KR20100021577A

KR20100021577A - 에스.아우레우스 ＯＲＦ0657ｎ을 표적화하는 항원 결합 단백질

Info

Publication number: KR20100021577A
Application number: KR1020097024900A
Authority: KR
Inventors: 아날리사 에스. 앤더슨; 데스몬드 제이. 클라크; 지챵 안; 푸바오 왕; 수잔 엘. 세코어; 에버하르트 두르; 레슬리 디. 코프; 테시 맥닐리
Original assignee: 머크 앤드 캄파니 인코포레이티드
Priority date: 2007-05-31
Filing date: 2008-05-29
Publication date: 2010-02-25
Also published as: US20100166772A1; WO2009029132A2; IL201906A0; CN101679516B; CA2687681A1; CN101679516A; EP2164869A2; MX2009012891A; AU2008294038A1; WO2009029132A3; BRPI0811193A2; JP2010528607A; RU2009149294A

Abstract

본 발명은 에스.아우레우스(S. aureus) 감염에 대한 방어를 제공하기 위해 표적화될 수 있는 에피토프를 보유하는 것으로 밝혀진 영역에 결합하는 항원 결합 단백질을 특징으로 한다. 상기 영역은 "CS-D7" 표적 영역이라 본원에서 명명하고 있다. CS-D7 표적 영역은 에스.아우레우스 감염의 가능성 또는 중증도를 경감시키기 위해 표적화될 수 있는 에스.아우레우스 ORF0657n 에피토프를 제공한다.

스타필로코커스 아우레우스 감염, 항원 결합 단백질, ORF0657n, 항체

Description

에스.아우레우스 ＯＲＦ0657ｎ을 표적화하는 항원 결합 단백질{Antigen-binding proteins targeting S. aureus ORF0657n}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 본 발명에 참고인용되는 2007년 5월 31일에 출원된 미국 임시출원번호 60/932,788 및 2007년 12월 17일에 출원에 미국 임시출원번호 61/007,998의 우선권을 주장하는 출원이다.

본 출원을 통해 인용된 참고 문헌들은 본 발명에 대한 선행 기술임을 인정하는 것은 아니다.

스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(S. aureus)는 다양한 질환과 병태에 원인인 병원균이다. 에스.아우레우스에 의해 유발된 질환 및 병태의 예로는 세균혈증, 감염 심내막염, 모낭염, 종기, 큰 종기, 농가진, 물집 농가진, 연조직염, 포도균증, 독성 쇼크 증후군, 열상 피부 증후군, 중추신경계 감염, 감염성 및 염증성 안질환, 골수염, 및 기타 관절과 뼈의 감염, 및 기도 감염이 포함된다(The Staphylococci in Human Disease, Crossley and Archer(eds.), Churchill Livingstone Inc. 1997).

면역학 기반 전략은 에스.아우레우스 감염 및 에스.아우레우스의 전파를 통제하는데 이용될 수 있다. 면역학 기반 전략은 수동 및 능동 면역을 포함한다. 수동 면역은 에스.아우레우스를 표적화하는 면역글로불린을 이용한다. 능동 면역은 에스.아우레우스에 대하여 면역 반응을 유도한다.

발명의 개요

본 발명은 에스.아우레우스 감염을 방어하기 위해 표적화될 수 있는 에피토프를 보유하는 것으로 발견된 영역에 결합하는 항원 결합 단백질을 특징으로 한다. 이 영역은 본 명세서에서 "CS-D7" 표적 영역으로 명명되고 있다. CS-D7 표적 영역은 에스.아우레우스 감염의 가능성 또는 중증도를 감소시키기 위해 표적화될 수 있는 에스.아우레우스 ORF0657n 에피토프를 제공한다.

따라서, 본 발명의 제1 관점은 CS-D7 표적 영역에 결합하는 제1 가변 영역 및 제2 가변 영역을 포함하는 분리된 항원 결합 단백질을 특징으로 한다. 이 CS-D7 표적 영역은 모노클로날 항체 CS-D7(mAb CS-D7)에 의해서 특이적으로 표적화된다. mAb CS-D7은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진 2개의 경쇄와 서열번호 2의 아미노산 서열을 가진 2개의 중쇄를 보유하는 면역글로불린이다.

"분리된"이라는 언급은 자연에서 발견되는 것과 상이한 형태를 나타낸다. 상이한 형태는 예컨대 자연에서 발견되는 것과 다른 순도 및/또는 자연에서 발견되지 않는 구조일 수 있다. 자연에서 발견되지 않는 구조는 다른 영역이 함께 조합된 재조합 구조, 예컨대 하나 이상의 쥐 상보성 결정 영역이 사람 프레임워크 스캐폴드 에 삽입된 사람화된 항체, 또는 사람 항체의 표면 잔기와 유사하도록 재포장된 쥐 항체, 항원 결합 단백질 유래의 하나 이상의 상보성 결정 영역이 다른 프레임워크 스캐폴드에 삽입된 하이브리드 항체, 및 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 암호화하는 유전자가 무작위로 함께 조합된 자연의 사람 서열 유래의 항체를 포함한다.

분리된 단백질은 혈청 단백질이 실질적으로 없는 것이 바람직하다. 혈청 단백질이 실질적으로 없는 단백질은 혈청 단백질이 대부분 또는 전부 결여된 환경에 존재한다.

"가변 영역"은 중쇄 또는 경쇄 유래의 항체 가변 영역의 구조를 갖고 있다. 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 프레임워크 위에 서로 공간을 둔 3개의 상보성 결정 영역을 함유한다. 상보성 결정 영역은 주로 특정 에피토프 인식을 담당한다.

표적 영역은 mAb CS-D7에 의해 결합된 ORF0657n 영역(서열번호 47)에 관하여 정의된다. CS-D7 표적 영역에 결합하는 단백질은, 과량 및 동량의 경쟁 단백질과 모노클로날 항체가 루미넥스(Luminex) 기반의 저해 분석에 이용될 때 ORF0657n에 대한 mAb CS-D7의 결합을 적어도 약 20%, 바람직하게는 적어도 약 50% 감소시킨다.

"단백질"에 대한 언급은 연속적 아미노산 서열을 나타내며, 최소 또는 최대 크기 제한을 나타내지 않는다. 단백질에 존재하는 하나 이상의 아미노산은 해독후 변형, 예컨대 글리코실화 또는 이황화 결합 형성을 함유할 수 있다.

바람직한 항원 결합 단백질은 모노클로날 항체이다. "모노클로날 항체"에 대한 언급은 동일한 또는 거의 동일한 구조를 가진 항체의 수집물을 나타낸다. 이 항체들이 동일한 작제물(들)로부터 생산되었을 때 일어날 수 있는 것이 항체의 변이 이다.

모노클로날 항체는 예를 들어 항체를 암호화하는 하나 이상의 재조합 유전자를 함유하는 재조합 세포 및 특정 하이브리도마로부터 생산될 수 있다. 항체는 하나의 유전자가 중쇄를 암호화하고 하나의 유전자가 경쇄를 암호화하는 것과 같이, 하나보다 많은 재조합 유전자에 의해 암호화될 수 있다.

본 발명의 다른 관점은 CS-D7 표적 영역에 결합하는, 항원 결합 단백질 V_h 영역 또는 V_l 영역 중 어느 하나 또는 둘 모두를 암호화하는 하나 또는 그 이상의 재조합 유전자를 함유하는 핵산에 관한 것이다. 하나의 유전자가 V_h 영역을 함유하는 항체 중쇄 또는 이의 단편을 암호화하고 다른 유전자가 V_l 영역을 함유하는 항체 경쇄 또는 이의 단편을 암호화하는 것과 같이 다중 재조합 유전자가 유용하다.

재조합 유전자는 적당한 전사 및 프로세싱을 위한 조절 인자(해독 인자 및 해독후 인자를 포함할 수 있다)와 함께 단백질을 암호화하는 재조합 핵산을 함유한다. 재조합 핵산은 그 서열 및/또는 형태 면에서 자연에는 없는 것이다. 재조합 핵산의 예는 정제된 핵산, 자연에서 발견되는 것과 다른 핵산을 제공하는 함께 조합된 2 이상의 핵산 영역, 및 서로 자연에서 결합되어 있는 하나 이상의 핵산 영역(예, 상류 또는 하류 영역)의 부재를 포함한다.

본 발명의 또 다른 관점은 항원 결합 단백질 V_h 영역 및 V_l 영역 중 어느 하나 또는 둘 모두를 암호화하는 하나 이상의 재조합 유전자를 함유하는 재조합 세포 를 특징으로 한다. 재조합 세포는 V_h 및 V_l 영역을 모두 발현하는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 관점은 항체가변영역을 포함하는 단백질 생산방법을 포함한다. 이 방법은 (a) 단백질이 발현되는 조건 하에서 단백질을 암호화하는 재조합 핵산을 함유하는 재조합 세포를 성장시키는 단계; 및 (b) 단백질을 정제하는 단계를 포함한다. 단백질은 완전한 항원 결합 단백질인 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 관점은 약제학적 조성물에 관한 것이다. 이 조성물은 본 명세서에 기술된 치료학적 유효량의 항원 결합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유한다.

치료학적 유효량은 유용한 치료 또는 예방 효과를 제공하기에 충분한 양이다. 에스.아우레우스에 감염된 환자의 경우, 유효량은 다음 효과, 즉 에스.아우레우스가 환자에서 전파하는 능력의 감소 또는 환자에 존재하는 에스.아우레우스 양의 감소 중 하나 이상을 달성하기에 충분한 양이다. 에스.아우레우스로 감염되지 않은 환자의 경우, 유효량은 에스.아우레우스 감염에 대한 감수성 저하 또는 만성 질환의 지속적인 감염을 확립시키는 감염균의 능력 저하 중 하나 이상을 달성하기에 충분한 양이다.

본 발명의 다른 관점은 에스.아우레우스 감염에 대한 치료용(치료요법적 또는 예방요법적) 약제의 제조에 사용되는 치료학적 유효량의 항원 결합 단백질의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 다른 관점은 에스.아우레우스 감염에 대하여 환자를 치료하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 본 명세서에 기술된 항원 결합 단백질의 유효량, 예컨대 이의 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 치료받는 환자는 에스.아우레우스에 감염되거나 감염되지 않을 수 있다. 환자는 사람인 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 관점은 서열번호 47의 아미노산 42 내지 342와 적어도 95% 서열 동일성이 있는 아미노산 서열을 함유하고 길이가 아미노산 350개 이하인 폴리펩타이드를 특징으로 한다.

"포함한다"와 같이 개방형 용어에 대한 언급은 추가 요소 또는 단계를 허용한다. 경우에 따라, 개방형 용어와 함께 또는 이 용어없이 사용된 "하나 이상"과 같은 어구는 추가 요소 또는 단계의 가능성을 강조하는 것이다.

분명한 언급이 없는 한, 단수적 표현의 용어에 대한 언급은 하나에 제한되는 것이 아니다. 예를 들어, "세포"는 "세포들"을 배제하는 것이 아니다. 경우에 따라, 하나 이상과 같은 어구는 복수의 존재 가능성을 강조하기 위해 사용된다.

본 발명의 다른 특징 및 장점은 본원에 제공된 추가 설명, 예컨대 여러 실시예들로부터 분명해진다. 제공된 실시예들은 본 발명을 실시하는데 유용한 여러 요소와 방법론을 예시한 것이다. 실시예는 청구된 본 발명을 제한하지 않는다. 본 명세서에 입각하여, 당업자는 본 발명의 실시에 유용한 여타 요소와 방법론을 확인하고 이용할 수 있다.

도 1은 IgG 분자의 구조를 예시한 것이다. "V_l"은 경쇄 가변 영역을 의미한 다. "V_h"는 중쇄 가변 영역을 의미한다. "C_l"은 경쇄 불변 영역을 의미한다. "CH₁", "CH₂" 및 "CH₃"은 중쇄 불변 영역이다. 점선은 이황화 결합을 나타낸다.

도 2는 mAb CS-D7 경쇄 가변 영역(서열번호 1의 아미노산 1-108), mAb CS-E11 경쇄 가변 영역(서열번호 3), mAb CS-D10 경쇄 가변 영역(서열번호 5), mAb CS-A10 경쇄 가변 영역(서열번호 7), mAb BMV-H11 경쇄 가변 영역(서열번호 9), mAb BMV-E6 경쇄 가변 영역(서열번호 11), mAb BMV-D4 경쇄 가변 영역(서열번호 13), 및 mAb BMV-C2 경쇄 가변 영역(서열번호 15)의 서열 비교를 제공한다. 상보성 결정 영역 1, 2 및 3은 진하게 표시했고, 다른 CDR 서열을 나타내는 서열번호도 표시되어 있다.

도 3은 mAb CS-D7 중쇄 가변 영역(서열번호 2의 아미노산 1-126), mAb CS-E11 중쇄 가변 영역(서열번호 4), mAb CS-D10 중쇄 가변 영역(서열번호 6), mAb CS-A10 중쇄 가변 영역(서열번호 8), mAb BMV-H11 중쇄 가변 영역(서열번호 10), mAb BMV-E6 중쇄 가변 영역(서열번호 12), mAb BMV-D4 중쇄 가변 영역(서열번호 14), 및 mAb BMV-C2 중쇄 가변 영역(서열번호 16)의 서열 비교를 제공한다. 상보성 결정 영역 1, 2 및 3은 진하게 표시했고, 다른 CDR 서열을 나타내는 서열번호도 표시되어 있다.

도 4는 옵소닌포식작용 활성(OPA) 분석을 이용하여 에스.아우레우스에 대한 방어 효과를 제공하는 mAb CS-D7의 능력을 예시한 것이다.

도 5는 옵소닌포식작용 활성(OPA) 분석을 이용하여 에스.아우레우스에 대한 방어 효과를 제공하는 mAb CS-D10의 능력을 예시한 것이다.

도 6은 에스.아우레우스 세균혈증을 경감시키는 mAb CS-D7의 능력을 예시한 것이다.

본 명세서에 기술된 항원 결합 단백질은 CS-D7 표적 영역에 결합하는 능력으로 인해, 예컨대 ORF0657n 기반 항원의 생산, 특성규명 또는 연구에 도구로서 및/또는 에스.아우레우스 감염을 치료하는 제제로서 사용될 수 있다. ORF0657n은 에스.아우레우스 외막에 위치한 에스.아우레우스 단백질이다. ORF0657n은 에스.아우레우스의 여러 균주에서 잘 보존되고 있는 것으로 발견되었다(Anderson et al., 국제공개번호 WO 2005/009379, 국제공개일자 2005년 2월 3일). 여러 ORF0657n 유도체들은 에스.아우레우스 감염에 대한 방어 면역 반응을 생산하기 위해 사용될 수 있다(Anderson et al., 국제공개번호 WO 2005/009379, 국제공개일자 2005년 2월 3일).

I. 항원 결합 단백질

항원 결합 단백질은 에피토프에 대한 특이적인 결합을 제공하는 항체 가변 영역을 함유한다. 항체 가변 영역은 예를 들어 완전한 항체, 항체단편 및 항체 또는 항체 단편의 재조합 유도체에 존재할 수 있다.

