JP3540315B2 - キメラ抗体の製造−組合せアプローチ - Google Patents

Description

本発明は抗体の製造に関する。より詳しくは、本発明は、同一抗原に特異的な親の抗体よりも増加されたヒトの特性を有する抗体の製造に関する。
ハイブリドーマ技術を使って多数の齧歯類モノクローナル抗体が単離されており、ヒトにおいて生体内での治療目的や診断目的に使われている。例えば、それらのマウスモノクローナル抗体の初期の適用は腫瘍を抹殺するためまたは画像診断するための標的剤としてであった（F.H.DelandおよびD.M.Goldenberg,1982,“Radio−nuclide Imaging"D.E.Kuhl編,289−297頁,Pergamon,Paris;R.LevyおよびR.A.Miller,Ann.Rev.Med.,1983,34,107−116頁）。しかしながら、そのような抗体の生体内使用は問題を引き起こし得る。外来の免疫グロブリンは抗グロブリン応答を惹起せしめ（ヒト抗マウス抗体（HAMA）応答として知られる）、該応答は療法を妨害し（R.A.Millerら,1983,Blood,62,988−995）またはアレルギー性過敏症もしくは免疫複合体過敏症を引き起こし得る（B.Ratner,1943,Allergy,Anaphylaxis and Immunotherapy,Williams and Wilkins,Baltimore）。
それらの問題を解決するために、Winterと同業者（GB 2188638B）は、そのような抗体をヒト化する、即ち「再構築する（reshaping）」方法を開発した。抗原結合部位を含んで成るマウス抗体の相補性決定領域（CDR）をヒトのフレームワーク領域中に挿入し、それによってCDR配列のみが元のマウス抗体に由来する抗体を作製する。これは、「CDR移植」または「CDR刷り込み」として知られる技術である。そのような１つの再構築された抗体CAMPATH−１（L.Riechmannら,1988,Nature 322,323−327頁）がＢ細胞リンパ腫（G.Haleら,1988,Lancer 2,1394−1399頁）、脈管炎（P.W.Mathiesonら,New.Engl.J.Med.,1990,323,250−254頁）および慢性関節リウマチ（V.Kyleら,1991,J.Rheumatol.18,1737−1738頁）の治療において好結果に使われている。これは癌マーカー、例えばインターロイキン−２レセプター（C.Queenら,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,10029−10033頁）；表皮増殖因子レセプター（C.A.Kettleboroughら,1991,Protein Eng.4,773−783頁;P.Carterら,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,4285−4289頁）および癌胎児抗原（K.Bossletら,1992,Brit.J.Cancer 65,234−238頁）に対して向けられた治療目的の多数の抗体のヒト化を促した。感染性ウイルスに対して向けられた多数の抗体、例えばRSウイルス（P.R.Tempestら,1991,Bio/Technology 9,266−271頁）；単純ヘルペスウイルス（M.S.Coら,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,2869−2873頁）およびヒト免疫不全ウイルス（H.Maedaら,1991,Human Antibodies and Hybridomas 2,124−134頁）に対して向けられた抗体もヒト化されている。ヒト化された抗体は、放射性同位体で標識後、腫瘍の画像診断にも使われている（V.Hirdら,1991,Brit.J.Cancer 64,911−914頁）。
好結果の再構築は、各ドメインのβ−シートの方向および重鎖と軽鎖の一緒の詰め込みの両方が構造的に保持されている齧歯類とヒトのフレームワーク領域に依存する。超可変性ループが抗原との接触の大部分を行っており、該ループは基礎をなすβ−シートフレームワークにより同様な方法で保持される。それらの条件は幾つかの抗体には正しいらしいが、或る抗体ではループとフレームワークとの鍵状接触の回復が必要なことがわかり、これは分子モデル作製（Riechemanら,1988,前掲;Tempestら,1991,前掲）や一次配列の相違を最少にするような齧歯類とヒトのフレームワーク領域の組織的合致（Queenら,1989,前掲;Gormanら,1991,前掲;Maedaら，前掲）により支持された。重鎖および軽鎖可変ドメインの両方のCDRの基礎をなす“Vernier"帯に多数の残基があり、この“Vernier"帯がCDR構造を調整しそして抗原と合うように微調整し、よって親和性と特異性に強力な効果を及ぼし得ることが研究により示されている（J.FooteおよびG.Winter,1992,J.Mol.Biol.224,487−499）。このアプローチの変形は、埋没するアミノ酸残基はマウス抗体に由来しそして露出するアミノ酸は相同のヒトフレームワークに由来するというヒト／マウスキメラフレームワーク上にマウスCDRを転移せしめることである（E.A.Padlanら,1991,Mol.Immunol.28,485−498）。
CDR移植の過程は、非ヒト（動物）抗体からヒト抗体への抗原結合部位の転移を含む。ほとんどの場合、重鎖と軽鎖の両方からの３つのCDR全てが動物抗体から１つのヒトフレームワークに移植されている。幾つかのCDRは抗原への結合に関与しないことがあり、また異なる配列を有するCDRが同じ折りたたみを有することができる（従って異なる配列にもかかわらず抗原から主鎖への接触が保持され得る）ため、常に全てのCDRを移植する必要はないと予想される。実際、単一のドメイン（Wardら,1989,Nature 341,544−546頁）または単一のCDRでさえも（R.Taubら,1989,J.Biol.Chem.264,259−265頁）それだけで抗原結合活性を有することができる。しかしながら、CDRの全部を移植するにせよ幾つかだけを移植するにせよ、CDR移植の意図は、同じまたはほとんど同じ抗原部位を動物抗体からヒト抗体に移植することである。
構造的には、最も単純な抗体（IgG）は４本のポリペプチド鎖、即ちジスルフィド結合によって相互に連結された２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖を含んで成る（図１参照）。軽鎖はカッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの異なる形態で存在する。各鎖は定常領域（Ｃ）と可変領域（Ｖ）を有する。各鎖は一連のドメインに編成される。軽鎖は２つのドメインを有し、一方がＣ領域で他方がＶ領域に相当する。重鎖は４つのドメインを有し、１つはＶ領域に相当し、３つのドメイン（1,2,3）はＣ領域にある。抗体は２本のアーム（各アームはFab領域である）を有し、その各々は互いに結合されたV_L領域とV_H領域を有する。Ｖ領域のこのペア（V_LとV_H）は抗体ごとに異なっており（アミノ酸配列変化のため）、一緒になって抗原を認識しそして抗原結合部位（ABS）を提供する原因となる。更により詳しくは、各Ｖ領域は、４つのフレームワーク領域（FR）により隔てられた３つの相補性決定領域（CDR）から構成されている。CDRは可変領域の最も可変的な部分であり、それらは重要な抗原結合機能を果たす。CDR領域は、組換え、突然変異および選択を含む複雑な過程を経て多数の潜在的生殖細胞系列配列から誘導される。
抗原を結合する機能が完全抗体の断片により果たされ得ることは証明されている。例えば結合性断片は、（ｉ）V_L,V_H,C_LおよびC_H1ドメインから成るFab断片；（ii）V_HドメインとC_H1ドメインとから成るFd断片；（iii）抗体の一本のアームのV_LドメインとV_Hドメインとから成るFv断片；（iv）V_Hドメインから成るdAb断片（Ward,E.S.ら,Nature 341,544−546,1989）；（ｖ）単離されたCDR領域；並びに（vi）ヒンジ領域のところでジスルフィド結合によって連結された２つのFab断片を含んで成る二価断片であるＦ（ab'）_２断片である。
Fv断片の２つのドメインは別の遺伝子によってコードされるけれども、それらを単一タンパク質鎖〔一本鎖Fv（scFv）として知られる;Bird,R.E.ら,Science 242,423−426（1988）;Huston,J.S.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,5879−5883（1988）〕として生産できるようにする合成リンカーを組換え法により作製することが可能であると判明した。
モノクローナル抗体のヒト化を使った経験により、それらの分子が治療と診断に非常に有益なものとなり得ることが示されている。しかしながら、マウスモノクローナル抗体の元の特性を保持または改善するものを得るために多数のヒト化された抗体誘導体をモニタリングすることができるための必要条件がある。更に、迅速且つ簡便な方法によってそのような分子を作製するための必要条件がある。
用語法
この章で説明する用語のほとんどは適宜明細書中に言及されているものである。
複製可能な遺伝表示パッケージ（Rgdp）
これは、複製能力をもった粒子を提供する遺伝情報を有する生物学的粒子を言う。該粒子はその表面上にポリペプチドの少なくとも部分を表示することができる。該ポリペプチドは、該粒子にとって生来である遺伝情報および／または該粒子中もしくはその祖先中に人工的に置かれた遺伝情報によりコードされ得る。表示されるポリペプチドは、特異的結合ペアのいずれかのメンバー、例えば免疫グロブリン分子を基にした重鎖もしくは軽鎖ドメイン、酵素またはレセプター等であることができる。
該粒子はウイルス、例えばfdまたはM13といったバクテリオファージでもよい。
パッケージ
これは、前記粒子が特異的結合ペアのメンバーをその表面上に表示している複製可能な遺伝表示パッケージを言う。該パッケージはその表面上に抗原結合性ドメインを表示するバクテリオファージであることができる。この型のパッケージはファージ抗体（pAb）と呼ばれている。
抗体
これは、天然に産生されるにせよ部分的または完全に合成により製造されるにせよ免疫グロブリンを言う。この用語は免疫グロブリン結合性ドメインに相同である結合性ドメインを有する任意のタンパク質をも包含する。それらのタンパク質は天然源から誘導されるか、または部分的にもしくは完全に合成により製造されてもよい。
例となる抗体は免疫グロブリンイソタイプおよびFab,F（ab'）₂,scFv,Fv,dAb,Fd断片である。
抗体ポリペプチド二量体
抗体ポリペプチド二量体は、抗原を結合することができる、抗体の２本のポリペプチド鎖の会合体である。それは重鎖と軽鎖とから成る抗体の一本のアームであってもよく、V_L,V_H,C_LおよびC_H1抗体ドメインから成るFab断片、V_LドメインとV_Hドメインとから成るFv断片、または合成リンカーによってV_Hドメインに連結されたV_Lドメインから成るscFv（「一本鎖Fv」）断片であってもよい。scFv断片は、合成リンカーによって結合された抗体の２つのポリペプチド鎖成分から成り、抗原を結合することができるため、「抗体ポリペプチド二量体」の定義の中に含まれる単一ポリペプチド鎖である。
免疫グロブリンスーパーファミリー
これは、ポリペプチドのファミリーであって、そのメンバーが免疫グロブリン分子の可変または定常領域の構造に関連した構造を有する少なくとも１つのドメインを有するものを言う。該ドメインは、２つのβ−シートと通常は１つの保存されたジスルフィド結合を含む（A.F.WilliamsおよびA.N.Barclay,1988,Ann.Rev.Immunol.6,381−405を参照のこと）。
免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーの例は、CD4、血小板由来増殖因子レセプター（PDGFR）、細胞間接着分子（ICAM）である。異なって指図されない限り、本明細書中での免疫グロブリンおよび免疫グロブリン同族体への言及は、免疫グロブリンスーパーファミリーとその同族体のメンバーを包含する。
同族体
この用語は、それらの一次、二次または三次構造において対応位置に同一のまたは保存された残基を有するポリペプチドを指摘する。この用語は同族のポリペプチドをコードする２以上のヌクレオチド配列にも及ぶ。
同族のポリペプチドの例は免疫グロブリンイソタイプである。
遺伝学上多様な集団
抗体またはそれのポリペプチド成分との関連において、この用語は細胞または生物体の自然集団中に存在し得る多様性だけでなく、試験管内または生体内での人工的突然変異によって生じ得る多様性も指している。
試験管内突然変異誘発は、例えば、変えたいと思う配列のランダム変異を有するオリゴヌクレオチドを使ったランダム突然変異誘発を含むことができる。生体内突然変異誘発は、例えば、DNAを導入するのに宿主微生物の変異株を使うことができる（例えばWO 92/01047の実施例38を参照のこと）。「ユニーク集団」という用語は、遺伝学上多様でない、即ち全て同一である、複数の例えばポリペプチド鎖を表示するのに使う。限定集団は、多様であるが動物の全レパートリーよりもずっと少ない集団である。多様性は例えば抗原結合特異性を使った予備選別により減少させておくことができる。
ドメイン
ドメインは、それ自体の中で且つ同一タンパク質の他の部分とは無関係に且つ相補的結合メンバーとは無関係に折りたたまれるタンパク質の部分である。
折りたたみ単位
これは、α−ヘリックスおよび／またはβ−ストランドおよび／またはβ−ターン構造の特定の組合せである。ドメインおよび折りたたみ単位は、一次構造では近位でないアミノ酸を一緒にする構造を含有する。
遊離形
これは複製可能な遺伝表示パッケージによって表示されないポリペプチドの状態を言う。
条件的に欠損のある
これは、或る設定条件下では特定のポリペプチドを発現しないが、別の設定条件下では該ポリペプチドを発現する遺伝子を言う。一例は、それぞれ非抑制性または抑制性宿主において発現されるアンバー変異を含む遺伝子である。
あるいは、遺伝子は、或る設定条件下では欠損があるが別の設定条件下では欠損がないタンパク質を発現することがある。その例は温度感受性変異を有する遺伝子である。
抑制性翻訳終結コドン
これは、或る設定条件下では該コドンの下流のヌクレオチド配列の翻訳を許容するが、別の設定条件下では該コドンのところで翻訳が終結するコドンを言う。抑制性翻訳終結コドンの例は、アンバー、オーカーおよびオパールコドンである。
変異誘発株
これは、該株内で複製されたDNAを親のDNAに関して突然変異させる遺伝的欠損を有する宿主細胞である。変異誘発株の例はNR9046mutD5およびNR9046mutT1である（WP 92/01047の実施例38を参照のこと）。
ヘルパーファージ
これは、欠損性ファージゲノムを含む細胞を感染せしめるのに使われ該欠損を補完する機能を持つファージである。欠損性ファージゲノムは、遺伝子配列をコードする或る種の機能が除去されているファージまたはファジミドであることができる。ヘルパーファージの例はM13K07、K13K07遺伝子III No.3、およびキャプシドタンパク質と融合した結合性分子を表示またはコードするファージである。
ベクター
これは、宿主生物体内で複製することができるDNA分子であって、組換えDNA分子を作製するためにその中に遺伝子が挿入されるDNA分子である。
ファージベクター
これは、バクテリオファージの複製開始点を含むがプラスミドの複製開始点は含まない、ファージゲノムの変更によって誘導されたベクターである。
ファジミドベクター
これは、バクテリオファージの複製開始点とプラスミドの複製開始点とを含む、プラスミドゲノムの変更によって誘導されたベクターである。
分泌される
これは、rgdpまたはrgdp上に表示されたポリペプチドと会合する分子を言い、ここで該ポリペプチドおよび／または該分子は細胞のサイトゾルの外部で折りたたまれ且つパッケージが構築される。
再配列された免疫グロブリン遺伝子のレパートリー
動物中で発現される免疫グロブリン遺伝子をコードする天然に存在するヌクレオチド、例えばDNA配列の収集物。それらの配列は、Ｈ鎖については例えばV,DおよびＪセグメント、Ｌ鎖については例えばＶおよびＪセグメントの生体内再配列によって作製される。あるいは、該配列は、試験管内で免疫処置した細胞系からおよび免疫処置に応答した再配列が細胞内で生じるような細胞系から作製してもよい。「レパートリー」という語は遺伝学的多様性を示すために使われる。
ライブラリー
クローン内部のヌクレオチド（例えばDNA）配列の収集物；ポリペプチドまたは特異的結合ペアメンバーの遺伝学的に多様な収集物；あるいは、個々のポリペプチドもしくはsbpメンバーまたはポリペプチドもしくはsbpメンバーの混合集団を提供するために選択もしくはスクリーニングすることのできるrgdp上に表示されたポリペプチドもしくはsbpメンバーの遺伝学的に多様な収集物。
人工的に再配列された免疫グロブリン遺伝子のレパートリー
動物由来の再配列された免疫グロブリン配列以外の源から全体的にまたは部分的に誘導されたヌクレオチド（例えばDNA）配列の収集物。例として、再配列されていないＶセグメントをＤおよびＪセグメントと組合せることによるV_HドメインをコードするDNA配列、並びにＶセグメントとＪセグメントを組み合わせることによるV_LドメインをコードするDNA配列を挙げることができる。
該DNA配列の部分または全部をオリゴヌクレオチド合成によって誘導することができる。
分泌リーダーペプチド
これは、ポリペプチドのＮ末端に結合しておりサイトゾルの外側への該ポリペプチドの移動を指令するアミノ酸配列である。
溶離剤
これは、２分子間の結合を破壊するのに使われる溶液である。結合は非共有結合または共有結合であることができる。前記２分子はsbpのメンバーであることができる。
誘導体
これは、選択したrgdpの中のDNAによりコードされるポリペプチドから誘導した物質である。誘導体ポリペプチドは、アミノ酸の付加、欠失、置換もしくは挿入により、またはコードされるポリペプチドへの他の分子の結合により、コードされるポリペプチドとは異なることができる。それらの変更はヌクレオチドレベルまたはタンパク質レベルで行われ得る。例えばコードされるタンパク質がFab断片であり、次いでそれが別の源からのFcテールと結合されてもよい。あるいは、酵素、フルオレセイン等といった標識物質を例えばFab断片、scFv断片に結合してもよい。
本発明の一観点によれば、着目の抗原に特異的な抗体ポリペプチド二量体の製造方法であって、該方法は次の段階を有する：
（ｉ） 複製可能な遺伝表示パッケージ（rgdp）の成分を使ってパッケージングすることのできる核酸発現ベクターを提供し；
（ii）（ａ）各々ヒト抗体の第一の抗原結合部位構成部分をコードする核酸配列の遺伝学上多様なレパートリーを（ｂ）前記着目の抗原を結合することが知られている非ヒト抗体の第二の抗原結合部位構成部分のユニーク集団または遺伝学上多様な集団をコードする核酸と組合せ、抗体ポリペプチド二量体をコードする前記発現ベクター上の核酸配列のライブラリーを形成せしめ、ここで前記二量体は各々第一のポリペプチド鎖成分と第二のポリペプチド鎖成分とから成り、前記第一の抗原結合部位構成部分と前記第二の抗原結合部位構成部分とは組み合わせると抗原ポリペプチド二量体の抗原結合部位を形成し；
（iii）組換え宿主生物細胞において前記ベクターから前記ライブラリーを発現せしめ、ここで前記第一のポリペプチド鎖成分の各々は、前記第一のポリペプチド鎖成分をrdgpの表面に表示するrgdpの成分との融合体として発現され、；
（iv） 前記発現されたライブラリーから、前記着目の抗原に対する結合特異性を有する前記抗体ポリペプチド二量体のユニーク集団または限定集団を抗原への結合により選択し、ここで各選択された抗体ポリペプチド二量体がその各々のrgdpの中でそれの前記第一の抗原結合部位構成部分をコードする核酸と関連づけられる。
抗体ポリペプチド二量体は本明細書中のいずれかの箇所に定義される。該用語は抗体のFab,FvおよびscFv断片並びに抗体の完全なアームを包含するほど広い意味である。
