TW202302645A - 抗vsig4抗體或抗原結合片段及其用途 - Google Patents

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Abstract

揭示的是新穎的抗VSIG4 (V組、第4型含Ig域)抗體或抗原結合片段。還提供了該些抗體的用途，包括治療方法。

Description

抗VSIG4抗體或抗原結合片段及其用途
發明領域
本發明關於抗VSIG4(V組、第4型含Ig域)抗體或其抗原結合片段及其用途。
背景
巨噬細胞是在循環周邊血液中從單核球分化而來的吞噬細胞和抗原呈現細胞。彼等藉由活化T淋巴球在吾等免疫系統中扮演重要角色，與癌症生物學特別相關。巨噬細胞是重要的腫瘤浸潤細胞，在腫瘤生長和轉移中扮演關鍵角色。特別是，腫瘤相關巨噬細胞(TAM)可直接支持腫瘤生長並抑制腫瘤免疫反應。TAM經由多重途徑而有助於創建免疫抑制的腫瘤微環境，包括觸發T細胞中的抑制性免疫檢查點。TAM主要被描述為具有M2樣表型並有利於腫瘤生長、血管新生和轉移。TME中帶有M2表型的高密度TAM與癌症的較差存活率相關。將TAM轉換成主要的M1表型因此已被提議作為關鍵的抗癌免疫治療策略(Mills et al. (2016) Cancer Res 76: 513-516；Mantovani et al. (2017) Nat Rev Clin Oncol. 14(7): 399-416；Belgiovine et al. (2020) J Clin Med. 9(10):3226, Zhang et al. (2020) Pharmacol Res. 161: 105111；Pan et al. (2020) Front Immunol. 11: 583084；Zhou et al. (2020) Front Oncol. 10:188；Xiang et al. (2021) Signal Transduct Target Ther. 6(1): 75；Reis-Sobreiro et al. (2021) Cells. 10(9): 2364；Hourani et al. (2021) Front Oncol. 11: 788365；Jiang & Li (2022) Front Immunol. 13: 835932)。
作為第三代抗癌免疫治療劑的免疫檢查點抑制劑於2010年首次獲得美國食品暨藥物管理局批准，從黑色素瘤的臨床治療開始，從那時起，持續不斷發表在肺癌、肝癌等抗癌治療中顯示顯著療效的一系列研究成果。近10年來，免疫檢查點抑制劑已成為全世界的重要話題。由於抗癌免疫治療劑是一種俾使癌細胞受到T細胞攻擊而產生的抗體，因此報導了證實即使在與常規抗癌劑的組合療法中也展現出顯著效果的研究結果。迄今為止，已知多種免疫檢查點蛋白，包括 CTLA-4(第4型細胞毒性T淋巴球相關蛋白)、PD-1(第1型計劃性細胞死亡蛋白)、PD-L1(第1型計劃性死亡配體)、PD-L2(第2型計劃性死亡配體)、TIM-3(第3型T細胞免疫球蛋白和含黏蛋白域)、LAG-3(第3型淋巴球活化基因)、TIGIT(具有免疫球蛋白和以免疫受體酪胺酸為基礎的抑制性基序域的T細胞免疫受體) 、PSG-L1(第1型P-選擇素糖蛋白-配體)和VISTA(含v域Ig的T細胞活化抑制因子)。
第4型含V組Ig域(VSIG4、CRIg或Z39Ig)是一種B7家族相關蛋白，包括PDL1、VISTA和CTLA4配體。VSIG4在組織駐留的巨噬細胞和腫瘤相關巨噬細胞 (TAM)中係高度表現(Lee et al. (2006) J Leukoc Biol. 80(4): 922-928；Xia et al. (2020) JCI Insight. 5(18): e141115)。VSIG4和B7家族蛋白共享一個保守的胺基酸序列。在人類中，有兩種不同形式的VSIG4蛋白。長形式含有恆定(C2型)和可變(V型)免疫球蛋白域，而短形式僅包含V型免疫球蛋白域，沒有C2型(Vogt L. et al. (2006) J Clin Invest. 116: 2817-2826；Helmy KY. et al. (2006) Cell 124: 915-927)。
值得注意的是，VSIG4表現的誘發與小鼠和人類中的幾種炎症性疾病和癌症有關(參閱例如He et al. (2008) Mol. Immunol. 45(16): 4041-4047；Xu T. et al. (2015) Am J Transl Res. 7: 1172-1180；Byun et al. (2017) Int J Gynecol Cancer. 27(5): 872-878；Zhu et al. (2018) Cancer Manag Res. 10: 3697-3705；Hu et al. (2019) Biomed Res Int. 2019: 2506843；Kim et al. (2020) J Immunol 204(Suppl. 1) 243.4)。VSIG4係作用如同免疫檢查點調節劑，抑止了T淋巴球功能並促進癌症發展和進程(Zhang et al. (2016) Oncol Rep. 36(5): 2967-2975；Bianchi-Frias et al. (2019) Mol Cancer Res. 17(1): 321-331)。值得注意的是，據報導，巨噬細胞上的VSIG4表現與抗腫瘤免疫力的調節有關，例如肺癌的發展(Liao Y. et al. (2014) Lab Invest. 94: 706-715)。此外，已知VSIG4藉由與轉化酶的C3b次單元結合來抑制補體活性的替代補體途徑，藉此參與病原體的清除。
先前已經描述針對VSIG4的抗體(參閱例如WO 2020/069507)。然而，該些抗體僅結合該兩種形式的蛋白中的一種，藉此僅介導其活性的部分抑制。其他抗體(WO 2019/005817；Wen et al. (2017) Immunobiology. 222(6): 807-813；WO 2008/137338)阻斷 VSIG4和C3b 之間的相互作用，因此可用於對抗感染。然而，沒有建議該些抗體可用於癌症治療。
因此，仍有需要提供能夠建立最佳抗腫瘤免疫力的新型抗VSIG4抗體。
目的
本揭示內容的目的在於提供一種針對VSIG4的新穎抗體或其抗原結合片段。
因此，本揭示內容的另一個目的是提供一種用於癌症治療的組成物，其包含上述抗體或抗原結合片段。 為達成上述目的之技術方法
為達成上述目的，本揭示內容提供一種特異性地結合至VSIG4之單株抗體或其抗原結合片段。本案揭示的抗體結合VSIG4的長形式和短形式兩者，致使有效抑止VSIG4介導的抗炎訊息並逆轉VSIG4介導的T細胞活化抑制。在一態樣中，本案揭示的抗體誘發TAM復極化為腫瘤抑制性M1巨噬細胞，致使T細胞增生和腫瘤抑止。本案揭示的抗VSIG4抗體因此活化了有所需要的患者的免疫反應，藉此賦予患者保護性抗腫瘤免疫力。
本揭示內容尤其提供一種抗VSIG4單株抗體或其抗原結合片段，其具有三個重鏈CDR和三個輕鏈CDR，其中該等CDR的序列選自SEQ ID NOs: 3-14所示的序列群組。更具體地，本案揭示的抗體包含如表2所示的三個重鏈CDR和三個輕鏈CDR。
本揭示內容進一步提供一種抗VSIG4單株抗體或其抗原結合片段，包含選自於由SEQ ID NOs: 45和47的胺基酸序列組成之群組的任何一個重鏈可變區；以及選自於由SEQ ID NOs: 46和48的胺基酸序列組成之群組的任何一個輕鏈可變區，以及該單株抗體的抗原結合片段。
此外，本揭示內容進一步提供一種多核苷酸，其編碼單株抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區或其抗原結合片段。
此外，本揭示內容進一步提供一種包含多核苷酸的表現載體。
此外，本揭示內容進一步提供一種以表現載體轉形的宿主細胞。
此外，本揭示內容進一步提供一種藉由培養轉形體來產生特異性地結合至VSIG4之單株抗體或其抗原結合片段的方法。
此外，本揭示內容進一步提供一種用於刺激免疫反應的組成物，其包含作為有效成分的特異性地結合至VSIG4之單株抗體或其抗原結合片段。
此外，本揭示內容進一步提供一種用於治療癌症的醫藥組成物，其包含作為有效成分的特異性地結合至VSIG4之單株抗體或其抗原結合片段。
此外，本揭示內容進一步提供一種用於治療癌症的方法，其包括將用於治療癌症的醫藥組成物投予一個體。
此外，本揭示內容進一步提供一種抗體-藥物綴合物，其具有連接至特異性地結合至VSIG4之單株抗體或其抗原結合片段的藥物。
此外，本揭示內容進一步提供一種CAR(嵌合抗原受體)蛋白，包括i)上述抗體；ii)跨膜域以及；iii)帶有細胞內訊息傳導域的CAR(嵌合抗原受體)，其特徵在於根據上述i)抗體與抗原的結合引起T細胞活化。
此外，本揭示內容又進一步提供一種多特異性抗體，其包含特異性地結合至VSIG4之單株抗體或其抗原結合片段。 本發明的益處
由於本發明之結合至VSIG4的新穎抗體及其抗原結合片段可結合至VSIG4以抑制VSIG4的活性，因此期望彼等可有利地用於開發用於VSIG4相關病症的各種免疫治療劑。
由本案提供的詳細說明和附圖將更充分理解本發明，該些僅以例示方式提供且不限制本發明的預期範疇。 定義
除非特別定義，否則本案使用的所有技術和科學術語與化學、生物化學、細胞生物學、分子生物學和醫學科學領域的技術人員通常理解的含義相同。
術語「約」或「大略」是指熟習此藝者已知的給定值或範圍的正常誤差範圍。通常是指在給定值或範圍的20%以內，例如10%以內，或5%以內(或1%或更少)。
如本案所用，「投予(administer)」或「投藥(administration)」是指注射或以其他方式物理遞送存在於體外的物質(例如本案提供的抗VSIG4抗體)進入患者體內的行為，例如藉由黏膜、皮內、靜脈內、肌肉內遞送及/或本案所述或本領域已知的任何其他物理遞送方法。當正在治療疾病或其症狀時，物質的投予通常發生在疾病或其症狀發作之後。當正在預防疾病或其症狀時，物質的投予通常發生在疾病或其症狀發作之前。本發明的組成物的投藥途徑可以是各種途徑中的任何一種，包括口服和非腸胃道途徑，只要其允許將組成物遞送至目標組織即可。具體而言，可透過口服、大腸直腸、局部、靜脈內、腹膜內、肌肉內、動脈內、經皮、鼻內、吸入、眼內或皮內途徑的常規方法進行投藥。
術語「抗體」和「免疫球蛋白」或「Ig」在本案中可互換使用。該些術語在本案中以最廣義使用，具體涵蓋任何同型的單株抗體(包括全長單株抗體)，例如 IgG、IgM、IgA、IgD和IgE、多株抗體、多特異性抗體、嵌合抗體和抗體片段，前提是該等片段保留所需的生物學功能。該些術語旨在包括免疫球蛋白類之多肽中的B細胞的多肽產物，該多肽產物能夠結合至特定分子抗原且由兩對相同的多肽鏈組成，藉由二硫鍵相互連接，其中每對具有一個重鏈(約50-70 kDa)和一條輕鏈(約25 kDa)，各條鏈的各個胺基端部分包括約100至約130個或更多個胺基酸的可變區和各條鏈的各個羧基端部分包括恆定區(參閱Borrebaeck (ed.) (1995) Antibody Engineering, Second Ed., Oxford University Press.; Kuby (1997) Immunology, Third Ed., W.H. Freeman and Company, New York)。各條重鏈和輕鏈的各個可變區是由三個互補決定區 (CDR)和四個框架(FR)組成，該等互補決定區也稱為高度可變區，該等框架(FR)是可變域的高度保守部分，從胺基端排列到羧基端按以下順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合域。抗體的恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，包括免疫系統的各種細胞(例如效應細胞)和古典補體系統的第一組分(C1q)。在一些實施方案中，可被本案提供的抗體結合的特異性分子抗原包括標靶VSIG4多肽、片段或表位。與特定抗原反應的抗體可藉由重組方法生成，例如選擇噬菌體或類似載體中的重組抗體庫，或藉由用抗原或抗原編碼之核酸賦予動物免疫性。
抗體還包括但不限於合成抗體、單株抗體、重組產生的抗體、多特異性抗體(包括雙特異性抗體)、人類抗體、人源化抗體、駱駝化抗體、嵌合抗體、胞內抗體、抗獨特型(抗-Id)抗體和任何上述的功能片段，其指抗體重鏈或輕鏈多肽的一部分，其保留了衍生該片段之抗體的一些或全部生物學功能。本案提供的抗體可為任何類型(例如 IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、任何類別(例如 IgG1、IgG2、IgG3、IgG4 ,、IgA1和IgA2)或任何亞類(例如IgG2a和IgG2b)的免疫球蛋白分子。
術語「抗VSIG4抗體」、「結合至VSIG4的抗體」、「結合至VSIG4表位的抗體」和類似術語在本案中可互換使用，是指結合至VSIG4多肽例如VSIG4抗原或表位的抗體。此類抗體包括多株抗體和單株抗體，包括嵌合抗體、人源化抗體和人類抗體。結合至VSIG4抗原的抗體可能與相關抗原交叉反應。在一些實施方案中，結合至VSIG4的抗體不與其他抗原例如屬於B7超家族的其他肽或多肽交叉反應。例如，可藉由免疫試驗、BIAcore或熟習此藝者已知的其他技術來辨識結合至VSIG4的抗體。抗體與VSIG4結合，例如，當該抗體與VSIG4結合時的親和力高於任何使用實驗技術，例如放射免疫試驗(RIA)和酶關聯免疫吸附試驗(ELISA)所測定的交叉反應性抗原，例如，特異性地結合至VSIG4的抗體。通常，特異性或選擇性的反應會至少是背景訊號或噪聲的兩倍，可能是背景的10倍以上。參閱例如Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology Second Edition, Raven Press, New York在第332-336頁關於抗體特異性的討論。在一些實施方案中，「結合」感興趣抗原的抗體是以足夠的親和力結合該抗原的抗體，俾使該抗體可用作靶向表現該抗原的細胞或組織的診斷及/或治療劑，並且不與其他蛋白質發生顯著交叉反應。在此類實施方案中，抗體與「非標靶」蛋白質的結合程度將小於抗體與其特定標靶蛋白質結合之約10%，如藉由螢光活化細胞分選(FACS)分析或放射免疫沉澱(RIPA)所測定的。關於抗體與標靶分子的結合，術語「特異性結合」或「特異性結合至」或「特異性針對」特定多肽或特定多肽標靶上的表位是指與非特異性相互作用顯著不同的結合。例如，可藉由測定分子的結合與對照組分子的結合相比較來測量特異性結合，對照組分子通常是不具有結合活性的類似結構的分子。例如，特異性結合可藉由與類似於標靶的對照組分子，例如過量的未標記標靶競爭來測定。在此情況下，假使經標記標靶與探針的結合被過量的未標記標靶競爭性地抑制，則指示特異性結合。如本案所用的術語「特異性結合」或「特異性結合至」或「特異性針對」特定多肽或特定多肽標靶上的表位可例如藉由具有針對標靶之以下K D的分子來展現：至少約10 -4M，或者至少約10 -5M，或者至少約10 -6M，或者至少約10 -7M，或者至少約10 -8M，或者至少約10 -9M，或者至少約10 -10M，或者至少約10 -11M，或者至少約10 -12M或更大。在一些實施方案中，術語「特異性結合」是指分子結合特定多肽或特定多肽上的表位而實質上不結合任何其他多肽或多肽表位。在一些實施方案中，結合至VSIG4的抗體具有≤ 1µM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1nM或≤ 0.1nM之解離常數(K D)。
如本案所用，術語「抗原」是指可選擇性結合至抗體的預定抗原。標靶抗原可是多肽、碳水化合物、核酸、脂質、不完全抗原(hapten)或其他天然存在的或合成的化合物。在一些實施方案中，標靶抗原是多肽，包括例如VSIG4多肽。
術語「抗原結合片段」、「抗原結合域」、「抗原結合區」和類似術語是指包含與抗原相互作用並賦予結合劑對該抗原(例如互補決定區(CDR))的特異性和親和力的胺基酸殘基的抗體部分。藉由抗體的「抗原結合片段」用語，其旨在指出任何肽、多肽或蛋白質，其保留與該抗體的標靶(也通常稱為抗原)結合的能力，通常是相同的表位，並包含抗體的胺基酸序列的至少5個鄰接胺基酸殘基、至少10個鄰接胺基酸殘基、至少15個鄰接胺基酸殘基、至少20個鄰接胺基酸殘基、至少25個鄰接胺基酸殘基、至少40個鄰接胺基酸殘基、至少50個鄰接胺基酸殘基、至少60個鄰接胺基酸殘基、至少70個鄰接胺基酸殘基、至少80個鄰接胺基酸殘基、至少90個鄰接胺基酸殘基、至少100個鄰接胺基酸殘基、至少125個鄰接胺基酸殘基、至少150個鄰接胺基酸殘基、至少175個鄰接胺基酸殘基或至少200個鄰接胺基酸殘基。在一個特定的實施方案中，該抗原結合片段包含其所衍生之抗體的至少一個CDR。仍然在一個較佳的實施方案中，該抗原結合片段包含其所衍生之抗體的2、3、4或5個CDR，更佳6個CDR。
「抗原結合片段」可選自於由以下組成的群組，但不限於：Fab、Fab'、(Fab') 2、Fv、scFv(sc表示單鏈)、雙-scFv、scFv-Fc片段、Fab2、Fab3、微型抗體、雙抗體、三抗體、四抗體和奈米抗體，以及具有無序肽的融合蛋白，例如XTEN(擴展重組多肽)或PAS基序，以及藉由化學修飾增加半衰期的任何片段，例如添加聚(伸烷基)二醇，例如聚(乙)二醇(「PEG化」)(稱作 Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’) 2-PEG或Fab'-PEG的聚乙二醇化片段)(「PEG」表示聚(乙)二醇)或藉由摻入脂質體，該等片段具有根據本發明的抗體的至少一個CDR特徵。在抗體片段中，Fab具有包括輕鏈可變區和重鏈可變區、輕鏈恆定區和重鏈的第一恆定區(CH1)的結構，且具有一個抗原結合位點。Fab'與Fab的不同之處在於它在重鏈CH1域的C端具有一個包括一個或多個半胱胺酸殘基的鉸鏈區。F(ab')2抗體是在Fab'的鉸鏈區的半胱胺酸殘基形成二硫鍵時所生成的。Fv是僅具有重鏈可變區和輕鏈可變區的最小抗體片段，用於產生Fv片段的重組技術描述於國際公開案WO 88/10649等。在雙鏈Fv(dsFv)中，重鏈可變區和輕鏈可變區藉由二硫鍵彼此連接，在單鏈Fv(scFv)中，重鏈可變區和輕鏈可變區通常藉由肽連接子彼此共價連接。這些抗體片段可藉由使用蛋白酶獲得(例如Fab可藉由用木瓜蛋白酶限制性消化整個抗體獲得，F(ab')2片段可藉由用胃蛋白酶限制性消化獲得)，並且可較佳藉由基因工程技術生產。較佳地，該「抗原結合片段」將構成或將包含其所衍生的抗體的重鏈或輕鏈可變鏈的部分序列，對於標靶，該部分序列足以保持與其來源之抗體相同的結合特異性的抗體和足夠的親和力，較佳為其來源之抗體的親和力的至少等於1/100，以更佳的方式至至少1/10。此類抗體片段可在例如Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)；Myers (ed.), Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, New York: VCH Publisher, Inc.；Huston et al., Cell Biophysics, 22:189-224 (1993)；Plückthun and Skerra, Meth. Enzymol., 178:497-515 (1989)及在Day, E.D., Advanced Immunochemistry, Second Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, NY (1990)找到。
如本案所用的術語「結合(binds)」或「結合(binding)」是指分子之間的相互作用以形成在生理條件下相對穩定的複合物。相互作用可為例如非共價相互作用，包括氫鍵、離子鍵、疏水相互作用及/或凡德瓦相互作用。複合物還可包括藉由共價或非共價鍵、相互作用或力保持在一起的兩個或更多個分子的結合。抗體上的單一抗原結合位點與標靶分子的單一表位(例如VSIG4)之間的總非共價相互作用的強度是該抗體或功能片段對該表位的親和力。抗體對單價抗原的締合( k 1 )對解離( k -1 )之比( k 1 / k -1 )是締合常數 K，這是親和力的度量。 K值因抗體和抗原的不同複合物而異並取決於 k 1 與 k -1 兩者。本案提供的抗體的締合常數 K可使用本案提供的任何方法或熟習此藝者熟知的任何其他方法來測定。一個結合位點的親和力並不總是反映抗體和抗原之間相互作用的真實強度。當含有多個重複抗原決定簇(例如多價VSIG4)的複雜抗原與包含多個結合位點的抗體接觸時，抗體與抗原在一個位點的相互作用將增加在第二個位點發生反應的可能性。多價抗體和抗原之間的此類多重相互作用的強度稱為結合性(avidity)。抗體的結合性可比其個別結合位點的親和力更好地衡量其結合能力。例如，高結合性可補償低親和力，因為有時發現五聚體IgM抗體的親和力低於IgG，但由於其多價性，IgM的高結合性使其能夠有效地結合抗原。用於測定兩個分子是否結合的方法在本領域中是眾所周知的並且包括例如平衡透析、表面電漿體共振等。在一個特定的實施方案中，該抗體或其抗原結合片段與VSIG4結合的親和力比其結合非特異性分子例如BSA或酪蛋白的親和力大至少兩倍。在一個更特定的實施方案中，該抗體或其抗原結合片段僅結合VSIG4。
如本案所用，術語「生物樣本」或「樣本」是指已從生物來源，例如患者或個體獲得的樣本。如本案所用的「生物樣本」特別是指整個生物體或其組織、細胞或組成部分的子集(例如血管，包括動脈、靜脈和毛細血管，體液，包括但不限於血液、血清、黏液、淋巴液、滑液、腦脊液、唾液、羊水、臍帶血、尿液、陰道液和精液)。「生物樣本」另指從整個生物體或其組織、細胞或組成部分的子集或其小部分或一部分製備的勻漿、溶胞產物或提取物。最後，「生物樣本」是指培養基，例如培養生物體的營養肉湯或凝膠，其中含有細胞成分，例如蛋白質或核酸分子。
如本案所述，術語「生物淘選」表示從在噬菌體外殼上展示肽的噬菌體庫中選擇僅在表面上展示具有與標靶分子(例如抗體、酶和細胞表面受體)結合特性的肽的噬菌體的方法。在一個實施方式中，如本案所用的生物淘選包含四個步驟，其中第一步驟是製備噬菌體庫的步驟，第二步驟是捕獲步驟，涉及使噬菌體庫與標靶分子接觸，第三步驟是洗滌步驟，涉及去除未與標靶分子結合的噬菌體，第四步驟是沖提步驟，藉其回收感興趣的噬菌體。在本揭示的實施例中例示了生物淘選的範例。
當在抗體的脈絡中使用時，術語「阻斷」或其語法等效詞是指防止或終止抗體所結合的抗原的生物學活性的抗體。阻斷抗體包括與抗原結合而不引起反應但阻斷另一種蛋白質隨後與該抗原結合或複合的抗體。抗體的阻斷效應可為導致抗原生物活性發生可測量變化的阻斷效應。
