CN101679516A - 靶向金黄色葡萄球菌ORF0657n的抗原结合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明表征了抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白结合被发现具有可被靶向以提供抵抗金黄色葡萄球菌感染的保护作用的表位的区域。所述区域在本文中被命名为“CS－D7”靶区域。CS－D7靶区域提供了金黄色葡萄球菌ORF0657n表位，该表位可被靶向以减少金黄色葡萄球菌感染的概率或严重度。
Description
交叉参考相关申请
本申请要求2007年5月31日提交的美国临时申请60/932,788和2007年12月17日提交的美国临时申请61/007,998的权益，所述美国临时申请都通过引用合并入本文。
发明背景
在整个本申请中引用的参考资料不被承认为所述发明的现有技术。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(S.aureus)是导致许多疾病和状况的病原体。由金黄色葡萄球菌引起的疾病和状况的实例包括菌血症、传染性心内膜炎、毛囊炎、疖、痈、脓疱病、大疱性脓疱病、蜂窝组织炎、葡萄菌病、中毒性休克综合征、皮肤烫伤综合征(scalded skinsyndrome)、中枢神经系统感染、传染性和炎性眼疾病(infective andinflammatory eye disease)、骨髓炎和关节与骨的其他感染以及呼吸道感染。(The Staphylococci in Human Disease，Crossley和Archer(eds.)，Churchill Livingstone Inc.1997.)
基于免疫的策略可用于控制金黄色葡萄球菌感染和金黄色葡萄球菌的传播。基于免疫的策略包括被动和主动免疫。被动免疫使用靶向金黄色葡萄球菌的免疫球蛋白。主动免疫诱导抵抗金黄色葡萄球菌的免疫应答。
发明概述
本发明表征了抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白结合被发现具有可被靶向以提供抵抗金黄色葡萄球菌感染的保护作用的表位的区域。所述区域在本文中称为“CS-D7”靶区域。CS-D7靶区域提供了金黄色葡萄球菌ORF0657n的表位，该表位可被靶向以减少金黄色葡萄球菌感染的概率或严重度。
因此，本发明的第一方面表征了分离的抗原结合蛋白，所述蛋白包含第一可变区和第二可变区，其中所述可变区结合CS-D7靶区域。CS-D7靶区域被单克隆抗体CS-D7(mAb CS-D7)特异性靶向。MAb CS-D7是具有两条具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的轻链和两条具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链的免疫球蛋白。
“分离的”表示与在天然环境中发现的不同的形式。该不同的形式可以例如是与天然环境中发现的不同的纯度和/或非天然环境中发现的结构。非天然环境中发现的结构包括其中将不同区域组合在一起的重组结构，例如人源化抗体(其中将一个或多个鼠互补决定区插入人构架支架或赋予鼠抗体新表面以模拟人抗体的表面残基)、杂交抗体(其中将来自抗原结合蛋白的一个或多个互补决定区插入不同的构架支架)以及来源于天然人序列的、其中将编码轻链和重链可变结构域的基因随机组合在一起的抗体。
分离的蛋白质优选基本上不含血清蛋白。基本上不含血清蛋白的蛋白质存在于缺乏大部分或所有血清蛋白的环境中。
“可变区”具有来自重链或轻链的抗体可变区的结构。抗体重链和轻链可变区包含3个间插在构架上的互补决定区。互补决定区主要负责识别特定表位。
根据被mAb CS-D7结合的ORF0657n区域(SEQ ID NO：47)来限定靶区域。当使用基于Luminex的抑制测定法，使用过量和等量的竞争性蛋白质和单克隆抗体时，结合CS-D7靶区域的蛋白质减少mAb CS-D7与ORF0657n的结合至少大约20％，优选至少大约50％。
“蛋白质”表示连续的氨基酸序列并且不提供最小或最大的大小限制。存在于蛋白质中的一个或多个氨基酸可包含翻译后修饰例如糖基化或二硫键的形成。
优选抗原结合蛋白是单克隆抗体。“单克隆抗体”表示具有相同的或基本上相同的结构的抗体的集合。抗体中的变化是当所述抗体从相同的结构产生时可发生的变化。
单克隆抗体可以例如从特定的杂交瘤以及从包含一个或多个编码抗体的重组基因的重组细胞产生。抗体可由多个重组基因编码，其中例如一个基因编码重链，一个基因编码轻链。
本发明的另一个方面描述了包含一个或多个编码抗原结合蛋白Vh区域或Vl区域或两者的重组基因的核酸，其中抗原结合蛋白结合CS-D7靶区域。多个重组基因是有用的，例如，其中一个基因编码抗体重链或其包含Vh区的片段，另一个基因编码抗体轻链或其包含Vl区的片段。
重组基因包含编码蛋白质的重组核酸和用于正确转录和加工的调控元件(其可包括翻译和翻译后元件)。由于其序列和/或形式，重组核酸不存在于天然环境中。重组核酸的实例包括纯化的核酸、组合在一起从而提供与天然环境中发现的不同的核酸的两个或更多个核酸区域以及不存在一个或多个彼此天然连接的核酸区域(例如，上游或下游区域)。
本发明的另一个方面表征了包含一个或多个编码抗原结合蛋白Vh区或Vl区或两者的重组基因的重组细胞。优选重组细胞同时表达Vh和Vl区域。
本发明的另一个方面包括产生包含抗体可变区的蛋白质的方法。所述方法包括步骤：(a)在其中使所述蛋白质表达的条件下培养包含编码所述蛋白质的重组核酸的重组细胞；和(b)纯化蛋白质。优选，蛋白质是完整的抗原结合蛋白。
本发明的另一个方面描述了药物组合物。组合物包含治疗有效量的本文中描述的抗原结合蛋白和药学上可接受的载体。
治疗有效量是足以提供有用的治疗或预防效果的量。对于感染了金黄色葡萄球菌的患者，有效量足以获得一个或多个下列效果：减少金黄色葡萄球菌在患者体内繁殖的能力或减少患者体内的金黄色葡萄球菌的量。对于未感染金黄色葡萄球菌的患者，有效量足以获得一个或多个下列效果：减少对金黄色葡萄球菌感染的易感性或减少感染性细菌建立持续感染来产生慢性疾病的能力。
本发明的另一个方面描述了治疗有效量的抗原结合蛋白在制备用于防治(治疗上或预防性上)以抵抗金黄色葡萄球菌感染的药剂中的用途。
本发明的另一个方面表征了治疗患者以抵抗金黄色葡萄球菌感染的方法。所述方法包括对患者施用有效量的本文中描述的抗原结合蛋白(包括其药物组合物)的步骤。被治疗的患者可以感染了金黄色葡萄球菌或可以未感染金黄色葡萄球菌。优选，患者是人。
本发明的另一个方面表征了包含具有与SEQ ID NO：47的氨基酸42-342至少95％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽的长度最高达到350个氨基酸。
开放式术语(open-ended term)例如“包括”允许存在额外的元素或步骤。有时，将短语例如“一个或多个”与开放式术语一起或不与其一起使用来强调额外的元素或步骤的可能性。
除非明确地指出，否则术语例如“a”或“an”不限定于一个。例如“a细胞”不排除“多个细胞”。有时，短语例如一个或多个用于强调多个的可能存在。
根据本文中提供的其他描述，包括不同的实施例，本发明的其他特征和有利方面将变得显然。所提供的实施例举例说明用于实施本发明的不同组成部分和方法。所述实施例不限定本发明。基于本公开内容，本领域技术人员可鉴定和使用用于实施本发明的其他组成部分和方法。
附图概述
图1举例说明IgG分子的结构。“Vl”表示轻链可变区。“Vh”表示重链可变区。“Cl”表示轻链恒定区。“CH1”、“CH2”和“CH3”是重链恒定区。虚线表示二硫键。
图2提供了mAb CS-D7轻链可变区(SEQ ID NO：1的氨基酸1-108)、mAb CS-E11轻链可变区(SEQ ID NO：3)、mAb CS-D10轻链可变区(SEQID NO：5)、mAb CS-A10轻链可变区(SEQ ID NO：7)、mAb BMV-H11轻链可变区(SEQ ID NO：9)、mAb BMV-E6轻链可变区(SEQ ID NO：11)、mAb BMV-D4轻链可变区(SEQ ID NO：13)和mAb BMV-C2轻链可变区(SEQ ID NO：15)的序列比较。互补决定区1、2和3以粗体显示，用SEQ ID NO：标识不同的CDR序列。
图3提供了mAb CS-D7重链可变区(SEQ ID NO：2的氨基酸1-126)、mAb CS-E11重链可变区(SEQ ID NO：4)、mAb CS-D10重链可变区(SEQ ID NO：6)、mAb CS-A10重链可变区(SEQ ID NO：8)、mAbBMV-H11重链可变区(SEQ ID NO：10)、mAb BMV-E6重链可变区(SEQ ID NO：12)、mAb BMV-D4重链可变区(SEQ ID NO：14)和mAbBMV-C2重链可变区(SEQ ID NO：16)的序列比较。互补决定区1、2和3以粗体显示，用SEQ ID NO：标识不同的CDR序列。
图4举例说明使用调理吞噬活性(OPA)测定法测定的mAb CS-D7提供抵抗金黄色葡萄球菌的保护作用的能力。
图5举例说明使用调理吞噬活性(OPA)测定法测定的mAb CS-D10提供抵抗金黄色葡萄球菌的保护作用的能力。
图6举例说明mAb CS-D7减轻金黄色葡萄球菌性菌血症的能力。
发明详述
归因于它们结合CS-D7靶区域的能力，本文中所述的抗原结合蛋白可以例如在基于ORF0657n的抗原的生产、表征或研究中用作工具；和/或用作治疗金黄色葡萄球菌感染的试剂。ORF0657n是位于金黄色葡萄球菌外膜上的金黄色葡萄球菌蛋白。已发现ORF0657n在不同的金黄色葡萄球菌中保守性较高。(Anderson等人，国际公开号WO 2005/009379，国际公开日期200年2月3日)。可使用不同的ORF0657n衍生物来产生抵抗金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫应答。(Anderson等人，国际公开号WO 2005/009379，国际公开日期2005年2月3日)。
I.抗原结合蛋白
抗原结合蛋白包含提供对表位的特异性结合的抗体可变区。抗体可变区可存在于例如完整抗体、抗体片段和抗体或抗体片段的重组衍生物中。
不同种类的抗体具有不同的结构。不同抗体区域可通过参考IgG(图1)来进行举例说明。IgG分子包含4个氨基酸链：两个较长的重链和两个较短的轻链。重链和轻链各自包含恒定区和可变区。在可变区内是3个负责抗原特异性的高变区。(参见，例如Breitling等人，RecombinantAntibodies，John Wiley & Sons，Inc.and Spektrum Akademischer Verlag，1999；和Lewin，Genes IV，Oxford University Press and Cell Press，1990.)
高变区(也称为互补决定区)介于更保守的侧翼区(flanking region)(也称为构架区)之间。可如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，U.S.Department of Health and Human Services，1991中所述，对与构架区和互补决定区(CDR)相关的氨基酸进行编号和比对。
两个重链羧基区是由二硫键连接(从而产生Fc区)的恒定区。Fc区对于提供效应子功能是非常重要的。(Presta，Advanced Drug DeliveryReviews 58：640-656，2006.)组成Fc区的两条重链中的每一条重链通过铰链区延伸入不同的Fab区。
在高等脊椎动物中，存在两种类型的轻链和五种类型的重链。轻链是κ或λ。重链定义了抗体的类型，其为α、δ、ε、γ或μ。例如，IgG具有γ重链。对于不同类型的重链还存在亚型例如人γ1、γ2、γ3和γ4。重链赋予铰链区和尾部区域独特的构象。(Lewin，Genes IV，OxfordUniversity Press and Cell Press，1990.)
包含抗体可变区的抗体片段包括Fv、Fab和Fab2区。各Fab区包含由可变区和恒定区组成的轻链以及包含可变区和恒定区的重链区域。轻链通过恒定区中的二硫键连接至重链。Fab区的轻链和重链可变区提供参与抗原结合的Fv区。
抗体可变区可存于重组衍生物中。重组衍生物的实例包括单链抗体、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)和微型抗体(miniantibody)。(Kipriyanov等人，Molecular Biotechnology26：39-60，2004.)
抗原结合蛋白可包含一个或多个识别相同或不同表位的可变区。(Kipriyanov等人，Molecular Biotechnology 26：39-60，2004.)
II.导向CS-D7靶区域的抗原结合蛋白的产生
导向CS-D7靶区域的抗原结合蛋白可使用不同的技术来获得，所述技术是例如利用结合CS-D7靶区域的抗原结合蛋白和筛选结合靶区域的另外的结合蛋白的技术。抗体结合CS-D7靶区域的能力可使用Luminex测定法和mAb CS-D7(参见下文中的实施例2)来估量。可以以不同的方式使用结合CS-D7靶区域的抗原结合蛋白来获得另外的结合蛋白，例如使用来自抗原结合蛋白的序列信息和/或修饰抗原结合蛋白来获得。
II.A.可变区设计
抗原结合蛋白的可变区可基于结合CS-D7靶区域的可变区来设计。基于Luminex测定，可发现命名为CS-D7、CS-E11、CS-D10、CS-A10、BMV-H11、BMV-E6、BMV-D4和BMV-C2的mAb结合相同的区域。图2提供了这些不同抗体的轻链可变区的序列比较。图3提供了这些不同抗体的不同重链可变区的序列比较。
图2和3中的序列比较提供了抗原结合蛋白的不同可变区CDR和构架序列的实例。图2和3中举例说明的抗体可变区来源于外周血淋巴细胞库(命名为“BMV”)或脾淋巴细胞(命名为“CS”)。
CDR主要负责结合特定表位。在特定CDR内，存在少数特异性决定残基(specificity determining residue)(SDR)，其对于与表位的结合更加重要。(Kashmiri等人，Methods 36：25-34，2005，Presta，Advanced DrugDelivery Reviews 58：640-656，2006)。可以例如通过抗体结合部位(antibody combining site)的抗原-抗体三维结构和突变分析的帮助来鉴定SDR。(Kashmiri等人，Methods 36：25-34，2005.)
