WO2021206078A1 - 腫瘍細胞を死滅させるための医薬 - Google Patents

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tumor cells
cell
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奈緒子 戸田
須藤　幸夫
浜窪　隆雄
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株式会社ＰｈｏｔｏＱ３
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Definitions

  • the present invention is a medicament for killing tumor cells in which the expression level of the target substance on the cell surface is low, including a conjugate of a substance that binds to the target substance on the surface of the tumor cell and a cytotoxic substance, and a photosensitizing dye. Regarding.
  • low-molecular-weight anticancer drugs cancer chemotherapy
  • cancer chemotherapy low-molecular-weight anticancer drugs
  • antibody drugs can reduce the strong side effects of small molecule anticancer drugs and are becoming widely used, but they are still effective for solid tumors.
  • ADCs antibody drug conjugates
  • ADCs antibody drug conjugates
  • immunotherapeutic antibodies which are new antibody drugs, have strong efficacy against a wide range of cancer types by a new mechanism, but there are not always many patients who are effective, and in some cases death may occur. It has been found to show severe side effects.
  • antibody drugs containing ADC have another essential drawback that they are ineffective unless the number of expression of the tumor cell surface antigen to which the antibody binds is high, and usually the target substance to which the antibody binds is 1. It is thought that the expected medicinal effect cannot be exhibited unless there are about 100,000 molecules per cell.
  • the expression level of the target antigen in the tumor tissue is not always uniform among the tumor cells, and the effect cannot be exerted on the tumor cells having a low expression level.
  • the expression number of the target differs depending on the patient, and only some patients with a high expression level can exert the effect.
  • the photosensitizer is incorporated into endosomes by irradiating the photosensitizer with light by combining a photosensitizer and immunotoxin that easily localize to the endosome membrane.
  • Methods have also been devised to destroy tumor cells by releasing the released immunotoxin (or fragments thereof) into the cytoplasm.
  • the target on the surface of the tumor cell to which immunotoxin binds is highly expressed.
  • the tumor cell surface target is EGFR
  • Non-Patent Document 1 only examples of drug efficacy expressed in cell lines in which the target is highly expressed have been reported (Non-Patent Document 1). It is considered to have no effect on tumor cells in which the expression level of the tumor cell surface target is low as in the case of ordinary antibody drugs.
  • the target substance when an antibody is used to kill a tumor cell, it is an essential requirement that the target substance is highly expressed on the tumor cell.
  • the expression level of the target substance on the surface of the tumor cell is often non-uniform between patients, within the patient (primary site and metastatic site), and even within the cancer tissue, and as a result, the effect of treatment is achieved. It caused a problem that the range of output was narrowed.
  • An object to be solved by the present invention is to provide a drug for killing a tumor cell having few side effects for a tumor cell having a low expression level of a target antigen.
  • the expression level of the target antigen when considering a drug for tumor cells in which the expression level of the target antigen is low, we considered a method of irradiating the tumor site with light to cause the drug effect in order to localize the range of the drug effect.
  • the low expression level of the target antigen in the present invention is assumed to indicate the expression of 20,000 or less molecules per cell, which is difficult for ordinary antibody drugs (including ADC) to exert their medicinal effects.
  • a method of destroying tumor cells which is a combination of a photosensitizer and immunotoxin that easily localizes to endosome membranes, has also been devised.
  • a photosensitizing dye is accumulated on the endosome membrane and irradiated with light to destroy the endosome membrane, thereby releasing the immunotoxin (or a fragment thereof) incorporated in the endosome membrane into the cytoplasm. It is a method believed to destroy endosome cells. Specific effects are expected due to local light irradiation and the specificity of immunotoxin that binds to tumor cells.
  • ⁇ 1> A combination of a substance that binds to a target substance on the surface of a tumor cell and a cytotoxic substance; and a photosensitizer; A drug for killing tumor cells in which the expression level of the target substance is low, including.
  • ⁇ 2> The medicament according to ⁇ 1>, wherein the expression level of the target antigen is 20,000 molecules or less per cell.
  • ⁇ 3> The drug according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, which is a drug for killing a tumor cell group containing a tumor cell having an expression level of a target substance of 20,000 molecules or less per cell.
  • ⁇ 4> The medicament according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>, wherein the substance that binds to the target substance on the surface of the tumor cell is an antibody, an antibody fragment, a ligand, or a peptide.
  • ⁇ 5> The medicament according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the cytotoxicity is saporin, gelonin, or Pseudomonas aeruginosa exotoxin.
  • ⁇ 6> The medicament according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the photosensitizer is talaporfin sodium, porphimer sodium, AlPcS2a or TPCS2a.
  • EGFR Epidermal Growth Factor Receptor
  • EphA2 Ephrin type-A receptor 2
  • Glypican3 Glypican3
  • CDH17 Cadherin17
  • Tumor cells are head and neck cancer, lung cancer, liver cancer, colon cancer, skin cancer, esophageal cancer, gastric cancer, cervical cervical cancer, endometrial cancer, mesenteric tumor, brain tumor, malignant melanoma , Breast cancer, bile duct cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, renal cancer, bladder cancer, prostate cancer or malignant lymphoma, or osteosarcoma, ⁇ 1> to ⁇ 7> The medicine described in any one.
  • ⁇ 10> (1) A step of bringing the conjugate and the photosensitizer into contact with the tumor cell, and (2) then irradiating the tumor cell with a wavelength effective for activating the photosensitizer.
  • ⁇ B> A step of bringing a substance that binds to a target substance on the surface of a tumor cell having a low expression level, a conjugate of a cytotoxic substance, and a photosensitizing dye into contact with the tumor cell. (2) After that, the tumor cells having a low expression level of the target substance are killed, including the step of killing the tumor cells by irradiating the tumor cells with a wavelength effective for activating the photosensitizing dye.
  • FIG. 1 shows the cell viability in a cytotoxicity test using aluminum phthalocyanine for MCF7 cells.
  • FIG. 2 shows the cell viability in a cytotoxicity test using talaporfin sodium for MCF7 cells.
  • photosensitizers such as sodium taraporphyrin and AlPcS2a and "combinations of substances that bind to target substances on the surface of tumor cells and cytotoxicity" such as immunotoxin have been described.
  • cytotoxicity such as immunotoxin
  • the conjugate of the substance that binds to the target substance on the surface of the tumor cell and the cytotoxic substance is encapsulated in the endosome after binding to the tumor.
  • the photosensitizer dye added separately (or at the same time) is irradiated with light to release immunotoxin (or its decomposition product) and the like in endosomes into the cytoplasm. We believe that tumor cells can be killed.
  • the low expression level of the target antigen on the tumor cells means that the expression level per cell is 20,000 molecules or less.
  • the expression level per cell can be measured by a usual method such as FACS or ELISA.
  • methods such as immunostaining and MS proteomics analysis can be considered.
