede diluirse en un regulador HBS-EP a una concentración de menos de 0.5 pg/mL y se inyecta a través de los canales de chip individuales utilizando tiempos de contacto variables, para lograr dos márgenes de densidad de antígeno, ya sea 50-200 unidades de respuesta (RU) para estudios cinéticos detallados u 800-1 ,000 RU para ensayos de selección. Los estudios de regeneración han mostrado que NaOH 25 mM en 25% v/v de etanol remueve efectivamente el enlace de Fab mientras que mantiene la actividad del GHR en el chip de más de 200 inyecciones. Típicamente, las diluciones en serie (que abarcan concentraciones de 0.1 -10x de KD estimada) de muestras Fab purificadas se inyectan durante 1 minuto a 100 pUminuto y los tiempos de disociación de hasta 2 horas se permiten. Las concentraciones de las proteínas Fab se determinan por ELISA y/o electroforesis de SDS-PAGE utilizando un Fab de concentración conocida (como se determina por el análisis de aminoácidos) como un estándar. Los índices de asociación cinética (kencend¡do) y los índices de disociación (kapagado) se obtienen simultáneamente ai ajustar los datos globalmente a un modelo de unión Langmuir 1 :1 (Karlsson, R. Roos, H . Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). ethods Enzymology 6. 99-110) utilizando el programa BIAevaluation. Los valores constantes de disociación de equilibrio (KD) se calculan como kapagado/kencendido- Este protocolo es adecuado para su uso en la determinación de afinidad de unión de un anticuerpo a cualquier GHR, que incluye GHR humano, GHR de mono cynomolgus (cyno), y GHR de ratón, así como diferentes formas del GHR. La afinidad de unión de un anticuerpo se mide generalmente en 25°C, aunque también se mide a 37°C.

Por consiguiente, la invención proporciona cualquiera de lo siguiente, o composiciones (incluyendo composiciones farmacéuticas) que comprenden un anticuerpo que tiene una secuencia de cadena parcial ligera y una secuencia de cadena parcial pesada como se encuentran en la Tabla 1. En la Tabla 1 , las secuencias subrayadas son secuencias de CDR de acuerdo con Kabat, y las secuencias en negritas son secuencias de CDR de acuerdo con Chothia. La afinidad de unión de los anticuerpos de los anticuerpos del GHR humano se determinó por análisis de Biacore™ y se muestra en la Tabla 1.

TABLA 1 La invención también proporciona porciones de CDR de anticuerpos a GHR. La determinación de las regiones de CDR se encuentra bien dentro de la experiencia de la técnica. Se entenderá que en algunas modalidades, las CDR pueden ser una combinación de la CDR de Kabat y Chothia (también denominadas las "CDR combinadas" o "CDR extendidas"). En algunas modalidades, las CDR son las CDR de Kabat. En otras modalidades, las CDR son las CDR de Chothia. En otras modalidades, las CDR son las CDR extendidas, AbM, conformacionales o de contacto. En otras palabras, en modalidades con más de una CDR, las CDR pueden ser cualquiera de las CDR de Kabat, Chothia, extendidas, AbM, conformacionales, de contacto o combinaciones de los mismos.

La Tabla 2 proporciona ejemplos de las secuencias de CDR y las afinidades de unión de los anticuerpos antagonistas del GHR proporcionados en la presente. Las afinidades de unión se miden a 25°C, excepto cuando se marcan con un asterisco (*). El asterisco indica una afinidad de unión medida a 37°C.

TABLA 2 Secuencias de CDR de unión de antígeno anticuerpos antagonistas del GHR de acuerdo con Kabat (subrayado) y Chothia (en negritas) con afinidades de unión (Kp) La invención también proporciona métodos para elaborar cualquiera de estos anticuerpos o polipéptidos. Los anticuerpos de esta invención pueden hacerse por procedimientos conocidos en el arte. Los polipéptidos pueden producirse por proteolíticos u otra degradación de los anticuerpos, por métodos recombinantes (es decir, polipéptidos simples o de fusión) como se describen en lo anterior o por síntesis química. Los polipéptidos de los anticuerpos, especialmente los polipéptidos más cortos hasta alrededor de 50 aminoácidos, se hacen convenientemente por síntesis química. Los métodos de síntesis química se conocen en el arte y se encuentran comercialmente disponibles. Por ejemplo, un anticuerpo puede producirse por un sintetízador de polipéptido automatizado que emplea el método de fase sólida. Véase también, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,807,715, 4,816,567; y 6,331 ,415.

En algunas modalidades, los anticuerpos pueden prepararse y seleccionarse por tecnología de despliegue de fago. Véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; y 6,265,150; y Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455, 1994. Alternativamente, la tecnología de despliegue de fago (McCafferty et al., Nature 348:552-553, 1990) puede utilizarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, a partir de repertorios de genes de dominio de variable de inmunoglobulina (V) a partir de donadores no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes de dominio V de anticuerpo se clonan en un marco ya sea en un gen de proteína de tapa mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como 13 o fd, y se despliegan como fragmentos de anticuerpos funcionales en la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de una sola hebra del genoma de fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también resultan en la selección del gen que codifica el anticuerpo que muestra estas propiedades. Por lo tanto, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. El despliegue de fago puede realizarse en una variedad de formatos; para su revisión véase, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinión in Structural Biology 3:564-571 , 1993. Varias fuentes de segmentos de gen V pueden utilizarse para el despliegue de fago. Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991 , aisló una disposición diversa de anticuerpos anti-oxazolona a partir de una biblioteca combinatoríal aleatoria pequeña de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Un repertorio de genes V a partir de donadores humanos no inmunizados puede construirse y los anticuerpos para una disposición diversa de antígenos (incluyendo auto-antígenos) puede aislarse esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991 , o Griffith et al., EMBO J. 12:725-734, 1993. En una respuesta inmune natural, los genes de anticuerpo acumulan mutaciones en un alto índice (hipermutación somática). Algunos de los cambios introducidos conferirán una mayor afinidad, y las células B que despliegan la inmunoglobulina de superficie de alta afinidad de preferencia son replicadas y diferenciadas durante la exposición a antígeno subscuente. Este proceso natural puede mimetizarse al emplear la técnica conocida como "intercambio de cadena." (Marks et al., Bio/Technol. 10:779-783, 1992). En este método, la afinidad de los anticuerpos humanos "primarios" obtenida por el despliegue de fago puede mejorarse al remplazar secuencialmente los genes de la región V de cadena pesada y ligera con repertorios de variantes de origen natural (repertorios) de genes de dominio V obtenidos a partir de donadores no inmunizados. Esta técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos con afinidades en el margen de pM-nM. Una estrategia para elaborar repertorios de anticuerpo de fago muy largos (también conocidos como "la madre de todas las bibliotecas") se ha descrito por Waterhouse et al., Nucí. Acids Res. 21:2265-2266, 1993. El intercambio de genes también puede utilizarse para derivar anticuerpos humanos a partir de anticuerpos de roedores, en donde el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares al anticuerpo de roedor de partida. De acuerdo con este método, el cual también se denomina como "impresión de epítope", el gen de dominio V de cadena pesada o ligera de anticuerpos de roedores obtenidos por técnica de despliegue de fago se remplaza con un repertorio de genes de dominio V humano, creando quimeras de roedores-humanos. La selección en el antígeno resulta en aislamiento de regiones variables humanas capaces de restaurar un sitio de unión de antígeno funcional, es decir, el epítope gobierna (impronta) la elección de la pareja. Cuando el proceso se repite para remplazar el dominio V de roedores restante, se obtiene un anticuerpo humano (véase Publicación PCT No. WO 93/06213). A diferencia de la humanización tradicional de anticuerpos de roedores por injertos de CDR, esta técnica proporciona anticuerpos completamente humanos, los cuales no tienen una estructura principal o residuos de CDR del roedor de origen.

En algunas modalidades, los anticuerpos pueden hacerse utilizando tecnología de hibridoma. Se contempla que cualquier sujeto mamífero incluyendo humanos o células que producen anticuerpos a partir de los mismos pueden manipularse para servir como la base para la producción de líneas celulares de hibridoma de mamíferos, incluyendo humanos. La ruta y programa de inmunización del animal huésped se encuentran generalmente de acuerdo con las técnicas establecidas y convencionales para estimulación y producción de anticuerpos, como se describe además en la presente. Típicamente, el animal huésped se inocula intraperitoneal, intramuscular, oral, subcutánea, intraplantar, y/o ¡ntradérmicamente con una cantidad de inmunógeno, incluyendo como se describe en la presente.

Los hibridomas pueden prepararse a partir de linfocitos y células de mieloma inmortalizados utilizando la técnica de hibridación de célula somática general de Kohler, B. y Milstein, C, 1975, Nature 256:495-497 o como se modifica por Buck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381 , 1982. Las líneas de mieloma disponibles, incluyendo pero no limitadas a X63-Ag8.653 y aquellas a partir de Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., USA, pueden utilizarse en la hibridación. Generalmente, la técnica implica fusionar células de mieloma y células linfoide utilizando un fusógeno tal como polietilenglicol, o por medios eléctricos bien conocidos por aquellos con experiencia en el arte. Después de la fusión, las células se separan del medio de fusión y se cultivan en un medio de cultivo selectivo, tal como un medio de hipoxantina-aminopterin-timidina (HAT), para eliminar las células madre no hibridizadas. Cualquiera de los medios descritos en la presente, suplementados con o sin suero, pueden utilizarse para cultivar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales. Como otra alternativa a la técnica de fusión de células, células B inmortalizadas EBV pueden utilizarse para producir los anticuerpos monoclonales de GHR de la invención objeto. Los hibridomas u otras células B inmortalizadas se expanden y se subclonan, si se desea, y los sobrenadantes se someten a ensayo para la actividad anti-inmunogeno por procedimientos de inmunoensayo convencionales (por ejemplo, radioinmunoensayo, inmunoensayo de enzima, o inmunoensayo de fluorescencia).

Los hibridomas que pueden utilizarse como fuente de anticuerpos abarcan todos los derivados, las células de progenie de los hibridomas madre que producen anticuerpos monoclonales específicos para GHR, o una porción de los mismos.

Los hibridomas que producen tales anticuerpos pueden cultivarse in vitro o in vivo utilizando procedimientos conocidos. Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse a partir de un medio de cultivo o fluidos corporales, por procedimientos de - purificación de inmunoglobulina convencionales tales como precipitación de sulfato de amonio, electroforesis en gel, diálisis, cromatografía y ultrafiltración, si se desea. La actividad indeseada, si está presente, puede removerse, por ejemplo, al ejecutar la preparación sobre adsorbentes hechos de inmunógeno conectado a una fase sólida y eluyendo o liberando los anticuerpos deseados fuera del inmunógeno. La inmunización del animal huésped con un polipéptido de GHR, o un fragmento que contiene Secuencia de aminoácidoss objetivo conjugada a una proteína que es inmunogénica en las especies a inmunizarse, por ejemplo, la hemocianina de lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina de bovino, o inhibidor de tripsina de soya utilizando un agente bifuncional o de derivación, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCI2, o R1N=C=NR, en donde R y R1 son grupos alquilo diferentes, puede producir una población de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales).

Si se desea, el anticuerpo antagonista de GHR (monoclonal o policlonal) de interés puede secuenciarse y la secuencia de polinucleótido puede entonces clonarse en un vector para expresión o propagación. La secuencia que codifica el anticuerpo de interés puede mantenerse en el vector en una célula huésped y la célula huésped puede entonces expandirse y congelarse para uso futuro. La producción de anticuerpos monoclonales recombinantes en el cultivo celular puede llevarse a cabo a través de la clonación de genes de anticuerpo de las células B por medios conocidos en el arte Véase, por ejemplo Tiller et al., 2008, J. Immunol. Métodos 329, 112; Patente de los Estados Unidos No. 7,314,622.

En algunas modalidades, la secuencia de polinucleótido puede utilizarse por manipulación genética para "humanizar" el anticuerpo o para mejorar la afinidad, u otras características del anticuerpo. Los anticuerpos también pueden personalizarse para su uso, por ejemplo, en perros, gatos, primates, equinos y bovinos.

En algunas modalidades, los anticuerpos completamente humanos pueden obtenerse al utilizar ratones comercialmente disponibles que se han manipulado para expresar proteínas de inmunoglobulina humana específica. Los anímales transgénicos que se diseñan para producir una respuesta inmune más deseable (por ejemplo, anticuerpos completamente humanos) o más fuerte también pueden utilizarse para la generación de anticuerpos humanizados o humanos. Ejemplos de tal tecnología son Xenomouse™ de Abgenix, Inc. (Fremont, CA) y Hu Ab-Mouse® y TC Mouse™ de Medarex, Inc. (Princeton, NJ).

Los anticuerpos pueden hacerse recombinantemente al aislar primero los anticuerpos y las células que producen anticuerpos de animales huéspedes, obteniendo la secuencia de genes, y utilizando la secuencia de genes para expresar el anticuerpo recombinantemente en células huésped (por ejemplo, células CHO). Otro método que puede emplearse es expresar la secuencia de anticuerpo en plantas (por ejemplo, tabaco) o leche transgénica. Se han descrito métodos para expresar anticuerpos recombinantemente en plantas o leche. Véase, por ejemplo, Peeters, et al. Vaccine 19:2756, 2001 ; Lonberg, N. y D. Huszar Int. Rev. Immunol 13:65, 1995; y Pollock, et al., J Immunol Métodos 231 : 147, 1999. Los métodos para elaborar derivados de anticuerpos, por ejemplo, de dominio, de cadena simple, etc., se conocen en el arte.

Los inmunoensayos y las técnicas de clasificación de cítometría de flujo tales como clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) también pueden emplearse para aislar anticuerpos que son específicos para GHR.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla y se secuencia fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, al utilizar sondas de oligonucleótido que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión (tales como vectores de expresión descritos en la Publicación PCT No. WO 87/04462), los cuales entonces se transfectan en células huésped tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster Chino (CHO), o células de mieloma que no producen de otra forma proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Véase, por ejemplo, la Publicación PCT No. WO 87/04462. El ADN también puede modificarse, por ejemplo, al sustituir la secuencia de codificación para dominios constantes de cadena pesada o ligera humana en lugar de secuencias de murino homologas, Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81 :6851 , 1984, o al unirse covalentemente a la secuencia de codificación de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido sin inmunoglobulina. De esta manera, se preparan anticuerpos "quiméricos" o "híbridos" que tienen la especificidad de unión de un anticuerpo monoclonal de GHR en la presente.

Los fragmentos de anticuerpos pueden producirse por degradación proteolítica u otra degradación de anticuerpos, por métodos recombinantes (es decir, polipéptidos simples o de fusión) como se describe en lo anterior o por síntesis química. Los polipéptidos de los anticuerpos, especialmente polipéptidos más cortos hasta de alrededor de 50 aminoácidos, se elaboran convenientemente por síntesis química. Los métodos de la síntesis química son conocidos en el arte y se encuentran comercialmente disponibles. Por ejemplo, un anticuerpo puede producirse por un sintetizador de polipéptido automatizado que emplea el método de fase sólida. Véase también, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,807,715; 4,816,567; y 6,331 ,415.

En algunas modalidades, un polinucleótido comprende una secuencia que codifica las regiones variables de cadena pesada y/o la cadena ligera de anticuerpo SS1 , SS3, SS4, T 1 o TM9. La secuencia que codifica el anticuerpo de interés puede mantenerse en un vector en una célula huésped y la célula huésped puede entonces expandirse y congelarse para uso futuro. Los vectores (incluyendo los vectores de expresión) y las células huésped se describen adicionalmente en la presente.

La invención incluye modalidades de afinidad madurada. Por ejemplo, los anticuerpos de afinidad madurada pueden producirse por procesos conocidos en el arte (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783; Barbas et al., 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91 :3809-3813; Schier et al., 1995, Gene, 169:147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol., 155:1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol., 154(7):3310-9; Hawkins et al., 1992, J. Mol.

Biol., 226:889-896; y Publicación PCT No. WO2004/058184).

Los siguientes métodos pueden utilizarse para ajustar la afinidad de un anticuerpo y para caracterizar una CDR. Una forma de caracterizar una CDR de un anticuerpo y/o alterar (tal como mejorar) la afinidad de unión de un polipéptido, tal como un anticuerpo, denominado "mutagénesis de exploración de biblioteca". Generalmente, la mutagénesis de exploración de biblioteca trabaja como sigue. Una o más posiciones de aminoácido en la CDR se remplazan con dos o más (tal como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ó 20) aminoácidos utilizando métodos reconocidos en el arte. Esto genera pequeñas bibliotecas de clones (en algunas modalidades, una para cada posición de aminoácido que se analiza), cada uno con una complejidad de dos o más miembros (si dos o más aminoácidos se sustituyen en cada posición). Generalmente, la biblioteca también incluye un clon que comprende el aminoácido nativo (no sustituido). Un número pequeño de clones, por ejemplo, alrededor de 20-80 clones (dependiendo de la complejidad de la biblioteca), de cada biblioteca se seleccionan para afinidad de unión al polipéptido objetivo (u objetivo de unión), y los candidatos con unión incrementada, la misma, disminuida, o sin unión se identifican. Los métodos para determinar la afinidad de unión son bien conocidos en el arte. La afinidad de unión puede determinarse utilizando, por ejemplo, el análisis de resonancia de plasmón de superficie Biacore™, el cual detecta las diferencias en la afinidad de unión de alrededor de 2 veces o más, un Biosensor Kinexa®, ensayos de proximidad de escintilación, ELISA, inmunoensayo de ORIGEN®, extinción de fluorescencia, transferencia de fluorescencia, y/o despliegue de levadura. La afinidad de unión también puede seleccionarse utilizando un bioensayo adecuado. Biacore™ es particularmente útil cuando el anticuerpo de partida ya se une con una afinidad relativamente alta, por ejemplo un KD de alrededor de 10 nM o menos.