다른 유형의 항체는 구조가 다르다. 다른 항체 영역은 IgG를 참조로 하여 예시할 수 있다(도 1). IgG 분자는 4개의 아미노산 사슬, 즉 2개의 긴 중쇄 및 2개의 짧은 경쇄를 포함한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 불변 영역과 가변 영역을 포함한다. 가변 영역 내에는 항원 특이성을 담당하는 3개의 과가변 영역이 존재한다(예컨대, Breitling et al., Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, Inc. and Spektrum Akademischer Verlag, 1999; 및 Lewin, Genes IV, Oxford University Press and Cell Press, 1990).

과가변 영역(상보성 결정 영역이라고도 함)은 더욱 보존적인 인접 영역(프레임워크 영역이라고도 함) 사이에 중재되어 있다. 프레임워크 영역 및 상보성 결정 영역(CDR)과 관련된 아미노산은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991]에 기술된 바와 같이 번호가 매겨지고 정렬될 수 있다.

2개의 중쇄 카르복실 영역은 Fc 영역을 생성하기 위해 이황화결합에 의해 연결된 불변 영역이다. Fc 영역은 효과기 기능을 제공하는데 중요하다(Presta, Advanced Drug Delivery Riviews 58: 640-656, 2006). Fc 영역을 구성하는 2개의 중쇄는 각각 힌지(hinge) 영역을 통해 다른 Fab 영역으로 연장된다.

고등 척추동물에는 2가지 유형의 경쇄와 5가지 유형의 중쇄가 있다. 경쇄는 κ 또는 λ이다. 중쇄는 항체 유형을 한정하고, α, δ, ε, γ 또는 μ이다. 예를 들어, IgG는 γ 중쇄를 보유한다. 또한, 아형은 사람 γ₁, γ₂, γ₃ 및 γ₄와 같이 다른 종류의 중쇄가 존재한다. 중쇄는 힌지 및 테일 영역에 독특한 입체형태를 부여한다(Lewin, Genes IV, Oxford University Press and Cell Press, 1990).

항체 가변 영역을 함유하는 항체 단편은 Fv, Fab 및 Fab₂ 영역을 포함한다. 각 Fab 영역은 가변 영역과 불변 영역으로 구성된 경쇄 및 가변 영역과 불변 영역을 함유하는 중쇄 영역을 포함한다. 경쇄는 불변 영역을 통해 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결된다. Fab 영역의 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 항원 결합에 참여하는 Fv 영역을 제공한다.

항체 가변 영역은 재조합 유도체로 존재할 수 있다. 재조합 유도체의 예로는 단일쇄 항체, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody) 및 미니항체(miniantibody)를 포함한다(Kipriyanov et al., Molecular Biotechnology 26: 39-60, 2004).

항원 결합 단백질은 동일 에피토프 또는 다른 에피토프를 인식하는 하나 또는 그 이상의 가변 영역을 함유할 수 있다(Kipriyanov et al., Molecular Biotechnology 26: 39-60, 2004).

II. CS-D7 표적 영역에 지향성인 항원 결합 단백질의 생성

CS-D7 표적 영역에 지향성인 항원 결합 단백질은 여러가지 기술로 수득할 수 있는데, 예컨대 CS-D7 표적 영역에 결합하는 항원 결합 단백질을 이용하는 기술 및 표적 영역에 결합하는 다른 결합 단백질을 선별하는 기술이 있다. CS-D7 표적 영역에 결합하는 항체의 능력은 루미넥스 분석과 mAb CS-D7을 이용하여 평가할 수 있다(이하 실시예 2 참조). CS-D7 표적 영역에 결합하는 항원 결합 단백질은 다른 결합 단백질을 수득하기 위해, 항원 결합 단백질로부터 서열 정보를 이용하는 방법 및/또는 항원 결합 단백질을 변형시키는 방법과 같은 여러 방법에 사용될 수 있다.

II.A. 가변 영역 설계

항원 결합 단백질의 가변 영역은 CS-D7 표적 영역에 결합하고 있는 가변 영역을 기초로 하여 설계할 수 있다. 루미넥스 분석에 기초하여, CS-D7, CS-E11, CS-D10, CS-A10, BMV-H11, BMV-E6, BMV-D4 및 BMV-C2로 명명한 mAb가 동일한 영역에 결합하는 것을 발견했다. 도 2는 이러한 여러 항체들의 경쇄 가변 영역들을 서열 비교한 것이다. 도 3은 이러한 여러 항체들의 다른 중쇄 가변 영역들을 서열 비교한 것이다.

도 2와 3의 서열 비교는 항원 결합 단백질의 여러 가변 영역 CDR 및 프레임워크 서열의 예를 제공한다. 도 2와 3에 예시된 항체가변영역은 말초혈액 림프구 라이브러리("BMV"라 명명) 또는 비장 림프구("CS"라 명명)에서 유래되었다.

CDR은 특정 에피토프에 대한 결합을 주로 담당한다. 특정 CDR 내에는, 에피토프에 대한 결합에 더욱 중요한 몇몇 특이성 결정 잔기(SDR)가 있다(Kashmiri et al., Methods 36: 25-34, 2005, Presta, Advanced Drug Delivery Reviews 58: 640-656, 2006). SDR은 예컨대 항원-항체 3차원 구조의 도움과 항체 조합 부위의 돌연변이 분석을 통해 확인할 수 있다(Kashmiri et al., Methods 36: 25-34, 2005).

프레임워크 영역은 전체 구조의 제공에 도움을 주고 CDR보다 다른 아미노산 변형들에 더욱 내성이다. 다양한 여러 자연발생의 프레임워크 영역은 당업계에 공지되어 있다(예컨대, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991).

mAb CS-D7, CS-E11, CS-D10, CS-A10, BMV-H11, BMV-E6, BMV-D4 및 BMV-C2의 가변 영역과 대응하는 CDR 서열번호는 도 2 및 3 서열 비교에 표시되어 있다. 표 1은 CDR 서열번호를 정리한 것이다.

도 2와 3에 예시된 서열 비교는 프레임워크 및 CDR 영역 내에 존재하는 여러 아미노산 치환의 예를 제공한다. 프레임워크 영역과 CDR 모두에는 CS-D7 결합 영역에 대한 특이성을 유지하는 변경이 이루어질 수 있다.

II.B. 다른 결합 단백질 선별

CS-D7 표적 영역을 표적화하는 다른 결합 단백질은 전체 길이의 ORF0657n 또는 mAb CS-D7에 의해 인식되는 에피토프를 제공하는 폴리펩타이드를 이용하여 수득할 수 있다. CS-D7 표적 영역은 ORF0657n의 대략 아미노산 42-342 내에 위치하는 것으로 나타난다(서열번호 47).

다양한 기술은 항원을 인식하는 단백질을 선택하는데 이용할 수 있다. 이러한 기술의 예로는 파지 디스플레이 기술 및 하이브리도마 생산의 이용이 포함된다. 사람 항체는 사람 파지 디스플레이 라이브러리를 출발물질로 사용하거나 또는 키메라 마우스, 예컨대 XenoMouse 또는 Trans-Chromo 마우스를 이용해서 생산할 수 있다(예, Azzazy et al., Clinical Biochemistry 35: 425-445, 2002, Berger et al., Am. J. Med. Sci. 324(1): 14-40, 2002).

또한, 비-사람 항체, 예컨대 쥐 항체도 수득할 수 있다. 사람 항-마우스 항체의 잠재적 발생은 쥐 항체 사람화, 면역제거(de-immunization) 및 키메라 항체 생산과 같은 기술을 이용해서 감소시킬 수 있다(O'Brien et al., Humanization of Monoclonal Antibodies by CDR Grafting, p 81-100, From Methods in Molecular Biology Vol. 207: Recombinant antibodies for Cancer Therapy: Methods and Protocols (Eds. Welschof and Krauss) Humana Press, Totowa, New Jersey, 2003; Kipriyanov et al., Molecular Biotechnology 25:39-60, 2004; Gonzales et al., Tumor Biol. 26:31-43, 2005, Presta, Advanced Drug Delivery Reviews 58:640-656, 2006, Tsurushita et al., Methods 35:69-83, 2005, Roque et al., Biotechnol. Prog. 20:639-654, 2004).

친화도 성숙과 같은 기술은 표적에 선택적으로 결합하는 항원 결합 단백질의 능력을 더욱 증강시키기 위해 사용될 수 있다. 친화도 성숙은 예를 들어 CDR 영역에 돌연변이를 도입시키고 이 돌연변이가 결합시에 미치는 효과를 측정함으로써 수행할 수 있다, 돌연변이의 도입에는 여러 기술들이 이용될 수 있다(Rajpal et al., PNAS 102:8466-8471, 2005, Presta, Advanced Drug Delivery Reviews 58:640-656, 2006).

II.C. 추가 성분

항원 결합 단백질은 가변 영역 외에 다른 성분 또는 유용한 활성을 제공하거나 유용한 활성을 제공하는 것을 돕는 추가 가변 영역을 비롯하여, 이에 국한되지 않는 추가 성분을 포함할 수 있다. 유용한 활성은 항체 의존적인 세포의 세포독성, 포식작용, 보체 의존적 세포독성 및 반감기/제거율과 같은 항체 효과기 기능을 포함한다(Presta, Advanced Drug Delivery Reviews 58:640-656, 2006). 다른 유용한 활성으로는, 결합 단백질에 의해 에스.아우레우스로 전달될 수 있는 독성 그룹의 사용 및 CS-D7 표적 영역을 표적화하는 제1 항원 결합 단백질의 안정성 또는 활성을 증강시키는, 숙주 또는 이종 항원을 표적화하는 제2 항원 결합 단백질의 사용을 포함한다.

항체 효과기 기능은 여러 숙주 성분, 예컨대 Fcγ 수용체, 신생 Fc 수용체(FcRn) 및 C1q 등에 의해 매개된다(Presta, Advanced Drug Delivery Reviews 58:640-656, 2006, Satoh et al., Expert Opin. Biol Ther. 5:1161-1173, 2006). 다른 종류의 항체 성분 또는 변경은 효과기 기능을 증강시키는데 사용될 수 있다. 유용한 성분 또는 변경의 예로는 비-푸코실화된 올리고사카라이드, FcRn에 대한 결합능이 증강된 아미노산, 및 Fcγ 수용체에 대한 결합능이 증강된 아미노산 변경의 사용을 포함한다(Presta, Advanced Drug Delivery Reviews 58:640-656, 2006; Satoh et al., Expert Opin. Biol Ther. 6:1161-1173, 2006; Lazar et al., U.S. Patent Application Publication US 2004/0132101; Shields et al., The Journal of Biological Chemistry 276:6591-6604, 2001; Dall'Acqua et al., The Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524, 2006).

본 발명의 한 양태에서, CS-D7 표적 영역을 표적화하는 항원 결합 단백질은 이중특이성이다. CS-D7을 표적화하는 이중특이성 항원 결합 단백질은 제1 영역이 CS-D7 표적 부위를 표적화하고 제2 영역이 다른 에피토프를 표적화하는 2 이상의 결합 영역을 함유한다. 추가 영역이 존재할 수도 있다. 이중특이성 항원 결합 단백질의 일반적인 형의 예는 이중특이성 항체 및 이종중합체를 포함하고, 이 둘은 모두 2가, 3가, 4가 등과 같이 다가로 제공될 수 있다.

한 양태에서, 이중특이성 항원 결합 단백질은 이중특이성 항체이다(예컨대, Marvin and Zhu, Acta Pharmacologica Sinica 25:649-658, 2005; Zuo et al., Protein Engineering 13:361-367, 2000; Ridgway et al., Protein Engineering 9:617-621, 1996; Alt et al., FEBS Letters 454:90-94, 1999; Carter, J. Immunol. Methods 248:7-15, 2001 참조). 추가의 양태에서, CS-D7 표적 영역을 표적화하는 이중특이성 항체는 숙주 또는 이종 항원을 표적화한다. 숙주 항원은 예를 들어 안정성 또는 활성을 증가시키기 위해 표적화될 수 있다. 이중특이성 항체와 관련와 관련된 여러 양태들의 예로는, 항체 효과기 기능을 매개할 수 있는 Fc 또는 변형 Fc 도메인을 함유하는 이중특이성 항체; 2가, 3가 또는 4가인 이중특이성 항체; 및 C3b 유사 수용체 또는 다른 이종 항원, 예컨대 생체내 감염동안 세균 표면에서 발현되는 에스.아우레우스 또는 에스.에피더미디스(S. epidermidis) 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 단백질을 함유하는 이중특이성 항체의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다(예컨대, LTA, capsule; O'Riordan and Lee, Clin. Micro. Rev. 17:218-234, 2004; Lees A., KoKai-kun J., LopezAcosta A., Acevedo J., Mond J. 2005. Lipotechoic Acid Conjugate Vaccine for Staphylococcus [abstract]. In: 8th Annual Conference on Vaccine Research; 2005 May 8-11; Baltimore. Sl:p.58; Fischer et al., 미국 특허 6,610,293; Stinson et al., 미국 특허 7,250,494 참조).

다른 양태에서, CS-D7 표적 영역을 표적화하는 이중특이성 항원 결합 단백질은 숙주 또는 이종항원을 표적화하는 제2 항원 결합 단백질과의 이종중합체 복합체 내에 포함될 수 있다. 숙주 항원은 항원 결합 단백질의 안정성 또는 활성을 증강시키도록 표적화될 수 있다. 다른 양태들의 예로는, 항체 효과기 기능을 매개할 수 있는 Fc 또는 변형 Fc 도메인을 함유하는 이종중합체; 2가, 3가 또는 4가인 이종중합체; 및 C3b 유사 수용체 또는 다른 이종 항원, 예컨대 생체내 감염동안 세균 표면에서 발현되는 에스.아우레우스 또는 에스.에피더미디스 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 단백질을 함유하는 이종중합체의 임의의 조합을 포함한다. 이종중합체성 복합체를 형성하도록 2개의 항체를 화학적 가교시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다(Taylor et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA 88:3305-3309, 1991; Powers et al., Infection and Immunity 63:1329-1335, 1995).

적혈구의 C3b 유사 수용체의 표적화는 혈류로부터 병원균을 제거하는데 도움을 줄 수 있다(Lindorfer et al., Immunological Reviews 183:10-24, 2001; Mohamed et al., Current Opinion in Molecular Therapeutics 7:144-150, 2005). 영장류에 존재하는 C3b 유사 수용체는 다른 포유동물에서 CR1 또는 CD35 및 제II형 인자로 알려져 있다. 정상 면역 부착 조건 하에서, 병원균에 특이적으로 결합하는 항체와 공동으로 병원균을 함유하는 면역복합체("IC")는 보체 단백질(예, C3b, C4b)에 의해 태그화되고, 이 보체 단백질은 이후 적혈구세포("RBC") 상의 CR1에 결합한다. RBC는 Fc 수용체(즉, FcγR)를 발현하는 식세포(예, 대식세포)로 IC를 전달하고, IC의 Fc 부와 세포 표면 상의 Fc 수용체 간의 상호작용을 통해 상기 IC를 식세포의 세포로 전이시킨다. IC는 그 다음 식세포에 의해 파괴되고 RBC는 혈행으로 복귀한다. 하나의 항원 결합 단백질이 CR1에 특이적인 이중특이성 항원 결합 단백질 복합체를 함유하는 이종중합체는, 항-CR1 항체가 CR1의 자연 리간드인 C3b의 대용물로 작용하기 때문에 보체 캐스캐이드를 활성화시켜야 하는 필요성을 없애준다. 이는 목표 제거율을 위한 자연 면역 부착 과정의 효능을 향상시킬 수 있다.