  • the present invention is characterized in that it can exert an effect even on a tumor cell having a low expression level of a target antigen, but it is self-evident that it is also effective on a tumor cell having a higher expression level than this. ..
  • the effect can be expected for tumor cell groups having different expression levels.
  • the methods for killing tumor cells include (1) a combination of a substance that binds to a target substance on the surface of the tumor cell and a cytotoxic substance, (2) and (3) in the coexistence of a photosensitizer. ) There is a form of irradiating light having a wavelength that activates the photosensitizer.
  • a substance that binds to a target substance on the surface of tumor cells and a conjugate of a cytotoxic substance are administered, then (2) a photosensitizer is administered, and then (3) a photosensitizer. It can also be achieved by irradiating light with a wavelength that activates.
  • a photosensitizing dye is administered, then (2) a substance that binds to a target substance on the surface of tumor cells and a conjugate of a cytotoxic substance are administered, and then (3) photosensitization is performed. It can also be achieved by irradiating light with a wavelength that activates the dye.
  • a substance that binds to a target substance on the surface of tumor cells, a conjugate of a cytotoxic substance, and (2) a photosensitizer are simultaneously administered, and then (3) a photosensitizer. It can also be achieved by irradiating light with a wavelength that activates.
  • the photosensitizer used in the present invention is a sensitizer that induces photochemical intracellular translocation by activation by light, and preferably one that generates singlet oxygen by activation by light.
  • Examples of photosensitizers used in the present invention are proposed or used in PCI (Photochemical Internalization) and PDT (Photodynamic Therapy). It is possible to raise the photosensitizing pigment.
  • photosensitizer used in the present invention include talaporfin sodium (Rezaphyrin (registered trademark)), porphimer sodium (photophyllin (registered trademark)), and 5-aminolevulinic acid (Levulan (registered trademark)). Registered trademark)), 5-aminolevulinic methyl ester (Metvix®) can be mentioned.
  • Yet another embodiment includes tetraphenylchlorin disulphonic acid (TPCS2a) and a salt thereof, disulfonized aluminum phthalocyanine (AlPcS2, AlPcS2a) and a salt thereof.
  • sulfonized tetraphenylporphyrins eg, TPPS 2a , TPPS 4 , TPPS 1 and TPPS 2o , Nile blue, chlorin derivatives, bacteriophage chlorin, ketochlorin, natural and synthetic porphyrins.
  • protoporphyrin IX foscan, chlorin, uroporphyrin I, uroporphyrin III, heptacarboxyporphyrin I, heptacarboxyporphyrin III, hexacarboxyporphyrin I, hexacarboxyporphyrin III, pentacarboxyporphyrin I, Pentacarboxyporphyrin III, Coproporphyrin I, Coproporphyrin III, Isocoproporphyrin, Halderoporphyrin, Isohalderoporphyrin, Hematoporphyrin, Mesoporphyrin, Ethioporphyrin, Pyroporphyrin, Duteroporphyrin IX, Pentporphyrin, ATXs-10 5, Aminorepric acid derivative and the like can be mentioned.
  • the photosensitizer used in the present invention may be activated by absorbing visible light, but it is also preferable to absorb long-wavelength visible light or near-infrared light.
  • Examples of such a sensitizer include silicon phthalocyanine, zinc phthalocyanine and their derivatives. Further specific examples include IR700® and its derivatives.
  • Substances that bind to target substances on the surface of tumor cells include, but are not limited to, an antibody, a ligand, a peptide, and the like.
  • the target substance on the surface of a tumor cell for example, Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR, ERBB1, ERBB2, ERBB3, ERBB4), Mesothelin, Ephrin type
  • EGFR Epidermal Growth Factor Receptor
  • ERBB1, ERBB2, ERBB3, ERBB4 Mesothelin
  • Ephrin type Ephrin type
  • EGFR Epidermal Growth Factor Receptor
  • GPC3 Glypican3
  • Cadhelin17 CDH17
  • Cadherin3 CDH3
  • Roundabout homolog 1 Robot1
  • the type of antibody used in the present invention is not particularly limited, and is artificially used for the purpose of reducing heterologous antigenicity to humans, mouse antibody, human antibody, rat antibody, rabbit antibody, sheep antibody, camel antibody, triantibody, etc.
  • Any of the recombinantly modified antibody for example, a chimeric antibody, a humanized antibody, or the like may be used.
  • the recombinant antibody can be produced using a known method.
  • a chimeric antibody is an antibody consisting of a heavy chain of a mouse antibody, a variable region of a light chain, and a heavy chain of a human antibody, a constant region of a light chain, and a DNA encoding the variable region of a mouse antibody.
  • Humanized antibodies are obtained by transplanting the complementarity determining regions (CDRs) of non-human mammals, for example, mouse antibodies into the complementarity determining regions of human antibodies, and their general gene recombination methods are also known. .. Specifically, several oligos prepared so as to have an overlapping portion at the end of a DNA sequence designed to link the CDR of a mouse antibody and the framework region (FR) of a human antibody. It is synthesized from nucleotides by the PCR method. It is obtained by ligating the obtained DNA to the DNA encoding the human antibody constant region, then incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it (EP 239400, WO96 / 02576, etc.). ).
  • a method for obtaining human antibodies is known.
  • a human lymphocyte is sensitized in vitro with a desired antigen or a cell expressing the desired antigen, and the sensitized lymphocyte is fused with a human myeloma cell such as U266 to have a desired human antibody having an antigen-binding activity.
  • a desired human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having the entire repertoire of human antibody genes with a desired antigen (WO93 / 12227, WO92 / 03918, WO94 / 02602, WO94 / 25585, See WO96 / 34096, WO96 / 33735).
  • a technique for obtaining a human antibody by panning using a human antibody library is also known.
  • a phage that binds to an antigen can be selected by expressing the variable region of a human antibody as a single-chain antibody (scFv) on the surface of the phage by the phage display method.
  • scFv single-chain antibody
  • the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined.
  • an appropriate expression vector can be prepared for the sequence to obtain a human antibody.
  • Antibodies that bind to tumor cells are preferably humanized or human antibodies, but are not limited thereto.
  • these antibodies are low-molecular-weight antibodies such as antibody fragments or antibody modifications, as long as they do not lose the property of recognizing the entire length or part of the protein encoded by the antigen gene on the surface of the tumor cell.
  • An antibody fragment is a portion of an antibody that retains its ability to bind to ROBO1. Specific examples of the antibody fragment include Fab, Fab', F (ab') 2, Fv, Diabody, and a single chain antibody fragment (scFv).
  • a gene encoding these antibody fragments may be constructed, introduced into an expression vector, and then expressed in an appropriate host cell.
  • an antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used.
