JP6371758B2 - 抗ブドウ球菌抗体、その製造方法並びにその使用 - Google Patents
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Description
ブドウ球菌に対する抗菌剤の開発は、β‐ラクタム系のペニシリンより始まった。しかし、ブドウ球菌は遺伝子的に薬剤耐性機構を獲得しやすく、発売数年後には早くも耐性菌が出現した。その後、アミノグリコシド系、マクロライド系、クロラムフェニコール系、テトラサイクリン系、キノロン系、ペネム系などの各抗菌剤が開発されたが、耐性菌を克服することはできなかった。そして、開発後長期に渡って耐性菌が発見されなかったグリコペプチド系抗菌剤バンコマイシンへの耐性菌がついに出現し(非特許文献2)、さらには近年数十年ぶりに新規抗菌剤として開発されたオキサゾリジン系抗菌剤への耐性菌も、発売同年には出現した(非特許文献3)。
こうしたことから、従来の抗菌物質による治療とは異なる新たな治療戦略が強く望まれており、ワクチンや抗体による感染制御が近年研究されている。例えば、ワクチンの例として、黄色ブドウ球菌の莢膜多糖類タイプ5,8、Iron Surface Determinant Bなどが、抗体の例としてClumping factor A、ABCトランスポーター、タイコ酸に対する抗体が挙げられる。
Rebecca A. Brady, Jeff G. Leid, Anne K. Camper, J. William Costerton, and Mark E. Shirtliff (2006) Infect. Immun. 74: 3415-3426 CDC. (2002) MMWR 51: 565-567 Sotirios Tsiodras, Howard S. Gold, George Sakoulas, George M. Eliopoulos, Christine Wennersten, Lata Venkataraman, Robert C. Moellering Jr,and Mary Jane Ferraro (2001) Lancet 358: 207-208 R. Monina Klevens, Melissa A. Morrison, Joelle Nadle, Susan Petit, Ken Gershman, Susan Ray, Lee H. Harrison, Ruth Lynfield, Ghinwa Dumyati, John M. Townes, Allen S. Craig, Elizabeth R. Zell, Gregory E. Fosheim, Linda K. McDougal, Roberta B. Carey, and Scott K. Fridkin (2007) JAMA 298: 1763-1771 CDC. (1999) MMWR 48: 707-710 Adam C. Schaffer and Jean C. Lee (2009) Infect. Dis. Clin. North. Am. 23: 153-171
本発明者らは、これらの課題を解決するために鋭意研究し、細胞表面の物質を脱アセチル化したブドウ球菌を抗原として用いることで新規な抗体を作製することに成功した。さらに、ブドウ球菌感染症モデルに有効な特定の抗体を見出すことにも成功した。
また、本発明によれば、ZBIA5H抗体またはZBIA3H抗体由来の相補性決定領域(CDR)を含む抗ブドウ球菌抗体(ZBIA5H系列抗体またはZBIA3H系列抗体)が提供される。この抗体は、好ましくはZBIA5H抗体またはZBIA3H抗体と同一のCDRを含む。
また、本発明によれば、重鎖可変領域が、配列番号:1、2および3に示されるアミノ酸配列あるいは配列番号:9、10および11に示されるアミノ酸配列をそれぞれ含むCDRH1、2および3を含み、軽鎖可変領域が、配列番号:4、5および6に示されるアミノ酸配列あるいは配列番号:12、13および14に示されるアミノ酸配列をそれぞれ含むCDRL1、2および3を含む抗ブドウ球菌抗体が提供される。
また、本発明によれば、配列番号:7に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号:8に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗ブドウ球菌抗体(ZBIA5H系列抗体)が提供される。
また、本発明によれば、配列番号:15に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号:16に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗ブドウ球菌抗体(ZBIA3H系列抗体)が提供される。
また、本発明によれば、受託番号:NITE BP-1367または受託番号:NITE BP-1366で寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体が提供される。
これらの抗体は、好ましくは黄色ブドウ球菌と結合することができる。
また、これらの抗体は、好ましくは他のブドウ球菌(例えば、表皮ブドウ球菌、腐性ブドウ球菌、またはStaphylococcus haemolyticusなど)、特に好ましくは表皮ブドウ球菌とも結合することができる。
これらの抗体は、好ましくは、ブドウ球菌感染症の治療または予防効果を有し、さらに好ましくは、薬剤耐性ブドウ球菌感染症の治療または予防効果を有する。
さらに、本発明によれば、抗ブドウ球菌抗体をコードする核酸、その核酸を含むベクター、並びにそのベクターを含む宿主細胞が提供される。
さらに、本発明によれば、抗ブドウ球菌抗体をコードする核酸がその抗体を発現する条件下で、宿主細胞を培養することを含むその抗体の製造方法が提供される。
さらに、本発明によれば、抗ブドウ球菌抗体を含む、ブドウ球菌感染症の治療または予防のための医薬が提供される。
さらに、本発明によれば、治療または予防対象に抗ブドウ球菌抗体または組成物を投与することを含む、ブドウ球菌感染症の治療または予防方法が提供される。