「抗体−抗体結合部位の構成部分」は、ポリペプチド鎖成分、例えばV_HまたはV_Lドメインであるかまたはそれに相当する。しかしながら、それはCDR、V_L配列＋V_HのCDR、V_H配列＋V_LのCDR、V_H＋CDRのみを欠くV_L配列、等であってもよい。
前提条件は、抗体の抗原結合部位の第一および第二の構成部分が組み合わせると（一緒になって）抗原結合部位を形成しなければならないことである。よって、もし着目の抗原に特異的な非ヒト抗体の第二の抗原結合部位構成部分がCDRであるならば、ヒト抗体の第一の抗原結合部位構成部分は、抗原結合部位を形成するのに必要とされるV_HおよびV_L領域の残部〔会合した抗体定常領域を有するかまたは有さない（Fab型）、あるいはリンカーペプチド配列を有するかまたは有さない（Fv型）〕を含んで成るだろう。（scFv型では、リンカーペプチドが軽鎖ドメインと重鎖ドメインとを連結する。）非ヒト抗体の第二の抗原結合部位構成部分は、V_Lドメイン＋V_Hドメインの一部分を含んで成り、該部分は１または複数のCDR、例えばおそらくCDR3であろう。そのような場合、ヒト抗体の第一の抗原結合部位構成部分は、第二の抗原結合部位構成部分と組み合わせると抗原結合部位を形成するV_H配列の残部を含んで成るだろう。もちろん逆の状況も適用でき、当業者は一緒になって抗原結合部位を形成する第一の構成部分と第二の構成部分の他の組合せを想像することができるだろう。
段階（iv）において選択された抗体ポリペプチド二量体を変更して非ヒト特性を除去または削減するという追加の段階（ｖ）が存在してもよい。この変更は二量体またはその成分を遺伝子的に変更することによるものであることができる。この遺伝子変更は、突然変異、点変異、挿入または欠失、例えば特に非ヒト残基、特に非ヒト／ヒトハイブリッド抗体ポリペプチド二量体をヒトに投与する時に抗イディオタイプ免疫応答を引き起こし得るそれらの残基を除去または隠蔽（マスキング）するためのものであることができる。
段階（ｖ）の変形は、
（ａ） 段階（iv）において選択された前記第一の抗原結合部位構成部分をコードする核酸のユニーク集団または限定集団を、各々ヒト抗体の第二の抗原結合部位構成部分をコードする核酸配列の遺伝学上多様なレパートリーと組合せ、抗体ポリペプチド二量体をコードする核酸配列の第二のライブラリーを形成せしめることを含んで成り、ここで各抗体ポリペプチド二量体は、rgdpの一成分を使ってパッケージングすることができる核酸配列から発現される第二の抗体ポリペプチド鎖成分を含んで成り、前記第二の鎖成分は、それによってrgdpの表面に前記第二の鎖成分を表示するrgdpの成分との融合体として発現され、その結果、前記着目の抗原との結合によって前記第二のライブラリーから前記着目の抗原に特異的な抗体ポリペプチド二量体を選択することが可能である。ここで各抗体ポリペプチド二量体は、そのrgdpにおいてそれの第二のポリペプチド成分をコードする核酸と関連づけられる。
選択された抗体ポリペプチド二量体は、可溶性ポリペプチドとしてまたは遊離形において発現させることができる。
説明したように、前記非ヒト抗体の第二の抗原結合部位構成部分は、抗原と接触する抗体領域であることができ、該領域はおそらく相補性決定領域（CDR）であろう。
前記非ヒト抗体の第二の構成部分は、抗体の第二のポリペプチド鎖成分であることができる。
各々前記非ヒト抗体の第二の抗原結合部位構成部分をコードする配列は、本法の段階（ii）における前記組合せの前に遺伝子的に変更してヒト抗体の第二の構成部分との相同性を増加させることができる。
抗体ポリペプチド二量体の前記ライブラリーのいずれかの各抗体ポリペプチド二量体は、単一ポリペプチド鎖として（これは好ましくはscFv断片であることができる）発現せしめることができる。scFv断片は抗体ポリペプチド二量体の定義の必要条件を満たしている。
他方、抗体ポリペプチド二量体の前記ライブラリーのいずれかの各抗体ポリペプチド二量体は、２本のポリペプチド鎖として、好ましくはFvまたはFab断片として発現せしめることができるだけでなく、おそらく抗原結合部位の形成を許容するコンホメーションにおいて共有結合的または非共有結合的のいずれかで可変ドメインと相互作用してそれを固定するだろう追加の非抗体ドメインを有するポリペプチドとしても発現せしめることができる。
本発明の別の観点によれば、着目の抗原に特異的なヒト抗体ポリペプチド二量体の製造方法が提供され、該方法は、次の段階を含んで成る：
（ｉ）各々ヒト抗体の第一のポリペプチド鎖の可変ドメインを含んで成るポリペプチドの多様性集団（集団Ａ）を、各々前記抗原に特異的な非ヒト抗体の第二のポリペプチド鎖の可変ドメインを含んで成るポリペプチドのユニーク集団または限定集団（集団Ｂ）と組合せ、それによって各々ヒト抗体の第一のポリペプチド鎖の可変ドメインを含んで成るポリペプチドと非ヒト抗体の第二のポリペプチド鎖の可変ドメインを含んで成るポリペプチドとから成る抗体ポリペプチド二量体のライブラリーを形成せしめ；
（ii）前記ライブラリーから、前記抗原に対する結合特異性を有する前記抗体ポリペプチド二量体のユニーク集団または限定集団（集団Ｃ）を選択し；
（iii）各々ヒトの第一のポリペプチド鎖を含んで成る段階（ii）において選択されたポリペプチド二量体から誘導したポリペプチドのユニーク集団または限定集団（集団Ｄ）を、各々ヒト抗体の第二のポリペプチド鎖の可変ドメインを含んで成るポリペプチドの多様性集団（集団Ｅ）と組合せ、それによってヒト抗体ポリペプチド鎖二量体のライブラリーを形成せしめ、そのライブラリーから、前記抗原に特異的なヒト抗体のポリペプチド二量体のユニーク集団または限定集団（集団Ｆ）が選択可能である。
この観点の好ましい態様では：
（ａ） 前記集団Ａのポリペプチドが、組換え宿主生物細胞において、rgdpの第一集団においてrgdpの表面上に前記ポリペプチドを表示する複製可能な遺伝表示パッケージ（rgdp）の成分との融合体としてベクター（Ｘ）から発現され、；
（ｂ） 前記rgdp成分を使って前記ベクター（Ｘ）の核酸をパッケージングすることができ、それによって前記rgdpの遺伝物質が前記集団Ａのポリペプチドをコードし、その結果、集団Ｃの抗体ポリペプチド二量体がそれら各々のrgdp中でヒト抗体の第一のポリペプチド鎖の可変領域を含んで成るポリペプチドをコードする核酸と関連づけられ；
（ｃ） 前記集団Ｅのポリペプチドの各々が、組換え宿主生物細胞において、rgdpの第二集団においてrgdpの表面上に前記ポリペプチドを表示するrgdpの成分との融合体としてベクター（Ｙ）から発現され；
（ｄ） 前記rgdp成分を使って前記ベクター（Ｙ）の核酸をパッケージングすることができ、それによって、rgdpの第二集団中の前記rgdpの遺伝物質が前記集団Ｅのポリペプチドをコードする。
前記集団Ａが前記集団Ｅと同じベクターから発現されてもよく、またはそれらの集団が同じベクターから発現されなくてもよい。前記集団Ｄと前記集団Ｅとが同じベクターから発現されてもよく、またはそれらの集団ＤとＥが同じベクターから発現されなくてもよい。言い換えれば、この方法は二元的組合せ方式であるかもしれないしそうでないかもしれないが、明細書中のどこかに記載されるように、他の可能性がある中でも特に、恐らくは階層方式であろう。
前記抗体ポリペプチド二量体ライブラリーのいずれかの各抗体ポリペプチド二量体は単一ポリペプチド鎖として発現されてもよく、scFv断片であってもよい。
前記抗体ポリペプチド二量体ライブラリーのいずれかの各抗体ポリペプチド二量体は、本発明の別の観点に関連して上記に既に述べたように、２本のポリペプチド鎖、好ましくはFvまたはFab断片として発現されてもよい。
前記集団Ｂのポリペプチドは、各々が（非ヒト、例えば齧歯類の可変ドメインと一緒に）ヒト抗体定常ドメインを含んで成るキメラであることができる。
前記集団Ｅのポリペプチドは、各々が前記抗原に特異的な非ヒト抗体からの領域を含んで成ることができ、前記領域は抗原と接触するもの、例えば相補性決定領域（CDR）、特にCDR3である。
前記第一のポリペプチド鎖は抗体軽鎖であることができ、前記第二のポリペプチド鎖は抗体重鎖であることができ、またはその逆も可能である。
前記抗原に特異的なヒト抗体ポリペプチド二量体の前記集団Ｆを選択する追加の段階が存在してもよい。
前記集団ＣとＦのいずれか一方を前記抗原との結合によって選択してもよい。
本発明はまた、本法のいずれかにおいて使用されるベクターと試薬を含んで成るキットも包含する。本発明は更に、本法のいずれかによって製造されるライブラリーと抗体または抗体断片にも及ぶ。抗体ポリペプチド二量体のいずれかの選択されたポリペプチド成分をコードする核酸、または選択された抗体ポリペプチド二量体をコードする核酸を使って、組換え宿主生物体中で前記ポリペプチド成分もしくはポリペプチド二量体またはその誘導体を発現せしめる方法も本発明に包まれる。本発明の方法を使って製造されたライブラリーからのいずれのポリペプチドまたは二量体でも、改変してその誘導体を製造することができ、または治療用もしくは予防用薬品または診断用製品の調製に用いることができる。
着目の抗原に対して向けられた抗体または抗体の集団の抗原結合部位からの配列を使うことによって抗体を製造する新規方法がここに提案される。
これは、定義された抗原結合活性を有する動物抗体をヒト化する別の手段を提供する。例えば単一の齧歯類抗体については、該抗体の抗原結合部位の一部分を含んで成る配列を、組み合わせると完全な抗原結合部位を形成することができるヒト抗体の配列の多様性レパートリーと組合せることができる。元の齧歯類（およびヒト）配列は完全な鎖または鎖の一部分を含んで成ることができる。例えば、齧歯類抗体の軽鎖をヒト重鎖可変ドメインのレパートリーと組み合わせることができ；または齧歯類抗体の重鎖の第三CDRを、重鎖可変ドメインの残部をコードするヒト重鎖のレパートリーとヒト軽鎖可変ドメインのレパートリーと組み合わせることができる。次いでそれらの配列を含んで成る抗原結合部位を抗原への結合について選択する。
抗原結合部位の一構成部分を含んで成る配列は、抗原結合に関与すると一般に思われる一次配列の部分、例えば１もしくは複数のCDR、またはCDRのループの先端の残基であることができる。あるいは、該配列は、例えばＸ線結晶学もしくはNMRによって解析された抗原−抗体複合体の構造から決定されたように、または抗体の部位特異的突然変異誘発から決定されたように、抗原と接触することが知られている抗体の配列であることができる。
この方法によって作製された抗原結合部位は、元の齧歯類抗体の配列の部分のみが同様な方法で抗原と接触するらしいという点で、CDR移植により作製されたものとは異なっている。選択されたヒト配列は配列が異なるらしく、元の結合部位のものに代わる方法で抗原と接触するらしい。しかしながら、抗原への元の配列の部分の結合により課せられる束縛並びに抗原およびそれの抗原結合部位の形状は、抗原の同一領域またはエピトープに対するヒト配列の新たな接触を指令するらしい。従って本発明者らはこの方法を「エピトープ刷り込み選択（EIC）」と名付けた。
動物抗体から出発して、１つの方法は部分的にヒト抗体である抗体の選択をもたらした。そのような抗体は、そのまま直接にまたは幾つかの重要な残基の変更後に療法利用することができるほど十分に、配列がヒト抗体に類似しているだろう。例えば、齧歯類抗体からのV_H−CDR3領域も含んで成るヒト重鎖および軽鎖可変ドメインを使って作製された抗体は、ヒト抗体と齧歯類抗体の両CDR3領域が高度に可変的であるため、真のヒト抗体に非常に似ているだろう。同様に、幾つかの齧歯類抗体の軽鎖はヒト抗体の軽鎖と配列が非常に類似し得る。よって、ヒト重鎖のレパートリーと組み合わせてそれらの齧歯類軽鎖から作製した抗体は、ヒト抗体に密接に類似するだろう。選択した抗体の齧歯類成分とヒト配列との配列の相違は、ヒト配列の残基と異なるそれらの残基を、例えば個々の残基の部位特異的突然変異誘発によってまたはループ全体のCDR移植によって置換することにより、最少にすることができる。動物抗体から出発する代わりに、動物抗体由来の遺伝子操作された抗体を使って出発することも可能であるだろう。操作された出発抗体は、例えばヒトフレームワーク領域とマウス相補性決定領域とを有するCDR移植抗体（例えばGB2188638Bに記載されたようなもの）かもしれない。あるいは、操作された出発抗体は、ヒト抗体との配列相同性を最大にするために残基が変更されている重鎖または軽鎖を含んで成ることもできる。
しかしながら、本発明は、完全にヒトの配列を有する抗体を作製することも可能である。例えば、ヒト重鎖と非ヒト（例えばマウス）軽鎖を有する部分的にヒトの抗体から出発して、非ヒト軽鎖をヒト軽鎖のレパートリーにより置き換えることができる。こうして、選択された抗体の配列は完全にヒトであり、しかもまだ抗原結合部位は抗原の同一エピトープに向けられるだろう。従ってEISは、それぞれ動物の抗体または部分的にヒトの抗体と同じエピトープに結合する部分的にヒトのまたは完全にヒトの抗体を作製する方法を提供する。
CDR移植では抗原結合部位全体が移植されるため、通常は抗原への結合について１個だけまたは数個の抗体を試験することが必要である。しかし、EISは、非常に多数の抗体のスクリーニングの必要がある場合に、ヒト配列の恐らくは非常に多数のレパートリーと組み合わせて抗原結合部位の一部のみを使うことができる。実際に好ましい態様では、抗体断片のレパートリーが糸状ファージの表面上に表示され、そして抗原への該ファージの結合によって抗原結合活性を有する断片をコードする遺伝子が選択される。抗体断片をファージ上に表示できること、それらが抗原を結合するだろうこと、そしてそれらを選択できることは、特許出願WO 92/01047に開示されている。WO 92/01047に記載されたようなファージ上への表示の使用により提供される抗体選択能力は、制限部位におけるCDRの挿入を使ってまたは試験管内突然変異誘発技術（Riechmannら,1988,前掲；ドイツ国特許第2188638B号）においてまたはPCR技術（B.L.Daughertyら,1991,Nucl.Acids Res.19,2471−2476頁）を使って作製することができる多数のヒト化された抗体誘導体の迅速スクリーニングを可能にする。WO 92/01047では、１つの抗体重鎖または軽鎖可変ドメインが一定に保持され、そして抗原に結合する相手の選択のため相補鎖の可変ドメインのライブラリーを有するファージ上に表示されるという、分類体系的（heierarchical）ライブラリーの作製が記載されている。そのようなアプローチは重鎖と軽鎖の可変ドメイン組合せの高多様性プールをもたらし、そこから抗体特異性を選択することができる。例えば、更にハプテン結合性抗体の相補鎖の軽鎖および重鎖結合相手を得るため（Clacksonら,1991,Nature 352,624−628）または高親和性ヒト抗体を作製するために（J.D.Marksら,1992,Bio/Technology 10,779−783）、鎖入替えが適用された。それらの場合、新たな結合相手鎖は、元の組合せにおいて見つかるものと配列が非常に関連していた。
それらの実施例では、異なる種の鎖は組み合わされなかった。しかしながら、ハプテンに対して向けられたマウス抗体の重鎖をヒト軽鎖のレパートリー（マウス軽鎖のレパートリーとも同様に）と組合せ、そしてニトロセルロースフィルターを使って抗原への各クローンの結合についてスクリーニングする試みについての報告はある。ただ、結合体は検出されなかったし、マウス抗体を「ヒト化する」手段としての方法は提案されなかった（A.S.Kangら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1991,88,11120−11123）。この著者らは、「体細胞変異された鎖と生来の結合相手との組換えによる抗体の再設計は難しい方法であるかもしれない」と結論づけた。従って、EISの使用（異なる種からの鎖を使った鎖入替えにより例示されるような）は新規の概念であると思われる。更に、Kangら,1991,前掲からの例を考慮すると、マウス抗体からの鎖を免疫処置されていないヒト起源の鎖のレパートリーと組み合わせることによって抗原結合性組合せ体を製造できることは驚くべきことである（下記実施例１に記載）。
本発明の方法の利用形態は広範囲にわたる。例えば、
（１） 細菌中での発現または糸状ファージ上での表示には、Fv、一本鎖FvおよびFab断片の使用が好ましい（Fab断片については実施例１と２を参照のこと;scFvについては実施例３と４を参照のこと）。最も好ましくは、抗体断片は糸状ファージ上に表示され、そして該ファージが抗原結合について直接選択される。それらの手順によって選択された抗体はそのまま利用することができ、または追加のコード配列、例えばヒト定常領域と融合せしめ、ヒトエフェクター機能を有する抗体分子を作製することができる。可変ドメインを酵素または毒素分子をコードする配列と融合せしめ、特定の細胞型に薬剤または毒素を標的指向させることに向けられる抗体とすることができる。
（２） ヒト鎖のレパートリーは、Ｖ鎖の幾つかの可能なレパートリーから、例えば免疫処置されていないヒトの再配列されたＶ遺伝子（Marksら,1991,J.Mol.Biol.,222,581−597頁；および実施例１）から、または免疫処置されたヒトから、または合成Ｖ遺伝子レパートリーから提供することができる。例えば、ヒトＪ領域と単離された抗体特異性とを組み込んだ合成CDR3領域を使って、ヒト生殖細胞系列（germ line）の重鎖および軽鎖Ｖ遺伝子のライブラリーを作製することができる（HoogenboomおよびWinter,1992,J.Mol.Biol.,227,381−388頁）。更に、マウス抗体の各鎖と配列が密接に関連している（おそらく最も相同である）ヒトＶ遺伝子のレパートリー（例えば合成的に製造されたもの）を使うことも可能である（実施例５を参照のこと）。
（３） 元の抗体の重鎖と軽鎖は、それらがコードするＶ遺伝子（例えばPCRにより単離されたもの、Orlandiら,1989）によって提供してもよい（実施例1,2および３を参照のこと）。しかしながら、好ましくは免疫処置によって惹起されたマウス鎖のレパートリーを使って開始することも可能である（実施例４）。例えば、マウス重鎖のレパートリーをマウス軽鎖と組合せ、そして結合について選択することができる（Clacksonら,1991,前掲，のように）。次いで選択された対合鎖のレパートリーを相補的ヒト鎖のレパートリーで組み換えて無理やり新しい対合をつくることができる。あるいは、免疫処置されたマウスのmRNAからのマウス鎖のレパートリーを単純に相補的ヒト鎖のレパートリーと組み合わせることができる。
（４） 「鎖の入替え」法におけるように完全な重鎖および軽鎖可変ドメインを使うことができ、または例えばMarksら,1992,前掲のように、或る抗体の軽鎖と重鎖のCDR3を保持する（そしてこの配列を、重鎖可変ドメインCDR1および２の残部を含んで成る鎖のレパートリーと組み合わせる）ことにより、鎖の構成部分を使うことが可能である。実施例２と３により例示される本発明の一態様は、ヒト鎖またはヒト抗体の抗原結合部位の構成部分を使って入れ替える時に、元の親の非ヒト抗体からの少なくとも１つの領域（該領域は抗原と接触する）を保持することを含む。この領域はCDRであることができ、その場合、この方法は「CDR刷り込み選択」である。
実際、実施例２と３において、元のマウス重鎖のCDR3を保持し、そしてマウスCDR3を組み込んでいるプライマーを使ったヒト重鎖可変ドメインのレパートリーのPCR増幅により、ヒト重鎖可変ドメインのレパートリーと組み合わせた。重鎖のCDR3はしばしば抗原結合にとって最も重要であるという点で、マウスV_H−CDR3の保持が特に有利だろう。
この理論は、再配列されたマウスV_H遺伝子をヒトJ_Hプライマー（正プライマー）とヒトV_Hフレームワーク３プライマー（逆プライマー）を使って増幅せしめることによりマウスCDR3レパートリーに拡張することができる。それらのプライマーは、マウスＶ遺伝子とヒトＶ遺伝子の両方に対して相同性を有するように設計しなければならない。次いでマウスCDR3の増幅DNAレパートリーをヒト重鎖遺伝子のレパートリーと共にPCRにより構築することができる。