  • the DNA encoding the monoclonal antibody is easily isolated and sequenced by conventional methods (eg, using an oligonucleotide probe capable of specifically binding to the genes encoding the heavy and light chains of the monoclonal antibody). can. Hybridoma cells are a preferred starting material for such DNA. Once isolated, the DNA was inserted into the expression vector and E. coli. Monoclonal antibodies can be produced from recombinant host cells, such as colli cells, COS cells, CHO cells, or myeloma cells that do not produce immunoglobulin unless transformed.
  • Ligand can be used as a substance that binds to the target substance on the surface of the tumor cell.
  • a receptor such as Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR, ERBB1, ERBB2, ERBB3, ERBB4), Mesothelin, Ephrin type-A receptor 2 (EphA2)
  • EGFR Epidermal Growth Factor Receptor
  • EphA2 Ephrin type-A receptor 2
  • Peptides can also be used as substances that bind to target substances on the surface of tumor cells. Peptides that bind to target substances on the surface of tumor cells can be designed and manufactured by those skilled in the art.
  • the cytotoxic substance is preferably a protein having cytotoxicity, but is not limited to this, and may be a compound having a synthetic / natural anticancer activity such as bleomycin, or a compound used in ADC.
  • Preferred embodiments of cytotoxic proteins include saporins, geronins, ciguatoxins, ricin A chains, glycated chain ricin A chains, ribosome inactivating proteins, alphasalcin, aspergillin, restrictocin, ribonuclease, etc. Examples thereof include epodophilotoxin, diphtheriatoxin, ciguatoxin and its variants, and gene recombinants.
  • an anticancer drug that is difficult to transfer from the endosome into the cytoplasm can also be used.
  • a combination of a substance that binds to a target substance on the surface of a tumor cell and a cytotoxic substance The substance that binds to the target substance on the surface of the tumor cell and the cytotoxic must be directly or indirectly bound.
  • an antibody or fragment thereof is used as a substance that binds to a target substance on the surface of a tumor cell
  • the method of directly chemically binding this to a cytotoxic substance is used in a known ADC (Antibody Drug Conjugate). You can use the binding method that is used. It is also possible to use a bifunctional cross-linking agent when the cytotoxicity is a protein.
  • immunotoxin can be produced by genetically modifying a toxin and an antibody or a fragment thereof to form a protein.
  • a method of indirectly binding an antibody or a fragment thereof with a cytotoxic agent using a second binding pair.
  • avidin-biotin, antibody-hapten and the like can be used as an example of the second binding pair.
  • a peptide or ligand that binds to a target substance on the surface of a tumor cell and a conjugate of the toxin can be used.
  • the administration method when the medicament of the present invention is administered to a subject having a tumor is not particularly limited.
  • the conjugate of the substance that binds to the target substance on the surface of the tumor cell and the cytotoxic substance shall be administered, for example, by intravenous administration, arterial administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, intraperitoneal administration, or oral administration. Can be done.
  • the photosensitizer can be administered, for example, by intravenous administration, arterial administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, intraperitoneal administration, or oral administration.
  • the dose of the binding between the substance that binds to the target substance on the surface of the tumor cell and the cytotoxic substance is not particularly limited, but is, for example, 1 ⁇ g / kg body weight to 100 mg / body weight kg, preferably 10 ⁇ g / kg body weight to 10 mg / kg body weight. It can be administered.
  • the dose of talaporfin sodium or porphimer sodium is not particularly limited, but can be administered, for example, at 1 ⁇ g / kg body weight to 100 mg / kg body weight, preferably 10 ⁇ g / kg body weight to 10 mg / kg body weight.
  • the number of administrations is not particularly limited, and can be administered once or more and multiple times (1 to 20 times, preferably 1 to 10 times), for example, every 2 to 4 weeks, or every 1 to 2 months. be able to. Further, the number of times of light irradiation is not particularly limited, and the light irradiation can be performed once or more times.
  • the tumors to which the medicament of the present invention is administered are Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR, ERBB1, ERBB2, ERBB3, ERBB4), Mesothelin, Ephrin type-A receptor 2 (EphA2), Glypican3 (GPC3), Cadhelin17 (CDH17). , Cadhelin3 (CDH3), or Roundabout homolog 1 (Robo1), CD20, etc. are expressed on the surface of the tumor.
  • EGFR Epidermal Growth Factor Receptor
  • EphA2 Ephrin type-A receptor 2
  • Glypican3 Glypican3
  • Cadhelin17 CDH17
  • Cadhelin3 (CDH3) Cadhelin3
  • Roundabout homolog 1 (Robo1), CD20, etc. are expressed on the surface of the tumor.
  • head and neck cancer lung cancer, liver cancer, colon cancer, skin cancer, esophageal cancer, gastric cancer, cervical cancer, endometrial cancer, mesenteric tumor, brain tumor, malignant melanoma, breast cancer, Cancers such as bile duct cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, renal cancer, bladder cancer, prostate cancer or malignant lymphoma, and osteosarcoma can be mentioned.
  • the tumor cell line MCF7 which has an EGFR expression level of about 15,000 molecules per cell, has the same effect as the tumor cell line A431, which has an EGFR expression of about 300,000 molecules per cell. This is demonstrating the present invention.
  • Example 1 Cytotoxicity test using aluminum phthalocyanine for MCF7 cells ⁇ Obtaining materials> MCF7 (human breast cancer cells) was obtained from KAC Co., Ltd. (Kyoto, Japan) as a strain expressing low EGFR.
  • AlPcS2a aluminum phthalocyanine purchased from Frontier Scientific (Utah) was used. I purchased an anti-EGFR antibody Cetuximab, an LED lamp (54 W) with a peak wavelength at 650 nm from King Do Way (18PCS E27, Amazon.co.jp).
  • MCF7 was cultured in Eagle's Medium Minimal Essential Medium (EMEM) with 10% fetal bovine serum and non-essential amino acids added under the conditions of 37 ° C and 5% CO2 concentration.
  • EMEM Eagle's Medium Minimal Essential Medium
  • Cetuximab dissolved in PBS (-) and EZ-LINK sulfo-NHS-LC-biotinylated reagent (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts) dissolved in ultrapure water are mixed so as to have a molar ratio of 1:40. After reaction, it was purified using PD SpinTrap G-25 (GE Healthcare Life Sciences, England). The obtained biotinylated Cetuximab and streptavidin-saporin (Biotin-Z Internalization Kit [KIT-27-Z], Advanced Targeting Systems, California) were mixed in equal amounts and reacted at room temperature for 30 minutes to bind the saporin-bound Cetuximab (Cetuximab). IT-Cetuximab) was obtained.
  • IT-Cetuximab and AlPcS2a were added according to each condition, and after 16 hours, the cells were washed once with PBS (-), and a new drug-free medium was added. After another 4 hours, the cell group under condition 2 was irradiated with light at 650 nm so as to be 18.8 m J / cm 2.