さらに、本発明によれば、ブドウ球菌感染症の治療または予防のための医薬の製造における、抗ブドウ球菌抗体または組成物の使用が提供される。
さらに、本発明によれば、ブドウ球菌感染症の治療または予防に使用するための抗ブドウ球菌抗体または組成物が提供される。
さらに、本発明によれば、(a)容器;(b)パッケージ挿入物および/または容器上のラベル;および(c)前記容器内に収容された抗ブドウ球菌抗体を含む組成物を含んでなり、パッケージ挿入物および/または前記容器上のラベルの少なくとも一つの当該組成物がブドウ球菌感染症の治療または予防に使用できることを表示する製造品が提供される。
さらに、本発明によれば、脱アセチル化したブドウ球菌により哺乳動物を免疫し、該哺乳動物から抗体産生細胞を得ることを含む、抗ブドウ球菌抗体の製造方法が提供される。
この方法によれば、ブドウ球菌の脱アセチル化により様々な抗原性を賦与することができ、新規でかつ多種類の抗体を製造することができる。
本明細書中においては、次の用語は以下に示す意味を有し、各用語は、以下に示す各態様を表すものとする。
ブドウ球菌種の中で、臨床上重要な感染起因菌であると共に、本発明の効果が特に高い菌種として、黄色ブドウ球菌を挙げることができる。
「表皮ブドウ球菌」とは、表皮ブドウ球菌種(Staphylococcus epidermidis種)に属するグラム陽性球菌を意味し、「腐性ブドウ球菌」とは、腐性ブドウ球菌種(Staphylococcus saprophyticus種)に属するグラム陽性球菌を意味し、「Staphylococcus haemolyticus」とはStaphylococcus haemolyticus種に属するグラム陽性球菌を意味する。これらのブドウ球菌は、その生化学的特徴あるいは遺伝的特徴などにより、常法に従い、同定・判別することができる。
また、「薬剤耐性黄色ブドウ球菌」には、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)並びにバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌(VRSA)が含まれる。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の特定の株としては、これに限定されるものではないが、例えば、MW2株、N315株などが挙げられ、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌としては、これに限定されるものではないが、例えば、VRS1株などが挙げられる。
黄色ブドウ球菌による感染症には、これに限定されるものではないが、食中毒、皮膚/軟部組織感染症(例えば、ニキビ、伝染性膿痂疹(とびひ)、毛包炎、せつ(furuncle)、よう(carbuncle)、化膿性汗腺炎、乳腺炎、感染性爪囲炎、蜂窩織炎(蜂巣炎)、化膿性筋炎、皮下膿瘍、術後創部感染症)、菌血症、敗血症、心内膜炎、髄膜炎、脳膿瘍、骨髄炎、関節炎、中毒性ショック症候群、ブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群、感染症続発性紅皮症、リンパ節炎、眼瞼炎、麦粒腫、非淋菌性細菌性結膜炎、角膜潰瘍、鼻炎、副鼻腔炎、下顎下腔感染症、咽頭上顎膿瘍、化膿性耳下腺炎、肺炎、肺膿瘍、膿胸、横隔膜下膿瘍、腹腔内膿瘍、骨盤膿瘍、後腹膜膿瘍、傍腎膿瘍、内臓膿瘍(脾膿瘍、膵膿瘍、肝膿瘍)、肛門直腸膿瘍、前立腺膿瘍、前立腺炎、尿道炎、膀胱炎、腎盂腎炎 などが挙げられる。
表皮ブドウ球菌による感染症には、これに限定されるものではないが、特にカテーテルや心臓弁などの医療器具使用時の、皮膚/軟部組織感染症(例えば、深在性の化膿症や慢性感染症など)、菌血症、敗血症、心内膜炎、骨髄炎などが挙げられる。
腐性ブドウ球菌による感染症には、これに限定されるものではないが、尿路感染症などが挙げられる。
Staphylococcus haemolyticusによる感染症には、これに限定されるものではないが、尿路感染症などが挙げられる。
上記の感染症の少なくとも一部は、特に、人工医療デバイス・インプラント(例えば、人工弁、人工関節、中心静脈カテーテル、心臓弁など)埋め込み患者、手術患者、がん患者、血液透析患者、未熟児、糖尿病患者、免疫不全患者、高齢者、人工呼吸器使用者などで特に起こり易い。
また、抗体は、発明の効果を損なわない範囲で、何れのクラス(例えば、IgG、IgA、IgM、IgD、IgE)、何れのサブクラスであってもよい。
また、特に抗体がFc領域を含む場合、抗体は糖鎖を含み得る。哺乳動物細胞によって産生される抗体は典型的にはFc領域のCH2ドメインのAsn297へのN結合によって一般に結合した分岐オリゴ糖を含む(例えば、Wright et al., (1997) TIBTECH 15: 26-32を参照のこと)。オリゴ糖は様々な炭水化物、例えばマンノース、N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)、ガラクトース、およびシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「ステム部」としてGlcNAcに結合したフコースを含み得る。
VLの24−36または24−34(CDRL1)、46−56または50−56(CDRL2)、89−97または89−96(CDRL3)、VHの26−35(CDRH1)、50−65または49−65(CDRH2)、93−102、94−102または95−102(CDRH3)
また、別段明記する場合には、Chothiaによる番号付け等の、当業者に公知の他の番号付けを用いることもできる。
「Fc領域」とは、一般にCH2ならびにCH3領域からなる、抗体の重鎖のC末端領域を意味する。重鎖のFc領域の境界は変化し得るが、例えば、ヒトIgG重鎖Fc領域は、一般には、Cys226またはPro230のアミノ酸残基からFc領域のカルボキシル末端までからなる。