（５） 鎖の入替えは、２つのレプリコンを使って、例えばHoogenboomら,1991,Nucleic Acids Research,19,4133−4137頁に記載されたような二元的組合せ法を使って実施することができる。この場合は、実施例１に例示されるように、一定に保持すべきほうの鎖を１つのレプリコン（例えばファージ）中でクローニングし、次いで別のレプリコン（例えばプラスミド）中でもう１つの鎖のレパートリーと組み合わせる。高い効率で両方の鎖を同一レプリコン上でクローニングできるようにする別法も発明された。それらも同じく重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子を別々のレプリコン上でクローニングすることに頼っているが、今度は両方の鎖が同一レプリコン上に置かれるように２つのベクター間の組換えを促進することを目指している。そのような系の一例はコリファージP1のlox P/Creレコンビナーゼ系（HoessおよびAbremski,1990,“Nucleic acids and Molecular Biology",EcksteinおよびLilley編，第４巻,99−109頁,Springer−Verlag,Berlin,Heidelberg）に基づく。二元的組合せ法では、抗体はFv断片としてまたはFab断片として発現させることができる（実施例１のように）。Fab断片の場合、重鎖のV_H1C_H1部分が１つのレプリコン（例えばファージ）上に発現され、そして軽鎖が別のレプリコン（例えばプラスミド）上に発現される。入替え法において新規特異性の入手源として使う予定のFab断片のＶドメインは、所望により、クローン化されたヒトドメイン、例えばＣγ１およびＣκドメインと融合されてもよい。（Ｖドメインは、ヒト抗体mRNAレパートリーから直接増幅せしめることによってC_H1、ＣκまたはＣλドメインと直接融合させることができる。）
あるいは、鎖入替えは、Clacksonら,1991,前掲に記載のようなPCR構築法を使って、または元の構成物中（例えば一本鎖Fvのリンカー領域中）に組み込まれている適当な部位での制限断片のライブラリーの連続クローニングにより、単一のレプリコンにおいて実施することができる。
本発明は、２段階の入替えによる両方の鎖の置換を包含し、一態様では非ヒト抗体、例えば齧歯類抗体と同様のまたは改善された特性を有するヒト抗体の開発を包含する。この態様では、親の例えば齧歯類抗体が「ファージ抗体」にされるだろう。ファージ抗体（pAb）は、その表面上に抗体、抗体誘導体もしくは抗体断片、例えばFab,Fv,scFv等、または免疫グロブリンドメインに相同なドメインを表示するバクテリオファージウイルス粒子として定義される:WO 92/01047を参照のこと。一本の鎖が、ヒト免疫グロブリンレパートリーから誘導された鎖のレパートリー、例えば成人リンパ球集団からまたは胎児由来の源もしくは人工的に誘導された源から誘導された鎖のレパートリーで置換されるだろう。このファージの混合集団を抗原への結合によって選択し、元の抗原に結合するが一本の例えば齧歯類抗体鎖と一本のヒト抗体鎖とから新たに成るファージ抗体の集団を誘導せしめることができる。残りの齧歯類鎖は、最初の入替えの時に使ったものと同じまたは異なる源のヒトレパートリーにより置換することができる。まだ抗原を結合する抗体の集団を選択した後、２本のヒト抗体鎖を含有する抗体から成る集団が得られる。こうして、元の齧歯類抗体が同一抗原を結合するヒト抗体に変換された。
本発明の方法による多数のヒト化された抗体の作製は、所望の親和性と特異性を有する抗体の選択を可能にすること以上の利点を有することができる。ヒト化された抗体を療法においてヒトに利用する時、抗イディオタイプ応答を引き起こす可能性がある。単離された抗体を生体内に投与する時の抗イディオタイプ応答について調査することができ、そして最も低い応答を有するものを選択することができる。あるいは、抗イディオタイプ応答が検出されるまで１つの抗体を療法的に投与し、検出された時点で、使用抗体を異なるイディオタイプの第二の同等に有効な抗体にスイッチすることができる。
本発明を使って得ることができるヒト化された抗体は、多分それらがずっと抗イディオタイプ応答を引き起こしにくいだろうという意味において、従来のCDR移植によりヒト化された抗体よりも優れているようだ。
本発明の方法によって選択された抗体は、一本鎖FvまたはFab形態で直接使用することができる。あるいは、可変ドメインを追加のコード配列、例えばヒト定常ドメインと融合せしめて、例えばヒトエフェクター機能を有する抗体分子を作製することができる。可変ドメインを酵素または毒素分子をコードする配列と融合せしめて、特定の細胞型に薬剤または毒素を標的投与することに向けられた抗体にすることが可能である（それらの分子がヒト起源のものでないなら、ヒト化することの利点の幾つかは失われている）。
抗原結合についての選択による抗体の単離は、各段階でファージ表示を使って実施できるけれども、鎖の入替えがPCR構築または制限断片の挿入によって行われる場合、特に数が減少してしまった時には、フィルターアッセイ（A.Skerraら,1991,Anal.Biochem.196,151−155;M.L.Dreherら,1991,J.Immunol.Methods 139,197−205;PCT/GB90/01476）を使って抗体を抗原結合についてスクリーニングすることができる。それらの方法は、ファージ表示を使って処理することができる数に比べて比較的少数のクローンの場合に効果的であろう。
本発明の観点および態様を下記実施例により更に説明することにする。それらは限定を伴わずに本発明を例証する。本明細書中に記載された文献に加えて、WO 92/01047に注意を向けられたい。そこには本明細書中で使用する材料と方法の多くが記載されている。WO 92/01047の開示は本明細書中に参考として組み込まれる。抗体ポリペプチド二量体を含む抗体および抗体断片のrgdp上への機能的表示の詳細と説明については、WO 92/01047を調べることを本文書の読者に勧める。明細書を通じて図面への参照が行われる。ここで、
図１はエピトープ刷り込み選択（Epitope Imprinted Selection）の理論を示す。
図２はベクターpUC19−pelB−mycのポリリンカー領域（配列番号126）を示す。
図３はFab断片を表示しているファージのELISAの結果を示し、ここで一方の鎖はg3p融合体としてファージ上に表示され（fd−...により示されている）他方の鎖は分泌される可溶性鎖パートナーとして提供される。
図４は、元のMab32抗体並びにマウス（scFv−Mab32）およびヒト（他のscFv）抗体の領域の特異的ELISAを示す。
図５は、Mab32のＶ遺伝子のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を示す。CDR領域は太活字体である。（重鎖ヌクレオチド 配列番号2;軽鎖アミノ酸 配列番号3;軽鎖ヌクレオチド 配列番号４）。
図６は、ヒトTNFに結合する抗体断片のV_HおよびV_L抗体遺伝子の推定タンパク質配列を示す。
（軽鎖:Mab32配列番号110;Vλ１−１−１配列番号111;VλAZ配列番号112;VλC4配列番号113;VλD1配列番号114。重鎖:Mab32配列番号115;DP−51配列番号116;V_HP1配列番号117;V_HP2配列番号133;V_HP3配列番号134;DP−46配列番号118;V_HLM2配列番号135;V_HLM8配列番号141）。
図７は、FabMab32と一本鎖Fv断片との間の競合ELISAの結果を示す。
図８は、二元的組合せ法を用いてCDR刷り込み選択を使ってマウス抗体をヒト化するための計画の一例を示す。
図９は、単一レプリコン、一本鎖Fv形式において組合せライブラリーを用いてCDR刷り込み選択を使ってマウス抗体をヒト化するための計画の一例を示す。
図10は、CDR刷り込み選択により選択されたscFv断片を使って得られる相対的ELISAシグナルを元のF58一本鎖Fv断片に比較して示す。
図11は、元のF58重鎖および最も密接に関連したヒト生殖細胞系列V_H遺伝子に比較した、選択された重鎖Graft/27,Graft/2,Graft/H3およびGraft/H9の推定アミノ酸配列を示す。
（V_H6:F58 配列番号127;DP−74 配列番号128;Graft/27 配列番号136;Graft/2 配列番号137;GRAFT/H3 配列番号138;GRAFT/H9 配列番号139。V_H1:F58 配列番号129;DP−２ 配列番号130;Graft/20 配列番号140）。
図12は、ベクターpCANTAB3−myc並びにクローニング部位の領域中のDNA配列とアミノ酸配列（配列番号131）を示す。
図13は、ベクターpCANTAB5−myc並びにクローニング部位の領域中のDNA配列およびアミノ酸配列を示す（配列番号132）。
図14は、再配列されたV_H遺伝子の構築を示す。
表１は本明細書中に言及されるオリゴヌクレオチドプライマーとペプチドの一覧である。本文書の読者は、それらのオリゴヌクレオチドとペプチドに関する配列情報については、表中に配列番号を完備した表１に注意を向けられたい。

下記実施例は本発明の方法の実施態様を例示する：
実施例１に記載の実験では、TNFのエピトープに対して向けられたマウス抗体をファージ上での表示のためFab断片としてクローニングし、そして重鎖をヒト軽鎖のレパートリーと組み合わせることにより（または実際には軽鎖をヒト重鎖のレパートリーと組み合わせることにより）、１本がマウス鎖で１本がヒト鎖であるFab断片を産生するファージを選択することが可能であった。それらの抗体断片は元のマウス抗体と同じTNFエピトープに結合した。次いで新たなヒト鎖（重鎖または軽鎖）をヒト相手鎖のレパートリーと組み合わせて、同一TNFエピトープに結合する完全にヒトの抗体Fab断片を作製した。
実施例２は、二元的組換え方式におけるCDR刷り込み選択を例示する。エピトープ刷り込み選択により元のマウス重鎖CDR3を保持したままで抗HIV gp120抗体をヒト化した。マウス抗体のV_HおよびV_LドメインをマウスC_H1およびＣκ鎖との融合体としてクローニングした。得られた重鎖V_HC_H1断片を、ファージベクターからg3p融合体として発現されたヒト軽鎖のレパートリーと組み合わせてファージ上に表示せしめた。ファージ上に表示されたヒト軽鎖を選択し、そして選択された鎖を、元のマウス重鎖のCDR3を含むように増幅されg3p融合体として発現されたヒト生来の重鎖V_HC_H1断片のライブラリーと組み合わせてファージ上に表示せしめた。
実施例３は単一レプリコン一本鎖Fv形式におけるCDR刷り込み選択を例示する。エピトープ刷り込み選択により元のマウス重鎖のCDR3を保持したままで抗HIV gp120抗体をヒト化した。一本鎖Fvライブラリーをファージ上に表示せしめ、元のマウス軽鎖と重鎖のCDR3とを含んでいるが軽鎖の残部はヒト起源のものである断片を、ヒト生来の重鎖のライブラリーから誘導した。次いで選択されたファージの重鎖可変ドメインをヒト軽鎖可変ドメインのレパートリーと組み合わせて、ファージ上にscFvライブラリーを作製した。このライブラリーから選択されたファージは、マウス重鎖のCDR3の保持を除いて可変ドメインが完全にヒト起源のものであるscFv断片を表示した。
実施例４は、免疫処置されたマウスの免疫レパートリーから誘導したヒト抗体の単離を例示する。TNFで免疫処置されたマウス由来のマウス重鎖および軽鎖Ｖ遺伝子のレパートリーを一本鎖Fv断片としてファージ上に表示せしめ、TNFへの結合についてファージ選択した。この選択されたマウス集団由来のV_H遺伝子を、一本鎖Fv断片としてヒト生来のライブラリーから誘導したV_L遺伝子と組み合わせ、そしてファージ選択した。選択された半ヒト化抗体ポリペプチド二量体を、ヒトV_Lをヒト生来のライブラリーからのヒトV_Hと対合することにより、完全にヒト化した。次いで得られたライブラリーからTNFに特異的な完全にヒト化された抗体ポリペプチド二量体を選択することができる。
実施例５は合成ライブラリーの作製を例示する。
実施例１
マウス抗体のヒト化：
エピトープ刷り込み選択を使った腫瘍壊死因子α（TNF−α）上の特異的エピトープに対して向けられたヒト抗体の単離
本発明者らは、二回の鎖入替えによるヒト化のための標的抗体として、ヒトTNFに対して向けられたマウスモノクローナル抗体を選択した。抗体Mab32（IgG2bクラス、κ）（D.Rathjenら,1991,Mol.Immunol.28,79頁;D.Rathjenら,1992,Brit.J.Cancer 65,852−856頁；オーストラリア国特許出願第7,576号；欧州特許第486,526号）は、TNFの細胞溶解作用を阻害しない（おそらくそれがTNFレセプターへのTNFの結合を阻害しないため）けれども、サイトカインの生体内抗癌作用と抗ウイルス作用を増強する。抗原結合部位はTNFの最初の18残基を包含するTNF−三量体の領域中に位置している。この実施例は、ヒトTNF−α上のこの同一エピトープを特異的に認識するヒト抗体を作製するのに利用することができる。
実験と結果
使用する一般的方法はこの章の最後に与える。
1. Mab32のＶ遺伝子のクローニングとファージ上への表示
Mab32のＶ遺伝子のクローニング：
本質的には記載された通り（Clacksonら,1991,前掲,Clacksonら，“PCR:a practical approach,Mr Phenoxら編,IRL Press,Oxford,187−214頁）のPCRにより、V_H遺伝子用のプライマーVH1BACKとVH1FOR2、V_L遺伝子用のプライマーVK2BACKとVK4FOR、並びにポリメラーゼ連鎖反応（PCR;R.K.Saikiら,1985,Science 230,1350頁）を使って、マウスMab32抗体の遺伝子を救済した。マウスV_H遺伝子とＶκ遺伝子を、scFv断片としての発現に向けてPCR構築により構築し、VH1BACKSfiおよびVKFOR4NOTを使って増幅せしめ、Sfi I−Not I切断制限断片としてファジミドpHEN1（H.R.Hoogenboomら,1991,Nucl.Acids Res.19,4133−4137頁）中に連結せしめ、そしてE.コリHB2151細胞中にエレクトロポレーションした。ELISAにより分析した96個のクローンのうち（下記参照）、９個がTNF結合性可溶性scFv断片を分泌した。配列決定によると、全てのクローンでファミリーII BのマウスV_HとファミリーVIのマウスＶκを示した（E.A.Kabatら,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Public Health Services）。９つの配列を比較することによっておそらくPCRによって導入されたであろうヌクレオチド変異を検出し、そして「共通」配列および結合活性を有するクローン（scFv−Mab32）を更なるクローニング実験のため選択した（図５）。
可溶性発現のためのMab32 V遺伝子の再クローニング：
マウスＶ遺伝子を重鎖（Fd,V_HC_H1）または軽鎖の可溶性発現のために、継ぎ合わせ重複伸長（splice overlap extension）によりマウスＶ遺伝子をヒトC_H1（μイソタイプ）またはヒトＣκ遺伝子とそれぞれ連結することにより再クローニングした。オリゴヌクレオチドMOJK1FOLNX（Ｖ遺伝子のＪ領域中に結合する；この実施例において使用する全オリゴヌクレオチドは表１に与えられている）とMVKBASFI（５′領域中に結合し、Sfi I制限部位を付加する）を使って、scFv−Mab32 DNAからマウスＶκ遺伝子を増幅せしめた。一方で、Clacksonら,1991に記載の通り、２断片構築法を使って、オリゴヌクレオチドMOVK−HUCK−BACK（ヒトＣκの５′に結合し、そしてマウスＪκ１領域と部分的に相補的である）とHUCKNOT16NOMYC（ヒトＣκの３′末端に位置し、末端のシステインを保持し、Not I制限部位の上に標識を付ける）を使ったマウス−ヒトキメラ軽鎖遺伝子（Hoogenboomら,1991,前掲中に記載されたNQ10.12.5の遺伝子）からのPCRにより、ヒトＣκを得た。DNA断片の連結のため、２つのPCR断片を混合し、MVKBASFIとHUCKNOT16NOMYCを使って増幅せしめた。次いで、軽鎖の可溶性発現のためpelBシグナルペプチド配列と適当なクローニング部位とを含むpUC19誘導体（pUC19−pelB−myc、図２）中にSfi I−Not I断片としてキメラＶκＣκ遺伝子をクローニングした。同様に、重複発現PCRによる継ぎ合わせにより、マウスV_H遺伝子（LMB3とVH1FOR−２を使ってscFv−Mab32から増幅したもの）をヒトμ−C_H1ドメイン〔Mo−VH−Hu−CH1とHCM1FONOを使ってヒトIgM由来のcDNA（Marksら,1991,前掲およびWO 92/01047）から増幅したもの〕と組合せ、そして標識鎖の可溶性発現のためpUC19−pelB−myc中にSfi I−Not I断片としてクローニングした。
ファージ上へのMab32抗体の表示：
HUCKCYSNOTとMVKBAAPAを使ってマウス／ヒトキメラ鎖を再増幅せしめ、そしてApaL1−Not I断片としてfd−tet−DOG1中にクローニングすることにより、キメラ軽鎖をファージfd上に表示せしめた。重鎖Fd鎖遺伝子を有するプラスミドを含有する細胞を、AMP−GLU（１％）を含む２×TY中で対数期（0.5のOD₆₀₀）まで増殖させ、そして20倍過剰の軽鎖表示ファージにより感染せしめた。２×TY、アンピシリン（100μg/ml）、グルコース１％培地中で振盪せずに37℃にて45分間そして振盪しながら37℃にて45分間後、50倍容の予熱した（37℃）２×TY、アンピシリン（100μg/ml）およびテトラサイクリン（15μg/ml）中に希釈し、37℃にて１時間、次いで30℃にて一晩（攪拌しながら）試料を増殖せしめた。そのような培養物の上清から収集したファージ粒子は、それらの表面上に軽鎖を通して固定されたTNF結合性Fab断片を表示した。
同様にして逆の配置のものを作製した。まず重鎖V_HC_H1断片をfd−tet−DOG1中にクローニングし（VH1BACKAPAとHCM1FONOを使ってマウス／ヒトキメラ構成物からのFd鎖遺伝子を増幅せしめた後）、そしてファージを使って可溶性軽鎖を産生することのできる細胞を感染せしめた。そのような細胞の上清から収集したファージ粒子は、それらの表面上に重鎖V_HC_H1を通して固定されたTNF結合性Fab断片を表示した。
ファージ上に表示されたMab32断片の性質：
ハイブリドーマＶ遺伝子を増幅せしめ、上記のごとくV_H遺伝子とＶκ遺伝子をscFv断片としてファジミドpHEN1中にクローニングすることにより、マウス抗体Mab32のＶ遺伝子をクローニングした。TNFに結合する抗体scFv断片をELISAにより同定した（詳細については下記を参照のこと）。マウスV_H遺伝子はヒトμ−C_H1に結合したマウスV_Hとして可溶性発現させるためにpUC19−pelB−myc（図２）中で再クローニングし、一方軽鎖は、−との融合体としてヒトＣκドメインを有するベクターfd−tet−DOG1中で再クローニングした。重鎖構成物を含有する細胞を、軽鎖を有するfdファージにより感染せしめると、Fd重鎖と会合した軽鎖−g3pを担持しているファージ粒子が出現した。実際、マウス−ヒトキメラFabを表示しているファージを使ったELISAにより評価すると、TNFと301ペプチドへの結合は保持された。このファージELISAにおいては、軽鎖のみを担持しているファージのバックグラウンドシグナルは野生型fd−tet−DOG1ファージよりもわずかに高かったが、Fabを表示しているファージを使って得られたシグナルよりも常に低かった。同様にして、ファージ上に固定された重鎖V_HC_H1断片と可溶性断片として提供された軽鎖とを使ってTNF結合性ファージを作製した。ゆえに、Mab32は、両方の表示方向での二元的組合せ方法において機能的である。
２ エピトープ刷り込み選択（EIS）による鎖入替え
一本鎖ライブラリーの作製：
