CN111836643A - 用于治疗或预防异位骨化的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种药物组合物，所述药物组合物用于患有异位骨化和/或患有脑肿瘤的患者的治疗和/或预防方法，其特征在于，患者具有作为异位骨化或脑肿瘤病因的ALK2蛋白的激活型突变，且ALK2的330位氨基酸残基是脯氨酸，以及，所述组合物的有效成分是包含与ALK2结合的性质、交联ALK2的性质和抑制BMP信号转导的性质的抗ALK2抗体或其抗原结合片段。

Description

用于治疗或预防异位骨化的药物组合物
技术领域
本发明涉及一种药物组合物，所述药物组合物用于异位骨化和/或脑肿瘤的治疗和/或预防方法，其特征在于，向具有ALK2的激活型突变且ALK2的330位氨基酸残基无突变的患者给予具有ALK2结合性和交联能力的抗ALK2抗体。
背景技术
进行性骨化性纤维发育不良(Fibrodysplasia ossificans progressiva(FOP))是在骨骼肌或肌腱、韧带等通常不形成骨组织的软组织中，异位性地形成软骨组织或骨组织的遗传性疾病(非专利文献1-3)。本疾病中异位骨化在包括面部的全身发生，异位性骨组织与现有的骨组织发生融合而使关节活动度明显降低，身体发生变形(非专利文献1-3)。
已知FOP中异位骨化除了伴随成长而慢性发展之外，还伴有因肌肉损伤或病毒感染等而发生称为急性发作(flare-up)的症状而发展为急性异位骨化(非专利文献1)。急性发作是以炎症反应、长期疼痛为主要症状的肿胀，除了发生肌肉损伤的碰伤或跌倒、肌肉注射等所诱导之外，也已知有原因不明的突然的急性发作病例。由于在FOP中急性发作后形成异位性骨组织，严禁进行活检或手术等侵入性医疗行为，不能用外科方法去除异位性骨组织。此外，在FOP中形成的异位性骨组织由于是由正常的软骨细胞或成骨细胞形成，与正常的骨组织同样地被代谢，因此不能使用药物等内科方法仅去除异位性骨组织。
抑制FOP异位骨化的根本治疗法尚未确立，只能对疼痛采取对症治疗。因此，去除在FOP中形成的异位性骨组织非常困难，期待着开发出在异位骨化开始前能够达到预防效果的药物。
作为FOP的致病基因，已鉴定出编码在包括骨骼肌组织的软组织中诱导异位性骨形成的骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein(BMP))受体之一的Activin LikeKinase 2(ALK2；激活素样激酶2)基因(非专利文献4)。ALK2也就是称为激活素AI型受体1(Activin A type I Receptor 1(ACVR1))的基因。从家族性和孤立性FOP病例中发现了伴有氨基酸置换的ALK2(非专利文献4)。
人和小鼠ALK2是包含具有信号肽的509个氨基酸的一次跨膜蛋白，作为与BMP结合的跨膜型丝氨酸-苏氨酸激酶受体发挥功能(非专利文献1-3)。在N末端侧的胞外区结合BMP，通过细胞内的丝氨酸-苏氨酸激酶激活下游的细胞内信息传递系统。
BMP受体根据其结构和功能，分为含ALK2的I型受体、II型受体这2种(非专利文献1-3)。II型受体是即使不结合BMP也显示激酶活性的组成性活性酶。另一方面，含ALK2的I型受体在不与BMP结合的状态为非活性酶，显示为BMP结合依赖性激酶活性。认为这是由于与BMP的结合，II型受体激酶以I型受体的细胞内结构域作为底物进行磷酸化，使I型受体三级结构发生变化而激活I型受体(非专利文献1-3)。
已知如果置换I型受体胞内区的特定氨基酸，则变为II型受体非依赖性激活的组成性活性型受体(非专利文献1-3)。如果过表达该I型受体的组成性活性型突变体，则不施加BMP刺激也可激活细胞内信息传递系统。因此，认为I型受体是由细胞外向细胞内传递BMP信息的主要作用分子。
从家族性和典型的孤立性FOP病例鉴定出的ALK2的突变是Arg206置换为His的R206H突变体(非专利文献4)。迄今为止从FOP病例鉴定出的基因突变已确认全部在ALK2胞内区发生氨基酸突变。这些FOP病例的大部分突变集中在ALK2胞内区的ATP结合区附近(非专利文献5)。
如果使FOP鉴定的ALK2突变体在培养细胞中过表达，则不施加BMP刺激也可激活BMP的细胞内信息传递系统(非专利文献6)。因此，作为FOP的治疗药，已开发出期待能够通过作用于ALK2的胞外区阻碍信号转导，从而对包括ALK2的野生型和新突变体在内的胞内区中的各种突变体也有抑制作用的抗ALK2抗体(专利文献1)。
另外，扩散型内因性脑桥神经胶质瘤(DIPG)是一种集中于脑桥而被发现的弥漫性(浸润性)星形细胞瘤，据说占小儿脑干肿瘤的约75％至80％。因为脑干控制着呼吸等基本功能，因此是长期存活率低于10％的罕见疾病。已经从DIPG病例中鉴定出与FOP病例相同的ALK2突变(非专利文献7)。因此，可通过抗ALK2抗体治疗DIPG等脑肿瘤。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公布第WO2016/121908号
非专利文献
非专利文献1：T.Katagiri，J.Oral Biosci.，52，33-41(2010)
非专利文献2：T.Katagiri，J.Oral Biosci.，54，119-123(2012)
非专利文献3：T.Katagiri and S.Tsukamoto，Biol.Chem.，394，703-714(2013)
非专利文献4：E.M.Shore et al.，Nat.Genet.，38，525-527(2006)
非专利文献5：A.Chaikuad et al.，J.Biol.Chem.，287，36990-36998(2012)
非专利文献6：T.Fukuda et al.，J.Biol.Chem.，284，7149-7156(2009)
非专利文献7：K.R.Taylor et al.，Nat Genet.，46，457-461(2014)
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的在于提供一种异位骨化和/或脑肿瘤的有效治疗和/或预防方法，以及用于该方法的药物组合物。
解决问题的技术方案
本发明人对抗ALK2抗体作为FOP的治疗药进行了评价，结果发现在对FOP模型小鼠给予抗ALK2抗体时，可促进异位骨化。本发明人为了解决上述问题而进行了深入研究，本次发现抗ALK2抗体虽然促进具有R206H突变的小鼠ALK2的细胞内信号转导，但使用具有R206H突变的人ALK2时，反而抑制细胞内信号转导。因此，当分别置换人ALK2和小鼠ALK2的胞内与胞外时，如果胞内区具有R206H突变的小鼠ALK2，则证实了抗ALK2抗体促进细胞内信号转导。当将人ALK2和小鼠ALK2的胞内区的氨基酸序列进行对比时，只有182位氨基酸残基(人中为天冬氨酸(D)、小鼠中为谷氨酸(E))和330位氨基酸残基(人中为脯氨酸(P)、小鼠中为丝氨酸(S))不同。因此，制作将具有R206H突变的人ALK2的182位天冬氨酸(D)和330位的脯氨酸(P)分别置换为小鼠的氨基酸残基的谷氨酸(E)和丝氨酸(S)的突变体，研究抗ALK2抗体的作用。结果表明，当具有R206H突变的人ALK2的330位的脯氨酸(P)置换为丝氨酸(S)时，抗ALK2抗体促进细胞内信号转导。还发现将330位的脯氨酸(P)置换为天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)或丙氨酸(A)也可得到同样的结果。进一步，在即使将不具有R206H突变的人ALK2的328位甘氨酸(G)置换为缬氨酸(V)时，证实了通过抗ALK2抗体使由ALK2介导的BMP信号转导增强。结果本发明人发现：在具有ALK2激活型突变的患者中，通过仅向ALK2的330位氨基酸残基无突变的患者和/或无G328V突变的患者给予抗ALK2抗体，能够有效地治疗和/或预防异位骨化和/或脑肿瘤，从而完成了本发明。
即，本发明包含以下的发明：
(1)一种药物组合物，所述药物组合物用于患有异位骨化的患者的治疗和/或预防方法，其特征在于，所述患者具有作为异位骨化病因的激活素样激酶2(ALK2)蛋白的激活型突变，且所述ALK2的330位氨基酸残基是脯氨酸，以及，所述组合物的有效成分是包含与所述ALK2结合的性质、交联所述ALK2的性质和抑制BMP信号转导的性质的抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段。
(2)根据所述(1)所述的药物组合物，其中，所述ALK2不具有G328V突变。
(3)根据所述(1)所述的药物组合物，其中，所述方法包括如下步骤：(a)检测患者的ALK2是否存在激活型突变；(b)筛选具有ALK2激活型突变的患者；(c)确认患者的ALK2的330位氨基酸残基无突变；以及，(d)向筛选出的患者给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段。
(4)根据所述(3)所述的药物组合物，其中，所述步骤(c)还包括确认患者的ALK2不具有G328V突变的步骤。
(5)根据所述(3)所述的药物组合物，其中，对成为所述抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段给药对象的患者的筛选包括如下步骤：(a)检测异位骨化的患者中的ALK2是否存在激活型突变；(b)筛选具有ALK2激活型突变的患者；以及，(c)将ALK2的330位氨基酸残基有突变的患者排除。
(6)根据所述(5)所述的药物组合物，其中，所述步骤(c)还包括将ALK2具有G328V突变的患者排除的步骤。
(7)根据所述(1)～(6)中任一项所述的药物组合物，其中，所述抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段与包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中21位～123位氨基酸残基的多肽特异性结合。
(8)根据所述(1)～(7)中任一项所述的药物组合物，其中，所述抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段与以下结合：
(i)含有下列各残基的表位：SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的38位谷氨酸、39位甘氨酸、59位异亮氨酸、60位天冬酰胺、61位天冬氨酸、62位甘氨酸、63位苯丙氨酸、64位组氨酸、65位缬氨酸、66位酪氨酸、102位天冬酰胺、104位苏氨酸、106位谷氨酰胺、107位亮氨酸，或者
(ii)含有下列各残基的表位：SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的38位谷氨酸、39位甘氨酸、40位亮氨酸、59位异亮氨酸、60位天冬酰胺、61位天冬氨酸、62位甘氨酸、63位苯丙氨酸、64位组氨酸、65位缬氨酸、66位酪氨酸和104位苏氨酸。
(9)根据所述(1)～(7)中任一项所述的药物组合物，其中，所述抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段与根据所述(8)所述的抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段竞争对ALK2的结合。
(10)根据所述(1)～(9)中任一项所述的药物组合物，其中，所述抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段是单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、双链抗体、多特异性抗体或F(ab’)2。
(11)根据所述(1)～(10)中任一项所述的药物组合物，其中，所述抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的重链序列含有具有CDRH1、CDRH2、CDRH3的可变区，所述CDRH1、CDRH2和CDRH3各自包含下列所示的氨基酸序列：
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7；
SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13；
SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20；或者，
SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26；以及，
轻链序列含有具有CDRL1、CDRL2、CDRL3的可变区，所述CDRL1、CDRL2和CDRL3各自包含下列所示的氨基酸序列：
SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；
SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:10；
SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；
SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23；或者，
SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29。
(12)根据所述(1)～(11)中任一项所述的药物组合物，其中，所述抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的重链可变区序列是下列序列：
a1)包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列中20位～142位氨基酸残基的氨基酸序列；
a2)包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列中20位～142位氨基酸残基的氨基酸序列；
a3)包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列中20位～140位氨基酸残基的氨基酸序列；
a4)包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列中20位～140位氨基酸残基的氨基酸序列；
a5)包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列中20位～140位氨基酸残基的氨基酸序列；
a6)包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列中20位～140位氨基酸残基的氨基酸序列；
a7)与选自所述a1)～a6)的氨基酸序列中任一个的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；
a8)与选自所述a1)～a6)的氨基酸序列中任一个的氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列；或者，
a9)选自所述a1)～a6)的氨基酸序列中任一个的氨基酸序列中1个或数个氨基酸残基被置换、缺失或添加的氨基酸序列；
以及，轻链可变区序列是下列序列：
b1)包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列中21位～133位氨基酸残基的氨基酸序列；
b2)包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列中21位～129位氨基酸残基的氨基酸序列；
b3)包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列中21位～129位氨基酸残基的氨基酸序列；
b4)与选自所述b1)～b3)的氨基酸序列中任一个的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；
b5)与选自所述b1)～b3)的氨基酸序列中任一个的氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列；或者，
b6)选自所述b1)～b3)的氨基酸序列中任一个的氨基酸序列中1个或数个氨基酸残基被置换、缺失或添加的氨基酸序列。
(13)根据所述(12)所述的药物组合物，其中，所述抗ALK2抗体是包含下列重链和轻链的抗体：含有包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列中20位～142位氨基酸残基的重链可变区的重链和含有包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列中21位～133位氨基酸残基的轻链可变区的轻链、含有包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列中20位～142位氨基酸残基的重链可变区的重链和含有包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列中21位～133位氨基酸残基的轻链可变区的轻链、含有包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列中20位～140位氨基酸残基的重链可变区的重链和含有包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列中21位～129位氨基酸残基的轻链可变区的轻链、含有包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列中20位～140位氨基酸残基的重链可变区的重链和含有包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列中21位～129位氨基酸残基的轻链可变区的轻链、含有包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列中20位～140位氨基酸残基的重链可变区的重链和含有包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列中21位～129位氨基酸残基的轻链可变区的轻链，或者含有包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列中20位～140位氨基酸残基的重链可变区的重链和含有包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列中21位～129位氨基酸残基的轻链可变区的轻链。
(14)根据所述(1)～(13)中任一项所述的药物组合物，其中，所述ALK2的激活型突变选自L196P、delP197_F198insL、R202I、R206H、Q207E、R258S、R258G、G325A、G328E、G328R、G328W、G356D和R375P中的至少一个。
(15)根据所述(1)～(13)中任一项所述的药物组合物，其中，所述ALK2的激活型突变是R206H突变。
(16)根据所述(1)～(15)中任一项所述的药物组合物，其中，所述异位骨化是进行性骨化性纤维发育不良(FOP)。
(17)一种药物组合物，所述药物组合物用于患有脑肿瘤的患者的治疗和/或预防方法，其特征在于，所述患者具有作为脑肿瘤病因的激活素样激酶2(ALK2)蛋白的激活型突变，以及，所述组合物的有效成分是包含与所述ALK2结合的性质、交联所述ALK2的性质和抑制BMP信号转导的性质的抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段。
(18)根据所述(17)所述的药物组合物，其中，所述患者的ALK2的330位氨基酸残基是脯氨酸。
(19)根据所述(17)或(18)所述的药物组合物，其中，所述ALK2的激活型突变选自R206H、R258G、G328E、G328W和G356D中的至少一个。
(20)根据所述(17)～(19)中任一项所述的药物组合物，其中，所述抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段是根据所述(7)～(13)中任一项所定义的抗ALK2抗体或其抗原结合片段。
(21)根据所述(17)～(20)中任一项所述的药物组合物，其中，所述脑肿瘤是扩散型内因性脑桥神经胶质瘤(DIPG)。
(22)一种对给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的副作用发生风险进行预测的方法，所述方法包括下列步骤：(a)检测患者的ALK2是否存在激活型突变和330位氨基酸残基的突变；以及，(b)将具有ALK2的激活型突变且330位氨基酸残基无突变的患者判定为给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的副作用发生风险低。
(23)一种对给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的治疗和/或预防应答性进行预测的方法，所述方法包括下列步骤：(a)检测患者的ALK2是否存在激活型突变和330位氨基酸残基的突变；以及，(b)将具有ALK2的激活型突变且330位氨基酸残基无突变的患者判定为具有给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的治疗和/或预防应答性。
(24)一种对给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的治疗和/或预防的对象患者进行筛选的方法，所述方法包括下列步骤：(a)检测患者的ALK2是否存在激活型突变和330位氨基酸残基的突变；以及，(b)将具有ALK2的激活型突变且330位氨基酸残基无突变的患者筛选为给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的治疗和/或预防的对象患者。
(25)一种给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的疾病的治疗和/或预防方法，所述方法包括下列步骤：(a)检测患者的ALK2是否存在激活型突变和330位氨基酸残基的突变；以及，(b)向具有ALK2的激活型突变且330位氨基酸残基无突变的患者给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段。
(26)根据所述(25)所述的方法，其中，还包括进行所述(22)～(24)中任一项所述的方法的步骤(b)。
(27)根据所述(22)～(26)中任一项所述的方法，其中，所述给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段是给予根据所述(1)～(21)中任一项所述的药物组合物。
(28)根据所述(22)～(27)中任一项所述的方法，其中，所述步骤(b)还包括确认ALK2的激活型突变不是G328V突变的步骤。
(29)根据所述(22)～(27)中任一项所述的方法，其中，所述ALK2的激活型突变选自L196P、delP197_F198insL、R202I、R206H、Q207E、R258S、R258G、G325A、G328E、G328R、G328W、G356D和R375P中的至少一个。
(30)根据所述(22)～(27)中任一项所述的方法，其中，所述ALK2的激活型突变选自R206H、R258G、G328E、G328W和G356D中的至少一个。
(31)根据所述(25)～(30)中任一项所述的方法，其中，所述患者患有的疾病是异位骨化或脑肿瘤。
(32)根据所述(31)所述的方法，其中，所述患者患有的疾病是异位骨化。
(33)根据所述(25)～(31)中任一项所述的方法，其中，所述患者患有的疾病是进行性骨化性纤维发育不良(FOP)或扩散型内因性脑桥神经胶质瘤(DIPG)。
(34)根据所述(33)所述的方法，其中，所述患者患有的疾病是进行性骨化性纤维发育不良(FOP)。
本文包括作为本申请优先权基础的日本国专利申请号2018-039066号的公开内容。
根据本发明，对于指定的患者，提供一种异位骨化和/或脑肿瘤的有效治疗和/或预防方法，以及用于该方法的药物组合物。此外，根据本发明，提供一种对给予抗ALK2抗体的副作用发生风险进行预测的方法、对给予抗ALK2抗体的治疗和/或预防应答性进行预测的方法，以及对给予抗ALK2抗体的治疗和/或预防的对象进行筛选的方法。而且，根据本发明，提供一种给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的对由ALK2的激活型突变引起的疾病(例如，异位骨化、脑肿瘤等)的治疗和/或预防方法。
附图简述
图1是通过BMP特异性萤光素酶报告基因显示以下内容的图示：抗ALK2抗体(27D-H2L2_LALA)在表达小鼠R206H ALK2的HEK293细胞中激活BMP信号转导(图1A)，而在表达人R206H ALK2的HEK293细胞中不激活BMP信号转导(图1B)。纵轴表示相对于未处理对照(即，不含所述抗ALK2抗体的对照)的相对萤光素酶活性(Relative luc activity)，而横轴表示抗体浓度。对照ALK2是小鼠野生型ALK2(Mouse WT ALK2)和人野生型ALK2(Human WTALK2)，对照抗体(Ctrl)是IgG1。
图2是通过BMP特异性萤光素酶报告基因显示以下内容的图示：F(ab’)2(27D-H2L2_F(ab’)2)与抗ALK2抗体(27D-H2L2_LALA)同样地仅在表达小鼠R206H ALK2的HEK293细胞中激活BMP信号转导(图2A)，而Fab(27D-H2L2_Fab)即使在表达小鼠R206H ALK2和人R206H ALK2中任一个的HEK293细胞中也不激活BMP信号转导(分别为图2A、图2B)。纵轴表示相对于未处理对照(即，不含所述F(ab’)2的对照)的相对萤光素酶活性(Relative lucactivity)，而横轴表示抗体浓度。此外，对照抗体(Ctrl)是IgG1。
图3是通过Nanoluc Binary技术显示A2-27D、27D-H2L2_LALA和27D-H2L2_F(ab’)2诱导形成ALK2的交联(形成复合物)的图示。与此相对，27D-H2L2_Fab未诱导形成ALK2的交联(形成复合物)。纵轴表示萤光素酶活性，而横轴表示抗体浓度。