また、脊椎動物種の抗体の軽鎖は、その定常領域のアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)およびラムダ(λ)の何れかを取り得る。
また、抗体は、公知の任意の方法によって修飾が行われた修飾抗体も含む。例えば、糖鎖の修飾(WO0061739など)やFc領域のアミノ酸の変異(US20050054832A1)などはFc受容体等との結合を高め、より高い治療効果をもたらすことができる。
「ヒト化抗体」は、キメラ抗体の一種であり、重鎖および/または軽鎖の可変領域配列が既知のヒト可変領域配列と大きく一致するよう変更された可変領域を有する抗体である。このような変更は従来技術で既知であり、これに限定されるものではないが、典型的には突然変異誘発またはCDR移植によってなされる。CDR移植は、所望の特異性を有する抗体のCDRをヒト抗体のフレームワークに移植し、それによって大部分の非ヒト配列をヒト配列と交換することをいう。
ヒト化抗体は、レシピエント抗体(ヒト抗体)にも、ドナー抗体(マウス抗体)にも、見出されない残基を含んでいてもよい。マウスモノクローナル抗体をヒト化することにより、ヒト抗マウス抗体(HAMA)応答が低減される。
ヒト抗体は、様々な従来技術により作製することができるが、例として以下の方法を挙げることができる。
例えば、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択したFvクローン可変領域配列を既知のヒト定常領域配列と組み合わせることにより、ヒト抗体を作製することができる。
また、ヒト抗体が、非ヒト親抗体(例えばマウス抗体)と類似した親和性および特性を有している場合、非ヒト親抗体からヒト抗体を得るために遺伝子シャッフリングを使用することもできる(エピトープインプリンティングとも称される;例えば、国際公開第93/06213号を参照のこと)。CDR移植による非ヒト抗体のヒト化と異なり、この技術により、非ヒト起源のFRまたはCDR残基を全く有さないヒト抗体を得ることもできる。
「多重特異性抗体」は、少なくとも2つの異なる抗原に対して結合特異性を有する抗体(抗体断片も含む)であり、特に2つの異なる抗原に対して結合特異性を有する抗体(抗体断片も含む)を、「二重特異性抗体」という。
抗体は、例えばELISA、ウエスタンブロットなどといった公知の方法によって、その抗原結合活性について試験することができる。
これらの抗体は、ELISAなどのアッセイによって、非特異的結合(バックグラウンド)に対して得られるシグナルの少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも5倍、または少なくとも10倍の結合親和性が得られる場合、特異的に結合するということができる。これらの抗体は、更に好ましくは、本発明の効果を損なわせる他の抗原(他の細菌や他の生物)との結合が、ブドウ球菌との結合の50%以下、30%以下、20%以下、10%以下、5%以下、2%以下、または1%以下である。
結合強度の指標としては、例えば、解離定数(Kd)を用いることができ、結合強度の測定には、ELISA、ラジオイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴等、当分野で公知の手法を用いることができる。また、これら抗原中の具体的なエピトープについては、ELISA、ウエスタンブロットといった手法を用い、同定することができる。
このようなコンジュゲート抗体において、抗体(Ab)は、望ましくはリンカー(L)を介して、一または複数の薬剤部分(D)、例えば1抗体につき1から20の薬剤部分にコンジュゲートされる。このようなコンジュゲート抗体は、公知の有機化学反応ならびに試薬を用いる手段によって作製することができる。コンジュゲート抗体(Ab−DpまたはAb−(L−D)p)は、これに限定されるものではないが、例えば、(1)抗体の求核基を二価のリンカー試薬と反応させて共有結合を介してAb−Lを形成した後、薬剤部分と反応させること;あるいは(2)薬剤部分の求核基を二価のリンカー試薬と反応させて共有結合を介してD−Lを形成した後、抗体の求核基と反応させることにより作製してもよい。
「抗生剤」としては、例えばペニシリン、セファゾリン、イミペネム、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、ダプトマイシン、バンコマイシンが挙げられる。
「合成抗菌剤」としては、例えばレボフロキサシン、モキシフロキサシン、リネゾリドが挙げられる。
「溶菌酵素」としては、例えばアクロモペプチダーゼ、ラビアーゼ、リソスタフィン、リゾチーム、ムタノリシンが挙げられる。
「抗菌ペプチド」としては、例えばデフェンシン、カセリシジン、ヘパシジン、ヒスタチン、ラクトフェリン、ダーミシジンが挙げられる。
ある配列に対し、変異を導入する方法としては、天然源からの単離(天然に生じるアミノ酸/ヌクレオチド配列変異体の場合)、部位特異的変異、PCR突然変異誘発、およびカセット変異導入を含むが、これらに限定されない。
また、ポリペプチドに結合したオリゴ糖(糖鎖)が天然体から変更されたものも、あるアミノ酸配列を有するポリペプチドに含まれ得る。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することであり、所望の特徴を保持される範囲で、非保存的置換を行うこともできる。
「単離された」とは、対象分子が、自然環境に通常付随している少なくとも一の他の類似分子(ポリペプチド、核酸など)から分離されおよび/または回収されている状態にあることを意味する。通常は、単離された分子は、少なくとも一の精製工程を経て調製される。
「治療」とは、既に起こった感染の減少、緩和または軽減を意味し、「予防」とは、将来的な感染に対する防御を意味する。治療の望ましい効果には、症状の寛解、疾病の任意の直接的または間接的病理的結果の低減、症状悪化の進行速度の低減、疾病状態の回復または緩和、予後の改善が含まれる。
「無菌の」あるいは「滅菌」とは、防腐性であるか、または実質的に全ての生きている微生物およびそれらの胞子を含まないことを意味する。