构架区帮助提供总体结构并且比CDR更能耐受不同的氨基酸变异。多种不同的天然存在的构架区在本领域内是熟知的。(参见例如，Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Department ofHealth and Human Services，1991.)
mAbs CS-D7、CS-E11、CS-D10、CS-A10、BMV-H11、BMV-E6、BMV-D4和BMV-C2的可变区和相应的CDR SEQ ID NOs：示于图2和图3的序列比较中。表1提供了CDR SEQ ID Nos的概述。
表1
图2和3中举例说明的序列比较提供了构架区和CDR区内的不同氨基酸置换的实例。可对构架区和CDR区进行改变，所述改变仍然保持对于CS-D7结合区域的特异性。
II.B.筛选另外的结合蛋白
靶向CS-D7靶区域的另外的结合蛋白可使用全长ORF0657n或提供被mAb CS-D7识别的表位的多肽来获得。CS-D7靶区域显示位于ORF0657n的大致氨基酸42-342(SEQ ID NO：47)内。
多种技术可获得用来选择识别抗原的蛋白质。此类技术的实例包括使用噬菌体展示技术和杂交瘤的产生。人抗体可始于人噬菌体展示文库来产生或使用嵌合子小鼠例如XenoMouse或转染色体小鼠(Trans-Chromo mouse)来产生。(E.g.，Azzazy等人，Clinical Biochemistry35：425-445，2002，Berger等人，Am.J.Med.Sci.324(1)：14-40，2002.)
还可获得非人抗体例如鼠抗体。可使用技术例如鼠抗体人源化、去免疫化作用和嵌合抗体的产生来减少人抗小鼠抗体的潜在产生。(参见，例如O’Brien等人，Humanization of Monoclonal Antibodies by CDRGrafting，p 81-100，From Methods in Molecular Biology 第207卷：Recombinant antibodies for Cancer Therapy：Methods and Protocols(Eds.Welschof和Krauss)Humana Press，Totowa，New Jersey，2003；Kipriyanov等人，Molecular Biotechnology 26：39-60，2004；Gonzales等人，Tumor Biol.26：31-43，2005，Presta，Advanced Drug Delivery Reviews 58：640-656，2006，Tsurushita等人，Methods 36：69-83，2005，Roque等人，Biotechnol.Prog.20：639-654，2004.)
可使用技术例如亲和力成熟来进一步增强抗原结合蛋白选择性结合靶的能力。可以例如通过将突变导入CDR区，然后测定突变对结合的作用来进行亲和力成熟。可使用不同的技术来导入突变。(Rajpal等人，PNAS 102：8466-8471，2005，Presta，Advanced Drug Delivery Reviews58：640-656，2006.)
II.C.另外的组分
抗体结合蛋白可包括另外的组分，包括但不限于除了提供或帮助提供有用的活性的可变区或另外的可变区外的组分。有用的活性包括抗体效应子功能例如抗体依赖性细胞毒性、噬菌作用、补体依赖性细胞毒性和半衰期/清除率。(Presta，Advanced Drug Delivery Reviews 58：640-656，2006.)其他有用的活性包括使用可通过结合蛋白被递送至金黄色葡萄球菌的毒性基团，和使用靶向宿主或外来抗原以增强靶向CS-D7靶区域的第一抗原结合蛋白的稳定性或活性的第二抗原结合蛋白。
抗体效应子功能由不同的宿主组分例如Fcγ受体、新生儿Fc受体(FcRn)和C1q来介导。(Presta，Advanced Drug Delivery Reviews58：640-656，2006，Satoh等人，Expert Opin.Biol.Ther.6：1161-1173，2006.)不同类型的抗体组分或变化可用于增强效应子功能。有用的组分或变化的实例包括非岩藻糖基化低聚糖、具有增强的对FcRn的结合的氨基酸和具有增加的对Fcγ受体的结合的氨基酸变化的使用。(Presta，AdvancedDrug Delivery Reviews 58：640-656，2006；Satoh等人，Expert Opin.Biol.Ther.6：1161-1173，2006；Lazar等人，美国专利申请公开号US2004/0132101；Shields等人，The Journal of Biological Chemistry276：6591-6604，2001；Dall′Acqua等人，The Journal of BiologicalChemistry 281：23514-23524，2006.)
在本发明的一个实施方案中，靶向CS-D7靶区域的抗原结合蛋白是双特异性的。靶向CS-D7的双特异性抗原结合蛋白包含两个或更多个区域，其中一个区域靶向CS-D7靶位点，第二区域靶向不同的表位。可存在另外的区域。一般类型的双特异性抗原结合蛋白的实例包括双特异性抗体和杂多聚体(heteropolymer)，其两者都可以以多价例如二价、双价、四价等提供。
在实施方案中，双特异性抗原结合蛋白是双特异性抗体(参见，例如，Marvin and Zhu，Acta Pharmacologica Sinica 26：649-658，2005；Zuo等人，Protein Engineering 13：361-367，2000；Ridgway等人，ProteinEngineering 9：617-621，1996；Alt等人，FEBS Letters 454：90-94，1999；Carter，J.Immunol.Methods 248：7-15，2001).在另外的实施方案中，靶向CS-D7靶区域的双特异性抗体也靶向宿主或外来抗原。宿主抗原可被靶向，例如，以增加稳定性或活性。涉及双特异性抗体的不同实施方案的实例，包括但不限于下列抗体的任何组合：包含Fc或经修饰的Fc结构域的双特异性抗体(其能够介导抗体效应子功能)；为双价、三价或四价的双特异性抗体；和包含特异性结合C3b-样受体或另一种外来抗原(例如在体内感染期间在细菌表面上表达的金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌体(S.epidermidis)抗原)的第二抗原结合蛋白的双特异性抗体(例如，LTA、荚膜；O′Riordan and Lee，Clin.Micro.Rev.17：218-234，2004；Lees A.，KoKai-kun J.，LopezAcosta A.，Acevedo J.，Mond J.2005.Lipotechoic Acid Conjugate Vaccine for Staphylococcus[abstract].In：8thAnnual Conference on Vaccine Research；2005 May 8-11；Baltimore.S1：p.58；Fischer等人，美国专利6,610,293；Stinson等人，美国专利7,250,494)。
在另一个实施方案中，靶向CS-D7靶区域的双特异性抗原结合蛋白可包含在具有靶向宿主或外来抗原的第二抗原结合蛋白的杂多聚体复合物中。宿主抗原可被靶向以增强抗原结合蛋白的稳定性或活性。不同实施方案的实例包括下列物质的任何组合：包含能够介导抗体效应子功能的Fc或经修饰的Fc结构域的杂多聚体；为二价体、三价体或四价体的杂多聚体；和包含特异性结合C3b-样受体或另一种外来抗原(例如在体内感染期间在细菌表面上表达的金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌体抗原)的第二抗原结合蛋白的杂多聚体。化学交联两种抗体以形成杂多聚体复合物的方法在本领域内是已知的。(Taylor等人，Proc，Natl.Acad.Sci.USA 88：3305-3309，1991；Powers等人，Infection and Immunity63：1329-1335，1995.)
靶向红细胞的C3b-样受体可帮助从血流清除病原体。(参见Lindorfer等人，Immunological Reviews 183：10-24，2001；Mohamed等人，Current Opinion in Molecular Therapeutics 7：144-150，2005.)灵长类动物中的C3b-样受体在其他哺乳动物中被称为CR1或CD35和因子II。在正常免疫粘着(immune adherence)条件下，用补体蛋白(例如，C3b、C4b)(其随后可结合红细胞(“RBC”)表面上的CR1)标记包含与抗体结合的病原体(所述抗体特异性结合该病原体)的免疫复合物(“IC”)。RBC将IC递送至表达Fc受体(即，FcγR)的吞噬细胞(例如，巨噬细胞)，从而通过IC的Fc部分与细胞表面上的Fc受体之间的相互作用将IC转移至吞噬细胞。然后IC被吞噬细胞被坏，同时RBC返回循环。包含双特异性抗原结合蛋白复合物(其中一个抗原结合蛋白对于CR1是特异性的)的杂多聚体避开了对激活补体级联反应的需要，因为抗CR1抗体用作C3b(CR1的天然配体)的替代物。这可提高用于靶清除的天然免疫粘着过程的功效。
在另外的实施方案中，双特异性抗体或杂多聚体靶向CS-D7靶区域和CR1，并且还包含Fc恒定区。该实施方案中的杂多聚体包含两个不同的抗体，所述抗体中的任一个或两个具有Fc恒定区。在本发明的一个实施方案中，杂多聚体的抗-CR1抗体特异性结合小鼠CR1。在第二实施方案中，抗-CR1抗体特异性结合人CR1。CR1-特异性抗体在本领域内是已知的(参见，例如，Nickells等人，Clin.Exp.Immunol.112：27-33，1998)。
在本发明的另一个实施方案中，靶向CS-D7靶区域的抗原结合蛋白包含改变抗原结合蛋白的生理化学性质的另外的组分，从而提供了显著的药理学有利方面。例如，多聚乙醇(“PEG”)至分子的连接可在当分子用作治疗时帮助提高所述分子的安全性和功效。生理化学变化包括但不限于可共同作用以增加治疗剂的全身性保留的构象的改变、静电结合以及疏水作用的变化。此外，通过连接PEG部分以增加抗原结合蛋白的分子量，药理学有利方面包括延长的循环周期、增加的稳定性以及增强的抵抗宿主蛋白酶的保护作用。PEG连接(attachment)还可影响治疗部分与细胞受体的结合亲和力。PEG是由重复单位(-O-CH2-CH2-)组成的产生一系列从400至15,000以上(例如，分子量最高达到400,000的PEG聚合物可商购获得)的分子量的非离子聚合物。
II.D.不同实施方案的实例
靶向CS-D7靶区域的抗原结合蛋白包含第一可变区和第二可变区，其中第一和第二可变区结合靶区域。基于本文中提供的指导，可产生具有不同CDR和构架氨基酸的靶向CS-D7靶区域的抗原结合蛋白。可存在另外的组成部分例如铰链区、Fc区、毒性部分和/或另外的抗原结合蛋白或结合区(参见部分II.C.，同上)。
在涉及抗原结合蛋白的第一实施方案中，第一可变区是包含任何一个、二个或所有三个下列CDR的Vh区：
包含SEQ ID NO：46或与SEQ ID NO：46相异在于一个氨基酸的序列的第一Vh CDR；SEQ ID NO：46基于SEQ ID NOs：35和40。SEQ IDNO：46具有下列氨基酸序列GGSIX1SSSYYWG，其中X1是任何氨基酸。优选，X1是丝氨酸或精氨酸；
包含SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：44，或与SEQ ID NOs：36、38、39、41、43或44相异在于一个氨基酸的序列的第二Vh CDR；优选第二VhCDR包含SEQ ID NOs：36、38、39、41、43或44；和，
包含SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：45，或与SEQID NOs：37、42或45相异在于一个氨基酸的序列的第三Vh CDR；优选，第三Vh CDR包含SEQ ID NOs：37、42或45。
优选，Vh区包含第一Vh CDR(CDR1)、第二Vh CDR(CDR2)和第三Vh CDR(CDR3)。
在第二实施方案中，第一可变区是包含第一、第二和第三CDR的Vh区，所述第一、第二和第三CDR包含选自下列序列的氨基酸序列：
a)分别地SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37；
b)分别地SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：37；
c)分别地SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：37，；
d)分别地SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42；
e)分别地SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：45；和，
f)分别地SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：42。
在另外的实施方案中，第一可变区是包含含有SEQ ID NO：35的第一Vh CDR、含有SEQ ID NO：36的第二Vh CDR和含有SEQ ID NO：37的第三Vh CDR的Vh区。
在第三实施方案中，第二可变区是包含任何一个、二个或所有三个下列CDR的Vl区：
包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：32，或与SEQ ID NOs：17、20、23、26、29或32相异在于一个氨基酸的序列的第一VlCDR；优选第一VlCDR包含SEQ ID NOs：17、20、23、26、29或32；
包含SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：33，或与SEQ ID NOs：18、21、24、27、30或33相异在于一个氨基酸的序列的第二VlCDR；优选第二VlCDR包含SEQ ID NOs：18、21、24、27、30或33；和，
包含SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：34，或与SEQ ID NOs：19、22、25、28、31或34相异于一个氨基酸的序列的第三VlCDR；优选第三VlCDR包含SEQ ID NOs：19、22、25、28、31或34。
优选，Vl区包含第一VlCDR(CDR1)、第二VlCDR(CDR2)和第三VlCDR(CDR3)。
在第四实施方案中，第二可变区是包含第一、第二和第三CDR的Vl区，所述第一、第二和第三CDR包含选自下列序列的氨基酸序列：
a)分别地SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19；
b)分别地SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22；
c)分别地SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25；
d)分别地SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28；
e)分别地SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31；和，
f)分别地SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34。
在另外的实施方案中，第一可变区是包含含有SEQ ID NO：17的第一VhCDR、含有SEQ ID NO：18的第二VlCDR和含有SEQ ID NO：19的第三VlCDR的Vl区。
在第五实施方案中，结合蛋白包含第一或第二实施方案中所述的Vh区和第三或第四实施方案中所述的Vl区。