本質的にはMarksら,1991,前掲に記載された通りに、２人の健康な提供者の末梢血リンパ球から調製したmRNAから、κ，λ軽鎖およびμ特異的cDNAを調製した。μ特異的、λおよびκライブラリーそれぞれに対してオリゴヌクレオチドHCM1FO,HUCLCYSおよびHUCKCYSを使って、第一鎖cDNA合成を行った。このcDNAから、オリゴヌクレオチドHCM1FOと６つのファミリー特異的VHBACKプライマー（Marksら,1991,前掲に記載）を使ってV_HC_H1レパートリーを増幅せしめ、Not I標識された正プライマー（HCMFONO）とApa I標識したVHBACKプライマー（HuVH1BAAPAからHuVH6BAAPAまでの６つのプライマー；表１）とを使って再増幅せしめた。同様に、Marksら,1991,前掲およびPCT/GB91/01134（WO 92/01047）に記載されたHUCLCYSまたはHUCKCYS正プライマーと、HuVλ1BACKからHuVλ6BACKまでまたはHuVk1BACKからHuVk6BACKまでの逆プライマーとを使って、軽鎖レパートリーを増幅せしめた。この項目に記載される各場合において、λ鎖およびκ鎖可変レパートリーは別々に増幅せしめた。増幅されたレパートリーを、ApaL IおよびNot I標識されたそれらのオリゴヌクレオチドの変形（それぞれHuVλ1BAAPAからHuVλ6BAAPAまでまたはHuVk1BAAPAからHuVk6BAAPAまでの13個の逆プライマー、および２個の正プライマーHuCLCYSNOTとHuCKCYS−NOT）を使って再増幅せしめた。３つのレパートリー全てをApaL I−Not I断片としてfd−tet−DOG1中にクローニングし、そしてE.コリMC1061細胞中にエレクトロポレーションし、ＶλＣλについては1.0×10⁷個のクローン、ＶκＣκについては1.4×10⁷個のクローン、そしてIgM由来のV_HC_H1については５×10⁹個のクローンを得た。挿入断片の存在を確認すると、該ライブラリー中の挿入断片の頻度は３つの場合の全てにおいて95％よりも高いことがわかった。
マウスV_Hドメインをドッキング鎖として使ったヒトV_Lの選択
エピトープ刷り込み選択を使って鎖を入替える時、マウスＶ遺伝子が第１回の選択の際に一定に保持されることに依存して、マウスからヒト抗体への２つのルートがある（図１参照）。抗原結合に対するマウス重鎖および軽鎖の影響並びに元のエピトープ上へのヒト相手鎖のドッキングに対するそれらの影響は、おそらくドメインが抗原結合性接触のほとんどを形づくることに依存して、抗体間で相当異なるだろう。
図１は、出発にマウス抗体を使って例示されるような、エピトープ刷り込み選択の理論を示す。白い長方形は元のマウス抗体のV_HドメインとV_Lドメインを表す。影を付けた長方形はヒトのV_HドメインとV_Lドメインを表す。最後の行の左側に示されるヒト抗体誘導体は、次の段階を含む手順によって作製される：
（ａ） （ｉ）元のマウスV_Hを保持し、ヒトV_Lドメインのライブラリーと組合せ、次いで抗原への結合により選択する。
（ａ） （ii）それらの選択されたヒトV_LドメインをヒトV_Hドメインのライブラリーと組合せ、次いで抗原への結合により選択する。
最後の行の右側に示されるヒト抗体誘導体は、別の経路に由来する：
（ｂ） （ｉ）元のマウスV_Lを保持し、ヒトV_Hドメインのライブラリーと組合せ、次いで抗原への結合により選択する。
（ｂ） （ii）それらの選択されたヒトV_HドメインをヒトV_Lドメインのライブラリーと組合せ、次いで抗原への結合により選択する。
最後の行の中央に示されるヒト抗体は、次の手順により誘導される：
（ｃ） （ａ）（ｉ）において誘導した選択されたヒトV_L鎖を、（ｂ）（ｉ）において誘導した選択されたヒトV_H鎖と組合せ、次いで抗原への結合により選択する。
（ｂ）（ii）において誘導したV_H鎖を（ａ）（ii）において誘導したV_L鎖と組み合わせることができ、またその逆も可能である。この章は手順（ａ）を説明し、次の章は手順（ｂ）と（ｃ）を説明する。この実施例は二元的レプリコン、二元的組合せ方式を使った手順を説明するが、この方法は単一レプリコン、一本鎖Fv方式にも同様に適用することが可能である。
第１回の鎖入替え実験において、pUC19−pelB−mycから発現されたマウスV_H（ヒトC_H1ドメインに結合されている）を、Fab断片として10⁷の異なるヒトＶλＣλドメインのライブラリーと対合せしめた。該抗体断片を表示しているファージを、TNFがコーティングされた試験管上での連続選別にかけた。溶出したファージの力価を追跡することにより選択の程度をモニタリングすることができる。４回の選択後（溶出ファージの力価が100倍増加する）、28個の各クローンのうち24個が、Fab断片（全てマウスV_H−ヒトC_H1を有する）を発現しているファージを使ったELISAにおいて、TNFに結合することがわかった。選択されたヒトＶλＣλドメインのみを表示しているファージは、キメラマウスＶκ−ヒトＣκのみを表示しているファージと同様なバックグラウンドを与えた。第１回の選択後に取った16個のクローンは陰性であることがわかった。
24個の結合体の中で３種類だけの異なるBstN Iフィンガープリントが検出され、１パターンが優位を占めていた（21/24）。軽鎖ＶλA2,VλC4およびＶλD4がそれぞれ21/24,2/24および1/24の頻度で見つかった。配列決定により、３つの軽鎖が全て同じ生殖細胞系列遺伝子、即ちヒトＶλ１−１−１に由来することが明らかになった。クローンＶλC4は１個、クローンＶλD1は２個、そしてクローンＶλA2は７個の生殖細胞系列とのアミノ酸残基の相違を有した（図６）。しかしながら、クローンＶλA2は、関連するＶλ１の生殖細胞系列配列と一層類似しているフレームワーク−１領域、humv1117を使用しており、従ってこれは組換えの結果であるかもしれない。３つのクローン間での配列中の変異が最少で且つ長さの変化が全くないというそれらクローンの生殖細胞系列特性は、CDR3配列中にも認められる。どうやら、非常に類似した配列を有する非常に限定された数の遺伝子のみが緊縮条件（マウスV_Hと適合して抗原結合ペアを形成すること）を満たすらしい。１つの驚くべきことは、Ｖ遺伝子をコードするヒト生殖細胞系列がそれらの条件を満たすドメインを供給できることである。しかしながら、このライブラリーの出発材料は別の実験で非常に多様であることが証明された。例えば、同じ２人の提供者から作製した免疫処置されていないscFvライブラリーから、本発明者らは既知の生殖細胞系列遺伝子に比較して或る程度のヌクレオチド変異を有する多数の異なるλ鎖を誘導した（Marksら,1991,前掲）。その上、同一提供者から誘導した軽鎖遺伝子を親和性成熟のため鎖入替え実験において使用し、そして多数の変異を有する軽鎖変異体（全てＶλ１）を単離した（Marksら,1992,前掲）。
選択されたヒトV_Lドメインをドッキング鎖として使ったヒトV_Hの選択
３つの選択されたＶλ遺伝子をＶλＣλ鎖としての可溶性発現のためpUC19−pelB−myc中で再クローニングした。３つの軽鎖プラスミドを含有するE.コリ細胞を混合し、ヒトV_HC_H1遺伝子のファージライブラリーにより感染せしめ、前に記載したfd−tet−DOG1ライブラリーから発現させ、そして該ライブラリーをTNFがコーティングされた免疫試験管上での連続選別にかけた。５ラウンド後、溶出ファージの力価が100倍に増加した時、クローンを採取した。DNA挿入断片のBstN Iフィンガープリントにより分析した20個のクローンのうち15個が２パターンのうちの１つを使用した（ほぼ同じ頻度で）。それらの重鎖V_HC_H1断片をＶλA2軽鎖と組み合わせた時の15個のクローンは、ＶλC4またはＶλD1軽鎖と組み合わせた時よりも強いファージELISAシグナルを与えた（図３）。重鎖V_HC_H1断片のみを表示しているファージを使って得られたバックグラウンドシグナルは、マウスV_H−ヒトC_H1のシグナルと同様であった。
配列決定により、この２パターンは３つのユニークヒト_Ｈ配列（クローンV_HP1/2/3、クローンV_HP1はクローンV_HP2のものとほぼ同じBstN Iフィンガープリントを有する）に帰することができることが明らかになった。選択された軽鎖遺伝子と同様、選択された重鎖遺伝子は同じ生殖細胞系列V_H遺伝子（V_H3ファミリーの生殖細胞系列DP−51、Tomlinsonら,J.Mol.Biol.227,776−798,1992;図６）に由来し、最少の残基相違を有する。図６は、ヒトTNFに結合する抗体断片のV_HおよびV_L抗体遺伝子の推定タンパク質配列を示す。選択されたヒトＶ遺伝子をそれらの最も近い生殖細胞系列同族体と整列させた。選択された遺伝子中の同一残基はハイフン（−）により表される。V_H遺伝子のフレームワーク４は第４残基のところで切り取られている。クローンV_HP1はおそらくDP−51と関連生殖細胞系列DP−47との間の組換え体であろう。３つの選択されたV_H遺伝子は全て、比較的短いCDR3ループ（8,9および10残基）を有するが、この配列の相同性はほとんどない。V_H−CDR3は本来６つの抗体可変性ループ全ての最大多様性領域であるので、その領域中に共通配列を有するクローンを選択する機会は実際には非常に小さい。
選択されたＶ遺伝子対の結合の特異性
Mab32および可溶性scFv断片を使った多数の抗原に関する特異的ELISAは、元のMab32抗体、そのscFv誘導体および３種のヒト化されたTNF結合体（scFv断片として）が特異的にTNFに結合することを示した（図４）。アオガイヘモシアニン、オボアルブミン、チトクロムｃ、ウシ血清アルブミン、ヒトチログロブリンまたは２−フェニルオキサゾール−５−オン−BSAがコーティングされたELISAプレートにもプラスチックだけにも全く有意な結合が得られなかった。ヒト化された抗体が同一エピトープに結合するという証拠は、ペプチド301がコーティングされたプレートと、元のマウス／ヒトキメラFab断片またはヒト化されたFab断片を表示しているファージとを使ったファージELISAから最初に得られた（このアッセイは可溶性scFv断片の検出を可能にするほど十分には感受性でない）（図３）。図３は、一方の鎖がg3p融合体としてファージ上に表示され（fd−...により示される）、そして他方の鎖が分泌された可溶性相手鎖として提供された、Fab断片を表示しているファージのELISAの結果を示す。クローンは次の鎖の組合せを表示する:fd−DOG1（抗体なし）；軽鎖：マウスMoV_L（Mab32由来）、ヒトＶλA2およびＶλC4（マウスV_Hを使って選択されたもの）；重鎖：マウスMoV_H（Mab32由来）、ヒトV_HP1,2,3（ヒトＶλA2,VλD1,VλC4を使って選択されたもの）、ヒトV_HLM2、V_HLM8（マウスV_Lを使って選択されたもの）。Ｖλ鎖はV_Lとして示される。ペプチド301とTNFの両方に結合する完全にヒト化されたクローンが得られた。
加えて、ヒトscFv断片がTNFへの結合を目当てに元の抗体と競争することを示すために、本発明者らは、Mab32のタンパク質分解的開裂により誘導されたFab断片を使った競合ELISAにおいてscFv構成物の結合を分析した。一本鎖Fv断片を、TNFがコーティングされた表面上で増加する量のFab断片と共にインキュベートし、そして結合したscFvの量をELISAにおいて検出した（図７）。元のscFv−Mab32とヒト化されたscFv断片の両方を含むscFv断片の各々が、TNFへの結合を目当てにFab Mab32と競争する。
かくして、ヒト化過程を通じてTNFのペプチド301に対するMab32の微妙な特異性が保持される。
選択されたＶ遺伝子ペアの結合親和性
マウスMab32抗体、並びに精製された単量体形の組換えマウスscFv−Mab32並びにヒトscFv抗体V_HP1−ＶλA2,V_HP2−ＶλA2およびV_HP3−ＶλA2を、TNFに対する相対親和性の測定のため競合ELISAにかけた。TNFコーティングされた表面上で増加する量の可溶性TNFの存在下で抗体をインキュベートした。全てのクローンが同範囲の増加するTNF濃度に渡りほぼ同様なELISAシグナルの減少を示した（10nM〜100nM範囲にIC₅₀を有する）。親のMab32はより強力に結合すると報告されているけれども（ヒトTNFへの結合親和定数8.77×10⁹M^-1）、これはscFv断片の一価性に比べて完全抗体分子の二価性を反映している。
Mab32およびV_HP3VλA2断片をPharmacia BIAcoreを使った結合特性についても分析した。TNFを直接表面上に固定化し、抗体の結合をモニタリングした。元のマウス抗体の特性はMab32の２つの単量体形を分析した。TNF表面上では、タンパク質分解的開裂によるMab32のFab断片とscFv Mab32とが非常に類似した急速なオフ速度を示した（約10^-2s^-1）。ヒトV_HP3−ＶλA2抗体は元のscFv−Mab32と同範囲にオフ速度を有する。抗体タンパク質相互作用のオン速度は、他のタンパク質とそのレセプターとの相互作用について検出される範囲であり、10⁴〜10⁶M^-1s^-1の100倍範囲に及ぶ（Mason D.M.およびWilliams,A.F.,1986,Kinetics of Antibody Reactions and the Analysis of Cell Surface Antigens,Blackwell,Oxford;Pecht,I.,1992,Sela,M.編,Dynamic Aspects of Antibody Function,Academic Press Inc.,New York,第６巻,1−68頁）。抗体TNF相互作用のオン速度が抗体タンパク質相互作用に特有であると仮定すれば、BIAcore分析により誘導されるオフ速度は競合ELISAにより示される親和性（Kd＝10^-7〜10^-8M）と一致する。
従って、それらの測定値は、同様な親和性を有するscFv Mab32およびヒト化されたscFvクローンV_HP3−ＶλA2と一致し、よってエピトープ刷り込み選択による親和性並びに特異性の保持とも一致する。
エピトープ刷り込み選択の別経路によるヒト化された抗体の選択；
ヒトV_H鎖に次ぐV_L鎖の選択
更に別経路を使ってヒト鎖を選択することができるかどうかの疑問に答えるために、本発明者らはまず、刷り込み鎖としてマウスV_Lドメインを使ってヒトV_Hを選択した。４回の選別後、２つのヒトV_Hドメイン（V_H−LM2とV_H−LM8）が集団の優位を占めた。両V_H遺伝子とも、V_H3ファミリーに属する生殖細胞系列（DP−46）と比較すると最少の相違を示した。V_HP1,2および３配列と比較すると、V_H−LM2とV_H−LM8は同一（V_H3）ファミリーの生殖細胞系列を使用し、CDR1およびCDR2に同一の標準的ループ構造を共有する（I.M.Tomlinsonら,1992,前掲;C.Chothiaら,1992,J.Mol.Biol.227,789−817頁）。しかしながら、クローンV_H−LM2とV_H−LM8は、V_HP1,2および３配列に比べて長いV_H−CDR3（それぞれ8,9,10残基に比べて18および14アミノ酸残基）を使用し、そしてそれらの各々の生殖細胞系列が15アミノ酸残基異なっている。（相補的性質ではなくて）相違に関して選択されたそれらの鎖の相補性を試験するために、V_H−LM2ドメインをファージ上のFabとしてまたはscFv配置においてのいずれかでヒトＶλA2ドメインと組み合わせた。共に結合性組合せ体を生じた（図３、結果は示してない）。加えて、マウスV_LはヒトV_HP3と組合せると（ファージ上のFab断片として）比較的弱い結合体を形成した。
一般法
２レプリコン系を使った表面上にFab断片を表示するファージの調製
可溶性発現のための抗体鎖をコードするプラスミドを含有するE.コリ細胞を、100μg/mlアンピシリンと１％グルコースを含む10mlの２×TY中で37℃にて0.5のOD₆₀₀まで増殖させた。元のライブラリーから調製した（15μg/mlのテトラサイクリンを含む２×TY中で37℃にてライブラリーを増殖させそして２回のPEG沈澱によってファージを収集することにより）10¹¹形質転換単位（TU）をまたは選別実験からの溶出物1ml（様々な力価）を、37℃にて振盪せずに45分間そして振盪しながら45分間インキュベートすることにより、細胞に感染せしめた。次いでアンピシリン（100μg/ml）とテトラサイクリン（15μg/l）を含む予熱した培地500ml中に細胞を接種し、37℃にて１時間増殖させた後、一晩のインキュベーションのため30℃の振盪器に移した。２回のPEG−NaCl沈澱によりファージを調製し、選択前に約10¹³TU/mlになるように水に再懸濁した。
結合体の選択
50mM炭酸水素塩緩衝液（pH9.6）中10μg/mlのTNF溶液2mlを使って免疫試験管（Nunc）を一晩コーティングした。ファージとのインキュベーション、洗浄および溶出条件はMarksら,1991により記載された通りであった。可溶性相補鎖を発現しているE.コリ細胞に溶出ファージを感染せしめ、そして選択されたファージ集団の増幅（上述）に向けてテトラサイクリンを含む２×TY培地中で増殖させた。
結合についてのクローンのスクリーニング
一本鎖ファージ原株を調製し、そしてこのファージを使って相手鎖をコードする遺伝子（クローンを選択するのに使ったもの）を含む細胞を感染せしめることにより、個々のクローンを結合についてファージELISAにおいて分析した。上述のような一晩培養物（2ml）から調製したFab断片を表示しているファージを、PEG沈澱により10倍濃縮し、50μlをELISAでアッセイした。組換えヒトTNF−α（酵母産物、比活性3.2×10単位/mg、Peptide Technology）を、50mM炭酸水素塩緩衝液（pH9.6）もしくはPBS中10μg/mlにおいて50μl／ウエルで、室温で一晩プラスチック製平底マイクロタイタープレート（Falcon 3912）上にコーティングした。PBSで洗浄し、２％乾燥脱脂粉乳（Marvel）で２時間ブロックした後、ウエルあたり50μlのファージを50μlの４％ Marvelに添加し、その後で記載された通り（Marksら,1991及びPCT/GB91/01134）抗ファージ抗血清を使ってELISAを続けた。Mab32エピトープへの結合の検出のため、PBS中10μg/mlのペプチドを100μl／ウエル使って室温で一晩インキュベートすることにより、301−ペプチド（Peptide Technologyから提供、配列Ｈ−VRSSSRTPSDKPVAHVVA−OH配列番号119）をコーティングした。３％BSAによりウエルを２時間ブロックし、上記と同様に（Marvelとのインキュベーションを使って）ELISAを続けた。
あるいは、選択した鎖を１つのプラスミド中で再クローニングし（scFv断片として）、適当な株中で発現を誘導し、そしてE.コリ培養上清中の結合した抗体断片を抗myc−tag抗体によって検出することにより、可溶性抗体断片を調製した。精製された単量体scFv断片（精製については下記参照）を競合ELISA実験と結合特異性を調べるためとに使った。特異的ELISAのために、記載の様々なタンパク質（Marksら,1991,前掲およびWO 92/01047）でプレートをコーティングした。
競合ELISAには、Mab32（Peptide Technologyから提供）のタンパク質分解的開裂により誘導されたFab断片と、9E10−プロテインＡ精製済マウスscFv−Mab32かプロテインＡ精製済ヒトscFv断片（V_HP1/2/3−Ｖλ２）のどちらかを使った。TNFがコーティングされたプレート（PBS中３％BSAでブロックしたもの）に、４つのscFv断片の各１つと増加する量のマウスFab断片（総量100μlで、1mg/ml溶液を1.2μl、４μlおよび10μl）との混合物を添加した。２時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、そして抗体9E10（これはscFv断片のＣ末端のmyc−tagを認識する;MunroおよびPelham,1986,Cell 46,291−300）とペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス抗体（Fc特異的）とを使って、結合したscFvを検出した。負の対照として、同じ抗体を使って増加する量のFab断片のみを検出した〔抗マウス（Fc特異的）抗体はマウスFabと弱く交差反応する〕。ある範囲の濃度のscFv断片（250μg/mlまで）を使って実験を行い、競合が目に見えるscFvの最少検出可能量を確立した（過剰量のscFvを使った時、競合は全く目に見えない）。