추가 양태에서, 이중특이성 항체 또는 이종중합체는 CS-D7 표적 영역과 CR1을 모두 표적으로 하고, 추가로 Fc 불변 영역을 함유한다. 이러한 양태에서 이종중합체는 2개의 다른 항체를 함유하며, 이 항체 중 어느 하나 또는 둘 모두는 Fc 불변 영역을 보유한다. 본 발명의 한 양태에서, 이종중합체의 항-CR1 항체는 마우스 CR1에 특이적으로 결합한다. 제2 양태에서, 항-CR1 항체는 사람 CR1에 특이적으로 결합한다. CR1 특이적 항체는 당업계에 공지되어 있다(예컨대, Nickells et al., Clin. Exp. Immunol. 112: 27-33, 1998).

본 발명의 다른 양태에서, CS-D7 표적 영역을 표적화하는 항원 결합 단백질은 약리학적으로 유의적인 이점을 제공하는 항원 결합 단백질의 이화학적 성질을 변경시키는 추가 성분을 포함한다. 예를 들어, 분자에 폴리에틸렌 글리콜("PEG")의 부착은 치료제로서 사용될 때 상기 분자의 안전성 및 효능을 향상시키는데 도움을 줄 수 있다. 이화학적 변경으로는, 치료제의 전신 체류를 증가시키기 위해 함께 작용할 수 있는 소수성, 정전기적 결합 및 입체형태의 변화를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, PEG 부분을 부착시켜 항원 결합 단백질의 분자량을 증가시킴으로써 수득되는 약리학적 이점은 혈행 수명의 연장, 안정성 증가 및 숙주 프로테아제로부터의 보호 증강도 포함한다. PEG 부착은 또한 세포 수용체에 대한 치료제 부분의 결합 친화도에 영향을 미칠 수도 있다. PEG는 분자량 범위가 400 내지 15,000 초과(예컨대, 분자량 400,000 이하의 PEG 중합체를 시중에서 입수할 수 있다)인 중합체를 제조하기 위해 반복 단위(-O-CH₂-CH₂-)로 구성된 비이온성 중합체이다.

II.D. 다른 양태들의 예

CS-D7 표적 영역을 표적화하는 항원 결합 단백질은 표적 영역에 각각 결합하는 제1 가변 영역과 제2 가변 영역을 포함한다. 본 명세서에 제공된 지시를 기초로 하여, 다른 CDR과 프레임워크 아미노산을 보유하는, CS-D7 표적 영역을 표적화하는 항원 결합 단백질이 생산될 수 있다. 힌지 영역, Fc 영역, 독성 부분 및/또는 추가 항원 결합 단백질 또는 결합영역(예, 상기 II.C. 부분 참고)과 같은 추가 성분이 존재할 수도 있다.

항원 결합 단백질에 관한 제1 양태에서, 제1 가변 영역은 다음 CDR 중 어느 하나, 둘 또는 셋 모두를 포함하는 V_h 영역이다:

서열번호 46 또는 서열번호 46과 하나의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는 제1 V_h CDR; 서열번호 46은 서열번호 35와 40을 기초로 한다. 서열번호 46은 아미노산 서열 GGSIX¹SSSYYWG를 보유하고, 여기서 X¹은 임의의 아미노산이다. X¹은 세린 또는 아르기닌인 것이 바람직하다;

서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43 또는 서열번호 44, 또는 서열번호 36, 38, 39, 41, 43 또는 44와 하나의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는 제2 V_h CDR; 제2 V_h CDR은 서열번호 36, 38, 39, 41, 43 또는 44를 포함하는 것이 바람직하다; 및

서열번호 37, 서열번호 42 또는 서열번호 45, 또는 서열번호 37, 42 또는 45와 하나의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는 제3 V_h CDR; 제3 V_h CDR은 서열번호 37, 42 또는 45를 포함한다.

V_h 영역은 제1 V_h CDR(CDR1), 제2 V_h CDR(CDR2) 및 제3 V_h CDR(CDR3)을 포함하는 것이 바람직하다.

제2 양태에서, 제1 가변 영역은 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 제1, 제2 및 제3 CDR을 포함하는 V_h 영역이다:

a) 서열번호 35, 서열번호 36 및 서열번호 37 각각;

b) 서열번호 35, 서열번호 38 및 서열번호 37 각각;

c) 서열번호 35, 서열번호 39 및 서열번호 37 각각;

d) 서열번호 40, 서열번호 41 및 서열번호 42 각각;

e) 서열번호 40, 서열번호 43 및 서열번호 45 각각; 및

f) 서열번호 40, 서열번호 44 및 서열번호 42 각각.

또 다른 양태에서, 제1 가변 영역은 서열번호 35를 포함하는 제1 V_h CDR, 서열번호 36을 포함하는 제2 V_h CDR 및 서열번호 37을 포함하는 제3 V_h CDR을 포함하는 V_h 영역이다.

제3 양태에서, 제2 가변 영역은 다음 CDR 중 어느 하나, 둘 또는 셋 모두를 포함하는 V_l 영역이다:

서열번호 17, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 26, 서열번호 29 또는 서열번호 32, 또는 서열번호 17, 20, 23, 26, 29 또는 32와 하나의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는 제1 V_l CDR; 제1 V_l CDR은 서열번호 17, 20, 23, 26, 29 또는 32를 포함하는 것이 바람직하다;

서열번호 18, 서열번호 21, 서열번호 24, 서열번호 27, 서열번호 30 또는 서열번호 33, 또는 서열번호 18, 21, 24, 27, 30 또는 33과 하나의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는 제2 V_l CDR; 제2 V_l CDR은 서열번호 18, 21, 24, 27, 30 또는 33을 포함하는 것이 바람직하다; 및

서열번호 19, 서열번호 22, 서열번호 25, 서열번호 28, 서열번호 31 또는 서열번호 34, 또는 서열번호 19, 22, 25, 28, 31 또는 34와 하나의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는 제3 V_l CDR; 제3 V_l CDR은 서열번호 19, 22, 25, 28, 31 또는 34를 포함하는 것이 바람직하다;

V_l 영역은 제1 V_l CDR(CDR1), 제2 V_l CDR(CDR2) 및 제3 V_l CDR(CDR3)을 포함하는 것이 바람직하다.

제4 양태에서, 제2 가변 영역은 다음으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 제1, 제2 및 제3 CDR을 포함하는 V_l 영역이다:

a) 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19 각각;

b) 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22 각각;

c) 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25 각각;

d) 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28 각각;

e) 서열번호 29, 서열번호 30 및 서열번호 31 각각; 및

f) 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34 각각.

추가 양태에서, 제1 가변 영역은 서열번호 17을 포함하는 제1 V_l CDR, 서열번호 18을 포함하는 제2 V_l CDR 및 서열번호 19를 포함하는 제3 V_l CDR을 포함하는 V_l 영역이다.

제5 양태에서, 결합 단백질은 제1 양태 또는 제2 양태에서 기술한 V_h 영역 및 제3 양태 또는 제4 양태에서 기술한 V_l 영역을 함유한다.

제6 양태에서, 항원 결합 단백질은 각각 제1, 제2 및 제3 CDR을 포함하는 V_h 영역과 V_l 영역을 함유하고, 이러한 제1, 제2 및 제3 V_h CDR 및 제1, 제2 및 제3 V_l CDR은 각각 다음 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다:

a) 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19;

b) 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22;

c) 서열번호 35, 서열번호 38, 서열번호 37, 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25;

d) 서열번호 35, 서열번호 39, 서열번호 37, 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28;

e) 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 29, 서열번호 30 및 서열번호 31;

f) 서열번호 40, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 29, 서열번호 30 및 서열번호 31;

g) 서열번호 40, 서열번호 44, 서열번호 42, 서열번호 29, 서열번호 30 및 서열번호 31;

h) 서열번호 40, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34; 및

여기서, 서열번호의 순서는 V_h CDR1, V_h CDR2, V_h CDR3, V_l CDR1, V_l CDR2 및 V_l CDR3에 대응한다. 다른 양태에서, V_h CDR1, V_h CDR2, V_h CDR3, V_l CDR1, V_l CDR2 및 V_l CDR3은 각각 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19를 포함한다.

제7 양태에서, 결합 단백질은 전술한 제1 양태 내지 제6 양태에 기술된 바와 같은 하나 이상의 가변 영역을 보유하는 항체이다. 또 다른 양태에서, 항체는 IgG이다.

제8 양태에서, 전술한 제1 양태 내지 제7 양태에 제공된 가변 영역은 mAb CS-D7, CS-E11, CS-D10, CS-A10, BMV-H11, BMV-E6, BMV-D4 및 BMV-C2 경쇄 또는 중쇄 프레임워크 중 적어도 하나와 적어도 90% 서열 동일성이 있는 프레임워크 영역을 보유한다(도 2 및 도 3 참조).

참조 서열에 대한 서열 동일성(동일 백분율이라고도 한다)은 서열을 참조서열과 정렬시키고, 대응 영역에 존재하는 동일한 아미노산 수를 계수함으로써 측정한다. 이 수를 참조 서열의 아미노산의 총 수(예컨대, 서열번호 1의 프레임워크 영역)으로 나눈 뒤, 100을 곱하여 가장 근접한 정수로 반올림한다. 서열 동일성은 다수의 당업계에 공인된 서열 비교 알고리듬 또는 육안 조사로 결정할 수 있다(일반적으로, Ausubel, F M, et al., Current Protocols in Molecular Biology, 4, John Wiley & Sons, Inc., Brooklyn, N.Y., A.1E.1-A.1F.11, 1996-2004 참조). 추가 양태에서, 서열 동일성은 mAb CS-D7, CS-E11, CS-D10, CS-A10, BMV-H11, BMV-E6, BMV-D4 및 BMV-C2 중 어느 하나의 프레임워크와 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일성이거나; mAb 프레임워크 중 어느 하나와 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산이 상이한 것이다.

제9 양태에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 서열번호 2의 아미노산 1-126, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14 및 서열번호 16으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 V_h 영역인 제1 가변 영역을 포함하는 항체이다. 추가의 양태에서, V_h 영역은 서열번호 2의 아미노산 1-126을 포함한다.

제10 양태에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 서열번호 1의 아미노산 1-108, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13 및 서열번호 15로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 V_l 영역인 제2 가변 영역을 포함하는 항체이다. 추가의 양태에서, V_l 영역은 서열번호 1의 아미노산 1-108을 포함한다.

제11 양태에서, 항원 결합 단백질은 다음을 포함하는 항체이다:

a) 서열번호 1의 아미노산 1-108을 포함하는 경쇄 가변(V_l) 영역 및 서열번호 2의 아미노산 1-126을 포함하는 중쇄 가변(V_h) 영역;

b) 서열번호 3을 포함하는 V_l 영역 및 서열번호 4를 포함하는 V_h 영역;

c) 서열번호 5를 포함하는 V_l 영역 및 서열번호 6을 포함하는 V_h 영역;

d) 서열번호 7을 포함하는 V_l 영역 및 서열번호 8을 포함하는 V_h 영역;

e) 서열번호 9를 포함하는 V_l 영역 및 서열번호 10을 포함하는 V_h 영역;

f) 서열번호 11을 포함하는 V_l 영역 및 서열번호 12를 포함하는 V_h 영역;

g) 서열번호 13을 포함하는 V_l 영역 및 서열번호 14를 포함하는 V_h 영역; 및

h) 서열번호 15를 포함하는 V_l 영역 및 서열번호 16을 포함하는 V_h 영역.

추가의 양태에서, V_h 영역은 서열번호 2의 아미노산 1-126을 포함하고 V_l 영역은 서열번호 1의 아미노산 1-108을 포함한다.

제12 양태에서, 결합 단백질은 상기 제7 양태 내지 상기 제11 양태에 기술된 항체로서, IgG₁, IgG₂, IgG₃ 또는 IgG₄ 아형 유래의 힌지, CH₁, CH₂ 및 CH₃ 영역을 포함하는 중쇄; 및 사람 카파 C_l 또는 사람 람다 C_l을 포함하는 경쇄를 포함한다. 추가의 양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다.

제13 양태에서, 결합 단백질은 경쇄가 서열번호 1을 포함하고 중쇄가 서열번호 2를 포함하는 항체이다.

제14 양태에서, 결합 단백질은 다음 중 하나 이상을 함유하는 상기 제7 양태 내지 제13 양태에 기술된 항체이다: 비푸코실화된 또는 실질적으로(즉, 존재하는 탄수화물의 몰 기준으로 10% 미만) 비푸코실화된 글리코실화 패턴; Fcγ 수용체 결합을 증강시키는 하나 이상의 아미노산 변경; 신생 Fc 수용체(FcRn) 결합을 증강시키는 하나 이상의 아미노산 변경; 및 C1q 결합을 증강시키는 하나 이상의 아미노산 변경.

제15 양태에서, 제1 양태 내지 제14 양태에 기술된 제시 영역(예, 가변 영역, CDR 영역, 프레임워크 영역)은 제시된 서열로 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어진다. 가변 영역, CDR 영역 또는 프레임워크 영역과 같은 영역에 관하여 "본질적으로 이루어진"에 대한 언급은 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단에서 하나 이상의 추가 아미노산의 존재 가능성을 시사하며, 이러한 아미노산은 표적에 대한 결합성을 유의적으로 저하시키지 않는 것이다.

제16 양태에서, 상기 제1 양태 내지 제15 양태에 기술된 항원 결합 단백질은 표적 항원에 대해 100 nM이하 또는 500pM 이하의 친화도 K_D를 제공하는 V_h 및 V_l 영역을 보유한다. 표적 항원에 대한 결합성은 실시예 8에 기술된 바와 같이 측정될 수 있다.

제17 양태에서, 상기 제1 양태 내지 제16 양태에 기술된 항원 결합 단백질은 적어도 하나 이상의 추가 성분, 예컨대 독성 부분, 항원 결합 단백질의 이화학적 및/또는 약리학적 성질을 증가시키는 분자(들) 및 제2 항원 결합 단백질(상기 섹션 II.C. 참조)을 비롯한, 이에 국한되지 않는 성분에 연결된다. 추가의 양태에서, 항원 결합 단백질은 제2 항원 결합 단백질(예, 항-CR1 항체)에 화학적으로 가교된 CS-D7 표적 영역을 표적화하는 항원 결합 단백질을 포함하는 이종중합체이다. 또 다른 양태에서, 항원 결합 단백질은 하나 이상의 PEG 부분을 보유한다.

다른 양태들에 기술된 아미노산 차이, 예컨대 서열 동일성에서 차이를 제공하는 아미노산 차이는 아미노산 결실, 삽입 또는 치환일 수 있다. 활성을 유지하는 아미노산 치환에서, 치환된 아미노산은 대략 동일한 전하, 크기, 극성 및/또는 소수성과 같은 하나 이상의 유사 성질을 보유해야 한다. CDR은 표적에 대한 결합을 담당하지만 변동될 수 있으면서 여전히 표적 특이성을 유지할 수 있는 것이다. 또한, 프레임워크 영역 서열도 변동될 수 있다.