以下、本発明を実施するための形態を用いて、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
これらの態様は、単独でも、複数を組み合わせてもよい。また、各態様の定義や詳細については、前述の「用語および態様の説明」も参照のこと。
本明細書で用いられる公知の技術および手順は、当業者には十分に理解されるものであり、常法に従い実施することができる。
本発明のある態様は、脱アセチル化したブドウ球菌を免疫して得られる、ブドウ球菌感染症の治療または予防効果(ブドウ球菌増殖阻害作用、ブドウ球菌傷害作用)を有する抗ブドウ球菌抗体である。
従来の抗原(エピトープ)の選択による、莢膜成分、特定の産生毒素、特定の細胞壁結合タンパク質や菌体成分などを抗原とするワクチン・抗体では必ずしも十分な結果が得られていなかったため、本発明者らは新規の抗原ならびに抗体の開発を目的として鋭意検討を重ね、脱アセチル化したブドウ球菌を抗原として作製した抗体が、ブドウ球菌感染症の治療または予防において、優れた効果を発揮することを見出して本発明を完成した。
上記態様において、ブドウ球菌としては、これに限定されるものではないが、ブドウ球菌の菌体そのものを用いることができ、より好ましくは、細胞壁あるいは細胞壁を含む画分・精製物等を用いることができる。脱アセチル化の手法としては、これに限定されるものではないが、脱アセチル化酵素を用いた酵素法、アルカリ処理を用いた化学法などが挙げられる。アンモニア水でブドウ球菌を処理することが簡便かつ温和な条件での脱アセチル化のため好ましい。脱アセチル化の手法の詳細については後述する。
本発明の抗体は、ブドウ球菌と結合することにより、ブドウ球菌感染症の予防・治療あるいはブドウ球菌の検出に好適に用いることができる。本発明の抗体は、ブドウ球菌の中でも、黄色ブドウ球菌に対して特に高い効果を発揮する。また、本発明の抗体は、ブドウ球菌の中でも、黄色ブドウ球菌を抗原として用いることにより、好適に得ることができる。
CDR配列は、抗原特異性を抗体に付与する配列であるため、ZBIA5H抗体またはZBIA3H抗体由来のCDR配列を含む抗体であれば、他の配列は異なる場合でも、ZBIA5H抗体またはZBIA3H抗体由来の所望の生物学的特性を発揮できるものと考えられる。
可変領域のCDRは、フレーム領域によって構造を保持され、他の鎖からのCDRとともに抗体のエピトープの形成に寄与しているが、これらのアミノ酸配列は公知の方法により変更することが可能である。一定の範囲のアミノ酸配列同一性を有するCDRは機能的には同等の抗体特性を有する蓋然性が高い。
CDRは、本発明の効果を損なわない範囲で、公知の何れの定義に基づくCDRであってもよいが、Kabat、Chothia、AbMまたはcontactの何れかにより定義されたCDRが好適に用いられ、さらに好適には、Kabatにより定義されたCDRが用いられる。
また、配列番号:9はZBIA3H抗体重鎖CDR1、配列番号:10はZBIA3H抗体重鎖CDR2、配列番号:11はZBIA3H抗体重鎖CDR3、配列番号:12はZBIA3H抗体軽鎖CDR1、配列番号:13はZBIA3H抗体軽鎖CDR2、配列番号:14はZBIA3H抗体軽鎖CDR3を表す。
なお、上記各配列はKabatの定義によるCDR配列である。
また、同様に、これに限定されるものではないが、ZBIA3H系列抗体の代表例としては、重鎖可変領域が配列番号:9、10および11に示されるアミノ酸配列をそれぞれ含むCDRH1、2および3を含み、軽鎖可変領域が配列番号:12、13および14に示されるアミノ酸配列をそれぞれ含むCDRL1、2および3を含む抗ブドウ球菌抗体が挙げられる。
同様に、ZBIA3H系列抗体の更なる代表例としては、配列番号:15に示されるアミノ酸配列とアミノ酸配列同一性90%以上、95%以上、98%以上あるいは100%のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号:16に示されるアミノ酸配列とアミノ酸配列同一性90%以上、95%以上、98%以上あるいは100%のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗ブドウ球菌抗体が挙げられる。
ここで、配列番号:7および8は、それぞれZBIA5H抗体の重鎖および軽鎖可変領域配列であり、配列番号:15および16は、それぞれZBIA3H抗体の重鎖および軽鎖可変領域配列である。
可変領域配列全体の定まったこれらの態様では、より確実に抗体の治療または予防効果を発揮できる。
本発明のある態様では、受託番号:NITE BP-1367または受託番号:NITE BP-1366で寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体(それぞれ、ZBIA5H抗体またはZBIA3H抗体と称する)が提供される。
上記何れかの態様において、抗体は、本発明の効果を損なわない範囲で、如何なる形態の抗体であってもよい。
これらの抗体も、好ましくは、ブドウ球菌感染症の治療または予防効果を有し、さらに好ましくは、薬剤耐性ブドウ球菌感染症の治療または予防効果を有する。
また、ZBIA5H系列抗体は、他の抗ブドウ球菌抗体(例えば、ZBIA3H系列抗体)と併用することで、それぞれの単独投与よりも更に優れたブドウ球菌感染症の治療または予防効果を奏することができる。
抗菌物質とコンジュゲートしていることにより、細菌への効果的な抗菌物質の集中化による抗菌物質の抗菌作用増強、副作用の低減、抗体エフェクター作用と共同した抗菌作用の増強などの更なる効果を奏することができる。
さらに好ましくは、合成抗菌剤は、リネゾリドである。その場合、血球減少等の副作用が軽減され、リネゾリド耐性菌にも効果を奏することができる。
さらに好ましくは、溶菌酵素は、リソスタフィンである。その場合、抗原性の低減、体内動態の改善、溶菌作用増強、投与用量減量などの効果を奏することができる。
さらに好ましくは、抗菌ペプチドはカセリシジンである。その場合、抗菌作用増強、投与用量減量の効果を奏することができる。