En algunas modalidades, cada posición de aminoácido en una CDR ser remplaza (en algunas modalidades, uno a la vez) con los 20 aminoácidos naturales que utilizan métodos de mutagénesis reconocidos en el arte (algunos de los cuales se describen en la presente). Esto genera pequeñas bibliotecas de clones (en algunas modalidades, uno para cada posición de aminoácido que se analiza), cada uno con una complejidad de 20 miembros (si los 20 aminoácidos se sustituyen en cada posición).

En algunas modalidades, la biblioteca a seleccionarse comprende sustituciones en dos o más posiciones, las cuales pueden estar en la misma CDR o en dos o más CDR. Por lo tanto, la biblioteca puede comprender sustituciones en dos o más posiciones en una CDR. La biblioteca puede comprender sustitución en dos o más posiciones en dos o más CDR. La biblioteca puede comprender sustitución en 3, 4, 5, o más posiciones, las posiciones encontradas en dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR. La sustitución puede prepararse utilizando codones de baja redundancia. Véase, por ejemplo, la Tabla 2 de Balint et al., 1993, Gene 137(1):109-18.

La CDR puede ser la CDR3 de región variable de cadena pesada (VH) y/o CDR3 de región variable de cadena ligera (VL). La CDR puede ser una o más de CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL, y/o CDR3 de VL. La CDR puede ser una CDR de Kabat, una CDR de Chothia, una CDR extendida, una CDR de AbM, una CDR de contacto, o una CDR conformacional.

Los candidatos con unión mejorada pueden secuenciarse, identificando asi un mutante de sustitución de CDR que resulta en la afinidad mejorada (también denominada una sustitución "mejorada"). Los candidatos que se unen también pueden secuenciarse, identificando así una sustitución de CDR que retiene la unión.

Pueden conducirse múltiples rondas de selección. Por ejemplo, los candidatos (cada uno comprende una sustitución de aminoácido en una o más posiciones de una o más CDR) con unión mejorada también son útiles para el diseño de una segunda biblioteca que contiene al menos aminoácido original y sustituido en cada posición de CDR (es decir, posición de aminoácido en la CDR en el cual un mutante de sustitución muestra una unión mejorada). La preparación y cribado o selección de esta biblioteca se discute adicionalmente en lo siguiente.

La mutagénesis de exploración de biblioteca también proporciona un medio para caracterizar una CDR, a medida que la frecuencia de clones con unión mejorada, la misma unión, la unión disminuida o sin unión también proporciona información en relación con la importancia de cada posición de aminoácido para la estabilidad del complejo de anticuerpo-antigeno. Por ejemplo, si una posición de la CDR retiene la unión cuando cambia a los 20 aminoácidos, esa posición se identifica como una posición que es improbable que se requiera para una unión de antígeno. Por el contrario, si una posición de CDR retiene la unión en sólo un pequeño porcentaje de sustituciones, es posición se identifica como una posición que es importante para la función de CDR. Por lo tanto, los métodos de mutagénesis de exploración de biblioteca generan información con respecto a las posiciones en las CDR que pueden cambiarse a muchos aminoácidos diferentes (incluyendo los 20 aminoácidos), y las posiciones en las CDR que no pueden cambiarse o las cuales pueden solamente cambiarse a unos cuantos aminoácidos.

Los candidatos con afinidad mejorada pueden combinarse en una segunda biblioteca, la cual incluye el aminoácido mejorado, el aminoácido original en esa posición, y puede incluir además sustituciones adicionales en esa posición, dependiendo de la complejidad de la biblioteca que se desea, o permite utilizar el método de cribado o selección deseado. Además, si se desea, la posición de aminoácido adyacente puede aleatorizarse en al menos dos o más aminoácidos. La aleatorización de los aminoácidos adyacentes puede permitir la flexibilidad conformacional adicional en la CDR muíante, lo cual puede a su vez, permitir o facilitar la introducción de un gran número de mutaciones mejoradas. La biblioteca también puede comprender la sustitución en posiciones que no muestran afinidad mejorada en la primera ronda de exploración.

La segunda biblioteca se criba o se selecciona por miembros de biblioteca con afinidad de unión mejorada y/o alterada utilizando cualquier método conocido en el arte, incluyendo el cribado utilizando el análisis de resonancia de plasmón de superficie Biacore™, y la selección utilizando cualquier método conocido en la técnica para la selección, incluyendo despliegue de fago, despliegue de levadura, despliegue de ribosoma.

Para expresar los anticuerpos de GHR de la presente invención, los fragmentos de ADN que codifican las regiones de VH y VL pueden obtenerse primero utilizando cualquiera de los métodos descritos en lo anterior. Varias modificaciones, por ejemplo mutaciones, supresiones, y/o adiciones también pueden introducirse en las secuencias de ADN utilizando métodos estándar conocidos por aquellos con experiencia en el arte. Por ejemplo, la mutagénesis puede llevarse a cabo utilizando métodos estándares, tales como mutagénesis mediada por PCR, en la cual los nucleótidos mutados se incorporan en los cebadores de PCR de tal manera que el producto de PCR contiene las mutaciones deseadas o las mutagénesis sitio dirigidas.

La invención abarca modificaciones a las regiones variables mostradas en la Tabla 1 y las CDR mostradas en la Tabla 2. Por ejemplo, la invención incluye anticuerpos que comprenden regiones variables funcionalmente equivalentes y las CDR que no afectan significativamente sus propiedades así como las variantes las cuales han mejorado o disminuido la actividad y/o afinidad. Por ejemplo, la Secuencia de aminoácidoss puede mutarse para obtener un anticuerpo con la afinidad de enlace deseada para GHR. La modificación de polipéptidos es práctica de rutina en el arte y no necesita describirse en detalle en la presente. Ejemplos de polipéptidos modificados incluyen polipéptidos con sustituciones conservadoras de residuos de aminoácidos, una o más supresiones o adiciones de aminoácidos las cuales no cambian significativamente de manera perjudicial la actividad funcional, o que maduran (mejoran) la afinidad del polipéptido para su ligando, o el uso de análogos químicos.

Las inserciones de secuencia de aminoácidoss incluyen fusiones amino y/o carboxilo terminales que varían en longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen un ciento o más de residuos, así como también inserciones de intrasecuencia de residuos de aminoácidos simples o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado a una etiqueta de epítope. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión a N o C-término del anticuerpo de una enzima o un polipéptido que incrementa la vida promedio del anticuerpo en la circulación sanguínea.

Las variantes de sustitución tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo y un residuo diferente insertado en su lugar Los sitios de mayor interés para la mutagénesis sustitucional incluyen las regiones hipervariables, aunque las alteraciones de estructura también se contemplan. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 3 bajo el título de "sustituciones conservadoras". Si tales sustituciones resultan en un cambio en la actividad biológica, entonces los cambios más sustancíales, denominados "sustituciones ejemplares" en la Tabla 3, o como se describe adicionalmente en lo siguiente con referencia a las clases de aminoácido, pueden introducirse en los productos seleccionados.

TABLA 3 Sustituciones de Aminoácidos Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se logran al seleccionar sustituciones que difieren significativamente en su efecto de mantener (a) la estructura de la estructura principal del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja ß o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos de origen natural se dividen en grupos basados en propiedades de cadena lateral comunes: (1 ) No polar: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) Polar sin carga: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) Acídico (negativamente cargado): Asp, Glu; (4) Básico (cargado positivamente): Lys, Arg; (5) Residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y (6) Aromático: Trp, Tyr, Phe, His.

Se hacen sustituciones no conservadoras al intercambiar un miembro de uno de estas clases por otra clase.

Un tipo de sustitución, por ejemplo, que puede hacerse es para cambiar una o más cisteinas en el anticuerpo, lo cual puede ser químicamente reactivo, a otro residuo, tal como, sin limitación, alanina o serina. Por ejemplo, puede tener una sustitución de una cisteína no canónica. La sustitución puede hacerse en una CDR o región de estructura de un dominio variable o en la región constante de un anticuerpo. En algunas modalidades, la cisteína es canónica. Cualquier residuo de cisteína no implicado en mantener la conformación apropiada del anticuerpo también puede sustituirse, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula e impedir la reticulación aberrante. Por el contrario, los enlaces de cisteína pueden agregarse al anticuerpo para mejorar su estabilidad, particularmente en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento de Fv.

Los anticuerpos también pueden modificarse, por ejemplo en los dominios variables de las cadenas pesadas y/o ligeras, por ejemplo, para alterar una propiedad de unión del anticuerpo. Los cambios en la región variable pueden alterar la afinidad de unión y/o especificidad. En algunas modalidades, no más de una a cinco sustituciones de aminoácidos conservadoras se hacen con un dominio de CDR. En otras modalidades, no más de una a tres sustituciones de aminoácidos conservadoras se hacen dentro de un dominio de CDR. Por ejemplo, una mutación puede hacerse en una o más de las regiones de CDR para incrementar o disminuir el KD del anticuerpo para GHR, para incrementar o disminuir kapagado, o para alterar la especificidad de unión del anticuerpo. Las técnicas en la mutagénesis sitio-dirigida son bien conocidas en el arte. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. y Ausubel et al., supra.

Una modificación o mutación también puede hacerse en una región de estructura o región constante para incrementar la vida promedio de un anticuerpo de GHR. Véase, por ejemplo, la Publicación PCT No. WO 00/09560. Una mutación en una región de estructura o región constante también puede hacerse para alterar la inmunogenicidad del anticuerpo, para proporcionar un sitio para unión covalente o no covalente a otra molécula, o para alterar tales propiedades como la fijación del complemento, la unión de FcR y la citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo. De acuerdo con la invención, un anticuerpo simple puede tener mutaciones en cualquiera o más de las CDR o regiones de estructura del dominio variable o en la región constante.

Las modificaciones también incluyen polipéptidos glicosilados y no glicosilados, así como también polipéptidos con otras modificaciones post-translacionales, tales como, por ejemplo, glicosilación con azúcares, acetilación y fosforilación diferentes. Los anticuerpos son glicosilados en posiciones conservadas en sus regiones constantes (Jefferis y Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128; Wright y Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32). Las cadenas laterales de oligosacárido de las inmunoglobulinas afectan la función de la proteína (Boyd et al., 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe y Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180) y la interacción intramolecular entre las porciones de la glicoproteína, que pueden afectar la conformación y superficie tridimensional presentada en la glicoproteína (Jefferis y Lund, supra, Wyss y Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416). Los oligosacáridos también pueden servir para dirigir una glicoproteína determinada para ciertas moléculas basadas en las estructuras de reconocimiento específico. La glicosilación de anticuerpos también se ha reportado que afecta la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). En particular, los anticuerpos producidos por las células CHO con la expresión regulada por tetraciclina de p(1 ,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), una formación de catalización de glicosiltransferasa de GIcNAc de bisección, se reportó que tiene actividad de ADCC mejorada (Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17:176-180).

La glicosilación de los anticuerpos es típicamente ya sea N-enlazado u O-enlazado. N-enlazado se refiere a la unión de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptido de asparagina-X-serina, asparagina-X-treonina, y asparagina-X-cisteína, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación O-enlazada se refiere a la unión a uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un ácido hidroxiamino, más comúnmente serina o treonina, aunque también puede usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se logra convenientemente al alterar la Secuencia de aminoácidoss de tal manera que contiene una o más de las secuencias de tripéptido antes descritas (para los sitios de glicosilación N-enlazados). La alteración también puede hacerse por la adición de o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación O-enlazados).

El patrón de glicosilación de anticuerpos también puede alterarse sin alterar la secuencia de nucleótido subyacente. La glicosilación depende en gran medida de la célula huésped utilizada para expresar el anticuerpo. Puesto que el tipo de célula utilizado para la expresión de glicoproteínas recombinantes, por ejemplo anticuerpos, como terapéuticas potenciales raramente es la célula nativa, las variaciones en el patrón de glicosilación de los anticuerpos pueden esperarse (véase, por ejemplo Hse et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:9062-9070).

Además, para la elección de las células huésped, factores que afectan la glicosilación durante la producción recombinante de anticuerpos incluyen el modo de crecimiento, la formulación de medios, la densidad de cultivo, la oxigenación, el pH, los esquemas de purificación y similares. Se han propuesto diversos métodos para alterar el patrón de glicosilación logrado en un organismo huésped particular incluyendo introducir o sobreexpresar ciertas enzimas implicadas en la producción de oligosacárido (Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,047,335; 5,510,261 y 5,278,299). La glicosilación, o ciertos tipos de glicosilación, pueden removerse enzimáticamente a partir de la glicoproteina, por ejemplo, utilizando endoglicosidasa H (Endo H), N-glicosidasa F, endoglicosidasa F1 , endoglicosidasa F2, endoglicosidasa F3. Además, la célula huésped recombinante puede manipularse genéticamente para ser defectuosa en ciertos tipos de procesos de polisacáridos. Éstas y técnicas similares son bien conocidas en el arte.

Otros métodos de modificación incluyen utilizar técnicas de acoplamiento conocidas en el arte, que incluyen, pero no se limitan a, medios enzimáticos, sustitución oxidativa y quelación. Las modificaciones pueden utilizarse, por ejemplo, para la unión de etiquetas para inmunoensayo. Los polipéptidos modificados se hacen utilizando procedimientos establecidos en el arte y pueden seleccionarse utilizando ensayos estándar conocidos en el arte, algunos de los cuales se describen en lo siguiente y en los Ejemplos.

En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una región constante modificada que ha incrementado o disminuido la afinidad de unión a un receptor gama Fe humano, es inerte inmunológicamente o parcialmente inerte, por ejemplo, sin activar la lisis mediada por complemento, no estimula las células dependientes de anticuerpo mediadas por citotoxicidad (ADCC), o no se activa la microglia; o se han reducido las actividades (comparadas con el anticuerpo no modificado) en cualquiera o más de lo siguiente: activación de lisis mediada por complemento, estimulación de ADCC, o activación de microglia. Las diferentes modificaciones de la región constante pueden utilizarse para lograr un nivel óptimo y/o combinación de funciones efectoras. Véase, por ejemplo, Morgan et al., Immunology 86:319-324, 1995; Lund et al., J. Immunology 157:4963-9 157:4963-4969, 1996; Idusogie et al., J. Immunology 164.4178-4184, 2000; Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601 , 1989; y Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998. En algunas modalidades, la región constante se modifica como se describe en Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624; Solicitud PCT No. PCT/GB99/01441 ; y/o Solicitud de Patente del Reino Unido No. 9809951.8.

En algunas modalidades, una región constante de anticuerpo puede modificarse para evitar la interacción con el receptor gama Fe y el complemento y sistemas inmunes. Las técnicas para preparación de tales anticuerpos se describen en la WO 99/58572. Por ejemplo, la región constante puede manipularse para parecerse más a regiones constantes humanas para evitar la respuesta inmune si el anticuerpo se utiliza en ensayos clínicos y tratamientos en humanos. Véase, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,997,867 y 5,866,692.

En algunas modalidades, la región constante se modifica como se describe en Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624; Solicitud PCT No. PCT/GB99/01 41 ; y/o Solicitud de Patente del Reino Unido No. 9809951.8. En tales modalidades, el Fe puede ser de lgG2 humano o de lgG4 humano. El Fe puede ser lgG2 humano que contiene la mutación A330P331 a S330S331 (lgG2¿a), en la cual los residuos de aminoácidos se numeran con referencia a la secuencia de lgG2 de tipo silvestre. Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una región constante de lgG4 que comprende las siguientes mutaciones (Armour et al., 2003, Molecular Immunology 40 585-593): E233F234L235 a P233V234A235 (IgG^c), en las cuales la numeración es con referencia a lgG4 de tipo silvestre. En aún otra modalidad, el Fe de lgG4 humano E233F234L235 a P233V234A235 con supresión de G236 (lgG ¿ )- En otra modalidad el Fe es cualquier Fe de lgG4 humano (lgG , lgG4Ab o lgG4Ac) que contiene la mutación S228 a P228 de estabilización de articulación (Aalberse et al., 2002, Immunology 105, 9-19).

En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una región constante de lgG2 de cadena pesada humana que comprende las siguientes mutaciones: A330P331 a S330S331 (la numeración de aminoácido con referencia a la secuencia de lgG2 de tipo silvestre). Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624. En aún otras modalidades, la región constante es aglicosilada para la glicosilación de N-enlazada. En algunas modalidades, la región constante es aglicosilada para glicosilación N-enlazada al mutar el residuo de unión de oligosacáridos y/o los residuos de flanqueo que son parte de la secuencia de reconocimiento de N-glicosilación en la región constante. Por ejemplo, el sitio N297 de N-glicosilación puede mutarse a, por ejemplo, A, Q, K, o H. Véase, Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601 , 1989; y Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998. En algunas modalidades, la región constante es aglicosilada para glicosilación N-enlazada. La región constante puede aglicosilarse para glicosilación N-enlazada enzimáticamente (tal como la remoción de carbohidrato por la enzima PNGasa), o por la expresión en una célula huésped deficiente de glicosilación.

Otras modificaciones de anticuerpo incluyen anticuerpos que se han modificado como se describe en la Publicación PCT No. WO 99/58572. Estos anticuerpos comprenden, además de un dominio de unión dirigido a una molécula objetivo, un dominio efector que tiene una Secuencia de aminoácidoss sustancialmente homologa a toda o parte de una región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina humana. Estos anticuerpos son capaces de unir la molécula objetivo sin activación significativa de la lisis dependiente del complemento, o la destrucción mediada por la célula del objetivo. En algunas modalidades, el dominio efector es capaz de unir específicamente FcRn y/o FcyRIlb. Éstos se basan típicamente en los dominios quiméricos derivados de dos o más dominios CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos modificados de esta manera son particularmente adecuados para su uso en terapia de anticuerpo crónica, para evitar las reacciones inflamatorias y otras reacciones adversas a la terapia de anticuerpo convencional.