도 2 및 도 3에 제공된 서열 비교는 CDR 및 프레임워크 영역 내의 변동의 예를 예시한 것이다. 도 2 및 3에 예시된 것 외의 변동이 생길 수도 있다. 아미노산 차이에 관한 양태에서, 추가 변동은 보존적 아미노산 치환이다. 보존적 치환은 아미노산을 성질이 유사한 다른 아미노산으로 교체하는 것이다. 표 2는 그룹의 한 구성원이 다른 구성원 대신에 보존적 치환되는, 아미노산 그룹 목록을 제공한다.

II.E. 항원 결합 단백질 칵테일

CS-D7 표적 영역을 표적화하는 항원 결합 단백질은 다른 ORF0657n 에피토프를 표적화하는 하나 이상의 추가 결합 단백질 또는 다른 단백질과 함께 조제되어 항원 결합 단백질 칵테일을 형성할 수 있다. 본 발명의 일 양태는 적어도 2개의 항원 결합 단백질의 배합 또는 이의 복합체(상기 섹션 II.C 참조)을 포함하는 항원 결합 단백질 칵테일로서, 상기 항원 결합 단백질 중 적어도 하나가 본 명세서에 기술된 CS-D7 표적 영역을 표적화하는 항원 결합 단백질 칵테일에 관한 것이다. 추가 항원 결합 단백질은 생체내 감염 중에 세균 세포 표면에서 발현된 추가 에스.아우레우스 또는 에스.에피더미디스 항원에 특이적인 것이 바람직하며, 그 예로는 LTA 및 협막(O'Riordan and Lee, Clin. Micro. Rev. 77:218-234, 2004; Lees A., KoKai-kun J., LopezAcosta A., Acevedo J., Mond J. 2005. Lipotechoic Acid Conjugate Vaccine for Staphylococcus [abstract]. In: 8th Annual Conference on Vaccine Research; 2005 May 8-11; Baltimore. Sl:p.58; Fischer et al., 미국 특허 6,610,293; Stinson et al., 미국 특허 7,250,494); sai-1 관련 폴리펩타이드(Anderson et al., 국제공개번호 WO 05/79315); ORF0594 관련 폴리펩타이드(Anderson et al., 국제공개번호 WO 05/086663); ORF0826 관련 폴리펩타이드(Anderson et al., 국제공개번호 WO 05/115113); PBP4 관련 폴리펩타이드(Anderson et al., 국제공개번호 WO 06/033918); AhpC 관련 폴리펩타이드 및 AhpC-AhpF 조성물(Kelly et al., 국제공개번호 WO 06/078680); 에스.아우레우스 5형 및 8형 협막 다당류(Shinefield et al., N. Eng. J. Med. 346:491-496, 2002); 콜라겐 부착소, 피브리노겐 결합 단백질 및 클럼핑 인자(Mamo et al., FEMS Immunology and Medical Microbiology 10:47-54, 1994, Nilsson et al., J. Clin. Invest. 101:2640-2649, 1998, Josefsson et al., The Journal of Infectious Diseases 184:1572-1580, 2001); 및 다당류 세포간 부착소 및 이의 단편(Joyce et al., Carbohydrate Research 338:903-922, 2003)을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.

한 양태에서, CS-D7 표적 영역을 표적화하는 칵테일에 함유된 항원 결합 단백질은 본 명세서에 기술된 모노클로날 항체이다. 다른 양태에서, 항체 칵테일에 함유된 각 항원 결합 단백질은 모노클로날 항체이다. 다른 양태에서, 항원 결합 단백질 칵테일은 치료학적 유효량의 상기 칵테일과 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물의 일부이다.

따라서, 본 발명의 이러한 부분에는 항원 결합 단백질의 적어도 하나가 CS-D7 표적 영역을 표적화하는 항원 결합 단백질 복합체(예컨대, 섹션 II.C. 상기 문헌 참조)의 칵테일이다. 예를 들어, 본 발명은 추가로 하나의 이종중합체 복합체가 CR1에 특이적으로 결합하는 항체에 화학적으로 가교된, 본 명세서에 기술된 CS-D7 표적 영역을 표적화하는 항원 결합 단백질을 함유하는, 적어도 2개의 이종중합체 복합체의 배합을 포함하는, 섹션 II.C.(상기 참조)에 기술된 바와 같은 이종중합체 복합체의 칵테일에 관한 것이다. 이러한 이종중합체는 CD1에 특이적으로 결합하는 항체에 화학적으로 가교되는, 생체내 감염 동안 세균 세포 표면에서 발현된 추가 에스.아우레우스 항원(예, LTA, 협막)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 포함하는 제2 이종중합체 복합체와 항원 결합 단백질 칵테일의 형태로 배합될 수 있다.

III. 단백질 생산

항원 결합 단백질 및 이의 영역은 재조합 핵산 기술을 사용하거나 하이브리도마의 사용을 통해 생산하는 것이 바람직하다. 단일쇄 항체, 항체들 또는 이의 단편과 같이, V_h 영역 및 V_l 영역을 함유하는 단일쇄 단백질; 및 별도 단백질의 부분들로서 V_h 및 V_l 영역을 함유하는 다중쇄 단백질을 포함하는 여러 항원 결합 단백질이 생산될 수 있다.

재조합 핵산 기술은 단백질 합성을 위해 핵산 주형의 작제를 수반한다. 하이브리도마 기술은 항원 결합 단백질을 생산하는 불멸화된 세포주의 사용을 수반한다. 적당한 재조합 핵산 및 하이브리도마 기술은 당업계에 공지되어 있다(Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 2005, Harlow et at., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

III.A. 재조합 핵산

항원 결합 단백질을 암호화하는 재조합 핵산은 사실상 암호화된 단백질의 제조소로서 작용하는 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 재조합 핵산은 숙주 세포 게놈으로부터 자율적으로 존재하거나 또는 숙주 세포 게놈의 일부로서 존재하는 항원 결합 단백질을 암호화하는 재조합 유전자를 제공할 수 있다.

재조합 유전자는 단백질 발현의 조절 인자와 함께 단백질을 암호화하는 핵산을 함유한다. 일반적으로, 재조합 유전자에 존재하는 조절 인자는 전사 프로모터, 리보좀 결합 부위, 터미네이터(terminator) 및 경우에 따라 존재하는 오퍼레이터(operator)를 포함한다. 진핵생물 세포에서 프로세싱을 위한 바람직한 인자는 폴리아데닐화 시그널이다. 또한, 항체 관련 인트론이 존재할 수도 있다. 항체 또는 항체 단편 생산을 위한 발현 카세트 및 벡터의 예는 당업계에 공지되어 있다(Persic et al., Gene 187:9-18, 1997, Boel et al., J. Immunol. Methods 239:153-166, 2000, Liang et al., J. Immunol. Methods 247:119-130, 2001, Tsurushita et al., Methods 36:69-83, 2005).

유전자 암호의 축퇴로 인해, 다수의 여러 암호화 핵산 서열이 특정 단백질을 암호화하는데 사용될 수 있다. 유전자 암호의 축퇴는 거의 모든 아미노산이 뉴클레오타이드 트리플렛(triplet) 또는 "코돈"의 다른 조합에 의해 암호화되기 때문에 일어난다. 아미노산은 다음과 같은 코돈에 의해 암호화된다:

세포 내에서 재조합 유전자의 발현은 발현 벡터의 사용에 의해 촉진된다. 발현 벡터는 재조합 유전자 외에 숙주 세포에서의 자율 복제를 위한 복제 오리진, 선택성 마커, 제한된 수의 유용한 제한효소부위 및 높은 카피수의 잠재능을 함유하는 것이 바람직하다.

바람직하다면, 항체를 암호화하는 핵산은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 숙주 염색체 내로 통합될 수 있다(예컨대, Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 2005, Marks et al., 국제출원번호 WO 95/17516, 국제공개일 1995년 6월 29일).

III.B. 재조합 핵산 발현

재조합 항원 결합 단백질 발현에는 원핵생물 유기체(예, 이.콜라이, 바실러스 종 및 스트렙토마이세스 종(또는 스트렙토마이세테) 및 진핵생물 유기체(예컨대, 효모, 배큘로바이러스 및 포유동물) 유래의 세포주를 비롯한 다양한 여러 세포주가 사용될 수 있다(Breitling et al., Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, Inc. and Spektrum Akademischer Verlag, 1999, Kipriyanov et al., Molecular Biotechnology 26:39-60, 2004, Tsurushita et al., Methods 36:69-83, 2005).

재조합 항원 결합 단백질 발현에 바람직한 숙주는 포유동물의 해독후 변형을 구비한다. 해독후 변형은 글리코실화 및 이황화결합 형성과 같은 화학적 변형을 포함한다. 해독후 변형의 다른 종류는 시그널 펩타이드 절단이다.

글리코실화는 일부 항체 효과기 기능에 중요할 수 있다(Yoo et al., Journal of Immunological Methods 261:1-20, 2002, Presta, Advanced Drug Delivery Reviews 58:640-656, 2006, Satoh et al., Expert Opin. Biol. Ther. 6:1161-1173, 2006).

포유동물 숙주 세포 및 비-포유동물 세포를 비롯하여 여러 종류의 숙주 세포가 효과적인 해독후 변형을 제공하는데 사용될 수 있다. 포유동물 숙주 세포의 예로는 중국 햄스터 난소(CHO), HeLa, C6, PC12, 사람 배아 신장(HEK293) 및 골수종 세포를 포함한다. 포유동물 숙주 세포는 효과적인 글리코실화 등을 위해 변형될 수 있다(Yoo et al., Journal of Immunological Methods 261:1-20, 2002, Persic et al., Gene 187:9-18, 1997, Presta, Advanced Drug Delivery Reviews 58:640-656, 2006, Satoh et al., Expert Opin. Biol. Ther. 6:1161-1173, 2006). 또한, 비-포유동물 세포는 원하는 글리코실화를 구비하기 위해 변형될 수 있다(Li et al., Nature Biotechnology 24(2):210-215, 2006). 이와 같이 변형된 비-포유동물 세포의 한 예는 당조작된(glycoengineered) 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)이다(Li et al., Nature Biotechnology 24(2):210-215, 2006).

III.C. 여러 양태들의 예

항원 결합 단백질 V_h 영역 또는 V_l 영역 중 어느 하나를 암호화하거나 또는 두 영역 모두를 암호화하는 하나 이상의 재조합 유전자를 포함하는 핵산은 CS-D7 표적 영역에 결합하는 완전 결합 단백질 또는 결합 단백질의 한 성분을 생산하는데 사용될 수 있다. 완전 결합 단백질은 예컨대 단일쇄 항체와 같이 V_h 영역과 V_l 영역을 함유하는 단일쇄 단백질을 암호화하는 단일 재조합 유전자를 사용하거나, 또는 각각의 V_h 및 V_l 영역 등을 생산하는 다중 재조합 유전자를 사용하여 제공될 수 있다. 또한, 결합 단백질의 한 영역은 예컨대 분리된 세포에서 V_h 영역 또는 V_l 영역을 함유하는 폴리펩타이드를 생산함으로써 수득할 수 있다.

따라서, 본 발명은 CS-D7 표적 영역에 결합하는 V_h 또는 V_l 영역을 포함하는 항원 결합 단백질 V_h 영역 또는 V_l 영역을 암호화하는 적어도 하나의 재조합 유전자를 함유하는 핵산을 포함한다. 또 다른 양태에서, 핵산은 2개의 재조합 유전자, 즉 항원 결합 단백질 V_h 영역을 암호화하는 제1 재조합 유전자 및 항원 결합 단백질 V_l 영역을 암호화하는 제2 재조합 유전자를 포함한다.

다른 양태들에서, 하나 이상의 재조합 유전자는 상기 섹션 II.D.에 기술된 바와 같이 항원 결합 단백질, 또는 V_h 영역 또는 V_l 영역을 암호화한다. 재조합 유전자(들)는 항원 결합 단백질을 생산하기 위해 단일 숙주 세포에서 발현되는 것이 바람직하다. 단백질은 세포로부터 정제될 수 있다.

IV . 항원 결합 단백질의 적용

적당한 에피토프를 인식하는 항원 결합 단백질은 치료적 적용예 및 다른 적용예를 보유할 수 있다. 다른 적용예로는 ORF0657n 항원 및 백신의 생산, 특성규명 또는 연구를 촉진하기 위한 ORF0657n 표적 영역을 인식하는 항원 결합 단백질의 사용을 포함한다. 특정 ORF0657n 영역을 함유하는 항원은 에스.아우레우스 감염에 대한 방어적 면역반응을 제공하는데 사용될 수 있다(Anderson et al., 국제공개번호 WO 2005/009379, 국제공개일 2005년 2월 3일).

표적 단백질의 생산, 특성규명 또는 연구에 모노클로날 항체 등의 항원 결합 단백질을 이용하는 기술은 당업계에 공지되어 있다(예컨대, Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 2005, Harlow et al., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, Harlow et al., Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, Lipman et al., ILAR Journal 46:258-268, 2005).

본 발명의 한 양태에서, 미세구체 또는 세포에 결합된, 용액 중의 ORF0657n 항원의 존재는 항원 결합 단백질을 사용하여 측정한다. 용액 또는 세포에 존재하는 단백질에 결합하는 결합 단백질의 능력은 웨스턴 블롯, 효소-결합된 면역흡착 검정(ELISA), 유세포분석 및 루미넥스(Luminex) 면역분석과 같은 여러 기술을 사용하여 측정할 수 있다.

V. 치료

치료요법적 및 예방요법적 치료는 적당한 표적 영역에 대한 항원 결합 단백질의 결합을 이용하여 환자에게 수행될 수 있다. 치료요법적 치료는 에스.아우레우스 감염자에게 수행한다. 예방요법적 치료는 일반 집단 또는 일반 집단의 아군에게 수행할 수 있다. 일반 집단의 바람직한 아군은 에스.아우레우스 감염의 위험이 증가된 사람들의 아군이다.

치료요법적 및 예방요법적 치료는, 본 명세서에 기술된 바와 같은 항원 결합 단백질 또는 이의 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, 에스.아우레우스 감염에 대하여 환자를 보호하거나 치료하는 방법을 포함한다. 필요하다면, 본 명세서에 제공된 항원 결합 단백질 조성물은 항원 결합 단백질 칵테일(예컨대, 상기 섹션 II.E. 참조)의 일부로 제공될 수 있다. 또한, 항원 결합 단백질 조성물은 다른 의약 물질이 함께 제공되는 병용 치료 요법의 일부로 투여될 수 있다. 따라서, 단독 또는 추가 물질과 배합된, 항원 결합 단백질의 투여는 약제학적 활성 담체를 포함하는 조성물의 형태를 취할 수 있다.

병용 요법은 본 명세서에 기술된 항원 결합 단백질(예컨대, 상기 섹션 II 참조)을 의약적 효과가 있는 하나 이상의 추가 성분, 예컨대 백신 항원 또는 항생제(이에 국한되지 않는다) 등과 함께 사용하여 수행할 수 있다. 치료 시기는 예방요법적 및/또는 치료요법적 치료를 달성하도록 설계할 수 있다. 예를 들어, 추가 성분은 항원 결합 단백질 치료와 동시에 또는 항원 결합 단백질 치료 전이나 후에 짧은 시간 안에 투여할 수 있다. 짧은 시간 안에 투여는 환자를 위한 최상의 치료 요법에 따라서, 항원 결합 단백질이 투여된 시점의 약 2주 내의 시간을 의미한다.