  • Example 2 Cytotoxicity test using talaporfin sodium in MCF7 cells ⁇ Obtaining materials> MCF7 (human breast cancer cells) was obtained from KAC Co., Ltd. (Kyoto, Japan) as a strain expressing low EGFR.
  • the anti-EGFR antibody Cetuximab, the photosensitizer talaporfin sodium, and the LED lamp having a peak wavelength at 650 nm were the same as those used in Comparative Example 1.
  • Condition 1 Add only IT-Cetuximab at a concentration of 0.032-20 nM
  • Condition 2 Add IT-Cetuximab at a concentration of 0.032-20 nM and Talaporfin sodium at a concentration of 20 ⁇ M
  • Condition 3 IT-Cetuximab at a concentration of 0.032-20 nM And after adding 20 ⁇ M Talaporfin sodium, light irradiation (650 nm, 37.6 m J / cm 2 )
  • IT-Cetuximab and Talaporfin sodium were added according to each condition, and after 16 hours, the cells were washed once with PBS (-), and a new drug-free medium was added. After another 4 hours, the cell group under condition 3 was irradiated with light at 650 nm so as to be 37.6 mJ / cm 2.
  • Non-Patent Document 2 Antibody-dependent cellular cytotoxicity mediated by cetuximab against lung cancer cell lines., Kurai J, Chikumi H, Hashimoto K, Yamaguchi K, Yamasaki A, Sako T, Touge H, Makino H, Takata M, Miyata M, Nakamoto M, Burioka N, Shimizu E. Clin Cancer Res 2007, 13 (5), 1552-61.
  • Non-Patent Document 3 ear infrared fluorescence imaging of EGFR expression in vivo using IRDye800CW-nimotuzumab., Bernhard W1, El-Sayed A1, Barreto K1, Gonzalez C1, Hill W1, Parada AC2, Fonge H3,4,5, Geyer CR1. , Oncotarget, 2018, 9 (5), 6213-6227
  • MCF7 had low EGFR expression, and no cytotoxic effect was obtained even when Cetuximab bound with immunotoxin was added at a concentration of 20 nM.

Abstract

本発明の課題は、副作用の少ない、腫瘍細胞を死滅するための医薬を提供することである。本発明によれば、腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合物；及び　光増感色素；を含む、該標的物質の発現量が少ない腫瘍細胞を死滅させるための医薬が提供される。

Description

腫瘍細胞を死滅させるための医薬
　本発明は、腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合物と、光増感色素とを含む、細胞表面上の標的物質の発現量の少ない腫瘍細胞を死滅させるための医薬に関する。
　日本国内でがんで死亡する人は、年間37万人に上り、昭和56年より継続して死因の第一位である。これまでに、国内外で数多のがんに対する治療方法が開発されてきているが、特効薬は未だ生まれていない。
　いわゆる低分子の抗癌剤（がん化学療法）が開発されてきているが、必ずしも薬効が強くないばかりか、強い副作用による患者への苦痛が大きく望ましい医薬とはいえない。抗体医薬は、がんへの特異性が強い特徴から、低分子抗癌剤にみられる強い副作用は軽減されることができ、広く使用されるようになってきているが、未だ固形がんに有効な、抗体医薬は数すくない。薬効を強化するために、ADC（抗体薬物複合体）が開発されてきているが、毒性面も含めて満足にいたってはいない。
　また、新規の抗体医薬である免疫治療抗体（チェックポイント阻害剤）は、新規メカニズムで広いガン種に強い薬効をしめしているが、効果のある患者がかならずしも多くなく、かつ場合によっては死に至るような激烈な副作用を示すことがわかってきている。
　しかし、ADCを含む抗体医薬には、抗体の結合する腫瘍細胞表面抗原の発現数が多くないと効果がでないというもう一つの本質的な欠点が存在し、通常は抗体の結合する標的物質は１細胞当たり約10万分子くらいはないと期待できる薬効が発揮できないと考えられている。
　腫瘍組織中での標的抗原の発現量は腫瘍細胞間で必ずしも均一ではなく、発現量の少ない腫瘍細胞には効果が発揮できなくなる。また、患者により標的の発現数が異なり、発現量の多い一部の患者しか効果が発揮できなくなる。これらの本質的な欠点は、奏効率が想定より低いという結果となる。
　別のアプローチとして、治療部位を限局化し副作用を軽減するという考えから、エンドゾーム膜に局在化しやすい光増感色素とイムノトキシンの組み合わせにより、光増感色素に光を照射することによりエンドゾームに取り込まれたイムノトキシン（またはその断片を）を細胞質内に放出することにより、腫瘍細胞を破壊する方法も考案されている。しかし、これまでにはイムノトキシンの結合する腫瘍細胞表面上の標的が高発現していなければ効果が認められていなかった。例えば、腫瘍細胞表面標的がEGFRの場合でも、標的が高発現している細胞株での薬効の発現例しか報告されていない（非特許文献１）。通常の抗体医薬同様に腫瘍細胞表面標的の発現量が少ない腫瘍細胞には効果がないと考えられている。
　このように、腫瘍細胞を死滅させるために抗体を使用する場合は、該腫瘍細胞上に該標的物質が高発現していることが必須要件であった。一方、臨床的には、腫瘍細胞表面上の標的物質の発現量は、患者間、患者内（原発部位と転移部位）、癌組織内でも不均一なことが多く、この結果として、治療の効果の出る範囲が狭まってくるという問題を生じさせていた。
Targeted Delivery and Enhanced Cytotoxicity of Cetuximab-Saporin by Photochemical Internalization in EGFR-Positive Cancer Cells： Wai Lam Yip,† Anette Weyergang,† Kristian Berg,† Hanne H. Tonnesen,‡ and Pal K. Selbo*,†　MOLECULAR PHARMACEUTICS　2007 （VOL. 4）, NO. 2, 241-251
　本発明者らは、そのような状況下で、標的抗原の発現量が少ない腫瘍細胞に対する、副作用の少なく、薬効の強い医薬品の開発の必要性を感じ、本開発に至った。本発明は、標的抗原の発現量が少ない腫瘍細胞に対する、副作用の少ない、腫瘍細胞を死滅するための医薬を提供することを解決すべき課題とする。
　我々は、標的抗原の発現量が少ない腫瘍細胞に対する医薬品を考えた場合、薬効の生じる範囲を限局化するため腫瘍部位に光を照射して薬効を生じさせる方法を考えた。
　この発明における標的抗原の発現量が少ないとは、通常の抗体医薬（ADCを含む）では、薬効の発揮しづらい１細胞あたり20,000分子以下の発現を想定している。
　エンドゾーム膜に局在化しやすい光増感色素とイムノトキシンを組合わせた腫瘍細胞を破壊する方法も考案されてきている。この方法では、エンドゾーム膜に光増感色素を集積させこれに光を照射することによりエンドゾーム膜を破壊することにより、エンドゾーム膜内に取り込まれているイムノトキシン（またはその断片）を細胞質内に放出し腫瘍細胞を破壊すると考えられている方法である。局所的な光照射と、腫瘍細胞に結合するイムノトキシンの特異性により特異的な効果が期待されている。