本発明のある態様は、脱アセチル化したブドウ球菌により哺乳動物を免疫し、その哺乳動物から抗体産生細胞を得ることを含む、ブドウ球菌感染症の治療または予防効果を有する抗ブドウ球菌抗体の製造方法またはスクリーニング方法である。
この方法によれば、脱アセチル化により様々な抗原性を賦与することができ、新規でかつ多種類の抗体を製造することができる。
アセチル化、脱アセチル化による荷電の変化が物質の立体構造や相互作用を変化させる一例としてヒストンを挙げることができる。ヒストンは通常、陽性に荷電して、陰性に荷電しているDNAと静電気的に結合することができる。しかし、ヒストンアセチル基転移酵素によりアセチル化されるとヒストンの荷電はなくなり、DNAとの結合は弱まる。ヒストン脱アセチル化酵素による脱アセチル化はヒストンを再び陽性に荷電させることでDNAと結合しやすくする。
脱アセチル化の手段としては、脱アセチル化が達成される限り、その手段には限定されるものではないが、例えば、酵素処理、アルカリ処理などが挙げられる。さらに、ブドウ球菌の細胞壁N−アセチルムラミン酸O−アセチル基が脱アセチル化される手段が好ましい。
アンモニア水の濃度は、脱アセチル化と非特異的変性作用との兼合いから5〜30%が好ましく、脱アセチル化反応速度と非特異的変性作用との兼合いから10〜15%がさらに好ましい。処理温度は、脱アセチル化と非特異的変性作用との兼合いから4〜50℃が好ましく、脱アセチル化反応速度と非特異的変性作用との兼合いから30〜40℃がさらに好ましい。処理時間としては、脱アセチル化と非特異的変性作用との兼合いから6〜48時間が好ましく、脱アセチル化反応速度と非特異的変性作用との兼合いから12〜24時間がさらに好ましい。さらに、アンモニア水処理では、攪拌を行うことが好ましい。
(1)免疫
得られた抗原を哺乳動物へ投与して免疫を行う。抗原は、アジュバントと混合して用いられてもよい。哺乳動物としては、マウスが好適に用いられ、BALB/cマウスがさらに好適に用いられる。免疫は、同一の哺乳動物に対し、単数回行われても、複数回行われてもよい。
(2)スクリーニング
脾細胞より常法によりハイブリドーマを作製し、抗体価等所望の活性を指標に、スクリーニングを行う。脾細胞を得る前に、免疫した哺乳動物単位で、血清抗体価などの血清中の活性を指標にプレスクリーニングを行ってもよい。また、スクリーニングは、好ましくはELISAを用いて行われ、さらに好ましくは、ブドウ球菌Cell−ELISAを用いて行われる。
スクリーニングで選抜したハイブリドーマをマウス腹腔へ投与して腹水を産生させ、その抗体含有腹水を採取し、精製して、抗ブドウ球菌抗体を得る。好ましくは、マウスとしてはSCIDマウスが用いられる。精製には、好ましくはクロマトグラフィー、より好ましくはアフィニティークロマトグラフィー、例えばプロテインGアフィニティークロマトグラフィーなどが用いられる。
(4)組換え生産
スクリーニングで得られた抗体については、その抗体を産生するハイブリドーマからcDNAを得るなどにより、他の細胞において組換え体を製造することができ、このような態様も上記製造方法に含まれる。
得られたcDNAを用い、他の細胞において組換え体を製造する方法の詳細は、後述する。
上記何れかの態様の核酸は、常法により、単離し、配列決定することができる。これに限定されるものではないが、例えば、重鎖および/または軽鎖等を特異的に増幅するように設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて配列決定することができる。また、単離された核酸は、クローニングおよび発現させるために原核または真核細胞へ遺伝子導入することができる。
好適宿主細胞としては、原核生物、酵母、または高等真核生物細胞を挙げることができる。好適な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌(例えばグラム陰性またはグラム陽性菌)が挙げられる。
ポリペプチド発現には、糸状菌または酵母菌のような真核微生物も好適に用いることができる。
高等真核生物細胞のうち、無脊椎動物細胞の例には植物および昆虫細胞が含まれる。
通常は抗体を産生しない宿主細胞(例えば、大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、またはミエローマ細胞)に上記何れかの態様の核酸を形質移入し、プロモーターを誘導し、適切な栄養培地中で培養することにより、その核酸によりコードされる抗体を産生させることができる。その後、例えば、宿主細胞ペーストから可溶性分画へと抗体を分離し、精製する(例えば、アイソタイプに応じてプロテインAまたはGカラムを用いる)ことにより、抗体を製造することができる。
抗体が細胞内に産生された場合、第1の工程として、不要物(細胞細片など)を例えば遠心分離または限外濾過によって除去する。Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌された抗体の単離方法を記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム(pH3.5)、EDTA、およびフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)の存在下で約30分間冷解凍を行う。細胞細片は遠心分離で除去できる。
抗体が培地中に分泌される場合は、そのような発現系からの上清を、一般的にはタンパク質濃縮フィルター(例えばAmiconもしくはPelliconの限外濾過フィルター)を用いて濃縮する。PMSFなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めることで、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を用いることで外来性の汚染生物の増殖を防止してもよい。
上述した予備的精製工程に続いて、目的の抗体および混入物を含む混合液に、例えば、pH約2.5−4.5、好ましくは低塩濃度(例として、約0−0.25M塩)の溶出緩衝液を用いた低pH疎水性相互作用クロマトグラフィーを施してもよい。