術語「細胞增殖性病症」和「增殖性病症」是指與某種程度的異常細胞增殖相關的病症。在一些實施方案中，細胞增殖性病症是腫瘤或癌症。如本案所用的「腫瘤」是指所有贅生細胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的，以及所有癌前和癌細胞和組織。術語「癌症」、「癌性」、「細胞增殖性病症」、「增殖性病症」和「腫瘤」在本案中並不相互排斥。術語「癌症」和「癌性」是指或描述哺乳動物的生理狀況，其特徵通常是不受調節的細胞生長。如本案所用的「癌症」是由生物體中受損細胞的非所欲生長、侵襲和在某些條件下轉移導致的任何惡性腫瘤。導致癌症的細胞在遺傳上受損，並且通常已經失去了控制細胞分裂、細胞遷移行為、分化狀態及/或細胞死亡機制的能力。大多數癌症形成腫瘤，但一些造血系統癌症(例如白血病)不會。因此，如本案所用的「癌症」可包括良性和惡性癌症。如本案所用的術語「癌症」特別是指可藉由本揭示的人類抗體治療的任何癌症，沒有任何限制。其範例包括肝癌、乳癌、腎癌、腦腫瘤、膽道癌、食道癌、胃癌、結腸癌、大腸直腸癌、鼻咽癌、喉癌、肺癌、升結腸癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、白血病、霍金森氏症、淋巴瘤和多發性骨髓瘤血癌，但不限於此。
「化療劑」是用於治療癌症的化學或生物藥劑(例如包括小分子藥物或生物製劑的藥劑，例如抗體或細胞)，無論作用機制如何。化療劑包括用於靶向治療和常規化療的化合物。化療劑包括但不限於烷化劑、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、有絲分裂抑制劑、染色質功能抑制劑、抗血管生成劑、抗雌激素、抗雄激素或免疫調節劑。
術語「嵌合」抗體是指重鏈及/或輕鏈的一部分衍生自特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈的其餘部分衍生自不同來源或物種的抗體。在一個實施方案中，「嵌合抗體」是恆定區或其一部分被改變、替換或交換，使得可變區連接到不同物種的恆定區或屬於另一個抗體類別或亞類的恆定區的抗體。在另一個實施方式中，「嵌合抗體」是可變區或其一部分被改變、替換或交換，使得恆定區連接到不同物種的可變區或屬於另一個抗體類別或亞類的可變區的抗體。
如本案所用，「CDR」是指免疫球蛋白(Ig或抗體)VH β-褶板框架的非框架區內的三個高度可變區(H1、H2或H3)之一者，或抗體VL β-褶板框架的非框架區內的三個高度可變區(L1、L2或L3)之一者。因此，CDR是散佈在框架區序列內的可變區序列。CDR區係熟習此藝者眾所知悉的，並已由例如Kabat定義為抗體可變(V)域內具有最高度可變性的區(Kabat et al.(1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616; Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75)。Kabat CDR是以序列可變性為基礎，而且是最常用的(Kabat eta/.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD)。Chothia則指的是結構環的位置(Chothia and Lesk (1987) J Mol. Biol. 196:901-917)。Chothia在結構上也將CDR區序列定義為那些不屬於保守β-褶板框架的殘基，因此能夠採用不同的構形(Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917)。當使用Kabat編號慣例來編號時，取決於環的長度，Chothia CDR-H1環的末端在H32和H34之間變化(這是因為Kabat編號方案將插入處置於H35A和H35B；假使 35A和35B都不存在，則環在32處結束；假使僅存在35A，則環在33處結束；假使35A和35B都存在，則環在34處結束)。這兩個命名法在本領域中都是公認的。AbM、Contact和IMGT也都定義了CDR區序列。AbM高度可變區代表Kabat CDR和Chothia結構環之間的折衷，並被Oxford Molecular的AbM抗體建模軟體使用。「接觸」高度可變區是基於對可用複雜晶體結構的分析。近來，一種通用編號系統已經開發出來並被廣泛採用，即ImMunoGeneTics (IMGT) Information System ®(Lefranc et al.(2003) Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77)。IMGT通用編號已被定義成比較可變域，無論抗原受體、鏈類型或物種[Lefranc M.-P. (1997) Immunol. Today 18: 509；Lefranc M.-P. (1999) The Immunologist 7: 132-136]。在IMGT通用編號中，保守胺基酸總是具有相同的位置，例如半胱胺酸23 (1st-CYS)、色胺酸41 (保守的-TRP)、疏水胺基酸89、半胱胺酸104 (2nd-CYS)、苯丙胺酸或色胺酸118(J-PHE或J-TRP)。IMGT通用編號提供了框架區(FR1-IMGT：位置1至26、FR2-IMGT：39至55、FR3-IMGT：66至104和FR4-IMGT：118至128)和互補決定區：CDR1-IMGT：27至38，CDR2-IMGT：56至65和CDR3-IMGT：105至117的標準化定界。由於間隙代表未佔用的位置，因此CDR-IMGT長度(顯示在方括號之間並由點分隔，例如[8.8.13])成為關鍵訊息。IMGT通用編號係用於2D圖形表示，命名為IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53: 857-883 (2002)；Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2: 21-30 (2007)]，以及IMGT/3D結構-DB中的3D結構[Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32: D208-D210 (2004)]。藉由比較多種結構確定了典型抗體可變域內的CDR位置(Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol.273:927-948 (1997)；Morea et al., Methods20:267-279 (2000))。因為不同抗體中的高度可變區內的殘基數量不同，所以相對於典型位置的額外殘基通常在典型可變域編號方案中的殘基編號旁邊用a、b、c等編號(Al-Lazikani et al.，見上文(1997))。這樣的命名法對於熟習此藝者來說同樣是眾所周知的。
高度可變區可包含如下「延伸的高度可變區」：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96 (L3)和VH中的26-35或26-35A(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。對於該些定義中的各者，可變域殘基根據上文Kabat et al.編號為25。如本案所用，術語「HVR」和「CDR」可互換使用。
如本案所用，「檢查點抑制劑」是指靶向免疫檢查點並阻斷該免疫檢查點功能的分子，例如小分子、可溶性受體或抗體。更具體地，如本案所用的「檢查點抑制劑」是能夠抑制或以其他方式降低免疫檢查點的一種或多種生物活性的分子，例如小分子、可溶性受體或抗體。在一些實施方案中，免疫檢查點蛋白的抑制劑(例如本案提供的拮抗性抗體)可例如藉由抑制或以其他方式降低表現該免疫檢查點蛋白的細胞(例如T細胞)的活化及/或細胞訊息傳導途徑發揮作用，藉此相對於不存在拮抗劑時的生物活性抑制細胞的生物活性。免疫檢查點抑制劑的例子包括小分子藥物、可溶性受體和抗體。
術語「恆定區」或「恆定域」是指輕鏈和重鏈的羧基端部分，其不直接參與抗體與抗原的結合，但表現出各種效應子功能，例如與Fc受體的相互作用。該等術語是指免疫球蛋白分子之具有更保守的胺基酸序列的一部分，其相對於免疫球蛋白的其餘部分可變域，可變域包含抗原結合位點。恆定域含有重鏈的CH1域、CH2域和CH3域以及輕鏈的CL域。
如本案所述，「細胞毒性劑」是指當投藥於一個體時，藉由抑制或阻止細胞功能及/或引起細胞死亡來治療或預防該個體體內細胞增殖的發展，較佳癌症的發展的藥劑。可用於本發明抗體-藥物綴合物的細胞毒性劑包括對細胞增殖具有細胞毒性效應或抑制效應的任何藥劑、其部分或殘基。此類藥劑的範例包括(i)能夠發揮如同微管蛋白抑制劑、有絲分裂抑制劑、拓撲異構酶抑制劑或DNA螯合劑功能的化療劑； (ii)能夠發揮酶促功能的蛋白質毒素； (iii)放射性同位素(放射性核素)。細胞毒性劑可與抗體例如抗VSIG4抗體綴合，以形成免疫綴合物。較佳地，細胞毒性劑在特定條件下例如在酸性條件下從抗體中釋放，藉此治療性地影響標靶細胞，例如藉由阻止其增殖或藉由展現細胞毒性作用。
如本案所用的術語「降低的」是指個體的生物標記例如VSIG4的位準低於其參考值至少1倍(例如1、2、3、4、5、10、20、30、40 , 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 10,000 倍或更多)。「降低的」，當其指的是個體的生物標記例如VSIG4的位準時，亦表示比參考樣本中的位準或相對於該標記的參考值低了至少5%(例如5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%)、95%)、99%)或100%)。
如本案所用的術語「偵測」涵蓋定量或定性偵測。
如本案所用的術語「可偵測探針」或「可偵測試劑」是指提供可偵測訊號的組成物。該術語是指可用於測定樣本或個體中所需分子(例如本案提供的抗體)的存在或出現的物質。可偵測試劑可為能夠被可視化的物質或能夠以其他方式被測定及/或測量(例如藉由定量)的物質。該術語包括但不限於透過其活性提供可偵測訊號的任何螢光團、發色團、放射性標記、酶、抗體或抗體片段等。
如本案所用，「診斷」或「辨識個體患有」是指從體徵和症狀辨識疾病、病況或損傷的的過程。診斷尤其是確定個體是否患有疾病或病痛(例如癌症)的過程。例如藉由偵測與癌症相關的標記例如VSIG4的存在來診斷癌症。
術語「編碼」或其語法等效詞在用於指核酸分子時是指處於其天然狀態或當藉由熟習此藝者熟知的方法操作時可被轉錄以產生mRNA的核酸分子，然後將其轉譯成多肽及/或其片段。反義股是此類核酸分子的互補物，編碼序列可由此推導出來。
藥劑(例如藥物調配物)的「有效量」或「治療有效量」是指在必要的劑量和時間段內有效地在個體中引發期望的生物反應的量。此類反應包括緩解正在治療的疾病或病症的症狀，預防、抑制或延遲疾病或疾病本身的症狀的復發，與不接受治療相比，個體的壽命增加，或預防、抑制或延緩疾病症狀或疾病本身的進展。「有效量」尤其是有效實現所欲治療或預防結果的藥劑的量 更具體地，如本案所用的「有效量」是賦予治療益處的藥劑的量。治療有效量也是藥劑的治療有益效應勝於任何毒性或有害作用的量。
有效量可以一次或多次投藥、施用或劑量來投予。此類遞送取決於許多變異量，包括使用個別劑量單位的時間段、藥劑的生物利用度、投藥途徑等。在一些實施方案中，有效量也指本案提供的抗體的量(例如抗VSIG4抗體)以達到特定的結果(例如抑制免疫檢查點生物活性，例如調節T細胞活化)。在一些實施方案中，該術語是指治療量(例如免疫檢查點抑制劑，諸如例如VSIG4抗體)足以降低及/或改善給定疾病、病症或病況及/或與其相關的症狀的嚴重性及/或持續時間。該術語還涵蓋減少或改善給定疾病、病症或病況的進程或進展，減少或改善給定疾病、病症或病況的復發、發展或發作及/或改進或增強另一種療法的預防或治療效果(例如該免疫檢查點抑制劑以外的療法)。在癌症治療的脈絡下，治療益處意指例如癌症的任何改善，包括下列任何一者或其組合：停止或減緩癌症進程(例如從癌症的一個階段到下一個階段)、停止或延遲癌症症狀或體徵的惡化或劣化，降低癌症的嚴重程度、誘發癌症的緩解、抑制腫瘤細胞增殖、腫瘤大小或腫瘤數量或降低指示癌症的生物標記的位準。在一些實施方案中，抗體的有效量為約0.1 mg/kg (每kg個體體重的抗體mg)至約100 mg/kg。在一些實施方案中，其中提供的抗體的有效量為約0.1 mg/kg、約0.5 mg/kg、約1 mg/kg、3 mg/kg、5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg /kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約45 mg/kg、約50 mg/kg、約60 mg/kg 、約70 mg/kg、約80 mg/kg、約90 mg/kg或約100 mg/kg(或其中的範圍)。
如本案所用的術語「表位」是指抗體結合的抗原區，例如VSIG4多肽或VSIG4多肽片段。較佳地，如本案所用的表位是抗原表面上的局部區域，例如VSIG4多肽或VSIG4多肽片段，其能夠與抗體的一個或多個抗原結合區結合，並且在動物，例如哺乳動物(例如人類)中具有抗原活性或免疫活性，能夠引發免疫反應。具有免疫活性的表位是在動物中引發抗體反應的多肽的一部分。具有抗原活性的表位是抗體結合的多肽的一部分，如同藉由本領域熟知的任何方法，例如藉由免疫試驗法所測定的。抗原表位不一定是免疫性的。抗原通常由分子的化學活性表面基團例如胺基酸組成，並具有特定的三維結構特性以及特定的電荷特性。在某些實施方案中，表位可包括作為分子的化學活性表面基團，例如糖側鏈、磷醯基或磺醯基的決定簇，並且在某些實施方案中，可具有特定的三維結構特性及/或特定的電荷特性。表位可由鄰接殘基或藉由抗原蛋白折疊而靠近的非鄰接殘基形成。由鄰接胺基酸形成的表位通常在暴露於變性溶劑時保留，而由非鄰接胺基酸形成的表位通常在該暴露下丟失。一般而言，抗原具有幾個或許多不同的表位並與許多不同的抗體反應。抗體所結合的表位的測定可藉由熟習此藝者已知的任何表位圖譜技術進行。
術語「全長抗體」、「完整抗體」或「整個抗體」可互換使用，以指示實質上完整形式的抗體，而不是抗體片段。具體而言，如本案所用的「全長抗體」包括該等具有包括Fc區的重鏈和輕鏈者。恆定域可為天然序列恆定域(例如人類天然序列恆定域)或其胺基酸序列變異體。在某些情況下，完整抗體可能具有一種或多種效應子功能。
本案所述的術語「醣苷基化」是指用於將醣苷基遞送至蛋白質的加工方法。進行醣苷基化是藉由醣苷基轉移酶介導的醣苷基與標靶蛋白的絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺或羥離胺酸殘基結合。醣苷基化蛋白質不僅可用作活體組織的構成材料，而且在細胞表面的細胞識別中發揮重要作用。因此，根據本發明，藉由改變本發明的單株抗體或其抗原結合片段的醣苷基化或醣苷基化模式，可獲得抗體的增強效果。
當用於提及抗體時，術語「重鏈」是指約50-70 kDa的多肽鏈，其中胺基端部分包括約120至130個或更多胺基酸的可變區和羧基端部分包括恆定區。根據重鏈恆定區的胺基酸序列，恆定區可為五種不同類型中的一種，稱作α、δ、ε、γ和μ。不同的重鏈大小不同：α、δ和γ含有大約450個胺基酸，而μ和ε含有大約550個胺基酸。當與輕鏈結合時，這些不同類型的重鏈分別產生五類眾所周知的抗體，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包括 IgG的四個亞類，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。重鏈可為人類重鏈。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」和「宿主細胞培養物」可互換使用，是指已引入外源核酸的細胞，包括此類細胞的後代。宿主細胞包括「轉形體」和「經轉形細胞」，其包括初代經轉形細胞和由其衍生的後代，不考慮繼代次數。後代的核酸含量可能與親代細胞不完全一致，但可能含有突變。與在初代經轉形的細胞中篩選或選擇的具有相同功能或生物活性的突變後代係包括在本案中。
「人類抗體」是擁有對應於由人類產生的及/或已經使用如本案揭示的用於製造人類抗體的任何技術製造的抗體的胺基酸序列的抗體。人類抗體的此定義特別排除了包含非人類抗原結合殘基的人源化抗體。可使用本領域已知的各種技術產生人類抗體，包括如本案所揭示的噬菌體展示庫。Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol.,227:381 (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol.,222:581 (1991)。Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)；Boerner et al., J. Immunol.,147(1):86-95 (1991)描述的方法也可用於製備人類單株抗體。另參閱van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol.,5: 368-74 (2001)。人類抗體也可藉由將抗原投予轉基因動物來製備，該轉基因動物已被修飾以回應於抗原攻擊產生此類抗體，但其內源基因座已被停用，例如免疫的外源基因組(參閱例如美國專利號6,075,181與6,150,584，關於XENOMOUSE™技術)。另參閱例如Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,103:3557-3562 (2006) regarding human antibodies generated via a human B-cell hybridoma technology。
「人源化」抗體是指包含衍生自非人類免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。在一個實施方式中，人源化抗體是人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體CDR的殘基被來自非人類物種(供體抗體)例如小鼠、大鼠、兔或具有所欲特異性、親和力及/或能力的非人類靈長類動物。在一些情況下，根據熟習此藝者已知的技術，若干骨架區段殘基(框架稱作FR)可被修飾以保持結合親和力(Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986)。在一些實施方案中，人類免疫球蛋白的FR殘基被相應的非人類殘基取代。在某些實施方案中，人源化抗體將包含至少一個，通常是兩個可變域的實質上全部，其中全部或實質上全部的CDR對應於非人類抗體的CDR，以及全部或實質上全部的FR對應於人類抗體的FR。人源化抗體任擇地可包含抗體恆定區(Fc)的至少一部分，通常是人類免疫球蛋白的。抗體的「人源化形式」，例如非人類抗體，是指已經經歷人源化的抗體。人源化的目標是降低異種抗體例如鼠類抗體的免疫性，以引入人體內，同時保持抗體的完全抗原結合親和力和特異性。對於更多細節，參閱例如Jones et al, Nature 321: 522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)；和Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)。參閱例如Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1 :105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)；和U.S. Pat. Nos. 6,982,321 and 7,087,409
如本案所用，在指稱具有病況的個體時，「辨識」是指評估一個體並確定該個體具有病況例如患有癌症的過程。
如本案所用，術語「免疫檢查點」或「免疫檢查點蛋白」是指由某些類型的免疫系統細胞(例如T細胞)和某些癌症細胞產生的某些蛋白質。此類蛋白質在免疫系統中調節T細胞功能。值得注意的是，彼等有助於監控免疫反應，並可防止 T 細胞殺死癌症細胞。該免疫檢查點蛋白藉由與特定配體相互作用來實現此一結果，這些配體將訊息發送到T細胞中並基本上關閉或抑制T細胞功能。抑制這些蛋白質會導致T細胞功能的恢復和對癌症細胞的免疫反應。檢查點蛋白的例子包括但不限於 CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIGIT、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4(屬於CD2家族分子，在所有NK、γδ和記憶 CD8+ (αβ) T細胞上表現)、CD160(也稱作 BY55)、CGEN-15049、CHK1和CHK2激酶、IDO1、A2aR和各種B7家族配體。
如本案所用的術語「增加的」是指個體的生物標記例如VSIG4的位準高於其參考值至少1倍(例如1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、1000、10,000倍或更多)。「增加的」，當其指的是個體的生物標記例如VSIG4的位準時，亦表示比參考樣本中的位準或相對於該標記的參考值高了至少5%(例如5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%)。
如本案所用，「抑制劑」或「拮抗劑」是指能夠抑制或以其他方式降低標靶蛋白例如上述任何一種免疫檢查點蛋白的一種或多種生物活性的分子。
「單離的(isolated)」抗體是已經從其自然環境的組分中分離出來的抗體。在一些實施方案中，抗體被純化至大於95%或99%的純度，如同藉由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析法(例如離子交換或逆向HPLC)所測定者。對於評估抗體純度的方法的回顧，參閱例如Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)。
「單離的」核酸是指已與其自然環境的組分中分離的核酸分子。單離的核酸包括了內含在通常含有該核酸分子的細胞中的核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或存在於與其天然染色體位置不同的染色體位置。
本案使用的術語「K D」是指特定抗體-抗原相互作用的解離常數，並用作測量抗體對抗原的親和力的指標。較低的K D意指抗體對抗原的更高親和力。
如本案所預期的，生物標記例如VSIG4的「位準」由樣本中，例如從患有癌症的患者收集的樣本中的生物標記的定量值組成。在一些實施方案中，定量值不由實際測量的絕對值組成，而是由考慮使用的試驗格式發生的信噪比得到的最終值及/或考慮用於提高癌症標記位準在不同試驗之間的測量可再現性的校準參考值所組成。在一些實施方案中，生物標記例如VSIG4的「位準」表示為任意單位，因為重要的是相同種類的任意單位在下列之間被比對(i)不同試驗之間、或(ii)患癌症的患者與其他人、或(iii)在不同時間段對同一患者進行的試驗或(iv)在患者樣本中測量的生物標記位準與預定參考值(本案也可稱作「截止」值)。
當用於提及抗體時，術語「輕鏈」是指約25 kDa的多肽鏈，其中胺基端部分包括約100至110個或更多胺基酸的可變區和羧基端部分包括恆定區。輕鏈的大略長度為211至217個胺基酸。基於恆定域的胺基酸序列，有兩種不同的類型，稱作λ或κ。輕鏈胺基酸序列是本領域眾所周知的。輕鏈可為人類輕鏈。
如本案所用的「巨噬細胞」是骨髓免疫細胞，它是單核吞噬細胞系統的一部分。巨噬細胞幾乎存在於身體的所有組織中，其中彼們分化成組織駐留的巨噬細胞，藉此形成特化細胞的網絡，包括肺泡巨噬細胞(肺)、紅髓巨噬細胞(脾)、庫弗細胞(肝)、小膠質細胞(腦)、蘭氏細胞(表皮)、破骨細胞(骨)和組織細胞(結締組織)。巨噬細胞是在循環周邊血液中從單核球分化而來的吞噬細胞和抗原呈現細胞。彼等還在免疫反應的所有階段，包括組織修復階段產生許多重要的細胞激素。彼等藉由活化T淋巴球在先天免疫和適應性免疫中發揮重要作用。