En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una región constante modificada que ha incrementado la afinidad de unión para FcRn y/o una vida media de suero incrementada cuando se compara con el anticuerpo no modificado.

En un proceso conocido como "línea germinal", ciertos aminoácidos en las secuencias de VH y VL pueden mutarse para que coincidan con aquellas encontradas naturalmente en las secuencias de VH y VL de línea germinal. En particular, las secuencias de aminoácido de las regiones de estructura en las secuencias de VH y VL pueden mutarse para que coincidan con las secuencias de linea germinal para reducir el riesgo de inmunogenicidad cuando se administre el anticuerpo. Las secuencias de ADN de línea germinal para los genes de VH y VL humanos se conocen en el arte (véase por ejemplo, la base de datos de secuencia de línea germinal humana "Vbase"; véase también Kabat, E. A., et al., 1991 , Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health y Human Services, Publicación NIH No. 91-3242; Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:776-798; y Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:827-836).

Otro tipo de sustitución de aminoácido que puede hacerse es para remover los sitios proteolíticos potenciales en el anticuerpo. Tales sitios pueden ocurrir en una CDR o región de estructura de un dominio variable o en la región constante de un anticuerpo. La sustitución de los residuos de cisterna y la remoción de sitios proteolíticos puede disminuir el riesgo de heterogeneidad en el producto de anticuerpo y por lo tanto incrementa su homogeneidad. Otro tipo de sustitución de aminoácido es para eliminar pares de asparagina-glicina, que forman los sitios de desamidación potenciales, al alterar uno o ambos de los residuos. En otro ejemplo, la lisina C-terminal de la cadena pesada de un anticuerpo de GHR de la invención puede escindirse. En varias modalidades de la invención, las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos de GHR pueden incluir opcionalmente una secuencia de señal.

Una vez que se obtienen los fragmentos de ADN que codifican los segmentos de VH y VL de la presente invención, estos fragmentos de ADN pueden manipularse adicionalmente por técnicas de ADN recombinantes estándares, por ejemplo para convertir los genes de región variable a genes de cadena de anticuerpo de longitud completa, a genes de fragmento de Fab, o a un gen de scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica VL o VH se enlaza operativamente a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o un enlazador flexible. El término "enlazado operativamente", como se utiliza en este contexto, se pretende para significar que los dos fragmentos de ADN se unen de tal manera que la Secuencia de aminoácidoss codificados por los dos fragmentos de ADN permanece en el marco.

El ADN aislado que codifica la región de VH puede convertirse a un gen de cadena pesada de longitud completa al enlazar operativamente el ADN que codifica VH a otra molécula de ADN que codifica las regiones constantes de cadena pesada (CH1 , CH2 y CH3). Las secuencias de genes de región constante de cadena pesada humana se conocen en el arte (véase por ejemplo, Kabat, E. A., et al., 1991, Secuences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health y Human Services, Publicación de NIH No. 91 -3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse por amplificación de PCR estándar. La región constante de cadena pesada puede ser una región constante de Igd, lgG2, lgG3, lgG , IgA, IgE, IgM o IgD, aunque de mayor preferencia es una región constante de IgGi o lgG2. La secuencia de región constante de IgG puede ser cualquiera de los diversos alelos o alotipos conocidos para presentarse entre diferentes individuos, tales como Gm(1), Gm(2), Gm(3), y Gm(17). Estos alotipos representan la sustitución de aminoácido de origen natural en las regiones constantes de lgG1. Para un gen de cadena pesada de fragmento de Fab, el ADN que codifica VH puede enlazarse operativamente a otra molécula de ADN que codifica sólo la región constante de cadena pesada CH1. La región constante de cadena pesada CH1 puede derivarse de cualquiera de los genes de cadena pesada.

El ADN aislado que codificas la región VL puede convertirse a un gen de cadena ligera de longitud completa (así como también un gen de cadena ligera de Fab) al enlazar operativamente el ADN que codifica VL a otra molécula de ADN que codifica la región constante de cadena ligera, CL. Las secuencias de los genes de región constante de cadena ligera humana se conocen en el arte (véase por ejemplo, Kabat, E. A., et al., 1991 , Secuences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health y Human Services, Publicación de NIH No. 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse por amplificación de PCR estándar. La región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda. La región constante kappa puede ser cualquiera de los diversos alelos conocidos para presentarse entre diferentes individuos, tales como lnv(1), lnv(2), y lnv(3). La región constante lambda puede derivarse de cualquiera de los tres genes de lambda.

Para crear un gen scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL se enlazan operativamente a otro fragmento que codifica un enlazador flexible de tal manera que las secuencias de VH y VL pueden expresarse como una proteína de cadena simple contigua, con las regiones VL y VH unidas por el enlazador flexible (Véase por ejemplo, Bird et al., 1988, Science 242.423-426, Huston et al., 1988, Proa Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554. Un ejemplo de un péptido de enlace es (GGGGS)3 (SEQ ID NO: 144), que se puentea aproximadamente 3.5 nm entre el término carboxi de una región variable y el término amino de la otra región variable. Los enlazadores de otras secuencias se han diseñado y utilizado (Bird et al., 1988, supra). Los enlazadores pueden a su vez modificarse para funciones adicionales, tales como unión de fármacos o unión a soportes sólidos. El anticuerpo de cadena simple puede ser monovalente, si sólo se utiliza un VH y VL simple, bivalente, si se utilizan dos VH y VL, o polivalente, si se utilizan más de dos VH y VL. Los anticuerpos biespecíficos o polivalentes que pueden generarse se unen específicamente a GHR y a otra molécula. Las variantes de cadena simple pueden producirse ya sea recombinante o sintéticamente. Para la producción sintética de scFv, puede utilizarse un sintetizador automatizado. Para la producción recombinante de scFv, un plásmido adecuado que contiene polinucleótido que codifica el scFv puede introducirse en una célula huésped adecuada, ya sea eucariótica, tal como células de levadura, planta, insecto o mamíferos, o procariótica tal como E. coli. Los polinucleótidos que codifican el scFv de interés pueden hacerse por manipulaciones de rutina tales como la ligación de polinucleótidos. El scFv resultante puede aislarse utilizando técnicas conocidas en el arte de purificación de proteina estándar.

Otras formas de anticuerpos de cadena simple, tales como diacuerpos, también se abarcan. Los diacuerpos son bivalentes, anticuerpos biespecíficos en los cuales VH y VL se expresan en una cadena de polipéptido simple, aunque utilizando un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamieto entre los dos dominios en la misma cadena, forzando así a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión de antígenos (véase por ejemplo, Holliger, P., et al., 1993, Proc. Nati. Acad Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al., 1994, Structure 2:1 21-1123).

Los anticuerpos heteroconjugados, que comprenden dos anticuerpos unidos covalentemente, también se encuentran dentro del alcance de la invención. Tales anticuerpos se han utilizado para células del sistema inmune objetivo para células no deseadas (Patente de los Estados Unidos No. 4,676,980), y para el tratamiento de infección por VIH (Publicaciones PCT Nos. WO 91/00360 y WO 92/200373; EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados pueden hacerse utilizando cualesquier métodos de reticulación convenientes. Los agentes de reticulación adecuados y las técnicas son bien conocidas en el arte, y se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 4,676,980.

Los anticuerpos quiméricos o híbridos también pueden prepararse in vitro utilizando métodos conocidos de química de proteína sintética, incluyendo aquellos que implican agentes de reticulación. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden construirse utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o al formar un enlace de tioéter. Ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato.

La invención también abarca las proteínas de fusión que comprenden uno o más fragmentos o regiones de los anticuerpos descritos en la presente. En algunas modalidades, un anticuerpo de fusión puede hacerse que comprenda toda o una porción de un anticuerpo de GHR de la invención enlazado a otro polipéptido. En otra modalidad, sólo los dominios variables del anticuerpo de GHR se enlazan al polipéptido. En otra modalidad, el dominio de VH de un anticuerpo de GHR se enlaza a un primer polipéptido, mientras que el dominio de VL de un anticuerpo de GHR se enlaza a un segundo polipéptido que se asocia con el primer polipéptido en una forma tal que los dominios de VH y VL pueden interactuar entre si para formar un sitio de unión de antígeno. En otra modalidad preferida, el dominio de VH se separa del dominio de VL por un enlazador de tal manera que los dominios de VH y VL pueden interactuar entre sí. El anticuerpo de VL en el enlazador de VH entonces se enlaza al polipéptido de interés. Además, los anticuerpos de fusión pueden crearse en los cuales dos (o más) anticuerpos de cadena simple se enlazan entre sí. Esto es útil si uno quiere crear un anticuerpo divalente o polivalente en una cadena de polipéptido simple, o si uno quiere crear un anticuerpo biespecífico.

En algunas modalidades, un polipéptido de fusión se proporciona que comprende al menos 10 aminoácidos contiguos de la región de cadena ligera variable mostrada en los SEQ ID NOs: 7, 9, 1 1 , 13 ó 14 y/o al menos 10 aminoácidos de la región de cadena pesada variable mostrados en las SEQ ID NOs: 8, 10 ó 12. En otras modalidades, se proporciona un polipéptido de fusión que comprende al menos alrededor de 10, al menos alrededor de 15, al menos alrededor de 20, al menos alrededor de 25, o al menos alrededor de 30 aminoácidos contiguos de la región de cadena ligera variable y/o al menos alrededor de 10, al menos alrededor de 15, al menos alrededor de 20, al menos alrededor de 25, o al menos alrededor de 30 aminoácidos contiguos de la región de cadena pesada variable. En otra modalidad, el polipéptido de fusión comprende una región variable de cadena ligera y/o una región variable de cadena pesada, como se muestra en cualquiera de los pares de secuencia seleccionados de entre las SEQ ID NOs: 7 y 8, 9 y 10, 11 y 12, 13 y 8, y 14 y 8. En otra modalidad, el polipéptido de fusión comprende una o más CDR. En aún otras modalidades, el polipéptido de fusión comprende CDR3 de VH y/o CDR3 de VL. Para propósitos de esta invención, una proteína de fusión contiene uno o más anticuerpos y otra Secuencia de aminoácidoss a la cual no se conecta en la molécula nativa, por ejemplo, una secuencia heteróloga o una secuencia homologa de otra región. Las secuencias heterólogas ejemplares incluyen, pero no se limitan a una "etiqueta" tal como etiqueta FLAG o una etiqueta 6His. Las etiquetas se conocen bien en la técnica.

Un polipéptido de fusión pueden crearse por métodos conocidos en el arte, por ejemplo, sintética o recombinantemente. Típicamente, las proteínas de fusión de esta invención se hacen al preparar una expresión de un polinucleótido que lo codifica utilizando métodos recombinantes descritos en la presente, aunque también pueden prepararse por otros medios conocidos en el arte, que incluyen, por ejemplo, síntesis química.

En otras modalidades, otros anticuerpos modificados pueden prepararse utilizando moléculas de ácido nucleico que codifican el anticuerpo de GHR. Por ejemplo, "los cuerpos Kappa" (III et al., 1997, Protein Eng. 10:949-57), "Minicuerpos" (Martin et al., 1994, EMBO J. 13:5303-9), "Diacuerpos" (Holliger et al., supra), o "Janusinos" (Traunecker et al., 1991 , EMBO J 10:3655-3659 y Traunecker et al., 1992, Int. J. Cáncer (Suppl.) 7:51-52) pueden prepararse utilizando técnicas biológicas moleculares estándares después de las enseñanzas de la especificación.

Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos, los anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes, pueden prepararse utilizando los anticuerpos descritos en la presente. Los métodos para fabricar anticuerpos biespecíficos se conocen en el arte (véase, por ejemplo, Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121 :210). Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos o fragmentos de unión de antígeno pueden producirse por fusión de hibridomas o enlaces de fragmentos de Fab. Véase, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 , Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina, con las dos cadenas pesadas que tienen especificidades diferentes (Millstein y Cuello, 1983, Nature 305, 537-539). Además, los anticuerpos biespecíficos pueden formarse como "diacuerpos" o "Janusinos." En algunas modalidades, el anticuerpo biespecífico se une a dos epítopes diferentes de GHR. En algunas modalidades, los anticuerpos modificados descritos en lo anterior se preparan utilizando uno o más de los dominios variables o regiones de CDR de un anticuerpo de GHR proporcionado en la presente.

De acuerdo con un procedimiento para hacer los anticuerpos biespecíficos, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios que combinan anticuerpo-antigeno) se fusionan a secuencias de región constante de inmunoglobulina. La fusión de preferencia es con una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de la articulación, las regiones CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1), que contiene el sitio necesario para unir la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan hacia un organismo huésped adecuado. Esto proporciona mayor flexibilidad al ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en modalidades cuando las relaciones desiguales de las tres cadenas de polipéptido utilizadas en la construcción proporcionan las producciones óptimas. Sin embargo es posible insertar las secuencias de codificación para dos o las tres cadenas de polipéptido en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptido en relaciones iguales resulta en alta producción o cuando las relaciones no son de significancia particular.

En un procedimiento, los anticuerpos biespecíficos se componen de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Esta estructura asimétrica, con una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula biespecífica, facilita la separación del compuesto biespecífico deseado a partir de combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas. Este procedimiento se describe en la Publicación PCT No. WO 94/04690.

Esta invención también proporciona composiciones que comprenden anticuerpos conjugados (por ejemplo, enlazados) a un agente que facilita el acoplamiento a un soporte sólido (tal como biotina o avidina). Para simplicidad, se hará referencia generalmente a anticuerpos con el entendimiento de que estos métodos se aplican a cualquiera de las modalidades de unión y/o antagonistas de GHR descritos en la presente. La conjugación generalmente se refiere a enlazar estos componentes como se describe en la presente. El enlace (el cual generalmente se fija a estos componentes en asociación próxima al menos para administración) puede lograrse en cualquier número de formas. Por ejemplo, una dirección directa entre un agente y un anticuerpo es posible cuando cada uno posee un sustituyente capaz de reaccionar con el otro. Por ejemplo, un grupo nucleofílico, tal como un grupo amino o sulfhidrilo, en uno puede ser capaz de reaccionar con un grupo que contiene carbonilo, tal como un anhídrido o un haluro ácido, o con un grupo alquilo que contiene un buen grupo saliente (por ejemplo, un haluro) en el otro.

Los anticuerpos pueden enlazarse a muchos portadores diferentes. Los portadores pueden ser activos y/o inertes. Ejemplos de portadores bien conocidos incluyen polipropileno, poliestireno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, vidrio, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del portador puede ser ya sea soluble o insoluble para propósitos de la invención. Aquellos con experiencia en la técnica sabrán de otras portadores adecuados para unir anticuerpos, o serán capaces de determinarlos, utilizando experimentación de rutina.

Un anticuerpo o polipéptido de esta invención puede enlazarse a un agente de etiquetado tal como una molécula fluorescente, una molécula radioactiva o cualesquier otras etiquetas conocidas en el arte. Las etiquetas se conocen en el arte que proporcionan generalmente (ya sea directa o indirectamente) una señal.

Polinucleótidos, vectores, y células huésped La invención también proporciona polinucleótidos que codifican cualquiera de los anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpos y anticuerpos modificados descritos en la presente, tales como, anticuerpos que tienen funciones efectoras alteradas. En otro aspecto, la invención proporciona un método para fabricar cualquiera de los polinucleótidos descritos en la presente. Los polinucleótidos pueden hacerse y expresarse por procedimientos conocidos en el arte. Por consiguiente, la invención proporciona polinucleótidos o composiciones, que incluyen composiciones farmacéuticas, que comprenden polinucleótidos, que codifican cualquiera de los siguientes: los anticuerpos SS1 , SS3, SS4, TM1 o TM9 o cualquier fragmento o parte de los mismos que tienen la capacidad de antagonizar GH .

Los polinucleótidos complementarios a cualquiera de tales secuencias también se abarcan por la presente invención. Los polinucleótidos pueden ser de una sola hebra (codificante o antisentido) o de doble hebra, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc o sintético) o ARN. Las moléculas de ARN incluyen moléculas de HnARN, las cuales contienen intrones y corresponden a una molécula de ADN en una forma de uno a uno, y las moléculas de ARNm, las cuales no contienen intrones. Las secuencias de codificación o sin codificación adicionales pueden, aunque no necesitan, presentarse dentro de un polinucleótido de la presente invención, y un polinucleótido puede, aunque no necesita, enlazarse a otras moléculas y/o materiales de soporte.

Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifica un anticuerpo o un fragmento del mismo) o puede comprender una variante de tal secuencia. Las variantes de polinucleótido contienen una o más sustituciones, adiciones, supresiones y/o inserciones de tal manera que la inmunoreactividad del polipéptido codificado no se disminuye, en relación con una molécula inmunoreactiva nativa. El efecto en la inmunoreactividad del polipéptido codificado puede evaluarse generalmente como se describe en la presente. Las variantes de preferencia exhiben al menos alrededor de 70% de identidad, de mayor preferencia, al menos alrededor de 80% de identidad, aún de mayor preferencia, al menos alrededor de 90% de identidad, y de mayor preferencia, al menos alrededor de 95% de identidad a una secuencia de polinucleótido que codifica un anticuerpo nativo o un fragmento del mismo.

Dos secuencias de polinucleótido o polipéptido se dice que son "idénticas" si la secuencia de nucleótidos o aminoácidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinean para correspondencia máxima como se describe en lo siguiente. Las comparaciones entre las dos secuencias se realizan típicamente al comparar las secuencias sobre una ventana de comparación para identificar y comparar las regiones locales de similaridad de secuencia. Una "ventana de comparación" como se utiliza en la presente, se refiere a un segmento de al menos alrededor de 20 posiciones contiguas, usualmente 30 a alrededor de 75, ó 40 a alrededor de 50, en las cuales una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que dos secuencias se alinean óptimamente.