DNAフィンガープリント法およびクローンの配列決定
TNF−ELISAにおいて陽性のファージクローンのＶ遺伝子DNAをDNAフィンガープリント法（Clacksonら,1991,前掲）により分析した。簡単に言えば、fd−PCR−BACKと重鎖にはfd−SEQ1または軽鎖にはHULAMBDASEQとを用いて該遺伝子を25サイクル増幅せしめ（94℃で１分;50℃で１分そして72℃で２分）、次いでDNAをBstN Iで切断した。アガロースゲル電気泳動による消化物の分析は、陽性クローン間の主な相違の同定を可能にした。シークエナーゼキット（USB）と適当な配列決定用プライマーを使って、ジデオキシチェーンターミネーション法（F.Sangerら,1977,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,5463−5467頁）により、選択されたＶ領域の核酸配列を決定した。pHEN1中でクローニングされたマウスＶ遺伝子はpHEN−SEQとLINKSEQを使って配列決定し；ヒトV_H遺伝子はヒトC_H1（μ）領域中に位置するプライマー（Hu−MCH1FORSEQ2）を使って配列決定し、一方ヒトＶλ遺伝子にはHULAMBDASEQを使った。
可溶性発現に向けての選択された鎖の再クローニング
pUC19−pelB−myc中へのクローニングのため、選択された軽鎖をSfi I標識逆プライマーとNot I標識正プライマーを使って増幅せしめた。ヒト軽鎖ＶλA2,VλD1およびＶλC4をHuVL1BACKSFIとHuCL1FORAMBNOTを使ってfdから増幅せしめ、無標識軽鎖としての可溶性発現（非抑制株中での）に向けてpUC19−pelB−myc中でクローニングした。
あるいは、選択されたＶ遺伝子を、本質的には記載された通りに（Clacksonら,1991,前掲;Marksら,1991,前掲およびWO 92/01047）、Marksら（1991,前掲およびWO 92/01047）に記載のオリゴヌクレオチドを使ってscFv遺伝子として構築し、そしてＣ末端myc−tagを有する可溶性scFv断片としてのE.コリHB2151細胞中での発現に向けてpHEN1（Hoogenboomら,1991,前掲）中でクローニングした。
scFv断片の精製
Ｃ末端myc−tagを有する元のマウスscFv−Mab32−c14断片は、9E10−プロテインＡアフィニティーカラム（Clacksonら,1991,前掲に記載）を使ってE.コリ上清から精製した。ヒトscFv断片（全てV_H3遺伝子を有する）はプロテインＡ−セファロースカラム（H.R.HoogenboomおよびG.Winter,J.Mol.Biol.227,381−388頁,1992）上で精製した。どのタンパク質もゲル濾過（Superdex−75,Pharmacia）を使って更に精製し、BIAcore分析用に単量体画分を取った。
標準的ポリメラーゼ連鎖反応
ポリメラーゼ連鎖反応用の標準的反応混合物は、５μlの鋳型DNA;20ピコモルの逆プライマー;20ピコモルの正プライマー;10mM KCl;10mM（NH₄）₂SO₄;20mM Tris−HCl（pH8.8）;2mM MgCl₂;100μｇのBSA/mlおよび１単位のTaq DNAポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetus）であった。この反応混合物の上に鉱油を重層させ、Techne熱循環器（Duxforld,England）を使って30サイクルの増幅にかけた。１サイクルは94℃で１分（変性）、55℃で１分（アニーリング）および72℃で1.5分（伸長）であった。その他のPCR条件は本明細書中または参考文献中に与えられている。
DNA生成物の精製
生成物は、アガロースゲル電気泳動後にGeneclean（Bio101）を使って、または電気溶出とエタノール沈澱（J.Sambrokkら,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY.）により精製した。
制限酵素消化
制限酵素消化は製造業者（New England Biolabs,CP Labs,Bishops Stortford）の指示に従って実施した。連結はSambrookら（1989,前掲）に従って実施した。
結論
本発明者らは、エピトープ刷り込み選択（EIS）方法によりマウス抗体を同じ特異性を持つヒト抗体に再構築できることを証明した。
ヒト軽鎖のライブラリーをマウスV_Hドメインと組合せ、結合性の組合せを選択し、次いでヒトV_H遺伝子のライブラリー用の「ドッキングドメイン」として２回目の入替えに使った。そのような「真の」ヒトライブラリーから完全にヒトの抗体を単離した。該抗体は結合特異性を保持していることが示された。あるいは、マウスV_LをヒトV_H相手鎖を選択するためのドッキング鎖として使った。そのようなV_HドメインはヒトV_L遺伝子を見つけるのに使うことができ、あるいはまた、マウスV_Hドメインを使って選択されたヒトV_Lドメインと組み合わせることができる。実際、独立的に選択された２つのＶ遺伝子を組み合わせることによって結合活性が得られた。これはEIS法の潜在的付加能力を示している。
CDR移植（Riechmannら,1988,前掲）方法はしばしば抗体の三次元構造の詳しい知識を必要とするため、EISアプローチの方がCDR移植よりも迅速に抗体をヒト化するのに役立つことができる。しかしながら、EIS法は、例えば免疫処置した齧歯類からのファージ選択により得られた抗体レパートリーに拡張することができる。抗原での免疫処置後、高い親和性と特異性を有するＶ遺伝子のレパートリーを選択し、次いでエピトープ刷り込み選択（実施例４参照）に使用し、高い親和性を有し且つ所望の特異性が富化された或る範囲のヒト抗体を産生することができる。
実施例２
多組合せ抗体ライブラリーとCDR刷り込みを使った齧歯類抗体のヒト化
重鎖のCDR3は、全CDRのうち長さと配列に関して最も可変的であることが通常認められ、そして抗原との重要な接触を行うことができる（Winter,G.およびMilstein,C.,“Man−made Antibodies",1991,Naure 349,293−299頁）。これは、CDR移植（ドイツ国特許明細書GB2188638B）によるにせよ鎖入替えを使って本明細書に記載の通りにしてにせよ、ヒト化する時に重要な事柄である。齧歯類抗体のV_HCDR3配列がヒトV_Hセグメント上に刷り込まれる鎖入替え法によるヒト化に多組合せアプローチを適用することが有利かもしれない。多組合せアプローチでは、１断片例えばV_HC_H1がファージベクターからの融合体としてファージ上に表示され、そして他方の断片例えば軽鎖が例えばプラスミドから可溶性断片として発現される。Fab断片としてファージ上に両断片を表示せしめるためにファージによる重感染が用いられる。
この実験では、マウス抗HIV gp120モノクローナル抗体をヒト化した。このマウス抗体のV_HドメインをヒトＣγドメインと融合せしめ、そしてpUC19Sfi/Not/polymyc中にクローニングした。
fd−DOG−１（WO 92/01047のfd−CAT−２としても知られる）中にg3融合体としてクローニングした生来のヒト軽鎖のレパートリーを、キメラ重鎖を担持する細胞中に感染せしめ、抗原に関してファージ選択した。ファージゲノムは軽鎖だけをコードするが、それらのファージはその表面上に重鎖と軽鎖の両方を有する。重鎖だけが提供されたものであるためこれは問題ではない。
こうして選択された軽鎖を、次いでヒト抗体のCDR3が元のマウス重鎖のもので置換されるようなやり方でPCR増幅させた生来のヒトV_Hドメインのライブラリーと対合させる。
項目（ａ）は、マウスF58のV_HおよびV_LドメインがヒトC_H1およびＣκ配列に融合されたキメラFab断片の作製を扱う。このクローンを抗体の早期特徴付けに使い、その後の重鎖のPCR増幅のための鋳型として働いた。これを次いでPst I−Not I断片としてpUC19 Sfi−Not polymyc中にクローニングした（項目（ｂ））。項目（ｃ）はfdDOG中でのヒト軽鎖レパートリーの作製を記載しており、このヒト軽鎖レパートリーを次いでpUC19上にキメラ重鎖を含む細胞に感染せしめた（項目（ｄ））。生じたファージをペプチドに対して選択し（項目（ｅ））、選択された軽鎖をPCR増幅せしめ、そしてキメラ重鎖と並んでAsc I−Not I断片としてクローニングし（項目（ｆ））、ELISAにより抗原への結合能力についてアッセイした（項目（ｇ））。選択された軽鎖をpUC中で再クローニングし（項目（ｈ））、生来のヒトV_Hドメイン上にF58 CDR3配列を刷り込む変異原性プライマーを使って該ヒトV_Hドメインを増幅せしめ、そして得られた断片をファージ中でクローニングした（項目（ｉ））。次いでこの刷り込まれた重鎖ファージのレパートリーを使って、pUC上に選択された軽鎖を担持している細胞を感染せしめ、得られたファージを抗原に関して選別した。最後に、選択された重鎖と軽鎖を同一レプリコン上で一緒にクローニングし、そして抗原への結合についてアッセイした（項目（ｊ））。
（ａ） F58キメラ重鎖のクローニング
（ｉ）cDNA合成と最初のPCR
5mlの培養ハイブリドーマ細胞（約２×10⁶細胞）をPBS中で洗浄し、ペレット化し、200μlの0.1％ジエチルピロカーボネート／水に再懸濁し、すぐに５分間煮沸した。遠心分離後、「煮沸物」の上清68μlを反応混合物28μlに添加し、140mM KCl,50mM Tris−HCl（42℃でpH8.1）,8mM MgCl₂,10mM DTT,500μＭデオキシチミジン三リン酸,500μＭデオキシシチジン三リン酸,500μＭデオキシシアデニン三リン酸および500μＭデオキシグアニン三リン酸ヌクレオチド三リン酸（500μM dNTPs）,160単位のヒト胎盤RNアーゼ阻害剤並びに10ピコモルの正プライマーを含有する反応混合物96μlを得た。４μl（100単位）の鳥類骨髄芽球症ウイルス（AMV）逆転写酵素を添加し、反応液を42℃にて１時間インキュベートし、100℃に３分間加熱し、氷上で急冷し、５分間遠心した。次いで上清をすぐにPCRに使った。
重鎖と軽鎖には別々のPCR増幅を実施した。cDNA合成からの上清５μl,250μM dNTPs,50mM KCl,10mM Tris−HCl（pH8.3）,1.5mM MgCl₂,175μg/mlBSA,各20ピコモルの適当な正および逆プライマーの混合物（Clackson,T.ら,1991,前掲）並びに１μl（５単位）のテルムス・アクアチクス（Taq）DNAポリメラーゼ（Cetus,Emeryville,CA）を含有する50μlの反応混合物を調製した。この反応混合物の上にパラフィン油を重層させ、Techne PHC−２熱循環器を使って30サイクルの増幅にかけた。１サイクルは94℃で１分（変性）、55℃で１分（アニーリング）そして72℃で１分（伸長）であった。５μlを２％アガロースゲル上で展開することにより生成物を分析した。残りはエーテルで２回、フェノール／クロロホルムで１回抽出し、エタノール沈澱せしめ、そして50μlの水に再懸濁した。
（ii） 増幅させたV_HおよびＶκDNAのクローニングと配列決定
増幅させたV_H DNAをPst IとBstE IIで消化し、２％低融点アガロースゲル上で精製し、そしてPst IとBstE IIで消化したM13VHPCR1〔Orlandi,R.,D.H.Gussow,P.T.JonesおよびG.Winter（1989）“Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction",Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86（10）,3833−７〕中に連結せしめた。増幅させたＶκDNAをPvu IIとBgl IIで消化し、そしてPvu IIとBcl Iで消化したM13VKPCR1中に連結せしめた。連結混合物を使ってコンピテントTG1細胞を形質転換せしめた。別々の増幅からの２つのクローンを、デオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法を使って各々のV_H鎖とＶκ鎖について配列決定した。
（iii）E.コリ中での発現用のFab構成物の作製
定常ドメインを含むベクター中にF58のＶドメインを連結せしめることにより、F58可変ドメインとヒトIgG1 C_H1およびＣκドメインとを含有するキメラFabを作製した。F58のV_Hを含有するM13VHPCR1とPst IとBstE IIで消化した。生じたF58V_H断片を次いで1.5％アガロースゲル上で精製し、Genecleanを使ってゲルから単離し、そしてPst IとBstE IIで消化したpJM−1FabD1.3（PCT/GB91/01134）中に連結せしめた。この連結混合物を用いてコンピテントE.コリN4830−１細胞〔Gottesman,M.E.,Adhya,S.およびDas,A.（1980）J.Mol.Biol.140,57−75頁〕を形質転換せしめ、RF DNAの制限分析によりF58V_Hを含むクローンを同定した。プライマーVk2BACKとVk3FOR2（Clackson,T.ら,1991,前掲）を使い、鋳型としてF58Vκを含むM13VkPCRを使って、PCRによりF58Vκを増幅せしめた。PCR生成物をSac IとXho Iで消化し、1.5％アガロースゲル上で精製し、Genecleanを使ってゲルから単離し、そしてF58V_Hを含有するSac IとXho Iで消化したpJM−1 Fabベクタ中に連結せしめた。この連結混合物を用いてコンピテントE.コリN4830−１細胞を形質転換せしめ、RF DNAの制限分析によりF58Vκを含むクローンを同定した。
（ｂ） F58キメラ重鎖のPCRとクローニング
上述の通り誘導したF58キメラ重鎖を、プライマーVH1BACKSFI15とHUCH1FORASCNOT（表１）を使ってF58のFabクローンDNAから増幅させた。得られた約700bpの断片をPst IとNot Iで消化し、そして標準法（Sambrook,J.ら,1989,前掲および実施例１）を使ってPst IとNot Iで切断されたpUC19Sfi/Not/Polymycプラスミド中にクローニングした。
（ｃ） 軽鎖レパートリーの作製
適当なファミリーに基づく逆プライマーと正プライマー（表１）の等モル混合物を使って、κ鎖遺伝子とλ鎖遺伝子を別々に増幅せしめた。κ鎖遺伝子は、HUCKFORプライマーを使ったcDNA合成物から、HUCKFORSERプライマーと共に６つのHUVKBACK 1a−6aプライマーの等モル混合物を使って増幅させた。λ鎖遺伝子は、HUCLFORプライマーを使ってcDNA合成物から増幅させ、そしてHUCLFORSERプライマーと共に７つのHULBACK 1−６プライマーの等モル混合物を使って増幅させた。各場合とも、適当なcDNA合成からの上清５μl、20ピコモルの合計濃度の逆（BACK）プライマー、20ピコモルの合計濃度の正（FOWARD）プライマー、250μM dNTPs,10mM KCl,10mM（NH₄）₂SO₄,20mM Tris−HCl（pH8.8）,2.0mM MgCl₂,100mg/ml BSAおよび１μl（１単位）のVent DNAポリメラーゼ（NewEngland Biolabs）を含有する反応混合物50μlを調製した。この反応混合物の上に鉱油（パラフィン油）を重層し、Techne熱循環器を使って30サイクルの増幅にかけた。１サイクルは94℃で１分（変性）、57℃で１分（アニーリング）そして72℃で2.5分（伸長）であった。生成物を２％アガロースゲル上で精製し、Geneclean（Bio−101）によりゲルから単離し、そして25μlのH₂Oに再懸濁した。
２つの軽鎖調製物の各々において２つの異なる危機脱出（pull−through）反応を実施した。κ鎖遺伝子は、HUCKFORSERNOTと一緒に６つのHUVKBAAPAプライマーの等モル混合物を使って２反応において増幅させた。λ鎖遺伝子もHUCLFORSERNOTと一緒に７つのHUVLBAAPAプライマーの等モル混合物を使って２反応において増幅させた。危機脱出条件は、25サイクルの増幅を使うこと以外は最初の軽鎖PCRについてと同様であった。
標準法を使ってPCR生成物をApaL IとNot Iで消化し、そして実施例１に記載の通りApaL IとNot Iで切断されたfd−DOG中にクローニングした。実施例１に記載の如くライブラリークローンからファージを調製し、重鎖を含む細胞を感染せしめるのに使った（下記参照）。
（ｄ） 入替えられたFabファージの生産
Fabキメラ重鎖を含有する細胞を2YTAG中で37℃にて一晩増殖させ、500μlを37℃に予熱された三角フラスコ中の新鮮な2YTAmp培地50mlに添加した。振盪させながら細胞を約0.5のOD₆₀₀まで増殖させた後、軽鎖レパートリーから合計10¹¹個のファージを添加した。培養物を振盪させながら37℃に45分間置き、次いで37℃で更に45分間激しく振盪させた後、テトラサイクリンを15μg/mlになるように加え、一晩振盪させた。
上述したように（実施例１）培養上清のPEG沈澱によってファージを収集し、選択実験に使った。
（ｅ） 入替えられたFabファージの選別
これは前に記載した通り（Marks,J.ら,1991,前掲）にmaxisorbプレート上で実施した。ただし、10μg/mlに溶解させたHIV−１単離物III Bのenv gp120 V3ループペプチドにより試験管をコーティングした。このペプチドはAIDS管理用プログラム（貯蔵番号:ADP737）から得られ、配列:CTRPNNNTRRSIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHCN（配列番号120）を有する。試験管から溶出させたファージを使って、F58キメラ重鎖を含む新鮮な細胞を再感染させ、そしてこの選別／再感染操作を更に３回繰り返した。
（ｆ） 選択された軽鎖の再クローニング
選択された軽鎖を、プライマーG3LASCGTBACKとHUCLFORSERNOTまたはHUCKFORSERNOTとを使ってfd−DOG軽鎖DNAからPCR増幅せしめた。G3LASCGTBACKプライマーはfd中のg IIIの翻訳開始シグナルの上流にアニールし、そしてAsc I部位とリボソーム結合部位（RBS）を提出する。それらの断片をAsc IとNot Iで消化し、そして可溶性Fabの生産を可能にするシストロンを造るようにAsc IとNot Iで切断されたpUC19F58プラスミド（図８に示す）中にクローニングした。これをペプチド結合についてELISAで分析し、軽鎖の末端のmyc tagペプチドによって、結合した抗体を検出した。
（ｇ） ELISA
ELISAは下記のように実施した。
1. 100μlの２×TY、100μg/mlアンピシリン、１％グルコースを96ウエルプレート（cell/tabウエル,Nuclon）上に接種し、そして振盪させながら（300rpm）37℃にて一晩増殖させる。
2. 96ウエルの移動装置を使ってこのプレートから１ウエルあたり200μlの新鮮な２×TY、100μg/mlアンピシリン、0.1％グルコースを含む第二の96ウエルプレートに小接種材料を移す。37℃で振盪させながらOD_600nmが約0.9になるまで（約３時間）増殖させる。元のプレートのウエルに１ウエルあたり25μlの60％グリセロールを加え、−70℃で保存する。
3. 25μlの２×TY:100μg/mlアンピシリン、9mM IPTG（最終濃度 1mM IPTG）を添加する。30℃で更に16〜24時間連続振盪培養する。
4. 4,000rpmで10分間遠心し、100μlの上清をELISAに使う。
5. プレート（Falcon 3912）を10μg/mlのペプチド水溶液50μl／ウエルでウエルをコーティングする。
6. PBSで３回洗浄し、200μl／ウエルの１％BSA/PBSで37℃にて１時間ブロックする。
7. PBSで３回洗浄し、次いで全ウエルに25μlの６％BSA/PBSを添加する。
8. 適当なウエルに可溶性Fabを含む培養上清100μlを添加する。混合し、室温で1.5時間放置する。