在第六实施方案中，抗原结合蛋白包含Vh区和Vl区，其各自包含第一、第二和第三CDR，其中所述第一、第二和第三VhCDR和所述第一、第二和第三VlCDR分别包含选自下列序列的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19；
b)SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22；
c)SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25；
d)SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28；
e)SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31；
f)SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31；
g)SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31；
h)SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34；和，
其中SEQ ID NO的顺序相应于Vh CDR1、Vh CDR2、Vh CDR3、VlCDR1、VlCDR2和VlCDR3。在另外的实施方案中，Vh CDR1、Vh CDR2、Vh CDR3、VlCDR1、VlCDR2和VlCDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19。
在第七实施方案中，结合蛋白是具有一个或多个上述第一至第六实施方案中描述的可变区的抗体。在另外的实施方案中，抗体是IgG。
在第八实施方案中，上述实施例1至7中提供的可变区具有构架区，所述构架区具有与mAbs CS-D7、CS-E11、CS-D10、CS-A10、BMV-H11、BMV-E6、BMV-D4和BMV-C2的轻链或重链构架中的至少一个至少90％的序列同一性(参见图2和3)。
与参照序列的序列同一性(也称为百分比同一性)可通过将序列与参照序列比对，然后测定相应区域内的相同氨基酸的数目来测定。将该目除了参照序列(例如，SEQ ID NO：1的构架区)中的氨基酸的总数，然后乘以100并且四舍五入至最接近的整数。序列同一性可通过许多本领域公认的序列比较算法或通过目测观察(通常参见Ausubel，F M，等人，Current Protocols in Molecular Biology，4，John Wiley & Sons，Inc.，Brooklyn，N.Y.，A.1E.1-A.1F.11，1996-2004)来测定。在另外的实施方案中，序列同一性是与mAbs CS-D7、CS-E11、CS-D10、CS-A10、BMV-H11、BMV-E6、BMV-D4或BMV-C2的任一个的构架区至少95％，或至少98％的同一；或与mAb构架区的任一个相异在于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。
在第九实施方案中，本发明的抗原结合蛋白是包含第一可变区的抗体，所述第一可变区是包含选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16的氨基酸序列1-126的氨基酸序列的Vh区。在另外的实施方案中，Vh区包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列1-126。
在第十实施方案中，本发明的抗原结合蛋白是包含第二可变区的抗体，所述第二可变区是包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15的氨基酸1-108的氨基酸序列的Vl区。在另外的实施方案中，Vl区包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-108。
在第十一实施方案中，抗原结合蛋白是包含下列序列的抗体：
a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-108的轻链可变(Vl)区和包含SEQ ID NO：2的氨基酸1-126的重链可变(Vh)区；
b)包含SEQ ID NO：3的Vl区和包含SEQ ID NO：4的Vh区；
c)包含SEQ ID NO：5的Vl区和包含SEQ ID NO：6的Vh区；
d)包含SEQ ID NO：7的Vl区和包含SEQ ID NO：8的Vh区；
e)包含SEQ ID NO：9的Vl区和包含SEQ ID NO：10的Vh区；
f)包含SEQ ID NO：11的Vl区和包含SEQ ID NO：12的Vh区；
g)包含SEQ ID NO：13的Vl区和包含SEQ ID NO：14的Vh区；和，
h)包含SEQ ID NO：15的Vl区和包含SEQ ID NO：16的Vh区。
在另外的实施方案中，Vh区包含SEQ ID NO：2的氨基酸1-126，Vl区包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-108。
在第十二实施方案中，结合蛋白是上述实施例7至11中描述的抗体，其包含含有来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型的铰链区、CH1、CH2和CH3区的重链；和包含人κCl或人λCl的轻链。在另外的实施方案中，抗体是单克隆抗体。
在第十三实施方案中，结合蛋白是其中轻链包含SEQ ID NO：1并且重链包含SEQ ID NO：2的抗体。
在第十四实施方案中，结合蛋白是上述实施例7至13中描述的抗体，其包含一个或多个下列修饰：为非岩藻糖基化或基本上(即，按摩尔数计算存在低于10％的糖类)非岩藻糖基化的糖基化模式；一个或多个增强Fcγ受体结合的氨基酸变化；一个或多个增强新生儿Fc受体(FcRn)结合的氨基酸变化；和，一个或多个增强C1q结合的氨基酸变化。
在第十五实施方案中，上述实施例1至14中所述的指出的区域(例如，可变区、CDR区、构架区)由或基本上由指出的序列组成。关于区域例如可变区、CDR区或构架区，“基本上由……组成”表示一个或多个另外的氨基酸可能存在于氨基和/或羧基端，其中此类氨基酸不显著降低与靶的结合。
在第十六实施方案中，上述实施方案1至15中描述的抗原结合蛋白具有对靶抗原提供了100nM或更低的KD，或500pM或更低的KD的Vh和Vl区。可如实施例8中所描述的，测定与靶抗原的结合。
在第十七实施方案中，上述实施方案1至16中描述的抗原结合蛋白与至少一个或多个另外的组分连接，所述另外的组分包括但不限于毒性部分、增加抗原结合蛋白的生理化学和/或药理性质的分子以及第二抗原结合蛋白(参见部分II.C.，同上)。在另外的实施方案中，抗原结合蛋白是杂多聚体，其包含靶向与第二抗原结合蛋白(例如，抗CR1抗体)化学交联的CS-D7靶区域的抗原结合蛋白。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白具有一个或多个PEG部分。
不同实施方案中描述的氨基酸差异(包括提供序列同一性的差异的氨基酸差异)可以是氨基酸缺失、插入或置换。在置换氨基酸以保持活性中，被置换的氨基酸应当具有一个或多个相似的性质例如大致相同的电荷、大小、极性和/或疏水性。CDR，虽然负责结合靶，但可被改变并且仍然保持靶特异性。构架区序列也可被改变。
图2和3中提供的序列比较举例说明了CDR和构架区中的变异的实例。可产生除了图2和3中举例说明的变异外的变异。在涉及氨基酸差异的实施方案中，另外的变异是保守性氨基酸置换。保守置换用另一个具有相似性质的氨基酸来替换氨基酸。表2提供了氨基酸的组的列表，其中组的一个成员是另一个成员的保守置换。
表2：保守置换
| Ala、Val、Ile、Leu、Met |
| Ser、Thr |
| Tyr、Trp |
| Asn、Gln |
| Asp、Glu |
| Lys、Arg、His |
II.E.抗原结合蛋白混合物
可将靶向CS-D7靶区域的抗原结合蛋白与一种或多种另外的靶向不同ORF0657n表位或不同蛋白质的结合蛋白一起配制，从而形成抗原结合蛋白混合物。本发明的一个实施方案涉及抗原结合蛋白混合物，所述混合物包含至少两种抗原结合蛋白或其复合物的组合(参见，上面，部分II.C.)、其中至少一种抗原结合蛋白靶向本文中描述的CS-D7靶区域。另外的抗原结合蛋白对于在体内感染期间在细菌细胞表面上表达的另外的金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌抗原是特异性的，所述抗原包括但不限于下列抗原：LTA和荚膜(O′Riordan和Lee，Clin.Micro.Rev.17：218-234，2004；Lees A.，KoKai-kun J.，LopezAcosta A.，Acevedo J.，Mond J.2005.Lipotechoic Acid Conjugate Vaccine for Staphylococcus[abstract].In：8th Annual Conference on Vaccine Research；2005May 8-11；Baltimore.S1：p.58；Fischer等人，美国专利6,610,293；Stinson等人，美国专利7,250,494)；sai-1相关多肽(Anderson等人，国际公开号WO05/79315)；ORF0594相关多肽(Anderson等人，国际公开号WO05/086663)；ORF0826相关多肽(Anderson等人，国际公开号WO05/115113)；PBP4相关多肽(Anderson等人，国际公开号WO 06/033918)；AhpC相关多肽和AhpC-AhpF组合物(Kelly等人。国际公开号WO06/078680)；金黄色葡萄球菌5型和8型荚膜多糖(Shinefield等人，N.Eng.J.Med.346：491-496，2002)；胶原粘附素(collagen adhesin)、血纤蛋白原结合蛋白(fibrinogen binding protein)和凝聚因子(clumping factor)(Mamo等人，FEMS Immunology and Medical Microbiology 10：47-54，1994，Nilsson等人，J.Clin.Invest.101：2640-2649，1998，Josefsson等人，The Journal of Infectious Diseases 184：1572-1580，2001)；以及多糖细胞内粘附素和其片段(Joyce等人，Carbohydrate Research 338：903-922，2003)。
在一个实施方案中，混合物中包含的靶向CS-D7靶区域的抗原结合蛋白是本文中描述的单克隆抗体。在另一个实施方案中，抗体混合物中包含的各抗原结合蛋白是单克隆抗体。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白混合物是包含治疗有效量的所述混合物和药学上可接受的载体的药物组合物的一部分。
因此，包括在本发明的该部分中的是抗原结合蛋白复合物的混合物(参见，上面，第II部分.C.)，其中至少一种抗原结合蛋白靶向CS-D7靶区域。例如，本发明还涉及部分II.C.(同上)中描述的杂多聚体复合物的混合物，其包含至少两种杂多聚体复合物的组合，其中一种杂多聚体复合物包含靶向本文中描述的与特异性结合CR1的抗体化学交联的CS-D7靶区域的抗原结合蛋白。可以以抗原结合蛋白混合物的形式将该杂多聚体与第二杂多聚体复合物组合，所述第二杂多聚体复合物包含特异性结合在体内感染期在细菌细胞表面上表达的另外的金黄色葡萄球菌抗原(例如，LTA，荚膜)(其与特异性结合CR1的抗体化学交联)的抗原结合蛋白。
III.蛋白质的产生
抗原结合蛋白和其区域优选使用重组核酸技术或通过使用杂交瘤来产生。可产生不同的抗原结合蛋白，包括包含Vh区和Vl区的单链蛋白例如单链抗体和其片段；和包含作为分开的蛋白质的部分的Vh和Vl区的多链蛋白。
重组核酸技术包括构建用于蛋白质合成的核酸模板。杂交瘤技术包括使用永生化的细胞系来产生抗原结合蛋白。适当的重组核酸和杂交瘤技术在本领域内是熟知的。(参见例如，Ausubel，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley，2005，Harlow等人，Antibodies，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988.)
III.A.重组核酸
编码抗原结合蛋白的重组核酸可在宿主细胞中表达，所述宿主细胞实际上用作被编码的蛋白质的工厂。重组核酸可提供编码抗原结合蛋白质的重组基因，该基因可与宿主细胞基因组分开而自主地存在或作为宿主细胞基因组的一部分存在。
重组基因包含编码蛋白质的核酸和用于蛋白质表达的调控元件。通常，存在于重组基因中的调控元件包括转录启动子、核糖体结合位点、终止子和任选地提供操纵基因。用于真核细胞中加工的优选元件是多腺苷酸化信号。还可存在抗体相关内含子。用于抗体或抗体片段产生的表达盒和载体的实例在本领域内是熟知的。(例如，Persic等人，Gene187：9-18，1997，Boel等人，J.Immunol.Methods 239：153-166，2000，Liang等人，J.Immunol.Methods 247：119-130，2001，Tsurushita等人，Methods 36：69-83，2005.)
由于遗传密码的简并性，许多不同的编码性核酸序列可用于编码特定的蛋白质。因为几乎所有氨基酸由不同的核苷酸三联体或“密码子”编码，因此产生了遗传密码的简并性。氨基酸由如下密码子编码：
A＝Ala＝丙氨酸：密码子GCA、GCC、GCG、GCU
C＝Cys＝半胱氨酸：密码子UGC、UGU
D＝Asp＝天冬氨酸：密码子GAC、GAU
E＝Glu＝谷氨酸：密码子GAA、GAG
F＝Phe＝苯丙氨酸；密码子UUC、UUU
G＝Gly＝半胱氨酸：密码子GGA、GGC、GGG、GGU
H＝His＝组氨酸：密码子CAC、CAU
I＝Ile＝异亮氨酸：密码子AUA、AUC、AUU
K＝Lys＝赖氨酸：密码子AAA、AAG
L＝Leu＝亮氨酸：密码子UUA、UUG、CUA、CUC、CUG、CUU
M＝Met＝甲硫氨酸：密码子AUG
N＝Asn＝天冬酰胺：密码子AAC、AAU
P＝Pro＝脯氨酸：密码子CCA、CCC、CCG、CCU
Q＝Gln＝谷氨酰胺：密码子CAA、CAG
R＝Arg＝精氨酸：密码子AGA、AGG、CGA、CGC、CGG、CGU
S＝Ser＝丝氨酸：密码子AGC、AGU、UCA、UCC、UCG、UCU
T＝Thr＝苏氨酸：密码子ACA、ACC、ACG、ACU
V＝Val＝缬氨酸：密码子GUA、GUC、GUG、GUU
W＝Trp＝色氨酸：密码子UGG
Y＝Tyr＝酪氨酸：密码子UAC、UAU
使用表达载体帮助重组基因在细胞中的表达。优选，除了重组基因以外，表达载体还包含用于在宿主细胞中自主复制的复制起始区、选择标记、有限数目的有用的限制性内切酶位点和用于高拷贝数目的潜力。
如果期望，可使用本领域内熟知的技术将编码抗体的核酸整合入宿主基因组。(例如，Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley，2005、Marks等人，国际申请号WO 95/17516，国际公开日期1995年1月29日。)
III.B.重组核酸的表达
多种不同的细胞系可用于重组抗原结合蛋白表达，包括来自原核生物(例如，大肠杆菌(E.coli)、杆菌属(Bacillus sp)和链霉菌属(Streptomyces sp.)(或链霉菌(streptomycete))和来自真核生物(例如，酵母，杆状病毒(Baculovirus)和哺乳动物)的细胞系。(Breitling等人，Recombinant Antibodies，John Wiley & Sons，Inc.and SpektrumAkademischer Verlag，1999，Kipriyanov等人，Molecular Biotechnology26：39-60，2004，Tsurushita等人，Methods 36：69-83，2005.)