La alineación óptima de secuencias para comparación puede conducirse utilizando el programa MegAlign® en el paquete Lasergene® de software de bioinformática (DNASTAR®, Inc., Madison, Wl), utilizando parámetros por defecto. Este programa incorpora diversos esquemas de alineación descritos en las siguientes referencias: Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Secuence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment y Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. y Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. y Muller W., 1988, CABIOS 4:1 1-17; Robinson, E.D., 1971 , Comb. Theor. 1 1 :105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. y Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principies y Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. y Lipman, D.J., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80:726-730.

De preferencia, el "porcentaje de identidad de secuencia" se determina al comparar dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación de al menos 20 posiciones, en donde la porción de la secuencia de polinucleótido o polipéptido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, espacios) de 20 por ciento o menos, usualmente 5 a 15 por ciento, o 10 a 12 por ciento, cuando se compara con las secuencias de referencia (las cuales no comprenden adiciones o supresiones) para alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula al determinar el número de posiciones en las cuales las bases de ácido nucleico idénticas o el residuo de aminoácido se presenta en ambas secuencias para producir el número de posiciones, que dividen el número de posiciones residentes por el número total de posiciones en la secuencia de referencia (es decir, el tamaño de ventana) y que multiplican los resultados por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia.

Las variantes también pueden, o de manera alternativa, son sustancialmente homologas a un gen nativo, o una porción o complemento del mismo. Tales variantes de polinucleótido son capaces de hibridar bajo condiciones moderadamente rigurosas para una secuencia de ADN de origen natural que codifica un anticuerpo nativo (o una secuencia complementaria).

Las "condiciones moderadamente rigurosas" adecuadas incluyen prelavar en una solución 5 X SSC, SDS al 0.5%, 1.0 mM EDTA (pH 8.0); hibridizar 50°C-65°C, 5 X SSC, durante la noche; seguido por el lavado dos veces a 65°C durante 20 minutos con cada uno de 2X, 0.5X y 0.2X SSC que contiene 0.1 % SDS.

Como se utiliza en la presente, las "condiciones altamente rigurosas" o "condiciones de alta rigurosdad" son aquellas que: (1) emplean baja resistencia iónica y alta temperatura para lavar, por ejemplo, cloruro de sodio 0.015 M/citrato de sodio 0.0015 M/dodecil sulfato de sodio al 0.1% a 50°C; (2) emplear durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bobino al 0.1%/Ficoll a 0.1%/polivinilpirrolidona al 0.1%/regulador de fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42°C; o (3) emplear formamida al 50%, 5 x SSC (NaCI 0.75 M, citrato de sodio 0.075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio al 0.1%, 5x de solución Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 pg/ml), SDS al 0.1%, y sulfato de dextrano al 10% a 42°C, con lavados a 42°C en 0.2x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y formamida al 50% en 55°C, seguido por un lavado de alta rigurosidad que consiste de 0.1x SSC que contiene EDTA a 55°C. El técnico especializado reconocerá cómo ajustar la temperatura, la resistencia iónica, etc., cuando sea necesario para acomodar los factores la longitud de sonda y similares.

Se apreciará por aquellos con experiencia ordinaria en el arte que, como resultado de la degeneración del código genético, existen muchas secuencias de nucleótido que codifican un polipéptido como se describe en la presente. Algunos de estos polinucleótidos portan homología mínima a la secuencia de nucleótido de cualquier gen nativo. No obstante, los polinucleótidos que varían debido a las diferencias en el uso de codón se contemplan específicamente por la presente invención. Además, los alelos, de los genes que comprenden las secuencias de polinucleótido proporcionados en la presente se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Los alelos son genes endógenos que se alteran como resultado de una o más mutaciones, tal como supresiones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos. El ARNm resultante y la proteína pueden, aunque no necesariamente, tener una estructura o función alterada. Los alelos pueden identificarse utilizando técnicas estandarizadas (tales como hibridación, amplificación y/o comparación de secuencia de base de datos).

Los polinucleótidos de esta invención pueden obtenerse utilizando síntesis química, métodos recombinantes, o PCR. Los métodos para síntesis de polinucleótido química se conocen bien en el arte y no necesitan describirse en detalle en la presente. Alguien de experiencia en el arte puede utilizar las secuencias proporcionadas en la presente y un sintetizador de ADN comercial para producir una secuencia de ADN deseada.

Para preparar polinucleótidos utilizando métodos recombinantes, un polinucleótido que comprende una secuencia deseada puede insertarse en un vector adecuado, y el vector a su vez puede introducirse en una célula huésped adecuada para replicación y amplificación, como se discute adicionalmente en la presente. Los polinucleótidos pueden insertarse en células huéspedes por cualquier medio conocido en el arte. Las células se transforman al introducir un polinucleótido exógeno por la incorporación directa, endocitosis, transfección, F-apareamiento o electroporación. Una vez introducido, el polinucleótido exógeno puede mantenerse dentro de la célula como un vector no integrado (tal como plásmido) o integrarse en el genoma de la célula huésped. El polinucleótido así amplificado puede aislarse de la célula huésped por métodos bien conocidos dentro del arte. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989.

Alternativamente, PCR permite la reproducción de las secuencias de ADN. La tecnología de PCR es bien conocida en el arte y se describe en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,683,195, 4,800,159, 4,754,065 y 4,683,202, asi como PCR: La Reacción en Cadena de Polimerasa, Mullís et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994.

El ARN puede obtenerse al utilizar el ADN aislado en un vector apropiado e insertarlo en una célula huésped adecuada. Cuando la célula se replica y el ADN se transcribe en ARN, el ARN puede entonces aislarse utilizando métodos bien conocidos por aquellos con experiencia en el arte, como se establece en Sambrook et al., 1989, supra, por ejemplo.

Los vectores de clonación adecuados pueden construirse de acuerdo con técnicas estándares, o pueden seleccionarse a partir de un gran número de vectores de clonación disponibles en el arte. Aunque el vector de clonación seleccionado puede variar de acuerdo con la célula huésped pretendida para utilizarse, los vectores de clonación útiles generalmente tendrán la capacidad de auto-replicarse, pueden poseer un único objetivo para una endonucleasa de restricción particular, y/o pueden llevar los genes para un marcador que puede utilizarse en selección de clones que contienen el vector. Ejemplos adecuados incluyen plásmidos y virus bacterianos, por ejemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por ejemplo, pBS SK+) y sus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1 , pCR1 , RP4, ADN de fagos, y vectores de colección tales como pSA3 y pAT28. Éstos y muchos otros vectores de clonación se encuentran disponibles a partir de vendedores comerciales tales como BioRad, Strategene, e Invitrogen.

Se proporcionan adicionalmente los vectores de expresión. Los vectores de expresión generalmente son constructos de polinucleótido replicables que contienen un polinucleótido de acuerdo con la invención. Se implica que un vector de expresión debe ser replicable en las células huésped ya sea como episomas o como una parte integral del ADN cromosomal. Los vectores de expresión adecuados incluyen pero no se limitan a plásmidos, vectores virales, incluyendo adenovirus, virus adeno-asociados, retrovirus, cósmidos, y vectores de expresión descritos en la Publicación PCT No. WO 87/04462. Los componentes de vector pueden incluir generalmente, aunque no se limitan a, uno o más de lo siguiente: una secuencia de señal; un origen de replicación; uno o más genes marcadores; elementos de control transcripcional adecuados (tales como promotores, mejoradores y terminadores). Para expresión (es decir, traducción), uno o más elementos de control translacional también se utilizan usualmente, tales como sitios de unión de ribosoma, sitios de iniciación de traducción, y codones de parada.

Los vectores que contienen los polinucleótidos de interés pueden introducirse en la célula huésped por cualquiera de un número de medios apropiados, que incluyen electroporación, transfección que emplea cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrano, u otras sustancias; bombardeo con microproyectiles; lipofección; e infección (por ejemplo, en donde el vector es un agente infeccioso tal como un virus de vaccina). La selección de vectores de introducción o polinucleótidos dependerá de las características de la célula huésped.

La invención también proporciona célula huéspeds que comprende cualquiera de los polinucleótidos descritos en la presente. Cualquier célula huéspeds capaces de sobre-expresar los ADNs heterólogos pueden utilizarse para el propósito de aislar los genes que codifican el anticuerpo, polipéptido o proteína de interés. Ejemplos no limitantes de células huésped mamíferos incluyen pero no se limitan a células COS, HeLa, y CHO. Véase también la publicación PCT N° WO 87/04462. Las células huésped son de mamífero adecuadas incluyen procariotas (tales como E. coli o B. subtilis) y levadura (tales como S. cerevisiae, S. pombe; o K. lactis). De Preferencia, las célula huésped expresan los ADNc en un nivel de alrededor de 5 veces más, de mayor preferencia, 10 veces más, incluso de mayor preferencia 20 veces más que aquella del aticuerpo endógeno correspodiente o proteína de interés, si esta presente, en los células huésped. La selección de las células huésped para un área en especifica GHR un dominio GHR se efectúa mediante un inmunoensayo o FACS. Una célula que sobreexpresa el anticuerpo o proteína de interés puede identificarse.

Un vector de expresión puede utilizarse para dirigir la expresión de un anticuerpo antagonista de GHR. Alguien con experiencia en el arte está familiarizado con administración de factores de expresión para obtener la expresión de una proteína exógena in vivo. Véase, por ejemplo, Las patente de E.U. Nos. 6.436.908; 6,413,942; y 6.376.471. Administración de Vectores expresión incluyen la administración local o sistémica, incluyendo inyección, administración oral, pistola de partículas o administración cateterizada, y administración tópica. En otra modalidad, el vector de expresión se administra directamente al tronco simpático o ganglio, o en una arteria coronaria, el atrio, ventrical, o pericardio.

El suministro dirigido de composiciones terapéuticas que contienen un vector de expresión, o polinucleótidos subgenómicos también pueden utilizarse. Las técnicas de suminstro de ADN mediadas por receptor, se descrien en, por ejemplo, Findeis et al, Trends Biotechnol, 1993, 1 1 :202; Chiou et al, Gene Therapeutics: Metods and Aplicaciones de la transferencia genética directa, Findeis et al., Trends Biotechnol., 1993, 1 1 :202; Chiou et al., Gene Therapeutics. Methods Y Applications Of Direct Gene Transfer, J.A. Wolff, ed., 1994; Wu et al. , J. Biol. Chem., 1988, 263:621 ; Wu et al., J. Biol.

Chem., 1994, 269:542; Zenke et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1990, 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem., 1991 , 266:338. Las composiciones terapéuticas que contienen un polinucleótido se administran en un margen de alrededor de 100ng de un alrededor de 200mg de ADN para administración local en un protocolo de terapia de gen. Las concentraciones varian de alrededor de 500ng de un alrededor de 50mg, alrededor de 1 pg una alrededor de 2mg, 5pg alrededor de un alrededor de 500 mg, y alrededor de 20mg una alrededor de 100pg de ADN también se puede utilizar durante un protocolo de terapia de gen. Los polinucleótidos terapéuticos Y polipéptidos pueden suministrarse utilizando vehículos de suministro de gen. El vehículo de suministro gen puede ser de origen viral o no viral (see, genertodasy, Jolly, Cáncer Gene Therapy, 1994, 1.51 ; Kimura, Humano Gene Therapy, 1994, 5:845; Connelly, Humano Gene Therapy, 1995, 1 :185; y Kaplitt, Nature Genetics, 1994, 6:148). La expresión de tales secuencias de codificación se puede inducir usando mamíferos endógenos o promotores heterólogos. La expresión de la secuencia de codificación puede ser constitutiva o regulada.

Los vectores de base viral para el suministro de un polinucleótido deseado y de expresión en una célula deseada se conocen bien en el arte. Los vehículos de base viral ejemplares incluyen, pero no se limitan a, retrovirus recombinantes (véase, por ejemplo, la publicación PCT N° WO 90/07936, WO 94/03622, WO 93/25698, WO 93/25234, WO 93/1 1230, WO 93/10218, WO 91/02805; Patente de la UE N° 5, 219,740 y 4,777,127; Patente GB N° 2.200.651 , patente EP y N° 0 345 242), Los vectores a base de alfavirus (por ejemplo, Vectores de virus Sindbis, virus de los bosques Semliki (ATCC VR-67, ATCC VR-1247), el virus del río Ross (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) del virus de la encefalitis equina de Venezuela y (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249, ATCC VR -532)), y vecores del virus adeno-asociado (AAV) (véase, por ejemplo, las publicaciones PCT N° WO 94/12649, WO 93/03769, WO 93/19191 , WO 94/28938, WO 95/1 1984 y WO 95/00655). La administración de ADN enlazado a adenovirus muertos como se describe en Curiel, Hum. Gene Ther., 1992, 3:147 también se pueden emplearse.

Vehículos de suministro no virales y métodos también se pueden emplearse, incluyendo, pero no limitados a, ADN condensada policatiónico enlazado o no enlazado a adenovirus muerto sólo (véase, por ejemplo, Curiel, Hum Gene Ther, 1992, 3:147); ADN enlazado ligado Ligy-(ver, por ejemplo, Wu, J. Biol. Chem., 1989, 264:16985); células de vehículos de suministro de células eucarióticas (véase, por ejemplo, Patente de la UE N° 5.814.482; publicación PCT N° WO 95/07994, WO 96/17072, WO 95/30763; y WO 97/42338) y la neutralización o fusión de carga nucléica con membranas celulares. El ADN desnudo también puede emplearse. Los métododos introducción de ADN desnuda ejemplares se describen en la publicación PCT N° WO 90/11092 y Patente de la UE N° 5.580.859. Los liposomas que pueden actuar como vehículos suministro gen se describen en la patente de la UE N° 5.422.120; Las publicaciones PCT N° WO 95/13796; WO 94/23697, WO 91/14445; y EP 0524968. Los procedimientos adicionales se describen en Philip, Mol. Célula Biol., 1994, 14:241 1 , y en Woffendin, Proc. Nati. Acad.

Ciencia., 1994, 91 : 1581.

Composiciones La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprende una cantidad efectiva de un anticuerpo de GHR descrita en la presente. Ejemplos de tales composiciones, asi como la manera de formular, también se describen en el presente documento. En algunas modalidades, la comprende una o más anticuerpos de GHR. En otras modalidades, los anticuerpos de GHR reconoce GHR. En otras modalidades, el anticuerpo de GHR es un anticuerpo humano. En otras modalidades, el anticuerpo de GHR es un anticuerpo humanizado. En algunas modalidades, el anticuerpo de GHR comprende una región constante que es capaz de desencadenar una respuesta inmune deseada, tal como lisis mediada por anticuerpo o ADCC. En otras modalidades, del anticuerpo de GHR comprende una región constante que no desencadena una respuesta inmune indeseada no pretendible o indeseable, que comprende una o más de CDR del anticuerpo (tal como uno, dos, tres, cuatro, cinco, o, en algunas modalidades, en todos los CDRs).

Se entenderá que las composiciones pueden comprender más de un anticuerpo antagonista de GHR (por ejemplo, una mezcla de anticuerpos antagonistas de GHR que reconocen diferentes epitopos de GHR). Otras composiciones ejemplares comprenden más de un anticuerpos antagonistas de GHR que reconocen el mismos epitopes, o diferentes especies de antagonistas anticuerpos de GHR que se unen a diferentes epítopes de GHR.

La composiciones utilizadas en la presente invención pueden comprender además portadores farmacéuticamente aceptables, excipientes estabilizadores (Remington: The Science y practice of Pharmacy 20th Ed. (2000), En forma de formulaciones liofilizadas las soluciones acuosas. Los portadores acceptables excipientes, o estabilizadores son no tóxicos a los receptores en las dosis y la concentraciones, y pueden comprender reguladoras tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; Los antioxidantes incluyen ácido ascórbico y metionina; Conservadores (Tales cómo cloruro de octadecildimetilbenzil amonio; cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol de butílico bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol, resorcinol; ciclohexanol: 3-pentanol, y m-cresol); polipetio de bajo peso molecular (de menos de alrededor de 10 residuos); proteínas, tales como suero de albúmina, gelatina, las inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilfirolidona; aminoácidos tales glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, lisina; monosacáridos , disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen a glucosa, mañosa, el dextrano; Agentes quelantes tales como el EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa sorbitol; contraiones que forman de sales tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo complejo de proteínas-Zn), y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG). Los excipientes farmacéuticamente aceptables se describen adicionalmente en el presente.

El anticuerpo antagonista de GHR y las composiciones de los mismos también puede utilizarse junto con agentes que sirven para mejorar y/o complementar la eficacia de los agentes.