9. 試験溶液を捨て、ウエルをPBS,0.05％Tween 20で３回、次いでPBSで３回洗浄する。２％Marvel/PBS中の４μg/mlの精製9E10抗体100μlを各ウエルにピペットで加える。室温で1.5時間インキュベートする。
10. 9E10抗体を捨て、PBS,0.05％Tween 20で３回、次いでPBSでウエルを３回洗浄する。抗マウス抗体（ペルオキシダーゼ接合抗マウス免疫グロブリン,Dakopats/ICN、またはペルオキシダーゼ接合抗マウスIgG,Fc特異的,Sigma A−2554）の1:500希釈液100μlをピペットで加える。室温で1.5時間インキュベートする。
11. 第二抗体を捨て、PBS,0.05％Tween 20で３回、次いでPBSでウエルを３回洗浄する。
12. 10mgのABTS〔2,2′−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸、ジアゾニウム塩〕錠剤１錠を20mlの50mMクエン酸緩衝液,pH4.5に添加する。（50mMクエン酸緩衝液,pH4.5は、同容量の50mMクエン酸三ナトリウムと50mMクエン酸を混合することにより作製する。）
13. 分配を行う直前に30％過酸化水素２μlを上記溶液に添加する。
14. 各ウエルに上記溶液100μlを添加する。室温で20〜30分間置く。
15. 3.2mg/mlのフッ化ナトリウム50μlを加えることによりクエンチングする。405nmで読む。
注1:あるいは、形質転換プレートからのクローンを96ウエルプレート（“cell well",Nuclon）中の100μlの２×TY、100μg/mlアンピシリン、0.1％グルコース中に接種し、OD_600nmが約0.9になるまで（約６時間）37℃で振盪しながら（300r.p.m.）増殖させる。段階３を続ける。
注2:この方法はDeBellis,D.およびSchwartz,I.,1990,Nucl.Acids Res.18,1311頁に基づいており、そして誘導物質（IPTG）を添加する時までに出発培地中に存在する低レベルのグルコースが代謝されることに頼っている。
注3:“Marvel"は乾燥粉乳である。PBSは１l中5.84g NaCl,4.72g Na₂HPO₄および2.64g NaH₂PO₄・2H₂O,pH7.2である。BSAはウシ血清アルブミンである。
（ｈ） 選択された軽鎖のサブクローニング
HUCLFORSERASCNOTと共に７つのHUVLBASFIプライマーの等モル混合物またはHUCKFORSERASCNOTと共に６つのHUVKBASFIプライマーの等モル混合物を使って、選択されたクローンのDNAから軽鎖をPCR増殖させた。反応条件は、25サイクルの増幅を使うこと以外は、最初のPCR反応について記載した条件と同じであった。PCR断片をSfi IとNot Iで切断し、そしてSfi IとNot Iで切断されたpUC19Sfi/Not/polymyc中にクローニングし、これを用いてTG1細胞を形質転換せしめた。
上述の選別／感染法を事実上再び繰り返したが、今度は重鎖と軽鎖の位置が逆であった。
（ｉ） CDR刷り込み用V_H
後述のようにして調製しプールした最初のPCR材料からV_Hドメインを増幅させた。
PCR増幅させたV_H遺伝子の２つの調製物を作製した。両調製物ともHUJHFORプライマー（表１）の等モル混合物を使い、一方の調製物では、HUVHBACKプライマー（表１）の各々を個別に使って６つの別々のPCR増幅を実施し、他方では、６つのHUVHBACKプライマー全ての等モル混合物を使ってPCR反応を実施した。７種のPCR全てについて、HUIGMFORプライマーを使ったcDNA合成からの上清５μl、合計濃度20ピコモルの逆（BACK）プライマー、合計濃度20ピコモルの正（FOWARD）プライマー、250μM dNTPs,10mM KCl,10mM（NH₄）₂SO₄,20mM Tris−HCl（pH8.8）,2.0mM MgCl₂,100mg/mlのBSAおよび１μl（１単位）のVent DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を含有する反応混合物50μlを調製した。この反応混合物の上に鉱油（パラフィン油）を重層し、TechnePHC−２熱循環器を使って30サイクルの増幅にかけた。１サイクルは94℃で１分（変性）、57℃で１分（アニーリング）そして72℃で１分（伸長）であった。生成物を1.5％アガロースゲル上で精製し、Geneclean（Bio−101）によりゲルから単離し、そして25μlのH₂Oに再懸濁した。
変異原性F58GRAFTJH4SALプライマーとHUVHBAAPA1−６プライマーの各々を個別に使って６つの別々の刷り込み反応を実施した。
刷り込み反応はプライマーHUVHBAAPA（全部で６つのプライマーの等モル混合物）とHUJHFORSAL（全部で４つのプライマーの等モル混合物）を使って設定された。前の段階からのプールしたPCR生成物５μlを含有する反応液50μlを、25サイクルの増幅を使いアニーリング温度が45℃であること以外は最初のPCRと同じ条件下で増幅させた。
得られたV_H断片プールし、標準条件下でApaL IとSal Iで切断し、そして標準的プロトコールを使ってApaL IとXho Iで切断されたfd−DOG−G1CH1中にクローニングした（Sal IとXho Iは適合性CTAG突然末端を生成する）。このライブラリーから上述の如くファージを調製し、今度は重鎖ファージを使って、pUC19Sfi/Not/polymyc中で発現させた選択された軽鎖を担持してる細胞を感染せしめた。
（ｊ） 最後の重鎖−軽鎖組合せ体のスクリーニング
この方法の最終結果は、選択された重鎖とプールと選択された軽鎖のプールである。それらをここで無作為に組み合わせる。HUCH1FORASCNOTと一緒に６つのHUVHBACKSFIプライマー全部の等モル混合物を使って実施例１に記載の手順を用いて重鎖クローンをPCR増幅せしめる。それらの断片をSfi IとAsc Iで切断し、標準手順（実施例１）を使ってゲル精製し、次いで上記段階（ｆ）から作製したAsc I−Not Iで切断された軽鎖および以前に作製したSfi I−Not Iで切断されたpUC19Sfi/Not/polymycベクターの等モル量と連結せしめる。あるいはそれらのSfi I−Asc I断片を、図８（Ａ）の最後に示した構成物中のF58重鎖と置換する。次いでそれらの構成物を用いてTG1を形質転換せしめ、上述の如くELISAによりペプチド結合活性について分析する。
最終産物は、親の齧歯類抗体と同じまたは類似した抗原特異性を有する完全にヒトのFab断片である。
実施例３
無作為組合せファージ表示ライブラリーとCDR移植（CDR刷り込み選択）を使った齧歯類抗体のヒト化
この実施例に記載の実験では、図９に図解されるようにしてマウス抗HIV−1 gp120モノクローナル抗体F58をヒト化した。F58のＶκドメイン、一本鎖FvリンカーおよびXho I制限部位を有するヒトV_Hフレームワーク４の最初の残基を含有してるベクター（pHENMBF58VL）を作製した。このベクターは、Nco I−Sal I断片としてのV_Hレパートリーのクローニングを可能にし、完全なscFvを与える。各重鎖が元のマウスのmab F58のCDR3とヒトフレームワーク４とを含むような方法でヒトV_HレパートリーをPCRにより増幅せしめ、そして最後にpHENMBF58VL中にクローニングした。scFvライブラリーをHIV−1 gp120由来のペプチドへの結合についてスクリーニングした。次いで選択されたscFvからの重鎖可変ドメインをPCR構築によりヒト軽鎖可変ドメインのレパートリーと組合せて完全にヒト化されたscFvを与え、そして抗原結合について再び選択した。従って、ここに説明される手順はCDR移植と組合せファージ表示ライブラリーの合成である。
1. F58可変ドメインのPCR増幅、クローニングおよび配列決定
これは実施例２に記載した。標準的PCR条件は実施例１のものと同じである。
2. F58 scFvの作製
上記で特徴付けたV_HおよびV_Lドメインを、基本的にはClacksonら,1991,前掲に記載の通りに構築してscFv断片を形成させた。
2.1章において言及するプライマーの配列は、Hoogenboomら（前掲）に記載されているVH1BACKSfiを除いてClacksonら（1991,前掲）に与えられている。
2.1 F58のV_HおよびV_LのPCR増幅並びにPCR構築法
F58のV_Hを含むM13VHPCR1（Orlandiら,1989,前掲）約1ngおよびF58のＶκを含むM13VkPCR（Orlandiら,1989,前掲）1ngを、２つの別個の（循環条件の点では同一の）PCR増幅における鋳型として使用した。上述の鋳型のいずれか1ng、20ピコモルのVH1BACKと20ピコモルのVH1FOR−１（V_Lを増幅するには20ピコモルのVK2BACKと20ピコモルのVK4FOR）、250μM dNTPs、５μlの10×Ventポリメラーゼ反応緩衝液（New England Biolabsから得られる）および２単位のVentDNAポリメラーゼを含有する２つの50μl反応液を調製した。25サイクルのPCRにより増幅を実施した（94℃で１分、55℃で１分、72℃で２分）。
同様にプライマーLINKBACKとLINKFOR（Clacksonら,1991,前掲）を使って約1ngの鋳型DNA pSW2scD1.3（McCaffertyら,Nature 348,552−554,1990）からリンカーDNAを増幅させた。
ゲル精製後、V_HとＶκ生成物の各々１μｇを、プライマーを含まないPCR混合物25μl中の300ngのリンカーと混合し、そして７回循環させ（94℃で２分、72℃で４分）両断片を連結せしめ、次いでVH1BACKとVK4FOLRプライマー各々25ピコモルを使って20サイクル（94℃で1.5分、72℃で2.5分）増幅させた。最後に、構築産物をゲル精製し、プライマーVH1BACK−Sfi IとVK4FOR−Not Iを使って再増幅させて制限部位を付加した（VK4FORとVK4FOR−Not Iは４つの異なるプライマーの等モル混合物である）。次いでF58 scFvをSfi IとNot Iで消化し、そして同様に消化したベクターpUC119Sfi−Notpolymyc中にクローニングした。その後、DNA配列決定により組換え体を確認した。
3. ベクターpHENMBF58VLの作製
上記で単離されたクローンから精製したpUC119F58scFv DNA10ngを、プライマーHuVHLBACK−Xho IとVK4FOR−Not Iを使った標準的PCR増幅において鋳型として使った。PCR産物を精製し、Xho IとNot Iで消化し、そして同様に消化したベクターpHEN1中にクローニングして新規ベクターpHENMBF58VLを作製した。
4. ヒト重鎖レパートリーの増幅とクローニング
4.1 cDNA鋳型の調製
手順は、Marksら,1991,前掲およびWO 92/01047により記載されたIgM定常領域正プライマーを使って実施例２（ａ）（ｉ）に記載した通りであった。
4.2 重鎖可変ドメインのPCR
重鎖可変ドメインを増幅せしめるための６つの別個の反応液は、他のものは標準的PCR混合物中の各々２μlの上記cDNA合成物、20ピコモルの各HUVHBACKSfiプライマーと20ピコモルのF58GRAFTSALプライマーを含んだ。プライマーF58GRAFTSALは６つのヒトV_Hファミリーのフレームワーク３領域にアニールしなければならないので、PCR循環のアニーリング温度を45℃に下げた。PCRを25サイクル行い（94℃で１分、45℃で１分、72℃で１分）、その後生成物をゲル精製した。次のクローニング段階用に多量の材料を得るために、同シリーズのHuVHBACKSfiプライマーとHuJH4FOR−Sal Iプライマーを使って２回目のPCRを行った。その条件はアニーリング段階が45℃の代わりに52℃であること以外は上記と同じであった。
5. scFv断片の作製
上記からのPCR生成物を各々等量プールし、Nco IとSal Iで消化した。この材料１μｇを３μｇのNco I/Sal Iで消化したベクターpHENMBF58VL中に連結せしめた。この連結反応物を処理し、Hoogenboomら（前掲）とWO 92/01047に記載されたようなTG1細胞の形質転換に使った。
6. 抗原結合についてのscFvライブラリーの選択
ヘルパーファージVCSM13を使ったTG1中のライブラリーの感染およびその後の連続選択へ向けてのファージのプロセシングは記載の通り行った（Hoogenboomら,1991およびWO 92/01047）。各選択のために、８ウエルのMaxisorpプレート（Nunc）に３μg/mlのペプチド水溶液50μlを接種した。該ウエルを一晩完全に乾燥させ、１％BSA/PBSを使って室温で30分間ブロックし、最後にPBSで２回洗浄した。各ウエルに50μlのファージと150μlのTris−HCl,pH8.3,0.5M NaCl,4％ BSAを添加した。２時間後、ウエルをTris−HCl,pH8.3,0.1M NaClで３回、次いでTris−HCl,pH8.3,0.5M NaClで３回洗浄した。結合したファージの溶出とTG1細胞の感染は記載の通り行った（WO 92/01047）。簡単に言えば、ウエルあたり50μlの100mMトリエチレンアミンを使って10分間ファージを溶出させた。次いで溶出した材料を即座に1/2容の1M Tris−HCl,pH7.4で中和し、そして対数関数的に増殖しているTG1細胞に感染せしめるのに使った。
ペプチド抗原はHIV−１単離物III Bのgp120 V3ループに相当し、これはMRCのAIDS管理プログラム（貯蔵所番号ADP737）から得られた。配列はYCTRPNNNTRRSIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHCY（配列番号121）である。
7. 選択されたscFvの分析
３回の選択後、溶出したファージのアリコートを使ってHB2151細胞を感染せしめ、可溶性scFvの発現に備えた。Fab断片よりむしろscFv断片を調製したこと以外は実施例２において上述した通りに、ペプチドELISAにより個々の結合性クローンの同定を行った。
分析したクローンの約15％がこの段階で陽性と記録され、同じプレート上で対照として行った元のF58 scFvに関して得られたシグナルの50％〜150％のELISAシグナルを与えた（図10参照）。陽性scFvはいずれもプラスチック、ニワトリ卵白リゾチームまたはヒトチログロブリンと反応しなかった。
ヌクレオチド配列分析は、陽性クローンがV_Hファミリー１および６の生殖細胞系列遺伝子に由来する体細胞変異されたヒトV_H遺伝子を含むことを明らかにした（図11参照）。
8. ヒト軽鎖可変ドメインのレパートリーによるF58軽鎖可変ドメインの置換
ペプチドELISAにおいて活性であることが示されたプールしたクローン約10ngを鋳型として50μlの標準的PCR増幅において使用し、選択された重鎖可変ドメインを得た。プライマーとして各々20ピコモルのLMB3とHuJH4FORASSUXho Iを使った。鋳型として50ngのDNAを使って標準的PCR反応においてプライマーfdSEQ1とHuVHLBACKを使ってIgG−scFvライブラリー（WO 92/01047の実施例42）からヒト軽鎖可変ドメインを増幅させた。重鎖と軽鎖の両増幅産物をゲル精製し、本質的には上述した通りに７サイクルに渡りPCR構築に使用した（各１μｇ）。環境条件は94℃で１分、55℃で１分そして72℃で２分であった。構築反応が完結した後、プライマーLMB3とfdSEQ1を加え（各20ピコグラム）、更に20サイクルに渡りPCRを続けた。構築産物をゲル精製し、Nco IとNot Iで消化した。最後に、切断したscFv1μｇを３μｇのNco I/Not I消化されたpHEN1中に連結せしめた。得られたライブラリーscFvを上記の通り（段階６）選択した。最後に、上述した通り（段階７）個々のクローンをV3ループペプチドへの結合についてスクリーニングした。
最終産物は、親のマウス抗体F58と同じまたは非常に類似した特異性を有する完全にヒトのscFv断片であり、即ちそれらはgp120 V3ループに結合するが非相同タンパク質には結合しない。
実施例４
免疫処置マウスの免疫レパートリーから誘導されたヒト抗体の、エピトープ刷り込み選択による単離
この実施例は、免疫処置マウスから誘導されたマウス抗体の元のライブラリーからの、連続する鎖入替えによるTNF−α特異的ヒト抗体の作製を説明し、本発明の更なる態様を例示する。この方法は、一方の鎖がマウスでありそして他方がヒトである場合、中間体V_H/V_L組合せは、元のマウスV_H/V_L対が向けられる抗原性エピトープに結合するという事実に基づく。
この実施例では、マウスライブラリーを抗原への結合について予備選択することにより、マウスライブラリー中の抗原（ここではTNF−α）に対する抗体の頻度を増加させることが好ましい。次いでマウス抗体のこの集団を鎖入替えによりヒト化することができる。選択されたマウス集団からのV_H鎖を一定に維持し、そして生来のヒトライブラリーからの一組のヒトV_L鎖を使って構築する。次いでこのマウスV_H/ヒトV_Lライブラリーを着目の抗原への結合についての連続選択にかける。それらのヒトV_Lを生来のヒトライブラリーから同様に誘導したヒトV_Hと対合させることにより、この選択された半分ヒト化された抗体の集団を完全にヒト化する。生じたライブラリーを抗原に特異的な結合体について選択することができる。逆に、最初の時点でマウスV_L鎖を固定し、そしてヒトV_H鎖を使って構築し、そして抗原への結合について選択した後、単離したヒトV_H鎖を生来のヒトライブラリーからのV_Lと対合させることにより、完全にヒト化することもできる。
1. 免疫処置マウスからの一本鎖Fvファージ表示ライブラリーの調製
TNF−αで高度免疫処置したマウスの脾臓から調製したリンパ球からRNAを抽出する。重鎖と軽鎖の可変領域をコードするDNA配列をPCRにより増幅させ、そしてWO 92/01047に記載した通りに一本鎖Fv断片として構築した。制限エンドヌクレアーゼApaL IとNot Iのための部位を５′末端と３′末端に組み込む。ApaL IとNot Iでの消化後、構築したDNAをApaL I/Not I消化したpCANTAB3−myc（図12）中に連結せしめ、E.コリTG1細胞中にエレクトロポレーションし、そしてアンピシリン選択培地上に塗抹する（下記プロトコール（ｈ）を参照のこと）。
2. TNFに結合するマウスscFv断片を表示しているファージの選択
M13K07ヘルパーファージでの重感染によりファジミドを救援し、そして1/5容の20％ポリエチレングリコール/2.5M NaClを使って沈澱させる。TNF−αでコーティングした免疫吸着試験管上でファージ抗体（1ml,PBS中10μg/ml）を選別し、そして1mlの100mMトリエチルアミンを用いて５分間溶出せしめ、次いで0.5mlのTRIS（1M,pH7.4）で中和することにより、選択されたTNF−α結合性ファージ抗体の集団を調製する。
溶出させたファージを使って対数増殖期にある10mlのTG1細胞を37℃にて30分間感染させ、アンピシリン耐性コロニーについて平板培養する。生じたコロニーを2YT培地中に掻き取り、M13K07を使って救援する。上記と同様にTNF−αによりコーティングした免疫吸着試験管上で再びファージ抗体を選択する。溶出したファージを使ってE.コリTG1細胞を感染させ、平板培養し、アンピシリン耐性コロニーを2YT培地中に掻き取り、15％までグリセロールを添加し、そして−70℃で保存する。この段階で、選択された集団中のTNF結合性クローンの頻度を実施例１に記載のようなELISAにより調べる。
3. 鎖入替え用断片の源としてのDNAの調製
ヒト重鎖および軽鎖DNA
免疫処置されていないヒトのＶ遺伝子に由来するscFv断片をコードするライブラリーをベクターpHEN1中で作製した（WO 92/01047,実施例42）。
DNA調製
２回目の選択のコロニー（マウスDNA）と生来のヒトライブラリー（ヒトDNA）から、アルカリ溶解によりMiniprep DNAを調製した。
グリセロール原株からの約５×10⁷個の細胞を、100μg/mlアンピシリン、２％グルコースを含有する2YT培地10ml中で30℃にて一晩増殖させる。遠心分離（3500rpm,15分間）により細胞をペレット化し、市販のキット（Promega）を使ったアルカリ溶解により該細胞ペレットからDNAを調製する。