成熟巨噬細胞根據其活化狀態和功能可分為兩個群體，即M1型(古典活化巨噬細胞)和M2型(交替活化巨噬細胞)。M1巨噬細胞，也被稱為「殺傷性巨噬細胞」，其特點是產生高位準的促炎細胞激素，具有介導對病原體的抵抗能力、強大的殺菌性能、產生大量活性氮和氧中間體並促進Th1反應。彼等可在其細胞膜上表現CD80、CD86、CD197、HLA-DR和CD40中的一或多者；有利地，彼等表現多於一種該等標記。M1極化作用是由LPS、IFN-γ和顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)觸發，並導致促炎細胞激素例如 IL-1β、TNF-α、IL-12p70、IL-6、IL- 18和IL-23的分泌。
活化Th2 T淋巴球的巨噬細胞提供抗炎反應，稱作M2巨噬細胞。M2巨噬細胞活化是由真菌細胞、免疫複合物、蠕蟲感染、補體成分、凋亡細胞、巨噬細胞群落刺激因子 (MCSF)、IL-4、IL-13、IL-10和TGF-β誘發。M2巨噬細胞在傷口癒合和組織修復中發揮重要作用。此外，彼等具有促腫瘤功能，包括例如腫瘤侵襲、轉移、腫瘤細胞增殖、腫瘤生長、腫瘤存活、血管新生、抑止適應性或先天性免疫和細胞外基質重塑。M2型巨噬細胞主要分泌精胺酸酶-I、IL-10和TGF-β等其他抗炎細胞激素，其具有減少炎症及促進腫瘤生長和免疫抑制功能的功能。與M2表型相關的細胞表面標記包括CD163、CD206、CD200R、CD209。M2巨噬細胞因此表現一種或多種該些標記；有利地，彼等表現多於一種該些標記。
如本案所用，術語「腫瘤相關巨噬細胞」(TAM)一般是指存在於癌症例如腫瘤的微環境中的巨噬細胞。起源於組織駐留巨噬細胞和循環單核球，TAM可能由多個具有重疊特徵的不同群體組成，這些特徵取決於多種因素，包括微環境中的位置、腫瘤的階段和癌症的類型。基於特定標記的表現，TAM亞群可有利地分類為腫瘤殺滅與腫瘤促進，通常稱作M1/M2巨噬細胞。M1 TAM擁有促炎和抗腫瘤活性(抗腫瘤)，而M2主要參與抑止炎症和促進腫瘤生長(促腫瘤)。TAM主要極化為M2，因此有利於腫瘤生長、血管新生和轉移。
TAM在調節對腫瘤的免疫反應中發揮著重要作用。TAM採用的免疫抑止機制旨在抑制適應性免疫系統，即T細胞和NK細胞的活性。TAM藉由直接與標靶細胞的細胞間相互作用或經由分泌因子來實現。較佳地，TAM利用以下四種不同功能中的至少一種來抑止T細胞介導的免疫性：(1)透過免疫檢查點抑制劑，例如PD-1和CTLA-4的訊息傳導；(2)剝奪局部環境對T細胞活化和功能所必需的營養物質；(3)藉由iNOS表現產生一氧化氮和反應性氮物種；(4)產生反應性氧。更佳地，這些作用最終導致抗腫瘤T細胞的效應和數量減少，同時增強支持腫瘤的調節性T細胞的數量。
如本案所用，術語「單株抗體」表示衍生自幾乎同質的抗體群體的抗體，其中群體包含相同的抗體，除了可以最小比例發現的一些可能的天然發生的突變。單株抗體源於單個細胞選殖體，例如雜交瘤的生長，其特徵在於一類和亞類的重鏈和一種類型的輕鏈。如本案所用，當將抗體呈現給單株抗體時，其顯示出與單一抗原位點(即單一表位)的特異性結合。單株抗體可藉由相應技術領域公知的各種方法製備。
如本案所述，術語「PEG化」是指藉由將聚乙二醇引入上述單株抗體或其抗原結合片段來增加抗體在血液中的滯留時間的加工方法。具體而言，藉由用聚乙二醇對聚合物奈米粒子進行PEG化，奈米粒子表面的親水性提高，據此，藉由防止被包括巨噬細胞在內以致使對從外部引入的病原體、廢物和異質材料的吞噬和消化的免疫活性在人體內識別的所謂的隱形效應，可防止在生物體內的快速降解。因此，可藉由聚乙二醇化增加抗體在血液中的滯留時間。本發明所採用的聚乙二醇化可藉由基於透明質酸的羧基和聚乙二醇的胺基之間的鍵形成醯胺基的方法進行，但不限於此，聚乙二醇化可藉由各種方法進行。此時，作為待使用的聚乙二醇，較佳使用具有100至1,000的分子量和直鏈或支鏈結構的聚乙二醇，但沒有特別限定。
如本案所用，核酸或胺基酸的兩條序列之間的「百分比同一性」或「%同一性」是指在最佳對齊後獲得的待比對的兩條序列之間相同核苷酸或胺基酸殘基的百分比，此百分比為純粹是統計的，兩個序列之間的差異沿其長度隨機分佈。兩個核酸或胺基酸序列的比對在傳統上是藉由將該等序列以最佳方式對齊之後，比對該等序列來進行的，該比對能夠藉由片段或藉由使用「對齊窗口」來執行。除了手動比對之外，還可藉由熟習此藝者已知的方法將用於比對的序列以最佳方式對齊。
對於展現與參考胺基酸序列有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列，較佳範例包括含有參考序列、某些修飾，特別是至少一個胺基酸的缺失、添加或取代，截短或延伸的那些。在取代一個或多個鄰接或非鄰接胺基酸的情況下，較佳的取代是其中被取代的胺基酸被「等效」胺基酸置換。在此，「等效胺基酸」用詞意指任何可能取代結構胺基酸之一但不改變相應抗體和下文定義的那些具體實施例的生物活性的胺基酸。等效胺基酸可根據其與取代其的胺基酸的結構同源性或根據可能產生的各種抗體之間的生物活性比對測試的結果來確定。
作為一個非限制性範例，下表1總結了可能進行的可能取代，而不會導致相應修飾的抗原結合蛋白的生物學活性的顯著改變；在相同條件下自然可進行反向取代。 表1
原始殘基 取代
Ala (A) Val、Gly、Pro
Arg (R) Lys、His
Asn (N) Gln
Asp (D) Glu
Cys (C) Ser
Gln (Q) Asn
Glu (E) Asp
Gly (G) Ala
His (H) Arg
Ile (I) Leu
Leu (L) Ile、Val、Met
Lys (K) Arg
Met (M) Leu
Phe (F) Tyr
Pro (P) Ala
Ser (S) Thr, Cys
Thr (T) Ser
Trp (W) Tyr
Tyr (Y) Phe、Trp
Val (V) Leu、Ala
如本案所用的術語「藥學上可接受的」是指由聯邦或州政府的監管機構批准，或在美國藥典、歐洲藥典或其他公認的藥典中列出用於動物，更特別是用於人類。更具體地，當提及載劑時，「藥學上可接受的」用詞是指載劑與組成物的其他成分相容並且對其接受者無害。據此，如本案所用，「藥學上可接受的載劑」用詞是指不抑制用於投藥的化合物的生物活性和特性且不刺激活生物體的載劑或稀釋劑。載劑的類型可基於預期的投藥途徑選擇。使用的各別載劑的量可在本領域常規的範圍內變化。作為製備成液體溶液的組成物中的藥學上可接受的載劑，可使用生理鹽水、無菌水、緩衝鹽水、白蛋白注射液、葡萄糖溶液、麥芽糖糊精溶液、甘油及其之一或多者的混合物作為適用於活生物體的無菌載劑。必要時可加入抗氧化劑、緩衝液、抑菌劑等常用添加劑。此外，藉由另外添加稀釋劑、分散劑、表面活性劑、黏合劑或潤滑劑，該組成物可製備成注射用調配物，比如水溶液、懸浮液和乳劑，丸劑、膠囊、粒劑或錠劑。
如本案所用，術語「多株抗體」是指在一種或多種其他不同抗體之間或存在下產生的抗體。一般來說，多株抗體是在幾個其他B淋巴球產生的不同抗體存在的情況下從B淋巴球產生的。通常，多株抗體直接從免疫動物中獲得。
如本案所用，術語「參考值」是指參考樣本中所考慮的生物標記(例如VSIG4)的表現位準。如本案所用的「參考樣本」是指從已知沒有疾病的個體，較佳兩個或多個個體，或者從一般人群中獲得的樣本。生物標記的適宜參考表現位準可藉由在幾個適宜的個體中測量該生物標記的表現位準來測定，此類參考位準可針對特定的個體群體調整。參考值或參考位準可為絕對值；相對值；具有上限或下限的值；一系列的值；平均的值(average value)；中位值、平均值(mean value)或與特定對照組或基線值相比的值。參考值可基於個別樣本值，例如從來自被測個體的樣本中獲得的值，但是在較早的時間點。參考值可基於大量樣本，例如來自實足年齡匹配組的個體群體，或者基於包括或排除待測試樣本的樣本池。
可經受本案所述方法的「個體」可為任何哺乳動物，包括人、狗、貓、牛、山羊、豬、豚、綿羊和猴子。人類個體可稱為患者。在一個實施方式中，「個體」或「有需要的個體」是指患有癌症或懷疑患有癌症或已被診斷患有癌症的哺乳動物。如本案所用，「患有癌症的個體」是指患有癌症或已被診斷患有癌症的哺乳動物。「對照組個體」是指未患有癌症且未懷疑患有癌症的哺乳動物。
如本案所用，「治療」個體中的疾病或「治療」患有疾病的個體是指使個體經受醫藥治療，例如投予藥物，俾使降低或防止疾病的程度。例如，治療致使疾病或病況的至少一種體徵或症狀減少。治療包括(但不限於)投予組成物，例如醫藥組成物，並且可預防性地或在病理事件開始後進行。治療可能需要不止一次投予藥劑及/或治療。
抗體的「可變區」或「可變域」是指抗體重鏈或輕鏈的胺基端區域。重鏈的可變域可稱作“V H”。輕鏈的可變域可稱作“V L”。這些域通常是抗體最可變的部分並含有抗原結合位點。
術語「載體」是指用於將核酸分子引入宿主細胞的物質。具體而言，如本案所用，「載體」是能夠繁殖與其連接的另一個核酸分子的核酸分子。載體的一個例子是「質體」，其指的是一個環狀雙股 DNA環，其中可接合額外的DNA片段。載體的另一個例子是病毒載體，其中額外的DNA片段可接合到病毒基因組中。 某些載體能夠在引入其宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其他載體(例如非附加型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞後整合到宿主細胞的基因組中，藉此與宿主基因組一起複製。因此，術語「載體」包括作為自我複製核酸結構的載體以及併進已引入該載體的宿主細胞基因組中的載體。適用的載體包括，例如，表現載體、質體、噬菌體載體、病毒載體、游離基因體和人工染色體，該等可包括可操作用於穩定整合到宿主細胞染色體中的選擇序列或標記。
某些載體能夠指導與其有效連接的基因的表現。此類載體在本案中稱作「重組表現載體」(或簡稱為「表現載體」)。通常，用於重組DNA技術的表現載體是質體的形式。在本說明書中，「質體」和「載體」可互換使用，因為質體是最常用的載體形式。然而，本發明意在包括下列形式的表現載體，例如細菌質體、YAC、黏粒、逆轉錄病毒、EBV衍生的游離基因體，以及熟習此藝者已知的便於確保表現感興趣抗體(例如抗VSIG4抗體)的重鏈及/或輕鏈的所有其他載體。技術人員將認識到編碼重鏈和輕鏈的多核苷酸可選殖到不同的載體或相同的載體中。
載體可包括一種或多種選擇標記基因和適當的表現控制序列。可包括的選擇性標記基因，例如，提供對抗生素或毒素的抗性、補充營養缺陷或提供不在培養基中的關鍵營養素。表現控制序列可包括本領域熟知的構成型和誘發型啟動子、轉錄增強子、轉錄終止子等。當要共表現兩種或更多種核酸分子(例如抗體重鏈和輕鏈兩者)時，可將兩種核酸分子插入例如單一表現載體或單獨的表現載體中。對於單一載體表現，編碼核酸可操作地連接到一種共同的表現控制序列或連接到不同的表現控制序列，例如一個誘發型啟動子和一個構成型啟動子。可使用本領域公知的方法來確認核酸分子被引入宿主細胞。此類方法包括例如核酸分析，例如mRNA的北方墨點法或聚合酶鏈反應(PCR)擴增，或用於基因產物表現的免疫墨點法，或用以測試引入的核酸序列或其相應的基因產物表現的其他適宜的分析方法。熟習此藝者應理解，核酸分子以足夠量表現以產生所欲產物(例如抗VSIG4抗體)，並且進一步理解可使用本領域熟知的方法最佳化表現位準以獲得足夠的表現。
術語「VSIG4」或「VSIG4多肽」和類似術語是指由人類V組和第4型含有免疫球蛋白域(VIG4)基因編碼的多肽(「多肽」、「肽」和「蛋白質」在本案中可互換使用)，其位於人類X染色體的著絲粒周圍區域，在本領域中也稱為免疫球蛋白超家族蛋白Z39IG、Z39IG、免疫球蛋白超家族的補體受體CRIg。VSIG4基因序列可例如由具有GenBank登錄號的序列表示，例如No.NM_007268.2、NM_001100431.1、NM_001184831.1、NM_001184830.1或NM_001257403.1。
VSIG4(V組和第4型含Ig域)是一種包含V組和免疫球蛋白域的蛋白質，在結構上與B7免疫調節蛋白家族相關。在人類中，有兩種不同形式的VSIG4蛋白。長的形式含有恆定(C2型)和可變(V型)免疫球蛋白域，而短的形式僅包含V型免疫球蛋白域，沒有C2型。這兩種形式如圖1A所示。在一個實施方式中，人類VSIG4蛋白具有由Uniprot登錄號Q9Y279的序列表示的序列。在一個實施方式中，人類VSIG4蛋白的長形式具有由Uniprot登錄號Q9Y279-1的序列表示的序列。較佳地，VSIG4的長形式具有SEQ ID No. 1列示的序列。在一個實施方式中，人類VSIG4蛋白的短形式具有由Uniprot登錄號Q9Y279-3的序列表示的序列。較佳地，VSIG4的短形式具有SEQ ID No. 2列示的序列。
VSIG4係作用如同補體受體，藉由與補體iC3b和C3b片段結合在功能上抑制補體活性，藉此介導C3b助噬的病原體的清除。已觀察到VSIG4表現僅限於組織巨噬細胞，並且已顯示其回應於脂多醣(LPS)而被向下調控(Vogt et al. (2006) J. of Clin. Invest. 116:2817)。另一方面，VSIG4在TAM中係高度表現(Lee et al. (2006) J Leukoc Biol. 80(4): 922-928；Xia et al. (2020) JCI Insight. 5(18): e141115)。
VSIG4是免疫檢查點蛋白，具有抗炎和免疫抑止特性。可溶性VSIG4融合蛋白抑制炎症(Small et al., Swiss Med Wkly. (2016) 146: w14301)， 而 VSIG4-缺乏症會引發巨噬細胞介導的炎症(Liao et al. (2014) Lab. Invest. 94:706)。VSIG4對巨噬細胞活化的此抑制似乎與C3b無關(Li et al. (2017) Nat Commun. 8(1):1322)。VSIG4 在T細胞活化上具有調節功能(Vogt et al. (2006) J. of Clin. Invest. 116: 2817；Xu et al. (2010) Immunol Lett. 128(1):46-50；Jung et al. (2012) Hepatology. 56(5): 1838-48; Jung et al. (2015) Immunol Lett. 165(2):78-83；Munawara et al. (2019) Front Immunol. 10:2892)。值得注意的是，VSIG4藉由結合未識別的T細胞配體受體而成為T細胞增殖和IL-2產生的強力負向調節劑(Vogt et al. (2006) J. of Clin. Invest. 116:2817)。
與許多免疫檢查點蛋白一樣，VSIG4活性是藉由促進免疫耐受性來促進腫瘤生長。 Vsig4-缺失小鼠的腫瘤比野生型更小，這表明VSIG4的缺失會活化免疫反應，藉此阻止腫瘤的生長。在診斷為非小細胞肺癌的患者中觀察到表現VSIG4的巨噬細胞大量浸潤到腫瘤微環境中(Liao et al. (2014) Lab. Invest. 94:706)。VSIG4基因在肺癌、卵巢癌、乳癌、肝癌和多發性黑色素瘤等多種癌細胞係過度表現，並像致癌基因一樣抑止免疫反應並促進腫瘤進程。高度的VSIG4表現確實與高級別膠質瘤和患者預後不良有關(Xu et al. (2015) Am. J. Transl. Res. 7: 1172)。 抗 VSIG4 抗體
免疫檢查點在生理條件下在維持自我耐受性及限制免疫介導的組織損傷方面扮演至關重要的角色。VSIG4是屬於B7相關免疫球蛋白超家族的第I型跨膜蛋白，在組織駐留巨噬細胞和腫瘤相關巨噬細胞中高度表現。VSIG4是一種共抑制配體，其經由抑制CD4 +和CD8 +T細胞增殖和IL-2產生來負向調節T細胞活化。已知兩種形式的VSIG4，一種長型(huVSIG4(L))和一種短型(huVSIG4(S))，該等的區別在於長型存在有IgC型免疫球蛋白域的膜近端域。
本發明人現已顯示兩種形式均在M2巨噬細胞中表現。值得注意的是，這兩種形式都在腫瘤中表現。此外，這兩種形式都具有功能性：huVSIG4(L) 或 huVSIG4(S)的可溶性版本抑制人類CD4 +和CD8 +T細胞活化，藉由抑制T細胞增殖和IFNγ產生已證實。因此，VSIG4的長形式和短形式都有助於蛋白質的調節活性，這意味著兩者都必須被抑制以緩解免疫抑止作用。
本揭示提供了與人類VSIG4特異性結合的新穎單株抗體。更具體地，與現有技術的抗體(例如WO 2020/069507)相比，本揭示提供能夠結合蛋白質的長形式和短形式兩者的新穎單株抗體。
發明人已經發現用本案揭示的抗VSIG4抗體實現了有效的VSIG4阻斷。事實上，這些抗體以C3b或iC3b來拮抗VSIG4相互作用。此外，本案揭示的抗體藉由表現VSIG4的巨噬細胞調節VSIG4抗炎活性，如同其觸發促炎細胞激素釋放，同時阻斷抗炎細胞激素分泌的能力所證明的。本發明抗體亦干擾VSIG4誘發的表現VSIG4的巨噬細胞對T細胞反應的免疫抑制。在共培養模型中獲得的初步結果確認了對VSIG4抗炎和免疫抑止功能的抑制，在體外試驗所證實的。目前的抗VSIG4抗體誘發巨噬細胞(尤其是TAM)極化為 M1表型，釋放相關的促炎細胞激素並誘發T細胞活化，藉此促進殺傷癌細胞。因此，本案揭示的抗VSIG4抗體促進巨噬細胞，尤其是TAM極化為M1表型，藉此賦予保護性抗腫瘤免疫性。
因此，本案揭示的抗VSIG4抗體可用於在癌症患者中產生抗腫瘤免疫反應。
在第一態樣中，本揭示提供能夠特異性結合至人類VSIG4的單株抗體或其抗原結合片段。在一個實施方案中，該抗體能夠結合人類VSIG4的長形式和VSIG4的短形式。在一個實施方案中，人類VSIG4蛋白的長形式具有SEQ ID No. 1列示的序列。在一個實施方案中，人類VSIG4蛋白的短形式具有SEQ ID No. 2列示的序列。
如本案所用的抗-VSIG4單株抗體包括但不限於合成抗體、重組產生的抗體、多特異性抗體(包括雙特異性抗體)、人類抗體、人源化抗體、駱駝化抗體、嵌合抗體、胞內抗體、抗獨特型(抗-Id)抗體和上述任何一者的功能性片段。抗VSIG4單株抗體可為人類或非人類來源的。非人類來源的抗VSIG4抗體的範例包括但不限於哺乳動物來源的那些(例如猿猴、囓齒動物、山羊和兔)。由於人類抗體的每一個結構都源自於人類，因此與常規人源化抗體或小鼠抗體相比，產生免疫反應的可能性很小，因此其具有在投予人類時不會引起任何不良免疫反應的優點。因此，其可非常有利地用作治療用抗體。因此，用於人類治療用途的抗-VSIG4單株抗體較佳是人源化的或完全人類的。更佳地，彼等為完全人類的。
根據本發明的一個實施方案，本案所述的抗體是本發明人藉由噬菌體顯示法對初始人類單鏈Fv庫進行生物淘選而產生的特異性地結合至VSIG4的人類抗體。
在噬菌體顯示法中，功能性抗體域係顯示在攜帶編碼該等的多核苷酸序列的噬菌體顆粒的表面上。特別是，編碼V H域和V L域是從動物cDNA庫(例如受影響組織的人類或鼠的cDNA庫)擴增。編碼V H域和V L域的DNA是藉由PCR與scFv連接子重組在一起並選殖到噬菌粒載體中。載體被電穿孔進入大腸桿菌中，該大腸桿菌被感染輔助噬菌體。這些方法所使用的噬菌體通常是絲狀噬菌體，包括 fd和M13，V H域和V L域通常與噬菌體基因III或基因VIII重組融合。可用抗原選擇或識別表現與特定抗原結合的抗原結合域的噬菌體，例如使用經標記抗原或是結合或捕獲到固體表面或珠粒的抗原。可用於製造本案提供的抗體的噬菌體顯示法的範例包括揭示在下列的那些：Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50；Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186；Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958；Persic et al., 1997, Gene 187:9-18；Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57:191-280；PCT/GB91/01134；WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/1 1236、WO 95/15982、WO 95/20401與WO97/13844；及美國專利號5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743與5,969,108。
如以上參考文獻所述，在噬菌體選擇之後，可單離來自噬菌體的抗體編碼區並用於生成完整的抗體，包括人類抗體，或任何其他所欲的抗原結合片段，並在任何所欲的宿主中表現，包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母和細菌， 例如下文所述者。也可使用本領域已知的方法運用重組生產Fab、Fab'和F(ab’) 2片段的技術，例如PCT公開案號WO 92/22324；Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12(6):864-869；Sawai et al., 1995, AJRI 34:26-34與Better et al., 1988, Science 240:1041-1043。
為了生成完整的抗體，包括VH或VL核苷酸序列、限制性位點和用於保護限制性位點的側翼序列的PCR引子可用於擴增scFv選殖體中的V H或V L序列。利用熟習此藝者已知的選殖技術，可將PCR擴增的VH域選殖到表現VH恆定區的載體中，例如人類γ4恆定區，並可將PCR擴增的VL域選殖到表現VL恆定區的載體中，例如人類κ或λ恆定區。也可將VH域和VL域選殖到一個表現必需恆定區的載體中。然後使用熟習此藝者已知的技術將重鏈轉換載體和輕鏈轉換載體共轉染到細胞系中，以生成表現全長抗體的穩定或瞬時細胞系，例如IgG。
根據上述方法產生的抗體是對抗原的親和力經增強的抗體。術語「親和力」是指特異性識別和結合至特定抗原位點的性質，連同與抗體對抗原的特異性，高親和力是免疫反應中的重要因素。在本發明中，藉由重鏈可變區的隨機突變來產生人源化重鏈庫細胞，對該等庫細胞進行菌落轉移試驗，篩選出具有高度抗原結合性質的第一變異選殖體。藉由對選擇的選殖進行競爭性ELISA，檢查各個選殖體的親和力。除了此方法外，還可運用各種測量對抗原的親和力的方法，表面電漿體共振技術是該等方法的一個範例。
在一個實施方案中，本案揭示的抗VSIG4單株抗體係特異性地結合至VSIG4蛋白內的表位。具體而言，可藉由測定哪些VSIG4殘基在被突變時無法進行抗體結合來辨識出與本發明抗體結合的表位。在一個實施方式中，VSIG4是長的變異體。在另一個實施方式中，VSIG4是短的變異體。