La invención también proporciona composiciones, que incluye composiciones farmacéuticas, que comprende cualquiera de los polinucleótidos de la invención. En algunas modalidades, la composición comprende un vector de expression que comprende un polinucleótido que codifica el anticuerpo como se describe en la presente. En otra modalidad, la composición comprende un vector de expression que comprende un polinucleótido que codifica el anticuerpo como se describe en la presente. En otra modalidad, la composición comprende un vector especial que comprende un polinucleótido que codifica cualquiera de los anticuerpos decritos en la presente. La composición comprende ya sea cualquiera o ambos de los polinucleótidos mostrados en SEQ ID NO: 142 y SEQ ID NO: 143 siguientes. Las secuencias de ácido nucleico que codifican la cadena pesada y ligera de SS1 el anticuerpo antagonista de GHR hlgG2Aa se muestra en lo siguiente: SS1 hlgG2Aa cadena pesada: GAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGAAAC CTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCA GCGACGCCTGGATGGACTGGGTGCGCCAGGCCCCTGGCAAGGGACTGG AATGGGTGGCCGAGATCAGAAGCAAGGCCAACTATCACGCCACCTACTA CGCCGAGAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACGACAGCAA GAACACCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAAACCGAGGACACCGCC GTGTACTACTGCACCCTGATTAGAGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGG TCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGC GCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCT GGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGC GCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAG GACTCTACTCCCTCAGCAGCGTAGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGG CACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAG GTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCC CAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACC CAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTG GTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGG ACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTT CAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCGTGCACCAGGAC TGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCC CATCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGA ACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAAC CAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCG CCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA CACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTC ACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCG TGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTG TCTCCGGGTAAA (SEQ ID NO: 142) SS1 hlgG2Aa cadena ligera: GAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCGGCACCCTGTCTCTGA GCCCTGGCGAGAGAGCCACCCTGAGCTGTACCGCCACCAGCAGCGTGT CCAGCAGCTACCTGAATTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAG ACTGCTGATCTACAGCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCATCCCCGACAGA TTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCCGGC TGGAACCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCACCAGTACCACAGAAG CACCCCCACCTTCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTG GCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATC TGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGG CCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCA GGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGC AGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACG CCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTT CAACAGGGGAGAGTGT (SEQ ID NO. 143) Kits La invención también proporciona kits que comprenden cualquiera o todos de los anticuerpos descritos en la presente. Los Kits de la invención incluyen uno o más contenedores que comprenden un anticuerpo antagonista de GHR descrito en la presente e instrucciones para su uso de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención descritos en la presente. Generalmente, estas instrucciones comprenden una descripción de la administración de la antagonista de GHR para los traramientos terapéuticos descritos en lo anterior. En algunas modalidades, los kits se proporcionan para producir una unidad de administración de dosis simple. En ciertas modalidades, el kit puede contener ambos de un primer contendor que tiene una proteína seca y un segundo contenedor que contiene una formulación acuosa. En ciertas modalidades, los kits que contienen jeringas pre-cargadas simples y cámaras múltiples (por ejemplo, jeringas liquidas y liojeringas) se incluyen.

En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En algunas modalidades, el anticuerpo monoclonal. Las instrucciones con relación al uso de un anticuerpo de GHR generalmente incluyen la información en cuanto a la dosificación, programa de dosis, ruta de administración para el tratamiento pretendido. Los contenedores pueden ser de dosis unitarias, envases a granel (por ejemplo, paquetes de dosis múltiple) o dosis en subunidades. Las instrucciones suministradas en los kits de la invención, son instrucciones escritas típicamente en una etiqueta o inserto de empaque (por ejemplo, una hoja de papel incluida en el kit), aunque las instrucciones legibles por máquina (por ejemplo, instrucciones transportadas en una o disco de almacenamiento magnético u óptico) también son aceptables.

Los kits de esta invención son en un empaque adecuado. El empaque adecuado incluye, pero no se limita a, frascos, botellas, jarras, empaques flexibles (por ejemplo, Mylar sellado o bolsas de plástico), y similares. También se contemplan los empaques para su uso en combinación un dispositivo específico, tal como un inhalador, dispositivo de administración nasal (por ejemplo, un atomizador) o un dispositivo de infusión tal como una minibomba. Un kit puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo los contenedores pueden ser una bolsa de solución intravenosa un frasco que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Los contenedores también puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo los contenedores puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de GHR. El contenedor puede comprender además un segundo agente farmacéuticamente activo.

Los kits pueden proporcionar adicionalmente composiciones adicioales tales como reguladores e información interpretativa. Normalmente, el kit comprende un contenedor y una la etiqueta o insertos de paquete en o asociados con el contenedor.

Depósito Biológico Los materiales representeativos de la presente invención presente se depositan en la colección de cultivos de tipo americano, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20.1 10-2209, EE.UU., el 22 de diciembre de 201 1. El vector SS1-HC que tiene un numero de acceso de ATCC PTA- 12352 es un polinucleótido que codifica la región variable de cadena ligera SS1 , y el vector SS1-LC qur tiene un número de accseso ATCC PTA- 12353 es un polinucleótido que codifica la región variable de cadena ligera de SS1. Los depósitos se realizaron bajo las provisión del tratado de Budapest en el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para el proposito de procediemitnos y regulaciones de patentes bajo el mismo (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de cultivos viables que el depósito durante 30 años a partir de la fecha de depósito. El depósito se hará disponible por la ATCC bajo los términos, del Tratado de Budapest, sujeto a un acuerdo entre Pfizer , Inc. y ATCC, que asegura la disponibilidad permanente y sin restricciones de la progenie del cultivo del depósito al público tras la publicación de el pertinente EE.UU. tras abrir al público de cualquier solicitud de patente de EE.UU. o del extranjero, lo que ocurra primero, y asegura la disponibilidad de la progenie de aquel determinado por el comisionado de patentes y marcas de EE UU para tener derecho del mismo de acuerdo con 35 USC EE.UU. Sección 122 y las reglas del comisionado en virtud de ellas (incluyendo 37 C.F.R. Sección 1.14 con referencia en particular a 886 OG 638).

El cesionario de la presente solicitud ha acordado que si un cultivo de los materiales en el depósito muriera o se pierdera o destruyera cuando se cultiva bajo condiciones adecuadas, los materiales serán reemplazadas rápidamente en notificación con otro de los mismos. La disponibilidad del material depositado no debe interpretarse como una licencia para practicar la invención en contravención de los derechos otorgados bajo la autoridad de cualquier gobierno las leyes de patentes.

Los siguientes ejemplos se ofrecen para propósitos ilustrativos solamente, y no se pretende limitar el alcance de la presente invención de ninguna forma. De hecho, diversas modificaciones de la invención, además de aquellas mostradas y descritas en la presente se volverán aparentes para aquellos con experiencia en el arte a partir de la descripción y cae del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Generación y Selección de anticuerpos antagonistas de GHR Procedimientos generales para inmunización de los animales para la generar anticuerpos monoclonales Se inyectaron ratones Balb/c 4 veces en los días 0, 3, 6 y 9 con 25ug gel antígeno hGHR/Fc R & D Systems™ No. Cat 1210-GR-050. Duante las primeras 4 inyecciones, el antígeno se preparó al mezclar las proteínas recombinantes con el adyuvante Gerbu siguido del protocolo y agitación por vértex. El inmunógeno se dió a través de inyección a la piel del cuello, en las almohadillas de las patas e intraperitonealmente. El último refuerzo, en el día 11 , se administró iv, CONOUT sin adyuvante. El día 15, los ratones se sacrificaton y sus bazos se removieron. Los linfocitos se inmortalizaron por fusión con una línea celular establecida para hacer clones de hibridoma usando tecnología de hibridomas estándar distribuidos en placas de 96 pozos. Los clones se dejaron crecer, y a después, se seleccionaron por el cribado de ELISA utilizando el antígeno de inmunización como se describe a continuación.

El Cribado de ELISA de anticuerpos El medio sobrenadante de cultivo clones de hibridoma se cribaron por separado para su capacidad para unirse al GHR/hFc humano recombinante. El ensayo se realizó con placas de 96 pozos revestidas durante la noche con 50µ? de una solución de pg/ml del antígeno. Los reactivos en exceso se lavaron de los pozos entre cada paso con PBS que contiene Tween™-20 al 0.05%. El sobrenadante se agregó a las placas y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. El Fe de cabra anti ratón conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) se agregó para unir los anticuerpos de ratón y se enlazan al antígeno. ABTS (Sal de diaamonio de 2 2'-Azino-bis (ácido 3) etilbenzotiazolin-6-Sulfónico)), se agregó entonces como sustrato para HRP para detectar la cantidad de anticuerpo de ratón presenten en el sobrenadante. La cantidad relativa de anticuerpo se cuantificó al leer la absorbancia a 405 nm. Los clones de hibridoma que secretan anticuerpos que son capaces de unirse a GHR/HFC humano se seleccionaron. Los siguientes ensayos se ejecutaron para detectar anticuerpos a HFC de modo que puedan evitarse. El análisis adicional se llevó a cabo para caracterizar los clones seleccionados EJEMPLO 2 Determinación de las Cinéticas de Anticuerpo y Afinidad de Unión Este ejemplo ilustra la determinación de la cinética de anticuerpo y afinidades de unión de anticuerpos de GHR para GHR de humano y cyno.

Determinación de la cinética y afinidad de las interacciones de IqG GHR/Ab13 a 25°C La afinidad un anti-anticuerpo de GHR de ratón, Ab13, para GHR humano y cyno se midió en un biosensor Biacore™ 2000 (GE Lifesciences™, Piscataway NJ). Un sensor de Ig anti-ratón se preparó usando un Biacore™ CM5 y reactivos del kit de captura anticuerpo de ratón Biacore™ (GE Lifesciences™, de catálogo BR-1008-38), utilizando instrucciones proporcionadas por el fabricante.

Los ensayos cinéticos pueden ejecutarse utilizado una metodología de titulación cinética cómo se describe en Karlsson et al, 2006, Anal. Biochem 349, 136-147. El anticuerpo de ratón, Ab13, se capturó en una célula de flujo correcta abajo a 0.5 mg/ml de una taza de flujo de 5 µ?/min durante 1 minuto, 2 minutos y 4 minutos en células de flujo 2, 3 y 4 respectivamente. La célula 1 de flujo se utilizó como en una superficie de referencia. Después de la captura de anticuerpos, ya sea GHR humano o cyno (monómeros etiquetados con his en los aminoácidos 31-235 del dominio extracelular del GHR Humano o cyno) se inyectó a 30 pL/minuto en todas las células de flujo en una serie de inyecciones de concentración baja a alta. La concentración superior fue de 400 nM para GHR de humano y 2000 nM para GHR de cyno; el factor de dilución fue de 5 veces. Cada inyección de GHR fue de dos mintuos, el tiempo de disociación después de inyección de PCSK9 400 nM fue de 10 minutos. Un conjunto similar de inyecciones se realizó con ejecución del regulador en lugar de GHR para propósitos de doble referencia (doble referencia como se describe en Myszka, 1999, J. Mol. Recognit 12, 279-284). Cada serie de diluciones GHR se ejecutó por duplicado. Después de cada ciclo de análisis todas las células de flujo se regeneraron con una inyección tres minutos de glicina 10mM pH 1 .7. Los sensogramas de doble referencia se ajustan globalmente a un modelo de unión de transporte de masa a un Langmuir de 1 :1 simple (con un parámetro local Rmax paracada célula de flujo).

Los experimentos se realizaron a 25°C utilizando un regulador de ejecución de HEPES 10 mM, NaCI 150 mM, Tween-20™ a 0.05% (v/v), pH 7.4. Los resultados del estudio se resumieron en la Tabla 4a siguiente.

Determinación de la cinética y afinidad de interacciones de GHR/ IgG para SS1 v quimera Ab13-HFC a 25°C Las afinidades de un anticuerpo GHR humanizado, SS1 , y una molécula quimérica que comprende los Fab de Ab13 fusionado a un dominio Fe Humano ("Ab13-HFC") para GHR a humano y cyno se midió en un biosensor Biacore 2000™ (GE Lifesciences™, Piscataway NJ).

Un fragmento sensor Fe anti-humano se preparó al acrivar todas las células de flujo de un fragmento sensor CM4 de Biacore™ con una mezcla de 1 :1 (v/v) de etil-N-(3-dietilaminopropol)carbodiimida 400 nM (EDC, Biacore™) y N-hidroxisucinamida 100 mM (NHS, Biacore™) durante 7 minutos, en una tasa de flujo de 10 pUmin. Un reactivo Fe anti-humano (Fe de IgG anti-humano de fragmento F(ab')2 de cabra, Catálogo Cappel No.55053) se diluyó a 60 pg/mL en acetato de sodio 10 mM pH 5.0 y se inyectó en todas las células de flujo durante 7 minutos a 20pL/min. Todas las células de flujo were blocked con etilendiamina 100 mM en regulador de borato 150 mM borate pH 8.5 durante 7 minutos a 10 pL/min.

El ensayo decinética se ejecutó utilizando una metodología con tiempos de disociaciónvariantes como sedescribe en Katsamba et al., 2006, Anal. Biochem 352, 208-221. Los anticuerpos se capturaron sobre las células de flujo corriente abajo (células de flujo 2, 3 y 4) a 4 pg/mL a una tasa de flujo a 10 pL/min durante 1 minuto. Se capturaron diferentes anticuerpos en cada célula de flujo. La célula 1 de flujo se utiñlizó como una superficie de referencia. Después de la captura de anticuerpos, el analito (regulador, GHR de humano o GHR de cyno) se inyectó a 30 pUmin en todas las células de flujo durante dos minutos. Para los analitos GHR analitos, se utilizaron los monómeros marcados con hisde los aminoácidos 31-235 del dominio extracelular del GHR de humano o de cyno. Después de la inyección del analito, se monitoreó la disociación durante 30 minutos (para el ciclo GHR 400 nM) o 30 segundos (los demás ciclos) seguidos por la regeneración de todas las células de flujo con dos inyecciones de 30 segundos de ácido fosfósitoc 75 mM. Una serie de dilución de 5 miembros de GHR se analizó utilizando este método, donde la concentración superior fue de 400 nM y el factor de dilución fue de 3 veces. Los ciclos del regulador se recolectaron tanto en los tiempos de disociación a 30 minutos como de 30 segundos dissociation para propósitos de doble referencia. Los sensogramas de doble referencia se fijaron globalmente a un modelo de unión de transporte de masa de Langmuir 1 :1.

Los experimentos se realizaron a 25°C utilizando un reguladorde ejecución de HEPES 10 mM, NaCI 150 mM, 0.05% Tween-20™ 0.05% (v/v), pH 7.4. Los resultados del estudio se resumen en la Tabla 4A a continuación.

TABLA 4A Determinación de la cinética y afinidad de las interacciones GHR/Fab (con Fab inmovilizado) a 37°C La afinidad del anticuerpo GHR Fab SS1 de humano y GHR de cyno se midió en un biosensor Biacore™ T200 (GE Lifesciences™, Piscataway NJ).

Un fragmento sensor kappa anti humano se preparó al activar todas las células de flujo de un fragmento sensor CM4 de Biacore™ con una mezcla 1 :1 (v/v) de EDC 400 mM y NHS 100 mM durante 7 minutos, a una tasa de flujo a 10 pUmin. Se diluyó un reactivo kappa anti-humano (fragmento kappa anti-humano F(ab')2 de cabra, catálogo Southern Biotech No. 2063-01) a 50 pg/mL en acetato de sodio 10 mM, pH 4.5 y se inyectó en todas las células de flujo durante 7 minutos a 20 plimin. Todas las células de flujo se bloquearon con etilendiamina 100 mM en regulador de borato 150 mM, pH 8.5 durante 7 minutos a 10 pL/min.

El ensayo de cinética se ejecutó utilizando una metodología con tiempos de disociación variantes como se describe en Katsamba et al., supra. Los Fab se capturararon sobre células de flujo corriente abajo (Células 2, 3 y 4 de flujo) a 2 pg/mL a una tasa de flujo de lOpLAnin durante 2 minutos. Se capturaron diferentes Fab en cada célula de flujo. La célula 1 de flujo se utilizó como una superficie de referencia. Después de la captura de los Fab, el analito (regulador, GHR de humano o GHR de cyno) se inyectó a 30 pL/min en todas las células de flujo durante dos minutos. Para los analitos GHR, los monómeros marcados con his de los aminoácidos 31-235 del dominio extracelular de la GHR de humano o de cyno se utilizaron. Después de la inyección del analito, se monitoreó la disociación durante 30 minutos (para los ciclos de GHR 133 nM y 400 nM) o 60 segundos (los demás ciclos) seguidos por la regeneración con tres inyecciones de 30 segundos de glicina 10 mM pH 1.7. Una serie de dilución de 6 miembros se GHR se analizó utilizando este método, en donde la concentración superior fue de 400 nM y el factor de dilución fue de 3 veces. Los ciclos de regulador se recolectaron con tanto 30 minutos como 60 segundos de tiempo de disociación para propósitos de doble referencia. Los sensogramas de doble referencia se ajustaron globalmente a un Langmuir 1 :1 simple con modelo de unión de transporte de masa.

Los experimentos se realizaron a 37°C utilizando un regulador de ejecución de HEPES 10 mM, NaCI 150 mM, Tween-20™ 0.05% (v/v), pH 7.4. Los resultados del estudio se resumieron en la Tabla 4B siguiente.

Determinación de cinética y afinidad de interacciones de GHR/ Fab (en donde hGHR-hFc se inmobiliza) a 37°C La afinidad del Fab SS1 de anticuerpo de GHR a GHR humano y cyno se midieron en un biosensor Biacore™ T200 (GE Lifesciences™, Piscataway NJ).

Un fragmento de sensor Fe anti-humano se preparó al activar todas las células de flujo de un fragmento de sensor CM4 Biacore™ con una mezcla de 1:1 (v/v) de EDC 400 mM y NHA 100 mM durante 7 minutos, a una tasa de flujo de 10 pL/min. Un reactivo Fe anti-humano (fragmento de F(ab')2 de cabra a Fe IgG humano, Cappel No. de Catálogo 55053) se diluyó a 60 pg/mL en acetato de sodio 10 mM pH 5.0 y se inyecto en todas las células de flujo durante 7 minutos a 20 pL/min. Todas las células de flujo se bloquearon con etilendiamina 100 mM en regulador de borato 150 mM pH 8.5 durante 7 minutos a 10 pL/min.