　しかしながら、この手法においても、前述したようにイムノトキシンの結合する細胞表面上の標的物質の発現量が多くなければ、効果がないと考えられていた。
　我々は、これまでの問題を解決するために、鋭意努力した結果、光増感色素と、腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合物を、腫瘍細胞に接触させ、光照射量・時間等を調節することにより、該腫瘍細胞表面の標的物質の発現量が従来認められていたよりも著しく低い場合でも概腫瘍細胞に対する細胞障害性が発生することを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞　腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合物；及び
　光増感色素；
を含む、該標的物質の発現量が少ない腫瘍細胞を死滅させるための医薬。
＜２＞　該標的抗原の発現量が１細胞当たり２万分子以下である、＜１＞に記載の医薬。
＜３＞　標的物質の発現量が細胞当たり２万分子以下である腫瘍細胞を含む腫瘍細胞群を死滅させるための医薬である、＜１＞又は＜２＞に記載の医薬。
＜４＞　腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質が、抗体、抗体断片、 リガ ンド、又はペプチドである、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の医薬。
＜５＞　細胞毒が　サポリン、ゲロニン、または緑膿菌外毒素である、＜１＞から＜４＞の何れか一に記載の医薬。
＜６＞　光増感色素が　タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウム、AlPcS2a 　またはTPCS2a である、＜１＞から＜５＞の何れか一に記載の医薬。
＜７＞　腫瘍細胞が、細胞表面にEpidermal Growth Factor Receptor (EGFR、ERBB1,ERBB2,ERBB3,ERBB4),　Mesothelin,Ephrin type-A receptor 2（EphA2）,Glypican3(GPC3),Cadherin17(CDH17)、又はRoundabout homolog 1 （Robo1）を発現している細胞である、＜１＞から＜６＞の何れか一に記載の医薬。
＜８＞　腫瘍細胞が、頭頚部がん、肺がん，肝がん、大腸がん、皮膚がん、食道がん、胃がん、子宮けいがん、子宮内膜がん、中皮腫、脳腫瘍、悪性黒色腫、乳がん、胆管がん、膵がん、卵巣がん、腎がん、膀胱がん、前立腺がん又は悪性リンパ腫、骨肉腫の何れかのがん細胞である、＜１＞から＜７＞の何れか一に記載の医薬。
＜９＞　（１）前記結合物を腫瘍細胞と接触させる工程；
（２）光増感色素を前記腫瘍細胞と接触させる工程；及び
（３）光増感色素を活性化させるのに有効な波長で前記腫瘍細胞を照射することにより前記細胞を死滅させる工程：
により腫瘍細胞を死滅させる、＜１＞から＜８＞の何れか一に記載の医薬。
＜１０＞　（１）前記結合物と、光増感色素とを腫瘍細胞と接触させる工程、及び
（２）その後、光増感色素を活性化させるのに有効な波長で前記腫瘍細胞を照射することにより前記細胞を死滅させる工程：
により腫瘍細胞を死滅させる、＜１＞から＜９＞の何れか一に記載の医薬。
＜Ａ＞（１）発現量の少ない腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合物を腫瘍細胞に接触させる工程；
（２）光増感色素を前記腫瘍細胞と接触させる工程；及び
（３）光増感色素を活性化させるのに有効な波長で前記腫瘍細胞を照射することにより前記細胞を死滅させること工程：
を含む、標的物質の発現量が少ない腫瘍細胞を死滅させる方法。
＜Ｂ＞（１）発現量の少ない腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合物と、光増感色素とを前記腫瘍細胞と接触させる工程、
（２）その後、該光増感色素を活性化させるのに有効な波長で前記腫瘍細胞を照射することにより前記細胞を死滅させる工程：を含む、標的物質の発現量が少ない腫瘍細胞を死滅させる方法。
　本発明によれば、副作用の少ない、腫瘍細胞を死滅させるための医薬を提供することができる。
図１は、MCF7細胞にアルミニウムフタロシアニンを使用した細胞傷害性試験における細胞生存率を示す。 図２は、MCF7細胞にタラポルフィンナトリウムを使用した細胞傷害性試験における細胞生存率を示す。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
＜本発明の概要＞
　本発明者等は、薬効が強く副作用の少ない標的抗原の発現量の少ない腫瘍の治療方法を検討した結果、光による局所的に薬効を強くする、光増感色素とイムノトキシンを組合わせるの手法に可能性があるのではと考えた。しかしながら、これまでこの手法では標的細胞の発現量の少ない細胞に効果を示すとは考えられていなかった。
　そこで、本発明者等は鋭意努力した結果、タラポルフィリンナトリウムやAlPcS2a 等の光増感色素と、イムノトキシンのような「腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合物」と、「腫瘍への光照射」とを組み合わせることにより、該標的物質の発現量が少ない腫瘍細胞にも薬効が強くかつ副作用の懸念が少ない治療方法を見出し、本発明を完成するに至った。
　つまり、本発明においては、腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合物が、腫瘍に結合したのちエンドソームに内包される。別途（または同時に）加えた光増感色素に光を照射して、エンドソーム内のイムノトキシン（またはその分解物）等を細胞質内に放出させ。腫瘍細胞を死滅させることができると考えている。
＜腫瘍細胞上の標的抗原の発現量＞
　当発明において、腫瘍細胞上の標的抗原の発現量が少ないということは、細胞当たりの発現量が　20,000分子　以下のことを意味している。細胞当たりの発現量は、FACS、ELISA等の通常の方法で測定することが可能である。また、免疫染色、MSプロテオミクス解析などの手法も考えられる。
　また、当発明において腫瘍細胞上の標的抗原の発現量が少ないものにも効果を発揮できることが特徴であるが、これよりも発現量の多い腫瘍細胞にも効果があることは自明のことである。また、発現量の異なる腫瘍細胞群にも効果が期待できる。
＜細胞を死滅させる方法に関する形態＞
　本発明における、腫瘍細胞を死滅させる方法としては、（１）腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合物、（２）および光増感色素の共存在下で、（３）光増感色素を活性化させる波長の光を照射する形態があげられる。
　さらに具体的形態として、（１）腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合物を投与後、（２）光増感色素を投与し、その後　、（３）光増感色素を活性化させる波長の光を照射する　ことによっても達成できる。
　また別の形態としては、（１）光増感色素を投与後、（２）腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合物を投与し、その後、（３）光増感色素を活性化させる波長の光を照射する　ことによっても達成できる。
　また、別の形態として、（１）腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合物と（２）光増感色素とを同時に投与し、その後、（３）光増感色素を活性化させる波長の光を照射する　ことによっても達成できる。
＜光増感色素＞
　本発明に用いられる光増感色素は、光による活性化により、光化学的細胞内移行を誘起する増感剤であり、好ましくは光による活性化により一重項酸素を発生させるものが好ましい。本発明に使用される、光増感色素の例としては、PCI（Photochemical Internalization：光化学的内部移行または光化学的細胞内移行)や、PDT（PhotodynamicTherapy、光線力学的療法)に提案され、または使用されている光増感色素をあげることができる。
　本発明で使用される、光増感剤の具体的な態様としては、タラポルフィンナトリウム (レザフィリン（登録商標））、ポルフィマーナトリウム（フォトフィリン（登録商標））、5アミノレプリン酸（Levulan（登録商標））、5アミノレピリンメチルエステル（Metvix（登録商標））を挙げることができる。
　さらに別の態様としては、テトラフェニルクロリン2スルフォン酸（TPCS2a)及びその塩、ジスルフォン化されたアルミニウムフタロシアニン（AlPcS2、AlPcS2a)及びその塩を挙げることができる。