图4表示在人、猴、狗、大鼠和小鼠的ALK2蛋白的序列对比中，182位氨基酸残基(人“D”，小鼠“E”)和330位氨基酸残基(人“P”，小鼠“S”)在人和小鼠的序列比对中不是保守的。
图5是通过BMP特异性萤光素酶报告基因显示以下内容的图示：抗ALK2抗体(A2-27D)在置换氨基酸序号330位的脯氨酸为丝氨酸的表达人R206H ALK2的HEK293细胞中激活BMP信号转导。予以说明，在置换氨基酸序号330位的丝氨酸为脯氨酸的表达小鼠R206HALK2的HEK293细胞中，显示出抑制BMP信号转导的激活(未示出数据)。而且，通过BMP特异性萤光素酶报告基因显示：抗ALK2抗体在表达小鼠R206H ALK2的HEK293细胞中激活BMP信号转导，而在表达人WT ALK2或置换氨基酸序号182位天冬氨酸为谷氨酸的人ALK2等图示的其他的人ALK2突变体的HEK293细胞中不激活或抑制(或阻碍)BMP信号转导。
图6是通过BMP特异性萤光素酶报告基因显示以下内容的图示：抗ALK2抗体(A2-27D)在置换氨基酸序号330位的脯氨酸(P)为丝氨酸(S)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、丙氨酸(A)的表达人R206H ALK2的HEK293细胞中激活BMP信号转导，而对于置换为缬氨酸(V)的人R206H ALK2不激活BMP信号转导。而且，对于具有上述置换但不含R206H突变的人WT ALK2，抗ALK2抗体不激活BMP信号转导。同时，也显示了对于具有如图所示突变的小鼠ALK2是否存在BMP信号转导的激活。对照(Control)是大鼠IgG2。
图7是通过BMP特异性萤光素酶报告基因显示以下内容的图示：4种抗ALK2抗体(27D-H2L2_LALA、15A-H4L6_IgG2、A2-11E、A2-25C)在表达小鼠R206H ALK2的HEK293细胞中激活BMP信号转导(图7A)，而在表达人R206H ALK2突变体的HEK293细胞中不激活BMP信号转导(图7B)。纵轴表示相对于未处理对照(即，不含所述抗ALK2抗体的对照)的相对萤光素酶活性(Relative luc activity)，而横轴表示抗体浓度。
图8是通过BMP特异性萤光素酶报告基因显示以下内容的图示：抗ALK2抗体(A2-27D)在表达人G328V和Q207D ALK2的HEK293细胞中激活BMP信号转导，而在其他表达人ALK2突变体(R206H、L196P、PF197-8L(也称为“delP197_F198insL”)、R202I、Q207E、R258G、R258S、G325A、G328E、G328R、G328W、G356D、R375P)的HEK293细胞中不激活BMP信号转导。活性是与实施例5同样测定的。图中，纵轴表示相对于未处理对照的萤光素酶活性，横轴表示A2-27D的浓度。此外，对于G328V(1/3)和Q207D(1/20)，在如下方式的测定中使用：G328V突变体是其他突变体的1/3量(例如，其他突变体是37.5ng/孔时为12.5ng/孔)，Q207D突变体是其他突变体的1/20量(例如，其他突变体是37.5ng/孔时为1.875ng/孔)。
发明的具体实施方式
对本发明进一步详细地说明。
1.定义
本文中，术语“基因”不仅包括DNA，还包括mRNA、cDNA和cRNA。
本文中，术语“多核苷酸”与“核酸“相同含义地使用，例如还包括DNA、RNA、探针、寡核苷酸和引物等。
本文中“多肽”与“蛋白”无区别地使用。
本文中“RNA级分“是指含有RNA的级分。
本文中“细胞”包括动物个体内的细胞和培养的细胞。
本文中“ALK2”与“ALK2蛋白”相同含义地使用，包括野生型和突变体(也称为“突变型”)。
本文中“抗体的抗原结合片段”也称为“抗体的功能性片段”，是指具有与抗原的结合性的抗体的部分片段，包括F(ab’)2、双链抗体(diabody)、线性抗体或单链抗体，以及由抗体片段形成的多特异性抗体等。条件是，只要与抗ALK2抗体同样地具有与ALK2的结合能力(或与ALK2结合的性质)且对ALK2的交联能力(或交联ALK2的性质)，就并不限定于这些分子。此外，优选上述抗体的抗原结合片段与抗ALK2抗体同样地还具有BMP信号转导抑制能力(或抑制(也称为“阻碍”)BMP信号转导的性质)。而且，这些抗原结合片段中不仅包括用适当的酶处理抗体蛋白的全长分子得到的片段，还包括使用基因工程修饰的抗体基因在适当的宿主细胞中产生的蛋白。
本文中“表位”也称为抗体的“抗原结合位点”，一般情况下，是指含有抗原的至少7个氨基酸、至少8个氨基酸、至少9个氨基酸或至少10个氨基酸的抗体所结合的抗原位点，本文中是指特定的抗ALK2抗体所结合的ALK2的部分肽或部分三级结构。所述的ALK2部分肽的表位例如可通过免疫测定法等本领域技术人员所熟知的方法进行确定，例如可以采用以下的方法。制作ALK2的各种部分结构。在制作部分结构时，可使用公知的寡肽合成技术。例如，用本领域技术人员已知的基因重组技术制作从ALK2的C末端或N末端以适当的点依次缩短的一系列多肽，然后研究检测抗体对这些多肽的反应性，在确定大致的识别位点之后，合成更短的肽并研究与这些肽的反应性，由此可确定表位。此外，特定的ALK2抗体所结合的ALK2部分三级结构的表位可通过由X射线结晶结构分析来鉴定对与所述抗体相邻的ALK2的氨基酸残基，由此可进行表位确定。如果第二抗ALK2抗体与第一抗ALK2抗体所结合的部分肽或部分三级结构结合，则可以判定第一抗体和第二抗体共享表位。此外，通过确认第二抗ALK2抗体对于第一抗ALK2抗体对ALK2的结合为竞争(即，第二抗体妨碍第一抗体与ALK2的结合)，即使未确定具体表位的序列或结构，也可以判定第一抗体和第二抗体共享表位。而且，第一抗体和第二抗体与共同的表位结合，并且第一抗体具有由ALK2介导的BMP信号的阻碍活性等活性时，可以期待第二抗体也具有相同的活性。
已知抗体分子的重链和轻链中各有3个互补决定区(CDR：ComplementarityDetermining Region)。互补决定区也称为超变结构域(hypervariable domain)，是位于抗体的重链和轻链可变区内，一级结构中变异性特别高的位点，独立地位于每条重链和轻链的多肽链的一级结构上的3处。本文中，对于抗体的互补决定区，从重链氨基酸序列的氨基末端侧起将重链的互补决定区表示为CDRH1、CDRH2、CDRH3，从轻链氨基酸序列的氨基末端侧起将轻链的互补决定区表示为CDRL1、CDRL2、CDRL3。这些位点在三级结构上彼此接近，决定对所结合的抗原的特异性。
本文中“在严格条件下进行杂交”是指能够在以下条件下或在与其相当的条件下进行杂交：在市售杂交溶液ExpressHyb Hybridization Solution(Clontech公司制)中，约50～70℃(例如68℃)进行杂交，或者使用将DNA固定的滤膜在约0.7～1.0M的NaCl存在下、在约50～70℃(例如68℃)进行杂交，然后使用约0.1～2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度SSC由150mM NaCl、15mM柠檬酸钠组成。此外，根据需要，该溶液中也可以含有约0.1％～0.5％SDS)，在约50～70℃(例如68℃)进行清洗而进行鉴定。
本文中“1个或数个”中的“数个”表示2～10个。优选为10个以下，更优选为5或6个以下，进一步更优选为2或3个。
本发明中，“交联能力”是指一个抗体或抗原结合片段与2分子的ALK2蛋白的各自胞外区结合并进行交联(即，crosslink)的能力。通常在BMP配体存在下，形成ALK2形成复合物并激活下游的SMAD1/5/8，但通过抗ALK2抗体诱导2分子的ALK2的交联，即使在配体不存在下也可能引起类复合物的形成。本发明人本次发现：当突变型人ALK2蛋白的330位氨基酸残基是脯氨酸时，以及根据情况，当突变型人ALK2蛋白无G328V突变时，与ALK2结合的抗ALK2抗体抑制(或阻碍)BMP信号转导，与此相对，当该330位的脯氨酸是丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸等另外的氨基酸残基时，BMP信号转导受到促进(或激活)。基于该发现，对突变型人ALK2蛋白的330位氨基酸残基是脯氨酸和根据情况突变型人ALK2蛋白上无G328V突变的患者进行鉴定并能够通过抗ALK2抗体进行有效的治疗。
促进BMP信号转导是指通过ALK2受体分子激活下游的细胞内信息传递系统。
本发明中，“患者”不仅是指患有疾病的人，还可以是指疑似患有疾病的人。
作为本发明中使用的“生物试样”，只要其能够检测ALK2是否存在突变，就没有特别限制，例如是血液样品或肿瘤样品。也可以是由这些试样得到的蛋白提取物或核酸提取物(例如mRNA提取物、由mRNA提取物制备的cDNA制备物或cRNA制备物等)。
2.ALK2
ALK2基因是编码在包括骨骼肌组织的软组织中诱导异位性骨形成的BMP受体的一种FOP致病基因。由家族性和孤立性FOP病例可发现伴随氨基酸置换的突变型ALK2。作为人ALK2的激活型突变，已知在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中有：L196P(196位亮氨酸被置换为脯氨酸的突变)、delP197_F198insL(也称为“PF197-8L”)(197位的脯氨酸和198位的苯丙氨酸缺失、插入亮氨酸的突变)、R202I(202位的精氨酸被置换为异亮氨酸的突变)、R206H(206位的精氨酸被置换为组氨酸的突变)、Q207E(207位的谷氨酰胺被置换为谷氨酸的突变)、R258S(258位的精氨酸被置换为丝氨酸的突变)、R258G(258位的精氨酸被置换为甘氨酸的突变)、G325A(325位的甘氨酸被置换为丙氨酸的突变)、G328E(328位的甘氨酸被置换为谷氨酸的突变)、G328R(328位的甘氨酸被置换为精氨酸的突变)、G328W(328位的甘氨酸被置换为色氨酸的突变)、G356D(356位的甘氨酸被置换为天冬氨酸的突变)、R375P(375位的精氨酸被置换为脯氨酸的突变)等。
另外，从DIPG病例也发现伴随氨基酸置换的突变型ALK2。作为人ALK2的激活型突变，已知在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中有：R206H、R258G、G328E、G328V(328位甘氨酸被置换为缬氨酸的突变)、G328W、G356D等。
本发明中使用的ALK2可通过在体外(in vitro)合成或利用基因操作在宿主细胞中产生而获得。具体地，将ALK2 cDNA导入能表达的载体中后，通过在含有转录和翻译所需要的酶、底物和能量物质的溶液中进行合成，或者转化其他原核生物或真核生物的宿主细胞以表达ALK2，由此可得到该蛋白。
本发明中使用的ALK2是来源于包括人及小鼠的哺乳动物的ALK2，例如人ALK2的氨基酸序列和核苷酸序列可通过参照GenBank登录号NM-001105来获得，氨基酸序列为SEQ IDNO:1、核苷酸序列为SEQ ID NO:2也在本文中公开。小鼠ALK2的氨基酸序列和核苷酸序列可通过参照GenBank登录号NP-001103674来获得，氨基酸序列为SEQ ID NO:3、核苷酸序列为SEQ ID NO:4也在本文中公开。而且，猴、大鼠和狗的ALK2的氨基酸序列可以分别通过参照GenBank登录号NM-001260761(SEQ ID NO:40)、NP_077812(SEQ ID NO:42)、XM_549615.5(SEQ ID NO:41)来获得。予以说明，ALK2有时也称为ACVR1(活化素AI型受体1，Activin Atype I Receptor 1)或ACTR1(活化素I型受体，Activin Receptor Type 1)，这些均表示完全相同的分子。
ALK2的cDNA，例如可以以表达ALK2 cDNA的cDNA文库为模板，对ALK2的cDNA使用特异性扩增的引物进行聚合酶链反应(下面称为“PCR”)(Saiki，R.K.，et al.，Science，(1988)239，487-49)，也就是利用PCR法来获得。
3.ALK2突变的检测
本发明中，“检测突变”原则上是指检测基因组DNA上的突变，但当该基因组DNA上的突变反映为转录产物中碱基的改变或翻译产物中氨基酸的改变时，也指包括检测这些转录产物或翻译产物中的所述改变(即，间接检测)。
本发明方法的优选方式是通过直接确定患者的ALK2基因区域的碱基序列来检测突变的方法。本发明中，“ALK2基因区域”是指在包含ALK2基因的基因组DNA上的一定区域。该区域中还包含ALK2基因的表达控制区域(例如，启动子区域、增强子区域)、ALK2基因的3’末端非翻译区域等。这些区域中的突变，例如会影响ALK2基因的转录活性。
在该方法中，首先从来源于患者的生物试样制备DNA试样。作为DNA试样，例如可举出：基因组DNA试样和从RNA由逆转录制备的cDNA试样。
作为从生物试样提取基因组DNA或RNA的方法，没有特别限制，可适当选择并使用公知的方法，例如，作为提取基因组DNA的方法，可举出使用SDS苯酚法(对保存在含尿素的溶液或乙醇中的组织用蛋白酶(proteinase K)、表面活性剂(SDS)和苯酚使该组织的蛋白发生变性，再用乙醇从该组织沉淀并提取DNA的方法)、Clean Columns(注册商标，NexTec公司制)、AquaPure(注册商标，Bio-Rad公司制)、ZR Plant/Seed DNA Kit(Zymo Research公司制)、AquaGenomicSolution(注册商标，Mo Bi Tec公司制)、prepGEM(注册商标，ZyGEM公司制)、BuccalQuick(注册商标，TrimGen公司制)的DNA提取方法等。此外，作为提取RNA的方法，例如可举出：使用苯酚和离液盐的提取方法(更具体地，使用Trizol(Invitrogen公司制)、ISOGEN(和光纯药株式会社制)等市售试剂盒的提取方法)，或使用其他市售试剂盒(RNAPrep总RNA提取试剂盒(Beckman Coulter公司制)、RNeasy Mini(QIAGEN公司制)、RNAExtraction Kit(Pharmacia Biotech公司制)等)的方法。进一步，作为从提取的RNA制备cDNA中使用的逆转录酶，没有特别限制，例如可举出：RAV(Rous associated virus，劳斯伴随病毒)、AMV(Avian myeloblastosis virus，禽成髓细胞瘤病毒)等来源于逆转录病毒的逆转录酶，MMLV(Moloney murine leukemia virus，莫洛尼鼠白血病病毒)等小鼠的来源于逆转录病毒的逆转录酶。
在这种方式中，接着，将包含ALK2基因区域突变位点的DNA进行分离，确定分离的DNA碱基序列。该DNA的分离例如可通过使用设计为在ALK2基因区域突变两侧的一对寡核苷酸引物，以基因组DNA或RNA为模板进行PCR等来进行。确定分离的DNA碱基序列可以使用例如Maxam-Gilbert法或Sanger法等本领域技术人员所公知的方法、利用下一代测序仪的方法等来进行。
通过将确定的DNA或cDNA碱基序列与对照(例如，来源于健康人生物试样的相应DNA或cDNA碱基序列)进行对比，可以确定患者的ALK2基因区域是否存在突变。
用于检测ALK2基因区域突变的方法除了可以直接确定DNA或cDNA碱基序列的方法之外，还可通过能够检测突变的各种方法来进行。
例如，本发明中突变的检测也可通过以下方法进行。首先，从生物试样制备DNA或cDNA试样。接着，制备具有与包含ALK2基因区域突变的碱基序列互补的碱基序列且用报告基因荧光染料和猝灭荧光染料标记的寡核苷酸探针。然后，在严格条件下使所述寡核苷酸探针与所述DNA试样杂交，进一步以所述寡核苷酸探针所杂交的所述DNA试样为模板，对包含ALK2基因区域所述突变的碱基序列进行扩增。然后，通过伴随所述扩增的寡核苷酸探针的分解，检测所述报告基因荧光染料发出的荧光(信号)，接着将检测到的所述荧光与对照进行对比。作为这种方法，例如可举出：双染料探针法、TaqMan(注册商标)探针法等。
进一步在另外的方法中，从生物试样制备DNA或cDNA试样。接着，在含有插入到DNA双链间就发出荧光的嵌入剂的反应体系中，以所述DNA试样为模板，对包含ALK2基因区域所述突变的碱基序列进行扩增。然后，改变所述反应体系的温度，检测所述嵌入剂发出的荧光强度的变化，并将伴随检测到的所述温度变化的所述荧光强度的变化与对照进行对比。作为这种方法，例如可举出：HRM(high resolution melting，高分辨率熔解曲线分析)法。
进一步在另外的方法中，首先，从生物试样制备DNA或cDNA试样。接着，对包含ALK2基因区域突变位点的DNA进行扩增。进一步，用限制性内切酶酶切扩增的DNA。接着，对DNA片段按照其大小进行分离。接着，将检测到的DNA片段的大小与对照进行对比。作为这种方法，例如可举出：利用限制性内切酶片段长度多态性(Restriction Fragment LengthPolymorphism/RFLP)的方法、PCR-RFLP法等。
进一步在另外的方法中，首先，从生物试样制备DNA或cDNA试样。接着，对包含ALK2基因区域突变位点的DNA进行扩增。进一步，将扩增的DNA解离成单链DNA。接着，在非变性凝胶上分离解离的单链DNA。将分离的单链DNA在凝胶上的迁移率与对照进行对比。作为这种方法，例如可举出：PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism，单链构象多态性)法等。
进一步在另外的方法中，首先，从生物试样制备DNA或cDNA试样。接着，对包含ALK2基因区域突变位点的DNA进行扩增。进一步，将扩增的DNA在DNA变性剂的浓度逐步增高的凝胶上进行分离。接着，将分离的DNA在凝胶上的迁移率与对照进行对比。作为这种方法，例如可举出：变性梯度凝胶电泳(denaturant gradient gel electrophoresis：DGGE)法等。
作为进一步另外的方法，有使用基板的方法，所述基板固定有从生物试样制备的包含ALK2基因区域突变位点的DNA和在严格条件下与该DNA进行杂交的寡核苷酸探针。作为这种方法，例如可举出：DNA阵列法等。
进一步在另外的方法中，首先，从生物试样制备DNA或cDNA试样。此外，制备“具有与距ALK2基因区域突变位点碱基1个碱基的3’侧碱基和与该3’侧碱基的3’侧碱基序列互补的碱基序列的寡核苷酸引物”。接着，以该DNA为模板并使用该引物，进行ddNTP引物延伸反应。接着，引物延伸反应产物放到质谱仪，进行质量测定。接着，由质量测定结果确定基因型。接着，将确定的基因型与对照进行对比。作为这种方法，例如可举出：MALDI-TOF/MS法等。
进一步在另外的方法中，首先，从生物试样制备DNA或cDNA试样。接着，制备包含5’-“与ALK2基因区域突变位点的碱基和该碱基的5’侧碱基序列互补的碱基序列”-“不与距ALK2基因区域突变位点1个碱基的3’侧碱基和该3’侧碱基的3’侧碱基序列杂交的碱基序列”-3’(flap)的寡核苷酸探针。此外，制备“具有与ALK2基因区域突变位点的碱基和与该碱基的3’侧碱基序列互补的碱基序列的寡核苷酸探针”。接着，使上述2种寡核苷酸探针与制备的DNA进行杂交。接着，用单链DNA酶切酶酶切杂交的DNA，使flap游离。作为单链DNA酶切酶，没有特别限制，例如可举出裂解酶(cleavase)。本方法中，接着使具有与flap互补的序列且标记有报告基因荧光和猝灭荧光的寡核苷酸探针与flap进行杂交。接着，测定产生的荧光强度。接着，将测定的荧光强度与对照进行对比。作为这种方法，例如可举出Invader法等。
进一步在另外的方法中，首先，从生物试样制备DNA或cDNA试样。接着，对包含ALK2基因区域突变位点的DNA进行扩增。然后，使扩增的DNA解离为单链，在解离的单链DNA中，仅分离其中的一条链。接着，从ALK2基因区域突变位点碱基的附近起进行每1个碱基的延伸反应，使这时产生的焦磷酸以酶促发光，测定发光强度。然后，将测定的荧光强度与对照进行对比。作为这种方法，例如可举出焦磷酸测序法等。
进一步在另外的方法中，首先，从生物试样制备DNA或cDNA试样。接着，对包含ALK2基因区域突变位点的DNA进行扩增。接着，制备“具有与距ALK2基因区域突变位点碱基1个碱基的3’侧碱基和该3’侧碱基的3’侧碱基序列互补的碱基序列的寡核苷酸引物”。接着，在荧光标记的核苷酸存在下，以扩增的DNA为模板并使用制备的引物进行单碱基延伸反应。然后，测定荧光偏振度。接着，将测定的荧光偏振度与对照进行对比。作为这种方法，例如可举出AcycloPrime法等。
进一步在另外的方法中，首先，从生物试样制备DNA或cDNA试样。接着，对包含ALK2基因区域突变位点的DNA进行扩增。接着，制备“具有与距ALK2基因区域突变位点碱基1个碱基的3’侧碱基和该3’侧碱基的3’侧碱基序列互补的碱基序列的寡核苷酸引物”。接着，在荧光标记的核苷酸存在下，以扩增的DNA为模板并使用制备的引物，进行单碱基延伸反应。接着，判定单碱基延伸反应中所使用的碱基种类。接着，将判定的碱基种类与对照进行对比。作为这种方法，例如可举出SnuPE(单核苷酸引物延伸)法等。
予以说明，从生物试样制备的试样可以是蛋白质。这种情况下，对于检测突变可以利用如下方法等，所述方法使用与因该突变引起氨基酸改变的位点特异性结合的分子(例如，抗体)。
4.异位骨化和/或脑肿瘤的检测
由ALK2介导的BMP信号转导可引发异位骨化和/或脑肿瘤。
“异位骨化”是指在本来不是骨的部位形成骨。“异位骨化”可举出进行性骨化性纤维发育不良(FOP)、进行性骨发育异常(POH)等，只要是通过由具有激活型突变的ALK2介导的BMP信号转导引发的异位骨化，就不限定于这些。
“脑肿瘤”是指在颅内组织中发生的肿瘤。“脑肿瘤”可举出：扩散型内因性脑桥神经胶质瘤(DIPG)、脑干神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤(GBM)、非胶质母细胞瘤脑肿瘤、脑膜瘤、中枢神经系统淋巴瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、未分化星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、少突星形细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤等，但只要是通过由具有激活型突变的ALK2介导的BMP信号转导引发的脑肿瘤，就不限定于这些。
ALK2是结合BMP的跨膜型丝氨酸-苏氨酸激酶受体，在N末端侧胞外区结合BMP，并通过细胞内的丝氨酸-苏氨酸激酶激活下游的细胞内信息传递系统。骨形成蛋白(BMP)是属于转化生长因子β(TGF-β)超家族的多功能生长因子，已鉴定有约20种BMP家族成员。已确定BMP在包含骨骼肌组织的软组织中诱导异位性骨形成，因此认为BMP与促进异常骨形成的疾病有关。与ALK2相比，认为BMP-2、BMP-4与ALK3亲和性更高。由于ALK3与ALK2相比广泛存在地表达，因此认为在各种部位诱导异位骨化的实验中一般常用BMP-2及BMP-4。另一方面，认为BMP-7对ALK2的亲和性较高，此外BMP-9一般对ALK1的亲和性较高，但已知对ALK2也具有较高的亲和性。FOP中由于引起由ALK2介导的异位骨化，因此认为由BMP-7和BMP-9激活由ALK2介导的信号而对异位性骨诱导进行药效验证，由此能够确认对FOP有无治疗和/或预防效果。
在BMP存在下培养成肌细胞(C2C12细胞)时，通过对BMP特异性的细胞内信号转导系统而抑制向成熟肌细胞分化，取而代之诱导为向成骨细胞分化。因此，通过用C2C12细胞的由BMP向成骨细胞的分化诱导模型，能够分析由ALK2介导的BMP信号转导。
5.抗ALK2抗体的制造
本发明中使用的对ALK2的抗体可以按照公知的方法(例如，Kohler andMilstein，Nature(1975)256，p.495-497、Kennet，R.ed.，Monoclonal Antibodies，p.365-367，Plenum Press，N.Y.(1980))获得。即，可通过将产生针对ALK2的抗体的抗体生成细胞与骨髓瘤细胞融合以建立杂交瘤，从而获得单克隆抗体。通过试验获得的抗体与ALK2的结合性和交联能力，从而能够筛选可适用于人疾病的抗体。
予以说明，本文中赋予抗体特征的CDR/FR中所分配的氨基酸位置按照KABAT编号(KABAT et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.PublicHealth Service National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))进行分配。
本发明中使用的抗体中不仅包括针对上述ALK2的单克隆抗体，还包括例如同样具有治疗/预防效果的多克隆抗体、以降低针对人的异种抗原性等为目的而进行人工修饰的基因重组型抗体，例如包括嵌合(Chimeric)抗体、人源化(Humanized)抗体、人抗体等。这些抗体可使用已知的方法制造。
作为嵌合抗体，可举出抗体的可变区和恒定区(Fc)各自为异种的抗体、例如将来源于小鼠或大鼠抗体的可变区连接到来源于人的恒定区的嵌合抗体(参照Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81，6851-6855(1984))。
作为人源化抗体，可举出仅将CDR整合到来源于人的抗体中的抗体(参照Nature(1986)321，p.522-525)或通过CDR移植法将除了CDR序列之外还将一部分构架的氨基酸残基也移植到人抗体中的抗体(国际公布第WO90/07861号)。
作为可用于本发明中的抗ALK2抗体的例子，包括但不限于以下，例如可举出含有以下重链可变区序列和轻链可变区序列的抗ALK2抗体。
一种抗ALK2抗体，所述抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的重链序列含有具有CDRH1、CDRH2、CDRH3的可变区，所述CDRH1、CDRH2和CDRH3各自包含下列所示的氨基酸序列：
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7；
SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13；
SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20；或者，
SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26；以及，
轻链序列含有具有CDRL1、CDRL2、CDRL3的可变区，所述CDRL1、CDRL2和CDRL3各自包含下列所示的氨基酸序列：
SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；
SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:10；
SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；
SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23；或者，
SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29；
或者，与所述抗ALK2抗体竞争对所述ALK2的结合，且具有交联所述ALK2的性质和抑制BMP信号转导的性质的抗体。
或者，一种抗ALK2抗体，所述抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的重链可变区序列是下列序列：
a1)包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列中20位～142位氨基酸残基的氨基酸序列；
a2)包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列中20位～142位氨基酸残基的氨基酸序列；
a3)包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列中20位～140位氨基酸残基的氨基酸序列；
a4)包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列中20位～140位氨基酸残基的氨基酸序列；
a5)包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列中20位～140位氨基酸残基的氨基酸序列；
a6)包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列中20位～140位氨基酸残基的氨基酸序列；
a7)与选自所述a1)～a6)的氨基酸序列中任一个的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；
a8)与选自所述a1)～a6)的氨基酸序列中任一个的氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列；或者，
a9)选自所述a1)～a6)的氨基酸序列中任一个的氨基酸序列中1个或数个氨基酸残基被置换、缺失或添加的氨基酸序列；
以及，轻链可变区序列是下列序列：
b1)包含所述SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列中21位～133位氨基酸残基的氨基酸序列；
b2)包含所述SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列中21位～129位氨基酸残基的氨基酸序列；
b3)包含所述SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列中21位～129位氨基酸残基的氨基酸序列；
b4)与选自所述b1)～b3)的氨基酸序列中任一个的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；
b5)与选自所述b1)～b3)的氨基酸序列中任一个的氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列；或者，
b6)选自所述b1)～b3)的氨基酸序列中任一个的氨基酸序列中1个或数个氨基酸残基被置换、缺失或添加的氨基酸序列；
或者，与所述抗ALK2抗体竞争对所述ALK2的结合，且具有交联所述ALK2的性质和抑制BMP信号转导的性质的抗体。
更具体地，作为可以在本发明中使用的抗ALK2抗体的例子，可举出本发明人在WO2016/121908中公开的抗ALK2抗体。
作为大鼠抗ALK2抗体的例子，可举出在WO2016/121908的实施例1中所述的A2-11E、A2-15A、A2-25C、A2-27D。
作为人嵌合化抗ALK2抗体的例子，可举出在WO2016/121908的实施例5中所述的cA2-15A、cA2-27D。
作为来源于A2-15A抗体的人源化抗体，只要含有A2-15A的6种全部的CDR序列，且具有对ALK2的结合性和交联能力，就包括在本发明中使用的抗体中。予以说明，A2-15A抗体的重链可变区含有：包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的CDRH1(GFTFSHYYMA)、包含SEQID NO:6所示的氨基酸序列的CDRH2(SITNSGGSINYRDSVKG)和包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的CDRH3(EGGENYGGYPPFAY)。此外，A2-15A抗体的轻链可变区含有：包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的CDRL1(RANQGVSLSRYNLMH)、包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的CDRL2(RSSNLAS)和包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的CDRL3(QQSRESPFT)。此外，还包含与所述A2-15A竞争对所述ALK2的结合，且具有交联所述ALK2的性质和抑制BMP信号转导的性质的抗体。
作为来源于A2-27D抗体的人源化抗体，只要含有A2-27D的6种全部的CDR序列，且具有对ALK2的结合性和交联能力，就包括在本发明中使用的抗体中。予以说明，A2-27D抗体的重链可变区含有：包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的CDRH1(GSTFSNYGMK)、包含SEQID NO:12所示的氨基酸序列的CDRH2(SISRSSTYIYYADTVKG)和包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的CDRH3(AISTPFYWYFDF)。此外，A2-27D抗体的轻链可变区含有：包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的CDRL1(LASSSVSYMT)、包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列的CDRL2(GTSNLAS)和包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列的CDRL3(LHLTSYPPYT)。此外，还包含与所述A2-27D竞争对所述ALK2的结合，且具有交联所述ALK2的性质和抑制BMP信号转导的性质的抗体。
作为来源于A2-11E抗体的人源化抗体，只要含有A2-11E的6种全部的CDR序列，且具有对ALK2的结合性和交联能力，就包括在本发明中使用的抗体中。予以说明，A2-11E抗体的重链可变区含有：包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的CDRH1(GFTFSNYYMY)、包含SEQID NO:19所示的氨基酸序列的CDRH2(SINTDGGSTYYPDSVKG)和包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的CDRH3(STPNIPLAY)。此外，A2-11E抗体的轻链可变区含有：包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列的CDRL1(KASQNIYKYLN)、包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列的CDRL2(YSNSLQT)和包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列的CDRL3(FQYSSGPT)。此外，还包含与所述A2-11E竞争对所述ALK2的结合，且具有交联所述ALK2的性质和抑制BMP信号转导的性质的抗体。
作为来源于A2-25C抗体的人源化抗体，只要含有A2-25C的6种全部的CDR序列，且具有对ALK2的结合性和交联能力，就包括在本发明中使用的抗体中。予以说明，A2-25C抗体的重链可变区含有：包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的CDRH1(GFTFSYYAMS)、包含SEQID NO:25所示的氨基酸序列的CDRH2(SISRGGDNTYYRDTVKG)和包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的CDRH3(LNYNNYFDY)。此外，A2-25C抗体的轻链可变区含有：包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的CDRL1(QASQDIGNWLS)、包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的CDRL2(GATSLAD)和包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的CDRL3(LQAYSAPFT)。此外，还包含与所述A2-25C竞争对所述ALK2的结合，且具有交联所述ALK2的性质和抑制BMP信号转导的性质的抗体。
另外，进一步各CDR中1～3个氨基酸残基被置换为其他氨基酸残基的CDR修饰的人源化抗体也只要具有对ALK2的结合性和交联能力，就包括在本发明中使用的抗体中。作为CDRL2中的氨基酸置换例，可举出在SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列(人源化hA2-15A-L4)中，置换1个氨基酸的CDRL2。优选包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列的CDRL2(RSSNLAQ)。
作为来源于A2-15A抗体的人源化抗体的实例，可举出包含下列重链和轻链的抗体：含有包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列(人源化hA2-15A-H4)中20～142位氨基酸残基的重链可变区序列的重链和含有包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列(人源化hA2-15A-L6)中21～133位氨基酸残基的轻链可变区序列的轻链，或者含有包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列(人源化hA2-15A-H4 IgG2)中20～142位氨基酸残基的重链可变区序列的重链和含有包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列中21～133位氨基酸残基的轻链可变区序列的轻链；或者是与所述A2-15A抗体中的任一种竞争对所述ALK2的结合，且具有交联所述ALK2的性质和抑制BMP信号转导的性质的抗体。
作为优选的组合，可举出包含下列重链和轻链的抗体：含有包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列中20～472位氨基酸残基的氨基酸序列的重链和含有包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列中21～238位氨基酸残基的氨基酸序列的轻链，或者含有包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列中20～468位氨基酸残基的氨基酸序列的重链和含有包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列中21～238位氨基酸残基的氨基酸序列的轻链；或者是与所述抗体中的任一种竞争对所述ALK2的结合，且具有交联所述ALK2的性质和抑制BMP信号转导的性质的抗体。
作为来源于A2-27D抗体的人源化抗体的实例，可举出包含下列重链和轻链的抗体：含有包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列(人源化hA2-27D-H2)中20～140位氨基酸残基的重链可变区序列的重链和含有包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列(人源化hA2-27D-L2)中21～129位氨基酸残基的轻链可变区序列的轻链、含有包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列(人源化hA2-27D-H3)中20～140位氨基酸残基的重链可变区序列的重链和含有包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列(人源化hA2-27D-L4)中21～129位氨基酸残基的轻链可变区序列的轻链、含有包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列(人源化hA2-27D-H2-LALA)中20～140位氨基酸残基的重链可变区序列的重链和含有包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列中21～129位氨基酸残基的轻链可变区序列的轻链，或者含有包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列(人源化hA2-27D-H3-LALA)中20～140位氨基酸残基的重链可变区序列的重链和含有包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列中21～129位氨基酸残基的轻链可变区序列的轻链；或者是与所述抗体中的任一种竞争对所述ALK2的结合，且具有交联所述ALK2的性质和抑制BMP信号转导的性质的抗体。
作为优选的组合，可举出包含下列重链和轻链的抗体：含有包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列中20～470位氨基酸残基的氨基酸序列的重链和含有包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列中21～234位氨基酸残基的氨基酸序列的轻链、含有包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列中20～470位氨基酸残基的氨基酸序列的重链和含有包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列中21～234位氨基酸残基的氨基酸序列的轻链、含有包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列中20～470位氨基酸残基的氨基酸序列的重链和含有包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列中21～234位氨基酸残基的氨基酸序列的轻链，或者含有包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列中20～470位氨基酸残基的氨基酸序列的重链和含有包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列中21～234位氨基酸残基的氨基酸序列的轻链；或者是与所述抗体中的任一种竞争对所述ALK2的结合，且具有交联所述ALK2的性质和抑制BMP信号转导的性质的抗体。
作为本发明中使用的抗体，还可举出人抗体。抗ALK2人抗体是指仅具有来源于人染色体的抗体基因序列的人抗体。抗ALK2人抗体可以使用具有包含人抗体的重链和轻链基因的人染色体片段的人抗体产生小鼠的方法(参照Tomizuka，K.et al.，Nature Genetics(1997)16，p.133-143，；Kuroiwa，Y.et.al.，Nucl.Acids Res.(1998)26，p.3447-3448；Yoshida，H.et.al.，Animal Cell Technology：Basic and Applied Aspects vol.10，p.69-73(Kitagawa，Y.，Matsuda，T.and Iijima，S.eds.)，Kluwer Academic Publishers，1999.；Tomizuka，K.et.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97，p.722-727等)来获得。
这种产生人抗体的小鼠具体地可通过如下方式制作：内源性免疫球蛋白重链和轻链基因座被破坏，取而代之通过人类人工染色体(Human Artificial Chromosome，HAC)载体或小鼠人工染色体(Mouse Artificial Chromosome，MAC)载体等载体导入人免疫球蛋白重链和轻链基因座而成的基因重组动物，从而制作基因敲除动物和转基因动物，以及使这些动物相互交配而制作。
另外，利用基因重组技术，通过分别编码上述人抗体重链和轻链的cDNA，优选通过含有该cDNA的载体来转化真核细胞，培养产生基因重组人单克隆抗体的转化细胞，由此也能够从培养上清中得到该抗体。这里，作为宿主，例如可使用真核细胞，优选使用CHO细胞、淋巴细胞或骨髓瘤等哺乳动物细胞。
另外，已知获得抗体的方法还有从人抗体文库筛选出来源于噬菌体展示的人抗体(参照Wormstone,I.M.et.al,Investigative Ophthalmology&Visual Science.(2002)43(7),p.2301-2308；Carmen,S.et.al.，Briefings in Functional Genomics andProteomics(2002)，1(2)，p.189-203；Siriwardena,D.et.al.，Ophthalmology(2002)109(3)，p.427-431等)。
例如，可以使用噬菌体展示法(Nature Biotechnology(2005)，23，(9)，p.1105-1116)，其在噬菌体表面表达人抗体的可变区作为单链抗体(scFv)，并选择与抗原结合的噬菌体。通过分析与抗原结合而被选择的噬菌体基因，可以确定编码与抗原结合的人抗体可变区的DNA序列。如果明确与抗原结合的scFv的DNA序列，则通过制作具有该序列的表达载体，并导入适当的宿主中表达，由此获得人抗体(WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388、Annu.Rev.Immunol(1994)12，p.433-455、Nature Biotechnology(2005)23(9)，p.1105-1116)。
作为可在本发明中使用的抗ALK2抗体，还包含与WO2016/121908中公开的抗ALK2抗体具有相同表位的抗体。例如可举出与A2-11E抗体、A2-15A抗体、A2-25C抗体和/或A2-27D抗体具有相同表位的抗体。
当抗体与抗原的部分高阶结构结合或识别时，该抗体的表位可通过如下确定：利用X射线结构分析来鉴定与该抗体相邻的抗原上的氨基酸残基来确定。例如，使抗体或其片段和抗原或其片段结合并结晶，再进行结构分析，由此可以对与抗体具有相互作用距离的抗原上的氨基酸残基进行鉴定。相互作用距离为8埃
Figure BDA0002651344820000301
以下，优选为6埃以下，更优选为4埃以下。具有这种与抗体相互作用的距离的1个或1个以上的氨基酸残基可构成抗体的表位(抗原结合位点)。当该氨基酸残基为2个以上时，各氨基酸在一级序列上也可以彼此不相邻。
与上述ALK2蛋白的表位结合的抗体或其抗原结合片段的例子如下所述。
抗ALK2抗体或其抗原结合片段可与包含人ALK2的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中21位～123位氨基酸残基的多肽特异性结合。
A2-27D抗体识别人ALK2上的部分高阶结构。在人ALK2的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中，与A2-27D抗体具有相互作用距离的氨基酸残基，即表位由以下各残基构成：38位谷氨酸(Glu)，39位甘氨酸(Gly)，59位异亮氨酸(Ile)，60位天冬酰胺(Asn)，61位天冬氨酸(Asp)，62位甘氨酸(Gly)，63位苯丙氨酸(Phe)，64位组氨酸(His)，65位缬氨酸(Val)，66位酪氨酸(Tyr)，102位天冬酰胺(Asn)，104位苏氨酸(Thr)，106位谷氨酰胺(Gln)，107位亮氨酸(Leu)的各残基。与该表位结合或与该氨基酸残基具有相互作用距离的抗体、其抗原结合片段或其修饰体也包括在本发明中使用的抗体中。
A2-25C抗体识别人ALK2上的部分高阶结构。在人ALK2的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中，与A2-25C抗体具有相互作用距离的氨基酸残基，即表位由以下各残基构成：38位谷氨酸(Glu)，39位甘氨酸(Gly)，40位亮氨酸(Leu)，59位异亮氨酸(Ile)，60位天冬酰胺(Asn)，61位天冬氨酸(Asp)，62位甘氨酸(Gly)，63位苯丙氨酸(Phe)，64位组氨酸(His)，65位缬氨酸(Val)，66位酪氨酸(Tyr)，104位苏氨酸(Thr)的各残基。与该表位结合或与该氨基酸残基具有相互作用距离的抗体、其抗原结合片段或其修饰体也包括在本发明中使用的抗体中。
或者，抗ALK2抗体或其抗原结合片段也可以是与上述抗ALK2抗体或其抗原结合片段(例如，A2-27D抗体、A2-25C抗体等)竞争对ALK2的结合的抗体或其抗原结合片段。
上述抗体可通过WO2016/121908的实施例2、实施例6、实施例9或实施例10所示的方法等评价对抗原的结合性，挑选出适合的抗体。抗体的解离常数(KD)，例如为1×10-6～1×10-12M或该范围以下，只要得到目的的治疗或预防效果，则不限定于此范围。抗体与抗原(ALK2)的解离常数可使用检测原理为表面等离子体共振(SPR)的Biacore T200(GEHealthcare Bioscience公司)进行测定。例如，对于作为配体固定的抗原，可通过使设定为适当浓度的抗体与分析物反应，测定其结合和解离，得到结合速率常数ka1、解离速率常数kd1和解离常数(KD；KD＝kd1/ka1)。对ALK2的结合性评价并不限定于使用Biacore T200，也可以利用检测原理为表面等离子体共振(SPR)的仪器、检测原理为结合平衡排除法(KineticExclusion Assay)的KinExA(Sapidyne Instruments公司)、检测原理为生物膜层干涉法(Bio-Layer Interferometry)的BLItz系统(Pall公司)或ELISA(Enzyme-linkedImmunoSorbent Assay，酶联免疫吸附试验)法等。
上述抗体例如可通过如后述的实施例4所示的方法等评价对抗原的交联能力，挑选出适合的抗体。即，可利用Nanoluc Binary技术：NanoBiT(Promega社)，在体外(invitro)细胞内表达ALK2与LgBiT或SmBiT的融合体，通过由LgBiT和SmBiT结构互补性所致的发光检测由抗体所致的ALK2蛋白的相互作用。
作为比较抗体性质时另外的指标的一例，可举出抗体稳定性。差示扫描量热法(DSC)是能够快速且准确地测量热变性中点温度(Tm)的方法，Tm是蛋白相对构象稳定性的有利指标。通过利用DSC测定Tm值并比较其值，从而比较热稳定性的差异。已知抗体的保存稳定性显示为与抗体的热稳定性有一定相关(Lori Burton，et.al.，PharmaceuticalDevelopment and Technology(2007)12，p.265-273)，可通过以热稳定性为指标，挑选适合的抗体。作为用于挑选抗体的其他指标，可举出在适当宿主细胞中产量高和在水溶液中的凝集性低。例如由于产量最高的抗体不一定显示最高的热稳定性，因此需要根据以上所述指标进行综合判断，以挑选出最适合对人用药的抗体。
另外，也已知有使用适当接头连接抗体的全长重链和轻链序列而获得单链免疫球蛋白(single chain immunoglobulin)的方法(Lee，H-S，et.al.，Molecular Immunology(1999)36，p.61-71；Shirrmann，T.et.al.，mAbs(2010)。这种单链免疫球蛋白通过二聚化，可以具有与本来的四聚体的抗体相似的结构与活性。此外，本发明中使用的抗体也可以为具有单一重链可变区但不具有轻链序列的抗体。这种抗体称为单一结构域抗体(singledomain antibody：sdAb)或纳米抗体(nanobody)或骆驼科抗体(重链抗体)，实际上报告有在骆驼或羊驼中被观察到，且具有抗原结合能力(Muyldemans S.et.al.，Protein Eng.(1994)7(9)，1129-35，Hamers-Casterman C.et.al.，Nature(1993)363(6428)446-8)。上述抗体也可以解释为本发明抗体的抗原结合片段中的一种。