El ensayo de cinética se ejecutó utilizando una metodología con tiempo de disociación variable como se describe en Katsamba et al., supra. La protema de fusión de hGHR-hFc (R&D Systems™, No. de Catálogo 210-GR) se capturó en células de flujo corriente abajo en 2 pg/mL en una tasa de flujo de 10 pL/min durante 30 segundos, 1 minuto y 2 minutos en células de flujo 2, 3 y 4, respectivamente. Se utilizó la célula de flujo 1 como una superficie de referencia. Después de la captura de hGHR-hFc, analito (regulador, Fab SS1 o Fab Ab13) se inyectó a 30 pL/min en todas las células de flujo durante dos minutos. Después de la inyección de analito, se monitoreo la disociación durante 30 minutos (ciclo Fab de 400 nM) o 60 segundos (todos los otros ciclos) seguido por la regeneración con dos inyecciones de 30 segundos de ácido fosfórico 75 mM. Una serie de dilución de 5 miembros de Fab se analizó utilizando este método, en donde la concentración superior fue de 400 nM y el factor de dilución fue de 3 veces. Los ciclos de regulador se recolectaron tanto en 30 minutos como en 60 segundos de tiempo de disociación para propósitos de doble referencia. Los sensogramas de doble referencia se ajustan globalmente a un Langmuir 1 :1 simple con modelo de unión de transporte de masa (con un parámetro Rmax local para cada célula de flujo).

Los experimentos se realizaron a 37°C utilizando una regulador de ejecución de HEPES 10 mM, NaCI 150 mM, Tween-20™ 0.05% (v/v), pH 7.4. Los resultados del estudio se resumieron en la Tabla 4B siguiente.

TABLA 4B EJEMPLO 3 Ensayo In Vitro de Fosforilación STAT5 Este Ejemplo ilustra el efecto de los anticuerpos de GHR en un ensayo de fosforilación de STAT5 in vitro. En este Ejemplo, la capacidad de los anticuerpos de GHR para bloquear la señalización corriente abajo de GHR se probó in vitro utilizando las células de sobreexpresion de GHR humano y las células de sobreexpresion de GHR de cyno.

Las señales de GH a través de la trayectoria de JAK/STAT. La unión de GH a GHR provoca un cambio conformacional en el receptor dimerizado. Este cambio resulta en la fosforilación intracelular de JAK2 (cinasa 2 asociada con Janus). La fosforilación de JAK2 entonces induce la fosforilación de STAT5 (transductor de señal y activador de transcripción 5). STAT5 fosforilado se trasloca al núcleo, en donde se une a las secuencias promotoras de los genes dependientes de GH.

El Ab 13 anticuerpo antagonista de GHR se probó para su capacidad para bloquear STAT5 en un ensayo in vitro. Las células HEK293 se transfectaron previamente con cualquier ADN que codifique el gen GHR humano de longitud completa (SEQ ID NO: 140) o ADN que codifique GHR de cyno de longitud completa (SEQ ID NO: 141). Las células se cultivaron en un medio freestyle durante aproximadamente 60 horas antes de la prueba. Las células se lavaron con DPBS (Solución Salina Regulada con Fosfato de Dulbecco) y se resuspendieron en un medio Freestyle, cuando se contó utilizando un hemocitómetro. 1X106 células se sembraron por pozo en placas de 6 pozos en 2 mis del medio Freestyle. Las células se incubaron durante 2 horas a 37°C, después se trataron con anticuerpo Ab13 5, 50, o 500 nM en el medio. Las células se incubaron a 37°C con mezcla suave durante 5 minutos con anticuerpos. Se agregó entonces GH (Genotropina) 4.5 nM a todo excepto los pozos de control. Las células se incubaron con GH a 37°C con mezcla suave durante 10 minutos.

Después de la incubación con GH, se agregaron 2 mi de DPBS con hielo seco con 1X de coctel inhibidor de proteasa (Roche) y ortovanadato de sodio 1 mM (BioLabs) a cada pozo y las placas se colocaron en hielo. Las células se transfirieron a tubos de 5 mi y se centrifugan para crear una pella celular y el regulador de lavado se aspiró, dejando la pella celular.

Los reactivos de Regulador de Señal de Célula MAP Millipore™ MILLIPLEX® y el Kit de Detección (No. de cat. 48-602) se utilizaron para lisar y tratar las pellas celulares. El regulador de lisis de Millipore con 1X de coctel inhibidor de proteasa y ortovanadato de sodio 1 mM se agregó a cada pella en un volumen de 200 ul/pellas. Las células se sometieron a vórtice y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente con un vórtice ocasional. El regulador 2 de Ensayo de Millipore con 1X de coctel inhibidor de proteasa y ortovanadato de sodio 1 mM se agregó entonces a los lisatos de 300ul/pozo.

Las cuentas Millipore™ MILLIPLEX® MAP Phospho STAT5A/B (Tyr694/699) MAPmate™ (No. de cat. 46-641) se resuspendieron en el Regulador 2 de Ensayo (a partir del kit Millipore™ No. de cat. 48-602) y se ubicaron en una placa de filtro de 96 pozos (proporcionada en el kit) a 25 ul/pozo. 25 ul/pozo de lisato de muestra se agregaron a los pozos y las cuentas y muestras se incubaron durante la noche a 4°C con agitación en la oscuridad.

El líquido se aspiró entonces utilizando un colector de vacío y las cuentas restantes se lavaron utilizando regulador de lavado de kit Millipore™. El anticuerpo de detección kit Millipore™ de 25 ul se agregó y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación en la oscuridad. El anticuerpo de detección se sometió a vacío a través de un kit de 25ul de estreptavidina-Ficoeritrina se agregó y se incubó en la oscuridad durante 15 min con agitación. El kit regulador de amplificación de 25 ul se agregó y se incubo entonces durante 15 minutos con agitación en la oscuridad. El líquido se aspiró utilizando un colector de vacío, y las cuentas se resuspendieron en kit Regulador 2 de Ensayo de 150 ul y se mezcló en un agitador durante 5 minutos antes de la lectura de la placa.

La placa se leyó utilizando un instrumento Luminex™ 200 y se midió la señal fluorescente emitida desde las muestras. Los resultados del ensayo STAT5 se muestran en las Tablas 5 y 6. "Promedio" indica la señal fluorescente promedio, y "SEM" indica el error estándar de la media.

TABLA 5 Ensayo de STAT5 Utilizando las Células Transfectadas de GHR Humano TABLA 6 Ensayo de STAT5 Utilizando Células Transfectadas de GHR Cyno El tratamiento de células transfectadas con GHR con señalización de STAT5 estimulada por la GH 4.5 nM en células que expresan ya sea GHR humano (Tabla 5, fila 2) o GHR de cyno (Tabla 6, fila 2). La señalización de STAT5 bloqueada por Ab 13 en la manera dependiente de dosis (Tabla 5, filas 3-5; Tabla 6, filas 3 y 4).

La Ab13 fue de afinidad madura y humanizada, conduciendo a la selección de Anticuerpos SS3 y SS1. La Secuencia de aminoácidoss de cadena pesada y ligera de los anticuerpos SS1 y SS3 antagonistas de GHR humanizados se muestran en lo siguiente.

Secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SS1 hlqG2Aa EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDAWMDWVRQAPGKGLEWVA EIRSKANYHATYYAESVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTLIR DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPS NTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCW VDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 134) Secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SS1 hlqG2Aa sin lisina C terminal EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDAWMDWVRQAPGKGLEWVA EIRSKANYHATYYAESVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTLIR DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSNA TVPSSNFGTQTYTCNVDHKPS NTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCW VDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO. 33) Secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SS1 hlqG2Aa EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCTATSSVSSSYLNWYQQKPGQAPRLLIYSTS NLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYHRSTPTFGGGTKV EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC (SEQ ID NO: 135) Secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SS3 hlqG2Aa EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDAWMDWVRQAPGKGLEWVA EIRSKANNHATYYAESVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTLFR DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPS NTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCW VDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 36) Secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SS3 hlgG2Aa EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCTATSSVSSSYLNWYQQKPGQAPRLLIYSTS NLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYHRFTPTFGGGTKV EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC (SEQ ID NO: 137) Secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SS1 FcM EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDAWMDWVRQAPGKGLEWVA EIRSKANYHATYYAESVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTLIR DYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPS NTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCW VDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVLHEALHSHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 138) Secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SS1 FcM EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCTATSSVSSSYLNWYQQKPGQAPRLLIYSTS NLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYHRSTPTFGGGTKV EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQS GNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS FNRGEC (SEQ ID NO: 139) Los anticuerpos SS3 y SS1 (hlgG2Aa) se probaron utilizando un ensayo de fosforilación STAT5. Para el ensayo de STAT5, las células HEK293 que sobreexpresan GHR humano de longitud completa o células HEK293 que sobreexpresan GHR cyno de longitud completa se cultivaron, se contaron por un contador de células automatizado, y se sembraron en un medio freestyle caliente en placas de 12 pozos (5X105 células/pozo en un medio de 1 mi). Las células se dejaron asentar durante 3 horas a 37°C después se trataron con 2.5, 5, 50, o 500 nM de SS1 o SS3 en el medio. Las células se incubaron a 37°C con mezcla suave de 5 minutos con anticuerpos. La hormona de crecimiento humano (Pfizer) 4.5 nM se agregó entonces a toda excepto los pozos de control. Las células se incubaron con GH a 37°C con una mezcla suave durante 0 minutos.

Después de la incubación con GH, se agregaron 2 mi de DPBS con hielo seco con 1X de coctel inhibidor de proteasa (Roche) y ortovanadato de sodio 1 mM (BioLabs) en cada pozo y las placas se colocaron en hielo. Las células se transfirieron a tubos de 5 mi y se centrifugaron para crear una pella celular y el regulador de lavado se aspiró, dejando la pella celular.

Los reactivos de Regulador de Señal de Célula MAP Millipore™ MILLIPLEX® y el Kit de Detección (No. de cat. 48-602) se utilizaron para lisar y tratar las pellas celulares. El regulador de lisis Millipore™ con 1X de coctel inhibidor de proteasa y ortovanadato de sodio se agregó a cada pella en un volumen de 100 ul/pella. Las células se sometieron a vórtice y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente con un vórtice ocasional. El Regulador 2 de Ensayo Millipore™ con 1X de coctel inhibidor de proteasa y ortovanadato de sodio 1 mM se agregó entonces a los lisatos de 200 ul/pozo.

Las cuentas Millipore™ MILLIPLEX® MAP Phospho STAT5A/B (Tyr694/699) MAPmate™ (No. de cat. 46-641) se resuspendieron en el Regulador 2 de Ensayo (a partir del kit de Millipore No. de cat. 48-602) y se cargó en una placa de filtro de 96 pozos (proporcionada en el kit) a 25 ul/pozo. Se agregaron 25 ul/pozo de lisato de muestra a los pozos y las cuentas y muestras se incubaron durante la noche a 4°C con agitación en la oscuridad.

El líquido se aspiró entonces utilizando un colector de vacio y las cuentas restantes se lavaron utilizando un regulador de lavado de kit Millipore™. 25 ul del anticuerpo de detección del kit Millipore™ se agregó y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación en la oscuridad. El anticuerpo de detección se sometió a vacío a través de y se agregó un equipo de estreptavidina-ficoeritrina a 25 ul y se incubó en la oscuridad durante 15 minutos con agitación. El kit regulador de amplificación de 25 ul se agregó entonces y se incubó durante 15 minutos con agitación en la oscuridad. El líquido se aspiró utilizando un colector de vacío, y las cuentas se resuspendieron en un kit Regulador 2 de Ensayo de 150 ul y se mezcló en un agitador durante 5 minutos antes de la lectura de la placa.

La placa se leyó utilizando un instrumento Luminex 200 y la señal fluorescente emitida de las muestras se midió. Los resultados del ensayo STAT5 se muestran en las Tablas 7 y 8.

TABLA 7 Ensayo de STAT5 Utilizando Células Transfectadas de GHR Humano TABLA 8 Ensayo de STAT5 Utilizando Células Transfectadas de GHR de Cvno El tratamiento de las células transfectadas con GHR con señalización de STAT5 estimulada por la GH 4.5 nM en células que expresan ya sea GHR humano (Tabla 7, fila 2) o GHR de cyno (Tabla 8, fila 2). Los anticuerpos SS1 y SS3 antagonistas de GHR humanizado ambos de señalización STAT5 bloqueada en una manera dependiente de dosis (Tabla 7, filas 3-10; Tabla 8, filas 3-10).

EJEMPLO 4 Anticuerpos del Antagonista GHR son Efectivos para Niveles de IGF-1 en Sangre Inferiores en Monos cvnomolgus Este Ejemplo ilustra el efecto de anticuerpos antagonistas de niveles de IGF-1 en sangre en monos cynomolgus.

Para determinar si los anticuerpos monoclonales antagonistas de GHR pueden afectar los niveles de IGF-1 in vivo al inhibir la función de GHR, el efecto del Ab13 de anti-anticuerpo de GHR humano murino se probó en monos cynomolgus. Los niveles de IGF-1 son un biomarcador para actividad de hormona de crecimiento un vivo. Bloquear GHR se ha demostrado que conduce a una caída en los niveles de IGF-1 cuando se compara con los niveles de los valores de referencia in vivo.

Para la prueba para cambios en los niveles de IGF-1 , cinco monos cynomolgus hembra sin tratamiento previo se inyectaron IV con una dosis simple de Ab13 o lgG1 de ratón control negativo en 1X PBS. Dos monos se dosificaron con 30 mg/kg de Ab13, una se dosificó con 10 mg/kg de Ab13, y dos se dosificaron con 30 mg/kg de lgG1 de ratón control negativo en el Día 1. Las muestras de suero se tomaron a partir de todos los animales en los siguientes puntos de tiempo: pre-dosis, 1 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h, 144 h, 168 h, 216 h, 264 h, y 312 h post-dosis.

Las muestras de suero se analizaron para cambios en los niveles de IGF-1 comparados para valores de referencia utilizando un kit de inmunoensayo IGF-1 humano R&D Systems™ Quantikine™ (No. de cat.DG100). Los resultados del estudio para los puntos de tiempo varían de 24 h a 312 h se muestran en la Tabla 9.

TABLA 9 Efecto de Ab13 en niveles de IGF-1 en suero (% de cambio de los valores de referencia) Los datos en la Tabla 9 muestran que la dosis de Ab 13 de anticuerpo antagonista de GHR reduce dependientemente los niveles de IGF-1 en suero en monos cynomolgus. Los niveles de IGF-1 en suero disminuyen a alrededor de 63% por debajo de los valores de referencia por 96 horas después de la administración intravenosa de una dosis simple de 30 mg/kg de Ab13, y los niveles de IGF-1 en suero permanecen en alrededor de 63% por debajo de los valores de referencia hasta alrededor de 144 horas después de la administración del anticuerpo. Los niveles de IGF-1 en suero disminuyen a alrededor de 48.8% por debajo de control por 96 horas después de la administración intravenosa de una dosis simple de 10 mg/kg de Ab13. Los niveles de IGF-1 regresan a los niveles de los valores de referencia por la hora 312. En contraste, los niveles de IGF-1 en suero en animales dosificados con lgG1 de control 30 mg/kg permanecen en alrededor de los niveles de los valores de referencia a través del estudio (Tabla 9). Estos resultados demuestran que el tratamiento con un anticuerpo antagonista de GHR es efectivo para disminuir los niveles de IGF-1 en sangre, y que el efecto es dependiente de la dosis.

EJEMPLO 5 Anticuerpos Antagonista de GHR son Efectivos para Disminuir los Niveles de IGF-1, IGFBP-3. y ALS en Sangre en Monos Cynomolgus Este Ejemplo ilustra el efecto de anticuerpos antagonistas de GHR en IGF-1 en sangre, la proteína 3 de unión de IGF (IGFBP-3) y los niveles de la subunidad lábil de ácido (ALS) en monos cynomolgus.

Para determinar si los anticuerpos monoclonales antagonistas de GHR pueden afectar niveles de IGF-1 , IGFBP-3, y ALS in vivo al inhibir la función de GHR, el efecto de anticuerpos de SS1 de GHR anti-humano humanizado se probó en monos cynomolgus. Se condujo un estudio de dosis-respuesta para probar os cambios en los niveles de IGF-1 , IGFBP-3, y ALS después de una dosis simple de SS1. Ocho monos cynomolgus hembra sin tratamiento previo se inyectaron intravenosamente con una dosis simple de SS1 o lgG2Aa humano de control negativo en 1X PBS Tween™ 20 al 0.01 %. Dos monos se dosificaron con 30 mg/kg de SS1 , dos se dosificaron con 10 mg/kg de SS1 , dos se dosificaron con 3 mg/kg de SS1 , y dos se dosificaron con 30 mg/kg de lgG2Aa humano de control negativo en el Día 1. Las muestras de suero se tomaron de todos los animales en los siguientes puntos de tiempo: pre-dosis, 24 h, 48 h, 72 h, 120 h, 144 h, 192 h, 240 h, 336 h, 528 h, 696 h. El suero también se tomó del SS1 30 mg/kg y animales tratados de control negativo en 864 h posteriores a la dosis.

Las muestras de suero se analizaron para cambios en los niveles de IGF-1 comparados con los valores de referencia utilizando un kit de inmunoensayo de IGF-1 humano R&D Systems™ Quantikine™ (No. de cat.DG100). Los resultados del estudio para los puntos de tiempo varían de 24 h a 864 h se muestran en la Tabla 10.

TABLA 10 Efecto de SS1 en niveles de IGF-1 en suero (% de cambio de los valores de referencia) Los datos en la Tabla 10 muestran que la dosis de SS1 de anticuerpo antagonista de GHR reduce dependientemente los niveles de IGF-1 en suero en mono cynomolgus. En animales control dosificados con lgG1 30 mg/kg, los niveles de IGF-1 en suero disminuyen a alrededor de 47% por debajo de los niveles de los valores de referencia en 48 h después de la dosificación con lgG1 control, después regresan al nivel de los valores de referencia por 144 h posteriores a la dosificación, y permanecen a alrededor de o por encima de los niveles de los valores de referencia a través del resto del estudio (Tabla 10, última fila). En contraste, los niveles de IGF-1 en suero disminuyen a alrededor de 75% por debajo de los niveles de los valores de referencia por 120 horas después de la administración intravenosa de una dosis simple de SS1 de 3, 10 o 30 mg/kg. Los niveles de IGF- en suero en animales tratados con SS1 permanecen substancialmente menor que los valores de referencia hasta 240 horas (dosis de 3 mg/kg), 336 horas (dosis de 10 mg/kg) o 696 horas (dosis de 30 mg/kg) después de la administración de dosis. Estos resultados demuestran que el tratamiento con un anticuerpo antagonista de GHR es efectivo para disminuir los niveles de IGF-1 en sangre, y que el efecto es dependiente de la dosis.