　また、スルフォン化されたテトラフェニルポルフィリン（例えば TPPS2a, TPPS4, TPPS1 and TPPS2o、）ナイルブルー、クロリン誘導体、バクテリオクロリン、ケトクロリン、天然及び合成のポルフィリンを挙げることができる。　
　さらに別の具体的な例としてプロトポルフィリンIX、フォスキャン、クロリン、ウロポルフィリンI、ウロポルフィリンIII、ヘプタカルボキシルポルフィリンI、ヘプタカルボキシルポルフィリンIII、ヘキサカルボキシルポルフィリンI、ヘキサカルボキシルポルフィリンIII、ペンタカルボキシルポルフィリンI、ペンタカルボキシルポルフィリンIII、コプロポルフィリンI、コプロポルフィリンIII、イソコプロポルフィリン、ハルデロポルフィリン、イソハルデロポルフィリン、ヘマトポルフィリン、メソポルフィリン、エチオポルフィリン、ピロポルフィリン、デューテロポルフィリンIX、ペンプトポルフィリン、ＡＴＸｓ－１０、５アミノレプリン酸誘導体等を挙げることができる。
　本発明で、使用される光増感剤は、可視光を吸収して活性化されてもいいが、長波長の可視光や、近赤外光を吸収することも好ましい。
　このような増感剤としては　シリコンフタロシアニンや亜鉛フタロシアニンとその誘導体をあげることができる。さらなる具体的な例としては、IR700（登録商標）とその誘導体を挙げることができる。
＜腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質＞
　腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質としては、抗体、リガント、またはペプチドなどを挙げることができるが、特に限定されない。
　腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質としては抗体を使用する場合には、腫瘍細胞表面上の標的物質（例えば、Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR、ERBB1,ERBB2,ERBB3,ERBB4),Mesothelin,Ephrin type-A receptor 2（EphA2）,Glypican3(GPC3),Cadhelin17(CDH17)、Cadherin3（CDH3）,Roundabout homolog 1 （Robo1）、CD20 等のタンパク質）に特異的に結合する抗体を使用することができる。
　本発明で用いる抗体の種類は特に制限されず、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体、トリ抗体等や、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体 、例えば、キメラ抗体 、ヒト化抗体等の何れでもよい。遺伝子組換え型抗体 は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体 の定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（CDR）をヒト抗体 の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体 のCDRとヒト抗体 のフレームワーク領域（framework region；FR）を連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAをヒト抗体 定常領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（EP 239400号公報 、国際公開WO96/02576号公報など）。
　また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ　ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体　を得ることもできる（特公平１－５９８７８参照）。また、ヒト抗体　遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体　を取得することができる（ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体 ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体 を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体 の可変領域を一本鎖抗体 （scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体 の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９３／０６２１３、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９３／１９１７２、ＷＯ９５／０１４３８、ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。
　腫瘍細胞に結合する抗体とは、好ましくはヒト化またはヒト抗体であるがそれに限定されるものではない。
　また、これらの抗体は　腫瘍細胞表面上の抗原遺伝子によってコードされる蛋白質の全長または一部を認識する特性を失わない限り、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体や抗体の修飾物などであってもよい。抗体の断片とは、ROBO1への結合能力を保持している抗体の部分である。抗体断片の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）などを挙げることができる。このような抗体断片を得るには、これら抗体　断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい。抗体　の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体　を使用することもできる。
　モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用な方法（例えば、モノクローナル抗体　の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）により容易に単離、配列決定できる。ハイブリドーマ細胞はこのようなＤＮＡの好ましい出発材料である。一度単離したならば、ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞または形質転換されなければ免疫グロブリンを産生しないミエローマ細胞等の宿主細胞へ組換え、組換え宿主細胞からモノクローナル抗体を産生させることができる。
　腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質として、リガントを使用することができる。腫瘍細胞表面上の標的物質が、例えば、Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR、ERBB1,ERBB2,ERBB3,ERBB4),Mesothelin,Ephrin type-A receptor 2（EphA2）などレセプターの場合には、上記レセプターに対するリガンドを使用することができる。
　腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質として、ペプチドを使用することもできる。腫瘍細胞表面の標的物質に結合するペプチドは、当業者であれば、設計及び製造することが可能である。
＜細胞毒＞
　細胞毒は、細胞毒性をもつ蛋白質が好ましいが、これに限定されるものではなく、ブレオマイシンのような合成・天然の抗癌作用を有する化合物や、ADCで使用される化合物であってもいい。
　細胞毒性をもつ蛋白質の好ましい態様としては、サポリン、ゲロニン、緑膿菌外毒素、リシンＡ鎖、脱糖鎖リシンＡ鎖、リボゾーム不活性化タンパク質、アルファサルシン、アスペルギリン、リストリクトシン、リボヌクレアーゼ、エポドフィロトキシン、ジフテリアトキシン、シガトキシン及びその変異体、遺伝子組換体を挙げることができる。
　また、エンドゾーム内から細胞質内に移行しづらい抗がん剤も使用することができる。
＜腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合物＞
　腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒とは、直接または間接的に結合していなければならない。
　腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質として抗体またはその断片を使用する場合、これと細胞毒とを直接化学的に結合させる方法は、既知のADC（Antibody Drug Conjugate；抗体薬物複合体）で用いられる結合方法を使用できる。また、細胞毒が蛋白質である場合には、2官能性の架橋剤を用いることも可能である。