用于重组抗原结合蛋白表达的优选宿主提供了哺乳动物翻译后修饰。翻译后修饰包括化学修饰例如糖基化和二硫键的形成。另一种类型的翻译后修饰是信号肽的切除。
糖基化对于一些抗体效应子功能可以是特别重要的。(Yoo等人，Journal of Immunological Methods 261：1-20，2002，Presta，AdvancedDrug Delivery Reviews 58：640-656，2006，Satoh等人，Expert Opin.Biol.Ther.6：1161-1173，2006.)
不同类型的宿主细胞可用于提供有效的翻译后修饰，包括哺乳动物宿主细胞和非哺乳动物细胞。哺乳动物宿主细胞的实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)、HeLa、C6、PC12、人胚肾(HEK293)和骨髓瘤细胞。可修饰哺乳动物宿主细胞，例如，以使之进行糖基化。(Yoo等人，Journal ofImmunological Methods 261：1-20，2002，Persic等人，Gene 187：9-18，1997，Presta，Advanced Drug Delivery Reviews 58：640-656，2006，Satoh等人，Expert Opin.Biol.Ther.6：1161-1173，2006.)也可修饰非哺乳动物细胞来提供期望的糖基化。(Li等人，Nature Biotechnology24(2)：210-215，2006.)经糖基因工程改造的(glycoengineered)的毕赤酵母(Pichia pastoris)是此类经修饰的非人哺乳动物细胞的实例。(Li等人，Nature Biotechnology 24(2)：210-215，2006.)
III.C.不同实施方案的实例
包含一个或多个编码抗原结合蛋白Vh区或Vl区或编码两个所述区域的重组基因的核酸可用于产生结合CS-D7靶区域的完整结合蛋白或所述结合蛋白的组成部分。可以例如通过使用单个重组基因编码包含Vh区和Vl区的单链蛋白例如单链抗体，或通过使用多个重组基因例如产生各个Vh和Vl区域来提供完整的结合蛋白。此外，可以例如通过在分开的细胞中产生包含Vh区或Vl区的多肽来产生结合蛋白的区域。
因此，本发明包括包含至少一种重组基因的核酸，所述重组基因编码抗原结合蛋白的Vh区或Vl区，其中包含所述Vh或Vl区的蛋白质结合CS-D7靶区域。在另外的实施方案中，核酸包含两个重组基因，编码抗体结合蛋白Vh区的第一重组基因，编码抗原结合蛋白Vl区的第二重组基因。
在不同的实施方案中，一个或多个重组基因编码部分II.D(同上)中描述的抗原结合蛋白或Vh区或Vl区。优选，在单个宿主细胞中表达重组基因来产生抗原结合蛋白。可从细胞中纯化所述蛋白。
IV.抗原结合蛋白的应用
识别适当的表位的抗原结合蛋白可具有治疗和其他应用。其他应用包括使用抗原结合蛋白识别ORF0657n靶区域来促进ORF0657n抗原和疫苗的产生、表征或研究。包含某些ORF0657n区域的抗原可用于提供抵抗金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫应答。(Anderson等人，国际公开号WO 2005/009379，国际公开日期2005年2月3日。)
在靶蛋白的产生、表征或研究中使用抗原结合蛋白例如单克隆抗体的技术在本领域内是熟知的。(参见，例如Ausubel，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley，2005，Harlow等人，Antibodies，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988，Harlow等人，Using Antibodies，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999，Lipman等人，ILARJournal 46：258-268，2005.)
在本发明的实施方案中，使用抗原结合蛋白测定结合至微球或细胞上的ORF0657n抗原在溶液中的存在。结合蛋白结合存在于溶液或细胞中的蛋白质的能力可使用不同的技术例如Western印迹法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、流式细胞术或Luminex免疫测定法来测定。
V.治疗
可使用结合适当靶区域的抗原结合蛋白对患者进行治疗性和预防性治疗。对感染了金黄色葡萄球菌的患者进行治疗性治疗。可对一般群体或一般群体的亚群进行预防性治疗。一般群体的优选亚群是处于增加的金黄色葡萄球菌感染的风险中的人的亚群。
治疗性和预防性治疗包括保护或治疗患者抵抗金黄色葡萄球菌感染的方法，其包括对患者施用本文中描述的抗原结合蛋白或其药物组合物的步骤。如果期望，可将本文中提供的抗原结合蛋白组合物作为抗原结合蛋白的混合物的一部分来提供(参见，例如，部分II.E，同上)。此外，可将抗原结合蛋白组合物作为联合治疗方案(其中还提供另外的药物材料(medicinal substance))的一部分来施用。因此，抗原结合蛋白单独地或与另外的物质组合的施用可采用包含药学活性载体的组合物的形式。
可使用本文中描述的抗原结合蛋白(参见，例如，部分II，同上)和一种或多种另外的具有疗效的组分(包括但不限于疫苗抗原或抗生素)一起进行联合治疗。可设计治疗的时间安排以获得预防性和/或治疗性治疗。例如，可将另外的组分与抗原结合蛋白治疗同时施用，或在抗原结合蛋白治疗之前或之后短暂的时间内施用。在短暂的时间内施用是指当施用抗原结合蛋白时前后大约两(2)周内的时间，这取决于用于患者的最佳治疗方案。
有效地抵抗金黄色葡萄球菌感染的抗生素的施用在本领域内是熟知的(参见，例如，Anstead等人，Methods Mol.Bio.391：227-258，2007；Micek，Clin.Infect.Dis.45：S184-S190，2007；Moellering，Clin.Infect.Dis.46：1032-1037，2008)。联合治疗的可能的抗生素包括例如：万古霉素、利奈唑胺、克林霉素、多西霉素、利福平、达托霉素、奎奴普丁-达福普汀、替加环素(tigecycline)、奥利万星、达巴万星(dalbavancin)、ceftobiprole、telavancin和iclaprim。
用于联合治疗的潜在抗原包括例如：ORF0657n相关多肽(Anderson等人，国际公开号WO 05/009379)；sai-1相关多肽(Anderson等人，国际公开号WO 05/79315)；ORF0594相关多肽(Anderson等人，国际公开号WO 05/086663)；ORF0826相关多肽(Anderson等人，国际公开号WO05/115113)；PBP4相关多肽(Anderson等人，国际公开号WO 06/033918)；AhpC相关多肽和AhpC-AhpF组合物(Kelly等人.国际公开号WO06/078680)；金黄色葡萄球菌5型和8型荚膜多糖(Shinefield等人，N.Eng.J.Med.346：491-496、2002)；胶原粘附素、血纤蛋白原结合蛋白和凝聚因子(Mamo等人，FEMS Immunology and Medical Microbiology 10：47-54，1994，Nilsson等人，J.Clin.Invest.101：2640-2649，1998，Josefsson等人，The Journal of Infectious Diseases 184：1572-1580，2001)；以及多糖细胞内粘附素和其片段(Joyce等人，Carbohydrate Research 338：903-922，2003)
“患者”是指能够感染金黄色葡萄球菌的哺乳动物。优选地，患者是人。然而，其他种类的哺乳动物例如牛、猪、绵羊、山羊、兔子、马、狗、猫、猴子、大鼠以及小鼠可感染金黄色葡萄球菌。非人患者的治疗用于保护宠物和家畜以及用于评估特定治疗的功效。
具有增加的金黄色葡萄球菌感染的风险的人包括卫生保健工作者、住院患者、免疫系统虚弱的患者、经历手术的患者、接受异体植入物(foreign body implant)例如导管或血管装置的患者、面临导致虚弱的免疫的治疗的患者和从事具有增加的烧伤或创伤损伤的风险的职业的人。(The Staphylococci in Human Disease，Crossley and Archer(ed.)，Churchill Livingstone Inc.1997.)
在实施方案中，将一种或多种抗原结合蛋白与手术或异体植入物结合来对患者施用。“手术或异体植入物”包括在提供或不提供外来植入物的情况下的手术以及在进行或不进行手术的情况下提供外来植入物。可设计施用的时间安排以使获得预防性治疗和/或治疗性治疗。优选施用与手术或移植几乎同时开始。
在例如Remington′s Pharmaceutical Sciences第20版，Ed.Gennaro，Mack Publishing，2000；和Modern Pharmaceutics第2版，Eds.Bankerand Rhodes，Marcel Dekker，Inc.，1990中提供了用于一般药物施用的指导。
药学上可接受的载体有助于抗原结合蛋白的贮存或施用。用于稳定蛋白质溶液制剂的物质包括糖类、氨基酸和缓冲盐。(Middaugh等人，Handbook of Experimental Pharmacology 137：33-58，1999.)
可利用不同的途径例如一种或多种下列途径施用抗原结合蛋白：静脉内、皮下、肌内和粘膜途径。可使用例如针头注射器或喷射注射器(jet-injector)进行皮下和肌内施用。可使用增强剂或粘膜粘着剂(mucoadhesive)进行粘膜递送例如鼻递送以在吸附位置产生更长的滞留时间。(Middaugh等人，Handbook of Experimental Pharmacology137：33-58，1999.)
优选通过考虑本领域内熟知的因素来确定适当的结药方案，所述因素包括患者的年龄、体重、性别和医疗条件；施用途径；期望的效果；以及所使用的具体的抗原结合蛋白。预期有效剂量范围应当为大约0.1mg/kg至20mg/kg，或0.5mg/kg至5mg/kg。给药频率随化合物的功效和稳定性变化而变化。给药频率的实例包括每二周一次、每周一次、每二月一次和每月一次。
VI.CS-D7靶片段
可以使用存在于ORF0657n区域(SEQ ID NO：47)内的和被mAbCS-D7结合的CS-D7靶片段例如产生II.B(同上)中提及的另外的抗体。CS-D7靶片段还可用于引发免疫应答。优选，CS-D7靶片段包含CS-D7靶区域。因此，CS-D7靶区域由ORF0657n提供。CS-D7靶片段经显示包含在ORF0657n区域的大约氨基酸42-342(参见实施例6)内以及可存在于来源于该区域的更小的片段内。
潜在的CS-D7靶片段由下述不同的实施方案提供.在第一实施方案中，CS-D7靶片段是具有与选自SEQ ID NO：47的氨基酸42-342、SEQ IDNO：47的氨基酸42-285和SEQ ID NO：47的氨基酸103-285的ORF0657n(SEQ ID NO：47)的部分至少95％的序列同一性的多肽，其中所述多肽的长度最高达到350个氨基酸.在另外的关于多肽的长度实施方案中，多肽最高达到250个氨基酸或最高达到200个氨基酸。另外的氨基酸优选是另外的ORF0657n区域。
在进一步描述第一实施方案的第二实施方案中，SEQ ID NO：47-相关多肽与SEQ ID NO：47的氨基酸42-342、氨基酸42-285或氨基酸103-285至少95％或至少99％同一性；与SEQ ID NO：47的氨基酸42-342、氨基酸42-285或氨基酸103-285相异在于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸变化；或基本上由SEQ ID NO：47组成。各氨基酸变化独立地是氨基酸置换、缺失或添加。变化可在SEQ ID NO：47区域内或被添加至SEQID NO：47区域。
“基本上由指定的氨基酸组成”表示提及的氨基酸存在并且另外的氨基酸也可存在。另外的氨基酸可以在羧基或氨基端。在不同的实施方案中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个另外的氨基酸被添加至SEQ ID NO：47的氨基酸42-342、氨基酸42-285或氨基酸103-285。另外的氨基酸的实例是氨基端甲硫氨酸。
引发免疫应答可用于帮助治疗性或预防性治疗金黄色葡萄球菌感染。可使用与本领域内熟知的技术一起在本文中提供的指导来配制免疫原和对患者施用免疫原。在例如Vaccines Eds.Plotkin和Orenstein，W.B.Sanders Company，1999；Remington′s Pharmaceutical Sciences第20版，Ed.Gennaro，Mack Publishing，2000；和Modern Pharmaceutics第2版，Eds.Banker and Rhodes，Marcel Dekker，Inc.，1990中提供了用于一般药物施用的指导。
药学上可接受的载体有助于免疫原的贮存和对患者的施用。药学上可接受的载体可包含不同的组分例如缓冲剂、注射用灭菌水、生理盐水或磷酸盐缓冲盐水、蔗糖、组氨酸、盐和聚山梨醇酯(polysorbate)80。
可通过不同的途径例如皮下、肌内途径施用免疫原。可使用例如针头注射器或喷射注射器进行皮下和肌内施用。
优选通过考虑本领域内熟知的因素来确定适当的给药方案，所述因素包括患者的年龄、体重、性别和医疗条件；施用的途径；期望的效果；和所使用的具体化合物。可以以多剂疫苗形式使用免疫原。预期剂量可由1.0μg至1.0mg的总的多肽的范围组成。在不同的实施方案中，范围是5.0μg至500μg、0.01mg至1.0mg或0.1mg至1.0mg。
剂量的时间安排取决于本领域内熟知的因素。在初次施用后，随后可施用一次或多次加强剂量来维持或提高抗体滴度。给药方案的实例可以是在第1天施用一次，在第1个月施用一次，在第4、6或12个月进行第三次剂量给药，当需要时在较长的时间后进行另外的加强剂量。
VII.实施例
下面提供实施例以进一步举例说明本发明的不同方面。实施例也举例说明了用于实施本发明的有用的方法。此类实施例不限定本发明。
实施例1：从scFv文库分离抗0657n mAb
使用噬菌体展示文库鉴定对于ORF0657n是特异性的ScFv。用ORF0657nH淘选(pan)文库。然后.然后复筛(counter screen)ScFv以确定它们是否结合ORF0657t。SEQ ID NO：47提供了ORF0657n金黄色葡萄球菌序列。ORF0657t相应于ORF0657n的氨基酸42-486。ORF0657nH相应于ORF0657n的氨基酸42-609。在酵母中表达ORF0657nH和ORF0657t。
使用固相淘选来就抗ORF0657nH的scFv(10μg/ml)筛选3个剑桥抗体文库(BMV：外周血淋巴细胞；CS：脾淋巴细胞；和DP47：具有CS文库的Vh CDR3和VL的种系DP47构架)。鉴定的190/264是ORF0657t特异性的。在从可变区DNA测序除去重复(duplicate)后，鉴定了DNA172/264。在除去重复序列和包含终止子的序列后，DNA序列分析从DP47筛选鉴定了41个独特的序列，从BMV筛选鉴定了57个序列以及从CS文库筛选鉴定了74个序列。
噬菌体ELISA筛选-为了验证选择的scFv-噬菌体克隆的抗原特异性，在ELISA中检测来自各第2轮文库中的172个噬菌体克隆和来自各第3轮文库中的88个噬菌体克隆。通过流式细胞术和在竞争性luminex测定中进一步检测一组ELISA阳性克隆。如下面所描述的，将通过流式细胞术测量的结合金黄色葡萄球菌的细胞表面上的ORF0657n的ScFv转换成完整的IgG。
流式细胞术筛选-进行流式细胞术分析以确定不同的ScFv的ORF0675n结合位点。将用于分析的金黄色葡萄球菌培养在不含铁的确定成分培养基(iron-deficient defined medium)(RPMI 1640)中。通过对2X RPMI培养的金黄色葡萄球菌Becker细胞进行流式细胞术来检查从第2轮固相噬菌体展示淘选分离的100多个不同的scFv。大多数受试scFv展示不同程度的结合。从这些实验产生的数据确认了通过淘选分离的所述scFv结合金黄色葡萄球菌。
IgG转换-就IgG转换鉴定12个scFv克隆。通过PCR扩增可变区的序列，将编码重链可变区的DNA与编码IgG1恒定区的DNA按读框融合，同时将编码轻链可变区的DNA与编码相应恒定区的DNA按读框融合。下面描述所得抗体表达载体的克隆方法。
轻链和重链的表达由人CMV启动子和牛生长激素多腺苷酸化信号驱动。前面的前导序列介导抗体至培养基中的分泌。重链前导序列是MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(SEQ ID NO：49)。轻链前导序列是MSVPTQVLGLLLLWLTDARC(SEQ ID NO：50)。表达载体具有来自EBV病毒基因组的oriP(以延长在293EBNA细胞中的表达)和细菌序列(卡那霉素选择标记)以及大肠杆菌的复制起点。
用PCR扩增可变区。在包含高保真PCR预混合物(master mix)、1μl的模板体积和各自1μl的正向和反向引物的25μl体积中进行PCR反应。PCR条件是1个循环(在94℃下进行2分钟)；25个循环(在94℃下进行1.5分钟；在60℃下进行1.5分钟；在72℃下进行1.5分钟)，以及在72℃下进行7分钟；在4℃下进行直至取出，并且通过使用In-Fusion策略，按读框在5’-末端处克隆前导序列并3’-末端处克隆恒定区。例如，使用下列引物克隆克隆CS-D7抗体：(轻链正向，5’-ACAGATGCCAGATGCGAAATTGTGATGACACAGTCT(SEQ ID NO：51)；轻链反向，5’-TGCAGCCACCGTACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC(SEQ ID NO：52)；重链正向，5’-ACAGGTGTCCACTCGCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCG(SEQ ID NO：53)和重链反向，5’-GCCCTTGGTGGATGCACTCGAGACGGTGACCAGGGT(SEQ ID NO：54))。
以相似的方式转换其余克隆。通过测序确认所有克隆的DNA序列。如下面进一步描述的，通过使用Luminex结合测定法，mAb BMV-H11、BMV-D4、BMV-E6、BMV-C2、CS-D7、CS-D10、CS-A10和CS-E11竞争对相同表位的结合。
从DNA序列推导的抗体CS-D7的全长氨基酸序列示于下面的表3中。可变区以粗体显示，CDR用下划线标示。
在图2和3中提供了mAb BMV-H11、BMV-D4、CS-D7、CS-D10、CS-A10、CS-E11、BMV-E6和BMV-C2的轻链及重链可变区的序列比较。重链恒定区的序列都是相同的，轻链恒定区的序列是κ或λ链。MAbCS-D7包含κ序列，其相应于SEQ ID NO：1的氨基酸109至201。MAbsBMV-H11、BMV-D4、CS-D10、CS-A10、CS-E11、BMV-E6和BMV-C2包含由SEQ ID NO：48提供的λ序列。
抗体在293EBNA单层细胞中表达。使用基于PEI的转染剂转染质粒。在Opti-MEM无血清培养基中温育转染的细胞，然后使用A/G蛋白亲和层析从培养基纯化分泌的抗体。通过OD280nm测定纯化的抗体的浓度和通过LabChip毛细管电泳确定纯度。
表3：mAb CS-D7氨基酸序列
mAb CS-D7轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：1)
1
51
101RT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT ASVVCLLNNF YPREAKVQWK