Se analizaron las muestras de suero para cambios en los niveles de IGFBP-3 comparados con los valores de referencia utilizando un kit de inmunoensayo IGFBP-3 humano de R&D Systems™ Quantikine™ (No. de cat.DGB300). Los resultados del estudio para los puntos de tiempo varían de 24 h a 336 h se muestran en la Tabla 1 1.

TABLA 11 Efectos de SS1 en niveles de IGFBP-3 en suero (% de cambio de los valores de referencia) Los datos en la Tabla 11 muestran que la dosis de SS1 de anticuerpo antagonista de GHR reduce dependientemente los niveles de IGFBP-3 en suero en mono cynomolgus. Los niveles de IGFBP-3 en suero disminuyen a alrededor de 36%, 38%, o 23% por debajo de los valores de referencia por 72 horas después de la administración intravenosa de una dosis simple de SS1 de 3, 10 ó 30 mg/kg, respectivamente. Durante 144 horas después de la dosificación, los niveles de IGFBP-3 en suero en animales tratados con SS1 de 3, 10, o 30 mg/kg disminuyen a alrededor de 47%, 51%, o 46% por debajo de los valores de referencia, respectivamente. Los animales de IGFBP-3 en suero tratados con una dosis simple de anticuerpo de SS1 regresaron a los niveles de los valores de referencia hacia el final del estudio. Los niveles de IGFBP-3 en suero en animales dosificados con lgG1 de control de 30 mg/kg permanecieron a alrededor de los niveles de los valores de referencia a través del estudio (Tabla 1 1 , última fila). Estos resultados demuestran que el tratamiento con un anticuerpo antagonista de GHR es efectivo para disminuir los niveles de IGFBP-3 en sangre.

Las muestras de suero se analizaron para cambios en los niveles de ALS comparados con los valores de referencia utilizando un kit de ELISA ALS humano BioVendor™ Humano (No. de cat. No.RMEE35R). Los resultados del estudio para los puntos de tiempo varían de 24 h a 336 se muestran en Tabla 12.

TABLA 12 Efecto de SS1 en los niveles de ALS en suero (% de cambio de los valores de referencia) Los datos en la Tabla 12 muestran que el anticuerpo SS1 antagonista de GHR reduces los niveles de ALS en suero en mono cynomolgus. Los niveles de ALS en suero disminuyen a alrededor de 51 %, 24%, o 49% durante 96 horas después de la administración intravenosa de una dosis de SS1 simple de 3, 10 o 30 mg/kg, respectivamente. Los animales con ALS en suero tratados con una dosis simple de un anticuerpo de SS1 regresan a los niveles de los valores de referencia hacia el final del estudio. Los niveles de ALS en suero en animales dosificados con lgG1 de control de 30 mg/kg permanecieron en alrededor de los niveles de los valores de referencia a través del estudio (Tabla 12, última fila). Estos resultados demuestran que tratamiento con un anticuerpo antagonista de GHR es efectivo para disminuir los niveles de ALS en sangre.

Los animales se dosificaron subcutáneamente para determinar si la dosificación subcutánea de SS1 resultó en la dimensión de niveles de IGF-1 y ALS en sangre. Se inyectaron Seis mono cynomologus hembra sin tratamiento previo ya sea intravenosa o subcutáneamente por una sola dosis de SS1 o lgG2Aa humano control negativo en 1 X PBS Tween™ 20 al 0.01%. Dos monos se dosificaron con SS1 3 mg/kg intravenosamente, dos se dosificaron con SS1 3mg/kg subcutáneamente, y dos se dosificaron con lgG2Aa humano de control negativo 3mg/kg subcutáneamente en el Día 1. Las muestras de suero se tomaron de todos los animales en los siguientes puntos de tiempo: pre-dosis, 24 h, 72 h, 120 h, 168 h, 216 h, 264 h, 312 h, 360 h, 408 h, 456 h y 504 h.

Las muestras de suero se analizaron para cambios en los niveles de IGF-1 comparados con la línea base utilizando un kit de inmunoensayo IGF-1 humano R&D System™ Quantikine™ (No. de cat. DG100). Los resultados del estudio para los puntos de tiempo que varían de 24 h a 360 h se mostraron en la Tabla 13.

TABLA 13 Efectos de SS1 en niveles de IGF-1 en suero (% de cambio de valores de referencia) Los datos en la Tabla 13 mostraron que la dosis SS1 de anticuerpo antagonista de GHR reduce dependientemente los niveles de IGF-1 en suero en los monos cynomolgus cuando se administraron subcutáneamente (SQ) o intravenosamente (IV). Los niveles de IGF-1 en suero, que disminuyeron a alrededor de 63% por debajo del control por 72 horas después de la administración subcutánea (SC) o intravenosa (IV) de una sola dosis de SS1 3 mg/kg. Los niveles de IGF-1 en suero en animales tratados con SS1 permanecieron por debajo del 60% de los niveles de valores de referencia hasta alrededor de 216 horas después de la dosificación ya sea SQ o IV. Los niveles de IGF-1 en suero en animales dosificados subcutáneamente con IGF-1 control de 3 mg/kg permanecieron en alrededor de los niveles de valores de referencia a través del estudio (Tabla 13, última fila). Estos resultados demostraron que el tratamiento con el anticuerpo antagonista de GHR administrado intravenosa o subcutáneamente es efectivo para disminuir los Niveles de IGF-1 en sangre.

Las muestras de suero se analizaron para cambios en los niveles de ALS comparados con los valores de referencia utilizando un kit ELISA ALS humano BioVendor™ (No. de cat. RMEE35R). Los resultados del estudio a partir de los puntos de tiempo que varían de 24 h a 260 h se mostraron en la Tabla 14.

TABLA 14 Efecto del SS1 en niveles de ALS en suero (% de cambio de valores de referencia) Los datos en la Tabla 14 mostraron que la dosis de SS1 de anticuerpo antagonista reduce dependientemente los niveles de ALS en suero en los monos cynomolgus cuando se administraron subcutáneamente (SQ) o intravenosamente (IV). Los niveles de ALS en suero, los cuales disminuyeron a alrededor de 43% por debajo del control por 72 horas después de la administración subcutánea (SQ) de una sola dosis de SS1 3 mg/kg. Los niveles de ALS disminuyeron a alrededor de 31 % por debajo del control por 72 horas después de la administración intravenosa (IV) de una sola dosis de SS1 3 mg/kg. Los niveles de ALS en suero regresaron a los niveles de valores de referencia por la hora 312. Los niveles de ALS en suero en animales dosificados con IGF-1 control de 3 mg/kg permanecieron en o por arriba de los niveles de valores de referencia a través del estudio (Tabla 14, última fila). Estos resultados demostraron que el tratamiento con el anticuerpo antagonista de GHR administrado intravenosa o subcutáneamente es efectivo para disminuir los niveles de ALS en sangre.

EJEMPLO 6 Anticuerpos Antagonistas de GHR en combinación con Irinotecan son Efectivos para Inhibir los Tumores en un Modelo de Ratón de Cáncer Este Ejemplo ilustra el efecto de anticuerpos antagonistas de GHR en el crecimiento tumoral en un modelo de ratón singeneíco de cáncer.

Para determinar si los anticuerpos monoclonales antagonistas de GHR pueden inhibir el crecimiento tumoral, el efecto de un anticuerpo de ratón, Ab1 1 , se probó en un modelo de tumor singeneico. El anticuerpo Ab11 es un anticuerpo lgG1 de ratón que bloquea GHR de ratón. La línea celular CT26 se utilizó como un modelo de ratón singeneico del cáncer colorectal. Los ratones se inyectaron con células tumorales y se dosificaron con el anticuerpo Ab1 1 solo o en combinación con iriniotecan. Un grupo control negativo y un grupo solo de irinotecan también se incluyeron en el estudio.

Los ratones BALB/c (BALB/cAnNCrl) se obtuvieron a partir de Charles River (Hollister, CA, USA) y se mantuvieron en bioterio en Rinat. Los animales tenían 7 semanas con un peso corporal inicial de 22-23 g cuando se utilizaron para el estudio. Los ratones se alojaron en microaisladores (jaulas con filtro superior) bajo condiciones libres de patógenas con un programa de 12-h de luz/12-h de oscuridad y alimentadas por autoclave estándar por alimento y agua a través del experimento.

La línea celular CT26 de carcinoma de colon no diferenciado de ratón (CRL-2638) se obtuvo a partir de la Colección de Cultura de Tipo Americano (ATCC; Manassas, VA, USA). Las células CT26 se cultivaron en RPMI 1640, 1X con L-glutamina ( 0-040-CV) (Cellgro™ Mediatech™, Inc., Manassas, VA, USA) que contienen suero de bovino fetal al 10% (43640) (JR Scientific™, Inc., Woodland, CA, USA) y solución de penicilina-estreptomicina al 1% (30-002-CI) (Cellgro™ Mediatech™, Inc., Manassas, VA, USA). Las células se cosecharon por una incubación con Accutase (A6964-100ML) (Sigma™ Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA) y se lavaron en un nuevo medio para conteo. El conteo celular y la viabilidad (95.8%) se evaluaron utilizando el contador automatizado ViCell™, y la máquina de viabilidad. La suspensión de células finales en el nuevo medio se diluyeron 1 :2 con membrana basal de BD Matrix Matrigel™ (356234) (BD Biosciences™, Bedford, MA, USA) por inyección.

Los xenoinjertos del tumor se iniciaron por inyección subcutánea (SC) de 105 células en el flanco izquierdo del ratón BALB/c. Siete días más tarde, los tumores habían crecido a un volumen de aproximadamente 75-150 mm3. Los animales se dividieron en cuatro grupos con aproximadamente volumen del tumor promedio iguales y errores estándar de la media y se asignaron aleatoriamente para recibir tratamiento. Los animales en el grupo control recibieron 1X PBS con Sulfóxido de dimetilo al 10% (DMSO) (D2650 -Sigma™ Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA) más el anticuerpo control isotipo de lgG1 de ratón de 10 mg/kg. Los animales en el grupo irinotecan recibieron Clorhidrato irinotecan 100 mg/kg (11406 - Sigma™ Aldrich), más el anticuerpo control de isotipo lgG1 de ratón 10 mg/kg. Los animales en el grupo Ab11 recibieron Ab11 10 mg/kg, más 1X de PBS con DMSO al 10%. Los animales en el grupo de combinación recibieron irinotecan 100 mg/kg, más Ab11 10 mg/kg.

Los ratones se dosificaron intra-peritonealmente (IP) cada segundo a tercer día. El volumen tumoral y el peso corporal se midieron al menos dos veces en una semana. El estudio fue ciego. En el Día 28, la sangre se recolectó para la medición de suero IGF-1.

Los tumores se midieron cada 2-4 días con un calibrador digital (mm). Los volúmenes de tumor de valores de referencia se calcularon utilizando la siguiente formula: V = d22 x (d1/2) donde d1 fue el diámetro más grande del tumor y d2 fue la perpendicular a d1. Al final del estudio, mientras que el estudio aún era ciego, se determinaron los valores atípicos y se excluyeron de los cuatro grupos. Los tumores que fueron 3X de error estándar del medio < el medio y 3X de error estándar del medio > el medio en todos los días después del día 14 (días 18, 22, 25, y 28) se determinaron los valores atípicos. El peso tumoral al final del estudio también se midió.

El IGF-1 en suero se midió por ELISA utilizando un equipo ELISA de IGF-1 de ratón/rata (MG100) (R&D Systems™, Inc., Minneapolis, N, USA).

Los datos del estudio de modelo de cáncer de ratón se muestran en la Tablas 16 y 17 siguientes. La Tabla 16 muestra el volumen tumoral medio (en mm3) en animales control, los animales tratados con Ab11 del anticuerpo antagonista de GHR, los animales tratados con irinotecan, y los animales tratados con tanto Ab11 e irinotecan. La Tabla 17 muestra el peso de tumor promedio (en gramos) al día 28 en animales control, los animales tratados con Ab1 1 del anticuerpo antagonista de GHR, los animales tratados con irinotecan, y los animales tratados con tanto Ab1 1 y irinotecan. En las Tablas 15 y 16, los valores se dieron como un medio para cada grupo de animales tratados con el anticuerpo lgG1 control, anticuerpo antagonista de GHR, irinotecan, o combinación de anticuerpo antagonista de GHR e irinotecan. Para los datos en las Tablas 15 y 16, * indica p < 0.05 contra control, ** índica p < 0.01 contra control, y *** indica p < 0.001 contra control.

TABLA 15 Volumen tumoral lmm]) en los ratones BALB/c que llevan los tumores CT26.

TABLA 16 Peso tumoral (en gramos) y los niveles de IGF-1 en suero (ng/mL) en el día 28 en ratones BALB/c que llevan el tumor CT26.

La Tabla 15 muestra el volumen de tumor promedio el cual fue significativamente menor en animales tratados con el anticuerpo antagonista de GHR en combinación con irinotecan (1092.1 mm3) que el volumen de tumor promedio en animales control (1939.7 mm3).

La Tabla 16 mostró el día 28 los niveles de IGF-1 del suero promedio, los cuales fueron significativamente menores en animales tratados con el anticuerpo antagonista de GHR, ya sea sola (298.6 ng/mL) o en combinación con irinotecan (278 ng/mL), comparados con los niveles de IGF-1 en suero en animales control (410.1 ng/mL). Estos resultados demostraron que el tratamiento con el anticuerpo antagonista de GHR es efectivo para disminuir los niveles de IGF-1 en sangre en un modelo de ratón de cáncer. La Tabla 16 también muestra el día 28 el peso de tumor promedio, el cual fue significativamente menor en animales tratados con el anticuerpo antagonista de GHR en combinación con irinotecan (0.8 g), comparados con el peso de tumor promedio en animales control (1.9 g). El tratamiento con irinotecan solo resultó en un peso de tumor promedio de 1.2 g. Estos resultados demostraron que el tratamiento con el anticuerpo antagonista de GHR en combinación con irinotecan es efectivo para inhibir el crecimiento tumoral en un modelo de ratón de cáncer.

EJEMPLO 7 Anticuerpos Antagonistas de GHR son Efectivos para Reducir la Severidad de Enfermedad en un Modelo de Ratón de Artritis Inducida por Colágeno Este Ejemplo ilustra el efecto de anticuerpos antagonistas de GHR en la severidad de enfermedad en un modelo de ratón de artritis inducida por colágeno.

Para determinar si los anticuerpos monoclonales antagonistas de GHR pueden reducir la severidad de la enfermedad en artritis el efecto de un anticuerpo de ratón, Ab11 , se probó en un modelo de ratón de artritis inducida por colágeno.

Cuarenta y cuatro ratones macho (cepa B10.RIII-H2r H2-T18bl(71NS)SnJ. existencia No. 000457) se compraron de los Laboratorios Jackson (Bar Harbor, ME), y se dejaron aclimatar durante siete días después de la llegada. Los animales fueron de aproximadamente 8 semanas en el momento de iniciar el estudio. Los ratones se asignaron aleatoriamente 4 grupos de 10 para recibir inducción de artritis reumatoide. Un grupo de 4 ratones sin tratar saludables se analizaron como control. En el Día 0 y día 15, los animales del grupo enfermedad se anestesiaron con isoflurano y se inyectaron intradérmicamente con colágeno de tipo II de bobina de 200 pg (Elastin Products, Owensville, MO) en adyuvante completo de Freund 100 µ? (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) con tuberculosis de micobacterium suplemental 4 mg/ml (Dífco Laboratories, Detroit, MI). Los animales recibieron una inyección intraperitoneal (IP) del artículo de prueba Ab11 o vehículo control profilácticamente en el Día -1. Dos dosificaciones de IP semanalmente con 3 mg/kg, 10 mg/kg, o 30mg/kg en el anticuerpo Ab11 o una inyección de control de vehículo (PBS polisorbato 20 al 0.01%. JT Baker, No. Cat 4116-04, Phillipsburg, NJ) seguido por un período de un mes. Los ratones se anestesiaron con isoflurano y se sangraron mediante el seno orbital para el suero en el Día -4, Día 15, y Día 29. Las muestras de suero se congelaron en -20°C o por debajo hasta el momento del análisis.

Se observaron y se registraron los puntajes clínicos para las cuatro patas diariamente. Los experimentadores trabajaron en ciego a la identidad de los grupos de dosificación en todo momento. Los puntajes se determinaron de acuerdo con los siguientes criterios. 0 = Saludable; 1 = Una articulación de la pata trasera o delantera afectada o eritema difuso mínimo e hinchazón; 2 = Dos articulaciones de la pata trasera o delantera afectadas o con eritema difuso leve e hinchazón; 3 = Tres articulaciones de la pata trasera o delantera afectada o con eritema difuso moderado e hinchazón; 4 = Eritema difuso marcado o hinchazón, o cuatro articulaciones de los dedos afectados; 5 = Eritema difuso severo y la pata completa con hinchazón severa, incapaz de flexionar los dedos.