　また、細胞毒が蛋白質である場合は、トキシンと抗体またはその断片を遺伝子組換え的に融合した蛋白質とすることによりイムノトキシンを作成することも可能である。
　また別の方法として、抗体またはその断片と細胞毒とを、第二の結合対を用いて間接的に結合する手法を使用することも可能である。第２の結合対の例としては、アビジン-ビオチン、抗体-ハプテン等の利用が可能である。
　また、本発明では抗体と毒素の結合したイムノトキシンの代わりに、腫瘍細胞表面の標的物質に結合するペプチド又はリガンドと、毒素との結合物を使用することも可能である。
＜投与方法及び投与量＞
　本発明の医薬を、腫瘍（例えば、がんなど）を有する被験体に投与する際の投与方法は特に限定されない。
　腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合物は、例えば、静脈投与、動脈投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、または経口投与により、投与することができる。
　また、腫瘍組織及びその周辺に局所注射、塗布、噴霧などの方式で投与する方法もある。
　光増感色素は、例えば、静脈投与、動脈投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、または経口投与により、投与することができる。また、腫瘍組織及びその周辺に局所注射、塗布、噴霧などの方式で投与するなどの方法もある。
　腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合の投与量は、特に限定されないが、例えば、１μｇ／体重ｋｇ～１００ｍｇ／体重ｋｇ、好ましくは１０μｇ／体重ｋｇ～１０ｍｇ／体重ｋｇで投与することはできる。
　タラポルフィンナトリウムまたはポルフィマーナトリウムの投与量は、特に限定されないが、例えば、１μｇ／体重ｋｇ～１００ｍｇ／体重ｋｇ、好ましくは１０μｇ／体重ｋｇ～１０ｍｇ／体重ｋｇで投与することはできる。
　投与回数は特に限定されず、１回以上複数回（１回から２０回、好ましくは１回から１０回）行うことができ、例えば、２～４週間毎に、又は１～２カ月毎に行うことができる。また、光照射回数も特に限定されず、１回以上複数回行う事ができる。
＜対象となる細胞・疾患＞
　本発明の医薬の投与の対象となる腫瘍は、Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR、ERBB1,ERBB2,ERBB3,ERBB4),Mesothelin,Ephrin type-A receptor 2（EphA2）,Glypican3(GPC3),Cadhelin17(CDH17)、Cadhelin3（CDH3）,またはRoundabout homolog 1 （Robo1） 、CD20　等を表面に発現している腫瘍である。
　具体的には頭頚部がん、肺がん，肝がん、大腸がん、皮膚がん、食道がん、胃がん、子宮けいがん、子宮内膜がん、中皮腫、脳腫瘍、悪性黒色腫、乳がん、胆管がん、膵がん、卵巣がん、腎がん、膀胱がん、前立腺がん又は悪性リンパ腫、骨肉腫等のがんをあげることができる。
　以下に示す実施例は、EGFRの発現量が細胞当たり約15,000分子である腫瘍細胞株MCF7でも、EGFRが細胞当たり約30万分子である腫瘍細胞株A431と同様な効果がみられることを示しており、本発明を実証していることになる。
実施例１：MCF7細胞にアルミニウムフタロシアニンを使用した細胞傷害性試験
＜材料の入手＞
EGFRの低発現株として、MCF7（ヒト乳腺癌細胞）を株式会社ケーエーシー（京都、日本）から入手した。光増感色素としてアルミニウムフタロシアニン（AlPcS2a）はFrontier Scientific社（ユタ）より購入したものを使用した。抗EGFR抗体のCetuximab、650 nm にピーク波長を持つLEDランプ（54 W）をKing Do Way (18PCS E27, Amazon.co.jp)より購入した。
＜細胞培養＞
　MCF7はイーグル培地最小必須培地（EMEM）に１０％のウシ胎児血清と非必須アミノ酸 を添加した培地を用い、37℃、CO2濃度5%の条件下にて培養を行った。
＜イムノトキシン調整＞
　PBS(-)に溶解させたCetuximabと超純水に溶解させたEZ-LINK スルホ-NHS-LC-ビオチン化試薬（Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州）を1:40のモル比となるように混合、反応させたのち、PD SpinTrap G-25 （GE Healthcare Life Sciences、イングランド）を用いて精製した。得られたビオチン化Cetuximabとstreptavidin-saporin (Biotin-Z Internalization Kit [KIT-27-Z],  Advanced Targeting Systems, カリフォルニア）を当量ずつ混ぜ、30分間室温にて反応させることでサポリンを結合したCetuximab（IT-Cetuximab）を得た。
＜細胞障害性アッセイ＞
　96ウェルプレートにMCF7を1ウェル当たり7.5×103 個 播種し一晩培養した後以下の３つの条件の通り、イムノトキシンや光増感剤の添加及び光照射を行い、各条件の置ける細胞障害の程度を比較した。
条件１：0.032 - 20 nM の 濃度のIT-Cetuximabのみを添加
条件２：0.032 - 20 nM の 濃度のIT-Cetuximab及び1 μMのAlPcS2aを添加後、光照射（650 nm、18.8 m J/cm2）
　各条件に沿ってIT-Cetuximab 及びAlPcS2aを添加し、16時間後に細胞をPBS（-）を用いて一度洗浄し、新たに薬剤無添加の培地を加えた。条件２の細胞群には、さらに４時間後、650 nmの光を 18.8 m J/cm2となるように光照射を行った。
　72時間培養した後、CCK-8 キット溶液 を、各ウェルに10 μlずつ加え、１時間から２時間反応させた後、各々の450 nmの吸収を測定した。実施例１と同様に得られた吸光度より、細胞生存率（図２）及び、50％生存率を示すIT-Cetuximab濃度を算出した（表１）。
実施例２：MCF7細胞にタラポルフィンナトリウムを使用した細胞傷害性試験
＜材料の入手＞
　EGFRの低発現株として、MCF7（ヒト乳腺癌細胞）を株式会社ケーエーシー（京都、日本）から入手した。抗EGFR抗体のCetuximab、光増感色素のタラポルフィンナトリウム、650 nm にピーク波長を持つLEDランプは比較例１で使用したものと同じものを使用した。
＜細胞培養＞
　MCF7は実施例１と同様の方法にて培養を行った。
＜イムノトキシン調整＞
　サポリンを付加したCetuximab（IT-Cetuximab）は、比較例１で作成したものと同じものを使用した。
＜細胞障害性アッセイ＞
　96ウェルプレートにMCF7を1ウェル当たり7.5×103 個 播種し一晩培養した後以下の３つの条件の通り、イムノトキシンや光増感剤の添加及び光照射を行い、各条件の置ける細胞障害の程度を比較した。
条件１：0.032 - 20 nM の 濃度のIT-Cetuximabのみを添加
条件２：0.032 - 20 nM の 濃度のIT-Cetuximab及び20 μMのTalaporfin sodiumを添加
条件３：0.032 - 20 nM の 濃度のIT-Cetuximab及び20 μMのTalaporfin sodiumを添加後、光照射（650 nm、37.6 m J/cm2）
　各条件に沿ってIT-Cetuximab 及びTalaporfin sodiumを添加し、16時間後に細胞をPBS（-）を用いて一度洗浄し、新たに薬剤無添加の培地を加えた。条件３の細胞群には、さらに４時間後、650 nmの光を 37.6 mJ/cm2となるように光照射を行った。
　72時間培養した後、CCK-8 キット溶液 を、各ウェルに10 μlずつ加え、１時間から２時間反応させた後、各々の450 nmの吸収を測定した。実施例１と同様に得られた吸光度より、細胞生存率（図３）及び、50％生存率を示すIT-Cetuximab濃度を算出した（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　標的分子であるEGFRの細胞当たりの発現量は　A431で約300,000分子、MCF7で約15,000分子である（非特許文献２及び３）。
非特許文献２：Antibody-dependent cellular cytotoxicity mediated by cetuximab against lung cancer cell lines.,Kurai J, Chikumi H, Hashimoto K, Yamaguchi K, Yamasaki A, Sako T, Touge H, Makino H, Takata M, Miyata M, Nakamoto M, Burioka N, Shimizu E. Clin Cancer Res 2007, 13(5), 1552-61.