에스.아우레우스 감염에 대하여 효과적인 항생제의 투여에 대해서는 당업계에 공지되어 있다(예컨대, Anstead et al., Methods Mol. Bio. 391:227-258, 2007; Micek, Clin. Infect. Dis. 45:S184-S190, 2007; Moellering, Clin. Infect. Dis. 46:1032-1037, 2008). 병용 치료에 가능한 항생제로는, 예컨대 반코마이신, 라인졸리드, 클린다마이신, 독시사이클린, 리팜핀, 답토마이신, 퀴누프린틴-달포프리스틴, 티제사이클린, 오리타반신, 달바반신, 세프토비프롤, 텔라반신 및 이클라프림이 있다.

병용 치료를 위한 잠재적 항원으로는 다음과 같은 것들을 포함한다: ORF0657n 관련 폴리펩타이드(Anderson et al., 국제공개번호 WO 05/009379); sai-1 관련 폴리펩타이드(Anderson et al., 국제공개번호 WO 05/79315); ORF0594 관련 폴리펩타이드(Anderson et al., 국제공개번호 WO 05/086663); ORF0826 관련 폴리펩타이드(Anderson et al., 국제공개번호 WO 05/115113); PBP4 관련 폴리펩타이드(Anderson et al., 국제공개번호 WO 06/033918); AhpC 관련 폴리펩타이드 및 AhpC-AhpF 조성물(Kelly et al. 국제공개번호 WO 06/078680); 에스.아우레우스 5형 및 8형 협막 다당류(Shinefield et al., N. Eng. J. Med. 346:491-496, 2002); 콜라겐 부착소, 피브리노겐 결합 단백질 및 클럼핑 인자(Mamo et al., FEMS Immunology and Medical Microbiology 10:47-54, 1994, Nilsson et al., J. Clin. Invest. 101:2640-2649, 1998, Josefsson et al., The Journal of Infectious Diseases 184:1572-1580, 2001); 및 다당류 세포간 부착소 및 이의 단편(Joyce et al., Carbohydrate Research 338:903-922, 2003).

"환자"는 에스.아우레우스로 감염될 수 있는 포유동물을 의미한다. 환자는 사람인 것이 바람직하다. 하지만, 소, 돼지, 양, 염소, 토끼, 말, 개, 고양이, 원숭이, 래트 및 마우스와 같은 다른 종류의 포유동물이 에스.아우레우스로 감염될 수 있다. 비-사람 환자의 치료는 애완동물 및 가축을 보호하는데 유용하고 특정 치료의 효능을 평가하는데 유용하다.

에스.아우레우스 감염의 위험이 증가된 사람은 의료 종사자; 입원환자; 면역계가 약화된 환자; 수술을 받은 환자; 카테터 또는 혈관 장치와 같이 이물질 이식을 받은 환자; 면역성 약화를 야기하는 치료법에 직면한 환자; 및 화상이나 상처 손상의 위험이 높은 특정 직업 종사자를 포함한다(The Staphylococci in Human Disease, Crossley and Archer (ed.), Churchill Livingstone Inc. 1997).

한 양태에서, 환자는 수술 또는 이물질 이식과 함께 1종 이상의 항원 결합 단백질을 투여받는다. "수술 또는 이물질 이식"에 대한 언급은 이물질 이식의 제공 유무 하의 수술, 및 수술과 함께 또는 수술없이 이물질 이식의 제공을 포함한다. 투여 시기는 예방요법적 치료 및/또는 치료요법적 치료를 달성하도록 설계할 수 있다. 투여는 수술이나 이식과 거의 동시에 시작하는 것이 바람직하다.

약제학적 투여의 지침은 일반적으로, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 20th Edition, Ed. Gennaro, Mack Publishing, 2000; 및 Modern Pharmaceutics 2nd Edition, Eds. Banker and Rhodes, Marcel Dekker, Inc., 1990]에 제공되어 있다.

약제학적으로 허용되는 담체는 항원 결합 단백질의 보관 또는 투여를 용이하게 한다. 단백질 용액 제형을 안정시키는데 사용되는 물질로는 탄수화물, 아미노산 및 완충 염이 포함된다(Middaugh et al., Handbook of Experimental Pharmacology 137:33-58, 1999).

항원 결합 단백질은 정맥내, 피하, 근육내 및 점막 중 하나 이상의 경로와 같이 여러 경로로 투여될 수 있다. 피하 및 근육내 투여는 주사바늘 또는 분사-주입기 등을 이용하여 수행할 수 있다. 비측 전달과 같은 점막 전달은 흡착 부위에서 더 긴 체류 시간을 제공하기 위해 증진제 또는 점막접착제의 사용을 수반할 수 있다(Middaugh et al., Handbook of Experimental Pharmacology 137:33-58, 1999).

적당한 용량투여 요법은 환자의 연령, 체중, 성별 및 의학적 상태; 투여 경로; 원하는 효과; 및 이용되는 특정 항원 결합 단백질 등, 당업계에 공지된 인자들을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다. 유효 용량 범위는 약 0.1mg/kg 내지 20mg/kg 범위, 또는 0.5mg/kg 내지 5mg/kg 범위이어야 한다. 용량투여 빈도는 화합물의 효과 및 안정성에 따라 달라질 수 있다. 용량투여 빈도의 예는 격주, 매주, 매월 및 격월을 포함한다.

VI. CS-D7 표적 단편

ORF0657n 영역(서열번호 47) 내에 존재하고 mAb CS-D7이 결합되는 CS-D7 표적 단편은 예를 들어 상기 II.B에 언급된 바와 같은 추가 항체의 생성에 사용될 수 있다. CS-D7 표적 단편도 면역 반응을 유도하는데 사용될 수 있다. CS-D7 표적 단편은 CS-D7 표적 영역을 포함하는 것이 바람직하다. 즉, CS-D7 표적 영역은 ORF0657n에 의해 제공된다. CS-D7 표적 단편은 ORF0657n 영역의 대략 아미노산 42-342 내에 포함되어 있는 것으로 나타나고(실시예 6 참조), 이 영역 유래의 더 작은 단편들에 존재할 수도 있다.

잠재적인 CS-D7 표적 단편은 이하에 기술되는 여러 양태들로 제공된다. 제1 양태에서, CS-D7 표적 단편은 서열번호 47의 아미노산 42-342, 서열번호 47의 아미노산 42-285 및 서열번호 47의 아미노산 103-285로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 ORF0657n(서열번호 47)의 부분들과 서열 동일성이 적어도 95%이고 길이가 아미노산 350개 이하인 폴리펩타이드이다. 폴리펩타이드의 길이에 관한 다른 양태에서, 폴리펩타이드는 아미노산 250개 이하 또는 아미노산 200개 이하이다. 다른 아미노산은 다른 ORF0657n 영역인 것이 바람직하다.

제1 양태를 추가로 설명하는 제2 양태에서, 서열번호 47 관련 폴리펩타이드는 서열번호 47의 아미노산 42-342, 아미노산 42-285 또는 아미노산 103-285와 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일하거나; 서열번호 47의 아미노산 42-342, 아미노산 42-285 또는 아미노산 103-285와 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 변경에 의해 상이하거나; 또는 서열번호 47로 본질적으로 이루어진 것이다. 각 아미노산 변경은 독립적으로 아미노산 치환, 결실 또는 부가이다. 변경은 서열번호 47 영역 내에서 이루어질 수 있거나, 또는 서열번호 47 영역에 부가될 수 있다.

제시된 아미노산으로 "본질적으로 이루어진"에 대한 언급은 언급된 아미노산이 존재하고 추가 아미노산이 존재할 수 있음을 나타낸다. 추가 아미노산은 카르복시 또는 아미노 말단에 존재할 수 있다. 다른 양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 추가 아미노산이 서열번호 47의 아미노산 42-342, 아미노산 42-285 또는 아미노산 103-285에 부가된다. 추가 아미노산의 한 예는 아미노 말단 메티오닌이다.

면역반응의 유도는 에스.아우레우스 감염을 치료요법적 또는 예방요법적으로 치료하는 것을 돕는데 유용할 수 있다. 면역원을 조제하여 당업계에 공지된 기술과 함께 본 명세서에 제공된 지침을 사용하여 환자에게 투여할 수 있다. 약제학적 투여의 지침은 일반적으로 예컨대 문헌[Vaccines Eds. Plotkin and Orenstein, W.B. Sanders Company, 1999; Remington's Pharmaceutical Sciences 20^th Edition, Ed. Gennaro, Mack Publishing, 2000; 및 Modern Pharmaceutics 2^nd Edition, Eds. Banker and Rhodes, Marcel Dekker, Inc., 1990]에 제공되어 있다.

약제학적으로 허용되는 담체는 보관 및 환자에게 면역원의 투여를 용이하게 한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 완충액, 주사용 멸균수, 일반 식염수 또는 인산염 완충 식염수, 수크로스, 히스티딘, 염 및 폴리소르베이트와 같은 여러 성분을 함유할 수 있다.

면역원은 피하, 근육내 또는 점막과 같은 여러 경로로 투여될 수 있다. 피하 및 근육내 투여는 주사바늘 또는 분사 주입기 등을 이용하여 수행할 수 있다.

적당한 용량투여 요법은 환자의 연령, 체중, 성별 및 의학적 상태; 투여 경로; 원하는 효과; 및 이용되는 특정 화합물 등, 당업계에 공지된 인자들을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다. 면역원은 다회용량 백신 제형으로 사용될 수 있다. 용량은 1.0㎍ 내지 1.0mg 총 폴리펩타이드 범위를 포함할 수 있을 것으로 생각된다. 다른 양태에서, 범위는 5.0㎍ 내지 500㎍, 0.01mg 내지 1.0mg 또는 0.1mg 내지1.0mg 이다.

용량투여의 시기는 당업계에 공지된 요인들에 따라 달라진다. 1차 투여 후 1회 이상의 추가접종 용량이 항체 역가의 유지 또는 증대를 위해 후속적으로 투여될 수 있다. 용량투여 요법의 한 예는 1일, 1개월, 4개월, 6개월 또는 12개월에 3차 용량, 및 긴 시간후 필요할 때의 추가접종 용량일 수 있다.

이하, 본 발명의 다른 특징을 추가로 예시하는 실시예가 제공된다. 실시예는 또한 본 발명의 수행에 유용한 방법론을 예시한다. 이러한 실시예들은 본 발명을 제한하지 않는다.

실시예 1: scFv 라이브러리로부터 항-0657n mAb의 분리

ORF0657n에 특이적인 scFv는 파지 디스플레이 라이브러리를 이용하여 확인했다. 이 라이브러리는 ORF0657nH로 패닝했다. scFv는 그 다음 ORF0657t에 결합되어있는지를 측정하기 위해 카운터 스크린(counter screen)했다. 서열번호 47은 ORF0657n 에스.아우레우스 서열을 제공한다. ORF0657t는 ORF0657n의 아미노산 42-486에 대응한다. ORF0657nH는 ORF0657n의 아미노산 42-609에 대응한다. ORF0657nH 및 ORF0657t는 효모에서 발현되었다.

3가지 캠브리지 항체 라이브러리(BMV: 말초혈액 림프구; CS: 비장 림프구; 및 DP47: CS 라이브러리의 V_h CDR3과 V_L을 보유하는 배선 DP47 프레임워크)는 고상 패닝을 이용해 ORF0657nH(10㎍/ml)에 대해 scFv를 선별했다. 확인된 190개/264개가 ORF0657t 특이적이었다. 가변 영역 DNA 서열분석으로부터 중복물을 제거한 후에는 172개/264개가 확인되었다. DNA 서열분석 결과, 중복 서열과 종결 코돈 함유 서열을 제거한 후 CS 라이브러리 스크린으로부터 74개 서열과 DP47 스크린으로부터 41개의 고유 서열 및 BMV 스크린으로부터 57개 서열이 확인되었다.

파지 ELISA 스크리닝 - 선택한 scFv-파지 클론의 항원 특이성을 확인하기 위해, 2차 라운드의 각 라이브러리 유래의 172개 파지 클론과 각 3차 라운드 라이브러리 유래의 88개 클론을 ELISA로 검사했다. ELISA 양성 세트는 유세포분석 및 경 쟁적 루미넥스 분석으로 추가 시험했다. 유세포분석에 의해 측정된 에스.아우레우스의 세포 표면에 존재하는 ORF0657n에 결합된 scFv는 이하에 기술된 바와 같이 전체 IgG로 전환시켰다.

유세포분석 스크리닝 - 유세포분석은 여러 scFv의 ORF0657n 결합 부위의 측정을 위해 수행했다. 이 분석에 사용된 에스.아우레우스는 철-결핍 제한배지(RPMI 1640)에서 성장시켰다. 고상 파지 디스플레이 패닝의 2차 라운드에서 분리된 100가지 이상의 다른 scFv를, 2X RPMI에서 성장된 에스.아우레우스 베커(Becker) 세포에 대하여 유세포분석으로 조사했다. 시험된 scFv의 대부분은 다양한 결합 정도를 나타냈다. 이 실험에서 수득된 데이터는 패닝에서 분리된 scFv가 에스.아우레우스에 결합한다는 것을 확인시켜주었다.

IgG 전환 - IgG 전환을 위해 12가지 scFv 클론을 확인했다. 가변 영역의 서열은 PCR 증폭시켰고, 중쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA는 IgG1 불변 영역을 암호화하는 DNA와 프레임내(in-frame) 융합시키고, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA는 대응하는 불변 영역을 암호화하는 DNA와 프레임내 융합시켰다. 최종 항체 발현 벡터를 위한 클로닝 절차는 이하에 설명한다.

경쇄 및 중쇄의 발현은 사람 CMV 프로모터 및 소 성장호르몬 폴리아데닐화 시그널에 의해 유도했다. 전방의 리더 서열은 배양배지로 항체의 분비를 매개했다. 중쇄 리더 서열은 MEWSWVFLFFLSVTTGVHS (서열번호 49)였다. 경쇄 리더 서열은 MSVPTQVLGLLLLWLTDARC (서열번호 50)였다. 발현 벡터는 293EBNA 세포에서 장기 발현을 위한 EBV 바이러스 게놈 유래의 oriP 및 카나마이신 선택 마커를 위한 세균 서열 및 이.콜라이의 복제 오리진을 보유한다.

가변 영역은 PCR 증폭시켰다. PCR 반응은 고 정확도의 PCR 마스터 혼합물, 1㎕ 용량의 주형 및 각각 1㎕의 정방향 및 역방향 프라이머를 함유하는 25㎕ 용량에서 수행했다. PCR 조건은 94℃에서 2분, 1회 사이클; 94℃에서 1.5분, 60℃에서 1.5분, 72℃에서 1.5분 및 72℃에서 7분간 25회 사이클; 분리하여 In-Fusion 전략을 이용해 5' 말단에 리더 서열 및 3'-말단에 불변 영역과 프레임내 클로닝할 때까지 4℃였다. 예를 들어, 클론 CS-D7 항체는 다음과 같은 프라이머를 이용하여 클로닝했다:

나머지 클론들도 유사한 방식으로 전환시켰다. 모든 클론의 DNA 서열은 서열분석으로 확인했다. 이하에 더 상세히 설명되듯이, 루미넥스 결합 분석을 이용하여 동일 에피토프에 결합하기 위해 mAb BMV-H11, BMV-D4, BMV-E6, BMV-C2, CS-D7, CS-D10, CS-A10 및 CS-E11은 경쟁한다.