151 VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHQ
201 GLSSPVTKSF NRGEC
mAb CS-D7重链氨基酸序列(SEQ ID NO：2)
1
51
101
ASTK GPSVFPLAPS SKSTSGGTAA
151 LGCLVKDYFP EPVTVSWNSG ALTSGVHTFP AVLQSSGLYS LSSVVTVPSS
201 SLGTQTYICN VNHKPSNTKV DKRVEPKSCD KTHTCPPCPA PELLGGPSVF
251 LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP
301 REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG
351 QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY
401 KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL
451 SLSPGK
实施例2：Luminex结合研究
CAT scFv(参见实施例1)的选择的特征在于筛选一组鼠mAb(2H2、13C7、1G3和13G11)以及CAT mAb(CS-D3、CS-D7、CS-D10、CS-E11、BMV-E6、BMV-D4、mAb 1和mAb 2)以确定它们是竞争ORF0657n上的相同表位还是结合不同表位。在此类测定中，单个CAT scFv(或CATmAb)竞争单个mAb(鼠或猫)。
在2007年1月23日提交的国际申请PCT/US07/01687(通过引用合并入本文)中描述了鼠抗体2H2、1G3、13C7或13G11。PCT/US07/01687(国际公开号WO 2007/089470)提及产生mAb 1G3.BD4、mAb 2H2.BE11、mAb 13C7.BC1和mAb 13G11.BF3的杂交瘤细胞系，该细胞系根据布达佩斯协议于2005年9月30日保藏于美国典型培养物保藏中心、10801University Boulevard、Manassas、VA 20110-2209。所述细胞系被赋予：ATCC号PTA-7124(产生mAb 2H2.BE11)、ATCC号PTA-7125(产生mAb13C7.BC1)、ATCC号PTA-7126(产生mAb 1G3.BD4)和ATCC号PTA-7127(产生mAb 13G11.BF3)。
ORF0657n-珠粒的构建-将9.4×106个Radix马来酰亚胺微球(Georgetown、TX)在室温下偶联至750μg ORF0657n-Se(包含羧基末端半胱氨酸基团的ORF0657n)，进行2小时。用1ml PBS清洗珠粒3次，然后用1M N-乙酰-L-半胱氨酸(Sigma)在室温下淬灭2小时。在PBS中清洗微球3次。对珠粒进行计数，然后以500个微球/μl的终浓度将其重悬浮。
CAT ScFv和鼠mAb之间的竞争的检测-将CAT scFv以1∶4、1∶8、1∶16和1∶32稀释于PBS-TBN(0.05％Tween 20、1％BSA和0.05％叠氮化纳)中，然后将其在室温下与5000个ORF0657n-偶联的微球在Multiscreen滤板(Millipore)中一起温育1小时15分钟。然后用PBS和0.05％Tween 20(PBS/Tween20)清洗珠粒3次。将具有结合的CAT scFv的ORF0657n-珠粒与鼠单克隆抗体(2H2、1G3、13C7或13G11)一起温育。用R-藻红蛋白(PE)缀合物(Chromoprobe Inc.)商业标记鼠mAb。分别将标记的mAb在PBS-TBN中稀释至2μg/ml的终浓度。向板中加入稀释的mAb(50μL/孔)，在室温下再温育另外1小时15分钟。用PBS/Tween20清洗微球3次。将微球重悬浮于PBS/Tween20中，使用Bio-Plex光度计(BioRad)读取中位荧光信号。
基于scFv与鼠mAb之间的结合竞争，受试抗体的结合位点被分为下列组。组1，scFv BMV-C2、BMV-E6、BMV-D4、BMV-H11、CS-E11、CS-A10、CS-D10和CS-D7，不与任何鼠mAb竞争；组2，两个scFv与鼠mAb 2H2竞争；组3，两个scFv与mAb 1G3竞争；组4，scFv中都不与mAb 13C7竞争；以及组5，scFv中都不与mAb 13G11竞争。对于scFvCS-D10和CS-D7、使用Biacore获得的结果与在本研究中使用Luminex(参见实施例5，下文)的分析不同。
CAT mAb和鼠mAb之间的竞争的检测-如实施例1中所述将ScFv BMV-D4、CS-D7、CS-D10、CS-A10和BMV-C2、与鼠mAb 2H2竞争的scFv以及与1G3竞争的两个scFv转换成IgG抗体。将CAT mAb在PBS-TBN中稀释至2μg/ml的浓度，然后在室温下将其与5000个ORF0657n-偶联的微球在Multiscreen滤板(Millipore)中一起温育1小时15分钟。然后用含有0.05％Tween 20的PBS(PBS/Tween20)清洗珠粒3次。将具有结合的CAT mAb的ORF0657n-珠粒与鼠单克隆抗体(2H2、1G3、13C7或13G11)一起温育。已用R-藻红蛋白(PE)缀合物(Chromoprobe Inc.)商业标记鼠mAb。将标记的mAb分别在PBS-TBN中稀释至2μg/ml的终浓度。向板中加入稀释的mAb(50μL/孔)，将板在室温下再温育另外1小时15分钟。用PBS/Tween20清洗微球3次。将微球重悬浮于PBS/Tween20中，使用Bio-Plex光度计(BioRad)读取中位荧光信号。
就与鼠mAb的竞争检测CAT mAb。如对于上述的scFv和鼠mAb的竞争那样观察所述5个组。
CAT ScFv和CAT mAb之间的竞争的检测-CAT scFv在LuminexcLIA测定中单个地与CAT抗体竞争。将ScFv以1∶4、1∶8、1∶16和1∶32稀释于PBS-TBN(0.05％Tween 20、1％BSA和0.05％叠氮化纳)中，然后在室温下与5000个ORF0657n-偶联的微球一起在Multiscreen滤板(Millipore)中温育1小时15分钟。然后用含有0.05％Tween 20的PBS(PBS/Tween20)清洗珠粒3次。将各个抗体在PBS-TBN中稀释至2μg/ml的终浓度，然后加至分开的板中。向板中加入50μL/孔的稀释抗体，然后将板在室温下再温育另外1小时15分钟。用PBS/Tween20清洗板3次。以1∶50稀释Biotrend′s抗人IgG(Fc特异性的)抗体HP6043(R-藻红蛋白标记的)。向板中加入50μL/孔的稀释抗体。将板在室温下温育1小时15分钟。用PBS-Tween20清洗板3次。将微球重悬浮于PBS/Tween20中，使用Bio-Plex光度计(BioRad)读取中位荧光信号。如果中位荧光信号在至少两个稀释度上比对于非竞争性scFv所检测到的信号减少至少30％，那么ScFv被认为是竞争性的。
各个scFv BMV-H11、BMV-D4、BMV-E6、BMV-C2、CS-D7、CS-D10、CS-A10和CS-E11对各个mAb BMV-D4、BMV-E6、CS-D7、CS-D10和CS-E11的竞争的结果示于表4中。发现第一栏中的各scFv分别竞争抗第二栏中提供的所有mAb。
表4
实施例3：与ORF0657n的结合的
测量
利用
测定抗体对ORF0657n的结合。
整合微流体技术和表面等离子体共振技术(SPR)，以通过监测直接瞄准羧基甲基葡聚糖包被的(CM5)传感器芯片的偏振光的折射率的变化来检测质量的变化。在应答单元(Response Unit)中测量的应答的变化可与结合的分析物(例如，抗原或抗体)的量相关。
使用抗葡萄球菌(anti-Staph)抗体mAb 13C7.D12，使用
测量对ORF0657n的结合亲和力。将抗体共价结合在CM5传感器芯片的表面上。首先将结合的Ab暴露于ORF0657n，然后暴露于低浓度(5μg/mL)的待测试的抗体。在每一个ORF0657n+抗体的循环后，使用20mM HCl使传感器芯片的表面再生回固定的13C7.D12。
为了标准化各轮中初始结合的(捕获的)抗原的量，计算各受试抗体/抗原复合物的下列比率：
结果示于表5。对于mAb CS-D4和mAb CS-D6没有展示显著的结合。缺乏IgG结合的原因包括IgG蛋白不存在或值不正确、抗体聚集、极低的IgG结合活性或与捕获抗体的完全重叠(当抗原只以单体形式存在时)。在配对结合研究中观察到mAb CS-D4和mAb CS-E6结合，其中抗体浓度显著增加(实施例4，在下文中)。
表5
实施例4：配对竞争结合
进行配对结合实验以测定抗体与ORF0657n的相对结合。将抗葡萄球菌抗体mAb 13C7.D12共价结合(固定)在CM5传感器芯片的表面上。将固定的Ab首先暴露于ORF0657n，然后暴露于以矩阵形式存在的成对抗体。在每一个0657n蛋白+抗体对的循环后，使用20mM HCl使传感器芯片的表面再生回固定的13C7.D12。针对以矩阵形式存在的ORF0657n蛋白检测抗体以使可分析各抗体对的所有组合。
mAb CS-D7、CD-D10、BMV-D4和BMV-E6的矩阵设计概述于表6中。
为了标准化各轮中初始结合的(捕获的)抗原的量，计算各受试抗体/抗原复合物的下列比率：
对于作图对，如下计算剩下的可获得的用于各抗体的表位的百分比：
单克隆抗体CS-D7、CS-D10、BMV-D4和BMV-E6被导向相同的或显著重叠的区域。表7概述了配对结合研究的结果。
表7
显示的百分比是可获得的用于第二抗体结合的表位的百分比。
mAb的相对足迹大小(footprint size)如下：CS-D7＞CS-D10＞BMV-D4＞BMV-E6。单克隆抗体CS-D7具有最大的“足迹”(当其为供结合的第一抗体时，最大比率mRU Ab/RUAb)。与实施例3中描述的结合研究相反，抗体浓度显著增加，并且使用mAb BMV-D4和mAbBMV-D6观察到结合。
实施例5：另外的表位足迹图谱
使用BIACore对CAT ScFv和mAb的亚组进行另外的表位足迹图谱研究。在此类研究中，组1和组2的结合竞争与实施例2中的相同。然而，发现CS-D7和CS-E7与mAb 1G3(组3)竞争。
在BIACore 2000上就表位重叠测定抗体，除非另外指出，所有试剂由BIACore(Piscataway，NJ)提供。对于每一个实验，用EDC/NHS(NHS，N-羟基琥珀酰亚胺酯；EDC，(N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)混合物活化流动细胞；在这些存在于醋酸钠pH 5.0中的被活化的表面上方注射不同的单克隆抗体，然后用1.0M乙醇胺-HCl pH 8.5封闭所述表面。在各实验循环中，以10μL/分钟在共价固定的单克隆抗体的上方注射150μL ORF0657t。然后，以10μL/分钟在缀合物的上方注射120μL另一种单克隆抗体。在整个实验过程中，获得并且存储表面等离子共振技术(surface plasmon resonance)的数据。以60μL/分钟的流速使用20mM HCl的单次注射进行再生，接触时间为30秒。在25℃的受控温度下进行所有实验步骤。使用在Matlab平台(7.2.0.232 R2006a、MathworksInc.、Natick、MA)上运行的内部开发的软件进行随后的分析。
如实施例2中所指出的，在竞争性Luminex测定中，mAb CS-D7不与mAb 1G3竞争。竞争性Luminex和连续BIACore测定具有会产生该差异的区别。首先，竞争性基于珠粒的Luminex测定允许一种抗体置换另一种抗体，然而在Biacore 2000上进行的表面等离子共振技术(SPR)测定具有一种共价(不可逆)偶联的抗体。其次，竞争性测定使用对于其中一种抗体是特异性的标记，而SPR测定不使用标记并且只对表面上的材料的量敏感。在竞争性测定中，标记的高亲和力抗体可置换预先结合的低亲和力抗体，从而引起无表位重叠的假结果。在任一种测定中，当两种抗体在无干扰的情况下结合时，则无重叠存在。然而，在相反的情况下，当表位可以不同时，空间位阻可引起明显的表位重叠。当结合步骤是相继的而非同时进行的时候，该效应在两种测定中可得到增强。
实施例3和4以及实施例5中的实验之间的区别在于在实施例3和4中，首先用13C7mAb抗体捕获ORF0657n，然后，再使另一对抗体流过，以观察其是否可结合ORF0657n。如果此类抗体中的任一种与mAb13C7共有表位，则其可能不结合ORF0657n。因此，其实际上是mAb13C7、“第一抗体”和“第二抗体”之间的三元比较。相反地，实施例5是二元比较。
实施例6：mAb CS-D7表位作图
通过化学断裂ORF0657t的线性序列，然后确定被mAb CS-D7结合的片段来进行mAb CS-D7靶区域的表位作图。用CNBr化学断裂ORF0657t，进行2小时。通过SDS PAGE分析所得的断裂产物。SDSPAGE分析显示具有大约47、44、37、35、32、26、16、13和10kDa的分子量的10个条带。使用mAb CS-D7进行的Westem印迹分析清楚地显示只有47、44、37、35和32kDa条带被mAb CS-D7识别。被mAb CS-D7识别的短序列的不存在表明mAb CS-D7不识别ORF0657n的线性序列。
从SDS PAGE凝胶切取Westem印迹条带，进行凝胶内降解，通过串联质谱法鉴定的所得的肽与ORFO657n中相应的序列匹配。结果示于表8中。
表8
| SDS PAGE条带 | 表观MW(SDS PAGE) | Western阳性 | Western阴性 | ORF0657n[氨基酸] | 计算的MW |
| 1 | 47kDa | X | [42-396] | 40.7kDa | |
| 2 | 44kDa | X | [42-362] | 36.5kDa | |
| 4 | 37kDa | X | [42-342] | 34.1kDa | |
| 5 | 35kDa | X | [42-342] | 34.1kDa | |
| [156-486] | 38.5kDa | ||||
| 6 | 32kDa | X | [42-342] | 34.1kDa | |
| 7 | 26kDa | X | [42-254] | 23.8kDa | |
| [255-486] | 26.9kDa | ||||
| 8 | 16kDa | X | [254-384] | 15.3kDa | |
| [254-396] | 16.8kDa | ||||
| [343-486] | 16.6kDa | ||||
| 9 | 13kDa | X | [156-254] | 11.5kDa | |
| [255-375] | 14.2kDa | ||||
| [375-486] | 12.9kDa | ||||
| 10 | 10kDa | X | [156-254] | 11.5kDa | |
| [255-342] | 10.3kDa |
表8
| SDS PAGE条带 | 表观MW(SDS PAGE) | Western阳性 | Western阴性 | ORF0657n[氨基酸] | 计算的MW |
| [397-486] | 10.1kDa |
表8中显示的ORF0657n区域基于下列方面：凝胶内降解物中鉴定的肽、通过串联质谱鉴定的C-末端甲硫氨酸残基、所有CNBr降解物片段都始于和终于甲硫氨酸断裂位点的假设，以及SDS PAGE凝胶中的条带的表观分子量。在Western印迹分析中可用mAb CS-D7鉴定的ORF0657t的最小内部片段是氨基酸42-342。
实施例7：mAb CS-D7表位切除(epitope excision)
通过表位切除验证更高分子量的ORF0657t片段是结合mAb CS-D7所需要的。详细地，对于各表位切除实验，通过化学交联将mAb CS-D7固定至溴化氰激活的琼脂糖(Amersham货号17 0430 01)。然后让完整的ORF0657t结合固定的抗体，通过用磷酸盐缓冲盐水充分清洗来洗去未结合的ORFO657t。向结合的ORF0657t加入胰蛋白酶。充分清洗掉在温育期间被蛋白酶切除的肽，然后用SDS加样缓冲液释放特异性结合mAb CS-D7的ORF0657t片段。
通过SDS PAGE分析特异性结合mAb CS-D7的片段。表位切除实验在SDS PAGE分析中显示具有大约48、23和19.5kDa的分子量的3个条带。从SDS PAGE凝胶切取所有条带，进行凝胶内降解，通过串联质谱法鉴定相应于所述条带的ORF0657n的肽(表9)。通过串联质谱法鉴定的各ORF0657n肽的计算分子量比通过SDS-PAGE鉴定的相应条带的分子量小(表9)，这是实验设计的结果。因此，该实验中结合mAb CS-D7的片段实际上可能跨越比通过质谱法鉴定的多肽区域更大的ORF0657n的多肽区域。例如，条带3通过质谱法鉴定为相应于ORF0657n的氨基酸117-224，并且具有12.5kDa的计算分子量。其具有通过SDS-PAGE鉴定的为19.5kDa的分子量。如果向质谱法鉴定的肽的N-和C-末端部分加入相应于大约7kDa(计算分子量和SDS PAGE-鉴定的分子量之间的差)的氨基酸区域，将产生相应于ORF0657n的大约氨基酸42-285的片段。在该情况下，因为向鉴定的片段的N-和C-末端部分都加入了7kDa区域，因此获得mAb CS-D7结合所必需的ORF0657n的最小部分可能相应于氨基酸42-285内的区域。因为实施例6中的化学断裂实验显示相应于氨基酸42-254的片段不结合mAb CS-D7，所以相应于氨基酸254-285的区域或其部分对于适当的抗体结合是非常重要的。
表9
| 条带 | 通过串联质变法鉴定的ORF0657n区域[氨基酸] | 计算分子量 | SDS PAGE条带大小 |
| 1 | [117-456] | 39.7kDa | 47.7kDa |
| 2 | [117-196] | 9.2kDa | 23.3kDa |
| 3 | [117-224] | 12.5kDa | 19.5kD |
实施例8：亲和力测定
使用Biacore进行scFv CS-D7和全长IgG CS-D7的表面等离子体共振技术(SPR)估量。为了测量结合结构域和抗原之间的1∶1相互作用，取决于分析抗体片段还是全长IgG，对在Biacore上建立的实验进行改进。对于IgG测量，将IgG捕获至表面作为配体，以ORF0657t作为分析物来进行实验。对于抗体片段分析，将0657t结合至表面作为配体，以抗体片段作为分析物来进行实验。两个方法的比较产生相似的结果(表10)。对于每一个方法，从2个独立的实验产生标准差。
表10
| 抗体 | KD |
| D7scFv | 179pM±5pM |
| D7IgG | 422pM±11pM |
实施例9：留置导管模型(Indwelling Catheter Model)
就功效在于大鼠中进行的留置导管模型中检测单克隆抗体。购买Sprague Dawley大鼠，通过手术将留置导管(PE50硅酮橡胶)植入颈静脉，通过缝合使之保持原位，并且在大鼠的背部中线处露出端口。在开始实验前将大鼠关养7天以上。为了检测抗体保护留置导管抵抗金黄色葡萄球菌的形成集落的保护作用，在攻击前1小时用0至4mg mAb腹膜内注射(ip)大鼠。使用4×109CFU通过尾静脉攻击动物。24小时后，处死动物，使用无菌技术取出导管。将导管(去除外端口(external port)的完整导管)置于甘露醇盐琼脂或TSA(Teknova)上以进行形成集落的估量。将板在37℃下培养24-48小时。菌落向外生长的任何迹象被评为培养阳性(culture positive)。5个分开的实验的结果示于表11和12中。表2中4mg剂量的mAb CS-D7与4mg剂量的mAb 20C2HA(同种型对照)相比较的p值＜0.0001。表11中4mg剂量的mAb CS-D7与PBS对照相比较的p值＜0.0001。
表11：大鼠留置导管模型(实验1-4)
表12：大鼠留置导管模型(实验5)