較佳地，本案揭示的抗體是與一個或多個表位中的至少一個胺基酸結合的抗體，該表位選自於由以下組成的群組： a) 表位M1，包含SEQ ID No. 2所列示序列的殘基E24、V25、E27、V29及/或T30； b) 表位M2，包含SEQ ID No. 2所列示序列的殘基D36、N38、L39及/或T42； c) 表位M3，包含SEQ ID No. 2所列示序列的殘基Q59、G61、S62、D63及/或V65； d) 表位M4，包含SEQ ID No. 2所列示序列的殘基I77、A80、Y82及/或Q83； e) 表位M5，包含SEQ ID No. 2所列示序列的殘基H87、H90、K91及/或V92； f) 表位M6，包含SEQ ID No. 2所列示序列的殘基S97、Q99、S101及/或T102； g) 表位M7，包含SEQ ID No. 2所列示序列的殘基R108、S109、H110、T112及/或E114； h) 表位M8，包含SEQ ID No. 2所列示序列的殘基T119、P120、D121、N123、Q124及/或V125。
更佳地，本案揭示的抗體是結合M7中的至少一個胺基酸及/或M8中的至少一個胺基酸的抗體。
可藉由熟習此藝者已知的任何方法或技術，例如但不限於放射性、Biacore、ELISA、流式細胞術等或根據如本說明書所述的方法進行對於抗VSIG4抗體結合至表位之結合的測定。
在一個實施方案中，本案揭示的抗VSIG4單株抗體包含三個重鏈CDR和三個輕鏈CDR。較佳地，抗體包含重鏈和輕鏈，其中重鏈包含三個重鏈CDR，輕鏈包含三個輕鏈CDR。
較佳地，本案揭示的抗體包含三個重鏈CDR和三個重鏈CDR，其中各個CDR的序列選自於SEQ ID Nos. 3-14所列示序列的群組。
在一個實施方案中，抗VSIG4抗體包含三個重鏈CDR，其包含選自於由以下組成的群組的序列：SEQ ID Nos. 3、4、5、9、10和11。
在一個實施方案中，抗VSIG4抗體包含三個輕鏈CDR，其包含選自於由以下組成的群組的序列：SEQ ID Nos. 6、7、8、12、13和14。
一較佳的實施方案提供了抗VSIG4抗體，該抗體具有包含三個重鏈CDR的重鏈，其包含選自於由以下組成的群組的序列：SEQ ID Nos. 3、4、5、9、10和11。
另一較佳的實施方案提供了抗VSIG4抗體，該抗體具有包含三個輕鏈CDR的輕鏈，其包含選自於由以下組成的群組的序列：SEQ ID Nos. 6、7、8、12、13和14。
在另一個較佳的實施方案中，抗VSIG4抗體包含三個重鏈CDR和三個輕鏈CDR，該等重鏈CDR包含選自於由以下組成的群組的序列：SEQ ID Nos. 3、4、5、9、10和11，該等輕鏈CDR包含選自於由以下組成的群組的序列：SEQ ID Nos. 6、7、8、12、13和14。
在又另一個較佳的實施方案中，抗VSIG4抗體包含一重鏈和一輕鏈，該重鏈包含三個重鏈CDR，其中該等重鏈CDR包含選自於由以下組成的群組的序列：SEQ ID Nos. 3、4、5、9、10和11，該輕鏈包含三個輕鏈CDR，其中該等輕鏈CDR包含選自於由以下組成的群組的序列：SEQ ID Nos. 6、7、8、12、13和14。
更佳地，本案揭示的抗體選自於由以下組成的群組： a)  一包含以下的抗體：序列SEQ ID Nos. 3、4和5的三個重鏈CDR和序列SEQ ID Nos. 6、7和8的三個輕鏈CDR；以及 b) 一包含以下的抗體：序列SEQ ID Nos. 9、10和11的三個重鏈CDR和序列SEQ ID Nos. 12、13和14的三個輕鏈CDR。
在較佳但非限制性的實施方案中，本發明的抗體選自於由以下組成的群組： a) 一包含以下的抗體：具有序列SEQ ID No. 45或展現與SEQ ID No. 45至少80%、85%、90%、95%或98%同一性之任何序列之重鏈可變域以及具有序列SEQ ID Nos. 6、7和8之三個輕鏈CDR；以及 b) 一包含以下或由以下組成的抗體：具有序列SEQ ID No. 47或展現與SEQ ID No. 47至少80%、85%、90%、95%或98%同一性之任何序列之重鏈可變域以及具有序列SEQ ID Nos. 12、13和14之三個輕鏈CDR。
「展現與SEQ ID No. 45至少80%，較佳85%、90%、95%或98%同一性之任何序列」意指展現三個重鏈CDR SEQ ID Nos. 3、4和5之序列以及，此外，在對應於該等CDR(即SEQ ID Nos. 3、4和5)的序列外部係展現與完整序列SEQ ID No. 45至少80%，較佳85%、90%、95%或98%同一性，其中「在對應於該等CDR的序列外部」旨在「除了對應於該等CDR的序列」。
在另一個較佳但非限制性的實施方案中，本發明的抗體選自於由以下組成的群組： a)  一包含以下的抗體：具有序列SEQ ID No. 46或展現與SEQ ID No. 46至少80%、85%、90%、95%或98%同一性之任何序列之輕鏈可變域以及具有序列SEQ ID Nos. 3、4和5之三個重鏈CDR； b) 一包含以下的抗體：具有序列SEQ ID No. 48或展現與SEQ ID No. 48至少80%、85%、90%、95%或98%同一性之任何序列之輕鏈可變域以及具有序列SEQ ID Nos. 9、10和11之三個重鏈CDR。
「展現與SEQ ID No. 46至少80%，較佳85%、90%、95%或98%同一性之任何序列」意指展現三個輕鏈CDR SEQ ID Nos. 6、7和8之序列以及，此外，在對應於該等CDR(即SEQ ID Nos. 6、7和8)的序列外部係展現與完整序列SEQ ID No. 46至少80%，較佳85%、90%、95%或98%同一性。
本揭示的實施方案關於識別VSIG4的抗體並選自於由以下組成的群組： a) 一包含以下的抗體：具有序列SEQ ID No. 45或展現與SEQ ID No. 45至少80%、85%、90%、95%或98%同一性之任何序列之重鏈可變域，以及具有序列SEQ ID No. 46或展現與SEQ ID No. 46至少80%、85%、90%、95%或98%同一性之任何序列之輕鏈可變域；以及 b) 一包含以下的抗體：具有序列SEQ ID No. 47或展現與SEQ ID No. 47至少80%、85%、90%、95%或98%同一性之任何序列之重鏈可變域，以及具有序列SEQ ID No. 48或展現與SEQ ID No. 48至少80%、85%、90%、95%或98%同一性之任何序列之輕鏈可變域。
根據本發明的一個實施方式的特異性地結合至VSIG4的單株抗體或其抗原結合片段較佳是選自於由以下組成的群組的抗體： a) 一包含以下的抗體：由胺基酸序列SEQ ID NO: 45所述之重鏈可變區和由胺基酸序列SEQ ID NO: 46所述之輕鏈可變區；以及 b) 一包含以下的抗體，由胺基酸序列SEQ ID NO: 47所述之重鏈可變區和由胺基酸序列SEQ ID NO: 48所述之輕鏈可變區。
為更清楚起見，下表2例示較佳抗體的序列(CDR、框架、V H與V L)和由這些抗體中的各者結合的表位。
表2 抗VSIG4抗體
Mab CDRs FR VH和VL 表位
SA2281 VH CDR 1.2281 GFTFSTYA SEQ ID NO. 3 H-FR1.2281: SEQ ID NO.21 H-FR2.2281: SEQ ID NO.22 H-FR3.2281: SEQ ID NO.23 H-FR4.2281: SEQ ID NO.24 L-FR1.2281: SEQ ID NO.25 L-FR2.2281: SEQ ID NO.26 L-FR3.2281: SEQ ID NO.27 L-FR4.2281: SEQ ID NO.28 VH2281: SEQ ID NO. 45       VL2281: SEQ ID NO. 46 M7
VH CDR 2.2281 VSHDGTYK SEQ ID NO. 4
VH CDR 3.2281 GRHAAGSSFDY SEQ ID NO.5
VL CDR 1.2281 RDISNY SEQ ID NO.6
VL CDR 2.2281 KTS SEQ ID NO.7
VL CDR 3.2281 QQSYRTPYT SEQ ID NO.8
SA2297 VH CDR 1.2297 GFIFSDYY SEQ ID NO.9 H-FR1.2297: SEQ ID NO.29 H-FR2.2297: SEQ ID NO.30 H-FR3.2297: SEQ ID NO.31 H-FR4.2297: SEQ ID NO.32 L-FR1.2297: SEQ ID NO.33 L-FR2.2297: SEQ ID NO.34 L-FR3.2297: SEQ ID NO.35 L-FR4.2297: SEQ ID NO.36 VH2297: SEQ ID NO.47       VL2297: SEQ ID NO.48 M7/M8
VH CDR 2.2297 ISPSGYTI SEQ ID NO.10
VH CDR 3.2297 ARRFSSSWSGYFDY SEQ ID NO.11
VL CDR 1.2297 QNINRW SEQ ID NO.12
VL CDR 2.2297 KAF    SEQ ID NO.13
VL CDR 3.2297 QQYLSYSSSI SEQ ID NO.14
SA3981 VH CDR 1.3981 GFTFSDYY SEQ ID NO.15 H-FR1.3981: SEQ ID NO.37 H-FR2.3981: SEQ ID NO.38 H-FR3.3981: SEQ ID NO.39 H-FR4.3981: SEQ ID NO.40 L-FR1.3981: SEQ ID NO.41 L-FR2.3981: SEQ ID NO.42 L-FR3.3981: SEQ ID NO.43 L-FR4.3981: SEQ ID NO.44 VH3981: SEQ ID NO.49       VL3981: SEQ ID NO.50 M7
VH CDR 2.3981 ISSSGSTI SEQ ID NO.16
VH CDR 3.3981 ARGYYYGMDV SEQ ID NO.17
VL CDR 1.3981 SSDVGDYNL SEQ ID NO.18
VL CDR 2.3981 EVS SEQ ID NO.19
VL CDR 3.3981 SSYKTGDTWL SEQ ID NO.20
在能夠特異性識別VSIG4的範圍內，本發明的單株抗體或其抗原結合片段不僅可包括本說明書所述的本發明的抗VSIG4抗體的序列，還可包括其生物學等效物。例如，為了進一步改善抗體的結合親和力及/或其他生物學特性，可對抗體的胺基酸序列進行額外的改變。例如，包括在這些修飾的有抗體的胺基酸序列的缺失、插入及/或取代。胺基酸的那些修飾是基於胺基酸側鏈取代基之間的相對相似性進行的，例如疏水性、親水性、電荷、大小等。藉由對胺基酸側鏈取代基的大小、形狀和類型的分析，發現精胺酸、離胺酸和組胺酸都是帶正電荷的殘基；丙胺酸、甘胺酸和絲胺酸的大小相似；苯丙胺酸、色胺酸和酪胺酸具有相似的形狀。因此，基於該些考量，從生物學上可說精胺酸、離胺酸和組胺酸；丙胺酸、甘胺酸和絲胺酸；苯丙胺酸、色胺酸和酪胺酸是功能性等效物。
在一個實施方案中，本案所述的抗VSIG4單株抗體可為全長抗體、多鏈或單鏈抗體、該等抗體之選擇性結合至VSIG4的片段(包括但不限於Fab、Fab’、(Fab') 2、Fv和scFv)、替代抗體(包括替代輕鏈構築體)、單域抗體、人源化抗體、駱駝化抗體等的形式。彼等也可為任何同型或衍生自任何同型，包括例如IgA(例如IgA1或IgA2)、IgD、IgE、IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)或IgM。在一些實施方案中，抗VSIG4抗體是IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。在一個實施方案中，抗體還包含人類恆定區。在進一步的實施方案中，人類恆定區選自於由以下組成的群組：IgG1、IgG2、IgG2、IgG3和IgG4。在更進一步的具體實施方案中，人類恆定區是IgG1。再者，重鏈恆定區具有γ、μ、α、δ和ε類型，並且作為亞類，具有γ1、γ2、γ3、γ4、α1和α2。輕鏈恆定區具有κ和λ類型。
抗VSIG4抗體包括可用於診斷應用的經標記抗體。抗體可用於診斷，例如，偵測特定細胞、組織或血清中的感興趣標靶的表現；或作為臨床測試程序的一部分，監測免疫反應的發展或進程，例如測定給定治療方案的效力。可藉由將抗體與可偵測物質或「標記」偶合來促進偵測。標記可直接或間接與本揭示的抗VSIG4抗體綴合。標記本身可被偵測到(例如放射性同位素標記、同位素標記或螢光標記)，或者在酶標記的情況下，可催化可偵測的受質化合物或組成物的化學變化。可偵測物質的範例包括各種酶、輔成基、螢光材料、發光材料、生物發光材料、放射性材料、使用各種正電子發射斷層掃描的正電子發射金屬和非放射性順磁性金屬離子。可偵測物質可使用本領域已知的技術直接偶合或綴合到抗體(或其片段)或經由中間體(例如本領域已知的連接子)間接偶合或綴合到抗體。酶標記的範例包括螢光素酶(例如螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶；美國專利號4,737,456)、螢光素、2,3-二氫酞嗪二酮、蘋果酸去氫酶、脲酶、過氧化物酶例如辣根過氧化物酶(HRPO)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、乙醯膽鹼酯酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、醣類氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸去氫酶)、雜環氧化酶(例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化物酶、微過氧化物酶等。適宜的輔成基複合物的範例包括鏈黴抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；適宜的螢光材料的範例包括繖形酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明(rhodamine)、二氯三嗪胺螢光素、丹磺醯氯、二甲胺-1-萘磺醯氯或藻紅蛋白等；發光材料的範例包括流明諾(luminol)；生物發光材料的範例包括螢光素酶、螢光素和水母發光蛋白；適宜的同位素材料的範例包括 13C、 15N和氘；適宜的放射性物質的例子包括 125I、 131I、 111In或 99Tc。 雙特異性抗體
此外，本揭示提供一種多特異性抗體，包括本案揭示的單株抗VSIG4抗體或其抗原結合片段。
本發明的上述多特異性抗體可較佳為雙特異性抗體，但不限於此。
根據本發明的多特異性抗體較佳具有本案所述的抗VSIG4抗體與對免疫效應子細胞特異性標靶分子或其片段具有結合特性的抗體結合的形式。免疫效應子細胞特異性標靶分子較佳為免疫檢查點，但不限於此。免疫效應子細胞特異性標靶分子的範例包括例如 PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、TIGIT、BTLA、KIR、A2aR、VISTA、B7-H3、TCR/CD3、CD16 (FcγRIIIa) CD44 、Cd56、CD69、CD64 (FcγRI)、CD89和CD11b/CD18 (CR3)。
多特異性抗體是能夠同時識別相同抗原或兩或多個不同抗原的不同多(雙或更高)表位的抗體，屬於多特異性抗體的該等抗體可分類為基於scFv的抗體、基於Fab的抗體、基於IgG的抗體等。在多特異性例如雙特異性抗體的情況下，可同時抑止或放大兩個訊息，因此可比抑止/放大一個訊息的情況更有效。與各個訊息分別用訊息抑制劑處理的情況相比，可實現低劑量投藥，並且可在同一空間內同時抑止/放大兩個訊息。
生產雙特異性抗體的方法是眾所周知的。慣常地，雙特異性抗體的重組生產是基於在兩條重鏈具有不同特異性的條件下，兩個免疫球蛋白的一對重鏈/輕鏈的共同表現。
在基於scFv的雙特異性抗體的情況下，藉由組合不同scFv的VL和VH，以異二聚體形式製備基於雜合scFv的抗體以產生雙抗體Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,90:6444, 1993)，並且藉由將不同的scFv相互連接，可產生串聯的ScFv。藉由在各個scFv的末端表現Fab的CH1和CL，可產生異二聚體微型抗體(Muller et al., FEBS lett., 432:45, 1998)。此外，藉由將CH3域的部分胺基酸取代成Fc的同源二聚體域，將結構改變為「旋鈕-孔洞(knob into hole)」形式以具有異二聚體結構，該些經修飾的CH3域在各個不同的scFv末端表現，因此可產生異二聚體scFv形式的微型抗體(Merchant et al., Nat. Biotechnol., 16:677, 1998)。
在基於Fab的雙特異性抗體的情況下，根據藉由利用二硫鍵或中介體的針對特定抗原的單獨Fab'的組合，可產生異二聚Fab形式的抗體，並且藉由在特定Fab的重鏈或輕鏈末端表現不同的scFv抗原，可獲得2的抗原價數。此外，藉由在Fab和scFv之間具有鉸鏈區，可以同源二聚體形式獲得4的抗原價數。此外，在相關領域中已知產生以下的方法：藉由雙標靶雙重體(bibody)，根據在Fab的輕鏈末端和重鏈末端融合不同抗原的scFv，獲得3的抗原價數；藉由參標靶雙重體，根據在Fab的輕鏈末端和重鏈末端融合不同抗原的scFv，獲得3的抗原價數，以及藉由三個不同Fab的化學融合獲得簡單形式的三標靶抗體F(ab') 3。
在基於IgG的雙特異性抗體的情況下，已知Trion Pharma有一種基於小鼠和大鼠雜交瘤的再雜交技術製備雜交的雜交瘤，即所謂的四雜交瘤來生產雙特異性抗體的方法。此外，已知一種生產所謂「孔洞與旋鈕(Holes and Knob)」形式的雙特異性抗體的方法，其中不同重鏈中Fc的CH3同源二聚體域的部分胺基酸被修飾，同時共享輕鏈部分(Merchant et al., Nat. Biotechnol., 16:677, 1998)，並且除了異二聚體形式的雙特異性抗體之外，還已知一種根據將兩種不同的scFv融合到IgG的輕鏈和重鏈的恆定域而不是可變域，然後表現來產生同二聚體形式的(scFv) 4-IgG的方法。此外，ImClone Systems報導，基於IMC-1C11作為人類 VEGFR-2的嵌合單株抗體，僅將小鼠血小板衍生生長因子受體-α的單一可變域融合到抗體輕鏈的胺基端，以便產生雙特異性抗體。此外，Rossi等人報導一種對CD20具有高抗原價數的抗體，其基於所謂的「對接和鎖定(DNL)」方法，使用蛋白激酶A (PKA) R次單元的對接域(DDD)和PKA的錨定域的二聚化(Rossi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:6841, 2006)。 抗體衍生物
本發明的抗VSIG4抗體可進一步經修飾以含有本領域已知且容易獲得的額外的非蛋白質部分。特別地，包括在本案的是抗VSIG4單株抗體，其經衍化、共價修飾或綴合至其他分子以供用於診斷和治療應用。例如，但不限於，衍化抗體包括經修飾的抗體，例如藉由糖基化、乙醯化、聚乙二醇化、磷酸化、醯胺化、藉由已知的保護/封閉基團衍化、蛋白水解切割、與細胞配體或其他蛋白質連接等。可藉由已知技術進行多種化學修飾中的任何一者，包括但不限於特異性化學裂解、乙醯化、甲醯化、衣黴素(tunicamycin)的代謝合成等。此外，衍生物可含有一種或多種非典型胺基酸。
特別地，本發明的單株抗體或其抗原結合片段可接受如上所述的衍化，特別是藉由例如糖基化及/或聚乙二醇化，以提高在被投予抗體的活生物體內的停留時間。
至於糖基化及/或聚乙二醇化，可藉由本領域公知的方法來修飾成各種糖基化及/或聚乙二醇化模式，只要保持本發明抗體的功能即可，而且包括在本發明的抗體中的是被修飾成各種模式的糖基化及/或聚乙二醇化的變異單株抗體或其抗原結合片段。
較佳地，適合衍化抗體的部分是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性範例包括但不限於聚乙二醇 (PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚醣、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1, 3-二氧戊環、聚- l,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)和葡聚醣或聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚合物可為任何分子量，並且可為支鏈或非支鏈的。接附在抗體上的聚合物的數量可能會有所不同，假使接附的聚合物不止一種，彼等可為相同或不同的分子。一般而言，用於衍化的聚合物的數量及/或類型可基於包括但不限於待改進抗體的特定性質或功能、抗體衍生物是否將在規定條件下用於療法中的考量來決定等等。
在一個具體範例中，本揭示的抗VSIG4抗體可接附至聚(乙二醇)(PEG)部分。在一具體實施方案中，抗體是抗體片段且PEG部分是經由位於抗體片段中的任何可用的胺基酸側鏈或末端胺基酸官能基接附，例如任何游離胺基、亞胺基、硫醇、羥基或羧基。此類胺基酸可天然存在於抗體片段中，也可使用重組 DNA方法工程化到該片段中。參閱例如美國專利號5,219,996。多個位點可用於接附兩個或多個PEG分子。PEG部分可藉由位於抗體片段中的至少一個半胱胺酸殘基的硫醇基團共價連接。在使用硫醇基團作為接附點的情況下，可使用適當活化的效應子部分，舉例來說，硫醇選擇性衍生物例如馬來醯亞胺和半胱胺酸衍生物。
在一個具體範例中，抗VSIG4抗體綴合物是經修飾的Fab'片段，其為聚乙二醇化的，具有與其共價接附的PEG(聚(乙二醇))，例如根據EP0948544中揭示的方法。亦參閱Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, (J. Milton Harris (ed.), Plenum Press, New York, 1992)；Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, (J. Milton Harris and S. Zalipsky, eds., American Chemical Society, Washington D.C., 1997)；與Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, (M. Aslam and A. Dent, eds., Grove Publishers, New York, 1998)；與Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54:531-545。PEG可接附到鉸鏈區的半胱胺酸。在一個範例中，經PEG修飾的Fab'片段具有與經修飾鉸鏈區中的單一硫醇基團共價連接的馬來醯亞胺基團。離胺酸殘基可共價連接到馬來醯亞胺基團，並且離胺酸殘基上的各個胺基可接附分子量約為20,000 Da的甲氧基聚(乙二醇)聚合物。因此，接附到Fab'片段的PEG的總分子量可約為40,000 Da。
在另一個實施方式中，提供了可藉由暴露於輻射而選擇性加熱的抗體和非蛋白質部分的綴合物。在一個實施方式中，非蛋白質部分是碳奈米管(Kam et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005))。輻射可為任何波長，並且包括但不限於不傷害普通細胞但將非蛋白質部分加熱到鄰近抗體-非蛋白質部分的細胞被殺死的溫度的波長。 免疫綴合物