本発明の他の態様は、上記何れかの態様の抗体を含む組成物である。
本発明の更なる態様は、ZBIA5H系列抗体と、他の抗ブドウ球菌抗体とを含む組成物である。他の抗ブドウ球菌抗体としては、ZBIA3H系列抗体が好ましい。
ZBIA5H系列抗体は、他の抗ブドウ球菌抗体(例えば、ZBIA3H系列抗体)と併用することで、それぞれの単独投与よりも更に優れたブドウ球菌感染症の治療または予防効果を奏することができるため、上記態様の組成物は特に効果的である。
上記何れかの態様の組成物は、本発明の効果を損なわない範囲で、凍結乾燥形態あるいは溶液形態等の何れであってもよいが、凍結乾燥形態で提供されることが好ましい。凍結乾燥品の場合、使用時に、薬学的に許容される水性担体(例えば、注射用滅菌水または滅菌生理食塩水)に溶解する。
また、上記何れかの態様の組成物は、対応する医薬であってよい。
なお、上記何れかの態様の抗体が、前述または後述する他の薬剤または抗ブドウ球菌抗体と併用される場合、それら併用された二剤が体内で(in situ)組成物を形成する場合も、上記何れかの態様の組成物に含まれる。
本発明の他の態様は、(a)容器;(b)パッケージ挿入物および/または前記容器上のラベル;および(c)容器内に収容された上記何れかの態様の抗体を含む組成物または上記何れかの態様の組成物を含んでなり、パッケージ挿入物および/または前記容器上のラベルの少なくとも一つの当該組成物がブドウ球菌感染症の治療または予防に使用できることを表示する製造品である。
本発明の他の態様は、治療または予防対象に上記何れかの態様の抗体または組成物を投与することを含む、ブドウ球菌感染症の治療または予防方法である。
また、本発明の他の態様は、上記何れかの態様の抗体または組成物を含む、ブドウ球菌感染症を治療または予防するための医薬である。
また、本発明の他の態様は、上記何れかの態様の抗体または組成物の、ブドウ球菌感染症の治療または予防のための医薬の製造における使用である。
また、本発明の他の態様は、ブドウ球菌感染症の治療または予防に使用するための上記何れかの態様の抗体または組成物である。
簡便のために、以下、これらの態様を医薬用途態様と総称する。
また、従来のブドウ球菌ワクチンでは、ブドウ球菌が常在菌であるため、免疫されにくく、さらに、対象患者が免疫不全の場合(ブドウ球菌感染症の患者には免疫不全が少なくない)、十分に免疫されないといった改善点が存在した。上記医薬用途態様は、これらの点については改善されており、少なくとも一側面において、従来型のワクチンよりも有用となり得る。
ZBIA5H系列抗体は、単独使用に比べて、他の抗ブドウ球菌抗体(特にZBIA3H系列抗体あるいはそのアナログ)と組み合わせて使用する際に、さらに優れた効果を奏することができる。
併用は、二抗体の同時投与でも、何れかの抗体の投与が前後となってもよく、2以上の抗体は同一製剤または別個の製剤の何れの製剤形態をとって提供されてもよい。
本発明と併用することのできる活性成分は、上記態様(他の抗ブドウ球菌抗体)に限られるものではなく、例えば、抗菌性物質等、他の薬剤(例えば、バンコマイシン、テイコプラニン、アルベカシン、リネゾリド、ダプトマイシン、イミペネム、ノルフロキサシン、ゲンタマイシンなど)やアジュバントと併用してもよい。
典型的な投与例を上に示したが、本発明はこれに限定されるものではない。
これらの治療の進行は、通常の診断やアッセイ等により簡便にモニターすることができる。
なお、ブドウ球菌感染症では、しばしば抗菌薬の投与のみでは十分ではないことがあるため、本発明の薬剤も、必要に応じて、病巣に対する外科的処置(人工弁の入れ替え、カテーテル抜去、関節腔の切開排膿など)と併用してよい。
例えば、上記何れかに記載の態様において、ZBIA3H(系列)抗体の代わりに、またはZBIA3H(系列)抗体と組み合わせて、ZBIA9H(系列)抗体を用いてもよい。ZBIA9H系列抗体は、好ましくはZBIA9H抗体と同一のCDRを含む。ZBIA9H(系列)抗体では、ZBIA3H(系列)抗体における配列番号:9、10、11、12、13、14、15および16のアミノ酸配列の代わりに、それぞれ配列番号17、18、19、20、21、22、23および24のアミノ酸配列が用いられる。
ブドウ球菌に対するモノクローナル抗体の調製
免疫抗原の調整
黄色ブドウ球菌MW2株をTryptic Soy Broth(BD社、以下TSB)で対数増殖後期にまで培養し、遠心回収後、ガラスビーズブレンダーで破砕した。Triton−X100および蒸留水で洗浄後、遠心回収してこれを細胞壁精製物とした。免疫原性を高め、多様な抗体を産生しやすくするために、12.5%アンモニア水に懸濁して37℃で16時間撹拌することで、N−アセチルムラミン酸O−アセチル基の脱アセチル化処理を行った(脱アセチル化細胞壁精製物:免疫抗原)。
免疫抗原2mg/mL、20mg/mLおよび200mg/mLと等量のフロイント完全アジュバント(以下FCA)もしくはフロイント不完全アジュバント(以下FIA)と混合してエマルジョンを作製し、これを免疫原とした。
雌性BALB/cマウス(日本チャールス・リバー(株))の腹腔へ、初回免疫時は免疫抗原とFCAとのエマルジョンを0.2mLずつ投与し(投与抗原量0.2mg、2mgおよび20mg、各群5匹)、以降4次免疫まではFIAとのエマルジョンを2週間毎に同様に投与した。
初回免疫の1週間前と各免疫の1週間後に尾静脈より採血し、血清中の抗ブドウ球菌抗体の抗体価を黄色ブドウ球菌固相化Cell−ELISAで測定した。抗体価は追加免疫毎に上昇し、概ね投与抗原量が多い個体(抗原20mg投与群)で高い抗体価が得られた(図1、20mg−1、2、3、4、5)。
そして個体20mg−2に、最終免疫として抗原5mgを静脈内に投与した。
増殖可能な感染性のあるブドウ球菌と実際に結合できる抗体を検出するため、抗ブドウ球菌抗体の結合性測定は、生きた菌体そのままを固相化した黄色ブドウ球菌固相化Cell−ELISAで行った。
TSBで30℃16時間静置培養したプロテインAノックアウトOS2株を遠心回収してダルベッコリン酸緩衝生理食塩液(−)(以下PBS)で3回洗浄し、A600=0.1程度に濃度を調整した。