| mAb(4mb) | 培养阴性导管的数目 | P值 |
| CS-D7 | 5个中有4个(80％) | 0.0036(与20C2HA相比较) |
| 20C2HA(同种型对照) | 5个中都不(0％) | |
| PBS | 5个中有1个(20％) | 0.0496(与CS-D7相比较) |
在攻击前1小时，用4mg单克隆抗体(CS-D7或同种型对照)或仅PBS腹膜内注射实验5中研究的插入导管的大鼠。然后用1-2×109CFU金黄色葡萄球菌菌株Becker静脉内攻击它们。在指定的时间点上从所有大鼠抽取血液。在终时间点(第32小时)抽取血液，然后处死动物，取出导管。通过将50μL涂布在TSA板上，然后培养过夜来就细菌评估血液。通过涂铺在甘露醇盐板上过夜来就金黄色葡萄球菌估量导管。如图6中所示，对于mAb CS-D7的注射，显示血液CFU的减少。
实施例10：离体(ex vivo)模型
使用被动保护的方法估量单克隆抗体。在通过腹膜内(ip)途径(离体方法)进行致死注射之前，用mAb对细菌进行离体预调理作用。在温和摇动的情况下，将一些对于6只Balb/c小鼠(6×LD100)是足够的细菌与800μg IgG一起在4℃下温育1小时。然后沉淀细菌，除去任何未结合的mAb。将经抗体调理的细菌重悬浮于2.4mL PBS中，将0.4mL(1×LD100)注射入5只小鼠的每一只。在攻击后，通过涂布在TSA上对各接种物进行定量，以确保为所有组的小鼠提供等量的CFU和确保mAb未凝聚细菌。攻击后监测存活率，进行3天。因为必须使靶抗原存在于细菌的表面上以使该方法有效，所以要注意确保在调理作用之前使ORF0657n在细菌上表达。攻击菌株是金黄色葡萄球菌RN4220，将其在低铁培养基RPMI中传代2次。注射入各小鼠的经调理的细菌的剂量是1-2×109CFU/小鼠。结果示于表13中。
表13
| 单克隆 | 试验编号 | 凝聚 | ％存活率 |
| 2H2.IgG1 | 6 | 30/30 | 100％ |
| 10B4.IgG1同种型对照 | 6 | 2/30 | 7％ |
| 13C7.IgG2b | 2 | 0/10 | 0％ |
| 6G6.IgG2b同种型对照 | 2 | 0/10 | 0％ |
| CS-D7 | 4 | 5/20 | 25％ |
| 20C2HA同种型对照 | 4 | 3/20 | 15％ |
实施例11：调理吞噬测定法
开发调理吞噬活性(OPA)测定法来估量抗体调理吞噬的能力。所述测定法测量抗体将补体(C’)结合和固定至细菌表面的能力，该能力导致此类细菌被粒细胞效应细胞吞噬的水平增加。
ORF0657n是金黄色葡萄球菌表面上的铁调节蛋白，其显示参与血红素/Fe的获取。用于该测定的金黄色葡萄球菌菌株是不产生A蛋白的菌株。此类菌株的实例是金黄色葡萄球菌SH1000。为了进行该测定，对菌株进行铁饥饿以增加ORF0657n的表达。该菌株还缺乏产生A蛋白的能力。A蛋白可结合任何IgG的Fc部分，因而该非特异性结合的抗体的存在可干扰OPA反应。
将HL60细胞暴露于二甲酰胺(DMF)进行5至6天以诱导细胞朝更多的粒细胞表型分化。然后，向抗体结合的细胞中加入2％C’-足够的无菌(gnotobiotic)猪血清。最后，然后用荧光化学物质5’，6’-FAM-SE标记经抗体和C’暴露的细胞。
在将经调理的荧光标记的细菌和未标记的HL60_DMF细胞一起温育后，通过用流式细胞术测量包含标记的细菌的HL60_DMF细胞的百分比来测定噬菌作用的水平。具有吞噬的细菌的HL60细胞的百分比与由抗体诱导的调理作用的量成比例。
在该测定中检查抗ORF0657n的鼠和人mAb。在图4和5中举例说明了结果。
ORF0657n-特异性mAb能够在该测定中产生可滴定的活性。鼠mAb2H2.BE11具有比鼠同种型对照mAb，6G6.A8更大的活性。人mAb CS-D7和mAb CS-D10与其IgG1同种型对照相比也具有更高的调理活性。产生最高噬菌作用水平所必需的mAb的量的范围是0.5ug(对于鼠mAb2H2.BE11)至0.06-0.25ug(对于人mAb)。与0.5ug鼠m Ab 2H2.BE11相比，只需0.06ug人mAb CS-D7就可产生最高的噬菌作用水平。
实施例12：另外的序列
提供金黄色葡萄球菌ORF0657n序列的SEQ ID NO：47如下：
Met Asn Lys Gln Gln Lys Glu Phe Lys Ser Phe Tyr Ser Ile Arg Lys
1 5 10 15
Ser Ser Leu Gly Val Ala Ser Val Ala Ile Ser Thr Leu Leu Leu Leu
20 25 30
Met Ser Asn Gly Glu Ala Gln Ala Ala Ala Glu Glu Thr Gly Gly Thr
35 40 45
Asn Thr Glu Ala Gln Pro Lys Thr Glu Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr
50 55 60
Thr Ser Glu Lys Ala Pro Glu Thr Lys Pro Val Ala Asn Ala Val Ser
65 70 75 80
Val Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala Pro Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala
85 90 95
Lys Glu Val Lys Glu Val Lys Ala Pro Lys Glu Thr Lys Ala Val Lys
100 105 110
Pro Ala Ala Lys Ala Thr Asn Asn Thr Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu
115 120 125
Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala Ile Lys Asp Lys Asp His Ser
130 135 140
Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe Glu Met Lys Lys Glu Asn Gly
145 150 155 160
Glu Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser Ser Val Lys Pro Ala Arg Val
165 170 175
Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly
180 185 190
Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro
195 200 205
Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg
210 215 220
Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala Val Lys Ile Val Ser Ser Thr
225 230 235 240
His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe
245 250 255
Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala Asp Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp
260 265 270
Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala pro Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu
275 280 285
Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu
290 295 300
Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys Leu Glu Asp Thr Lys Lys Ala
305 310 315 320
Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln
325 330 335
Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val
340 345 350
Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser Met Met Asp Thr Phe Val Lys
355 360 365
His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Met Val Met
370 375 380
Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys Asp Phe Met Val Glu Gly Gln
385 390 395 400
Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile
405 410 415
Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys
420 425 430
Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp Gly Gln Tyr His Val Arg Ile
435 440 445
Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala Asn Thr Asp Lys Ser Asn Lys
450 455 460
Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys Lys Glu Ala Thr Pro Ala Thr
465 470 475 480
Pro Ser Lys Pro Thr Pro Ser Pro Val Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln
485 490 495
Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln Leu Pro Ser Val Glu Lys Glu
500 505 510
Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys Asp Lys Thr Pro Ala Thr Lys
515 520 525
Pro Thr Lys Gly Glu Val Glu Ser Ser Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val
530 535 540
Val Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala Lys Pro Thr Thr Ala Ser Ser Lys
545 550 555 560
Thr Thr Lys Asp Val Val Gln Thr Ser Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys
565 570 575
Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly
580 585 590
His Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn Thr Gln Glu Asn Lys Ala Lys
595 600 605
Ser Leu Pro Gln Thr Gly Glu Glu Ser Asn Lys Asp Met Thr Leu Pro
610 615 620
Leu Met Ala Leu Leu Ala Leu Ser Ser Ile Val Ala Phe Val Leu Pro
625 630 635 640
Arg Lys Arg Lys Asn
645
提供人λ序列的SEQ ID NO：48如下：
Gln Pro Lys Ala Asn pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu cys Ser
100 105
实施例13：mAb CS-D7的治疗性施用
使用1-2×109CFU金黄色葡萄球菌通过尾静脉攻击插入导管的大鼠。1小时后，用4mg单克隆抗体(mAb CS-D7或同种型对照)或仅PBS腹膜内注射大鼠。在攻击后第24小时，处死大鼠，取出导管。通过涂布在甘露醇盐板上过夜来就金黄色葡萄球菌估量导管。不同实验的结果示于表14。
表14：大鼠留置导管模型，治疗性施用
*mAb CS-D7与mAb 20C2HA相比较的p值
**mAb CS-D7与PBS相比较的p值
实施例14：联合治疗-万古霉素和mAb CS-D7
在用2-4×109CFU的金黄色葡萄球菌Becker静脉内攻击之前1小时(1H)，给插入导管的大鼠皮下(sub.cu.)施用万古霉素(20mpk)。在攻击后1H，用6mg/大鼠的mAb CS-D6、同种型对照mAb 20C2HA或PBS注射大鼠。在攻击后24小时，处死动物，收获颈静脉导管，然后就导管上载有的细菌对导管进行估量。通过置于选择性肉汤培养基中和在Piccolo温育系统上的向外生长来进行导管的估量。通过将向外生长与在相同条件下的金黄色葡萄球菌生长的标准曲线相比较来计算实验导管上CFU的数目。在第一组实验(表15)中，使用少量动物检测系统。在第二组实验(表16)中，使用更多的大鼠。在两种情况下，在mAb CS-D7存在的情况下，与同种型对照mAb存在的情况下相比，万古霉素的活性显著增强。这表明mAb CS-D7可增加细菌的清除，高于仅万古霉素。该模型被设计来模拟临床状况，在所述临床状况中，患者正经历手术或其他侵入性过程，并且获得经验性或预防性抗生素。在该模型中，在细菌暴露后注射mAb，从而模拟用于手术期间感染的辅助性mAb治疗。在此类非常应急条件(stringent condition)下，mAb具有有益的效果。
表15：与同种型对照mAb相比，mAb CS-D7增强万古霉素的抗葡萄球菌活性，从而减少用金黄色葡萄球菌(Becker)攻击的插入导管的大鼠的导管形成集落。
@用于几何平均数测定的被赋予为″1″的值的不具有向外生长的导管
*p＝0.035，用于组2对比组3
表16：与同种型对照mAb相比较，mAb CS-D7增强万古霉素的抗葡萄球菌活性，从而减少用金黄色葡萄球菌(Becker)攻击的插入导管的大鼠的导管形成集落。
@用于几何平均数测定的被赋予为″10″的值的不具有向外生长的导管
*p＝0.035，用于组3对比组4
其他实施方案在下列权利要求之内。虽然已显示和描述了几个实施方案，但可进行各种修饰而不背离本发明的精神和范围。
序列表
<110>Merck & Co.，Inc.
<120>靶向金黄色葡萄球菌ORF0657n的抗原结合蛋白
<130>22319Y PCT
<150>61/007,998
<151>2007-12-17
<150>60/932,788
<151>2007-05-31
<160>54
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>215
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb CS-D7轻链
<400>1
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Val Ser Asp Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Arg Pro
85 90 95
Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210>2
<211>456
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb CS-D7重链
<400>2
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Asn Val Phe Phe Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Glu Asn Gln Ser
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Pro Gln Ala Tyr Ser His Asp Ser Ser Gly His Ser Pro
100 105 110
Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130 135 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195 200 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
210 215 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225 230 235 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245 250 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260 265 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275 280 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290 295 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340 345 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
355 360 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405 410 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420 425 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210>3
<211>112
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb CS-E11轻链可变区
<400>3
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Asp Arg Ser Asn Ile Gly Ala Thr
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn His Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Glu Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ala Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Gly
85 90 95
Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210>4