非特許文献３：ear infrared fluorescence imaging of EGFR expression in vivo using IRDye800CW-nimotuzumab.,Bernhard W1, El-Sayed A1, Barreto K1, Gonzalez C1, Hill W1, Parada AC2, Fonge H3,4,5, Geyer CR1., Oncotarget, 2018,  9(5), 6213-6227
　光増感色素AlPcS2aを使用し、MCF７細胞株への障害実験を行った（実施例１）。MCF７はEGFRが低発現であり、イムノトキシンを結合したCetuximabを20 nMの濃度で添加しても細胞障害効果は得られなかった。しかしながら、AlPcS2aをIT-Cetuximabと同時に添加し光照射によって細胞内在化効率を向上することによって、EC50＝0.29 nMと十分な細胞障害効果を得ることができた。
　光増感色素タラポルフィンナトリウムを使用して、MCF７に対する細胞障害実験を行った（実施例２）。この場合も、MCF7にIT-Cetuximabとタラポルフィンナトリウムを添加しさらに光照射を行うことで、十分な細胞障害活性を示すことがわかった（EC50＝0.61 nM）
　実施例１及び２よりEGFR低発現株でも腫瘍細胞障害活性が発現することがわかった。

Claims (10)

  1. 　腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質と細胞毒との結合物；及び
    　光増感色素；
    を含む、該標的物質の発現量が少ない腫瘍細胞を死滅させるための医薬。
  2. 　該標的抗原の発現量が１細胞当たり２万分子以下である、請求項１に記載の医薬。
  3. 　標的物質の発現量が細胞当たり２万分子以下である腫瘍細胞を含む腫瘍細胞群を死滅させるための医薬である、請求項１又は２に記載の医薬。
  4. 　腫瘍細胞表面の標的物質に結合する物質が、抗体、抗体断片、 リガ ンド、又はペプチドである、請求項１から３の何れか一項に記載の医薬。
  5. 　細胞毒が　サポリン、ゲロニン、または緑膿菌外毒素である、請求項１から４の何れか一項に記載の医薬。
  6. 　光増感色素が　タラポルフィンナトリウム、ポルフィマーナトリウム、AlPcS2a 　またはTPCS2a である　請求項１から５の何れか一項に記載の医薬。
  7. 　腫瘍細胞が、細胞表面にEpidermal Growth Factor Receptor (EGFR、ERBB1,ERBB2,ERBB3,ERBB4),　Mesothelin,Ephrin type-A receptor 2（EphA2）,Glypican3(GPC3),Cadherin17(CDH17)、又はRoundabout homolog 1 （Robo1）を発現している細胞である、請求項１から６の何れか一項に記載の医薬。
  8. 　腫瘍細胞が、頭頚部がん、肺がん，肝がん、大腸がん、皮膚がん、食道がん、胃がん、子宮けいがん、子宮内膜がん、中皮腫、脳腫瘍、悪性黒色腫、乳がん、胆管がん、膵がん、卵巣がん、腎がん、膀胱がん、前立腺がん又は悪性リンパ腫、骨肉腫の何れかのがん細胞である、請求項１から７の何れか一項に記載の医薬。
  9. （１）前記結合物を腫瘍細胞と接触させる工程；
    （２）光増感色素を前記腫瘍細胞と接触させる工程；及び
    （３）光増感色素を活性化させるのに有効な波長で前記腫瘍細胞を照射することにより前記細胞を死滅させる工程：
    により腫瘍細胞を死滅させる、請求項１から８の何れか一項に記載の医薬。
  10. （１）前記結合物と、光増感色素とを腫瘍細胞と接触させる工程、及び
    （２）その後、光増感色素を活性化させるのに有効な波長で前記腫瘍細胞を照射することにより前記細胞を死滅させる工程：
    により腫瘍細胞を死滅させる、請求項１から９の何れか一項に記載の医薬。
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KURAI J, CHIKUMI H, HASHIMOTO K, YAMAGUCHI K, YAMASAKI A, SAKO T, TOUGE H, MAKINO H, TAKATA M, MIYATA M, NAKAMOTO M, BURIOKA N, SH: "Antibody-dependent cellular cytotoxicity mediated by cetuximab against lung cancer cell lines", CLIN CANCER RES, vol. 13, no. 5, 2007, pages 1552 - 61, XP002770438, DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-06-1726
OLSEN CATHRINE ELISABETH, CHEUNG LAWRENCE H., WEYERGANG ANETTE, BERG KRISTIAN, VALLERA DANIEL A., ROSENBLUM MICHAEL G., SELBO PÅL : "Design, Characterization, and Evaluation of scFvCD133/rGelonin: A CD133-Targeting Recombinant Immunotoxin for Use in Combination with Photochemical Internalization", JOURNAL OF CLINICAL MEDICINE, vol. 9, no. 1, pages 68, XP055864658, DOI: 10.3390/jcm9010068 *
WAI LAM YIPANETTE WEYERGANGKRISTIAN SERGHANNE H. TONNESENPAL K. SELBO: "Targeted Delivery and Enhanced Cytotoxicity of Cetuximab-Saporin by Photochemical Internalization in EGFR-Positive Cancer Cells", MOLECULAR PHARMACEUTICS, vol. 4, no. 2, 2007, pages 241 - 251, XP055864663, DOI: 10.1021/mp060105u
YIP WAI LAM, WEYERGANG ANETTE, BERG KRISTIAN, TØNNESEN HANNE H., SELBO PÅL K.: "Targeted Delivery and Enhanced Cytotoxicity of Cetuximab−Saporin by Photochemical Internalization in EGFR-Positive Cancer Cells", MOLECULAR PHARMACEUTICS, vol. 4, no. 2, 1 April 2007 (2007-04-01), US , pages 241 - 251, XP055864663, ISSN: 1543-8384, DOI: 10.1021/mp060105u *

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