最終5次免疫から3日後に脾細胞を採取し、ポリエチレングリコールを用いてマウスミエローマ培養細胞株SP2/0細胞と細胞融合させ、常法に従いハイブリドーマを得た。
ハイブリドーマ培養上清中の抗ブドウ球菌IgGおよびIgM抗体を黄色ブドウ球菌固相化Cell−ELISAで測定した結果、1002ウェル中の106ウェルで黄色ブドウ球菌に結合親和性を有する抗体が検出された。このうちのA405>2の30ウェルをクローニングに供し、黄色ブドウ球菌固相化Cell−ELISA(IgG検出)によるスクリーニングと限界希釈法によるクローニングを繰り返すことで、抗ブドウ球菌抗体を産生する22種のハイブリドーマを得た。
In vivoスクリーニングへ供するモノクローナル抗体試料を調製するにあたり、数mg/mL程度の抗体含有量が期待できるハイブリドーマ腹水からの精製・調製を行った。
対数増殖期に達したハイブリドーマ5x106個を、遺伝的・機能的にB細胞およびT細胞を欠損しイムノグロブリンを持たないSCIDマウス(日本クレア(株))の腹腔に投与し、1〜2週間後、貯留した腹水を採取して−70℃に凍結保存した。
抗ブドウ球菌抗体とブドウ球菌との結合親和性を、ELISAの反応性で調べた。
各精製抗体の黄色ブドウ球菌固相化Cell−ELISAでの反応性を調べたところ、その添加濃度と反応性との関係から4つのグループが認められた(図2)。第一に、ZBIA6H、8H、10H、11Hおよび12H精製抗体が示す極めて結合親和性が高いグループ、第二にZBIA2H、4Hおよび14H精製抗体が示す第一のグループに次いで結合親和性が高いグループ、第三にZBIA1H、3H、5H、7H、9H、13H、15H、16H、17H、19H、20H、21Hおよび22Hが属する中程度の結合親和性を示すグループ、第四に結合親和性が弱いZBIA18Hの、4グループであった。
抗ブドウ球菌抗体の交差反応性
凍結保存してある表皮ブドウ球菌ATCC12228株をTSBで37℃16時間振とう培養し、この培養液を新鮮なTSBに1/100量添加してさらに37℃4時間振とう培養してこれを遠心回収し、PBSで3回洗浄後A600=0.1程度に濃度を調整した。これを96穴ELISAプレート(Nunc社、Maxisorp)に各ウェルあたり100μLずつ分注し、4℃で6時間静置することで菌体を固相化した。そしてPBSで3回洗浄後、1%ウサギ血清/PBSを各ウェルに300μLずつ加えて4℃で16時間静置し、ブロッキングを行った。さらに0.05%Tween20/PBSで3回洗浄後、ZBIA5H抗体もしくはZBIA3H抗体溶液100μL/ウェルを加えて30℃で2時間静置した。再び0.05%Tween20/PBSで3回洗浄した後、2次抗体としてヤギHRP標識F(ab’)2抗マウスIgG(γ)(KPL社)を100μL/ウェル添加し、30℃で2時間静置した。そして0.05%Tween20/PBSで3回洗浄後、基質としてABTSを100μL/ウェル加えて発色させ、A405をマイクロプレートリーダーで測光して表皮ブドウ球菌に交差反応性を示す抗体量を測定した。
その結果、上記抗体は、表皮ブドウ球菌にも結合親和性を示した(図3)。
市中感染MRSAマウス敗血症モデルへの効果
雌性BALB/cマウス7週齢の腹腔に黄色ブドウ球菌MW2株8x108個/0.5mL PBSおよび被験物質0.2mL(PBS、1mg抗ブドウ球菌抗体、1mgマウスIgG)を投与し、生存数を観察した。
その結果、ZBIA5H抗体およびZBIA3H抗体が、PBS投与群に対して有意な延命作用を示した(フィッシャーの正確確率検定、図4、5)。
また、ZBIA5H抗体0.5mgとZBIA3H抗体0.5mgとの同時投与群は、ZBIA5H抗体1mgあるいはZBIA3H抗体1mg単独投与群より優れた延命効果を示した(図6)。
バンコマイシン高度耐性MRSAマウス敗血症モデルへの効果
雌性BALB/cマウス7週齢の腹腔に黄色ブドウ球菌VRS1株2−3x109個/0.5ml PBSおよび被験物質0.2ml(PBS、1mg抗ブドウ球菌抗体、1mgマウスIgG、1mg塩酸バンコマイシン(VCM))を投与し、生存数を観察した。
その結果、ZBIA5H抗体およびZBIA3H抗体が、PBS投与群およびVCM投与群に対して有意な延命作用を示した(フィッシャーの正確確率検定、図7)。
市中感染MRSAマウス肺炎モデルへの予防効果
実施例3市中感染MRSAマウス敗血症モデルで用いた黄色ブドウ球菌MW2株は、壊死性肺炎を起こすことが知られている(非特許文献5)。そこで実施例3および4で有効であったZBIA5H抗体およびZBIA3H抗体の肺炎への有効性を明らかにするため、肺炎予防実験を試みた。
被験物質0.2mL(PBS、1mg抗ブドウ球菌抗体、1mg塩酸バンコマイシン(VCM))を尾静脈内へ投与し、その1時間後に黄色ブドウ球菌MW2株4x108個/40μL PBSを雌性BALB/cマウス7週齢に経鼻投与して肺に感染させ、感染4日後に肺を摘出してホモジナイザーで懸濁してマンニット食塩寒天培地平板へ塗布し、37℃で36時間培養して出現したコロニー数を計測して、これを肺感染菌数とした。
得られた結果をウイルコクソンの順位和検定で統計学的解析を行ったところ、ZBIA5HおよびZBIA3H抗体投与群はPBS投与群に対し、有意に肺感染菌数が減少していた(図8、9)。
市中感染MRSAマウス肺炎モデルへの治療効果
実施例5にてZBIA5HおよびZBIA3H抗体の肺炎予防効果が確認されたため、次に治療実験を試みた。
黄色ブドウ球菌MW2株4x108個/40μL PBSを雌性BALB/cマウス7週齢に経鼻投与し、肺に細菌を感染させ、3日後に被験物質0.2mL(PBS、1mg抗ブドウ球菌抗体、1mgマウスIgG、1mg塩酸バンコマイシン(VCM))を尾静脈内へ投与した。
黄色ブドウ球菌投与5日後(被験物質投与2日後)に肺を摘出してホモジナイズし、懸濁液をマンニット食塩寒天培地平板へ塗布した。これを37℃で36時間培養して出現したコロニー数を計測し、肺感染菌数とした。