En el día 29, la mitad de los ratones (5 por grupo para el conjunto con enfermedad y 2 ratones del conjunto de control saludable) se sacrificaron y sus patas delanteras, patas traseras, y rodillas se removieron y se colocaron en formalina regulada neutra. Las patas delanteras, patas traseras, y rodillas se fijaron durante 1-2 días, después se transfirieron por el descalsificador durante 4-5 días. Estas articulaciones se incorporaron, se seccionaron y se tiñeron con azul de toluidina. El puntaje histopatológico se realizó en las patas y rodilla para inflamación, presencia de pannus, daño en el cartílago, y daño en el hueso. Los siguientes criterios se utilizaron para clasificar el tejido. Inflamación: 0 = Normal; 1 = Infiltración mínima de las células inflamatorias durante el virus sinoviam y periarticular de las articulaciones afectadas; 2 = Infiltración leve; si las patas, se restringen a articulaciones afectadas; 3 = Infiltración moderna con edema moderado; si las patas, se restringen a las articulaciones afectadas; 4 = Infiltración marcada que afecta la mayoría de las áreas con edema marcado; 5 = Infiltración difusa severa con edema severo. Pannus: 0 = Normal; 1 = Infiltración mínima de pannus en cartílago y el huevo subcondral; 2 = Infiltración media con destrucción de zona marginal del tejido duro en las articulaciones afectadas; 3 = Infiltración moderada con destrucción del tejido duro moderado en articulaciones afectadas; 4 = Infiltración marcada con destrucción marcada de la arquitectura de la articulación, mayoría de las juntas; 5 = Infiltración severa asociada con la destrucción total o casi total de la arquitectura de juntas, afecta todas las articulaciones. Daño del Cartílago: 0 = Normal; 1 = Mínimo: Pérdida mínima a leve de tinción de azul de toluidina sin pérdida de condrocita obvio o alteración de colágeno en las articulaciones afectadas; 2 = Leve: Pérdida leve de la tinción de azul de toluidina con pérdida de condrocito leve (superficial) focal y/o alteración del colágeno en articulaciones afectadas; 3 = Moderado: Pérdida moderada de tinción de azul de toluidina con condrocito moderado multifocal (zona profunda a media) y/o alteración del colágeno en las articulaciones afectadas; 4 = Marcados: Pérdida marcada de tinción de azul de toluidina con pérdida de condrocito marcado multifocal (zona de profunda a intensa) y/o alteración de colágeno en la mayoría de las articulaciones; 5 = Severa: Pérdida difusa severa de la tinción de azul de toluidina con pérdida de condrocito severamente multifocal (de profundo a muy marcado) y/o alteración de colágeno en todas las articulaciones. Reabsorción ósea: 0 = Normal; 1 = Mínima. Áreas mínimas de reabsorsión, no son fácilmente aparentes a bajo aumento, osteoclastos raros en articulaciones afectadas; 2 = Leve: Más áreas numerosas de reabsorción, no son fácilmente aparentes a bajo aumento, osteoclastos más numerosos en las articulaciones afectadas; 3 = Moderado: Reabsorción obvia del hueso trabecular y cortical medularmente sin defectos de espesor completo en la corteza, pérdida de algunas trabéculas medulares, lesión aparente a bajo aumento, osteoclastos más numerosos en las articulaciones afectadas; 4 = Marcado: Defectos de espesor completos en el hueso cortical, incluso a menudo con distorsión del perfil de las superficie cortical restante, pérdida marcada de hueso medular, numerosos osteoclastos, afecta a la mayoría de las articulaciones; 5 = Severo: Defectos de espesor completos en el hueso cortical y destrucción de la arquitectura de articulación de todas las articulaciones.

Los pesos corporales se midieron y se registraron diariamente. El porcentaje de carga en el peso corporal del día 14 (manifestación de enfermedad) hasta el día 29 se calcularon para cada grupo. En el Día 29, la mitad de los ratones (5 por grupo para el conjunto con enfermedad y 2 ratones del conjunto de control saludable) se sacrificaron y sus patas traseras se removieron y se pesaron.

El suero del día 29 la recolección de sangre se analizó para niveles de anticuerpos terapéuticos Ab1 1. Las placas de ELISA maxisorp de 96 pozos Nunc (No. de Cat 446612, Dinamarca) se revistieron con 100 µ?/???? de 5 pg/ml de quimera GHR/Fc de ratón recombinante (R&D Systems. Cat No. 1360-GR, Minneapolis, MN) en 1X PBS (Cellgro - Mediatech, Herndon, VA). Una serie de 2 veces de dilución de Ab1 1 se utilizó para la curva estándar, con la dilución mayor que 0.03 pg/ml. Los estándares y las muestras se diluyeron en el regulador de ensayo que consiste de BSA al 0.5% (No. de Cat A7906, Sigma, St. Louis, MO) en 1X PBS y se cargaron a 100 µ?/????. Una dilución de 1 :2000 se lgG1 anti-ratón de conejo; conjugado con HRP (Zymed, No. de Cat 61-0120, South San Francisco, CA) en el regulador de ensayo se utilizó como un anticuerpo de detección. Las placas de Elisa se desarrollaron utilizando sustrato de TMB (No. de Cat 50-76-02/50-65-02, KPL, Gaithersburg, MD) y se detuvo con ácido fosfórico 1 M. Las placas se leyeron a 450 nm en un lector de microplaca de Dispositivos Moleculares.

Los autoanticuerpos se midieron a partir del suero recolectado en el estudio de los días 15 y 29. Las placas de ELISA Nunc se revistieron con 5 pg/ml de colágeno de tipo II de bobino (Rockly, No. de Cat 001-001-104). A una dilución de 1 :5000 de IgG anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa (H+L) (Jackson ImmunoResearch labs. No. de Cat 115-035-146, West Grove, PA) en un regulador de ensayo se utilizó como un anticuerpo de detección. Las placas de ELISA se desarrollaron utilizando un sustrato de TMB (No. de Cat 50-76-02/50-65-02, KPL, Gaithersburg, MD) y se detuvo con ácido fosfórico 1 M. Las placas se midieron a 450nm en un lector de microplaca de Dispositivos Moleculares. Los puntajes de densidad óptica se graficaron para cada dilución.

El suero a partir de la recolección de sangre de los valores de referencia, Día 15, y Día 29 se analizaron para el nivel de IGF-1. Las ELISA se etiquetaron utilizando un kit de inmunoensayo IGF-1 de Ratón Quantikino (R&D Systems. No. de Cat MG100, Minneapolis, MN). Las placas se midieron a 450 nm en un lector de microplaca de Dispositivos Moleculares. Los cambios de porcentaje de IGF-1 de valores de referencia se calcularon para cada punto de tiempo. Los animales tratados con Ab11 mostraron una disminución dependiente de la dosis en los niveles de IGF-1 comparados con el control (datos no mostrados).

En el dia 31 , la mitad de los ratones (5 por grupo para el conjunto con enfermedad y 2 ratones del conjunto de control saludable) se sacrificaron y sus nodos linfáticos inguinales se recolectaron y se analizaron para el tipo el tipo de célula específico utilizando análisis de FACS. Las suspensiones de célula individuales a partir de desdrenar los nodos linfáticos se generaron al empujar suavemente el tejido linfoide a través de una malla de alambre con el extremo de émbolo de caucho de una jeringa de 3 mi. Después de la recolección, las células se lavaron en el regulador de tinción (DPBS sin Mg2+ o Ca2+ más FCS inactivado con calor al 1 %, pH 7.4 - 7.6), y se bloquearon con anti-CD16-CD32 (2.4G2, BD Biosciences, San José, CA). Las células se lavaron nuevamente, después se tiñeron durante 30 minutos en la oscuridad a 4°C con anticuerpos etiquetados con fluorescencia específicos para CD4 marcadores de desperdicio celular (CD4-PerCP, BD Biosciences, No. de Cat. 553052), CD8 (CD8-APC, BD Biosciences, No. de Cat. 553035), IgD (IgD-FITC, BD Biosciences, No. de Cat. 553439), y CD25 (CD25-PE, BD Biosciences, No. de Cat. 558642). Los datos adquiridos en una FACSAria (BD Biosciences) y se analizaron con un software FACS Diva.

En el día 31 , la mitad de los ratones (5 por grupo para el conjunto con enfermedad y 2 ratones del conjunto de control saludable) se sacrificaron y sus bazos se recolectaron y se analizaron para el tipo el tipo de célula especifico utilizando análisis de FACS. Las suspensiones de célula individuales de esplenocito se generaron al empujar suavemente el tejido a través de una malla de alambre con el extremo de émbolo de caucho de una jeringa de 3 mi. Después de la recolección, las células se lavaron en el regulador de tinción (DPBS sin Mg2+ o Ca2+ más FCS inactivado con calor al 1 %, pH 7.4 - 7.6), y se bloquearon con anti-CD16-CD32 (2.4G2, BD Biosciences, San José, CA). Las células se lavaron nuevamente, después se tiñeron durante 30 minutos en la oscuridad a 4°C con anticuerpos etiquetados con fluorescencia específicos para CD4 marcadores de desperdicio celular (CD4-PerCP, BD Biosciences, No. de Cat. 553052), CD8 (CD8-APC, BD Biosciences, No. de Cat. 553035), IgD (IgD-FITC, BD Biosciences, No. de Cat. 553439), y CD25 (CD25-PE, BD Biosciences, No. de Cat. 558642). Los datos adquiridos en una FACSAria (BD Biosciences) y se analizaron con un software FACS Diva.

En el Día 31 , la mitad de los ratones (5 por grupo para el conjunto de enfermedad y 2 ratones del conjunto de control saludable) se sacrificaron, y la sangre entera se recolectó a partir del vehículo tratado, 3 y 10 mg/kg de Ab11 tratado, y ratones control saludables. No se recolectó sangre de los ratones tratados con 30 mg/kg. L a sangre se analizó por citometría de flujo utilizando el Sistema de Hematología ADVIA 120 (Siemens Medical Solutions Diagnostics, Tarrytown, NY). Los glóbulos blancos se contaron y se reportaron en unidades de 1000 células por mm3. Los glóbulos rojos se contaron y se reportaron en unidades de un millón de células por mm3. Los linfócitos y monocitos se contaron y reportaron como el porcentaje de glóbulos blancos. Los neutrófilos y eosinófilos se contaron y se reportaron como porcentaje de glóbulos blancos.

El tratamiento con Ab1 1 de anticuerpo antagonista de GHR resultó en una disminución en el puntaje en artritis clínica comparada con el control. Por ejemplo, en el día 21 , los animales tratados con el anticuerpo antagonista de GHR tuvieron un puntaje clínico (pata) de alrededor de 0.5 (dosis de 30 mg/kg), Alrededor de 0.7 (dosis de 3 mg/kg), o alrededor de 1.1 (dosis de 10 mg/kg). Por el contrario, en el día 21 , los animales control tuvieron un puntaje clínico de alrededor de 1.8. En el día 29, los animales tratados con el anticuerpo antagonista de GHR tuvieron un puntaje clínico (pata) de alrededor de 2 a 2.5. Por el contrario, en el día 29, los animales control tuvieron un puntaje clínico de alrededor de 3.5.

Estos resultados demuestran que el tratamiento con los anticuerpos antagonistas de GHR es eficaz para reducir la severidad en un modelo de ratón de artritis inducida por colágeno.

Todas las patentes, solicitudes de patente, entradas GenBank, manuales de referencia, y publicaciones citadas en lo anterior y en otras partes en la solicitud, se incorporan en la presente para referencia en su totalidad para todos los propósitos al mismo grado como si cada publicación individual, patente y solicitud de patente se indicaran específica e individualmente para incorporarse así por referencia. En caso de que uno o más de la literartura incorporada y materiales similares difieran de o contradigan esta solicitud incluyendo pero no limitada a términos definidos, el uso del término, las técnicas descritas, o similares, ésta controla la solicitud.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REVINDICACIONES

1. Un anticuerpo antagonista de GHR aislado que específicamente se une al receptor de hormona de crecimiento (GHR) de humano y de mono cynomolgus y, cuando se administra a un sujeto, disminuye un nivel de factor-1 de crecimiento tipo insulina (IGF-1 ) en la sangre del sujeto.

2. El anticuerpo antagonista de GHR aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el anticuerpo comprende una región de unión de antigeno que compite con SS1 de anticuerpo monoclonal para la unión de GHR humano.

3. El anticuerpo antagonista de GHR aislado de conformidad con la revinvidicacion 1 , caracterizado además porque el anticuerpo reconoce un epítope que es el mismo como o se traslapa con el epítope en el GHR humano reconocido por el anticuerpo monoclonal SS1.

4. El anticuerpo antagonista de GHR aislado de conformidad con cualquiera de las revindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque el anticuerpo se une al GHR humano con una constante de disociación de equilibrio de menos de alrededor de 10 nM.

5. El anticuerpo antagonista de GHR aislado de conformidad con cualquiera de las revindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera.

6. Un anticuerpo antagonista de GHR aislado que se une específicamente al receptor de la hormona de crecimiento (GHR) y comprende: una región variable de cadena pesada (VH), región de determinación complementaria uno (CDR1) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 , 15 ó 16, a CDR2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114 ó 115, una CDR3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 18, una región variable de cadena ligera (VL) CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 99, una CDR2 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, y una CDR3 de VL que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106.

7. Un anticuerpo antagonista de GHR aislado que se une específicamente al receptor de hormona de crecimiento (GHR) y comprende: una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una región de determinación complementaria uno (CDR1) de VH, CDR2 de VH, y CDR3 de VH de la secuencia de VH de SEQ ID NO: 8; y una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una CDR1 de VL, CDR2 de VL, y CDR3 de VL.

8. El anticuerpo antagonista de GHR aislado de conformidad con la revindicación 7, caracterizado además porque el VL comprende una CDR1 , CDR2 de VL, y CDR3 de VL de la secuencia de VL de SEQ ID NO: 7.

9. El anticuerpo antagonista de GHR aislado de conformidad con cualquiera de revindicaciones 6 a 8, caracterizado además porque la CDR1 de VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , 15 ó 16, la CDR2 de VH comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ó 17, la CDR3 de VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, la CDR1 de VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, la CDR2 de VL comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, y la CDR3 de VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

10. El anticuerpo antagonista de GHR aislado de conformidad con la revindicación 9, caracterizado además porque el VH comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 o una variante de la misma con una o varias sustituciones de aminoácidos conservadoras en residuos que no se encuentran dentro de una CDR, y la VL comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 o una variante de la misma con una o diversas sustituciones de aminoácidos en los aminoácidos que no están dentro de una CDR.

11. El anticuerpo antagonista de GHR aislado de conformidad con cualquiera de las revindicaciones 6 a 10, caracterizado además porque el anticuerpo comprende adicionalmente una región constante inmunológicamente inerte.

12. El anticuerpo antagonista de GHR aislado de conformidad con la revindicación 11 , caracterizado además porque el anticuerpo tiene un isotipo que se selecciona del grupo que consiste de lgG2, lgG2Aa, lgG4, l G4ab, lgG4Ac, lgG4 S228P, lgG4¿b S228P e lgG4Ac S228P.

13. El anticuerpo antagonista de GHR aislado de conformidad con la revindicación 1 , caracterizado además porque la región constante es Fe aglicosilado.

14. El anticuerpo antagonista de GHR aislado de conformidad con la revindicación 10, caracterizado además porque el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134 ó 133, y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 135.

15. Una composición farmacéutica comprende el anticuerpo de cualquiera de las revindicaciones 1 a 14.

16. Una linea célular que produce recombinantemente el anticuerpo de cualquiera de las revindicaciones 1 a 14.

17. Un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera de los anticuerpos de cualquiera de las revindicaciones 1 a 14.

18. El uso de un anticuerpo de cualquiera de las revindicaciones 1 a 14, en la preparación de un médicamente para reducir un nivel del factor-1 de crecimiento tipo insulina (IGF-1) en sangre de un individuo en necesidad del mismo.

19. El uso de la revindicación 18, en donde el nivel de IGF-1 se reduce en al menos alrededor de 40%.

20. El uso de la revindicación 18, en donde el nivel de IGF-1 se reduce al menos alrededor de 60%.

21. El uso de la revindicación 18, en donde el individuo tiene una enfermedad seleccionada del grupo que consiste de acromegalia, gigantismo, cáncer, nefropatía diabética, artritis e inflamación pulmonar.

22. El uso del anticuerpo de cualquiera de las revindicaciones 1 a 14, en la preparación de un medicamento para tratar acromegalia en un individuo en necesidad del mismo.

23. El uso del anticuerpo de cualquiera de las revindicaciones 1 a 14, en la preparación de un medicamento para tratar gigantismo en un individuo en necesidad del mismo.

24. El uso del anticuerpo de cualquiera de las revindicaciones 1 a 14, en la preparación de un medicamento para tratar cáncer en un individuo en necesidad del mismo.

25. El uso del anticuerpo de cualquiera de las revindicaciones 1 a 14, en la preparación de un medicamento para tratar nefropatía diabética en un individuo en necesidad del mismo.

26. El uso del anticuerpo de cualquiera de las revindicaciones 1 a 14, en la preparación de un medicamento para tratar inflamación pulmonar en un individuo en necesidad del mismo.

27. El uso del anticuerpo de cualquiera de las revindicaciones 1 a 14, en la preparación de un medicamento para tratar artritis en un individuo en necesidad del mismo.

28. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para usarse en la reducción de un nivel del factor-1 de crecimiento tipo insulina (IGF-1) en la sangre de un individuo que lo necesita.

29. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el nivel de IGF-1 se reduce en por lo menos aproximadmente 40%.

30. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el nivel de IGF-1 se reduce en por lo menos aproximadamente 60%.

31. El anticuerpo de conformiad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el individuo tiene una enferemedad seleccionada del grupo que consiste en acromegalia, gigantismo, cáncer, nefropatia diabética, artritis, e inflamación pulmonar.

32. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para usarse en el tratamiento de acromegalia en un individuo que lo necesita.

33. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para usarse en el tratamiento de gigantismo en un individuo que lo necesita.

34. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para usarse en el tratamiento de cáncer en un individuo que lo necesita.

35 El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para usarse en el tratamiento de nefropatia diabética en un individuo que lo necesita.

36. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para usarse en el tratamiento de inflamación pulmonar en un individuo que lo necesita.

37. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para usarse en el tratamiento de artritis en un individuo que lo necesita.