另外，本发明中使用的抗体通过调控所结合的糖链修饰，可以增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒活性。作为抗体糖链修饰调控技术，已知有WO99/54342、WO2000/61739、WO2002/31140等，但并不限定于这些。
在先分离抗体基因之后再导入适当的宿主来制作抗体的情况时，可使用适当的宿主与表达载体的组合。
作为抗体基因的具体例，可举出WO2016/121908中所述的编码抗体重链序列的基因(或多核苷酸)、编码轻链序列的基因(或多核苷酸)，或者这些基因(或多核苷酸)的组合。
当转化宿主细胞时，重链序列基因(或多核苷酸)和轻链序列基因(或多核苷酸)可以插入到同一表达载体中，此外也可以插入到不同的表达载体中。在使用真核细胞作为宿主的情况下，可以使用动物细胞、植物细胞、真核微生物。作为动物细胞，可举出哺乳类细胞，例如，猴细胞的COS细胞(Gluzman，Y.Cell(1981)23，p.175-182、ATCC CRL-1650)、小鼠成纤维细胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞，ATCC CCL-61)的二氢叶酸还原酶-缺陷型细胞株(Urlaub，G.and Chasin，L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77，p.4126-4220)。此外，在使用原核细胞的情况时，例如可举出大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。通过向这些细胞转化目的抗体基因而导入在体外(invitro)培养转化的细胞，由此可得到抗体。在上述培养法中有时产量因抗体的序列而不同，可以以产量为指标在具有同等结合性的抗体中筛选容易作为药物生产的抗体。
作为本发明中使用的抗体的同种型，只要对ALK2有交联能力即可，例如可举出：IgG(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)、IgM、IgA(IgA1，IgA2)、IgD或者IgE等，可举出优选为IgG或IgM，进一步优选为IgG1、IgG2或IgG4。
在使用IgG1作为本发明中使用的抗体的同种型的情况下，可通过置换恒定区的一部分氨基酸残基来调控效应子功能(参照WO88/07089、WO94/28027、WO94/29351)。作为IgG1的突变体，可举出IgG1 LALA(IgG1-L234A，L235A)、IgG1 LAGA(IgG1-L235A，G237A)等，优选为IgG1LALA。
在使用IgG4作为本发明中使用的抗体的同种型的情况下，通过置换恒定区的一部分氨基酸残基，可抑制IgG4特有的分解，延长半衰期(参照Molecular Immunology，30，1105-108(1993))。作为IgG4突变体，可举出IgG4 pro(IgG4-S241P)等。
另外，本发明中使用的抗体也可以是具有抗体的抗原结合位点的抗体的抗原结合片段或其修饰体。可通过用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白酶处理抗体，或者利用基因工程学方法修饰抗体基因并在适当的培养细胞中表达，由此得到该抗体的片段。在这些抗体片段中，可以将保持有全长抗体分子所具有的全部或一部分功能的片段称为抗体的抗原结合片段。作为抗体的功能，可举出通常的抗原结合性、阻碍抗原活性的活性、增强抗原活性的活性、抗体依赖性细胞介导的细胞毒活性、补体依赖性细胞毒活性和补体依赖性细胞的细胞毒活性。本发明中抗体的抗原结合片段所保持的功能是对ALK2的结合性和交联能力。对ALK2的结合性是指抗体或抗原结合片段与ALK2分子(优选为特异性)结合的性质，优选为阻碍ALK2活性的活性，更优选抑制由ALK2介导的BMP信号转导的活性，最优选为抑制、减轻或者消退异位骨化和/或脑肿瘤的活性。
例如，作为抗体的片段，可举出F(ab’)2等。
本发明中使用的抗体也可以进行多聚化以提高对抗原的亲和性。作为多聚化的抗体，可以是1种抗体，也可以是识别同一抗原多个表位的多个抗体。作为对抗体进行多聚化的方法，可举出IgG CH3结构域结合2个scFv、结合链霉亲和素、导入螺旋-转角-螺旋基序等。
本发明中使用的抗体可以是氨基酸序列不同的多种抗ALK2抗体混合物的多克隆抗体。作为多克隆抗体的一例，可举出CDR不同的多种抗体的混合物。作为这种克隆抗体，可使用对产生不同抗体的细胞混合物进行培养并从该培养物中纯化的抗体(参照WO2004/061104)。
本发明中使用的抗体可以是与上述抗体的重链和/或轻链相比具有80％～99％同一性的抗体。其中“同一性”的术语，具有本领域中使用的一般定义。同一性％是指将2个氨基酸序列进行比对(Alignment)使氨基酸一致性为最大时，总氨基酸数(包括帽)中相同氨基酸数的百分比。通过组合与上述重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列显示为高同一性的序列，可以选择具有与上述各抗体具有同等抗原结合能力、BMP信号转导抑制作用和交联能力的抗体。这样的同一性，一般为80％以上或85％以上的同一性，优选为90％以上、91％以上、92％以上、93％以上或94％以上的同一性，更优选为95％以上96％以上、97％以上或98％以上的同一性，最优选为99％以上的同一性。此外，通过组合在重链和/或轻链的氨基酸序列中1个或数个氨基酸残基被置换、缺失和/或添加的氨基酸序列，也可以选择与上述各抗体具有同等的各种作用的抗体。被置换、缺失和/或添加的氨基酸残基数，一般为10个氨基酸残基以下，优选为5～6个氨基酸残基以下，更优选为2～3个氨基酸残基以下，最优选为1个氨基酸残基。
予以说明，已知哺乳类培养细胞中生产的抗体的重链羧基末端的赖氨酸残基缺失(Journal of Chromatography A，705：129-134(1995))，此外已知相同重链羧基末端的甘氨酸、赖氨酸的2个氨基酸残基缺失，位于羧基末端的脯氨酸残基被重新酰胺化(Analytical Biochemistry，360：75-83(2007))。
而且，已知在制作抗体时，在抗体重链或轻链氨基末端的谷氨酰胺或谷氨酸残基被焦谷氨酰化修饰，本发明中使用的抗体也可以具有这样的修饰(WO2013/147153)。
但是，这些重链序列的缺失，或者重链或轻链序列的修饰并不影响抗体的抗原结合能力和效应子功能(补体的激活、抗体依赖性细胞毒作用等)。
因此，本发明中使用的抗体中也包括经该缺失或修饰的抗体，可举出在重链羧基末端缺失有1或2个氨基酸的缺失体和酰胺化的该缺失体(例如，羧基末端位点的脯氨酸残基经酰胺化的重链)、重链或轻链的N末端氨基酸残基经焦谷氨酰化的抗体等。条件是，只要保持有抗原结合能力和效应子功能，本发明中使用的抗体重链的羧基末端缺失体并不限定于上述各类。构成本发明中使用的抗体的2个重链可以是全长和选自于上述缺失体的重链中的任意一种，也可以是组合其中的任意两种。然而，各缺失体的相对量可受到产生本发明中使用的抗体的哺乳类培养细胞种类和培养条件的影响，可举出作为抗体的主要成分，在2个重链两者的羧基末端缺失1个氨基酸残基的情况。
两种氨基酸序列间的同一性可通过使用Blast算法2.2.2版(Altschul，StephenF.，Thomas L.Madden，Alejandro A.Schaffer，Jinghui Zhang，Zheng Zhang，WebbMiller，and David J.Lipman(1997)，“Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generationof protein database search programs”，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)的默认参数来进行确定。Blast算法也可通过在互联网访问www.ncbi.nlm.nih.gov/blast使用。予以说明，通过上述Blast算法，可计算Identity(或Identities，同一性)和Positivity(或Positivities，阳性)的2种百分比值。前者是在应计算同一性的两种氨基酸序列间在氨基酸残基一致时的值，后者是同时考虑化学结构相似的氨基酸残基的数值。本文中将在氨基酸残基一致时具有的Identity(同一性)的值作为同一性的值。
作为抗体的修饰体，可使用与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合的抗体。
本发明的抗体也可以是进一步与其他制剂形成缀合物(Immunoconjugate，免疫缀合物)的抗体。作为这种抗体的例子，可举出该抗体与放射性物质或具有药理作用的化合物结合而成的抗体(Nature Biotechnology(2005)23，p.1137-1146)。
得到的抗体可纯化至均一。抗体的分离、纯化可使用通常蛋白所用的分离、纯化方法即可。例如如果适当地选择及组合柱色谱、滤膜过滤、超滤、盐析、透析、制备用聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳等，则可分离纯化抗体(Strategies for Protein Purificationand Characterization：A Laboratory Course Manual，Daniel R.Marshak et al.eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual.EdHarlow and David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但并不限定于这些。
作为色谱法，可举出亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水色谱法、凝胶过滤色谱法、反相色谱法、吸附色谱法等。
这样的色谱法可使用HPLC或FPLC等液相色谱法进行。
作为亲和色谱中使用的柱子，可举出Protein A柱、Protein G柱。
例如作为使用Protein A柱的柱子，可举出Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(GEHealthcare公司)等。
另外也可以使用固定化有抗原的载体，利用对抗原的结合性来纯化抗体。
本发明中显示抗ALK2抗体与ALK2的结合亲和性的KD值，优选为10-6M以下，例如10- 7M以下、10-8M以下、10-9M以下、10-10M以下、10-11M以下、10-12M以下等。
6.异位骨化和/或脑肿瘤的治疗方法和用于该方法的药物组合物
本发明提供一种由ALK2的激活型突变引起的疾病的治疗和/或预防方法，其包括使用来源于患者的生物试样，检测该生物试样中的ALK2是否存在激活型突变，向具有ALK2的激活型突变且330位氨基酸残基(人ALK2序列时为脯氨酸残基)无突变的患者给予抗ALK2抗体。作为由ALK2的激活型突变引起的疾病，例如可举出：进行性骨化性纤维发育不良(FOP)、进行性骨发育异常(POH)、外伤性异位骨化、人工关节置换术后的异位骨化、扩散型内因性脑桥神经胶质瘤(DIPG)、脊椎关节炎(SpA)、强直性脊椎炎(AS)、贫血、头发稀疏等，优选为进行性骨化性纤维发育不良(FOP)、进行性骨发育异常(POH)、外伤性异位骨化或人工关节置换术后的异位骨化，优选为进行性骨化性纤维发育不良(FOP)，只要是由ALK2的激活型突变引起的疾病，就不限定于这些。FOP患者中可见手指、脚趾发生融合或变形、颈椎发生融合或变形等，还发现有听力困难，这些都包括在由ALK2的激活型突变引起的疾病中。
本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物用于患有异位骨化的患者的治疗和/或预防方法，其特征在于，所述患者具有作为异位骨化病因的ALK2蛋白的激活型突变，且所述ALK2的330位氨基酸残基是脯氨酸，以及，所述组合物的有效成分是包含与所述ALK2结合的性质、交联所述ALK2的性质和抑制BMP信号转导的性质的抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段。
在实施方式中，上述方法包括如下步骤：(a)检测患者的ALK2是否存在激活型突变；(b)筛选具有ALK2激活型突变的患者；(c)确认患者的ALK2的330位氨基酸残基无突变；以及，(d)向筛选出的患者给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段。
在另外的实施方式中，上述步骤(c)还包括确认患者的ALK2不具有G328V的步骤。
进一步在另外的实施方式中，对成为上述抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的给药对象的患者的筛选包括如下步骤：(a)检测异位骨化的患者中的ALK2是否存在激活型突变；(b)筛选具有ALK2激活型突变的患者；以及，(c)将ALK2的330位氨基酸残基有突变的患者排除。
在另外的实施方式中，上述步骤(c)还包括将ALK2具有G328V突变的患者排除的步骤。
作为本发明中的“异位骨化”，例如可举出进行性骨化性纤维发育不良(FOP)等，优选为进行性骨化性纤维发育不良(FOP)。
在全部的FOP患者的ALK2中发现激活型突变，迄今为止已报告有10种以上的突变种类。这些突变可知全部存在于ALK2蛋白的胞内区的氨基酸突变(错义突变)，胞外区的氨基酸序列则无变化。因此，通过使用与ALK2的胞外区结合的抗ALK2抗体，从而不论突变种类，可得到对FOP的治疗和/或预防效果。
FOP的治疗是指FOP的症状痊愈、症状改善、症状减轻，或者症状发展得到抑制。
FOP的预防是指避免或抑制急性发作或异位骨化的发病。
或者，本发明提供一种脑肿瘤的治疗和/或预防方法，其使用来源于患者的生物试样，检测该生物试样中的ALK2是否存在激活型突变，向具有除G328V突变之外的ALK2激活型突变的患者给予抗ALK2抗体。
本发明进一步提供一种药物组合物，所述药物组合物用于患有脑肿瘤的患者的治疗和/或预防方法，其特征在于，所述患者具有作为脑肿瘤的病因的ALK2蛋白的激活型突变，以及，所述组合物的有效成分是包含与所述ALK2结合的性质、交联所述ALK2的性质和抑制BMP信号转导的性质的抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段。
作为本发明中的“脑肿瘤”，例如可举出：扩散型内因性脑桥神经胶质瘤(DIPG)、脑干神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤(GBM)、非胶质母细胞瘤脑肿瘤、脑膜瘤、中枢神经系统淋巴瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、未分化星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、少突星形细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤等，优选为扩散型内因性脑桥神经胶质瘤(DIPG)。
在DIPG患者的ALK2中也发现激活型突变。作为人ALK2的突变型，已知有R206H、R258G、G328E、G328V、G328W和G356D，除G328V突变之外，与在FOP患者中发现的突变是共有的。除去有G328V突变存在的情况，抗ALK2抗体显示出ALK2阻碍活性，因此本发明中使用的抗ALK2抗体在具有除G328V突变之外的ALK2激活型突变的患者中，具有对DIPG的治疗和/或预防效果。
在体外(in vitro)由抗ALK2抗体所致的ALK2的生物活性(BMP信号阻碍活性)可通过如下方法确认：例如，用插入有BMP应答序列的报告质粒进行萤光素酶检测、SMAD1/5/8的磷酸化、BMP靶基因的表达分析或由BMP配体的刺激而向成骨细胞分化进行诱导的小鼠成肌细胞C2C12中测定碱性磷酸酶活性。
在体内(in vivo)利用实验动物的抗ALK2抗体对异位骨化的治疗或预防效果可通过如下方法确认：例如，对小鼠肌肉中移植含BMP配体颗粒的异位骨化诱导模型，或者对导入有突变ALK2的FOP模型小鼠皮下或静脉给药抗ALK2抗体，分析异位性骨的形成。或者，对脑肿瘤的治疗或预防效果例如可通过如下方法确认：对免疫不全小鼠中将来源于患者的肿瘤细胞移植到脑或皮下等的模型，皮下或静脉给予抗ALK2抗体，分析肿瘤的增殖、小鼠的生存天数。
在本发明的方法中，成为治疗或预防的对象的患者是具有ALK2激活型突变的患者，是ALK2的330位氨基酸残基无突变的患者(330位氨基酸残基是脯氨酸患者)或无G328V突变的患者(328位氨基酸残基未被置换为缬氨酸的患者)，优选为不具有ALK2的330位氨基酸残基的突变，且具有除G328V突变之外的ALK2激活型突变的患者。作为ALK2的激活型突变，可举出：L196P、delP197_F198insL(也称为“PF-197-8L”)、R202I、R206H、Q207E、R258S、R258G、G325A、G328E、G328R、G328W、G356D、R375P等，只要是使ALK2激活的突变，就不限定于这些。
本发明中使用的抗ALK2抗体对异位骨化的治疗或预防可以单独或与至少一个其他异位骨化治疗剂联合给予该抗体，对脑肿瘤的治疗或预防可以单独或与至少一个其他脑肿瘤治疗剂、放射治疗、免疫疗法或化学疗法等联合给予该抗体。
作为可与抗ALK2抗体联合给予的其他异位骨化治疗剂，可举出抗炎药、甾体药、双膦酸盐、肌肉松弛剂、视黄酸受体(RAR)γ激动剂等，但不限定于这些。
作为抗炎药，可举出：阿司匹林、双氯芬酸、吲哚美辛、布洛芬、酮洛芬、萘普生、吡罗昔康、罗非考昔、塞来考昔、咪唑硫嘌呤、青霉胺、甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、来氟米特、英夫利昔、依那西普等，优选为吲哚美辛、布洛芬、吡罗昔康或塞来考昔。
作为甾体药，可举出：泼尼松、倍氯米松、倍他米松、氟替卡松、地塞米松、氢化可的松等，优选为泼尼松。
作为双膦酸盐，可举出：阿仑膦酸盐、英卡膦酸盐、氯膦酸盐、依替膦酸盐、伊班膦酸盐、因卡膦酸盐、米诺膦酸盐、奈立膦酸盐、奥帕膦酸盐、帕米膦酸盐、匹瑞膦酸盐(piridronate)、利塞膦酸盐、替鲁膦酸盐、唑来膦酸盐等，优选为帕米膦酸盐或唑来膦酸盐。
作为肌肉松弛剂，可举出：环苯扎林、美他沙酮、巴氯芬等，优选为巴氯芬。
作为视黄酸受体γ激动剂，可举出帕罗伐汀(Palovarotene)等。
作为可与抗ALK2抗体联合给予的其他脑肿瘤治疗剂，例如可举出：替莫唑胺、贝伐单抗、卡莫司汀、洛莫斯汀、盐酸丙卡巴肼、长春新碱等。
根据异位骨化或脑肿瘤的状态或希望达到的治疗和/或预防的程度，也可以给予2种、3种或其以上的其他治疗剂，这些其他治疗剂可通过包括在同一制剂中同时给药。其他治疗剂和抗ALK2抗体也可通过封装在同一制剂中同时给药。此外，抗ALK2抗体和其他治疗剂也可通过封装在各自的制剂中同时给药。进一步，其他制剂和抗ALK2抗体也可以相继地各自给药。即，也可以在给予其他治疗剂后再给予含有抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段为有效成分的治疗剂，或者在给予含有抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段为有效成分的治疗剂后再给予其他治疗剂。在基因治疗中给药的情况下，蛋白性的异位骨化或脑肿瘤治疗剂基因和抗ALK2抗体基因可以插入到各自的或者同一启动子区的下游，可以导入到各自的或者同一载体中。
通过使异位骨化或脑肿瘤治疗剂与抗ALK2抗体或其片段结合，可以制造如M.C.Garnet“Targeted drug conjugates：principles and progress”，Advanced DrugDelivery Reviews，(2001)53，171-216中所述的靶向型药物复合体。为了该目的，除抗体分子之外，只要不完全失去与ALK2的结合能力(或识别性)和对ALK2的交联能力，可使用任何抗体片段，例如可举例有F(ab’)2等片段。抗ALK2抗体或该抗体片段与FOP治疗剂的结合方式可以是如M.C.Garnet“Targeted drug conjugates：principles and progress”，Advanced Drug Delivery Reviews，(2001)53，171-216、G.T.Hermanson“BioconjugateTechniques”Academic Press，California(1996)、Putnam and J.Kopecek“PolymerConjugates with Anticancer Activity”Advances in Polymer Science(1995)122，55-123等所述的各种方式。即，可举出抗ALK2抗体和异位骨化或脑肿瘤治疗剂以化学方式直接结合或者通过寡肽等间隔基进行结合的方式，或通过适当的药物载体进行结合的方式。作为药物载体的例子，可举出脂质体、纳米颗粒、纳米胶束、水溶性聚合物等药物递送系统(例如X.Yu et al.，J Nanomater.2016；2016：doi：10.1155/2016/1087250、J.Wang et al.，Drug Delivery，25：1，1319-1327，DOI：10.1080/10717544.2018.1477857)。这些药物载体所介入的方式，更具体地可举例有：异位骨化或脑肿瘤治疗剂包含在脂质体中的该脂质体与抗体结合而成的方式，以及异位骨化或脑肿瘤治疗剂与水溶性聚合物(分子量为1000～10万左右的化合物)以化学方式直接或者通过寡肽等间隔基进行结合的该水溶性聚合物与抗体结合而成的方式。抗体(或其片段)与异位骨化或脑肿瘤治疗剂、脂质体和水溶性聚合物等药物载体的结合可通过本领域技术人员已知的方法，如G.T.Hermanson“BioconjugateTechniques”Academic Press，California(1996)、Putnam and J.Kopecek“PolymerConjugates with Anticancer Activity”Advances in Polymer Science(1995)122，55-123所述的方法等实施。将异位骨化或脑肿瘤治疗剂包含在脂质体可通过本领域技术人员已知的方法，如D.D.Lasic“Liposomes：From Physics to Applications”，ElsevierScience Publishers B.V.，Amsterdam(1993)等所述的方法等实施。将异位骨化或脑肿瘤治疗剂结合到水溶性聚合物可通过本领域技术人员已知的方法，如D.Putnam and JKopecek“Polymer Conjugates with Anticancer Activity”Advances in PolymerScience(1995)122，55-123所述的方法等实施。除上述方法外，抗体(或该片段)与蛋白性的异位骨化或脑肿瘤治疗剂(例如抗体或其片段)的复合体可通过本领域技术人员已知的方法以基因工程学方法制作。
本发明中使用的抗ALK2抗体的给药量，在向患者给予人型抗ALK2抗体时，例如可以在1～180天以约0.1～100mg/kg体重地给药1次或多次即可。但是，关于给药量或给药次数，一般应考虑患者的性别、体重、年龄、症状、严重程度、副作用等确定，因此并不限定于上述剂量或用法。
本发明中使用的抗ALK2抗体的非限定实例可举出：注射剂(包括输液)、栓剂、经鼻制剂、舌下制剂、经皮吸收剂等。给药途径为经口途径或非经口途径，非经口途径的非限定实例可举出：静脉内、动脉内、肌肉内、直肠内、经粘膜内、皮内、腹腔内、脑室内等途径。
7.判定患者是否有资格治疗和/或预防
为了通过给予本发明中的上述抗ALK2抗体和含有该抗体的药物组合物而有效地治疗和/或预防ALK2蛋白的突变(例如，ALK2的激活型突变)患者，可以进行以下方法。
第一方法是一种对给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的副作用发生风险进行预测的方法，所述方法包括下列步骤：(a)检测患者的ALK2是否存在激活型突变和330位氨基酸残基的突变；以及，(b)将具有ALK2的激活型突变且330位氨基酸残基无突变的患者判定为给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的副作用发生风险低。
第二方法是一种对给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的治疗和/或预防应答性进行预测的方法，所述方法包括下列步骤：(a)检测患者的ALK2是否存在激活型突变和330位氨基酸残基的突变；以及，(b)将具有ALK2的激活型突变且330位氨基酸残基无突变的患者判定为具有给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的治疗和/或预防应答性。
第三方法是一种对给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的治疗和/或预防的对象患者进行筛选的方法，所述方法包括下列步骤：(a)检测患者的ALK2是否存在激活型突变和330位氨基酸残基的突变；以及，(b)将具有ALK2的激活型突变且330位氨基酸残基无突变的患者筛选为给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的治疗和/或预防的对象患者。
第四方法是一种给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的疾病的治疗和/或预防方法，所述方法包括下列步骤：(a)检测患者的ALK2是否存在激活型突变和330位氨基酸残基的突变；以及，(b)向具有ALK2的激活型突变且330位氨基酸残基无突变的患者给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段。
第四方法中还可包括进行第一～第三中任一项所述的方法的步骤(b)中的至少一个，即，
(第一方法的步骤(b))
将具有ALK2的激活型突变且330位氨基酸残基无突变的患者判定为给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的副作用发生风险低的步骤、