得られた結果をウイルコクソンの順位和検定で統計学的解析を行ったところ、ZBIA5H、ZBIA3H抗体およびVCM投与群はPBS投与群に対し、有意に肺感染菌数が減少していた(図10、11)。
抗体可変領域のクローニング
ZBIA5H抗体およびZBIA3H抗体可変部遺伝子は、5’−RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)法により得た。
まず、ZBIA5H抗体およびZBIA3H抗体産生ハイブリドーマより全RNAを抽出し、オリゴdTプライマー(Invitrogen)を用いて逆転写酵素(SuperScriptII、Invitrogen)にてcDNAを合成した。dCTP(タカラバイオ)存在下、TdT(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase、東洋紡またはタカラバイオ)にてcDNAの3’−末端にdCTP(Cテール)を付加し、これを鋳型としてCテールと相補的な配列を持つオリゴdGプライマーとマウスκ鎖遺伝子特異的プライマーまたはマウス重鎖遺伝子特異的プライマーとを用いたPCR法により、ZBIA5H抗体およびZBIA3H抗体重鎖および軽鎖可変部遺伝子を増幅した。各増幅産物をp3Tベクター(Mo Bi Tec)にサブクローニングし、導入遺伝子の塩基配列を確認した。重鎖および軽鎖の可変部アミノ酸配列を図12および図13に示す。
以下の抗体を産生するハイブリドーマをそれぞれ独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)に国際寄託(ブダペスト条約に基づく)した:
抗体 ハイブリドーマ受託番号 原寄託日 国際寄託への移管日
ZBIA5H NITE BP-1367 2012年5月29日 2012年6月25日
ZBIA3H NITE BP-1366 2012年5月29日 2012年6月25日
なお、本明細書に引用された特許、特許出願、および出版物の開示内容は全て、参照により本明細書に援用される。
ハイブリドーマ(ZBIA3H): NITE BP-1366
Claims (21)
- 黄色ブドウ球菌と結合することのできる、
重鎖可変領域が、配列番号:1、2および3に示されるアミノ酸配列をそれぞれ含むCDRH1、2および3を含み、
軽鎖可変領域が、配列番号:4、5および6に示されるアミノ酸配列をそれぞれ含むCDRL1、2および3を含む、あるいは、
重鎖可変領域が、配列番号:9、10および11に示されるアミノ酸配列をそれぞれ含むCDRH1、2および3を含み、
軽鎖可変領域が、配列番号:12、13および14に示されるアミノ酸配列をそれぞれ含むCDRL1、2および3を含む、抗体。 - 重鎖可変領域が、配列番号:1、2および3に示されるアミノ酸配列をそれぞれ含むCDRH1、2および3を含み、
軽鎖可変領域が、配列番号:4、5および6に示されるアミノ酸配列をそれぞれ含むCDRL1、2および3を含む、請求項1に記載の抗体。 - 配列番号:7に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号:8に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項2に記載の抗体。
- 重鎖可変領域が、配列番号:9、10および11に示されるアミノ酸配列をそれぞれ含むCDRH1、2および3を含み、
軽鎖可変領域が、配列番号:12、13および14に示されるアミノ酸配列をそれぞれ含むCDRL1、2および3を含む、請求項1に記載の抗体。 - 配列番号:15に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号:16に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項4に記載の抗体。
- 更に、表皮ブドウ球菌と結合することのできる、請求項1ないし5の何れか一項に記載の抗体。
- 抗体断片である、請求項1ないし6の何れか一項に記載の抗体。
- キメラ抗体、またはヒト化抗体である、請求項1ないし7の何れか一項に記載の抗体。
- 受託番号:NITE BP-1367または受託番号:NITE BP-1366で寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体。
- 請求項9に記載の抗体由来の、黄色ブドウ球菌と結合することのできる、抗体断片、キメラ抗体、またはヒト化抗体。
- 抗菌物質とコンジュゲートした請求項1ないし10の何れか一項に記載の抗体であって、抗体が抗菌物質とコンジュゲートした状態の抗体全体である、抗体。
- 前記抗菌物質が、抗生剤、合成抗菌剤、溶菌酵素または抗菌ペプチドである請求項11に記載の抗体。
- 請求項1ないし10の何れか一項に記載の抗体をコードする核酸。
- 請求項13に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項14に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項15に記載の宿主細胞を、前記核酸が前記抗体を発現する条件下で培養することを含む前記抗体の製造方法。
- 請求項1ないし12の何れか一項に記載の抗体を含む組成物。
- 請求項2または3に記載の抗体と請求項4または5に記載の抗体とを含む組成物。
- (a)容器;
(b)パッケージ挿入物および/または前記容器上のラベル;および
(c)前記容器内に収容された請求項17または18に記載の組成物を含んでなり、パッケージ挿入物および/または前記容器上のラベルの少なくとも一つの当該組成物がブドウ球菌感染症の治療または予防に使用できることを表示する製造品。 - 請求項1ないし12の何れか一項に記載の抗体あるいは請求項17または18に記載の組成物を含む、ブドウ球菌感染症の治療または予防のための医薬。
- 請求項2または3に記載の抗体と請求項4または5に記載の抗体とが併用して用いられる、請求項20に記載の医薬。
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