在另一態樣中，本揭示內容提供一種包含如本案所述的抗VSIG4抗體的免疫綴合物(可互換地稱作「抗體-藥物綴合物」或「ADC」)，該抗體綴合至細胞毒殺劑。
許多細胞毒殺劑已被單離或合成，使得彼等有可能抑制細胞增殖，或至少顯著地破壞或減少(假使不是確切的話)腫瘤細胞。然而，這些藥劑的毒性不僅限於腫瘤細胞，非腫瘤細胞也受到影響並可能被破壞。更具體地，在快速更新的細胞上觀察到副作用，例如造血細胞或上皮細胞，特別是黏膜細胞。為了限制對正常細胞的副作用同時保持對腫瘤細胞的高細胞毒性，已將免疫綴合物用於在癌症治療時局部遞送細胞毒殺劑(Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549；Wu et al (2005) Nature Biotechnology 23(9): 1137-1146；Payne, G. (2003) i 3:207-212；Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614；Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26:151-172; U.S. Pat. No. 4,975,278)。免疫綴合物允許將藥物部分(即細胞毒性劑)靶向遞送至腫瘤，並積聚於細胞內，其中未綴合藥物的全身投藥可能導致對正常細胞以及試圖消除的腫瘤細胞產生不可接受的毒性位準(Baldwin et al, Lancet (Mar. 15, 1986) pp. 603-05；Thorpe (1985) “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,” in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (A. Pinchera et al., eds) pp. 475-506. Both polyclonal antibodies and monoclonal antibodies have been reported as useful in these strategies (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother. 21 :183-87)。
本案揭示的免疫綴合物中使用的細胞毒殺劑可以但不限於藥物(即「抗體-藥物綴合物」)、毒素(即「免疫毒素」或「抗體-毒素綴合物」)、放射性同位素(即 「放射性免疫綴合物」或「抗體-放射性同位素綴合物」)等。
較佳地，免疫綴合物是連接至少一藥物或一醫藥品的結合蛋白。當結合蛋白是抗體或其抗原結合片段時，此類免疫綴合物通常被稱作抗體-藥物綴合物(或「ADC」)。
在第一個實施方案中，此類藥物可以其作用模式來說明。作為非限制性範例，可提及烷基化劑，例如氮芥、烷基磺酸鹽、亞硝基脲、噁唑啉、氮丙啶或亞胺乙烯、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、有絲分裂抑制劑、染色質功能抑制劑、抗血管生成藥物、抗雌激素、抗雄激素、螯合劑、鐵吸收刺激劑、環氧化酶抑制劑、磷酸二酯酶抑制劑、DNA抑制劑、DNA合成抑制劑、細胞凋亡刺激劑、胸苷酸抑制劑、T細胞抑制劑、干擾素促效劑、核糖核苷三磷酸還原酶抑制劑、芳香酶抑制劑、雌激素受體拮抗劑、酪胺酸激酶抑制劑、細胞週期抑制劑、紫杉烷、微管蛋白抑制劑、血管新生抑制劑、巨噬細胞興奮劑、神經激肽受體拮抗劑、大麻素受體促效劑、多巴胺受體促效劑、顆粒球刺激因子促效劑、促紅細胞生成素受體促效劑、生長抑素受體促效劑、LHRH促效劑、鈣增敏劑、VEGF受體拮抗劑、介白素受體拮抗劑、破骨細胞抑制劑、自由基形成刺激劑、內皮素受體拮抗劑、長春花生物鹼、抗激素或免疫調節劑或滿足細胞毒性或毒素的活性標準的任何其他新藥。
此類藥物例如在VIDAL 2010被引用、在專門用於癌症學和血液學欄「細胞毒物」所附的化合物的頁面上，參照本案引用的該些細胞毒性化合物在此被引用為較佳的細胞毒性劑。
更具體地，但不設限，根據本發明，以下藥物是較佳的：甲氯乙胺(mechlorethamine)、氯胺苯酚(chlorambucol)、美法崙(melphalen)、氯水合物、哌泊溴(pipobromen)、潑尼莫司汀(prednimustin)、磷酸氫二鈉(disodic-phosphate)、雌莫司汀(estramustine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、阿曲他明(altretamine)、曲磷醯胺(trofosfamide)、磺胺磷醯胺(sulfofosfamide)、異環磷醯胺(ifosfamide)、噻替哌(thiotepa)、三乙胺、阿四明(altetramine)、卡莫司汀(carmustine)、鏈脲佐菌素(streptozocin)、氟替莫司汀(fotemustin)、洛莫司汀(lomustine)、白消安(busulfan)、曲硫丹(treosulfan)、丙硫丹(improsulfan)、達卡巴嗪(improsulfan)、順鉑(cis-platinum)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、洛鉑(lobaplatin)、七鉑(heptaplatin)、米利鉑水合物(miriplatin hydrate)、卡鉑(carboplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、培美曲塞(pemetrexed)、5-氟尿嘧啶(5-fluoruracil)、氟尿苷(floxuridine)、5-氟去氧尿苷(5-fluorodeoxyuridine)、卡培他濱(capecitabine)、賽德薩(cytarabine)、氟達拉濱(fludarabine)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、6-巰基嘌呤(6-MP)、奈拉濱(nelarabine)、6-硫鳥嘌呤(6-TG)、氯去氧腺苷(chlorodesoxyadenosine)、5-氮雜胞苷(5-azacytidine)、吉西他濱(gemcitabine)、克拉屈濱(cladribine)、去氧可福黴素(deoxycoformycin)、替加氟(tegafur)、噴司他丁(pentostatin)、多柔比星(doxorubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、伊達比星(idarubicin)、伐柔比星(valrubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、更生黴素(dactinomycin)、光神黴素(mithramycin)、普卡黴素(plicamycin)、絲裂黴素C (mitomycin C)、博來黴素(bleomycin)、丙卡巴肼(procarbazine)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、長春地辛(vindesine)、長春瑞濱(vinorelbine)、托泊替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)、依托泊苷(etoposide)、伐柔比星(valrubicin)、鹽酸氨柔比星(amrubicin hydrochloride)、吡柔比星(pirarubicin)、醋酸艾立替銨(elliptinium acetate)、佐柔比星(zorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊達比星(idarubicin)和替尼泊苷(teniposide)、哌唑嗪、馬立馬司他、巴馬司他、普利司他、坦諾司他、伊洛馬司他、CGS-27023A、鹵夫酮、COL-3、新伐司他、沙利竇邁、CDC 501、DMXAA、L-651582、角鯊胺、內皮抑素、SU5416、SU6668、干擾素-α、EMD121974、介白素-12、IM862、血管抑制素、他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、碘氧芬、阿那曲唑、來曲唑、依西美坦、氟他胺、尼魯米特、螺內酯、乙酸環丙孕酮、非那雄胺、西咪替丁、硼替佐米(bortezomid)、萬珂(velcade)、比卡魯胺、環丙孕酮、氟他胺、氟維司群(fulvestran)、依西美坦、達沙替尼(dasatinib)、厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、伊馬替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、尼羅替尼(nilotinib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、維甲酸(retinoid)、羅西諾(rexinoid)、甲氧沙林(methoxsalene)、甲胺基乙醯丙酸酯(methylaminolevulinate)、阿地白胺酸(aldesleukine)、OCT-43、地尼介白素(denileukin diflitox)、介白素-2、他松那明、蘑菇多糖、西佐非蘭、羅喹美司、匹多莫德、培加酶、胸腺五肽、聚 I:C、丙達唑(procodazol)、Tic BCG、小棒桿菌(corynebacterium parvum)、NOV-002、烏克(ukrain)、左旋咪唑、1311-chTNT、H-101、西莫介白素(celmoleukin)、干擾素α2a、干擾素α2b、干擾素γ1a、干擾素-2、莫貝介白素(mobenakin)、Rexin-G、替西介白素(teceleukin)、阿柔比星(aclarubicin)、放射菌素(actinomycin)、阿加來必(arglabin)、天冬醯胺酶、嗜癌素(carzinophilin)、色黴素、道諾黴素、若克瘤(leucovorin)、馬索羅酚(masoprocol)、新抑癌素(neocarzinostatin)、培洛黴素(peplomycin)、肉黴素(sarkomycin)、澳洲茄邊鹼(solamaargine)、崔貝替定(trabectedin)、鏈脲佐菌素、 睾固酮，酚瑞淨(kunecatechins)、賽兒茶素(sinecatechins)、阿利維甲酸(alitretinoin)、鹽酸貝洛替康(belotecan hydrochloride)、月見草酮(calusterone)、屈他雄酮(dromostanolone)、依利醋銨(elliptinium acetate)、乙炔雌二醇、依托泊苷、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、福美坦(formestane)、磷雌醇(fosfetrol)、乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、胺基乙醯丙酸己酯、組胺瑞林(histrelin)、羥孕酮(hydroxyprogesterone)、伊沙匹隆(ixabepilone)、亮丙瑞林(leuprolide)、乙酸甲羥孕酮、乙酸甲地孕酮(megesterol acetate)、甲基普立朗(methylprednisolone)、甲基睾固酮、米替福新(miltefosine)、米托溴醇(mitobronitol)、苯丙酸萘龍(nadrolone phenylpropionate)、乙酸炔諾酮(norethindrone acetate)、普立朗、強的松(prednisone)、替西羅莫司(temsirrolimus)、睾固酮內酯(testolactone)、曲安康龍(triamconolone)、曲普瑞林(triptorelin)、乙酸伐普肽(vapreotide acetate)、齊諾他汀興奮劑(zinostatin stimalamer)、安吖啶(amsacrine)、三氧化二砷、鹽酸比生群(bisantrene hydrochloride)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氯烯雌醚(chlortrianisene)、順氯胺鉑(cis-diamminedichloroplatinium)、環磷醯胺、己烯雌酚(diethylstilbestrol)、六甲基三聚氰胺、羥基脲、來那度胺(lenalidomide)、洛尼達明(lonidamine)、氯乙胺、米托坦(mitotane)、奈達鉑(nedaplatin)、鹽酸尼莫司汀(nimustine hydrochloride)、帕米膦酸二鈉(pamidronate)、吡泊溴胺(pipobroman)、福得靈(porfimer sodium)、雷莫司汀(ranimustine)、雷佐生(razoxane)、塞莫司汀(semustine)、索布佐生(sobuzoxane)、甲磺酸鹽、三乙烯三聚氰胺、唑來膦酸(zoledronic acid)、甲磺酸卡莫司他(camostat mesylate)、法屈唑鹽酸鹽(fadrozole HCl)、萘福昔定(nafoxidine)、諾瓦得士(aminoglutethimide)、卡莫氟(carmofur)、氯法拉濱(clofarabine)、阿糖胞苷、地西他濱(decitabine)、多西氟尿苷(decitabine)、依諾西他濱(enocitabine)、磷酸氟達拉布(fludarabne phosphate)、氟尿嘧啶、富多拉富(ftorafur)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、阿倍瑞克(abarelix)、貝沙羅汀(bexarotene)、雷替曲塞(raltiterxed)、他米巴羅汀(tamibarotene)、替莫唑胺(temozolomide)、伏立諾他(vorinostat)、甲地孕酮、杏骨樂(clodronate disodium)、左旋咪唑、安瑞福(ferumoxytol)、異麥芽糖苷鐵、塞來昔布(celecoxib)、布地司特(ibudilast)、苯達莫司汀(bendamustine)、阿曲他明、米託內酯(mitolactol)、特癌適(temsirolimus)、普拉曲沙(pralatrexate)、TS-1、地西他濱(decitabine)、比卡魯胺(bicalutamide)、氟他胺、來曲唑、氯膦酸二鈉、地加瑞克(degarelix)、檸檬酸托瑞米芬(toremifene citrate)、組織胺二鹽酸鹽()、DW-166HC、硝克林(nitracrine)、地西他濱、鹽酸伊立替康(irinoteacn hydrochloride)、安吖啶(amsacrine)、羅米地辛(romidepsin)、維甲酸(tretinoin)、卡巴他賽(cabazitaxel)、凡德他尼(vandetanib)、來那度胺、伊班膦酸(ibandronic 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對於更多細節，發明所屬領域中具通常知識者可參照由“Association Française des Enseignants de Chimie Thérapeutique”所編輯，標題為“Traité de chimie thérapeutique”，vol. 6, Médicaments antitumouraux et perspectives dans le traitement des cancers, edition TEC & DOC, 2003的手冊。
或者，免疫綴合物可包含與至少一種放射性同位素連接的結合蛋白。當結合蛋白是抗體或其抗原結合片段時，此類免疫綴合物通常被稱作抗體-放射性同位素綴合物(或「ARC」)。
對於腫瘤的選擇性破壞，抗體可包含高放射性原子。多種放射性同位素可用於生產ARC，例如但不限於At 211、C 13、N 15、O 17、Fl 19、I 123、I 131、I 125、In 111、Y 90、Re 186、Re 188、Sm 153、tc 99m、Bi 212、P 32、Pb 212，Lu、釓、錳或鐵的放射性同位素。
熟習此藝者已知的任何方法或過程可用於將此類放射性同位素併入ARC中(參閱例如“Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy”, Chatal, CRC Press 1989)。作為非限制範例，Tc 99m或I 123、Re 186、Re 188和In 111可透過半胱胺酸殘基連接。Y 90可透過離胺酸殘基連接。I 123可使用IODOGEN方法連接(Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57)。
可提及幾個例子來說明ARC領域的熟習此藝者的知識，例如Zevalin ®，其係由抗CD20單株抗體和藉由硫脲連接子-螯合劑結合的In 111或Y 90放射性同位素所組成(Wiseman et at (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77；Wiseman et al (2002) Blood 99(12):4336-42；Witzig et at (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63；Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69)或Mylotarg ®，其係由抗CD33抗體連接至卡奇黴素所組成(美國專利號4,970,198；5,079,233；5,585,089；5,606,040；5,693,762；5,739,116；5,767,285；5,773,001)。最近，還可提及稱為雅詩力(Adcetris) (相當於本妥昔單抗(Brentuximab vedotin))的ADC，其近來已被 FDA接受用於治療霍金森氏淋巴瘤(Nature, vol. 476, pp380-381, 25 August 2011)。
在本揭示的又另一個實施方案中，免疫綴合物可包含與毒素連接的結合蛋白。當結合蛋白是抗體或其抗原結合片段時，此類免疫綴合物通常被稱作抗體-毒素綴合物(或「ATC」)。
毒素是由活生物體產生的有效且特異性的毒物。彼等通常由胺基酸鏈組成，其分子量可能在幾百(肽)和十萬道耳吞(蛋白質)之間變化。彼等也可為低分子有機化合物。毒素由許多生物體產生，例如細菌、真菌、藻類和植物。其中許多是劇毒的，毒性比神經毒劑大幾個數量級。
ATC使用的毒素可包括但不限於所有種類的毒素，該等可藉由包括微管蛋白結合、DNA結合或拓撲異構酶抑制在內的機制發揮其細胞毒性作用。
可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌)、蓖麻毒蛋白(ricin) A鏈、相思豆毒蛋白(abrin) A鏈、葫蓮根毒蛋白(modeccin) A 鏈、α-八聯球菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹(dianthin)蛋白、美洲商陸( Phytolaca americana)蛋白質(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜( Momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草( Sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒蛋白(gelonin)、米托黴素(mitogellin)、局限曲黴素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、依諾黴素(enomycin)和單端孢黴素(tricothecenes)。
本案亦設想到小分子毒素，例如海兔毒素(dolastatins)、澳瑞他汀(auristatins)、單端孢黴素和CC1065，以及這些毒素的具有毒素活性的衍生物。海兔毒素和澳瑞他汀已被證明可干擾微管動力學、GTP水解以及核和細胞分裂，並具有抗癌和抗真菌活性。
本案所述的免疫綴合物還可包含連接子。
「連接子」、「連接單元」或「連接物」是指包含將結合蛋白共價連接至至少一種細胞毒性劑的共價鍵或原子鏈的化學部分。
連接子可使用多種雙功能蛋白偶合劑製成，例如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亞胺基硫烷( IT)、亞胺基酯的雙官能衍生物(例如己二酸二甲酯HCl)、活性酯(例如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛(例如戊二醛)、雙疊氮化合物(例如雙(對疊氮苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮衍生物(例如雙-(對-重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如甲苯 2,6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(例如 1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。碳14標記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸 (MX-DTPA)是用於將細胞毒性劑與定址系統綴合的例示性螯合劑。其他交聯劑試劑可為BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS 、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB和SVSB (琥珀醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯)，該等是可商購的(例如來自美國伊利諾州羅克福德的Pierce Biotechnology, Inc.)。
連接子可為「不可切割的」或「可切割的」連接子。
較佳地，連接子是促進細胞毒性劑在細胞中釋放的「可切割連接子」。例如，可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感連接子、光不穩定連接子、二甲基連接子或含二硫鍵連接子。連接子較佳在細胞內條件下被切割，使得連接子的切割從細胞內環境中的結合蛋白釋放細胞毒性劑。
例如，在一些實施方案中，連接子可被存在於胞內環境(例如在溶酶體或內體或胞膜窖內)的切割劑切割。連接子可為例如被細胞內肽酶或蛋白酶切割的肽基連接子，包括但不限於溶酶體或內體蛋白酶。通常，肽基連接子至少有兩個胺基酸長或至少三個胺基酸長。裂解劑可包括組織蛋白酶B和D以及纖溶酶，已知所有該些皆會水解二肽藥物衍生物，藉此在標靶細胞內釋放活性藥物。例如，可使用可被在癌組織中高度表現的硫醇依賴性蛋白酶組織蛋白酶-B切割的肽基連接子(例如Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly連接子)。在具體實施方案中，可被細胞內蛋白酶切割的肽基連接子是Val-Cit連接子或Phe-Lys連接子。使用細胞毒性劑的細胞內蛋白水解釋放的一個優點是該劑在綴合時通常是減毒的且綴合物的血清穩定性通常是高的。