(第二方法的步骤(b))
将具有ALK2的激活型突变且330位氨基酸残基无突变的患者判定为具有给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的治疗和/或预防应答性的步骤、
(第三方法的步骤(b))
将具有ALK2的激活型突变且330位氨基酸残基无突变的患者筛选为给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的治疗和/或预防的对象患者的步骤。
由此，对于给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的治疗和/或预防，判定是否是有资格的患者、是否对患者带来副作用等，然后对认为有资格的患者，可给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段而产生治疗效果，即对患者进行所谓的“定制治疗”。
本文中使用的术语“判定”包括：确定、评价，或者支持判定。
在上述第一方法至第四方法中，给予上述抗ALK2抗体或其抗原结合片段优选给予上述6.中所述并说明的药物组合物。
在上述第一方法至第四方法中，上述步骤(b)还可包括确认ALK2的激活型突变不是G328V突变的步骤。
进一步，在上述第一方法至第四方法中，上述ALK2的激活型突变优选为选自L196P、delP197_F198insL、R202I、R206H、Q207E、R258S、R258G、G325A、G328E、G328R、G328W、G356D和R375P中的至少一个，或者，选自R206H、R258G、G328E、G328W和G356D中的至少一个。
而且，在上述第一方法至第四方法中，上述患者是疾病尚未鉴定的待测者，或者疑似患有由ALK2的激活型突变引起的疾病的待测者，以及，应予治疗的上述疾病例如是由ALK2的激活型突变引起的疾病，优选为异位骨化或脑肿瘤，更优选为异位骨化。这些疾病的具体例如上述6.中所述。虽非意图限定，进一步优选疾病是进行性骨化性纤维发育不良(FOP)或扩散型内因性脑桥神经胶质瘤(DIPG)，更优选为进行性骨化性纤维发育不良(FOP)。
实施例
下面，通过实施例具体地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。予以说明，下述实施例中关于基因操作的各项操作，除非另作说明，均根据《分子克隆(MolecularCloning)》(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.著，Cold Spring HarborLaboratory Press于1989年出版)所述的方法进行操作，或者在使用市售的试剂及试剂盒时，按照市售品的说明书进行使用。
<实施例1>
利用萤光素酶报告基因测定评价抗ALK2抗体(27D-H2L2_LALA)的BMP信号转导激活作用
实验中使用的抗ALK2抗体(27D-H2L2_LALA)按照WO2016/121908的实施例12中所述的方法制作。
使用BMP特异性萤光素酶报告基因分析由制作的抗ALK2抗体介导的BMP细胞内信号转导的激活作用。将HEK293A细胞以1×104个细胞/孔地接种到萤光素酶检测用的96孔白色酶标板(CORNING公司制)中，在含10％FBS的DMEM培养基中，在37℃、5％CO2的条件下过夜培养。次日，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司制)，将人或小鼠ALK2的野生型和R206H突变型表达质粒分别与pGL4.26/Id1WT4F-luc(Genes Cells，7，949(2002))一起导入。3小时后，将培养基更换为新鲜的OPTI-MEM I(Life Technologies公司制)，然后添加系列稀释的抗体，进一步过夜培养。次日，利用One-Glo萤光素酶检测系统(Promega公司制)并用酶标仪SpectraMax M4(Molecular Devices公司制)测定萤光素酶活性。
结果如图1所述。仅在表达小鼠R206H突变型ALK2的HEK293细胞中，确认到27D-H2L2_LALA使BMP特异性萤光素酶活性以浓度依赖性的方式上升(图1A的下图)。而在人的R206H突变型ALK2(图1B的下图)或人与小鼠的野生型ALK2(图1A的上图、图1B的上图)的表达细胞中未发现BMP报告基因的活性上升。
<实施例2>
抗ALK2抗体(27D-H2L2_LALA)的Fab(27D-H2L2_Fab)和F(ab’)2(27D-H2L2_F(ab’)2)的制备
2)-1
27D-H2L2_LALA的Fab化
利用来源于木瓜乳液的木瓜蛋白酶(Papain from Papaya latex)(SIGMA-ALDRICH)限制性酶切27D-H2L2_LALA，再用HiLoad 26/600Superdex 200pg(GEHealthcare)除去Fc片段等，然后用HiTrap MabSelect SuRe,1mL(GE Healthcare)分离未反应的27D-H2L2_LALA，回收Fab。
2)-2
27D-H2L2_LALA的F(ab’)2化
利用内切蛋白酶(Endoproteinase)Glu-C(SIGMA-ALDRICH)限制性酶切27D-H2L2_LALA，再用HiTrap MabSelect SuRe,10mL(GE Healthcare)分离未反应的27D-H2L2_LALA，然后用Bio-Scale CHT Type I,5mL(BIO-RAD)回收F(ab’)2。
<实施例3>
利用萤光素酶报告基因测定评价抗ALK2抗体的Fab(27D-H2L2_Fab)和F(ab’)2(27D-H2L2_F(ab’)2)中的BMP信号转导激活作用
使用BMP特异性萤光素酶报告基因分析由实施例2中制作的27D-H2L2_Fab和27D-H2L2_F(ab’)2介导的BMP细胞内信号转导的激活作用。作为比较对照，使用作为全长抗ALK2抗体的27D-H2L2_LALA。萤光素酶报告基因测定与实施例1同样的方法进行。
结果如图2所述。与27D-H2L2_LALA同样地，仅在表达小鼠R206H突变型ALK2的HEK293细胞中确认到27D-H2L2_F(ab’)2使BMP特异性萤光素酶活性以浓度依赖性的方式上升。而在27D-H2L2_Fab中即使在任一条件下也未发现BMP报告基因的活性上升。
<实施例4>
体外(in vitro)评价由抗ALK2抗体所致的ALK2分子的交联活性
在实施例1和3中确认了由27D-H2L2_LALA和27D-H2L2_F(ab’)2的BMP特异性萤光素酶报告基因的激活作用，但为了验证ALK2分子的交联的可能性，进行了NanoBiT测定(Promega公司制)。构建将全长人ALK2插入到pBit1.1-C[TK/LgBiT]和pBit2.1-C[TK/SmBiT]Vector(Promega公司制)中的表达载体。将C2C12细胞以5×103个细胞/孔地接种到萤光素酶检测用96孔白色酶标板(Greiner公司制)中，在含15％FBS的DMEM培养基中，在37℃、5％CO2的条件下过夜培养。次日，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司制)导入2种ALK2表达质粒。2.5小时后，将培养基更换为新鲜的OPTI-MEM I(Life Technologies公司制)，然后进一步过夜培养。次日，一起添加系列稀释的抗体与Nano-Glo Live Cell AssaySystem(Promega公司制)底物，培养15分钟后，用酶标仪GENios(TECAN公司制)测定萤光素酶活性。
结果如图3所示。A2-27D、27D-H2L2_LALA和27D-H2L2_F(ab’)2以抗体浓度依赖性的方式促进形成ALK2的交联(或形成ALK2的复合物)，但确认到27D-H2L2_Fab未诱导形成ALK2的交联(或形成ALK2的复合物)。
<实施例5>
验证182和330位氨基酸置换对由抗ALK2抗体所致的BMP特异性萤光素酶报告基因的激活作用带来的影响
5)-1
人/食蟹猴/狗/大鼠/小鼠的全长ALK2的氨基酸序列的比对
序列比对的结果如图4所示。如果将人、食蟹猴、狗、大鼠和小鼠的ALK2胞内区的氨基酸进行对比，则182位和330位的氨基酸残基不同。
5)-2
验证182和330位氨基酸置换对由抗ALK2抗体所致的BMP特异性萤光素酶报告基因的激活作用带来的影响
为了分析在人和小鼠的ALK2的胞内区不同的D182E和P330S所起的作用，构建使用了pcDEF3的表达载体，所述pcDEF3分别将D182E或P330S突变导入到人ALK2的野生型和R206H突变体中。将HEK293A细胞以1×104个细胞/孔地接种到萤光素酶报告基因测定用96孔白色酶标板(Greiner公司制)中，在含10％FBS的DMEM培养基中，在37℃、5％CO2的条件下过夜培养。次日，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司制)导入ALK2表达载体和pGL4.26/Id1WT4F-luc(Genes Cells，7，949(2002))、phRL SV40(Promega公司制)。2.5小时后，将培养基更换为含系列稀释抗体A2-27D的新鲜的OPTI-MEM I(Life Technologies公司制)，进一步过夜培养。次日，利用Dual-Glo双萤光素酶检测系统(Promega公司制)并用酶标仪GENios(TECAN公司制)测定萤火虫和海肾(Renilla)的萤光素酶活性。
结果如图5所示。与小鼠的R206H突变型ALK2同样地，仅在导入P330S突变的R206H突变型人ALK2确认到A2-27D的浓度依赖性活性上升。
<实施例6>
验证330位氨基酸置换对由抗ALK2抗体所致的BMP特异性萤光素酶报告基因的激活作用带来的影响
为了分析人ALK2的P330所起的作用，构建使用pcDEF3的表达载体，所述pcDEF3分别将P330D、P330E、P330A、P330V突变导入到人ALK2的野生型和R206H突变体中。此外，为了分析小鼠ALK2的S330所起的作用，构建分别将S330P突变导入到小鼠ALK2的野生型和R206H突变体中的表达载体。采用与实施例5同样的方法，将这些表达载体导入HEK293A细胞中，在含A2-27D的培养基中过夜培养后，测定萤光素酶活性。
结果如图6所示。可知：小鼠的R206H突变体如果导入S330P突变，则因A2-27D而活性受到抑制(即，拮抗活性)，但在S330(330位氨基酸残基为丝氨酸)时，因A2-27D而活性得到促进(即，激动活性)。另一方面，人的R206H突变体如果导入P330S、P330D，P330E、P330A突变，则因A2-27D而活性得到促进(即，激动活性)，但在P330V突变中活性受到抑制。
<实施例7>
利用萤光素酶报告基因测定评价4种抗ALK2抗体(27D-H2L2_LALA、15A-H4L6_IgG2、A2-11E、A2-25C)的BMP信号转导激活作用
实验中使用的抗ALK2抗体(27D-H2L2_LALA、15A-H4L6_IgG2、A2-11E、A2-25C)是按照WO2016/121908的实施例12、11和1中所述的方法制作的。
由制作的抗ALK2抗体介导的BMP细胞内信号转导的激活作用是按照与实施例1同样的方法并使用BMP特异性萤光素酶报告基因进行分析的。
结果如图7所示。与27D-H2L2_LALA同样地，仅在表达小鼠R206H突变型ALK2的HEK293细胞中确认到15A-H4L6_IgG2、A2-11E、A2-25C使BMP特异性萤光素酶活性以浓度依赖性的方式上升。而在人的R206H突变型ALK2表达细胞中未发现BMP报告基因的活性上升。
<实施例8>
对于除R206H突变之外的各种突变型ALK2，验证由抗ALK2抗体所致的BMP特异性萤光素酶报告基因的激活作用
构建使用pcDEF3的表达载体，所述pcDEF3导入在FOP和DIPG中发现的14种人ALK2突变体(L196P、P197F198del_insL(也称为PF197-8L)、R202I、R206H、Q207E、R258G、R258S、G325A、G328E、G328R、G328V、G328W、G356D、R375P)和组成性活性型突变体Q207D突变。将这些与实施例5、6同样地在HEK293细胞中过表达，在含系列稀释A2-27D的培养基中过夜培养后，测定萤光素酶活性。此时，在如下方式的测定中使用：G328V突变体是其他突变体的1/3量(例如，其他突变体是37.5ng/孔时为12.5ng/孔)，Q207D突变体是其他突变体的1/20量(例如，其他突变体是37.5ng/孔时为1.875ng/孔)。
结果如图8所示。确认到：在人ALK2突变体中，仅在DIPG中发现的G328V与组成性活性型Q207D以A2-27D的浓度依赖性地促进活性，而其他的人ALK2突变体以A2-27D的浓度依赖性地抑制活性。
工业实用性
根据本发明，可知：通过向具有ALK2的激活型突变且ALK2的330位氨基酸残基无突变的患者，优选无G328V突变的患者，给予具有与ALK2的结合能力和对ALK2的交联能力的抗ALK2抗体，能够有效地治疗和/或预防异位骨化和/或脑肿瘤。此外，根据本发明，可知：能够对给予抗ALK2抗体的副作用发生风险进行预测、能够对给予抗ALK2抗体的治疗和/或预防应答性进行预测，以及能够对给予抗ALK2抗体的治疗和/或预防的对象进行筛选。
序列表自由文本
SEQ ID NO:17：Gln是置换氨基酸残基。
SEQ ID NO:30：人源化hA2-15A-L4的氨基酸序列。
SEQ ID NO:31：人源化hA2-15A-H4的氨基酸序列。
SEQ ID NO:32：人源化hA2-15A-L6的氨基酸序列。
SEQ ID NO:33：人源化hA2-15A-H4_IgG2型的氨基酸序列。
SEQ ID NO:34：人源化hA2-27D-H2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:35：人源化hA2-27D-L2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:36：人源化hA2-27D-H3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:37：人源化hA2-27D-L4的氨基酸序列。
SEQ ID NO:38：人源化hA2-27D-H2_LALA的氨基酸序列。
SEQ ID NO:39：人源化hA2-27D-H3_LALA的氨基酸序列。
本文中引用的全部出版物、专利及专利申请直接通过引用以其整体并入本说明书中。
序列表
<110> 学校法人埼玉医科大学
第一三共株式会社
<120> 用于异位骨化治疗或预防的药物组合物
<130> PH-7730-PCT
<150> JP 2018-039066
<151> 2018-03-05
<160> 42
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 509
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Val Asp Gly Val Met Ile Leu Pro Val Leu Ile Met Ile Ala Leu
1 5 10 15
Pro Ser Pro Ser Met Glu Asp Glu Lys Pro Lys Val Asn Pro Lys Leu
20 25 30
Tyr Met Cys Val Cys Glu Gly Leu Ser Cys Gly Asn Glu Asp His Cys
35 40 45
Glu Gly Gln Gln Cys Phe Ser Ser Leu Ser Ile Asn Asp Gly Phe His
50 55 60
Val Tyr Gln Lys Gly Cys Phe Gln Val Tyr Glu Gln Gly Lys Met Thr
65 70 75 80
Cys Lys Thr Pro Pro Ser Pro Gly Gln Ala Val Glu Cys Cys Gln Gly
85 90 95
Asp Trp Cys Asn Arg Asn Ile Thr Ala Gln Leu Pro Thr Lys Gly Lys
100 105 110
Ser Phe Pro Gly Thr Gln Asn Phe His Leu Glu Val Gly Leu Ile Ile
115 120 125
Leu Ser Val Val Phe Ala Val Cys Leu Leu Ala Cys Leu Leu Gly Val
130 135 140
Ala Leu Arg Lys Phe Lys Arg Arg Asn Gln Glu Arg Leu Asn Pro Arg
145 150 155 160
Asp Val Glu Tyr Gly Thr Ile Glu Gly Leu Ile Thr Thr Asn Val Gly
165 170 175
Asp Ser Thr Leu Ala Asp Leu Leu Asp His Ser Cys Thr Ser Gly Ser
180 185 190
Gly Ser Gly Leu Pro Phe Leu Val Gln Arg Thr Val Ala Arg Gln Ile
195 200 205
Thr Leu Leu Glu Cys Val Gly Lys Gly Arg Tyr Gly Glu Val Trp Arg
210 215 220
Gly Ser Trp Gln Gly Glu Asn Val Ala Val Lys Ile Phe Ser Ser Arg
225 230 235 240
Asp Glu Lys Ser Trp Phe Arg Glu Thr Glu Leu Tyr Asn Thr Val Met
245 250 255
Leu Arg His Glu Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ser Asp Met Thr Ser
260 265 270
Arg His Ser Ser Thr Gln Leu Trp Leu Ile Thr His Tyr His Glu Met
275 280 285
Gly Ser Leu Tyr Asp Tyr Leu Gln Leu Thr Thr Leu Asp Thr Val Ser
290 295 300
Cys Leu Arg Ile Val Leu Ser Ile Ala Ser Gly Leu Ala His Leu His
305 310 315 320
Ile Glu Ile Phe Gly Thr Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp
325 330 335
Leu Lys Ser Lys Asn Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Gln Cys Cys Ile
340 345 350
Ala Asp Leu Gly Leu Ala Val Met His Ser Gln Ser Thr Asn Gln Leu
355 360 365
Asp Val Gly Asn Asn Pro Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro
370 375 380
Glu Val Leu Asp Glu Thr Ile Gln Val Asp Cys Phe Asp Ser Tyr Lys
385 390 395 400
Arg Val Asp Ile Trp Ala Phe Gly Leu Val Leu Trp Glu Val Ala Arg
405 410 415
Arg Met Val Ser Asn Gly Ile Val Glu Asp Tyr Lys Pro Pro Phe Tyr
420 425 430
Asp Val Val Pro Asn Asp Pro Ser Phe Glu Asp Met Arg Lys Val Val
435 440 445
Cys Val Asp Gln Gln Arg Pro Asn Ile Pro Asn Arg Trp Phe Ser Asp
450 455 460
Pro Thr Leu Thr Ser Leu Ala Lys Leu Met Lys Glu Cys Trp Tyr Gln
465 470 475 480
Asn Pro Ser Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Thr
485 490 495
Lys Ile Asp Asn Ser Leu Asp Lys Leu Lys Thr Asp Cys
500 505
<210> 2
<211> 3062
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
gaagagatgt gggcctctgg ggccgctgga ttcagtaact tccgtcgggt tctagactgg 60
ctcggctctg tccagtttgt gccagatagt ctcccacccc ctccccaccc ctcctttccc 120
ctggagattt gaacgctgct tgcatgggag aaaagctact tagagaagaa aacgttccac 180
ttagtaacag aagaaaagtc ttggttaaaa agttgtcatg aatttggctt ttggagagag 240
gcagcaagcc tggagcattg gtaagcgtca cactgccaaa gtgagagctg ctggagaact 300
cataatccca ggaacgcctc ttctactctc cgagtacccc agtgaccaga gtgagagaag 360
ctctgaacga gggcacgcgg cttgaaggac tgtgggcaga tgtgaccaag agcctgcatt 420
aagttgtaca atggtagatg gagtgatgat tcttcctgtg cttatcatga ttgctctccc 480
ctcccctagt atggaagatg agaagcccaa ggtcaacccc aaactctaca tgtgtgtgtg 540
tgaaggtctc tcctgcggta atgaggacca ctgtgaaggc cagcagtgct tttcctcact 600
gagcatcaac gatggcttcc acgtctacca gaaaggctgc ttccaggttt atgagcaggg 660
aaagatgacc tgtaagaccc cgccgtcccc tggccaagcc gtggagtgct gccaagggga 720
ctggtgtaac aggaacatca cggcccagct gcccactaaa ggaaaatcct tccctggaac 780
acagaatttc cacttggagg ttggcctcat tattctctct gtagtgttcg cagtatgtct 840
tttagcctgc ctgctgggag ttgctctccg aaaatttaaa aggcgcaacc aagaacgcct 900
caatccccga gacgtggagt atggcactat cgaagggctc atcaccacca atgttggaga 960
cagcacttta gcagatttat tggatcattc gtgtacatca ggaagtggct ctggtcttcc 1020
ttttctggta caaagaacag tggctcgcca gattacactg ttggagtgtg tcgggaaagg 1080
caggtatggt gaggtgtgga ggggcagctg gcaaggggag aatgttgccg tgaagatctt 1140
ctcctcccgt gatgagaagt catggttcag ggaaacggaa ttgtacaaca ctgtgatgct 1200
gaggcatgaa aatatcttag gtttcattgc ttcagacatg acatcaagac actccagtac 1260
ccagctgtgg ttaattacac attatcatga aatgggatcg ttgtacgact atcttcagct 1320
tactactctg gatacagtta gctgccttcg aatagtgctg tccatagcta gtggtcttgc 1380
acatttgcac atagagatat ttgggaccca agggaaacca gccattgccc atcgagattt 1440
aaagagcaaa aatattctgg ttaagaagaa tggacagtgt tgcatagcag atttgggcct 1500
ggcagtcatg cattcccaga gcaccaatca gcttgatgtg gggaacaatc cccgtgtggg 1560
caccaagcgc tacatggccc ccgaagttct agatgaaacc atccaggtgg attgtttcga 1620
ttcttataaa agggtcgata tttgggcctt tggacttgtt ttgtgggaag tggccaggcg 1680
gatggtgagc aatggtatag tggaggatta caagccaccg ttctacgatg tggttcccaa 1740
tgacccaagt tttgaagata tgaggaaggt agtctgtgtg gatcaacaaa ggccaaacat 1800
acccaacaga tggttctcag acccgacatt aacctctctg gccaagctaa tgaaagaatg 1860
ctggtatcaa aatccatccg caagactcac agcactgcgt atcaaaaaga ctttgaccaa 1920