<211>126
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb CS-E11重链可变区
<400>4
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Asn Val Phe Phe Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Glu Asn Gln Ser
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Pro Gln Ala Tyr Ser His Asp Ser Ser Gly His Ser Pro
100 105 110
Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>5
<211>113
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb CS-C10轻链可变区
<400>5
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Gly Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Asn Gly Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
Gly
<210>6
<211>126
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb CS-C10重链可变区
<400>6
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Asn Val Phe Phe Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Glu Asn Gln Ser
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Pro Gln Ala Tyr Ser His Asp Ser Ser Gly His Ser Pro
100 105 110
Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>7
<211>108
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb CS-A10轻链可变区
<400>7
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Leu Gly Asp Lys Ser Val
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Met Ser
35 40 45
Gln Gly Ser Lys Arg Pro Leu Gly Ile Pro Asp Arg Ile Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Thr Val
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Phe Tyr Cys Gln Thr Trp Asp Arg Tyr Thr Gly Val
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105
<210>8
<211>126
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb CS-A10重链可变区
<400>8
Arg Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Asn Val Phe Phe Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Glu Asn Gln Ser
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Pro Gln Ala Tyr Ser His Asp Ser Ser Gly His Ser Pro
100 105 110
Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>9
<211>111
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb BMV-H11轻链可变区
<400>9
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Gly Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Arg
85 90 95
Ser Thr Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210>10
<211>128
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb BMV-H11重链可变区
<400>10
Arg Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Ile Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Asn Met Phe Tyr Ser Gly Gly Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Ser Ile Ser Val Gly Pro Ser Ser Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Pro Leu Gly Tyr Asn Phe Asp Ser Ser Gly Gln Gly Lys
100 105 110
Ser Ala Phe Glu Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>11
<211>111
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb BMV-E6轻链可变区
<400>11
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Gly Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Arg
85 90 95
Ser Thr Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210>12
<211>128
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb BMV-E6重链可变区
<400>12
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Asn Met Phe Tyr Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Ser Ile Ser Val Gly Pro Ser Ser Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Pro Leu Gly His Asn Phe Asp Ser Ser Gly Gln Gly Glu
100 105 110
Gly Ala Phe Glu Ile Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>13
<211>111
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb BMV-D4轻链可变区
<400>13
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Met Ile Tyr Glu Gly Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Arg
85 90 95
Ser Thr Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210>14
<211>128
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb BMV-D4重链可变区
<400>14
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Asn Met Phe Tyr Ser Gly Gly Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Asn Arg Val Ser Ile Ser Val Gly Pro Ser Ser Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Pro Leu Gly Tyr Asn Phe Asp Ser Ser Gly Gln Gly Lys
100 105 110
Ser Ala Phe Glu Ile Trp Gly Lys Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>15
<211>111
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb BMV-C2轻链可变区
<400>15
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met
35 40 45
Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Asn Ser Ala Ser Leu Asp Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Ser Glu Phe Leu Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210>16
<211>128
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb BMV-C2重链可变区
<400>16
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Asn Met Phe Tyr Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Ser Ile Ser Val Gly Pro Ser Ser Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Pro Leu Gly His Asn Phe Asp Ser Ser Gly Gln Gly Glu
100 105 110
Gly Ala Phe Glu Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>17
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb CS-D7 VL CDR1
<400>17
Arg Ala Ser Gln Tyr Val Ser Asp Asn Leu Ala
1 5 10
<210>18
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb CS-D7 VL CDR2
<400>18
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210>19
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb CS-D7 VL CDR3
<400>19
Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Arg Pro Val Thr
1 5 10
<210>20
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb CS-E11 VL CDR1
<400>20
Thr Gly Asp Arg Ser Asn Ile Gly Ala Thr Tyr Asp Val His
1 5 10
<210>21
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb CS-E11 VL CDR2
<400>21
Gly Asn His Asn Arg Pro Ser
1 5
<210>22
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb CS-E11 VL CDR3
<400>22
Gln Ser Tyr Asp Ser Gly Leu Ser Gly Tyr Val
1 5 10
<210>23
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb CS-D10 VL CDR1
<400>23
Thr Gly Gly Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His
1 5 10
<210>24
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb CS-D10 VL CDR2
<400>24
Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser
1 5
<210>25
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb CS-D10 VL CDR3
<400>25
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Asn Gly Pro Val Val
1 5 10
<210>26
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb CS-A10 VL CDR1
<400>26
Ser G1y Asp Asn Leu Gly Asp Lys Ser Val Ser
1 5 10
<210>27
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb CS-A10 VL CDR2
<400>27
G1n Gly Ser Lys Arg Pro Leu
1 5
<210>28
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb CS-A10 VL CDR3
<400>28
Gln Thr Trp Asp Arg Tyr Thr Gly Val Val
1 5 10
<210>29
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAbs BMV-H11，BMV-E6和BMV-D4 VL CDR1
<400>29
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly G1y Tyr Asn Tyr Val Ser
1 5 10
<210>30
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAbs BMV-H11，BMV-E6和BMV-D4 VL CDR2
<400>30
Glu Gly Ser Lys Arg Pro Ser
1 5
<210>31
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAbs BMV-H11，BMV-E6和BMV-D4 VL CDR3
<400>31
Ser Ser Tyr Thr Thr Arg Ser Thr Arg Val
1 5 10
<210>32
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb BMV-C2 VL CDR1
<400>32
Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser
1 5 10
<210>33
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb BMV-C2 VL CDR2
<400>33
Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser
1 5
<210>34
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb BMV-C2 VL CDR3
<400>34
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Glu Phe Leu
1 5 10
<210>35
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAbs CS-D7，CS-E11，CS-D10和CS-A10 VH CDR1
<400>35
Gly Gly Ser Ile Arg Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly
1 5 10
<210>36
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAbs CS-D7和CS-E11 VH CDR2
<400>36
Asn Val Phe Phe Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn
1 5 10 15
<210>37
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAbs CS-D7，CS-E11，CS-D10和CS-A10 VH CDR3
<400>37
Pro Gln Ala Tyr Ser His Asp Ser Ser Gly His Ser Pro Phe Asp Leu
1 5 10 15
<210>38
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb CS-D10 VH CDR2
<400>38
Asn Val Phe Phe Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210>39
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb CS-A10 VH CDR2
<400>39
Asn Val Phe Phe Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Gly
1 5 10 15
<210>40
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAbs BMV-H11，BMV-E6，BMV-D4和BMV-C2 VH CDR1
<400>40
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly
1 5 10
<210>41
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb BMV-H11 VH CDR2