在其他實施方案中，可切割連接子是pH敏感的，即在某些pH值下對水解敏感。通常，pH敏感連接子在酸性條件下是可水解的。例如，可使用在溶酶體中可水解的酸不穩定連接子(例如腙、胺基脲、胺基硫脲、順烏頭醯胺、原酸酯、縮醛、縮酮等)。此類連接子在中性pH條件下(例如血液中的連接子)相對穩定，但在低於5.5或5.0(溶酶體的近似pH)下不穩定。在某些實施方案中，可水解連接子是硫醚連接子(例如透過醯基腙鍵與治療劑連接的硫醚。
在又其他實施方案中，連接子可在還原條件下被切割(例如二硫鍵連接子)。多種二硫鍵連接子是本領域已知的，包括例如可使用 SATA (N-琥珀醯亞胺基-S-乙醯硫代乙酸酯)、SPDP (N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB (N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)和SMPT (N-琥珀醯亞胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)形成的那些。
相比之下，不可切割的連接子沒有明顯的藥物釋放機制。包含此類不可切割連接子的免疫綴合物依賴於抗體的完全溶酶體蛋白水解降解，其在內化後釋放細胞毒性劑。
作為包含不可切割連接子的免疫綴合物的範例，可提及免疫綴合物曲妥珠單抗-賀癌寧(trastuzumab-emtansine) (TDM1)，其將曲妥珠單抗與連接之化療劑美登素(maytansin)組合(Cancer Research 2008; 68: (22). November 15, 2008)。
在較佳的實施方案中，本案揭示的免疫綴合物可藉由熟習此藝者已知的任何方法製備，例如但不限於i)使抗原結合蛋白的親核基團與二價連接子試劑反應，然後與細胞毒性劑反應或ii)使細胞毒性劑的親核基團與二價連接子試劑反應，然後與抗原結合蛋白的親核基團反應。
當抗原結合蛋白被醣基化時，抗原結合蛋白上的親核基團包括但不限於N-端胺基、側鏈胺基例如離胺酸、側鏈硫醇基和糖羥基或胺基。胺、硫醇和羥基是親核的並且能夠與連接子部分和連接子試劑上的親電子基團反應形成共價鍵，包括但不限於活性酯，例如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯和醯鹵；鹵代烷和苯甲基鹵化物，例如鹵代乙醯胺；醛、酮、羧基和馬來醯亞胺基團。抗原結合蛋白可具有可還原的鏈間二硫鍵，即半胱胺酸橋。藉由用還原劑如DTT (二硫代蘇糖醇)處理，可使抗原結合蛋白對與連接子試劑的綴合具有反應性。因此，理論上各個半胱胺酸橋將形成兩個反應性硫醇親核試劑。可藉由熟習此藝者已知的任何反應將額外的親核基團引進抗原結合蛋白中。作為非限制性範例，可藉由引進一個或多個半胱胺酸殘基將反應性硫醇基團引進抗原結合蛋白。
還可藉由修飾抗原結合蛋白以引進親電子部分來產生免疫綴合物，該親電子部分可與連接子試劑或細胞毒性劑上的親核取代基反應。醣基化抗原結合蛋白的糖可被氧化形成醛基或酮基，其可與連接子試劑或細胞毒性劑的胺基反應。所得亞胺席夫鹼(Schiff base)基團可形成穩定的鍵聯，或可還原形成穩定的胺鍵聯。在一個實施方式中，醣基化抗原結合蛋白的碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏過碘酸鈉的反應可在蛋白質生成可與藥物上的適當基團反應的羰基(醛和酮)基團。在另一個實施方式中，含有N-端絲胺酸或蘇胺酸殘基的蛋白質可與偏過碘酸鈉反應，致使產生醛來代替第一個胺基酸。 嵌合抗原受體
本發明還提供一種CAR (嵌合抗原受體)蛋白，包括i)本發明的抗體；ii)跨膜域和；iii)細胞內訊息傳導域，其特徵在於根據上述i)的抗體結合至抗原而引起T細胞活化。
在本發明中，CAR蛋白的特徵在於其係由本發明的單株抗體、公知的跨膜域和細胞內訊息傳導域構成。
如本案所述，術語「CAR (嵌合抗原受體)」是指能夠為免疫效應子細胞提供針對特定抗原的特異性的非天然受體。一般而言，CAR表示為T細胞提供單株抗體特異性的受體。CAR一般由胞外域、跨膜域和胞內域構成。胞外域包括抗原識別區，在本發明中，抗原識別位點是VSIG4特異性抗體。VSIG4特異性抗體係如上所述，CAR所使用的抗體較佳為抗體片段的形式。更佳為Fab或scFv的形式，但不限於此。
此外，CAR的跨膜域具有與胞外域相連的形式，其可源自於天然形式或合成形式。當其源自於天然形式時，可能源自於膜結合或跨膜蛋白，可為源自於各種蛋白質的跨膜域的部分，例如T細胞受體的α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε 、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154 或 CD8。這些跨膜域的序列可從本領域公知的文獻中獲得，其中很清楚地描述跨膜蛋白的跨膜域，但不限於此。
本發明的CAR是胞內CAR域的一部分，與跨膜域相連。本發明的胞內域可包括胞內訊息傳導域，其特徵在於具有在抗原結合至CAR的抗原識別位點時引起T細胞活化，較佳T細胞增殖的性質。沒有特別限定胞內訊息傳導域的種類，只要是在抗原結合至存在於細胞外部的CAR的抗原識別位點時可引起T細胞活化即可，可使用各種細胞內訊息傳導域。其範例包括基於免疫受體酪胺酸的活化基序(ITAM)，ITAM可包括源自於CD3 ξ、FcR γ、FcR β、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CDS、CD22、CD79a、CD79b、 CD66d 或 FcεRIγ，但不限於此。
此外，較佳的是，本發明的CAR的胞內域另外包含與胞內訊息傳導域一起的共刺激域，但不限於此。共刺激域是包含在本發明的CAR中的部分，除了來自胞內訊息傳導域的訊息外，還扮演向T細胞傳遞訊息的角色，其表示包括共刺激分子的胞內域的CAR胞內部分。
共刺激分子作為細胞表面分子意指淋巴球對抗原進行充分反應所需的分子，其範例包括CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1 (淋巴球功能相關抗原-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C和B7-H3，但不限於此。共刺激域可為選自那些共刺激分子及其組合的分子的胞內部分。
此外，選擇性地，短的寡肽或多肽連接子可連接CAR的胞內域和跨膜域。儘管此連接子可包括在本發明的CAR中，但沒有特別限定連接子長度，只要可透過抗原與胞外抗體的胞內域結合來誘發T細胞活化即可。 核酸和表現系統
本揭示包括編碼用於抗體，尤其是抗VSIG4抗體的免疫球蛋白輕鏈和重鏈基因的多核苷酸，包含此類核酸的載體以及能夠產生本揭示的抗體的宿主細胞。本案還提供了在高度嚴苛、中度或較低度嚴苛雜交條件下雜交， 例如如上文所定義，至編碼本案提供的抗體或經修飾抗體的的多核苷酸。
在第一態樣中，本揭示關於一種或多種編碼抗體的多核苷酸，尤其是能夠特異性地結合至VSIG4的抗體或其片段，如上所述。本揭示特別提供了編碼單株抗體的重鏈可變區及/或輕鏈可變區或其抗原結合片段的多核苷酸。更具體地，在某些實施方案中，本案提供的核酸分子包含以下或由以下組成：編碼本案揭示的重鏈可變區和輕鏈可變區的核酸序列或其任何組合(例如編碼本案提供的抗體的核苷酸序列，比如例如全長抗體、抗體的重鏈及/或輕鏈或本案提供的單鏈抗體)。
在一個實施方案中，多核苷酸編碼本案所述的抗VSIG4抗體的三個重鏈CDR。在一個實施方案中，多核苷酸編碼本案所述的抗VSIG4抗體的三個輕鏈CDR。在一個實施方案中，多核苷酸編碼本案所述的抗VSIG4抗體的三個重鏈CDR和三個輕鏈CDR。另一個實施方案提供一對多核苷酸，其中第一多核苷酸編碼本案所述的抗VSIG4抗體的三個重鏈CDR；第二個多核苷酸編碼本案所述的相同抗VSIG4抗體的三個輕鏈CDR。
在一個實施方案中，多核苷酸編碼本案所述的抗VSIG4抗體的重鏈可變區。在一個實施方案中，多核苷酸編碼本案所述的抗VSIG4抗體的輕鏈可變區。在一個實施方案中，多核苷酸編碼本案所述的抗VSIG4抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區。另一個實施方案提供一對多核苷酸，其中第一多核苷酸編碼本案所述的抗VSIG4抗體的重鏈可變區；第二個多核苷酸編碼本案所述的相同抗VSIG4抗體的輕鏈可變區。
在一個實施方案中，多核苷酸編碼本案所述的抗VSIG4抗體的重鏈。在一個實施方案中，多核苷酸編碼本案所述的抗VSIG4抗體的輕鏈。在一個實施方案中，多核苷酸編碼本案所述的抗VSIG4抗體的重鏈和輕鏈。另一個實施方案提供一對多核苷酸，其中第一多核苷酸編碼本案所述的抗VSIG4抗體的重鏈；第二個多核苷酸編碼本案所述的相同抗VSIG4抗體的輕鏈。
在一個實施方案中，提供了編碼上述抗VSIG4抗體SA2281的重鏈的多核苷酸。較佳地，該重鏈包含具有序列SEQ ID Nos. 3、4和5的三個重鏈CDR。更佳地，該重鏈包含了包含具有序列SEQ ID No. 45的可變區的重鏈。
在另一個實施方式中，多核苷酸編碼上述抗VSIG4抗體SA2281的輕鏈。較佳地，該輕鏈包含具有序列SEQ ID Nos. 6、7和8的三個輕鏈CDR。更佳地，該輕鏈包含了包含具有序列SEQ ID No. 46的可變區的輕鏈。
在另一個實施方式中，提供了編碼上述抗VSIG4抗體SA2297的重鏈的多核苷酸。較佳地，該重鏈包含具有序列SEQ ID Nos. 9、10和11的三個重鏈CDR。更佳地，該重鏈包含了包含具有序列SEQ ID No. 47的可變區的重鏈。
在另一個實施方式中，多核苷酸編碼上述抗VSIG4抗體SA2297的輕鏈。較佳地，該輕鏈包含具有序列SEQ ID Nos. 12、13和14的三個輕鏈CDR。更佳地，該輕鏈包含了包含具有序列SEQ ID No. 48的可變區的輕鏈。
由於密碼子簡併性或考慮到要表現人類抗體的輕鏈和重鏈或其片段的生物體中偏好的密碼子，編碼本發明單株抗體的輕鏈和重鏈的多核苷酸或其抗原結合片段可在不改變從編碼區表現的抗體的輕鏈和重鏈的胺基酸序列的範圍內的編碼區具有各種變化，甚至在編碼區以外的區域中，可在不影響基因表現的範圍內進行各種改變或修飾。熟習此藝者將容易理解，那些變異基因也落入本發明的範圍內。亦即，只要本發明的多核苷酸編碼具有同等活性的蛋白質，可藉由取代、缺失、插入或其組合改變一個或多個核酸鹼基，該些亦落入本發明的範疇內。多核苷酸的序列可為單鏈或雙鏈，其可為DNA分子或RNA (mRNA)分子。
根據本發明，可使用多種表現系統來表現本發明的抗體。在一態樣中，此類表現系統代表可產生和隨後純化感興趣的編碼序列的載體，但也代表了當以適當的核苷酸編碼序列瞬時轉染時可原位表現IgG抗體的細胞。
本揭示提供包含上述多核苷酸的載體。在一個實施方式中，載體含有編碼感興趣抗體(例如抗VSIG4抗體)的重鏈的多核苷酸。在另一個實施方式中，多核苷酸編碼感興趣抗體(例如抗VSIG4抗體)的輕鏈。在另一個實施方式中，多核苷酸編碼感興趣抗體(例如抗VSIG4抗體)的重鏈和輕鏈。在又另一個實施方案中，提供一對多核苷酸，其中第一個多核苷酸編碼感興趣抗體(例如抗VSIG4抗體)的重鏈，第二個多核苷酸編碼相同的感興趣抗體(例如抗VSIG4抗體)的輕鏈。
本揭示還提供包含編碼融合蛋白、經修飾抗體、抗體片段及其探針的多核苷酸分子的載體。
為了表現感興趣抗體(例如抗VSIG4抗體)的重鏈及/或輕鏈，將編碼該重鏈及/或輕鏈的多核苷酸插入表現載體中，俾使基因操作性地連接至轉錄序列和轉譯序列。在較佳的實施方案中，該些多核苷酸被選殖到兩個載體中。
「操作性地連接的(Operably linked)」序列包括與感興趣基因鄰接的表現控制序列以及以反相或遠距離作用以控制感興趣基因的表現控制序列。如本案所用的術語「表現控制序列」是指影響與其接合的編碼序列的表現和處理所必需的多核苷酸序列。表現控制序列包括適當的轉錄起始、終止、啟動子和增強子序列；有效的RNA處理訊號，例如剪接和聚腺苷酸化訊號；穩定細胞質mRNA的序列；增強轉譯效率的序列(即Kozak共通序列)；增強蛋白質穩定性的序列；以及視需要增強蛋白質分泌的序列。此類控制序列的本質因宿主生物體而異；在原核生物中，此類控制序列一般包括啟動子、核糖體結合位點和轉錄終止序列；在真核生物中，一般而言，此類控制序列包括啟動子和轉錄終止序列。術語「控制序列」旨在最小程度包括其存在對表現和處理至關重要的所有組分，並且還可包括其存在係有利的附加組分，例如前導序列和融合伴侶序列。
本發明的多核苷酸和包含該些分子的載體可用於轉形適宜的宿主細胞。如本案所用，術語「宿主細胞」旨在指已引進重組表現載體以表現感興趣抗體(例如抗VSIG4抗體)的細胞。應當理解，此類術語不僅意指特定的個體細胞，而且意指此類細胞的後代。因為某些修飾可能由於突變或環境影響而在後代中發生，所以此類後代實際上可能與親代細胞不同，但仍包括在本案所用的術語「宿主細胞」的範疇內。
可藉由將多核苷酸引進細胞宿主的任何已知方法進行轉形。此類方法是熟習此藝者熟知的且包括葡聚醣介導的轉形、磷酸鈣沉澱、聚凝胺介導的轉染、原生質體融合、電穿孔、將多核苷酸包封到脂質體中、基因槍注射和將DNA直接顯微注射到細胞核中。
宿主細胞可經一種或多種表現載體共轉染。例如，宿主細胞可經編碼感興趣抗體(例如抗VSIG4抗體)的重鏈和輕鏈兩者的載體轉染，如上所述。或者，宿主細胞可經編碼感興趣抗體(例如抗VSIG4抗體)的重鏈的第一載體和編碼該抗體的輕鏈的第二載體轉形。哺乳動物細胞通常用於表現重組治療性免疫球蛋白，特別是用於表現全重組抗體。例如，哺乳動物細胞，比如HEK293或CHO細胞，連同含有表現訊號的載體，比如攜帶來自人類巨細胞病毒的主要中間早期基因啟動子元件的載體，是表現本發明人源化抗VSIG4抗體的有效系統(Foecking et al., 1986, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8: 2)。
此外，可選擇調節插入序列表現或以所需特定方式修飾和加工基因產物的宿主細胞。蛋白質產物的此類修飾(例如醣基化)和處理對於蛋白質的功能可能很重要。不同的宿主細胞具有蛋白質和基因產物的轉譯後處理和修飾的特徵和特定機制。選擇適當的細胞系或宿主系統以確保正確修飾和處理所表現的感興趣抗體。因此，可使用具有適當處理初級轉錄物、基因產物醣基化的細胞機制的真核宿主細胞。此類哺乳動物宿主細胞包括但不限於 CHO、COS、HEK293、NS/0、BHK、Y2/0、3T3或骨髓瘤細胞(所有這些細胞系均可從公有寄存機構獲得，例如法國國家菌種中心(Collection Nationale des Cultures de Microorganismes, Paris, France)或美國菌種中心(American Type Culture Collection, Manassas, VA, U.S.A.))。
對於重組蛋白的長期、高產量生產而言，穩定表現係較佳的。在本發明的一個實施方案中，可將穩定表現抗體的細胞系工程化。不是使用含有病毒複製起點的表現載體，而是用適當的表現調控元件(包括啟動子、增強子、轉錄終止子、多聚腺苷酸化位點和熟習此藝者已知的其他適當的序列及可選擇標記)控制下的DNA來轉形宿主細胞。在引進外源DNA後，可使工程化細胞在富集培養基中生長一到兩天，然後轉移到選擇性培養基中。重組質體上的可選擇標記賦予選擇抗性，並允許細胞將質體穩定整合到染色體中並擴增到細胞系中。用於構築穩定細胞系的其他方法是本領域已知的。特別是，已經開發了用於特定站點整合的方法。根據該些方法，在適當的表現調控元件(包括啟動子、增強子、轉錄終止子、多聚腺苷酸化位點和其他適當的序列)控制下的經轉形DNA被整合到宿主細胞基因組中先前已被切割的特定標靶位點(Moele et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 104(9): 3055-3060；US 5,792,632；US 5,830,729；US 6,238,924；WO 2009/054985；WO 03/025183；WO 2004/067753)。
根據本發明可使用許多選擇系統，包括但不限於單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler et al., Cell 11:223, 1977)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Szybalska et al., Proc Natl Acad Sci USA 48: 202, 1992)、在甲硫胺酸亞磺醯亞胺存在下的麩胺酸合成酶選擇(Adv Drug Del Rev, 58: 671, 2006以及Lonza Group Ltd.的網站或文獻)以及分別在tk、hgprt或aprt細胞中的腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Lowy et al., Cell 22: 817, 1980)基因。再者，抗代謝物抗性可用作選擇以下基因的基礎：dhfr，其賦予對胺甲喋呤的抗性(Wigler et al., Proc Natl Acad Sci USA 77: 357, 1980)；gpt，賦予對黴酚酸的抗性(Mulligan et al., Proc Natl Acad Sci USA 78: 2072, 1981)；neo，其賦予對胺基糖苷類G-418的抗性(Wu et al., Biotherapy 3: 87, 1991)；和hygro，其賦予對潮黴素的抗性(Santerre et al., Gene 30: 147, 1984)。重組DNA技術領域中已知的方法可常規用於選擇所欲的重組選殖體，此類方法係描述於例如Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1993)。抗體的表現位準可藉由載體擴增來增加。當表現抗體的載體系統中的標記可擴增時，存在於培養物中的抑制劑位準的增加將增加標記基因的拷貝數。由於經擴增區域與編碼本發明的IgG抗體的基因相關，該抗體的產生也將增加(Crouse et al., Mol Cell Biol 3: 257, 1983)。存在表現本發明基因的替代方法且是熟習此藝者已知的。例如，可將經修飾的鋅指蛋白工程化，使其能夠結合本發明基因上游的表現調控元件；本發明的宿主細胞中該工程化鋅指蛋白(ZFN)的表現導致蛋白質產量增加(參閱例如Reik et al., Biotechnol. Bioeng., 97(5): 1180-1189, 2006)。此外，ZFN可刺激DNA整合到預定的基因組位置，進而實現高效的位點特異性基因添加(Moehle et al, Proc Natl Acad Sci USA, 104: 3055, 2007)。
可藉由在表現所欲抗體所必需的培養條件下使經轉形的宿主細胞的培養物生長來製備感興趣抗體(例如抗VSIG4抗體)。然後可從培養基或細胞提取物中純化得到的表現抗體。可從培養上清液中回收可溶形式的感興趣抗體(例如抗VSIG4抗體)。然後可藉由本領域已知的用於純化免疫球蛋白分子的任何方法將其純化，例如藉由層析法(例如離子交換、親和力，特別是藉由蛋白A對Fc的親和力等)、離心、差異性溶解度或藉由任何其他用於純化蛋白質的標準技術。適宜的純化方法對於本領域普通技術人員將是顯而易見的。
本發明的另一態樣因此關於一種用於產生本案所述的抗體(例如抗VSIG4抗體)的方法，該方法包含以下步驟： a) 在適宜的培養條件下在培養基中，使上述宿主細胞生長；以及 b)從該培養基或從該培養細胞中回收該抗體(例如抗VSIG4抗體)。
藉由培養轉形體獲得的抗體可在未純化的狀態下使用。雜質可藉由額外的各種常用方法例如離心或超濾去除，所得物可接受透析、鹽沉澱、層析等等，其中該方法可單獨使用或組合使用。其中，最廣泛使用的是親和力層析，包括離子交換層析、尺寸排阻層析、疏水交互作用層析、羥基磷灰石層析等。 醫藥組成物
在另一態樣中，本揭示提供一種組成物，包含抗VSIG4抗體或其抗原結合片段，例如本案所述的任何抗VSIG4抗體或其綴合物，即包含本案所述的抗VSIG4抗體之一的免疫綴合物。
該些組成物對於例如刺激個體的免疫反應特別有用。特異性地結合至VSIG4的本發明抗體是藉由結合至抑制T細胞活化的VSIG4蛋白來誘發T細胞活化，因此該抗體可刺激免疫反應。
本案所述的組成物也可用於治療癌症。可藉由投藥包含本案揭示的抗VSIG4抗體、其抗原結合片段或其綴合物的此類組成物來建立保護性抗腫瘤免疫。
任擇地，該等組成物可包含一個或多個額外的治療劑，例如下文所述的免疫檢查點抑制劑。該等組成物通常作為無菌醫藥組成物的一部分供應，醫藥組成物通常包括藥學上可接受的載劑及/或賦形劑。在另一態樣中，本發明因此提供一種包含抗VSIG4抗體或其綴合物的醫藥組成物和藥學上可接受的載劑及/或賦形劑。
此組成物可為任何適宜的形式(取決於將其投予患者的所欲方法)。在本案所述的方法中利用的組成物可例如藉由以下投予：玻璃體內(例如藉由玻璃體內注射)、藉由滴眼劑、肌肉內、靜脈內、皮內、經皮、動脈內、腹腔內、病灶內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、鞘內、鼻內、陰道內、直腸內、局部、腫瘤內、腹腔、皮下、結膜下、囊內、黏膜、心包內、臍內、眼內、眶內、口服、局部、透皮、藉由吸入、藉由注射、藉由植入、藉由輸注、藉由連續輸注、藉由局部灌注、直接浸浴標靶細胞、藉由導管、藉由灌洗、在乳膏中或在脂質組成物中。本案所述方法中利用的組成物也可全身或局部投予。投藥方法可取決於各種因素(例如所投予的化合物或組成物以及所治療的病況、疾病或病症的嚴重程度)而變化。在任何給定情況下，最適宜的投藥途徑將取決於特定的抗體、個體、疾病的本質和嚴重程度以及個體的身體狀況。抗VSIG4抗體、其抗原結合片段或其綴合物可調配成水溶液並藉由皮下注射投予。
醫藥組成物可方便地以單位劑量形式存在，每劑含有預定量的抗-VSIG4、其抗原結合片段或其綴合物。此類單位可含有例如但不限於5 mg至5 g，例如10 mg至1 g或20至50 mg。用於本揭示的藥學上可接受的載劑可採取多種形式，其取決於例如待治療的病況或投藥途徑。
本揭示的醫藥組成物可藉由將具有所欲純度的抗體與本領域通常運用的任擇的藥學上可接受的載劑、賦形劑或安定劑(所有這些在本案稱作「載劑」)，即緩衝劑、安定劑、防腐劑、等滲劑、非離子清潔劑、抗氧化劑和其他雜項添加劑。參閱Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980)。在所運用的劑量和濃度下，此類添加劑必須對接受者無毒。