aattgataat tccctcgaca aattgaaaac tgactgttga cattttcata gtgtcaagaa 1980
ggaagatttg acgttgttgt cattgtccag ctgggaccta atgctggcct gactggttgt 2040
cagaatggaa tccatctgtc tccctcccca aatggctgct ttgacaaggc agacgtcgta 2100
cccagccatg tgttggggag acatcaaaac caccctaacc tcgctcgatg actgtgaact 2160
gggcatttca cgaactgttc acactgcaga gactaatgtt ggacagacac tgttgcaaag 2220
gtagggactg gaggaacaca gagaaatcct aaaagagatc tgggcattaa gtcagtggct 2280
ttgcatagct ttcacaagtc tcctagacac tccccacggg aaactcaagg aggtggtgaa 2340
tttttaatca gcaatattgc ctgtgcttct cttctttatt gcactaggaa ttctttgcat 2400
tccttacttg cactgttact cttaatttta aagacccaac ttgccaaaat gttggctgcg 2460
tactccactg gtctgtcttt ggataatagg aattcaattt ggcaaaacaa aatgtaatgt 2520
cagactttgc tgcattttac acatgtgctg atgtttacaa tgatgccgaa cattaggaat 2580
tgtttataca caactttgca aattatttat tacttgtgca cttagtagtt tttacaaaac 2640
tgctttgtgc atatgttaaa gcttattttt atgtggtctt atgattttat tacagaaatg 2700
tttttaacac tatactctaa aatggacatt ttcttttatt atcagttaaa atcacatttt 2760
aagtgcttca catttgtatg tgtgtagact gtaacttttt ttcagttcat atgcagaacg 2820
tatttagcca ttacccacgt gacaccaccg aatatattac tgatttagaa gcaaagattt 2880
cagtagaatt ttagtcctga acgctacggg gaaaatgcat tttcttcaga attatccatt 2940
acgtgcattt aaactctgcc agaaaaaaat aactattttg ttttaatcta ctttttgtat 3000
ttagtagtta tttgtataaa ttaaataaac tgttttcaag tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3060
aa 3062
<210> 3
<211> 509
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 3
Met Val Asp Gly Val Met Ile Leu Pro Val Leu Met Met Met Ala Phe
1 5 10 15
Pro Ser Pro Ser Val Glu Asp Glu Lys Pro Lys Val Asn Gln Lys Leu
20 25 30
Tyr Met Cys Val Cys Glu Gly Leu Ser Cys Gly Asn Glu Asp His Cys
35 40 45
Glu Gly Gln Gln Cys Phe Ser Ser Leu Ser Ile Asn Asp Gly Phe His
50 55 60
Val Tyr Gln Lys Gly Cys Phe Gln Val Tyr Glu Gln Gly Lys Met Thr
65 70 75 80
Cys Lys Thr Pro Pro Ser Pro Gly Gln Ala Val Glu Cys Cys Gln Gly
85 90 95
Asp Trp Cys Asn Arg Asn Ile Thr Ala Gln Leu Pro Thr Lys Gly Lys
100 105 110
Ser Phe Pro Gly Thr Gln Asn Phe His Leu Glu Val Gly Leu Ile Ile
115 120 125
Leu Ser Val Val Phe Ala Val Cys Leu Leu Ala Cys Ile Leu Gly Val
130 135 140
Ala Leu Arg Lys Phe Lys Arg Arg Asn Gln Glu Arg Leu Asn Pro Arg
145 150 155 160
Asp Val Glu Tyr Gly Thr Ile Glu Gly Leu Ile Thr Thr Asn Val Gly
165 170 175
Asp Ser Thr Leu Ala Glu Leu Leu Asp His Ser Cys Thr Ser Gly Ser
180 185 190
Gly Ser Gly Leu Pro Phe Leu Val Gln Arg Thr Val Ala Arg Gln Ile
195 200 205
Thr Leu Leu Glu Cys Val Gly Lys Gly Arg Tyr Gly Glu Val Trp Arg
210 215 220
Gly Ser Trp Gln Gly Glu Asn Val Ala Val Lys Ile Phe Ser Ser Arg
225 230 235 240
Asp Glu Lys Ser Trp Phe Arg Glu Thr Glu Leu Tyr Asn Thr Val Met
245 250 255
Leu Arg His Glu Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ser Asp Met Thr Ser
260 265 270
Arg His Ser Ser Thr Gln Leu Trp Leu Ile Thr His Tyr His Glu Met
275 280 285
Gly Ser Leu Tyr Asp Tyr Leu Gln Leu Thr Thr Leu Asp Thr Val Ser
290 295 300
Cys Leu Arg Ile Val Leu Ser Ile Ala Ser Gly Leu Ala His Leu His
305 310 315 320
Ile Glu Ile Phe Gly Thr Gln Gly Lys Ser Ala Ile Ala His Arg Asp
325 330 335
Leu Lys Ser Lys Asn Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Gln Cys Cys Ile
340 345 350
Ala Asp Leu Gly Leu Ala Val Met His Ser Gln Ser Thr Asn Gln Leu
355 360 365
Asp Val Gly Asn Asn Pro Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro
370 375 380
Glu Val Leu Asp Glu Thr Ile Gln Val Asp Cys Phe Asp Ser Tyr Lys
385 390 395 400
Arg Val Asp Ile Trp Ala Phe Gly Leu Val Leu Trp Glu Val Ala Arg
405 410 415
Arg Met Val Ser Asn Gly Ile Val Glu Asp Tyr Lys Pro Pro Phe Tyr
420 425 430
Asp Val Val Pro Asn Asp Pro Ser Phe Glu Asp Met Arg Lys Val Val
435 440 445
Cys Val Asp Gln Gln Arg Pro Asn Ile Pro Asn Arg Trp Phe Ser Asp
450 455 460
Pro Thr Leu Thr Ser Leu Ala Lys Leu Met Lys Glu Cys Trp Tyr Gln
465 470 475 480
Asn Pro Ser Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Thr
485 490 495
Lys Ile Asp Asn Ser Leu Asp Lys Leu Lys Thr Asp Cys
500 505
<210> 4
<211> 3312
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 4
ccgcctcccc gggttcagca cccgaccgcc gctggaccag aggaacaaag gagctgcccc 60
cgtgtcaccc agcccttcag tggaagtctg gaaaaggaac agaggtgata ttgcagtgga 120
tgagcagaga gaagccggcc tctggtgctc ttgagctggt ctgcccatag ggagcctgct 180
gggagaaggt acagcttccg gaagactcct cccggagcgc ctctcccatc ctcctctccc 240
ttggagcagt cagtacctct ctgctggagg atctgggctg ggtgtgccgg gagctggctt 300
taactgtagc cctgtcaggc tttccccgga cctcgcggaa gagcgtcacc agcccccacg 360
gctttccaac acatcacctc ttttcatgcc gtttggcaca gatcgaatct acagggatga 420
atggatccag ggtctggttt taagttctat ggtagtcgtc caaggagcca ttggtattca 480
tctaacgcaa acgatcaagt tacattctga aagtaacatc ccaccagaaa ccctccagca 540
gcagtcacgt ctgtgtaaag ccaagccctg gcatgcgcac tgccaggtca gagtgtggtg 600
gtacacgtgt ttaacaggtc atttgtcaac tgaaggaaag accccggctt gacttacctg 660
ttatacaatg gtcgatggag taatgatcct tcctgtgcta atgatgatgg ctttcccttc 720
cccgagtgtg gaagatgaga agcccaaggt caaccagaaa ctttacatgt gtgtgtgtga 780
gggcctctcc tgcgggaacg aggaccactg tgaaggccag cagtgttttt cttctctgag 840
catcaacgat ggcttccacg tctaccagaa gggctgcttt caggtttatg agcaggggaa 900
gatgacgtgt aagaccccgc cgtcacctgg ccaggctgtg gagtgctgcc aaggggactg 960
gtgtaacagg aacatcacgg cccagctgcc cactaaaggg aagtccttcc ccggaacaca 1020
gaatttccac ctggaagttg gccttatcat cctctcggtg gtgtttgcag tatgtctttt 1080
agcttgcatc cttggagttg ctctcaggaa gtttaagaga cgcaatcaag agcgcctgaa 1140
ccccagagac gtggagtatg gtaccattga agggctcatc accaccaatg tgggagacag 1200
cactctagcg gaactactag atcactcgtg tacatcagga agtggctccg gtcttccttt 1260
cctggtacag agaacggtgg ctcgccagat aaccctgttg gagtgtgtcg ggaagggccg 1320
gtatggagaa gtatggaggg gcagctggca aggcgaaaat gtcgctgtga agatcttctc 1380
ctcccgagac gagaagtcat ggttcaggga gacggaattg tacaacactg tgatgttgag 1440
gcatgaaaat atcttaggtt tcatcgcttc agacatgacc tccagacact ccagtaccca 1500
gctgtggctc atcacacatt accatgaaat gggatcgttg tatgactacc ttcagctcac 1560
tactctggat acggttagct gccttcggat tgtactgtcc atagccagcg gccttgccca 1620
tttgcacata gagatatttg ggacccaagg gaagtccgcc attgcccatc gagatctgaa 1680
gagcaaaaac atcctggtga agaagaatgg acagtgctgc atagcagatt tgggcctggc 1740
agtcatgcat tcccagagca caaaccagct tgatgtggga aacaaccccc gtgtggggac 1800
caagcgctac atggctccgg aagtgctcga tgaaaccatc caagtggatt gctttgattc 1860
ttataagagg gtcgatattt gggcctttgg ccttgttctg tgggaagtgg ccaggcgaat 1920
ggtgagcaat ggtatagtgg aagattacaa gccaccattc tatgatgtgg ttcccaatga 1980
cccaagtttt gaagatatga ggaaagttgt ctgtgtggat caacagaggc caaacatacc 2040
taacagatgg ttctcagacc cgacattaac ttctctggcg aagctgatga aagagtgctg 2100
gtatcagaac ccatccgcaa gactcacagc tctacgtatc aaaaagactt tgaccaaaat 2160
cgataattcc ctagacaaat taaaaactga ctgttgacct tgtcaccggt gtcaagaagg 2220
agagtcaatg ctgtccttgt ccagctggga cctaatgctg gcctgactgg ttgtcagaac 2280
agaatccatc tgaccccctt cccgaagtgg ctgctttgac ggaagcagat gtctcttccc 2340
agccatgttc cagggggaga caccaaaacc accctaacct cgctcaaaaa ctgtgactcg 2400
agccctcgat gaactgttca caccacaaag acttaacggt gggcaggtct ggtggcaagg 2460
gggagggaag tggaggaacc cggaaagatc ctgcaggcga tctgggcatt aagacagtgg 2520
ctctctgcgt atctttcgcg ggtctcctag acactcccca cgggaagctc aaggaggcgg 2580
tgaattcgta atcagcaata tcggctgcat ctactcttcg ttgcactagg aattctgtgc 2640
attccttact tgcactgtgg cccttaatct taaagaccca acttgccaaa acattggctg 2700
cgtactccac tggcctgtct ctggataata ggaattcaat ctggcaacac aaaaatgtac 2760
cgttggactc tgctgcattt tacacacgtg ctgatgttta caaggatgcg aacattagga 2820
attgtttaga cacaactttg caaattattt attactggtg cacttagcgg tttgtttgaa 2880
accgcctcgt gcatatgtta aagcttattt ttatgtggtc ttatgatttt attaccgaaa 2940
tgtttttaac acccaactct gaaacggaca ttttctttta ttatcagtta aattcacatt 3000
taagtgcttc acattttttt ttttaaatgt gtgtagactg taactttctt ttcagttcgt 3060
atgcagaaca tatttagcca ttacccatgc aacaccaccc gatatattac tgatttagaa 3120
gcaaagattt cagtagaatt ttagtcccaa acgctgtggg gggaaatgca tcttcttcgg 3180
aattatccat tacgtgcatt taaactctgc cagaaaaaaa aataactatt ttgttttaat 3240
ctactttttg tatttagtag ttatttgtat aaattaaata aactgttttc aagtcaaaaa 3300
aaaaaaaaaa aa 3312
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 5
Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr Tyr Met Ala
1 5 10
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 6
Ser Ile Thr Asn Ser Gly Gly Ser Ile Asn Tyr Arg Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 7
Glu Gly Gly Glu Asn Tyr Gly Gly Tyr Pro Pro Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 8
Arg Ala Asn Gln Gly Val Ser Leu Ser Arg Tyr Asn Leu Met His
1 5 10 15
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 9
Arg Ser Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 10
Gln Gln Ser Arg Glu Ser Pro Phe Thr
1 5
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 11
Gly Ser Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met Lys
1 5 10
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 12
Ser Ile Ser Arg Ser Ser Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 13
Ala Ile Ser Thr Pro Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp Phe
1 5 10
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 14
Leu Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Thr
1 5 10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 15
Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 16
Leu His Leu Thr Ser Tyr Pro Pro Tyr Thr
1 5 10
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> Gln is a substituted amino acid residue.
<400> 17
Arg Ser Ser Asn Leu Ala Gln
1 5
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 18
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Tyr Met Tyr
1 5 10
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 19
Ser Ile Asn Thr Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 20
Ser Thr Pro Asn Ile Pro Leu Ala Tyr
1 5
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 21
Lys Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 22
Tyr Ser Asn Ser Leu Gln Thr
1 5
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 23
Phe Gln Tyr Ser Ser Gly Pro Thr
1 5
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 24
Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr Ala Met Ser
1 5 10
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 25
Ser Ile Ser Arg Gly Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 26
Leu Asn Tyr Asn Asn Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 27
<211> 11
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 27
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp Leu Ser
1 5 10
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 28
Gly Ala Thr Ser Leu Ala Asp
1 5
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 29
Leu Gln Ala Tyr Ser Ala Pro Phe Thr
1 5
<210> 30
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 人源化hA2-15A-L4的氨基酸序列
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(20)
<220>
<221> V_region
<222> (21)..(133)
<220>
<221> C_region
<222> (134)..(238)
<400> 30
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Asn Gln Gly
35 40 45
Val Ser Leu Ser Arg Tyr Asn Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Lys Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Asn Leu Ala Ser
65 70 75 80
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Asp Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln Gln Ser Arg Glu Ser Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Leu Lys Arg Ala Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
165 170 175
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
195 200 205
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
210 215 220
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 31