DNA 서열로부터 추론된 항체 CS-D7의 전체 아미노산 서열은 이하 표 3에 제시했다. 가변 영역은 진하게 표시하고 CDR은 밑줄친 부분이다.

mAb BMV-H11, BMV-D4, CS-D7, CS-D10, CS-A10, CS-E11, BMV-E6 및 BMV-C2 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 서열 비교는 도 2와 3에 제시했다. 중쇄 불변 영역의 서열은 모두 동일하고, 경쇄 불변 영역의 서열은 카파 또는 람다이다. mAb CS-D7은 서 열번호 1의 아미노산 109-201에 대응하는 카파 서열을 함유한다. mAb BMV-H11, BMV-D4, CS-D10, CS-A10, CS-E11, BMV-E6 및 BMV-C2는 서열번호 48에 제공된 람다 서열을 함유한다.

상기 항체들은 293EBNA 단층 세포에서 발현시켰다. 플라스미드는 PEI계 형질감염 시약을 이용하여 형질감염시켰다. 형질감염된 세포는 Opti-MEM 무혈청 배지에서 항온배양하고, 분비된 항체는 단백질 A/G 친화도 크로마토그래피를 이용하여 배지로부터 정제했다. 정제된 항체의 농도는 OD280nm에서 측정하고, 순도는 LabChip 모세관 전기영동으로 분석했다.

실시예 2: 루미넥스 결합 연구

CAT scFv(실시예 1 참조)의 선택은 쥐 mAb(2H2, 13C7, 1G3 및 13G11) 및 CAT mAb(CS-D3, CS-D7, CS-D10, CS-E11, BMV-E6, BMV-D4, mAb1 및 mAb2) 패널에 대하여 스크리닝하여, 이들이 ORF0657n 상의 동일 에피토프들에 대해 경쟁하는지 또는 다른 에피토프에 결합하는지를 측정했다. 이 분석에서, 단일 CAT scFv(또는 CAT mAb)는 단일 mAb(쥐 또는 CAT)와 경쟁했다.

쥐 항체 2H2, 1G3, 13C7 또는 13G11은 본 발명에 참고인용된 2007년 1월 23일에 출원된 국제출원 PCT/US07/01687에 기술되어 있다. PCT/US07/01687(국제공개번호 WO 2007/089470)은 부다페스트 조약에 따라 아메리칸 타입 컬처 컬렉션(ATCC)(미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불러바드 10801)에 2005년 9월 30일자로 기탁된 mAb 1G3.BD4, mAb 2H2.BE11, mAb 13C7.BC1 및 mAb 13G11.BF3을 생산하는 하이브리도마 세포주를 언급한다. 이 세포주들은 ATCC No. PTA-7124(mAb 2H2.BE11 생산), ATCC No. PTA-7125(mAb 13C7.BC1 생산), ATCC No. PTA-7126(mAb 1G3.BD4 생산) 및 ATCC No. PTA-7127(mAb 13G11.BF3 생산)로 표시되어 있다.

ORF0657n - 비드의 작제 - 9.4 x 10⁶ Radix 말레이미드 미세구체(Georgetown, TX)를 ORF0657n-Se(카르복시 말단 시스테인 그룹을 함유하는 ORF0657n) 750㎍에 실온에서 2시간 동안 커플링시켰다. 비드를 1ml PBS로 3회 세척한 뒤, 1M N-아세틸-L-시스테인(Sigma)으로 실온에서 2시간 동안 반응정지시켰다. 미세구체를 PBS로 3회 세척했다. 비드를 계수하고 500 미세구체/㎕의 최종 농도로 재현탁시켰다.

CAT scFv와 쥐 mAb 간의 경쟁 검출 - CAT scFv는 PBS-TBN(0.05% Tween 20, 1% BSA 및 0.05% 아지드화나트륨)에 1:4, 1:8, 1:16 및 1:32로 희석하고 멀티스크린 필터 평판(Millipore)에서 5000 ORF0657n-커플링된 미세구체와 실온에서 1시간 15분 동안 항온처리했다. 그 다음, 비드를 0.05% Tween 20 함유 PBS(PBS/Tween 20)로 3X 세척했다. CAT scFv가 결합된 ORF0657n 비드를 쥐 모노클로날 항체(2H2, 1G3, 13C7 또는 13G11)과 항온처리했다. 쥐 mAb는 R-피코에리트린(PE) 접합체(Chromoprobe Inc.)로 통상적으로 표지되어 있었다. 표지된 mAb는 PBS-TBN에 2㎍/ml의 최종 농도로 분리 희석했다. 희석된 mAb(50㎕/웰)는 평판에 첨가하여 실온에서 추가 1시간 15분 동안 항온처리했다. 미세구체를 PBS/Tween20으로 3X 세척했다. 미세구체를 PBS/Tween20에 재현탁시키고 중간 형광 시그널을 Bio-Plex 루미노미터(BioRad)를 이용하여 판독했다.

쥐 mAb와 scFv 간의 결합 경쟁을 기초로 하여, 시험된 항체들의 결합 부위는 다음과 같은 그룹으로 나뉘었다: 그룹 1, scFv BMV-C2, BMV-E6, BMV-D4, BMV-H11, CS-E11, CS-A10, CS-D10 및 CS-D7은 임의의 쥐 mAb와 경쟁하지 않았다; 그룹 2, 2가지 scFv가 쥐 mAb 2H2와 경쟁했다; 그룹 3, 2가지 scFv가 mAb 1G3과 경쟁했다; 그룹 4, scFv가 mAb 13C7과 전혀 경쟁하지 않았다; 그룹 5, scFv가 mAb 13G11과 전혀 경쟁하지 않았다. scFv CS-D10 및 CS-D7의 경우, Biacore를 이용한 결과는 루미넥스를 이용한 현 연구의 분석과 상이했다(이하 실시예 5 참조).

CAT mAb와 쥐 mAb 간에 경쟁 검출 - scFv BMV-D4, CS-D7, CS-D10, CS-A10 및 BMV-C2, mAb 2H2와 경쟁하는 scFv 및 13G와 경쟁하는 2가지 scFv를 실시예 1에 기술된 바와 같이 IgG 항체로 전환시켰다. CAT mAb는 PBS-TBN에 2㎍/ml 농도로 희석하고, 멀티스크린 필터 평판(Millipore)에서 5000개의 ORF0657n 커플링된 미세구체와 실온에서 1시간 15분 동안 항온처리했다. 그 다음, 비드를 0.05% Tween 20 보유 PBS(PBS/Tween20)로 3X 세척했다. CAT mAb가 결합되어 있는 ORF0657n-비드를 쥐 모노클로날 항체(2H2, 1G3, 13C7 또는 13G11)와 항온처리했다. 쥐 mAb는 R-피코에리트린(PE) 접합체(Chromoprobe Inc.)로 통상적으로 표지되어 있었다. 표지된 mAb는 PBS-TBN에 2㎍/ml의 최종 농도로 분리 희석했다. 희석된 mAb(50㎕/웰)는 평판에 첨가하여 실온에서 추가 1시간 15분 동안 항온처리했다. 미세구체를 PBS/Tween20으로 3X 세척했다. 미세구체를 PBS/Tween20에 재현탁시키고 중간 형광 시그널을 Bio-Plex 루미노미터(BioRad)를 이용하여 판독했다.

CAT mAb는 쥐 mAb와 경쟁 반응에 대해 시험했다. 전술한 scFV와 쥐 mAb의 경쟁 반응에서 관찰된 것과 동일한 5개 그룹이 관찰되었다.

CAT scFv와 CAT mAb 간에 경쟁 검출 - CAT scFv는 루미넥스 cLIA 분석에서 CAT 항체에 대하여 개별적으로 경쟁반응시켰다. scFv는 PBS-TBN(0.05% Tween 20, 1% BSA 및 0.05% 아지드화나트륨)에 1:4, 1:8, 1:16 및 1:32로 희석하고, 멀티스크린 필터 평판(Millipore)에서 5000개의 ORF0657n 커플링된 미세구체와 실온에서 1시간 15분 동안 항온처리했다. 그 다음, 비드를 0.05% Tween 20 보유 PBS(PBS/Tween20)로 3X 세척했다. 개별 항체를 PBS-TBN에 2㎍/ml의 최종 농도로 희석하고, 다른 평판에 첨가했다. 희석 항체 50㎕/웰을 평판에 첨가하고, 실온에서 추가 1시간 15분 동안 항온처리했다. 이 평판을 PBS/Tween20으로 3X 세척했다. 바이오트렌드의 항-사람 IgG(Fc 특이적) 항체 HP6043(R-피코에리트린 표지된)을 1:50으로 희석했다. 희석 항체 50㎕/웰을 평판에 첨가했다. 평판을 실온에서 1시간 15분 동안 항온처리했다. 미세구체를 PBS-Tween20으로 3X 세척했다. 미세구체는 PBS/Tween20에 재현탁시키고, Bio-Plex 루미노미터(BioRad)를 이용하여 중간 형광 시그널을 판독했다. scFv는 중간 형광 시그널이 적어도 2가지 희석물에서 비경쟁적 scFv에 의해 검출된 시그널에 비해 30% 이상 감소되었다면 경쟁적인 것으로 간주했다.

각각의 scFv BMV-H11, BMV-D4, BMV-E6, BMV-C2, CS-D7, CS-D10, CS-A10 및 CS-E11 대 각각의 mAb BMV-D4, BMV-E6, CS-D7, CS-D10 및 CS-E11의 경쟁 반응 결과는 표 4에 제시했다. 첫번째 컬럼의 각 scFv는 두번째 컬럼에 제공된 모든 mAb에 대해 개별적으로 경쟁적인 것으로 관찰되었다.

실시예 3: ORF0657n에 대한 결합성의 BIACORE ^® 측정

ORF0657n에 대한 항체 결합은 BIACORE^®로 측정했다. BIACORE^®는 마이크로유체학 기술 및 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 합친 것으로, 카르복시 메틸 덱스트란 코팅된 (CM5) 센서 칩의 표면에서 직접 조사된 편광의 굴절률의 변화를 모니터하여 질량의 변화를 검출한다. 반응의 변화는 반응 단위(Response Units)로 측정되며, 결합된 분석물(예, 항원 또는 항체)의 양과 상관성이 있을 수 있다.

ORF0657n에 대한 친화도 결합은 항-Staph 항체 mAb 13C7.D12를 사용하여 BIACORE^®로 측정했다. 항체는 CM5 센서 칩의 표면에 공유 결합했다. 결합된 Ab는 먼저 ORF0657n에 노출시키고, 이어서 저농도(5㎍/ml)로 검사되는 항체에 노출시켰다. ORF0657n + 항체가 각각 순환한 후, 센서 칩의 표면은 20mM HCl을 이용하여 고정된 13C7.D12로 재생시켰다.

각 실험에서 초기에 결합된(포획된) 항원의 양에 대해 표준화하기 위해, 각 시험 항체/항원 복합체에 대해 다음과 같은 비를 계산한다:

결과는 표 5에 제시한다. mAbCS-D4 및 mAb CS-D6에 대해서는 유의적인 결합이 나타나지 않았다. IgG 결합의 결여 원인은 IgG 단백질의 부재 또는 부정확한 값, 항체 응집, IgG의 매우 불량한 결합 활성 또는 포획 항체와 완전한 중복(항원이 단량체 형태로만 존재할 때)을 포함한다. mAb CS-D4 및 mAb CS-E6 결합은 쌍대 결합(pairwise binding) 연구로 관찰했고, 여기서 항체 농도는 유의적으로 증가했다(이하 실시예 4).

실시예 4: 쌍대 경쟁 결합

쌍대 결합 실험은 ORF0657n에 대한 항체의 상대적 결합을 측정하기 위해 수행했다. 항-Staph 항체 mAb 13C7.D12는 CM5 센서 칩의 표면에 공유 결합(고정화)되었다. 고정화된 Ab는 먼저 ORF0657n에 노출시키고, 이어서 매트릭스 판 중의 한쌍의 항체에 노출시켰다. 0657n 단백질 + 항체 쌍을 각각 순환시킨 후, 센서 칩의 표면은 20mM HCl로 다시 13C.D12 고정화로 재생시켰다. 항체는 각 항체쌍의 모든 조합이 분석될 수 있도록 매트릭스판 중의 ORF0657n 단백질에 대해 시험했다.

mAb CS-D7, CD-D10, BMV-D4 및 BMV-E6의 매트릭스 설계는 표 6에 정리했다.

각 실험에서 초기에 결합된(포획된) 항원의 양에 대해 표준화하기 위해, 다음과 같은 각 시험 항체/항원 복합체의 비를 계산했다:

각 항체에 남아있는 유용한 에피토프의 백분율은 다음과 같이 맵핑(mapping) 쌍에 대해서 계산할 수 있다:

모노클로날 항체 CS-D7, CS-D10, BMV-D4 및 BMV-E6은 동일한 또는 유의적으로 중복된 영역으로 유도되었다. 표 7은 쌍대 결합 연구의 결과를 정리한 것이다.

mAb의 상대적 풋프린트(footprint) 크기는 다음과 같다: CS-D7 > CS-D10 > BMV-D4 > BMV-E6. 모노클로날 항체 CS-D7은 가장 큰 "풋프린트"를 나타냈다(이 항체가 제1 결합 항체일 때 최고 mRU Ab/RUAb 비). 실시예 3에 기술된 결합 연구와 대조적으로, mAb BMV-D4 및 mAb BMV-D6의 사용시, 결합이 관찰되었고 항체 농도가 유의적으로 증가했다.

실시예 5: 추가 에피토프 풋프린팅

CAT ScFv 및 mAb의 서브세트에 대해 BIACore를 이용하여 추가 에피토프 풋프린팅 연구를 수행했다. 이 연구에서 그룹 1 및 그룹 2 결합 경쟁은 실시예 2에서와 동일하게 실시했다. 하지만, CS-D7 및 CS-E7은 mAb1G3(그룹 3)과 경쟁하는 것으로 발견되었다.

항체는 BIACore 2000에서 에피토프 중복에 대해 분석하고, 모든 시약은 특별한 언급이 없는 한, BIACore(Piscataway, NJ)에서 공급받았다. 각 실험에서 유세포는 EDC/NHS(NHS, N-하이드록시석신이미드; EDC,(N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드) 혼합물로 활성화시키고; 다양한 모노클로날 항체는 아세트산나트륨 pH 5.0 중에서 상기 활성화된 표면에 주입했고, 그 후 표면은 1.0M 에탄올아민-HCl pH 8.5로 차단시켰다. 각 실험 순환에서, ORF0657t 150㎕는 공유 고정화된 모노클로날 항체 위로 10㎕/min의 속도로 주입되었다. 이어서, 이 접합체 위로 다른 모노클로날 항체 120㎕를 10㎕/min의 속도로 주입했다. 본 실험을 통해 표면 플라즈몬 공명 데이터가 획득되었고 보관했다. 재생은 60㎕/min의 유속으로 흐르는 20mM HCl를 1회 주사하여 30초간 접촉시켜 수행했다. 모든 실험 단계는 25℃의 조절된 온도 하에서 수행했다. 매트랩(Matlab) 플랫폼(7.2.0.232 R2006a, Mathworks Inc., Natick, MA)에서 운영되는 내부 개발 소프트웨어를 가지고 후속 분석을 수행했다.