緩衝劑有助於將pH值維持在接近生理條件的範圍內。彼等可以介於約2 mM至約50 mM範圍的濃度存在。用於本發明的適宜緩衝劑包括有機酸和無機酸及其鹽，例如檸檬酸鹽緩衝劑(例如檸檬酸一鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸一鈉混合物等)、琥珀酸鹽緩衝液(例如琥珀酸-琥珀酸一鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩衝液 (例如酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、延胡索酸鹽緩衝液 (例如延胡索酸-延胡索酸一鈉混合物、延胡索酸-延胡索酸二鈉混合物、延胡索酸一鈉-延胡索酸二鈉混合物等)、葡萄糖酸鹽緩衝液(例如葡萄糖酸-葡萄糖酸鈉混合物、葡萄糖酸-氫氧化鈉混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩衝液(例如草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩衝液(例如乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)和乙酸鹽緩衝液(例如乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物等)。此外，可使用磷酸鹽緩衝液、組胺酸緩衝液和三甲胺鹽，例如Tris。
可添加防腐劑以延緩微生物生長，添加量範圍為 0.2%-1% (w/v)。用於本發明的適宜防腐劑包括酚、苯甲醇、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苯甲基氯化銨、苯扎鹵銨(例如氯化物、溴化物和碘化物)、氯化六甲銨和對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇和3-戊醇。可添加有時稱為「安定劑」的等滲劑以確保本揭示的液體組成物的等滲性，並且包括多元糖醇，例如三元或更高級糖醇，例如甘油、赤蘚糖醇、阿糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。安定劑是指一大類賦形劑，其功能範圍從填充劑到溶解治療劑(即抗VSIG4抗體、其抗原結合片段或其綴合物)或有助於防止變性或黏附在容器壁上的添加劑。典型的安定劑可為多元糖醇(上文列舉的)；胺基酸，例如精胺酸、離胺酸、甘胺酸、穀胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、丙胺酸、鳥胺酸、L-白胺酸、2-苯丙胺酸、穀胺酸、蘇胺酸等、有機糖或糖醇，例如乳糖、海藻糖、水蘇糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括環醇，例如肌醇；聚乙二醇；胺基酸聚合物；含硫還原劑，例如尿素、穀胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量多肽(例如10個或更少殘基的肽)；蛋白質，例如人類血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮單醣，例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；雙糖，例如乳糖、麥芽糖、蔗糖和三糖，例如棉子糖；和多醣，例如葡聚醣。安定劑可以每重量份活性蛋白(例如抗VSIG4抗體或包含此類抗體的綴合物)介於0.1至10,000重量份的範圍存在。
可添加非離子表面活性劑或清潔劑(也稱為「潤濕劑」)以幫助溶解抗VSIG4抗體(或其綴合物)以及保護治療性蛋白質免受攪動引發的聚集，其也允許調配物暴露於剪切表面應力而不造成蛋白質變性。適宜的非離子表面活性劑包括聚山梨醇酯(20、80等)、泊洛沙姆(polyoxamer) (184、188等)、普朗尼克多元醇(pluronic polyol)、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單醚(TWEEN®-20、TWEEN®-80等)。非離子表面活性劑可以約0.05 mg/ml至約1.0 mg/ml，例如約0.07 mg/ml至約0.2 mg/ml的範圍存在。
其他雜項賦形劑包括填充劑(例如澱粉)、螯合劑(例如EDTA)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、甲硫胺酸、維生素E)和助溶劑。
本發明更指涉一種醫藥組成物，其至少包含： i) 如本案所揭示的抗VSIG4抗體、其抗原結合片段或其綴合物；以及 ii) 第二治療劑，例如如下所述的免疫檢查點抑制劑， 作為同時、單獨或依序使用的組合產品。
如本案所用的「同時使用」是指以單一且相同的醫藥形式投予根據本發明組成物的兩個化合物。
如本案所用的「單獨使用」是指以不同的醫藥形式同時投予本發明組成物的兩個化合物。
如本案所用的「依序使用」是指本發明組成物的兩個化合物的連續投藥，每種化合物係呈現不同的醫藥形式。
抗VSIG4抗體(或其抗原結合片段或其綴合物)和第二治療劑，例如免疫檢查點抑制劑的組成物可作為一個或多個抗VSIG4抗體(或其抗原結合片段或其綴合物)及/或一個或多個第二治療劑(例如如下所述的免疫檢查點抑制劑)的混合物單獨投予，與可用於治療癌症的其他藥劑混合或組合或輔助其他癌症療法來投予。下文提供適宜的組合和輔助療法的範例。
本揭示所涵蓋的是含有抗VSIG4抗體(或其抗原結合片段或其綴合物)並在本案中描述的醫藥套組。醫藥套組是包含抗VSIG4抗體(例如呈凍乾形式或如同水溶液)和以下之一或多者的包裝： • 第二治療劑，例如如下所述的免疫檢查點抑制劑； • 用於投予抗VSIG4抗體的裝置，例如筆、針及/或注射器；以及 • 假使該抑制劑係呈抗體形式，用以使抗體重懸的醫藥級用水或緩衝液。
可將抗VSIG4抗體(或其抗原結合片段或其綴合物)的各個單位劑量分開包裝，套組可含有一個或多個單位劑量(例如兩單位劑量、三單位劑量、四單位劑量、五單位劑量、八單位劑量、十單位劑量或更多)。在一具體實施方案中，一個或多個單位劑量係各自容納在注射器或筆中。 有效量
抗VSIG4抗體、其抗原結合片段及其綴合物，任擇地與免疫檢查點抑制劑組合，通常以有效達到預期結果的量使用，例如在對其有需要之個體中有效治療癌症的量。包含抗VSIG4抗體(或其抗原結合片段或其綴合物)及/或免疫檢查點抑制劑的醫藥組成物可以治療有效劑量投予患者(例如人類個體)。
有效量的測定完全在熟習此藝者的能力以內，尤其按照本案提供的詳細揭示。化合物或綴合物的毒性和治療功效可藉由細胞培養和實驗動物中的標準藥學程序測定。待投予至一個體的本組合或其他治療劑的有效量將取決於疾病(例如癌症)的階段、類別和狀態以及該個體的特性，例如一般健康狀況、年齡、性別、體重和藥物耐受性。待投藥的本治療劑或組合的有效量亦將取決於投藥途徑和劑型。可個別調整劑量和間隔，以提供足以維持所欲治療效果的活性化合物的血漿位準。
所投予的抗VSIG4抗體或其抗原結合片段或其綴合物的量將取決於多種因素，包括所治療疾病(例如癌症)的本質和階段、投藥的形式、途徑和部位、治療方案(例如治療劑是否與免疫檢查點抑制劑組合使用)、所治療的特定個體的年齡和病況、用抗體或綴合物治療的患者的敏感性。熟習此藝者可容易地判定適當的劑量。最終，醫生將判定待使用的適當劑量。此劑量可酌情重複。假使出現副作用，可根據正常的臨床實務改變或減少劑量的量及/或頻率。可藉由使用熟習此藝者已知的常規技術監測治療的進展來建立適當的劑量和治療方案。
有效劑量可由體外試驗初始估計。例如，可調配用於動物的初始劑量以達到抗VSIG4抗體的循環血液或血清濃度，其等於或高於體外所測得的抗體對VSIG4的結合親和力。考慮到特定抗體的生物利用度來計算達到此循環血液或血清濃度的劑量完全在技術人員的能力以內。為獲得指導，讀者可參照Fingl & Woodbury, “General Principles” in Goodman and Gilman’s The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, Chapter 1, latest edition, Pagamonon Press，以及其中引用的文獻。初始劑量可從體內資料，例如動物模型估計。用於測試化合物治療特定疾病，例如癌症的功效的動物模型在本領域中通常是眾所周知的。普通技術人員可常規調整此類訊息以測定適用於人類投藥的劑量。
如本案所述的抗VSIG4抗體的有效劑量可介於每單次(例如推注)投藥、多次投藥或連續投藥約0.001至約75 mg/kg的範圍內，或每單次(例如推注)投藥、多次投藥或連續投藥達到血清濃度0.01-5000 μg/ml，或其中的任何有效範圍或值，其取決於所治療的病況、投藥途徑以及個體的年齡、體重和病況。在某個實施方案中，各個劑量可介於每公斤體重約0.5 μg至約50 μg，例如每公斤體重約3 μg至約30 μg的範圍。
投藥的量、頻率和持續時間將取決於多種因素，例如患者的年齡、體重和疾病狀況。用於投藥的治療方案可持續2週至無限期、2週至6個月、自3個月至5年、自6個月至1或2年、自8個月至18個月等。任擇地，治療方案提供重複投藥，例如每天一次、每天兩次、每兩天、三天、五天、一週、兩週或一個月。重複投藥可為相同劑量或不同劑量。投藥可重複一次、兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次。治療有效量的抗VSIG4抗體或其綴合物(任擇與免疫檢查點抑制劑組合)可作為單次劑量或在治療方案的過程中投予， 例如在一週、兩週、三週、一個月、三個月、六個月、一年或更長時間的過程中投予。 治療方法
本發明的抗VSIG4抗體誘發免疫反應的能力，例如藉由促進巨噬細胞極化，特別是TAM極化及/或拮抗VSIG4抗炎功能及/或抑制VSIG4介導的免疫抑制使其可用於治療VSIG4 介導的多種病況，包括癌症。對VSIG4抑制途徑的治療干預於是代表一種調節炎症和T細胞介導的免疫以治療廣泛多種癌症的有希望方式。
本案所述的抗VSIG4抗體、其抗原結合片段或綴合物於是可用於治療癌症、誘發巨噬細胞釋放促炎細胞激素、誘發CD4 +T細胞增殖、誘發CD8 +T細胞增殖、誘發CD4 +T細胞的細胞激素產生，並誘發CD8 +T細胞的細胞激素產生的方法中，其中該等方法包含將有效量的抗VSIG4抗體、其抗原結合片段或綴合物投予對其有需要之患者。本案所述的抗VSIG4抗體、其抗原結合片段或綴合物於是可用於治療癌症、誘發巨噬細胞釋放促炎細胞激素、誘發CD4 +T細胞增殖、誘發CD8 +T細胞增殖、誘發CD4 +T細胞的細胞激素產生，和/或誘發CD8 +T細胞的細胞激素產生的方法中，其中該等方法包含將有效量的抗VSIG4抗體、其抗原結合片段或綴合物投予對其有需要之患者。更佳地，本案所述的抗VSIG4抗體、其抗原結合片段或綴合物於是可用於治療癌症的方法，其中該治療包含將巨噬細胞的極化從M2切換成M1表型，且其中該方法包含將有效量的抗VSIG4抗體、其抗原結合片段或綴合物投予對其有需要之患者。甚至更佳地，該巨噬細胞是TAM，並且將該些TAM的極化切換為朝向M1表型，致使免疫抑止活性和抗炎活性的降低。本案所述的治療方法可包含將特異性結合本案所述VSIG4的抗體或其抗原結合片段或包含本案揭示的該些抗體的綴合物投予對其有需要之患者。本案揭示的VSIG4抗體、抗原結合片段及其綴合物於是可用於調節免疫，尤其是T細胞免疫，以治療癌症。
據此，本揭示的一個態樣關於一種用於治療患者中的癌症的抗VSIG4抗體或其抗原結合片段或其綴合物。本案還提供了一種在對其有需要之患者中治療癌症的方法，該方法包含將本案揭示的抗VSIG4抗體、其抗原結合片段或綴合物投予該患者。本揭示還關於一種將抗VSIG4抗體或其抗原結合片段或其綴合物用於製造治療癌症的醫藥品之用途。
在一個實施方案中，本揭示關於一種包含本案揭示的抗VSIG4抗體或其抗原結合片段或綴合物的組成物，其用於治療患者中的癌症。本案還提供了一種在對其有需要之患者中治療癌症的方法，該方法包含將包含本案揭示的抗VSIG4抗體、其抗原結合片段或綴合物的組成物投予該患者。本揭示還關於一種包含本案揭示的抗VSIG4抗體或其抗原結合片段或綴合物的組成物用於製造治療癌症的醫藥品之用途。
在一些實施方案中，癌症選自膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮內膜癌、食道癌、輸卵管癌、膽囊癌、胃腸道癌、頭頸癌、血液系統癌(例如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤)、喉癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、間皮瘤、卵巢癌、原發性腹膜癌、唾液腺癌、肉瘤、胃癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腎細胞癌、膠質母細胞瘤和前列腺癌。
本發明的抗體特別有用，因為彼等可在患者中，例如癌症患者中誘發免疫反應，如上文詳述。因此，在一個實施方案中，抗VSIG4抗體或其抗原結合片段或其綴合物的用途係用於治療患者中的癌症，其中該用途包含在該患者中誘發免疫反應。本案還提供了一種在對其有需要之患者中治療癌症的方法，該方法包含將包含本案揭示的抗VSIG4抗體、其抗原結合片段或綴合物的組成物投予該患者並在此患者中誘發免疫反應。本揭示還關於一種將抗VSIG4抗體或其抗原結合片段或其綴合物用於製造治療癌症的醫藥品之用途，其中該治療包含在該患者中誘發免疫反應。
在一個實施方案中，本揭示關於一種包含本案揭示的抗VSIG4抗體或其抗原結合片段或綴合物的組成物，其用於治療患者中的癌症，其中該用途包含在該患者中誘發免疫反應。本案還提供了一種在對其有需要之患者中治療癌症的方法，該方法包含將包含本案揭示的抗VSIG4抗體、其抗原結合片段或綴合物的組成物投予該患者並在此患者中誘發免疫反應。本揭示還關於一種包含本案揭示的抗VSIG4抗體或其抗原結合片段或綴合物的組成物用於製造治療癌症的醫藥品之用途，其中該治療包含在該患者中誘發免疫反應。
一個實施方案提供一種抗VSIG4抗體或其抗原結合片段或其綴合物，其用於在癌症患者中誘發免疫反應。本案還提供了一種在對其有需要之癌症患者中誘發免疫反應的方法，該方法包含將本案揭示的抗VSIG4抗體、其抗原結合片段或綴合物投予該患者。本揭示還關於一種將抗VSIG4抗體或其抗原結合片段或其綴合物用於製造在癌症患者中誘發免疫反應的醫藥品之用途。
在一個實施方案中，本揭示關於一種包含本案揭示的抗VSIG4抗體或其抗原結合片段或綴合物的組成物，其用於在癌症患者中誘發免疫反應。本案還提供了一種在對其有需要之癌症患者中誘發免疫反應的方法，該方法包含將包含本案揭示的抗VSIG4抗體、其抗原結合片段或綴合物的組成物投予該患者。本揭示還關於一種包含本案揭示的抗VSIG4抗體或其抗原結合片段或綴合物的組成物用於製造在癌症患者中誘發免疫反應的醫藥品之用途。
由本案揭示的抗體依此生成的免疫反應包括但不限於巨噬細胞(尤其是 TAM)極化成M1表型、誘發巨噬細胞釋放促炎細胞激素、誘發CD4 +T細胞增殖、誘發CD8 +T細胞增殖、誘發CD4 +T細胞的細胞激素產生和誘發CD8 +T細胞的細胞激素產生。較佳地，將TAM極化切換朝向M1表型，致使降低了免疫抑止活性、血管生成和腫瘤促進。
抗VSIG4抗體或其抗原結合片段或綴合物可與第二治療劑混合。
「治療劑」涵蓋生物劑，例如抗體、肽、蛋白質、酶和化療劑。治療劑亦涵蓋細胞結合劑(CBA)和化學化合物的免疫綴合物，例如抗體-藥物綴合物(ADC)。綴合物中的藥物可為細胞毒性劑，例如本案所述者。
如本案所用，假使抗VSIG4抗體或其抗原結合片段或綴合物和其他治療劑在同一天例如在同一患者就診期間投予該患者，則稱彼等是連續投予。連續投藥可相隔1、2、3、4、5、6、7或8小時進行。相反，假使將本揭示內容的抗VSIG4抗體或其抗原結合片段或綴合物與其他治療劑在不同的日子投予患者，則稱彼等是分開投予，例如本揭示的抗VSIG4抗體或其抗原結合片段或綴合物和其他治療劑可以1天、2天或3天、1週、2週或每月間隔投予。在本揭示的方法中，本揭示的抗VSIG4抗體或其抗原結合片段或綴合物的投藥可在其他治療劑的投藥之前或之後。
作為非限制性範例，抗VSIG4抗體或其抗原結合片段或綴合物及其他治療劑可同時投藥一段時間，接著第二段時間，其中本揭示的抗VSIG4抗體或其抗原結合片段或綴合物及其他治療劑是交替的。
本揭示的組合療法可得到大於相加或協同的效果，提供治療益處，其中抗VSIG4抗體或其抗原結合片段或綴合物、其他治療劑皆不是以單獨之治療有效量投予。因此，此類藥劑可以較低的量投予，進而降低副作用的可能性及/或嚴重性。
在較佳的實施方案中，其他治療劑是化療劑。該化療劑較佳為烷基化劑、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、 有絲分裂抑制劑、染色質功能抑制劑、抗血管生成劑、抗雌激素、抗雄激素或免疫調節劑。
如本案所用的術語「烷基化劑」是指可在細胞內交聯或烷基化任何分子，較佳核酸(例如DNA)的任何物質。烷化劑的範例包括氮芥，例如二氯甲基二乙酸(mechlorethamine)、苯丁酸氮芥(chlorambucol)、美法崙(melphalen)、可律靜(chlorydrate)、哌泊溴(pipobromen)、潑尼莫司汀(prednimustin)、磷酸二氫鈉(disodic-phosphate)或雌莫司汀(estramustine)；噁唑啉，例如環磷醯胺(cyclophosphamide)、阿曲他明、曲磷醯胺(trofosfamide)、磺胺磷醯胺(sulfofosfamide)或異環磷醯胺(ifosfamide)；氮丙啶類或亞胺-乙烯類，例如噻替帕(thiotepa)、三乙烯胺或六甲蜜胺(altetramine)；亞硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、鏈脲佐菌素(streptozocin)、氟替莫司汀(fotemustin)或洛莫司汀(lomustine)；烷基磺酸鹽，例如白消安(busulfan)、硫丹(treosulfan)或丙硫丹(improsulfan)；三氮烯，如達卡巴嗪(dacarbazine)；或鉑錯合物，例如順鉑(cis-platinum)、奧沙利鉑(oxaliplatin)和卡鉑(carboplatin)。
如本案所用的「抗代謝物」用語是指藉由干擾某些活性(通常是DNA合成)來阻斷細胞生長及/或代謝的物質。抗代謝物的範例包括甲胺蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluoruracil)、氟尿苷(floxuridine)、5-氟脫氧尿苷(5-fluorodeoxyuridine)、卡培他濱(capecitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟達拉濱(fludarabine)、阿拉伯糖胞苷(cytosine arabinoside)、6-巰基嘌呤(6-MP)、6-硫鳥嘌呤(6-TG)、氯脫氧腺苷(chlorodesoxyadenosine)、5-氮雜胞苷(5-azacytidine)、吉西他濱(gemcitabine)、克拉屈濱(cladribine)、脫氧可福黴素(deoxycoformycin)和噴司他丁(pentostatin)。
如本案所用，「抗腫瘤抗生素」是可防止或抑制DNA、RNA及/或蛋白質合成的化合物。抗腫瘤抗生素的範例包括多柔比星(doxorubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、伊達比星(idarubicin)、伐柔比星(valrubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、放線菌素(dactinomycin)、光輝黴素(mithramycin)、普卡黴素(plicamycin)、絲裂黴素C(mitomycin C)、博來黴素(bleomycin)和丙卡巴肼(procarbazine)。
如本案所用的「有絲分裂抑制劑」係阻止細胞週期和有絲分裂的正常進程。一般來說，微管抑制劑或紫杉醇類，例如紫杉醇(paclitaxel)和多烯紫杉醇(docetaxel)能夠抑制有絲分裂。長春花生物鹼，例如長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、長春地辛(vindesine)和長春瑞濱(vinorelbine)也能夠抑制有絲分裂。
如本案所用，術語「染色質功能抑制劑」或「拓撲異構酶抑制劑」是指抑制染色質建模蛋白，例如拓撲異構酶I或拓撲異構酶II的正常功能的物質。染色質功能抑制劑的範例包括，就拓撲異構酶I而言，喜樹鹼(camptothecine)及其衍生物，例如拓撲替康(topotecan)或伊立替康(irinotecan)；就拓撲異構酶II而言，依托泊苷(etoposide)、依托泊苷磷酸鹽和替尼泊苷(teniposide)。
如本案所用，術語「抗血管生成劑」是指抑制血管生長的任何藥物、化合物、物質或藥劑。例示性抗血管生成劑包括但不限於哌唑嗪(razoxin)、馬立馬司他(marimastat)、巴馬司他(batimastat)、普利司他(prinostat)、坦諾司他(tanomastat)、伊洛馬司他(ilomastat)、CGS-27023A、鹵夫酮(halofuginon)、COL-3、新伐司他(neovastat)、BMS-275291、沙利竇邁(thalidomide)、CDC 501、DMXAA、 L-651582、角鯊胺、內皮抑素(endostatin)、SU5416、SU6668、干擾素-α、EMD121974、介白素-12、IM862、血管抑制素和維他欣(vitaxin)。
如本案所用，術語「抗雌激素」或「抗雌激素劑」是指降低、拮抗或抑制雌激素作用的任何物質。抗雌激素劑的範例是他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、碘氧芬(iodoxyfene)、阿那曲唑(anastrozole)、來曲唑(letrozole)和依西美坦(exemestane)。
如本案所用，術語「抗雄激素」或「抗雄激素劑」是指減少、拮抗或抑制雄激素作用的任何物質。抗雄激素的範例是氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、螺內酯(sprironolactone)、乙酸環丙孕酮(cyproterone acetate)、非那雄胺(finasteride)和西咪替丁(cimitidine)。
如本案所用的「免疫調節劑」是刺激免疫系統的物質。
免疫調節劑的範例包括干擾素、介白素，例如阿地白素(aldesleukine)、OCT-43、地尼介白素(denileukin diflitox)和介白素-2、腫瘤壞死因子，例如他松那明(tasonermine)或其他免疫調節劑，例如蘑菇多糖(lentinan)、西佐非蘭(sizofiran)、羅喹美司(roquinimex)、匹多莫德(pidotimod)、培加酶(pegademase)、胸腺五肽(thymopentine)、聚I:C或左旋咪唑(levamisole)聯合5-氟尿嘧啶。
對於更多細節，發明所屬領域中具通常知識者可參照由“Association Française des Enseignants de Chimie Thérapeutique”所編輯，標題為“Traité de chimie thérapeutique”，vol. 6, Médicaments antitumouraux et perspectives dans le traitement des cancers, edition TEC & DOC, 2003的手冊。
所有激酶抑制劑，例如吉非替尼或厄洛替尼亦可作為化學劑或細胞毒性劑被提及。