<211> 472
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 人源化hA2-15A-H4的氨基酸序列
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(19)
<220>
<221> V_region
<222> (20)..(142)
<220>
<221> C_region
<222> (143)..(472)
<400> 31
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser His Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Asn Ser Gly Gly Ser Ile Asn Tyr Arg
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr
100 105 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Gly Gly Glu Asn Tyr Gly Gly Tyr Pro Pro
115 120 125
Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
145 150 155 160
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
165 170 175
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
180 185 190
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
195 200 205
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
210 215 220
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
225 230 235 240
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
245 250 255
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
260 265 270
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
275 280 285
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
290 295 300
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
305 310 315 320
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
325 330 335
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
340 345 350
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
355 360 365
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
370 375 380
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
385 390 395 400
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405 410 415
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
420 425 430
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
435 440 445
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
450 455 460
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 32
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 人源化hA2-15A-L6的氨基酸序列
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(20)
<220>
<221> V_region
<222> (21)..(133)
<220>
<221> C_region
<222> (134)..(238)
<400> 32
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Asn Gln Gly
35 40 45
Val Ser Leu Ser Arg Tyr Asn Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Lys Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Asn Leu Ala Gln
65 70 75 80
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Asp Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Gln Gln Ser Arg Glu Ser Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Leu Lys Arg Ala Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
165 170 175
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
195 200 205
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
210 215 220
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 33
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 人源化hA2-15A-H4_IgG2型的氨基酸序列
<400> 33
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser His Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Asn Ser Gly Gly Ser Ile Asn Tyr Arg
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr
100 105 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Gly Gly Glu Asn Tyr Gly Gly Tyr Pro Pro
115 120 125
Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr
145 150 155 160
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
165 170 175
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
180 185 190
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
195 200 205
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr
210 215 220
Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val
225 230 235 240
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
245 250 255
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260 265 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290 295 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
305 310 315 320
Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn
325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro
340 345 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355 360 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
370 375 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405 410 415
Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Pro Gly Lys
465
<210> 34
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 人源化hA2-27D-H2的氨基酸序列
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(19)
<220>
<221> V_region
<222> (20)..(140)
<220>
<221> C_region
<222> (141)..(470)
<400> 34
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Gly Met Lys Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Arg Ser Ser Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Ile Ser Thr Pro Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp
115 120 125
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
370 375 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 35
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 人源化hA2-27D-L2的氨基酸序列
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(20)
<220>
<221> V_region
<222> (21)..(129)
<220>
<221> C_region
<222> (130)..(234)
<400> 35
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser
20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Leu Ala Ser Ser Ser
35 40 45
Val Ser Tyr Met Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg
50 55 60
Leu Trp Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg
85 90 95
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu His Leu Thr Ser
100 105 110
Tyr Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Ala Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 36
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 人源化hA2-27D-H3的氨基酸序列
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(19)
<220>
<221> V_region
<222> (20)..(140)
<220>
<221> C_region
<222> (141)..(470)
<400> 36
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Gly Met Lys Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Arg Ser Ser Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Ile Ser Thr Pro Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp
115 120 125
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
370 375 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 37
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 人源化hA2-27D-L4的氨基酸序列
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(20)
<220>
<221> V_region
<222> (21)..(129)
<220>
<221> C_region
<222> (130)..(234)
<400> 37
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Met Ser
20 25 30
Ala Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Leu Ala Ser Ser Ser
35 40 45
Val Ser Tyr Met Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ala Ser Pro Arg
50 55 60
Leu Trp Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg
85 90 95
Met Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu His Leu Thr Ser
100 105 110
Tyr Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
115 120 125
Ala Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 38
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 人源化hA2-27D-H2_LALA的氨基酸序列
<400> 38
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Gly Met Lys Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Arg Ser Ser Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Ile Ser Thr Pro Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp
115 120 125
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
370 375 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 39
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工的(Artificial)
<220>
<223> 人源化hA2-27D-H3_LALA的氨基酸序列
<400> 39
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Gly Met Lys Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Arg Ser Ser Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Ile Ser Thr Pro Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp
115 120 125
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
370 375 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 40
<211> 509
<212> PRT
<213> 恒河猴(Macca mulatta)
<400> 40
Met Val Asp Gly Val Met Ile Leu Pro Val Leu Ile Ile Ile Ala Leu
1 5 10 15
Pro Ser Pro Ser Met Glu Asp Glu Lys Pro Lys Val Asn Pro Lys Leu
20 25 30
Tyr Met Cys Val Cys Glu Gly Leu Ser Cys Gly Asn Glu Asp His Cys
35 40 45
Glu Gly Gln Gln Cys Phe Ser Ser Leu Ser Ile Asn Asp Gly Phe His
50 55 60
Val Tyr Gln Lys Gly Cys Phe Gln Val Tyr Glu Gln Gly Lys Met Thr
65 70 75 80
Cys Lys Thr Pro Pro Ser Pro Gly Gln Ala Val Glu Cys Cys Gln Gly
85 90 95
Asp Trp Cys Asn Arg Asn Ile Thr Ala Gln Leu Pro Thr Lys Gly Lys
100 105 110
Ser Phe Pro Gly Thr Gln Asn Phe His Leu Glu Val Gly Leu Ile Ile
115 120 125
Leu Ser Val Val Phe Ala Val Cys Leu Leu Ala Cys Leu Leu Gly Val
130 135 140
Ala Leu Arg Lys Phe Lys Arg Arg Asn Gln Glu Arg Leu Asn Pro Arg
145 150 155 160
Asp Val Glu Tyr Gly Thr Ile Glu Gly Leu Ile Thr Thr Asn Val Gly
165 170 175
Asp Ser Thr Leu Ala Asp Leu Leu Asp His Ser Cys Thr Ser Gly Ser
180 185 190
Gly Ser Gly Leu Pro Phe Leu Val Gln Arg Thr Val Ala Arg Gln Ile
195 200 205
Thr Leu Leu Glu Cys Val Gly Lys Gly Arg Tyr Gly Glu Val Trp Arg
210 215 220
Gly Ser Trp Gln Gly Glu Asn Val Ala Val Lys Ile Phe Ser Ser Arg
225 230 235 240
Asp Glu Lys Ser Trp Phe Arg Glu Thr Glu Leu Tyr Asn Thr Val Met
245 250 255
Leu Arg His Glu Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ser Asp Met Thr Ser
260 265 270
Arg His Ser Ser Thr Gln Leu Trp Leu Ile Thr His Tyr His Glu Met
275 280 285
Gly Ser Leu Tyr Asp Tyr Leu Gln Leu Thr Thr Leu Asp Thr Val Ser
290 295 300
Cys Leu Arg Ile Val Leu Ser Ile Ala Ser Gly Leu Ala His Leu His
305 310 315 320
Ile Glu Ile Phe Gly Thr Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp
325 330 335
Leu Lys Ser Lys Asn Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Gln Cys Cys Ile
340 345 350
Ala Asp Leu Gly Leu Ala Val Met His Ser Gln Ser Thr Asn Gln Leu
355 360 365
Asp Val Gly Asn Asn Pro Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro
370 375 380
Glu Val Leu Asp Glu Thr Ile Gln Val Asp Cys Phe Asp Ser Tyr Lys
385 390 395 400
Arg Val Asp Ile Trp Ala Phe Gly Leu Val Leu Trp Glu Val Ala Arg
405 410 415
Arg Met Val Ser Asn Gly Ile Val Glu Asp Tyr Lys Pro Pro Phe Tyr
420 425 430
Asp Val Val Pro Asn Asp Pro Ser Phe Glu Asp Met Arg Lys Val Val
435 440 445
Cys Val Asp Gln Gln Arg Pro Asn Ile Pro Asn Arg Trp Phe Ser Asp
450 455 460
Pro Thr Leu Thr Ser Leu Ala Lys Leu Met Lys Glu Cys Trp Tyr Gln
465 470 475 480
Asn Pro Ser Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Thr
485 490 495
Lys Ile Asp Asn Ser Leu Asp Lys Leu Lys Thr Asp Cys
500 505
<210> 41
<211> 509
<212> PRT
<213> 狗(Canis lupus)
<400> 41
Met Val Asp Gly Val Met Met Leu Pro Val Leu Met Met Ile Ala Phe
1 5 10 15
Pro Ser Pro Ser Met Glu Asp Glu Lys Pro Lys Val Asn Pro Lys Leu
20 25 30
Tyr Met Cys Val Cys Glu Gly Leu Ser Cys Gly Asn Glu Asp His Cys
35 40 45
Glu Gly Gln Gln Cys Phe Ser Ser Leu Ser Ile Asn Asp Gly Phe His
50 55 60
Val Tyr Gln Lys Gly Cys Phe Gln Val Tyr Glu Gln Gly Lys Met Thr
65 70 75 80
Cys Lys Thr Pro Pro Ser Pro Gly Gln Ala Val Glu Cys Cys Gln Gly
85 90 95
Asp Trp Cys Asn Arg Asn Ile Thr Ala Gln Leu Pro Thr Lys Gly Lys
100 105 110
Ser Phe Pro Glu Thr Gln Asn Phe His Leu Glu Val Gly Leu Ile Ile
115 120 125
Leu Ser Val Val Phe Ala Val Cys Leu Leu Ala Cys Leu Leu Gly Val
130 135 140
Ala Leu Arg Lys Phe Lys Arg Arg Asn Gln Glu Arg Leu Asn Pro Arg
145 150 155 160
Asp Val Glu Tyr Gly Thr Ile Glu Gly Leu Ile Thr Thr Asn Val Gly
165 170 175
Asp Ser Thr Leu Ala Asp Leu Leu Asp His Ser Cys Thr Ser Gly Ser