실시예 2에서 언급한 바와 같이, 경쟁 루미넥스 분석 시에 mAb CS-D7은 mAb 1G3과 경쟁하지 않는다. 경쟁 루미넥스 및 후속 BIACore 분석은 이러한 모순을 허용하는 차이를 갖고 있다. 첫째, 경쟁 비드 기반의 루미넥스 분석은 한 항체를 다른 항체로 치환시키지만, Biacore 2000 상의 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석은 공유(비가역적) 커플링된 하나의 항체를 보유한다. 둘째, 경쟁 분석은 항체 중 하나에 특이적인 표지를 이용하지만, SPR 분석은 표지가 없고 표면에 존재하는 물질의 양에만 민감하다. 경쟁 분석에서, 표지된 고친화도 항체는 사전결합된 저친화도 항체를 대치할 수 있어, 에피토프 중복이 없다는 거짓 결과를 야기한다. 두 분석 중 어느 분석에서나, 두 항체가 모두 방해없이 결합하는 경우, 어떠한 중복도 존재하지 않는 것이다. 하지만, 그 반대인 경우, 입체장애는 에피토프가 다를 수 있는 경우에도 분명한 에피토프 중복을 야기할 수 있다. 이러한 효과는 결합 단백질가 동시적인 아닌 연속적인 경우에 증가될 수 있다.

실시예 3과 4, 및 실시예 5의 실험 간의 차이는, 실시예 3과 4의 실험에서 ORF0657n은 먼저 13C7 mAb에 의해 포획되고 그 다음 다른 쌍의 항체가 ORF0657n에결합할 수 있는지 관찰하기 위해 후속해서 유동된다는 점이다. 상기 항체들 중 어느 하나가 mAb 13C7과 에피토프를 공유한다면, 그 항체는 ORF0657n에 결합할 수 없을 것이다. 따라서, mAb 13C7, "제1 항체" 및 "제2 항체" 간에 3원 비교가 효과적이다. 이에 반해, 실시예 5는 2원 비교이다.

실시예 6: mAb CS-D7 에피토프 맵핑

mAb CS-D7 표적 영역의 에피토프 맵핑은 ORF0657t의 선형 서열의 화학적 절단 및 mAb CS-D7이 결합된 단편을 측정함으로써 수행했다. ORF0657t는 CNBr로 2시간 동안 화학적으로 절단했다. 수득되는 절단 산물은 SDS PAGE로 분석했다. SDS PAGE 분석은 분자량이 약 47, 44, 37, 35, 32, 26, 16, 13 및 10kDa인 10개의 밴드를 나타냈다. mAb CS-D7을 이용한 웨스턴 블롯 분석은 47, 44, 37, 35 및 32kDa 밴드만이 mAb CS-D7에 의해 인식되는 것으로 나타났다. mAb CS-D7에 의해 인식되는 짧은 서열의 부재는 mAb CS-D7이 ORF0657n의 선형 서열을 인식하지 못함을 시사한다.

웨스턴 블롯 밴드는 SDS PAGE 겔에서 절단하고, 겔내 분해를 수행했고, 수득되는 직렬질량분석법으로 확인된 펩타이드는 ORF0657n의 대응 서열과 일치했다. 결과는 표 8에 제시했다.

표 8에 제시된 ORF0657n 영역은 다음을 기초로 한다: 펩타이드들은 겔내 분해물에서 확인했고, C-말단 메티오닌 잔기는 직렬 질량 스펙트럼에 의해 확인되고, CNBr 분해물의 모든 단편이 메티오닌 절단 부위로 시작하고 끝난다는 가정, 및 SDS PAGE 겔에서의 밴드의 겉보기 분자량. 웨스턴 블롯 분석에서 mAb CS-D7에 의해 확인될 수 있는 ORF0657t의 최소 내부 단편은 아미노산 42-342였다.

실시예 7: mAb CS-D7 에피토프 절단

mAb CS-D7에 결합하는 ORF0657t의 고분자량 단편의 필요성은 에피토프 절단으로 확인했다. 상세하게, mAb CS-D7은 각 에피토프 절단 실험마다 시아노겐 브로마이드 활성화된 세파로스(Amersham cat no 17 0430 01)에 화학적 가교시켜 고정시켰다. 그 다음, 고정화된 항체에 본래의 ORF0657t를 결합시키고, 미결합된 ORF0657t를 인산염 완충 식염수로 철저하게 세척하여 제거했다. 결합된 ORF0657t에 트립신을 첨가했다. 항온처리동안 프로테아제에 의해 절단된 펩타이드는 철저하게 세척 제거하고 mAb CS-D7에 특이적으로 결합된 ORF0657t 단편을 SDS 로딩 완충액으로 유리시켰다.

mAb CS-D7에 특이적으로 결합된 단편은 SDS PAGE로 분석했다. 에피토프 절단 실험은 SDS PAGE 분석에서 분자량이 약 48, 23 및 19.5kDa인 3개의 밴드를 나타냈다. SDS PAGE 겔로부터 모든 밴드를 절단하고, 겔내 분해를 수행하고, 밴드에 대응하는 ORF0657n의 펩타이드를 직렬 질량 분광분석법으로 확인했다(표 9). 직렬 질량 분광분석법에 의해 확인된 각 ORF0657n 펩타이드의 계산된 분자량은, 실험 설계의 결과인 SDS-PAGE에 의해 확인된 대응 밴드의 분자량(표 9)보다 작았다. 즉, 본 실험에서 mAb CS-D7에 결합된 단편들은 사실상 질량분광분석법에 의해 확인된 것보다 더 큰 ORF0657n의 폴리펩타이드 영역에 걸쳐있을 가능성이 있다. 예를 들어, 밴드 3은 질량분광분석법에 의해 ORF0657n의 아미노산 117-224에 대응하는 것으로 확인되고 계산된 분자량은 12.5kDa이었다. 이것은 SDS-PAGE에 의해 확인된 분자량은 19.5kDa이었다. 약 7kDa(계산된 분자량과 SDS-PAGE에서 확인된 분자량의 차이)에 대응하는 아미노산 영역이 질량분광분석법에서 확인된 펩타이드의 N-말단부 및 C-말단부에 첨가된다면, ORF0657n의 대략 아미노산 42-285에 대응하는 단편이 생길 것이다. 이러한 경우에 확인된 단편의 N-말단부 및 C-말단부 모두에 7kDa 영역이 첨가되므로, mAb CS-D7 결합을 달성하는데 필요한 ORF0657n의 최소 부위는 아미노산 42-285 내의 영역에 대응할 가능성이 있다. 실시예 6의 화학적 절단 실험은 아미노산 42-254에 대응하는 단편이 mAb CS-D7에 결합하지 않음을 시사하는 바, 아미노산 254-285에 대응하는 영역 또는 이의 일부가 적당한 항체 결합에 중요할 가능성이 있다.

실시예 8: 친화도 측정

scFv CS-D7 및 전체 길이의 IgG CS-D7의 표면 플라즈몬 공명(SPR) 평가는 Biacore로 수행했다. 결합 도메인과 항원 사이에 1:1 상호작용을 측정하기 위해 Biacore에서의 실험 구성은 분석되는 IgG가 항체 단편인지 전체 길이의 IgG인지에 따라 변형시켰다. IgG 측정을 위해, IgG는 리간드로 표면에 포획시키고 분석물로 ORF0658t를 진행시켰다. 항체 단편 분석을 위해서는 0657t를 리간드로 표면에 결합시키고, 항체 단편을 분석물로 진행시켰다. 두 방법의 비교는 유사한 결과를 초래했다(표 10). 표준편차는 각 실험마다 2회의 독립 실험으로부터 수득했다.

실시예 9: 유치 카테터 모델

래트에서 진행된 유치 카테터 모델에서 모노클로날 항체의 효능을 시험했다. 스프라그 돌리 래트는 유치 카테터(PE50 실리콘 고무)가 경정맥 내로 외과적으로 이식되고 봉합하여 고정되어 있고 래트의 등쪽 중심선 위로 배출되고 포트가 구비되어 있는 래트를 구입했다. 래트는 실험 개시 전에 7일이 넘게 사육했다. 에스.아우레우스에 의해 집락화로부터 유치 카테터의 항체 보호를 시험하기 위해, 래트에게 시험감염 1시간 전에 mAb 0 내지 4mg을 복강내로 주사했다. 시험감염은 꼬리 정맥을 통해 4X10⁹ CFU를 동물에게 접종했다. 24시간 후, 동물을 희생시키고 멸균 기술을 이용하여 카테터를 제거했다. 카테터(외측 포트가 제거된 전체 카테터)는 집락화를 평가하기 위해 만니톨 염 한천 또는 TSA(Teknova) 상에 놓았다. 평판을 37℃에서 24 내지 48시간 동안 배양했다. 집락 생성의 모든 징후는 배양 양성으로 기록했다. 5회의 분리 실험의 결과는 표 11과 12에 제시했다. 표 11에서 mAb CS-D7 4mg 용량과 mAb 20C2HA(이소타입 대조군) 4mg 용량을 비교한 p값은 <0.0001 이다. 표 11에서 PBS 대조군과 mAb CS-D7 4mg 용량을 비교한 p값은 <0.0001 이다.

실험 5에서 연구된 캐뉼라삽입된 래트(표 12)에게는 시험감염 1시간 전에 4mg 모노클로날 항체(CS-D7 또는 이소타입 대조군) 또는 PBS 단독을 복강내로 주사했다. 그 다음, 1 내지 2 X 10⁹ CFU의 에스.아우레우스 균주 Becker를 정맥내로 시험감염했다. 지정된 시점에 모든 래트로부터 혈액을 채취했다. 최종 시점(32시간)에서, 혈액을 채취하고 동물을 희생시킨 뒤, 카테터를 제거했다. 혈액은 TSA 평판 상에 50㎕를 도말하고 하룻밤 동안 배양했다. 카테터는 만니톨염 평판에서 하룻밤 동안 평판배양하여 에스.아우레우스에 대해 평가했다. 도 6에 도시된 바와 같이, 혈액 CFU의 감소는 mAb CS-D7의 주사시에 입증되었다.

실시예 10: 생체외 모델

모노클로날 항체를 본 발명의 방법을 사용하여 평가했다. 세균은 복강내(ip) 경로를 통해 치사량을 주사하기 전에 생체외에서 mAb로 사전면역옵소닌화하였다(생체외 방법). 6마리의 Balb/c 마우스에 충분한 다량의 세균(6 X LD₁₀₀)을 800㎍ IgG와 함께 4℃에서 1시간 동안 약한 진동 하에 항온배양했다. 그 다음, 세균을 펠릿화하고 결합되지 않은 mAb를 제거했다. 항체-면역옵소닌화된 세균을 PBS 2.4ml에 재현탁하고, 5마리 각 마우스에게 0.4ml(1X LD₁₀₀)씩 주사했다. 시험감염 후, 각 접종물을 TSA 상에서의 평판배양으로 정량분석하여 동등한 CFU가 모든 마우스 그룹에 제공되고, 그리고 mAb가 세균을 응집시키지 않도록 한다. 생존은 시험감염 후 3일 동안 모니터했다. 이 절차가 효과적이기 위해서는 세균의 표면에 표적 항원이 존재해야 하기 때문에, 면역옵소닌화 전에 ORF0657n이 세균에서 발현되도록 주의가 필요하다. 시험감염 균주는 철 함량이 낮은 배지 RPMI에서 2X 계대배양한 에스.아우레우스 RN4220이었다. 각 마우스에게 주사된, 면역옵소닌화된 세균의 용량은 1 내지 2 X 10⁹ CFU/마우스였다. 결과는 표 13에 제시했다.

실시예 11: 옵소닌포식작용 분석

옵소닌포식작용 활성(OPA) 분석은 옵소닌포식작용하는 항체의 능력을 평가하기 위해 개발되었다. 이 분석은 과립구 효과기 세포에 의한 세균의 포식작용 수준을 증가시키는, 세균 표면에 결합하고 그 표면에 보체(C')를 고정시키는 항체의 능력을 측정한다.

ORF0657n은 헴/Fe 획득에 관여하는 것으로 나타나는 에스.아우레우스의 표면에 존재하는 철 조절된 단백질이다. 이 분석에 사용된 에스.아우레우스 균주는 단백질 A를 만들지 않는 균주이다. 이러한 균주의 한 예는 에스.아우레우스 SH1000 이다. 이 분석을 위해, 이 균주는 ORF0657n의 발현이 증가되도록 철 결핍화된다. 이 균주는 또한 단백질 A를 생산하는 능력이 없다. 단백질 A는 모든 IgG의 Fc 부분에 결합할 수 있고, 이와 같은 비특이적 결합된 항체의 존재는 OPA 반응을 방해할 수 있다.

HL60 세포는 세포가 더욱 더 과립구 표현형쪽으로 분화하도록 유도하기 위해 5 내지 6일 동안 디메틸포름아미드(DMF)에 노출시켰다. 그 다음, 2% C'-충분한 기지균외 무감염상태 돼지 혈청을 항체 결합된 세포에 첨가했다. 마지막으로, 항체와 C' 노출된 세포를 그 다음 형광성 화학물질 5',6'-FAM-SE로 표지화했다.

옵소닌화된 형광표지된 세균 및 표지되지 않은 HL60_DMF 세포를 접종한 후, 포식작용의 수준은 표지된 세균을 함유하는 HL60_DMF 세포의 백분율을 유세포분석법으로 측정하여 수득했다. 포식된 세균을 보유한 HL60 세포의 백분율은 항체에 의해 유도된 옵소닌화의 양에 비례한다. ORF0657n에 대한 쥐 및 사람 mAb가 모두 이 분석에서 조사되었다. 결과는 도 4와 5에 예시했다.

ORF0657n-특이적 mAb는 이 분석에서 적정가능한 활성을 나타낼 수 있었다. 쥐 mAb 2H2.BE11은 쥐 이소타입 대조군 mAb, 6G6.A8보다 더 큰 활성을 나타냈다. 또한, 사람 mAb CS-D7 및 mAb CS-D10은 이들의 IgG1 이소타입 대조군에 비해 높은 옵소닌 활성을 나타냈다. 포식작용의 최대 수준을 나타내는데 필요한 mAb의 함량은 쥐 mAb 2H2.BE11에 대한 0.5㎍부터 사람 mAb에 대한 0.06 내지 0.25㎍ 범위였다. 사람 mAb CS-D7은 포식작용의 최대 수준을 발생시키는데 쥐 mAb 2H2.BE11 0.5㎍에 비해 0.06㎍만을 필요로 했다.

실시예 12: 추가 서열

에스.아우레우스 ORF0657n 서열을 제공하는 서열번호 47은 다음과 같다:

사람 람다 서열을 제공하는 서열번호 48은 다음과 같다:

실시예 13: mAb CS-D7의 치료요법적 투여

캐뉼라삽입된 래트는 꼬리 정맥을 통해 1 내지 2 X 10⁹ CFU 에스.아우레우스로 시험감염되었다. 1시간 후, 래트에게 4mg 모노클로날 항체(mAb CS-D7 또는 이소타입 대조군) 또는 PBS만을 복강내 주사했다. 시험감염 24시간 후, 래트를 희생시키고 카테터를 제거했다. 카테터는 만니톨염 평판에서 하룻밤 동안 평판배양하여 에스.아우레우스에 대해 평가했다. 4가지 다른 실험의 결과는 표 14에 제시했다.