4. 鎖入替えしたscFv断片をコードするDNAの調製
次のプライマーを使用する：

LMB3とFDTSEQ1はそれぞれ、pCANTABシリーズのベクターの抗体クローニング部位の５′および３′隣接配列にアニールする。PCRHLINKとLINKPCRLは（gly4ser3）ペプチドリンカーをコードする配列とアニールする。プライマーをLMB3/PCRHLINKおよびFDTSEQ1/LINKPCRLのペアでPCR増幅に使うと、相補的３′/5′末端を有し且つ５′/3′末端に制限認識部位を有する重鎖および軽鎖断片が作製されるだろう。
この手順では、Marksら,1991（前掲）により記載されたヒトライブラリーが、重鎖および軽鎖可変ドメインをコードするDNAの源として使われる。各々の入替えには下記の鎖入替えプロトコールを使用する。それは例えばヒト生来の軽鎖可変ドメインをマウス重鎖可変ドメインと一度組み合わせ、次いでヒト生来の重鎖可変ドメインを有する選択されたヒト軽鎖可変ドメインと再び組み合わせることに従う。この手順により製造された入替えられたscFv断片をコードするDNAを、マウスV_H遺伝子とヒトV_H遺伝子のいずれがの入替えに使われたかに応じて、それぞれpCANTAB3−mycまたはpCANTAB5−myc（図13）中に挿入する。
（ａ） 一次PCR
次の反応液中で最初の重鎖および軽鎖産物を調製する：

「反応緩衝液」は10×PCR反応緩衝液:0.1M TRIS pH8.3,0.5MKCl,15mM MgCl₂,0.1％ゼラチンである。
PCR条件は94℃で１分、60℃で１分、72℃で２分の25サイクルであり、最後の10分は72℃である。
（ｂ） 生成物の精製
一次PCR生成物をアガロースゲル上で精製し、５μlの「グラスミルク」（Geneclean,Bio 101）を使って各々10μlの水の中で２回溶出させることにより精製する。
（ｃ） PCRによる構築
構築は次のようにして実施する：
精製した重鎖 2.5μl
精製した軽鎖 2.5μl
10×反応緩衝液 2μl
5mM各dNTP 1.0μl
Taqポリメラーゼ 0.2μl
水 37μl
PCR条件は94℃で１分および65℃で４分の25サイクルの後、72℃で最後の10分である。一次PCRについて与えられたPCR条件も機能するだろうが、結合反応には65℃が好ましい。
（ｄ） 二次PCR
二次PCRは（ｃ）からの結合材料１μlを鋳型として使用する。反応液は次のように設定する：
結合したPCR生成物 1μl
LMB3プライマー（10ピコモル／μl） 2.5μl
FDTSEQ1プライマー（10ピコモル／μl） 2.5μl
10×PCR反応緩衝液 5.0μl
5mM各dNTP 2.5μl
Taqポリメラーゼ（5U/μl） 0.3μl
水 37μl
PCR条件は94℃で１分、60℃で１分および72℃で２分の25サイクルの後、72℃で最後の10分である。
（ｅ） 二次PCR生成物（挿入断片）の消化
二次PCR生成物をフェノール：クロロホルムで抽出し、そしてエタノール沈澱せしめてTaqポリメラーゼを除去する。PCR生成物を270μlの水に溶かし、30μlの10×反応緩衝液を加える。50単位のNot Iを添加し、37℃で３時間消化する。フェノール：クロロホルムで抽出し、そしてエタノール沈澱せしめる。ペレットを270μlの水に再懸濁し、30μlの10×反応緩衝液を加える。使用したV_HがヒトであるならSfi I（50単位）を使用して50℃で一晩消化し、一方V_HがマウスであるならApaL1（50単位）を使用して37℃で一晩消化する。
10×ApaL1緩衝液:0.5M酢酸カリウム、0.2M TRIS酢酸塩、100mM酢酸マグネシウム、10mMジチオトレイトール（25℃にてpH7.9）。
10×Not I緩衝液:1.5M NaCl,100mM TRIS−HCl,100mM MgCl₂,0.1％ Triton X−100（25℃にてpH7.9）。
10×Sfi I緩衝液:0.5M NaCl,100mM TRIS−HCl,100mM MgCl₂,10mMジチオトレイトール（25℃にてpH7.9）。
（ｆ） 消化生成物の精製
消化物をフェノール：クロロホルムで処理し、エタノール沈澱せしめ、20μlの水に溶かす。該生成物を1.5％アガロースゲル上で展開し、約750bpのバンドをゲルから切り出し、Genecleanキットを使って精製する。最終容量10〜15μlの水の中にDNAを溶出させ、クローニングの準備をする。
5. ベクターDNAの調製とクローニング
ベクターDNAの調製
アルカリ溶解法によりプラスミドDNAを調製し、塩化セシウム遠心分離によって精製する。精製DNAを、製造業者の指示に従って（Sfi Iについては50℃、便利には一晩）100μg/mlのDNA濃度を使ってSfi I（pCANTAB5−mycの場合）またはApaL I（pCANTAB3−mycの場合）で消化し、次いでNot Iで３時間消化する。消化生成物を直接Choromaspin 1000カラム上に負荷して原料断片を除去し、そして卓上遠心機上で2200r.p.m.で３分間遠心分離する。次いでフェノール：クロロホルム抽出し、使用に向けて100μg/mlに溶かす。
連結と形質転換
連結は次のようなAmersham連結キットを使って行う：
ベクターDNA １μl（100ng）
挿入断片DNA ２μl（10〜50ng）
10mM MgCl₂,200mM Tris pH7.4 ３μl
緩衝液Ａ 24μl
緩衝液Ｂ ６μl
16℃にて30〜60分間インキュベートする。ライブラリーの調製には、上記に示した量の５倍を使用する。連結生成物を濃縮し、Genecleanを使って精製し、そして10〜50μlの容量の水の中に溶出させる。これをエレクトロコンピテントTG1細胞中に導入する。この場合の典型的形質転換効率は次のようである：
pUC119 1.6×10⁹形質転換体／μｇ
挿入断片を持つ連結ベクター1.0×10⁷形質転換体／μｇ
挿入断片なしの連結ベクター2.0×10⁶形質転換体／μｇ
6. 鎖入替えされたクローンの選択
各々の鎖入替え操作の後、TNF−αに結合するクローンを、マウス抗体ライブラリーからの選択について上記２に記載した手順により選択し、そしてELISAにより結合アッセイする。
7. 追加の入替え
例えばヒト生来の軽鎖可変ドメインを使ったマウス重鎖可変ドメインの選択集団の最初の入替えの後、この最初の入替えからの選択されたクローンをminiprep DNAの源として使用し、例えばWO 92/01047の実施例47において誘導されたライブラリーのヒト生来の重鎖可変ドメインを用いて、上記４と５に記載した鎖入替え操作とクローニング操作を繰り返す。次いでこの２回目の入替えライブラリーにおいて選択を実施し、このレパートリー刷り込み選択法により誘導されるTNF−α結合性の完全にヒト化された抗体を単離する。
実施例５
合成ライブラリーの作製
糸状ファージの表面上への抗体レパートリーの表示と抗原によるファージの選択により^１、免疫選択を模倣することができ^2,3そして免疫処置されていない提供者の再配列されたＶ遺伝子からヒト抗体を製造することができる^４。本発明者らはここで限定されたＶ遺伝子要素からの合成によりヒト抗体を製造した。49個のヒト生殖細胞系列V_H遺伝子セグメントのレパートリーを、５つの無作為アミノ酸残基の合成「Ｄセグメント」とＪセグメントに連結することによって試験管内で再配列させ、８残基を有する合成第三相補性決定領域^５（CDR）を作製した。再配列されたV_H遺伝子をヒトＶλ３軽鎖と共に一本鎖Fv断片としてファージ表示用にクローニングした。ウシ血清アルブミン（BSA）に接合した２−フェニル−オキサゾール−５−オン（phOx）ハプテンを使って10⁷ファージのライブラリーを選別し、そしてマイクロモルレベルにおいてphOx−BSAに対する特異的結合活性を有し且つpHOx−γ−アミノ酪酸（phOx−GABA）に対する親和性を有する断片をコードするファージを単離した。ユニーク配列を有する21個のクローンの比較は、該ハプテンに対する試験管内「免疫応答」が、CDR3の残基98に不変の芳香族残基（Tyr,Phe,Trp）を有するV_H26セグメント（V_H3ファミリー）^６に大きく制限されたことを示した。試験管内で再配列されたＶ遺伝子の使用は、既知構造の抗原の結合のほうに偏らせた抗体ライブラリーの設計を可能にし、免疫原性が低下された治療用ヒト抗体の作製を可能にするだろう。
抗体可変ドメインは、超可変配列またはCDR⁵の３つのループを有するβ−シートフレームワークから成る。このループは、平らな表面^７からポケット^８までに及ぶ様々な形状の抗原結合部位を造る。ヒト重鎖については、最初の２つのCDRの配列多様性は約50の生殖細胞系列V_Hセグメントのレパートリーによってコードされる（I.M.Tomlinsonら、前掲）。３番目のCDRは約30のＤセグメントと６つのＪセグメントとの組換えから生じ^９、そしてその配列は非常に可変的であるが、しばしばループのAsp101からフレームワークのArg94への塩橋を含んでいる¹⁰。最初の２つのCDRの構造と長さは制限されているが^10,11、CDR3のそれは大きく異なり、長さは４〜25残基に及んでいる^５。
Asp101を含む８残基のCDR3を有する再配列されたV_H鎖を単一のＶλ（参考文献12）軽鎖と組み合わせてライブラリーを作製した。ヒトV_Hレパートリーの大部分をコードする49の生殖細胞系列V_Hセグメント（Tomlinsonら、前掲）を、一緒になって８残基のCDR3ループをコードする合成Ｄセグメント（V_Hセグメントの３′末端の15塩基のランダム配列）とＪセグメントを導入するオリゴヌクレオチドプライマーを用い、ポリメラーゼ連鎖反応¹³を使って増幅せしめた（図14）。再配列されたセグメントをプールし、ファージ表示のためヒトＶλ３軽鎖と共にクローニングし、10⁷のファージクローンの合成ライブラリーを作製した。免疫系と同様に、10⁷ファージクローンの合成ライブラリーは可能な多様性のうちの小部分のみを採り出すことができる。よって多様性は潜在的に49×32⁵＝1.6×10⁹種類のヌクレオチド配列、または49×20⁵＝1.6×10⁸種類のアミノ酸配列である。
該ライブラリーをphOx−ウシ血清アルブミン（BSA）がコーティングされた試験管上での４回の増殖と選別にかけ、可溶性¹⁴一本鎖Fv断片^15,16としてphOx−BSAへの結合活性についてELISA⁴によりクローンをスクリーニングした。３回目および４回目の後、それぞれ14/96および61/96のクローンがphOx−BSAへの結合活性を有すると同定され、そしてそれらの（試験した29個の）うち１つも他のタンパク質には結合しなかった（表４参照）。更に、phOx−BSAがコーティングされたプレートへのそれらの結合は、可溶性ハプテンと競合できなかった（表４）。
配列決定により、phOx結合体の多数（21/29）がユニークであり、８残基CDR3を有し、そしてV_H4ファミリーからのセグメントかまたはV_H3ファミリーからの３セグメントのうちの１つを使用することが明らかになった（表４）。それらのセグメントは一緒になって、ヒトV_Hセグメントの最初の２つの超可変ループに利用可能である７つの「規準的」折りたたみのうちの３つを使用する（C.Chothiaら、前掲）。ユニーククローンの大部分（16/21）はV_H26セグメント^６に由来し、そして３番目の超可変ループ中に関連配列を有する。このグループでは、第一残基は分岐した脂肪族側鎖を有する傾向があり（15/16）、第二残基はリジンまたはアルギニンである傾向があり（11/16）、第四残基は常に芳香族残基（最も頻繁にはチロシン）である。
phOx−GABAに対する２つの強力な結合体（Ox−13とOx−31,表４）の親和性（K_d）は、蛍光消光滴定¹⁷によりそれぞれ3.1±0.2μＭと6.7±0.7μＭと測定された。合成抗体ライブラリーは多様なV_H−CDR長さと生体内で産生される抗体の種々の軽鎖を欠いているけれども、phOx−GABAに対する親和性は、免疫処置されていないヒト提供者から作られた（ファージ）抗体の0.5μM⁴、またはマウス一次免疫応答からの数個のハイブリドーマの１μM¹⁸に匹敵する（表３の凡例の注を参照のこと）。
理論上、試験管内で再配列されたＶ遺伝子のファージ表示ライブラリーの使用は、生体内で再配列されたものの興味ある代替物を提供する^４。第一に、該ライブラリーから作製した合成ヒト抗体の重鎖と軽鎖の両方のフレームワーク領域と最初の２つの超可変ループは本質的に生殖細胞系列である。これは、体細胞変異の程度が広範囲に異なる、生体内で再配列されたヒトＶ遺伝子から採った「一次」ファージ抗体^４と対照的である。多形性は別にして、V_H遺伝子セグメントは異なる固体で同一であり、合成抗体は潜在的に免疫原性が低い。重鎖と軽鎖のCDR3ループの長さと配列を変更することにより、または他のCDRループ中に最少の変異を置くことにより、または合成「生殖細胞系列」軽鎖を使って入れ替えることにより^19,20それらの生殖細胞系列の特性を保持したままでそれらの親和性を高めることが可能であるかもしれない。
第二に、両方の種類のライブラリーは高度に偏っている。「天然の」ライブラリーでは、偏りは制御外であり、例えば対立遺伝子変異、欠失多形性および自己反応性クローンの欠失によって付与される。合成ライブラリーでは、偏りを組織的に導入することができる。ここでは例えば、全てのV_H遺伝子セグメントを選択し、それによって第一と第二の超可変ループの折りたたみが固定され、V_H−CDR3および軽鎖の長さと多様性も固定された。多様性合成ライブラリーを作る幾つかの方法が提案されているけれども^２、コードされる構造に設計理論を組み入れることも可能であるだろう。もし抗原の形状が既知であったら、限定されたＶ遺伝子要素を使っておおよそ相補的な結合部位のエンベロープを設計・構築できるかもしれない。そのような「設計者」ライブラリーの使用は、より高い親和性を有する抗体の単離に有利であろう。

表３−合成ライブラリーの組成
49のヒトV_Hセグメント（Tomlinsonら，前掲）を使い、V_H2,V_H5およびV_H6遺伝子ファミリーの各々については１つ、そしてその他の３つのファミリーについては複数のセグメントを使い、ファミリーに従ってクローニングした。各ファミリーのV_Hセグメントからのクローン（図１の説明文を参照のこと）を挿入断片の存在（平均85％）について検査し、そして表４のような単一の大きなライブラリーの中にプールし、或る遺伝子ファミリーへの（制御された）偏りを生ぜしめた。それによってV_H2,V_H5およびV_H6ファミリーからのセグメントは他のファミリーからのセグメントに関して「過度に代表される（overpresented）」。未選択のライブラリーからの35個のクローンの配列決定は、各ファミリーからのV_Hセグメントが存在すること、およびＤセグメント中には予想の比率でヌクレオチドが存在するがＣへのわずかな偏りを有すること（各コドンの最初の位置と２番目の位置ではＡ 21.3％;G 17.9％;C33.7％およびＴ 27.1％、３番目の位置ではＧ 42.6％およびＴ 57.4％である）を確証した。抗体断片の発現レベルも調べると、V_Hセグメントは検出可能な発現レベルでクローン中に同定された。例えばV_H1（DP−７）,V_H2（DP−27）,V_H3（DP−29,35,38,44,47,51,53）,V_H4（DP−63,69）,V_H5（DP−73）およびV_H6（DP−77）。
方法
オリゴヌクレオチドLMB3とpHEN−SEQ1（参考文献４）を使った「PCRスクリーニング²¹」により、クローンを挿入断片の存在について調べ、そしてオリゴヌクレオチドLINKSEQ（5'−CGA TCC GCC ACC GCC AGA G−3'）を使ったジデオキシチェーンターミネーション法²²により二本鎖DNAから配列決定した。（表中の数字は挿入断片について補正されている）。可溶性scFv断片の発現は、E.コリHB2151（参考文献14）中の誘導一晩培養物の上清10μlをスロットブロット装置（Minifold II,Schleicher and Schuell）を使ってニトロセルロースフィルター上にスポットし、そして9E10抗体²³とペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体（Sigma）を使って、結合したペプチド標識scFv断片を検出することにより調べた。

表４−合成ライブラリーから単離されたphOx結合体
VCS−M13を用いた救援によりライブラリーからファージを単離し、そして参考文献４に記載のようなphOx−BSAコーティング試験管中での連続選別にかけた。phOxに結合する21個のファージの配列は、４つの生殖細胞系列V_Hセグメント、即ちDP−42,45,47（V_H3ファミリー）およびDP−67（V_H4ファミリー）を示した。DP−47はV_H26と同一であり（参考文献６、参考文献24で修正）、一方DP−42,DP−45およびDP−47は１個または２〜３個のフレームワーク残基だけがそれぞれ８−1B（参考文献25）,65−２（参考文献26）またはV_H4.22（参考文献27）と異なっている。DP−47のV_Hセグメントを使用しそしてCDR3の特徴的パターンを欠いている未選択のライブラリーからのクローンはphOxに結合しなかった。試験した21のphOx結合体の１つも、BSA、NIP−BSA、プラスチック、キモトリプシノーゲンＡ、チトクロムｃ、ウシチログロブリン、アオガイヘモシアニンまたは七面鳥卵白リゾチームに結合しなかった。BSAに結合した（phOxには結合しなかった）４つのクローンは夾雑物であることがわかった（αBSA3クローン、参考文献４から）。
方法
参考文献４の通りである。scFv断片の相対親和性は阻害ELISA²⁸により測定した。６〜400μＭの範囲の濃度を有する４−γ−アミノ酪酸メチレン−２−フェニル−オキサゾール−５−オン（phOx−GABA）の系列希釈液を４％ Matvel−PBS中に調製し、そしてscFv上清を添加した。phOx−BSAへの結合のシグナルの50％減少を引き起こすphOx−GABAの濃度（I₅₀）を記録した。phOx−GABAに対するクローンOx−13とOx−31の親和性は、ｃ−myc tagによって精製されたscFv断片を使った蛍光消光滴定（参考文献４）により測定した。理想的には、phOx−BSA接合体に対するまたはphOx−カプロン酸に対する親和性が直接測定されているが、ここでは参考文献18のハイブリドーマデータとの比較を可能にするためにphOx−GABAを使用した。phOx接合体またはphOx−カプロン酸に対する抗体の親和性は、おそらくphOx−GABAについて測定されるものよりも良いだろう。
図14−再配列されたV_H遺伝子の構築（本文参照）
方法
合成オリゴヌクレオチドSYNLIB1 5' GCC TCC ACC TCT CGA GAC GGT GAC CAG GGT ACC TTG GCC CCA ATA GTC AAA（［A/C］NN）₅ TCT TGC ACA GTA ATA CAC GGC CGT GTC 3'（配列番号109、表１参照）は、49のヒトV_H生殖細胞系列セグメント（Tomlinsonら、前掲）の各々の３′末端に、５残基ランダムアミノ酸配列を有するＤセグメント、ＪセグメントおよびXho I制限部位を導入した。該プライマーを、Nco I部位を組み込むV_Hファミリーベースの逆プライマー（VHBACK）^４と共にポリメラーゼ連鎖反応¹³において使用した。各V_Hセグメントクローン（M13ベクター中の一本鎖鋳型として提供）を個別に94℃で１分、50℃で１分そして72℃で1.5分を25サイクルに渡りPHC−３熱循環器（Techne）上で増幅せしめた。各増幅をアガロースゲル電気泳動により確認し、そして同ファミリーのV_Hセグメントからの同等量のDNAをプールし、Nco IとXho Iで消化し、そしてBSAに結合するscFv断片^４から取った再配列されたＶλ３軽鎖可変ドメイン（IGLV3S1;参考文献12）を担持しているベクターpHEN1（参考文献14）中にクローニングした。
ランダムオリゴヌクレオチドの代わりに、例えば齧歯類のCDRをコードするオリゴヌクレオチドを使用すると、これは合成ヒトライブラリー生成物上に前記非ヒトCDRを刷り込むだろう。