180 185 190
Gly Ser Gly Leu Pro Phe Leu Val Gln Arg Thr Val Ala Arg Gln Ile
195 200 205
Thr Leu Leu Glu Cys Val Gly Lys Gly Arg Tyr Gly Glu Val Trp Arg
210 215 220
Gly Ser Trp Gln Gly Glu Asn Val Ala Val Lys Ile Phe Ser Ser Arg
225 230 235 240
Asp Glu Lys Ser Trp Phe Arg Glu Thr Glu Leu Tyr Asn Thr Val Met
245 250 255
Leu Arg His Glu Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ser Asp Met Thr Ser
260 265 270
Arg His Ser Ser Thr Gln Leu Trp Leu Ile Thr His Tyr His Glu Met
275 280 285
Gly Ser Leu Tyr Asp Tyr Leu Gln Leu Thr Thr Leu Asp Thr Val Ser
290 295 300
Cys Leu Arg Ile Val Leu Ser Ile Ala Ser Gly Leu Ala His Leu His
305 310 315 320
Ile Glu Ile Phe Gly Thr Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp
325 330 335
Leu Lys Ser Lys Asn Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Gln Cys Cys Ile
340 345 350
Ala Asp Leu Gly Leu Ala Val Met His Ser Gln Ser Thr Asn Gln Leu
355 360 365
Asp Val Gly Asn Asn Pro Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro
370 375 380
Glu Val Leu Asp Glu Thr Ile Gln Val Asp Cys Phe Asp Ser Tyr Lys
385 390 395 400
Arg Val Asp Ile Trp Ala Phe Gly Leu Val Leu Trp Glu Val Ala Arg
405 410 415
Arg Met Val Ser Asn Gly Ile Val Glu Asp Tyr Lys Pro Pro Phe Tyr
420 425 430
Asp Val Val Pro Asn Asp Pro Ser Phe Glu Asp Met Arg Lys Val Val
435 440 445
Cys Val Asp Gln Gln Arg Pro Asn Ile Pro Asn Arg Trp Phe Ser Asp
450 455 460
Pro Thr Leu Thr Ser Leu Ala Lys Leu Met Lys Glu Cys Trp Tyr Gln
465 470 475 480
Asn Pro Ser Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Thr
485 490 495
Lys Ile Asp Asn Ser Leu Asp Lys Leu Lys Thr Asp Cys
500 505
<210> 42
<211> 509
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 42
Met Val Asp Gly Ala Met Ile Leu Ser Val Leu Met Met Met Ala Leu
1 5 10 15
Pro Ser Pro Ser Met Glu Asp Glu Glu Pro Lys Val Asn Pro Lys Leu
20 25 30
Tyr Met Cys Val Cys Glu Gly Leu Ser Cys Gly Asn Glu Asp His Cys
35 40 45
Glu Gly Gln Gln Cys Phe Ser Ser Leu Ser Val Asn Asp Gly Phe Arg
50 55 60
Val Tyr Gln Lys Gly Cys Phe Gln Val Tyr Glu Gln Gly Lys Met Thr
65 70 75 80
Cys Lys Thr Pro Pro Ser Pro Gly Gln Ala Val Glu Cys Cys Gln Gly
85 90 95
Asp Trp Cys Asn Arg Asn Val Thr Ala Arg Leu Pro Thr Lys Gly Lys
100 105 110
Ser Phe Pro Gly Ser Gln Asn Phe His Leu Glu Val Gly Leu Ile Ile
115 120 125
Leu Ser Val Val Phe Ala Val Cys Leu Phe Ala Cys Ile Leu Gly Val
130 135 140
Ala Leu Arg Lys Phe Lys Arg Arg Asn Gln Glu Arg Leu Asn Pro Arg
145 150 155 160
Asp Val Glu Tyr Gly Thr Ile Glu Gly Leu Ile Thr Thr Asn Val Gly
165 170 175
Asp Ser Thr Leu Ala Glu Leu Leu Asp His Ser Cys Thr Ser Gly Ser
180 185 190
Gly Ser Gly Leu Pro Phe Leu Val Gln Arg Thr Val Ala Arg Gln Ile
195 200 205
Thr Leu Leu Glu Cys Val Gly Lys Gly Arg Tyr Gly Glu Val Trp Arg
210 215 220
Gly Ser Trp Gln Gly Glu Asn Val Ala Val Lys Ile Phe Ser Ser Arg
225 230 235 240
Asp Glu Lys Ser Trp Phe Arg Glu Thr Glu Leu Tyr Asn Thr Val Met
245 250 255
Leu Arg His Glu Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ser Asp Met Thr Ser
260 265 270
Arg His Ser Ser Thr Gln Leu Trp Leu Ile Thr His Tyr His Glu Met
275 280 285
Gly Ser Leu Tyr Asp Tyr Leu Gln Leu Thr Thr Leu Asp Thr Val Ser
290 295 300
Cys Leu Arg Ile Val Leu Ser Ile Ala Ser Gly Leu Ala His Leu His
305 310 315 320
Ile Glu Ile Phe Gly Thr Gln Gly Lys Ser Ala Ile Ala His Arg Asp
325 330 335
Leu Lys Ser Lys Asn Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Gln Cys Cys Ile
340 345 350
Ala Asp Leu Gly Leu Ala Val Met His Ser Gln Ser Thr Asn Gln Leu
355 360 365
Asp Val Gly Asn Asn Pro Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro
370 375 380
Glu Val Leu Asp Glu Thr Ile Gln Val Asp Cys Phe Asp Ser Tyr Lys
385 390 395 400
Arg Val Asp Ile Trp Ala Phe Gly Leu Val Leu Trp Glu Val Ala Arg
405 410 415
Arg Met Val Ser Asn Gly Ile Val Glu Asp Tyr Lys Pro Pro Phe Tyr
420 425 430
Asp Val Val Pro Asn Asp Pro Ser Phe Glu Asp Met Arg Lys Val Val
435 440 445
Cys Val Asp Gln Gln Arg Pro Asn Ile Pro Asn Arg Trp Phe Ser Asp
450 455 460
Pro Thr Leu Thr Ser Leu Ala Lys Leu Met Lys Glu Cys Trp Tyr Gln
465 470 475 480
Asn Pro Ser Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Thr
485 490 495
Lys Ile Asp Asn Ser Leu Asp Lys Leu Lys Thr Asp Cys
500 505

Claims (34)

1.一种药物组合物，所述药物组合物用于患有异位骨化的患者的治疗和/或预防方法，其特征在于，所述患者具有作为异位骨化病因的激活素样激酶2(ALK2)蛋白的激活型突变，且所述ALK2的330位氨基酸残基是脯氨酸，以及，所述组合物的有效成分是包含与所述ALK2结合的性质、交联所述ALK2的性质和抑制BMP信号转导的性质的抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述ALK2不具有G328V突变。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述方法包括如下步骤：(a)检测患者的ALK2是否存在激活型突变；(b)筛选具有ALK2激活型突变的患者；(c)确认患者的ALK2的330位氨基酸残基无突变；以及，(d)向筛选出的患者给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中，所述步骤(c)还包括确认患者的ALK2不具有G328V突变的步骤。
5.根据权利要求3所述的药物组合物，其中，对成为所述抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段给药对象的患者的筛选包括如下步骤：(a)检测异位骨化的患者中的ALK2是否存在激活型突变；(b)筛选具有ALK2激活型突变的患者；以及，(c)将ALK2的330位氨基酸残基有突变的患者排除。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中，所述步骤(c)还包括将ALK2具有G328V突变的患者排除的步骤。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的药物组合物，其中，所述抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段与包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中21位～123位氨基酸残基的多肽特异性结合。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的药物组合物，其中，所述抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段与以下结合：
(i)含有下列各残基的表位：SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的38位谷氨酸、39位甘氨酸、59位异亮氨酸、60位天冬酰胺、61位天冬氨酸、62位甘氨酸、63位苯丙氨酸、64位组氨酸、65位缬氨酸、66位酪氨酸、102位天冬酰胺、104位苏氨酸、106位谷氨酰胺和107位亮氨酸，或者，
(ii)含有下列各残基的表位：SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的38位谷氨酸、39位甘氨酸、40位亮氨酸、59位异亮氨酸、60位天冬酰胺、61位天冬氨酸、62位甘氨酸、63位苯丙氨酸、64位组氨酸、65位缬氨酸、66位酪氨酸和104位苏氨酸。
9.根据权利要求1～7中任一项所述的药物组合物，其中，所述抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段与根据权利要求8所述的抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段竞争对ALK2的结合。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的药物组合物，其中，所述抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段是单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、双链抗体、多特异性抗体或F(ab’)2。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的药物组合物，其中，所述抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的重链序列含有具有CDRH1、CDRH2、CDRH3的可变区，所述CDRH1、CDRH2和CDRH3各自包含下列所示的氨基酸序列：
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7；
SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13；
SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20；或者，
SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26；以及，
轻链序列含有具有CDRL1、CDRL2、CDRL3的可变区，所述CDRL1、CDRL2和CDRL3各自包含下列所示的氨基酸序列：
SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；
SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:10；
SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；
SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23；或者，
SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的药物组合物，其中，所述抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的重链可变区序列是下列序列：
a1)包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列中20位～142位氨基酸残基的氨基酸序列；
a2)包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列中20位～142位氨基酸残基的氨基酸序列；
a3)包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列中20位～140位氨基酸残基的氨基酸序列；
a4)包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列中20位～140位氨基酸残基的氨基酸序列；
a5)包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列中20位～140位氨基酸残基的氨基酸序列；
a6)包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列中20位～140位氨基酸残基的氨基酸序列；
a7)与选自所述a1)～a6)的氨基酸序列中任一个的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；
a8)与选自所述a1)～a6)的氨基酸序列中任一个的氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列；或者，
a9)选自所述a1)～a6)的氨基酸序列中任一个的氨基酸序列中1个或数个氨基酸残基被置换、缺失或添加的氨基酸序列；
以及，轻链可变区序列是下列序列：
b1)包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列中21位～133位氨基酸残基的氨基酸序列；
b2)包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列中21位～129位氨基酸残基的氨基酸序列；
b3)包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列中21位～129位氨基酸残基的氨基酸序列；
b4)与选自所述b1)～b3)的氨基酸序列中任一个的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；
b5)与选自所述b1)～b3)的氨基酸序列中任一个的氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列；或者，
b6)选自所述b1)～b3)的氨基酸序列中任一个的氨基酸序列中1个或数个氨基酸残基被置换、缺失或添加的氨基酸序列。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中，所述抗ALK2抗体是包含下列重链和轻链的抗体：含有包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列中20位～142位氨基酸残基的重链可变区的重链和含有包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列中21位～133位氨基酸残基的轻链可变区的轻链、含有包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列中20位～142位氨基酸残基的重链可变区的重链和含有包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列中21位～133位氨基酸残基的轻链可变区的轻链、含有包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列中20位～140位氨基酸残基的重链可变区的重链和含有包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列中21位～129位氨基酸残基的轻链可变区的轻链、含有包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列中20位～140位氨基酸残基的重链可变区的重链和含有包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列中21位～129位氨基酸残基的轻链可变区的轻链、含有包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列中20位～140位氨基酸残基的重链可变区的重链和含有包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列中21位～129位氨基酸残基的轻链可变区的轻链，或者含有包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列中20位～140位氨基酸残基的重链可变区的重链和含有包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列中21位～129位氨基酸残基的轻链可变区的轻链。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的药物组合物，其中，所述ALK2的激活型突变选自L196P、delP197_F198insL、R202I、R206H、Q207E、R258S、R258G、G325A、G328E、G328R、G328W、G356D和R375P中的至少一个。
15.根据权利要求1～13中任一项所述的药物组合物，其中，所述ALK2的激活型突变是R206H突变。
16.根据权利要求1～15中任一项所述的药物组合物，其中，所述异位骨化是进行性骨化性纤维发育不良(FOP)。
17.一种药物组合物，所述药物组合物用于患有脑肿瘤的患者的治疗和/或预防方法，其特征在于，所述患者具有作为脑肿瘤病因的激活素样激酶2(ALK2)蛋白的激活型突变，以及，所述组合物的有效成分是包含与所述ALK2结合的性质、交联所述ALK2的性质和抑制BMP信号转导的性质的抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中，所述患者的ALK2的330位氨基酸残基是脯氨酸。
19.根据权利要求17或18所述的药物组合物，其中，所述ALK2的激活型突变选自R206H、R258G、G328E、G328W和G356D中的至少一个。
20.根据权利要求17～19中任一项所述的药物组合物，其中，所述抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段是根据权利要求7～13中任一项所定义的抗ALK2抗体或其抗原结合片段。
21.根据权利要求17～20中任一项所述的药物组合物，其中，所述脑肿瘤是扩散型内因性脑桥神经胶质瘤(DIPG)。
22.一种对给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的副作用发生风险进行预测的方法，所述方法包括下列步骤：(a)检测患者的ALK2是否存在激活型突变和330位氨基酸残基的突变；以及，(b)将具有ALK2的激活型突变且330位氨基酸残基无突变的患者判定为给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的副作用发生风险低。
23.一种对给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的治疗和/或预防应答性进行预测的方法，所述方法包括下列步骤：(a)检测患者的ALK2是否存在激活型突变和330位氨基酸残基的突变；以及，(b)将具有ALK2的激活型突变且330位氨基酸残基无突变的患者判定为具有给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的治疗和/或预防应答性。
24.一种对给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的治疗和/或预防的对象患者进行筛选的方法，所述方法包括下列步骤：(a)检测患者的ALK2是否存在激活型突变和330位氨基酸残基的突变；以及，(b)将具有ALK2的激活型突变且330位氨基酸残基无突变的患者筛选为给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的治疗和/或预防的对象患者。
25.一种给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段的疾病的治疗和/或预防方法，所述方法包括下列步骤：(a)检测患者的ALK2是否存在激活型突变和330位氨基酸残基的突变；以及，(b)向具有ALK2的激活型突变且330位氨基酸残基无突变的患者给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，还包括进行根据权利要求22～24中任一项所述的方法的步骤(b)。
27.根据权利要求22～26中任一项所述的方法，其中，所述给予抗ALK2抗体或该抗体的抗原结合片段是给予根据权利要求1～21中任一项所述的药物组合物。
28.根据权利要求22～27中任一项所述的方法，其中，所述步骤(b)还包括确认ALK2的激活型突变不是G328V突变的步骤。
29.根据权利要求22～28中任一项所述的方法，其中，所述ALK2的激活型突变选自L196P、delP197_F198insL、R202I、R206H、Q207E、R258S、R258G、G325A、G328E、G328R、G328W、G356D和R375P中的至少一个。
30.根据权利要求22～28中任一项所述的方法，其中，所述ALK2的激活型突变选自R206H、R258G、G328E、G328W和G356D中的至少一个。
31.根据权利要求25～30中任一项所述的方法，其中，所述患者患有的疾病是异位骨化或脑肿瘤。
32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述患者患有的疾病是异位骨化。
33.根据权利要求25～31中任一项所述的方法，其中，所述患者患有的疾病是进行性骨化性纤维发育不良(FOP)或扩散型内因性脑桥神经胶质瘤(DIPG)。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述患者患有的疾病是进行性骨化性纤维发育不良(FOP)。
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