실시예 14: 병용 치료 - 반코마이신 및 mAb CS - D7

캐뉼라삽입된 래트에게 2 내지 4 X 10⁹ CFU의 에스.아우레우스 Becker를 정맥내 시험감염하기 1시간(1H) 전에 피하로 반코마이신(20mpk)을 제공했다. 시험감염 1H 후, 래트에게 mAb CS-D6, 이소타입 대조군 mAb 20C2HA 또는 PBS 중 어느 하나를 6mg/래트로 주사했다. 시험감염 24시간 후, 동물을 희생시키고, 경정맥 카테터를 수거하여 카테터 상에 세균 부하량을 평가했다. 카테터의 평가는 선택성 액체 배지에 넣어 피콜로 접종 시스템에서 성장시켜 수행했다. 성장은 실험 카테터에 존재하는 CFU의 수를 계산하기 위해 동일한 조건 하에서 에스.아우레우스 성장의 표준 곡선과 비교했다. 1차 실험 세트(표 15)에서는, 소수의 동물을 사용하여 시스템을 검사했다. 2차 실험 세트(표 16)에서는 다수의 래트를 사용했다. 두 경우 모두, 이소타입 대조군 mAb의 존재시보다 mAb CS-D7의 존재시에 반코마이신의 유의적인 활성 증강을 나타냈다. 이는 mAb CS-D7이 반코마이신 단독일 때보다 세균 제거율을 증강시킬 수 있음을 시사한다. 이 모델은 환자가 수술이나 다른 침습 시술을 받고 있고, 실험적 또는 예방요법적 항생제를 투여받는 임상 상황을 모의하도록 설계했다. 이 모델에서, mAb는 세균 노출 후에 주사하여, 수술 중에 감염에 대한 보조적 mAb 치료를 모의했다. 이러한 매우 엄중한 조건 하에서, mAb는 유익한 효과를 나타냈다.

다른 양태들은 다음 청구의 범위에 속한다. 여러 양태들이 제시되고 설명되었지만, 본 발명의 취지와 범위를 벗어남이 없이 다양한 변형이 이루어질 수 있다.

<110> Merck & Co., Inc. <120> Antigen-binding proteins targeting S. aureus ORF0657n <130> 22319Y PCT <150> US 60/932,788 <151> 2007-05-31 <150> US 61/007,998 <151> 2007-12-17 <160> 54 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb CS-D7 light chain <400> 1 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Val Ser Asp Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Arg Pro 85 90 95 Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 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Ser Gly Asn Ser Ala Ser Leu Asp Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Glu Phe Leu Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 16 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb BMV-C2 heavy chain variable region <400> 16 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Asn Met Phe Tyr Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Ser Ile Ser Val Gly Pro Ser Ser Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Pro Leu Gly His Asn Phe Asp Ser Ser Gly Gln Gly Glu 100 105 110 Gly Ala Phe Glu Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb CS-D7 VL 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BMV-H11, BMV-E6 and BMV-D4 VL CDR3 <400> 31 Ser Ser Tyr Thr Thr Arg Ser Thr Arg Val 1 5 10 <210> 32 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb BMV-C2 VL CDR1 <400> 32 Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb BMV-C2 VL CDR2 <400> 33 Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb BMV-C2 VL CDR3 <400> 34 Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Glu Phe Leu 1 5 10 <210> 35 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAbs CS-D7, CS-E11, CS-D10 and CS-A10 VH CDR1 <400> 35 Gly Gly Ser Ile Arg Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly 1 5 10 <210> 36 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAbs CS-D7 and CS-E11 VH CDR2 <400> 36 Asn Val Phe Phe Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn 1 5 10 15 <210> 37 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAbs CS-D7, CS-E11, CS-D10 and CS-A10 VH CDR3 <400> 37 Pro Gln Ala Tyr Ser His Asp Ser Ser Gly His Ser Pro Phe Asp Leu 1 5 10 15 <210> 38 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb CS-D10 VH CDR2 <400> 38 Asn Val Phe Phe Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 39 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb CS-A10 VH CDR2 <400> 39 Asn Val Phe Phe Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Gly 1 5 10 15 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAbs BMV-H11, BMV-E6, BMV-D4 and BMV-C2 VH CDR1 <400> 40 Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly 1 5 10 <210> 41 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb BMV-H11 VH CDR2 <400> 41 Asn Met Phe Tyr Ser Gly Gly Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 42 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAbs BMV-H11 and BMV-C2 VH CDR3 <400> 42 Pro Leu Gly Tyr Asn Phe Asp Ser Ser Gly Gln Gly Lys Ser Ala Phe 1 5 10 15 Glu Ile <210> 43 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAbs BMV-E6 and BMV-C2 VH CDR2 <400> 43 Asn Met Phe Tyr Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 44 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb BMV-D4 VH CDR2 <400> 44 Asn Met Phe Tyr Ser Gly Gly Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn 1 5 10 15 <210> 45 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAbs BMV-E6 and BMV-C2 VH CDR3 <400> 45 Pro Leu Gly His Asn Phe Asp Ser Ser Gly Gln Gly Glu Gly Ala Phe 1 5 10 15 Glu Ile <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence of SEQ ID NOs: 35 and 40 <220> <221> VARIANT <222> 5 <223> Xaa = any amino acid <400> 46 Gly Gly Ser Ile Xaa Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly 1 5 10 <210> 47 <211> 645 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 47 Met Asn Lys Gln Gln Lys Glu Phe Lys Ser Phe Tyr Ser Ile Arg Lys 1 5 10 15 Ser Ser Leu Gly Val Ala Ser Val Ala Ile Ser Thr Leu Leu Leu Leu 20 25 30 Met Ser Asn Gly Glu Ala Gln Ala Ala Ala Glu Glu Thr Gly Gly Thr 35 40 45 Asn Thr Glu Ala Gln Pro Lys Thr Glu Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr 50 55 60 Thr Ser Glu Lys Ala Pro Glu Thr Lys Pro Val Ala Asn Ala Val Ser 65 70 75 80 Val Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala Pro Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala 85 90 95 Lys Glu Val Lys Glu Val Lys Ala Pro Lys Glu Thr Lys Ala Val Lys 100 105 110 Pro Ala Ala Lys Ala Thr Asn Asn Thr Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu 115 120 125 Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala Ile Lys Asp Lys Asp His Ser 130 135 140 Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe Glu Met Lys Lys Glu Asn Gly 145 150 155 160 Glu Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser Ser Val Lys Pro Ala Arg Val 165 170 175 Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly 180 185 190 Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro 195 200 205 Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg 210 215 220 Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala Val Lys Ile Val Ser Ser Thr 225 230 235 240 His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe 245 250 255 Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala Asp Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp 260 265 270 Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu 275 280 285 Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu 290 295 300 Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys Leu Glu Asp Thr Lys Lys Ala 305 310 315 320 Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln 325 330 335 Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val 340 345 350 Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser Met Met Asp Thr Phe Val Lys 355 360 365 His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Met Val Met 370 375 380 Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys Asp Phe Met Val Glu Gly Gln 385 390 395 400 Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile 405 410 415 Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys 420 425 430 Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp Gly Gln Tyr His Val Arg Ile 435 440 445 Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala Asn Thr Asp Lys Ser Asn Lys 450 455 460 Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys Lys Glu Ala Thr Pro Ala Thr 465 470 475 480 Pro Ser Lys Pro Thr Pro Ser Pro Val Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln 485 490 495 Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln Leu Pro Ser Val Glu Lys Glu 500 505 510 Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys Asp Lys Thr Pro Ala Thr Lys 515 520 525 Pro Thr Lys Gly Glu Val Glu Ser Ser Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val 530 535 540 Val Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala Lys Pro Thr Thr Ala Ser Ser Lys 545 550 555 560 Thr Thr Lys Asp Val Val Gln Thr Ser Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys 565 570 575 Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly 580 585 590 His Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn Thr Gln Glu Asn Lys Ala Lys 595 600 605 Ser Leu Pro Gln Thr Gly Glu Glu Ser Asn Lys Asp Met Thr Leu Pro 610 615 620 Leu Met Ala Leu Leu Ala Leu Ser Ser Ile Val Ala Phe Val Leu Pro 625 630 635 640 Arg Lys Arg Lys Asn 645 <210> 48 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 48 Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val 35 40 45 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 65 70 75 80 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95 Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 49 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain leader <400> 49 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 50 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain leader <400> 50 Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr 1 5 10 15 Asp Ala Arg Cys 20 <210> 51 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 51 acagatgcca gatgcgaaat tgtgatgaca cagtct 36 <210> 52 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 52 tgcagccacc gtacgtttaa tctccagtcg tgtccc 36 <210> 53 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 53 acaggtgtcc actcgcaggt gcagctgcag gagtcg 36 <210> 54 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer <400> 54 gcccttggtg gatgcactcg agacggtgac cagggt 36

Claims

제1 가변 영역과 제2 가변 영역을 포함하고, 상기 제1 및 제2 가변 영역이 CS-D7 표적 영역에 결합하는, 분리된 항원 결합 단백질.
제1항에 있어서, 제1 가변 영역이

서열번호 46 또는 서열번호 46과 하나의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는 제1 V_h CDR;

서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 41, 서열번호 43 또는 서열번호 44, 또는 서열번호 36, 38, 39, 41, 43 또는 44와 하나의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는 제2 V_h CDR; 및

서열번호 37, 서열번호 42 또는 서열번호 45, 또는 서열번호 37, 42 또는 45와 하나의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는 제3 V_h CDR

로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 중쇄 가변(V_h) 영역인, 항원 결합 단백질
제2항에 있어서, V_h 영역이 상기 제1 V_h CDR, 상기 제2 V_h CDR 및 상기 제3 V_h CDR을 포함하는 항원 결합 단백질.
제3항에 있어서, 제1, 제2 및 제3 V_h CDR이 각각

a) 서열번호 35, 서열번호 36 및 서열번호 37;

b) 서열번호 35, 서열번호 38 및 서열번호 37;

c) 서열번호 35, 서열번호 39 및 서열번호 37;

d) 서열번호 40, 서열번호 41 및 서열번호 42;

e) 서열번호 40, 서열번호 43 및 서열번호 45; 및

f) 서열번호 40, 서열번호 44 및 서열번호 42

로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 단백질.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 가변 영역이

서열번호 17, 서열번호 20, 서열번호 23, 서열번호 26, 서열번호 29 또는 서열번호 32를 포함하거나, 또는 서열번호 17, 20, 23, 26, 29 또는 32와 하나의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는 제1 V_l CDR;

서열번호 18, 서열번호 21, 서열번호 24, 서열번호 27, 서열번호 30 또는 서열번호 33을 포함하거나, 또는 서열번호 18, 21, 24, 27, 30 또는 33과 하나의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는 제2 V_l CDR; 및

서열번호 19, 서열번호 22, 서열번호 25, 서열번호 28, 서열번호 31 또는 서 열번호 34를 포함하거나, 또는 서열번호 19, 22, 25, 28, 31 또는 34와 하나의 아미노산이 상이한 서열을 포함하는 제3 V_l CDR

로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 경쇄 가변(V_l) 영역인 항원 결합 단백질.
제5항에 있어서, V_l 영역이 상기 제1 V_l CDR, 상기 제2 V_l CDR 및 상기 제3 V_l CDR을 포함하는 항원 결합 단백질.
제6항에 있어서, 제1, 제2 및 제3 V_l CDR이 각각

a) 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19;

b) 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22;

c) 서열번호 23, 서열번호 24 및 서열번호 25;

d) 서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28;

e) 서열번호 29, 서열번호 30 및 서열번호 31; 및

f) 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34

로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 단백질.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체인 항원 결합 단백질.
제8항에 있어서, 제1 V_h CDR, 제2 V_h CDR 및 제3 V_h CDR이 각각 서열번호 35, 서열번호 36 및 서열번호 37을 포함하고, 제1 V_l CDR, 제2 V_l CDR 및 제3 V_l CDR이 각각 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19를 포함하는 항원 결합 단백질.
제8항에 있어서, V_h 영역이 서열번호 2의 아미노산 1-126, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14 및 서열번호 16으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 단백질.
제10항에 있어서, V_l 영역이 서열번호 1의 아미노산 1-108, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 13 및 서열번호 15로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 단백질.
제8항에 있어서, 항체가

a) 서열번호 1의 아미노산 1-108을 포함하는 V_l 영역 및 서열번호 2의 아미노산 1-126을 포함하는 V_h 영역;

b) 서열번호 3을 포함하는 V_l 영역 및 서열번호 4를 포함하는 V_h 영역;

c) 서열번호 5를 포함하는 V_l 영역 및 서열번호 6을 포함하는 V_h 영역;

d) 서열번호 7을 포함하는 V_l 영역 및 서열번호 8을 포함하는 V_h 영역;

e) 서열번호 9를 포함하는 V_l 영역 및 서열번호 10을 포함하는 V_h 영역;

f) 서열번호 11을 포함하는 V_l 영역 및 서열번호 12를 포함하는 V_h 영역;

g) 서열번호 13을 포함하는 V_l 영역 및 서열번호 14를 포함하는 V_h 영역; 또는

h) 서열번호 15를 포함하는 V_l 영역 및 서열번호 16을 포함하는 V_h 영역

을 포함하는 항원 결합 단백질.
제12항에 있어서, V_h 영역이 서열번호 2의 아미노산 1-126을 포함하고, V_l 영역이 서열번호 1의 아미노산 1-108을 포함하는 항원 결합 단백질.
제8항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 IgG₁, IgG₂, IgG₃ 또는 IgG₄ 아형 유래의 힌지, CH₁, CH₂ 및 CH₃ 영역을 포함하는 중쇄; 및 V_l 영역과 사람 카파 C_l 또는 사람 람다 C_l을 포함하는 경쇄를 포함하는 항원 결합 단백질.
제1항에 있어서, 서열번호 1을 포함하는 경쇄 및 서열번호 2를 포함하는 중쇄를 포함하는 항체인 항원 결합 단백질.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기술된 항원 결합 단백질 중쇄 가변(V_h) 영역 또는 항원 결합 단백질 경쇄 가변(V_l) 영역을 암호화하는 적어도 하나의 재조합 유전자를 포함하는 핵산.
제16항에 있어서, 2개의 재조합 유전자를 포함하는 핵산으로서, 제1 재조합 유전자는 항원 결합 단백질 V_h 영역을 암호화하고 제2 재조합 유전자는 항원 결합 단백질 V_l 영역을 암호화하는 핵산.
제16항 또는 제17항의 재조합 핵산을 포함하는 재조합 세포.
항체 가변 영역을 포함하는 단백질의 생산방법으로서,

a) 제18항의 재조합 세포를 상기 단백질이 발현되는 조건 하에서 성장시키는 단계; 및

b) 상기 단백질을 정제하는 단계를 포함하는 생산방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질의 유효량을 환자 에게 투여하는 단계를 포함하여, 환자의 에스.아우레우스(S. aureus) 감염에 대하여 방어하거나 치료하는 방법.
제21항에 있어서, 환자가 사람이고 항원 결합 단백질이 수술 또는 이물질 이식과 함께 투여되는 방법.
제21항에 있어서, 환자가 에스.아우레우스로 감염된 사람인 방법.
에스.아우레우스 감염 치료용 약제의 제조에 있어서의 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 단백질의 용도.
서열번호 47의 아미노산 42-342와 서열 동일성이 적어도 95%인 아미노산 서열을 포함하고 길이가 아미노산 350개 이하인 폴리펩타이드.