<400>41
Asn Met Phe Tyr Ser Gly Gly Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210>42
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAbs BMV-H11和BMV-C2 VH CDR3
<400>42
Pro Leu Gly Tyr Asn Phe Asp Ser Ser Gly Gln Gly Lys Ser Ala Phe
1 5 10 15
Glu Ile
<210>43
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAbs BMV-E6和BMV-C2 VH CDR2
<400>43
Asn Met Phe Tyr Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210>44
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAb BMV-D4 VH CDR2
<400>44
Asn Met Phe Tyr Ser Gly Gly Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn
1 5 10 15
<210>45
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>mAbs BMV-E6和BMV-C2 VH CDR3
<400>45
Pro Leu Gly His Asn Phe Asp Ser Ser Gly Gln Gly Glu Gly Ala Phe
1 5 10 15
Glu Ile
<210>46
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>SEQ ID NOs：35和40的保守序列
<220>
<221>VARIANT
<222>5
<223>Xaa＝任意氨基酸
<400>46
Gly Gly Ser Ile Xaa Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly
1 5 10
<210>47
<211>645
<212>PRT
<213>金黄色葡萄球菌
<400>47
Met Asn Lys Gln Gln Lys Glu Phe Lys Ser Phe Tyr Ser Ile Arg Lys
1 5 10 15
Ser Ser Leu Gly Val Ala Ser Val Ala Ile Ser Thr Leu Leu Leu Leu
20 25 30
Met Ser Asn Gly Glu Ala Gln Ala Ala Ala Glu Glu Thr Gly Gly Thr
35 40 45
Asn Thr Glu Ala Gln Pro Lys Thr Glu Ala Val Ala Ser Pro Thr Thr
50 55 60
Thr Ser Glu Lys Ala Pro Glu Thr Lys Pro Val Ala Asn Ala Val Ser
65 70 75 80
Val Ser Asn Lys Glu Val Glu Ala Pro Thr Ser Glu Thr Lys Glu Ala
85 90 95
Lys Glu Val Lys Glu Val Lys Ala Pro Lys Glu Thr Lys Ala Val Lys
100 105 110
Pro Ala Ala Lys Ala Thr Asn Asn Thr Tyr Pro Ile Leu Asn Gln Glu
115 120 125
Leu Arg Glu Ala Ile Lys Asn Pro Ala Ile Lys Asp Lys Asp His Ser
130 135 140
Ala Pro Asn Ser Arg Pro Ile Asp Phe Glu Met Lys Lys Glu Asn Gly
145 150 155 160
Glu Gln Gln Phe Tyr His Tyr Ala Ser Ser Val Lys Pro Ala Arg Val
165 170 175
Ile Phe Thr Asp Ser Lys Pro Glu Ile Glu Leu Gly Leu Gln Ser Gly
180 185 190
Gln Phe Trp Arg Lys Phe Glu Val Tyr Glu Gly Asp Lys Lys Leu Pro
195 200 205
Ile Lys Leu Val Ser Tyr Asp Thr Val Lys Asp Tyr Ala Tyr Ile Arg
210 215 220
Phe Ser Val Ser Asn Gly Thr Lys Ala Val Lys Ile Val Ser Ser Thr
225 230 235 240
His Phe Asn Asn Lys Glu Glu Lys Tyr Asp Tyr Thr Leu Met Glu Phe
245 250 255
Ala Gln Pro Ile Tyr Asn Ser Ala Asp Lys Phe Lys Thr Glu Glu Asp
260 265 270
Tyr Lys Ala Glu Lys Leu Leu Ala Pro Tyr Lys Lys Ala Lys Thr Leu
275 280 285
Glu Arg Gln Val Tyr Glu Leu Asn Lys Ile Gln Asp Lys Leu Pro Glu
290 295 300
Lys Leu Lys Ala Glu Tyr Lys Lys Lys Leu Glu Asp Thr Lys Lys Ala
305 310 315 320
Leu Asp Glu Gln Val Lys Ser Ala Ile Thr Glu Phe Gln Asn Val Gln
325 330 335
Pro Thr Asn Glu Lys Met Thr Asp Leu Gln Asp Thr Lys Tyr Val Val
340 345 350
Tyr Glu Ser Val Glu Asn Asn Glu Ser Met Met Asp Thr Phe Val Lys
355 360 365
His Pro Ile Lys Thr Gly Met Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Met Val Met
370 375 380
Glu Thr Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Lys Asp Phe Met Val Glu Gly Gln
385 390 395 400
Arg Val Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ala Lys Asn Asn Thr Arg Thr Ile
405 410 415
Ile Phe Pro Tyr Val Glu Gly Lys Thr Leu Tyr Asp Ala Ile Val Lys
420 425 430
Val His Val Lys Thr Ile Asp Tyr Asp Gly Gln Tyr His Val Arg Ile
435 440 445
Val Asp Lys Glu Ala Phe Thr Lys Ala Asn Thr Asp Lys Ser Asn Lys
450 455 460
Lys Glu Gln Gln Asp Asn Ser Ala Lys Lys Glu Ala Thr Pro Ala Thr
465 470 475 480
Pro Ser Lys Pro Thr Pro Ser Pro Val Glu Lys Glu Ser Gln Lys Gln
485 490 495
Asp Ser Gln Lys Asp Asp Asn Lys Gln Leu Pro Ser Val Glu Lys Glu
500 505 510
Asn Asp Ala Ser Ser Glu Ser Gly Lys Asp Lys Thr Pro Ala Thr Lys
515 520 525
Pro Thr Lys Gly Glu Val Glu Ser Ser Ser Thr Thr Pro Thr Lys Val
530 535 540
Val Ser Thr Thr Gln Asn Val Ala Lys Pro Thr Thr Ala Ser Ser Lys
545 550 555 560
Thr Thr Lys Asp Val Val Gln Thr Ser Ala Gly Ser Ser Glu Ala Lys
565 570 575
Asp Ser Ala Pro Leu Gln Lys Ala Asn Ile Lys Asn Thr Asn Asp Gly
580 585 590
His Thr Gln Ser Gln Asn Asn Lys Asn Thr Gln Glu Asn Lys Ala Lys
595 600 605
Ser Leu Pro Gln Thr Gly Glu Glu Ser Asn Lys Asp Met Thr Leu Pro
610 615 620
Leu Met Ala Leu Leu Ala Leu Ser Ser Ile Val Ala Phe Val Leu Pro
625 630 635 640
Arg Lys Arg Lys Asn
645
<210>48
<211>105
<212>PRT
<213>人(Homo sapien)
<400>48
Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210>49
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>重链前导序列
<400>49
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210>50
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链前导序列
<400>50
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1 5 10 15
Asp Ala Arg Cys
20
<210>51
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>51
acagatgcca gatgcgaaat tgtgatgaca cagtct 36
<210>52
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>52
tgcagccacc gtacgtttaa tctccagtcg tgtccc 36
<210>53
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>53
acaggtgtcc actcgcaggt gcagctgcag gagtcg 36
<210>54
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>54
gcccttggtg gatgcactcg agacggtgac cagggt 36
Claims (25)
1.包含第一可变区和第二可变区的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一和第二可变区结合CS-D7靶区域。
2.权利要求1的结合蛋白，其中所述第一可变区是重链可变(Vh)区，其包含至少一个选自下列的互补决定区(CDR)：
包含SEQ ID NO：46或与SEQ ID NO：46相异在于一个氨基酸的序列的第一Vh CDR；
包含SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：44，或与SEQ ID NOs：36、38、39、41、43或44相异在于一个氨基酸的序列的第二Vh CDR；和，
包含SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：42或SEQ ID NO：45，或与SEQID NOs：37、42或45相异在于一个氨基酸的序列的第三Vh CDR。
3.权利要求2的结合蛋白，其中所述Vh区包含所述第一Vh CDR，所述第二Vh CDR和所述第三Vh CDR。
4.权利要求3的结合蛋白，其中所述第一、第二和第三Vh CDR分别包含选自下列序列的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37；
b)SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：37；
c)SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：37；
d)SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42；
e)SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：45；和，
f)SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：42。
5.权利要求1-4的任一项的结合蛋白，其中所述第二可变区是轻链可变(Vl)区，其包含至少一个选自下列的互补决定区(CDR)：
包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：32，或与SEQ ID NOs：17、20、23、26、29或32相异在于一个氨基酸的序列的第一VlCDR；
包含SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：33，或与SEQ ID NOs：18、21、24、27、30或33相异在于一个氨基酸的序列的第二VlCDR；和，
包含SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：34，或与SEQ ID NOs：19、22、25、28、31或34相异在于一个氨基酸的序列的第三VlCDR。
6.权利要求5的结合蛋白，其中所述Vl区包含所述第一VlCDR，所述第二VlCDR和所述第三VlCDR。
7.权利要求6的结合蛋白，其中所述第一、第二和第三VlCDR分别包含选自下列序列的氨基酸序列：
a)SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19；
b)SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22；
c)SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25；
d)SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28；
e)SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31；和，
f)SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34。
8.权利要求1-7的任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白是抗体。
9.权利要求8的结合蛋白，其中所述第一Vh CDR、所述第二VhCDR和所述第三Vh CDR分别包含SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37；和所述第一VlCDR、所述第二VlCDR和所述第三VlCDR分别包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19。
10.权利要求8的结合蛋白，其中所述Vh区包含选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQID NO：12、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16的氨基酸1-126的氨基酸序列。
11.权利要求10的结合蛋白，其中所述Vl区包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：15的氨基酸1-108的氨基酸序列。
12.权利要求8的结合蛋白，其中所述抗体包含：
a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-108的Vl区和包含SEQ ID NO：2的氨基酸1-126的Vh区；
b)包含SEQ ID NO：3的Vl区和包含SEQ ID NO：4的Vh区；
c)包含SEQ ID NO：5的Vl区和包含SEQ ID NO：6的Vh区；
d)包含SEQ ID NO：7的Vl区和包含SEQ ID NO：8的Vh区；
e)包含SEQ ID NO：9的Vl区和包含SEQ ID NO：10的Vh区；
f)包含SEQ ID NO：11的Vl区和包含SEQ ID NO：12的Vh区；
g)包含SEQ ID NO：13的Vl区和包含SEQ ID NO：14的Vh区；或，
h)包含SEQ ID NO：15的Vl区和包含SEQ ID NO：16的Vh区。
13.权利要求12的结合蛋白，其中所述Vh区包含SEQ ID NO：2的氨基酸1-126并且所述Vl区包含SEQ ID NO：1的氨基酸1-108。
14.权利要求8-13的任一项的结合蛋白，其中所述抗体包含含有来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型的铰链区、CH1、CH2和CH3区的重链；和包含所述Vl区和人κC1或人λC1的轻链。
15.权利要求1的结合蛋白，其中所述结合蛋白是包含含有SEQ IDNO：1的轻链和含有SEQ ID NO：2的重链的抗体。
16.包含至少一种重组基因的核酸，所述重组基因编码权利要求1-15的任一项中所描述的抗原结合蛋白重链可变(Vh)区或抗原结合蛋白轻链可变(Vl)区。
17.权利要求16的核酸，其中所述核酸包含两个重组基因，编码抗原结合蛋白的Vh区的第一重组基因和编码抗原结合蛋白的Vl区的第二重组基因。
18.包含权利要求16或权利要求17的重组核酸的重组细胞。
19.产生包含抗体可变区的蛋白质的方法，该方法包括步骤：
a)在其中使所述蛋白质表达的条件下培养权利要求18的重组细胞；和，
b)纯化所述蛋白质。
20.包含权利要求1-15的任一项的结合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。
21.在患者中保护或治疗抵抗金黄色葡萄球菌感染的方法，该方法包括对所述患者施用有效量的权利要求1-15的任一项的结合蛋白的步骤。
22.权利要求23的方法，其中所述患者是人并且将所述抗原结合蛋白与手术或异体植入物结合施用。
23.权利要求21的方法，其中所述患者是感染了金黄色葡萄球菌的人。
24.权利要求1-15的任一项的抗原结合蛋白在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗抵抗金黄色葡萄球菌感染。
25.包含具有与SEQ ID NO：47的氨基酸42-342具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽的长度最高达到350个氨基酸。
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