実施例５で言及した参考文献
1. MaCafferty,J.,Griffiths,A.D.,Winter,G.＆ Chiswell,D.J.（1990）Nature,348,552−554.
2. Milstein,C.（1990）Proc R Soc Lond Biol,239,1−16.
3. Winter,G.＆ Milstein,C.（1991）Nature,349,293−299.
4. Marks,J.D.ら（1991）J Mol Biol,222,581−597.
5. Kabat,E.A.,Wu,T.T.,Reid−Miller,M.,Perry,H.M.＆Gottesman,K.S.Sequences of proteins of immunological interest（US Department of Health and Human Services,US Government Printing Office,1987）．
6. Matthyssens,G.＆ Rabbits,T.H.（1980）Proc Natl Acad Sci USA,77,6561−6565.
7. Amit,A.G.,Mariuzza,R.A.,Phillips,S.E.＆ Poljak,R.J.（1986）Science,233,747−753.
8. Alzari,P.M.ら（1990）Embo J,9,3807−3814.
9. Ichihara,Y.,Matsuoka,H.＆ Kurosawa,Y.（1988）Embo J,7,4141−4150.
10. Chothia,C.＆ Lesk,A.M.（1987）J Mol Biol,196,901−917.
11. Chothia,C.ら（1989）Nature,342,877−883.
12.Frippiat,J.P.ら（1990）Nucleic Acids Res,18,7134.
13. Saiki,R.K.ら（1985）Science,230,1350−1354.
14. Hoogenboom,H.R.ら（1991）Nucleic Acids Res,19,4133−4137.
15. Huston,J.S.ら（1988）Proc Natl Acad Sci USA,85,5879−5883.
16. Bird,R.E.ら（1988）Science,242,423−426.
17. Eisen,H.N.（1964）Meth Med Research,10,115−121.
18. Foote,J.＆ Milstein,C.（1991）Nature,352,530−532.
19. Clackson,T.,Hoogenboom,H.R.,Griffiths,A.D.＆ Winter,G.（1991）Nature,352,624−628.
20. Roberts,A.J.ら（1992）Bio/Technology,印刷中．
21. Gussow,D.＆ Clackson,T.（1989）Nucleic Acids Res,17,4000.
22. Sanger,F.,Nicklen,S.＆ Coulson,A.R.（1977）Proc Natl Acad Sci USA,74,5463−5467.
23. Munro,S.＆ Pelham H.R.B.（1986）Cell,46,291−300.
24. Chen,P.P.,Liu,M.F.,Sinha,S.＆ Carson,D.A.（1988）Anthritis Rheum,31,1429−1431.
25. Berman,J.E.ら（1988）Embo J,7,727−738.
26. Matsuda,F.ら（1990）Embo J,9,2501−2506.
27. Sanz,I.ら（1989）Embo J,8,3741−3748.
28. Rath,S.,Stanley,C.M.＆ Steward,M.W.（1988）J Immunol Methods,106,245−249.

Claims (23)

1. 着目の抗原に特異的な抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片の製造方法であって、次の段階：
   （ｉ）複製可能な遺伝表示パッケージ（rgdp）の成分を使ってパッケージングすることができる核酸発現ベクターを用意し；
   （ii）a.各々ヒト抗体の第一の抗原結合部位構成部分をコードする核酸配列の遺伝学上多様なレパートリーを、b.前記着目の抗原と結合することが知られている非ヒト抗体の第二の抗原結合部位構成部分のユニーク集団または遺伝学上多様な集団をコードする核酸と組み合わせ、前記発現ベクター上に抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片をコードする核酸配列のライブラリーを形成せしめ、ここで前記二量体またはscFv断片は各々第一のポリペプチド鎖成分と第二のポリペプチド鎖成分とから成り、前記第一の抗原結合部位構成部分と前記第二の抗原結合部位構成部分は一緒になって抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片の抗原結合部位を形成し；
   （iii）組換え宿主生物細胞において前記ベクターから前記ライブラリーを発現せしめ、前記第一のポリペプチド鎖成分の各々が、前記第一のポリペプチド鎖成分をrdgpの表面に表示するrgdpの成分との融合体として発現され；
   （iv） 前記発現されたライブラリーから、前記着目の抗原に対する結合特異性を有する前記抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片のユニーク集団または限定集団を抗原との結合により選択し、各選択された抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片が各々のrgdp中でその前記第一の抗原結合部位構成部分をコードする核酸と連関しており、そして
   （ｖ） 前記段階（iv）において選択された抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片を遺伝子的に変更して非ヒト特性を除去または削減する、
   を含んで成り、
   ここで前記段階（ｖ）は、
   段階（iv）において選択された前記第一の抗原結合部位構成部分をコードする核酸のユニーク集団または限定集団を、各々ヒト抗体の第二の抗原結合部位構成部分をコードする核酸配列の遺伝学上多様なレパートリーと組合せ、抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片をコードする核酸配列の第二のライブラリーを形成せしめ、ここで各抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片は、rgdpの一成分を使ってパッケージングすることができる核酸配列から発現される第二の抗体ポリペプチド鎖成分を含んで成り、前記第二の鎖成分は、それによってrgdpの表面に前記第二の鎖成分を表示するrgdpの成分との融合体として発現され、その結果、前記着目の抗原との結合によって前記第二のライブラリーから着目の前記抗原に特異的な抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片を選択することが可能であり、各抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片がそのrgdp中でその第二のポリペプチド成分をコードする核酸と連関している、
   ことを含んで成る、方法。
2. 前記抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片が段階（iv）での選択後に可溶性ポリペプチドとして発現される、請求項１に記載の方法。
3. 前記段階（ii）での組合せの前に、各々前記非ヒト抗体の第二の構成成分をコードする配列を遺伝子的に変更してヒト抗体の第二構成部分との相同性を増加させる、請求項１または請求項２に記載の方法。
4. 着目の抗原に特異的な抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片の製造方法であって、次の段階：
   （ｉ）複製可能な遺伝表示パッケージ（rgdp）の成分を使ってパッケージングすることができる核酸発現ベクターを用意し；
   （ii）a.各々ヒト抗体の第一の抗原結合部位構成部分をコードする核酸配列の遺伝学上多様なレパートリーを、b.前記着目の抗原と結合することが知られている非ヒト抗体の第二の抗原結合部位構成部分のユニーク集団または遺伝学上多様な集団をコードする核酸と組み合わせ、前記発現ベクター上に抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片をコードする核酸配列のライブラリーを形成せしめ、ここで前記二量体またはscFv断片は各々第一のポリペプチド鎖成分と第二のポリペプチド鎖成分とから成り、前記第一の抗原結合部位構成部分と前記第二の抗原結合部位構成部分は一緒になって抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片の抗原結合部位を形成し；
   （iii）組換え宿主生物細胞において前記ベクターから前記ライブラリーを発現せしめ、前記第一のポリペプチド鎖成分の各々が、前記第一のポリペプチド鎖成分をrdgpの表面に表示するrgdpの成分との融合体として発現され；
   （iv） 前記発現されたライブラリーから、前記着目の抗原に対する結合特異性を有する前記抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片のユニーク集団または限定集団を抗原との結合により選択し、各選択された抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片が各々のrgdp中でその前記第一の抗原結合部位構成部分をコードする核酸と連関しており、そして
   （ｖ） 前記段階（iv）において選択された抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片を遺伝子的に変更して非ヒト特性を除去または削減する、
   を含んで成り、
   ここで前記段階（ｖ）は、
   ａ）複製可能な遺伝表示パッケージ（rgdp）の成分を使ってパッケージングすることができる核酸発現ベクターを用意し；
   ｂ）前記着目の抗原と結合することが知られている非ヒト抗体の第一の抗原結合部位構成部分のユニーク集団または遺伝学上多様な集団をコードする核酸を、各々ヒト抗体の第二の抗原結合部位構成部分をコードする核酸配列の遺伝学上多様なレパートリーと組み合わせ、前記発現ベクター上に抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片をコードする核酸配列の第二のライブラリーを形成せしめ、ここで前記二量体またはscFv断片は各々第一のポリペプチド鎖成分と第二のポリペプチド鎖成分とから成り、前記第一の抗原結合部位構成部分と前記第二の抗原結合部位構成部分は一緒になって抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片の抗原結合部位を形成し；
   ｃ）組換え宿主生物細胞において前記ベクターから前記第二ライブラリーを発現せしめ、前記第二のポリペプチド鎖成分の各々が、前記第二のポリペプチド鎖成分をrdgpの表面に表示するrgdpの成分との融合体として発現され；
   ｄ）前記発現された第二ライブラリーから、前記着目の抗原に対する結合特異性を有する前記抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片のユニーク集団または限定集団を抗原との結合により選択し、各選択された抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片が各々のrgdp中でその前記第二の抗原結合部位構成部分をコードする核酸と連関しているものであり；
   ｅ）段階（iv）において選択された前記第一の抗原結合部位構成部分をコードする核酸のユニーク集団または限定集団を、段階（ｄ）において選択された前記第二の抗原結合部位構成部分をコードする核酸のユニーク集団または限定集団と組合せ、抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片をコードする核酸配列の第三のライブラリーを形成せしめ、そのライブラリーから前記抗原に対して特異的なヒトポリペプチド二量体またはscFv断片のユニーク集団または限定集団を選択することが可能である；
   ことを含んで成る、方法。
5. 着目の抗原に特異的なヒト抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片の製造方法であって、
   （ｉ）各々ヒト抗体の第一のポリペプチド鎖の可変ドメインを含んで成るポリペプチドの多様性集団（集団Ａ）を、各々前記抗原に特異的な非ヒト抗体の第二のポリペプチド鎖の可変ドメインを含んで成るポリペプチドのユニーク集団または限定集団（集団Ｂ）と組合せ、それによって各々ヒト抗体の第一のポリペプチド鎖の可変ドメインを含んで成るポリペプチドと非ヒト抗体の第二のポリペプチド鎖の可変ドメインを含んで成るポリペプチドとから成る抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片のライブラリーを形成せしめ；
   （ii） 前記ライブラリーから、前記抗原に対する結合特異性を有する前記抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片のユニーク集団または限定集団（集団Ｃ）を選択し；
   （iii）各々ヒトの第一のポリペプチド鎖を含んで成る段階（ii）において選択されたポリペプチド二量体またはscFv断片から誘導したポリペプチドのユニーク集団または限定集団（集団Ｄ）を、各々ヒト抗体の第二のポリペプチド鎖の可変ドメインを含んで成るポリペプチドの多様性集団（集団Ｅ）と組合せ、それによってヒト抗体ポリペプチド鎖二量体またはscFv断片のライブラリーを形成せしめ、そのライブラリーから、前記抗原に特異的なヒト抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片のユニーク集団または限定集団（集団Ｆ）を選択することが可能であることを含んで成る方法。
6. （ａ） 前記集団Ａのポリペプチドが、組換え宿主生物細胞において、それによってrgdpの第一集団においてrgdpの表面上に前記ポリペプチドを表示する複製可能な遺伝表示パッケージ（rgdp）の成分との融合体としてベクター（Ｘ）から発現され、；
   （ｂ） 前記rgdp成分を使って前記ベクター（Ｘ）の核酸をパッケージングすることができ、それによって前記rgdpの遺伝物質が前記集団Ａのポリペプチドをコードし、その結果、集団Ｃの抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片がそれら各々のrgdp中でヒト抗体の第一のポリペプチド鎖の可変領域を含んで成るポリペプチドをコードする核酸と連関しており；
   （ｃ） 前記集団Ｅのポリペプチドの各々が、組換え宿主生物細胞において、rgdpの第二集団においてrgdpの表面上に前記ポリペプチドを表示するrgdpの成分との融合体としてベクター（Ｙ）から発現され；そして
   （ｄ） 前記rgdp成分を使って前記ベクター（Ｙ）の核酸をパッケージングすることができ、それによって、rgdpの第二集団の中の前記rgdpの遺伝物質が前記集団Ｅのポリペプチドをコードする、
   請求項５に記載の方法。
7. 着目の抗原に特異的な抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片の製造方法であって、次の段階；
   （ｉ）各々ヒト抗体の第一のポリペプチド鎖の可変ドメインを含んで成るポリペプチドの多様性集団（集団Ａ）を、各々前記抗原に対して特異的な非ヒト抗体の第二のポリペプチド鎖の可変ドメインを含んで成るユニーク集団または制限集団（集団Ｂ）と組み合わせ、これにより各々ヒト抗体の第一のポリペプチド鎖の可変ドメインを含んで成るポリペプチドと非ヒト抗体の第二のポリペプチド鎖の可変ドメインを含んで成るポリペプチドとから成る抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片のライブラリーを形成し；
   （ii） 前記ライブラリーから前記抗原に対して結合特異性である前記抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片のユニーク集団または制限集団（集団Ｃ）を選択し；
   （iii）各々前記抗原に対して特異的な非ヒト抗体の第一のポリペプチド鎖の可変ドメインを含んで成るポリペプチドのユニーク集団または制限集団（集団Ｈ）を、各々ヒト抗体の第二のポリペプチド鎖の可変ドメインを含んで成るポリペプチドの多様性集団（集団Ｉ）と組合せ、それによって各々非ヒト抗体の第一のポリペプチド鎖の可変ドメインを含んで成るポリペプチドとヒト抗体の第二のポリペプチド鎖の可変ドメインを含んで成るポリペプチドとから成る抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片の第二ライブラリーを形成せしめ；
   （iv） 前記第二ライブラリーから、前記抗原に対する結合特異性を有する前記抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片のユニーク集団または限定集団（集団Ｊ）を選択し；
   （ｖ）各々ヒトの第一のポリペプチド鎖を含んで成る段階（ii）において選択されたポリペプチド二量体またはscFv断片から誘導したポリペプチドのユニーク集団または限定集団（集団Ｋ）を、各々ヒトの第二のポリペプチド鎖を含んで成る段階（iv）において選択されたポリペプチド二量体またはscFv断片から誘導したポリペプチドのユニーク集団または制限集団（集団Ｌ）と組合せ、それによってヒト抗体ポリペプチド鎖二量体またはscFv断片のライブラリーを形成せしめ、そのライブラリーから、前記抗原に特異的なヒトポリペプチド二量体またはscFv断片のユニーク集団または限定集団（集団Ｆ）を選択することが可能である；
   を含んで成る方法。
8. 前記集団Ｉが前記抗原との結合により選択される、請求項７に記載の方法。
9. （ａ） 前記集団Ａのポリペプチドが、組換え宿主生物細胞において、それによってrgdpの第一集団においてrgdpの表面上に前記ポリペプチドを表示する複製可能な遺伝表示パッケージ（rgdp）の成分との融合体としてベクター（Ｘ）から発現され；
   （ｂ） 前記rgdp成分を使って前記ベクター（Ｘ）の核酸をパッケージングすることができ、それによって前記rgdpの遺伝物質が前記集団Ａのポリペプチドをコードし、その結果、集団Ｃの抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片がそれら各々のrgdp中でヒト抗体の第一のポリペプチド鎖の可変領域を含んで成るポリペプチドをコードする核酸と連関しており；
   （ｃ） 前記集団Ｉのポリペプチドの各々が、組換え宿主生物細胞において、rgdpの第二集団においてrgdpの表面上に前記ポリペプチドを表示するrgdpの成分との融合体としてベクター（Ｚ）から発現され；そして
   （ｄ） 前記rgdp成分を使って前記ベクター（Ｚ）の核酸をパッケージングすることができ、それによって、rgdpの第二集団の中の前記rgdpの遺伝物質が前記集団Ｉのポリペプチドをコードする、
   請求項７または８に記載の方法。
10. 前記集団Ｂのポリペプチドがキメラであり、ここで各々のキメラポリペプチドがヒト抗体定常ドメインを含んで成る、請求項５もしくは６に記載の方法。
11. 前記集団Ｂ及びＨのいずれかのポリペプチドがキメラであり、ここで各々のキメラポリペプチドがヒト抗体定常ドメインを含んで成る、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記非ヒト抗体の抗原部位の前記第二の構成部分が抗体領域であり、ここで当該領域が前記抗原と接触する部分である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記集団Ｅの各々のポリペプチドが前記抗原に特異的な非ヒト抗体に由来する領域を含んで成り、ここで当該領域が前記抗原と接触する部分である、請求項５もしくは６に記載の方法。
14. 前記集団Ｉの各々のポリペプチドが前記抗原に特異的な非ヒト抗体に由来する領域を含んで成り、ここで当該領域が前記抗原と接触する部分である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記領域が相補性決定領域（CDR）である、請求項12〜14のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記CDRがCDR3である、請求項15に記載の方法。
17. 前記第一のポリペプチド鎖が抗体軽鎖であり、前記第二のポリペプチド鎖が抗体重鎖である、請求項５〜16のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記抗原に特異的なヒト抗体ポリペプチド二量体またはscFv断片の前記集団Ｆを選択する追加の段階を含んで成る、請求項５〜17のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記集団ＣとＦのいずれか一方が前記抗原との結合により選択される、請求項５〜18のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記抗体ポリペプチド二量体のライブラリーのいずれかの各抗体ポリペプチド二量体がFvまたはFab断片として発現される、請求項１〜19のいずれか一項に記載の方法。
21. 連関したrgdpに由来する選択された抗体ポリペプチド二量体もしくはscFv断片又は前記構成部分をコードする核酸を、当該抗体ポリペプチド二量体もしくはscFv断片又は当該構成部分を発現するために用いるか、又はアミノ酸の付加、欠失もしくは置換もしくは挿入又は別の分子の連結を介するコードされた当該抗体ポリペプチド二量体もしくはscFv断片又は当該構成部分の誘導体を発現するように改質せしめてから使用する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記発現された抗体ポリペプチド二量体もしくはscFv断片又はその誘導体を医薬を調製するために利用するものとする、請求項21に記載の方法。
23. 前記集団Ｆから選択された抗原と特異的なヒト抗体ポリペプチド二量体またscFv断片を医薬の調製のために利用するものとする、請求項18に記載の方法。

Images