更一般地，適宜化療劑的範例包括但不限於1-去氫睾酮、5-氟尿嘧啶去卡巴肼(5-fluorouracil decarbazine)、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、放線菌素D、阿黴素(adriamycin)、阿地介白素、烷化劑、別嘌醇鈉(allopurinol sodium)、阿曲他明、氨磷汀、阿那曲唑、蒽黴素(AMC))、抗有絲分裂劑、順式二氯二胺鉑(II) (DDP)順鉑)、二胺基二氯鉑、蒽環類、抗生素、抗代謝物、天冬醯胺酶、BCG活菌(膀胱內)、倍他米松(betamethasone)磷酸鈉和倍他米松乙酸鹽、比卡魯胺、博來黴素硫酸鹽、白消安、亮紅黴素鈣、卡奇黴素、卡培他濱、卡鉑、洛莫司汀(CCNU)、卡莫司汀(BSNU)、苯丁酸氮芥、順鉑、克拉屈濱、秋水仙鹼、綴合雌激素、環磷醯胺、環崔醯胺(Cyclothosphamide)、阿糖胞苷、阿糖胞苷、細胞鬆弛素B、癌德星(Cytoxan)、達卡巴嗪、更生黴素、更生黴素(原放線菌素)、柔紅黴素HCL、柔紅黴素檸檬酸鹽、地尼介白素、德雷佐生、二溴甘露醇(Dibromomannitol)、二羥基蒽二酮、多西他賽、多拉司瓊甲磺酸鹽、多柔比星HCL、屈大麻酚、大腸桿菌L-天冬醯胺酶、依米汀(emetine)、宜保利-α、歐文氏菌(Erwinia) L-天冬醯胺酶、酯化雌激素、雌二醇、雌莫司汀磷酸鈉、溴化乙定(ethidium bromide)、乙炔雌二醇、依替膦酸鹽(etidronate)、檸檬酸依托泊苷因子(etoposide citrororum factor)、磷酸依托泊苷、非格司亭、氟尿嘧啶、氟康唑(fluconazole)、磷酸氟達拉濱、氟尿嘧啶、氟他胺、亞葉酸、吉西他濱HCL、糖皮質激素、乙酸戈舍瑞林、短桿菌肽D (gramicidin D)、格拉司瓊HCL、羥基脲、伊達比星HCL、異環磷醯胺、干擾素α-2b、伊立替康HCL、來曲唑、亞葉酸鈣、乙酸亮丙瑞林、左旋咪唑HCL、利多卡因、洛莫司汀、美登素、甲氯乙胺HCL、乙酸甲羥孕酮、乙酸甲地孕酮、美法崙HCL、巰基嘌呤、美司鈉( mesna)、胺甲喋呤、甲基睾酮、光神黴素、絲裂黴素 C、米托坦、米托蒽醌、尼魯米特、乙酸奧曲肽、昂丹司瓊HCL、奧沙利鉑、紫杉醇、帕米膦酸二鈉、噴司他丁、毛果芸香鹼HCL、普利黴素、波耐森20 (polifeprosan 20)與卡莫司汀植入物、福得靈、普魯卡因、丙卡巴肼HCL、普萘洛爾(propranolol)、利妥昔單抗(rituximab)、沙格司亭、鏈脲佐菌素、他莫昔芬、紫杉醇、替加氟、替尼泊苷、替諾泊苷(tenoposide)、睾酮內酯、丁卡因(tetracaine)、苯丁酸氮芥、硫鳥嘌呤、噻替哌、托泊替康HCL、檸檬酸托瑞米芬、曲妥珠單抗、維甲酸、伐柔比星、硫酸長春鹼、硫酸長春新鹼和酒石酸長春瑞濱(vinorelbine tartrate)。
本案揭示的抗VSIG4抗體或其抗原結合片段或綴合物可投予對接受化療劑組合治療癌症有需要之患者。化療劑的例示性組合包括5-氟尿嘧啶(5FU)與亞葉酸(亞葉酸或LV)組合；卡培他濱與尿嘧啶(UFT)和亞葉酸組合；替加氟與尿嘧啶(UFT)和亞葉酸組合；奧沙利鉑與5FU組合或與卡培他濱組合；伊立替康與卡培他濱組合，絲裂黴素C與5FU、伊立替康或卡培他濱組合。使用本案揭示的化療劑的其他組合也是可能的。
抗VSIG4抗體或其抗原結合片段或綴合物也可與其他治療性抗體組合。據此，基於本案揭示的抗VSIG4抗體或其抗原結合片段或綴合物的治療可與不同的單株抗體組合或輔助投予，例如但不限於抗-EGFR (EGF受體)單株抗體或抗VEGF單株抗體。抗EGFR抗體的具體例子包括西妥昔單抗(cetuximab)和帕尼單抗(panitumumab)。抗VEGF抗體的一個具體例子是貝伐單抗(bevacizumab)。
值得注意的是，本案所述的治療方法可包含免疫檢查點抑制劑與抗VSIG4抗體或其抗原結合片段或綴合物一起投予。免疫檢查點抑制劑和抗VSIG4抗體或其抗原結合片段或綴合物可同時、分開或依次投予。
如本案所用，「檢查點抑制劑」是指靶向免疫檢查點並阻斷該免疫檢查點功能的分子，例如小分子、可溶性受體或抗體。更具體地，如本案所用的「檢查點抑制劑」是阻斷由某些類型的免疫系統細胞，例如T細胞製造的某些蛋白質的分子，例如小分子、可溶性受體或抗體，以及一些癌細胞。
在第一個實施方案中，免疫檢查點抑制劑是CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIGIT、TIM3、GAL9、LAG3、PSG-L1、 VISTA、KIR、2B4(屬於CD2分子家族，在所有 NK、γδ和記憶CD8+ (αβ) T細胞上表現)、CD160 (也稱作BY55)、CGEN-15049、CHK 1和CHK2激酶、IDO1、A2aR和任何各種B-7家族配體。
例示性免疫檢查點抑制劑包括抗CTLA-4抗體(例如易普利單抗(ipilimumab))、抗LAG-3抗體(例如BMS-986016)、抗B7-H3抗體、抗B7-H4抗體、抗Tim3抗體(例如TSR-022、MBG453)、抗BTLA抗體、抗KIR抗體、抗A2aR抗體、抗CD200抗體、抗PD-1抗體(例如派姆單抗(pembrolizumab)、納武單抗(nivolumab)、西米普利單抗(cemiplimab)、匹利珠單抗(pidilizumab))、抗PD- L1抗體(例如阿替利珠單抗(atezolizumab)、阿維魯單抗(avelumab)、度伐利尤單抗(durvalumab)、BMS 936559)、抗TIGIT抗體(例如提瑞單抗(tiragolumab)、維伯單抗(vibostolimab))、抗VISTA抗體(例如JNJ 61610588)、抗CD28抗體、抗CD80或抗CD86抗體、抗B7RP1抗體、抗B7-H3抗體、抗HVEM抗體、抗CD137抗體(例如尤瑞單抗(urelumab))、抗CD137L抗體、抗OX40 (例如，9B12、PF-04518600、MEDI6469)、抗OX40L抗體、抗CD40或抗CD40L 抗體、抗GAL9抗體、抗IL-10抗體、PD-1配體胞外域的融合蛋白，例如PDL-1或PD-L2和 IgG1 (例如AMP-224)、OX40配體胞外域的融合蛋白，例如OX40L和IgG1 (例如MEDI6383)、IDO1藥物(例如艾帕卡度(epacadostat))和A2aR藥物。許多免疫檢查點抑制劑已獲批准或正在進行臨床試驗。此類抑制劑包括易普利單抗、派姆單抗、納武單抗、西米普利單抗、匹利珠單抗、阿替利珠單抗、阿維魯單抗、度伐利尤單抗、提瑞單抗、維伯單抗、BMS 936559、JNJ 61610588、尤瑞單抗、9B12、PF-04518600、BMS-986016、TSR-022、MEDIG453、MEDI6469、MEDI6383和艾帕卡度。
免疫檢查點抑制劑的範例係例如列於Marin-Acevedo et al., Journal of Hematology & Oncology 11: 8, 2018；Kavecansky and Pavlick, AJHO 13(2): 9-20, 2017；Wei et al., Cancer Discov 8(9): 1069–86, 2018。
較佳地，免疫檢查點抑制劑是CTLA-4、LAG-3、Tim3、PD-1、PD-L1、PSG-L1、VISTA、CD137、OX40或IDO1的抑制劑。 診斷方法
VSIG4在多種癌症中過度表現，表明VSIG4是診斷癌症的可靠生物標記。本案提供的與VSIG4蛋白結合的諸如經標記抗體的試劑於是可用於診斷目的，以偵測、診斷或監測細胞增殖性疾病、病症或病況，例如癌症。
本案提供的抗VSIG4抗體可用於使用本案所述或熟習此藝者已知的經典免疫組織學方法在生物樣本中偵測VSIG4或試驗VSIG4位準(例如參閱Jalkanen et al., 1985, J.Cell. Biol. 101:976-985；與Jalkanen et al., 1987, J.Cell. Biol. 105:3087-3096)。其他可用於偵測蛋白質基因表現的基於抗體的方法包括免疫試驗，例如酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和放射免疫試驗(RIA)。適宜的抗體試驗標記是本領域已知的且包括酶標記，例如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，例如碘( 125I、 121I)、碳( 14C)、硫( 35S)、氚( 3H)、銦( 121In)和鎝( 99Tc)；發光標記，例如流明諾；和螢光標記，例如螢光素和羅丹明，以及生物素。
因此，在第一態樣中，本發明關於一種用於偵測在個體中表現VSIG4的癌症的體外方法，該方法包含以下步驟： a) 使該個體的生物樣本與本案揭示的抗VSIG4抗體或其抗原結合片段接觸；以及 b) 偵測該抗體或其抗原結合片段與該生物樣本的結合。
根據本方法，抗VSIG4抗體的結合表示存在表現VSIG4的癌症。較佳地，腫瘤微環境的免疫浸潤物中的抗VSIG4抗體的結合表示存在表現VSIG4的癌症。
本發明亦關於一種用於偵測在個體中表現VSIG4的癌症的體外方法，該方法包含以下步驟： a) 使該個體的生物樣本與抗VSIG4抗體或其抗原結合片段接觸；以及 b) 量化該抗體或其抗原結合片段與該生物樣本的結合。
根據本方法，抗VSIG4抗體的結合表示存在表現VSIG4的癌症。較佳地，腫瘤微環境的免疫浸潤物中的抗VSIG4抗體的結合表示存在表現VSIG4的癌症。
如熟習此藝者顯而易見的，結合至VSIG4的抗體位準可藉由熟習此藝者已知的任何方式來量化，如下文詳述。較佳的方法包括使用免疫酶試驗，例如ELISA或ELISPOT、免疫螢光、免疫組織化學(IHC)、放射免疫測試驗(RIA)或FACS。
本方法步驟b)的量化是直接反映樣本中，特別是腫瘤微環境的免疫浸潤物中的VSIG4表現的位準。本方法因此允許藉由測定VSIG4的表現位準來識別表現VSIG4的癌症，如上所述。在較佳的實施方案中，將該樣本中，特別是腫瘤微環境的免疫浸潤物中的VSIG4的表現位準與參考位準進行比對。
根據進一步較佳的實施方案，本發明關於一種用於偵測在個體中表現VSIG4的癌症的體外方法，該方法包含以下步驟： a) 測定該個體的生物樣本中的VSIG4表現位準；以及 b) 將步驟a)的表現位準與參考位準進行比對； 其中步驟a)中VSIG4的試驗位準相較於參考位準的增加係指示表現VSIG4的癌症。
本發明亦關於一種用於診斷在個體中表現VSIG4的癌症的體外方法，該方法包含以下步驟： a) 測定該個體的生物樣本中的VSIG4表現位準；以及 b) 將步驟a)的表現位準與參考位準進行比對； 其中步驟(b)中VSIG4的試驗位準相較於參考位準的增加係指示表現VSIG4的癌症。
VSIG4的表現位準有利地與對照組細胞或樣本中的位準，也稱作「參考位準」或「參考表現位準」進行比對或測量。「參考位準」、「參考表現位準」、「對照組位準」和「對照組」在說明書中可互換使用。「對照組位準」意指在相仿的對照組細胞中所測得的單獨基線位準，該對照組細胞通常沒有疾病或癌症。對照組細胞可來自同一個體，因為即使在癌症患者中，腫瘤部位的組織仍然包含非腫瘤健康組織。也可能來自另一個正常或不患有與獲得患病或測試樣本的相同疾病的個體。在本發明的上下文中，術語「參考位準」是指用於評估患者的含有癌細胞的樣本中的VSIG4的測試表現位準的VSIG4表現的「對照組位準」。例如，當患者的生物樣本中的VSIG4位準高於VSIG4的參考位準時，細胞將被認為具有高位準表現或過度表現的VSIG4。參考位準可藉由多種方法測定。表現位準於是可界定帶有VSIG4的細胞或者無關乎表現VSIG4的細胞數量的VSIG4表現位準。於是，各個患者的參考位準可藉由VSIG4的參考比例來規定，其中參考比例可藉由用於測定本案所述的參考位準的任何方法來決定。
例如，對照組可為預定值，其可採取多種形式。可為單一截止值，例如中位數或平均。「參考位準」可為單一數字，同樣適用於每個患者，或者參考位準可根據患者的特定亞群而變化。於是，例如，對於同一癌症，老年男性可能與年輕男性具有不同的參考位準，而對於同一癌症，女性可能與男性具有不同的參考位準。或者，「參考位準」可藉由測量來自與待測腫瘤細胞組織相同組織的非致癌癌細胞中的VSIG4表現位準來決定。再者，「參考位準」可能是患者腫瘤細胞中的VSIG4相對於同一患者非腫瘤細胞中的VSIG4位準的某個比例。「參考位準」也可以是體外培養細胞的VSIG4位準，其可經操縱以模擬腫瘤細胞，或者可以產生準確測定參考位準的表現位準的任何其他方式來操縱。另一方面，「參考位準」可基於比較組建立，例如在沒有升高的VSIG4位準的組和具有升高的VSIG4位準的組。比較組的另一個範例是具有特定疾病、病況或症狀的組和沒有該疾病的組。例如，預定值可被安排在被測群體被等分(或不等分)成若干組中，例如低風險組、中風險組和高風險組。
參考位準也可藉由比對患有相同癌症的患者群體中的VSIG4位準來決定。這可藉由例如直方圖分析來完成，其中以圖形方式呈現整個患者群組，其中第一軸代表VSIG4的位準，第二軸代表該群組中腫瘤細胞以給定位準表現VSIG4的患者數量。可藉由識別具有相同或相似位準的VSIG4的群組的亞群來決定兩個或更多分別的患者組。然後可基於最能區分這些分別組的位準來決定參考位準。參考位準也可代表兩個或多個標記的位準，其中之一是VSIG4。例如，可藉由各個標記的位準值的比例來表示兩個或更多個標記。
同樣，明顯健康的群體將具有與已知具有與VSIG4表現相關的病況的群體不同的「正常」範圍。據此，所選擇的預定值可考慮個人所屬的類別。本領域普通技術人員只需進行常規實驗即可選擇適當的範圍和類別。「升高」「增加」意指相對於選定對照組而言是較高的。通常，對照組將以適當年齡範圍內明顯健康的正常個體為基準。
亦應理解的是，根據本發明的對照組除了預定值之外還可為與實驗材料一併測試的材料樣本。範例包括從同一個體同時獲得的組織或細胞，例如來自個體的單一活體組織切片的部分或單一細胞樣本的部分。
較佳地，VSIG4的參考位準是VSIG4在正常組織樣本中的表現位準(例如來自沒有表現VSIG4的癌症的患者，或來自疾病發作前的同一患者)。
對表現VSIG4的癌症進行更明確的診斷可使衛生專業人員更早地採用預防措施或積極治療，藉此防止表現VSIG4的癌症的發展或進一步進展。
以下，根據實施例詳細解釋本發明。然而，下列實施例僅提供用於例示本發明，顯然本發明並不限於下列實施例。 實施例 實施例 1 ： VSIG4 長和短格式的性質1-1.VSIG4長和短形式在巨噬細胞上的表現
已知VSIG4是藉由巨噬細胞表現。為了測試表現是否有差異，在M1和M2巨噬細胞的提取物中尋找兩種形式的VSIG4，即VSIG4(L)和VSIG4(S)中各者的存在。
將50ng/ml的IFN-γ (285-IF, R&D)添加到GM-CSF分化的M0巨噬細胞中，以供極化成促炎M1巨噬細胞。將20ng/ml的以下各個細胞激素：IL-4 (130 .093.922, Miltenyi Biotec)、IL-10 (217-IL/CF, R&D)和TGF-β (130.095.066, Miltenyi Biotec)添加到M-CSF分化的M0巨噬細胞中，以供極化成免疫抑止的M2巨噬細胞。將分化的M0巨噬細胞與細胞激素在 37°C、5% CO 2下培育2天。在第8天獲得M1和M2極化的巨噬細胞。將極化的巨噬細胞以100ng/ml LPS (L4516, Sigma)在37°C、5% CO 2下活化4小時。然後收穫巨噬細胞並在培養基中洗滌。在LPS活化後，藉由流式細胞術評估標靶抗體在極化的M1和M2巨噬細胞上的結合情形。
將15 µg的M1和M2蛋白提取物以及100 ng的hVSIG4(L)-hFc和hVSIG4(S)-hFc在SDS-PAGE凝膠上電泳，轉移到膜上並用對VSIG4特異的多株抗體(AF4646, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)或山羊同型對照組探測。
在M2巨噬細胞的提取物中觀察到兩條預期大小的條帶(圖1B)。此結果證實先前關於VSIG4在巨噬細胞表現的資料。此外，顯示hVSIG4(S)和 hVSIG4(L)都在巨噬細胞中表現。
1-2. VSIG4長和短形式在腫瘤中的表現。
調查兩種VSIG4形式在腫瘤中的表現。VSIG4基因位於X染色體上，基因模型中繪示7個外顯子。此產生藉由選擇性剪接產生的2個信使RNA。一個長形式長-VSIG4 (uc004dwh.2)和一個短形式短-VSIG4 (uc004dwi.2)，其分別生成hVSIG4(L)和hVSIG4(S)。癌症基因組圖譜(Cancer Genome Atlas，TCGA)含有來自超過20,000種原發性癌症特徵的資料以及涵括33種癌症類型的匹配正常樣本。TCGA腫瘤表現資料(Tumour TCGA RNASeq)係用於測定兩種同功型與ISOexpresso的表現模式Yang et al., BMC Genomics(2016) 17:631; http://wiki.tgilab.org/ISOexpresso/)。
結果顯示於表3。 表 3 ：依照適應症的長VSIG4同功型和短VSIG4同功型的百分比表現
適應症 % 長 -VSIG4 (uc004dwh.2) % 短 -VSIG4 (uc004dwi.2)
膀胱癌 66 32
乳癌 74 25
結腸癌 74 25
頭頸癌 70 29
肺腺癌 74 21
肺鱗狀細胞癌 72 24
卵巢癌 78 18
前列腺癌 72 24
胃癌 77 20
腎上腺皮質癌 55 41
嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤 68 26
膽管癌 67 29
膀胱泌尿道上皮細胞癌 66 32
急性骨髓性白血病 34 0
多形性膠質母細胞瘤 71 22
侵襲性乳癌 74 25
腦低級別神經膠質瘤 71 18
子宮頸鱗狀細胞癌和子宮頸腺癌 60 35
葡萄膜黑色素瘤 65 33
結腸腺癌 74 25
子宮體子宮內膜癌 49 48
食道癌 76 22
頭頸部鱗狀細胞癌 70 29
腎臟難染腺瘤 66 34
腎臟腎明亮細胞癌 69 25
腎臟腎乳突狀細胞癌 65 31
肝臟肝細胞癌 54 44
肺腺癌 74 21
肺鱗狀細胞癌 72 24
卵巢漿液性囊腺癌 78 18
胰腺癌 70 26
間皮瘤 61 30
前列腺癌 72 24
直腸腺癌 71 27
胃腺癌 77 20
睾丸生殖細胞腫瘤 71 27
胸腺瘤 51 45
甲狀腺癌 70 27
子宮癌肉瘤 59 40
長和短的VSIG4同功型均在腫瘤中表現。 1-3.藉由hVSIG4(S)和hVSIG4(L)抑制 CD4 +T細胞的活化
在37°C用2.5µg/ml的抗CD3 OKT3抗體(BioxCell ref BE0001-2選殖體OKT3)以100µl/孔塗佈96孔盤4h，用 PBS洗滌兩次並用10µg/ml重組蛋白(VSIG4(L)-Fc (SEQ ID NO. 83)、VGIG4(S)-Fc (SEQ ID NO. 84)、PDL1-Fc (R&D Systems 156-B7)或同型對照組hIgG1 (c9G4))塗佈並在4°C培育過夜。將該等孔以PBS洗滌兩次，將從健康供體中陰性純化並經CFSE標記的200,000個CD4 +T細胞添加到各孔中的 200 µl培養基。
培養3天後，將上清液轉移到新的盤中並藉由MSD分析IFN γ釋放。此外，藉由流式細胞術分析細胞以評估其增殖率。
圖2A顯示兩種形式的VSIG4 (VSIG4(S)和VSIG4(L))均抑制CD4 +T細胞的增殖。同樣，這兩種形式都抑制CD4 +T細胞釋放IFNγ(圖 2B)。CD8 +T細胞獲得類似的結果(資料未顯示)。 實施例 2.VSIG4 抗原的生產和純化2-1.VSIG4抗原蛋白表現載體的構築
為了選殖VSIG4蛋白，使用包括位在5’與3’的限制酶位點 SfiI的VSIG4引子(表4)藉由聚合酶鏈式反應(PCR)以Jurkat細胞cDNA庫(Stratagene, USA)進行擴增，以用於僅獲得胞外域(20Arg - Ser281)。藉由使用N293F載體將擴增的PCR產物在羧基端與人類Fc (hFc)或小鼠Fc (mFc)融合(圖4)。 表 4 ：VSIG4選殖的PCR引子
引子名稱 序列訊息(5'→3')
VSIG4-F cgtcccatcctggaagtgccag (SEQ ID NO: 51)
VSIG4-R gctctttcctggcccagcactgg (SEQ ID NO: 52)
2-2.VSIG4抗原蛋白的表現與純化
藉由使用PEI (聚乙烯亞胺：#23966, Polysciences, USA)，HEK293F細胞(Invitrogen, USA)被製備的VSIG4抗原質體轉染。此後，將細胞在FreeStyle 293表現培養基(#AG100009, Thermo Fisher Scientific, USA)中培養7天，該培養基為無血清培養基。收集含有VSIG4抗原的細胞培養物並在5,000 rpm下離心10 分鐘，並使用0.22 μm TOP-濾網(Millipore, USA)去除殘留的細胞和漂浮材料。基於使用蛋白A瓊脂糖樹脂的親和力層析，進行抗原的第一次純化。使用Superdex 200 (1.5cm x 100cm)凝膠過濾層析對第一次純化後獲得的蛋白質進行第二次純化。
在還原條件下藉由SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)測定純化蛋白質的純度。結果，如圖5所示，發現純化的VSIG4-hFc和VSIG4-mFc蛋白的純度為95%或更高。 實施例 3. 人類抗 VSIG4 抗體的選擇3-1.生物淘選
將實施例2製備的VSIG4-hFc和VSIG4-mFc、以及購自Sino Biological Inc.的VSIG4-his (12163-H08H)蛋白抗原以及用作非特異性結合指標的ITGA6-Fc塗佈(50 μg)在免疫吸附管上，然後固定。
關於人類抗體庫噬菌體，使大腸桿菌細胞被具有2.7 x 10 10個變異數的人類scFv (單鏈可變片段)庫感染，然後在30°C培養16小時。培養後，進行離心分離以用PEG (聚乙二醇，Sigma)濃縮上清液，並將所得物溶於PBS緩衝液中以製備人類抗體庫。將庫噬菌體加至免疫吸附管並使其在室溫下反應2小時。然後，在用1X PBS-Tween20 (PBS-T)和1X PBS洗滌後，僅沖提出與抗原特異性結合的scFv-噬菌體。
經由大腸桿菌細胞被沖提的噬菌體再次感染以供擴增的淘選過程，獲得陽性噬菌體池。藉由第一輪擴增的噬菌體，以與第一輪相同的方式進行第二輪和第三輪淘選，不同之處在於增加PBS-T洗滌步驟的次數。結果，如表5所示，確認了相對於輸入，在第三輪淘選過程中與抗原結合的噬菌體數量在輸出時略有增加。 表 5 ：根據淘選比對抗體效價
淘選次數 輸入噬菌體數量 輸出噬菌體數量
1 3 x 10 11 1.05 x 10 6
2 5 x 10 12 2.5 x 10 5
3 3 x 10 10 2.4 x 10 7
3-2.多噬細胞ELISA
為了檢查從實施例3-1的各輪淘選過程中獲得的陽性多scFv-噬菌體抗體庫的抗原特異性，進行了多噬菌體ELISA(酶聯免疫試驗)。
將第一輪至第三輪各次淘選後的冷凍的細胞原液添加到含有2X YTCM (酵母提取物10 g、胰蛋白腖17 g、NaCl 5 g、氯黴素34 μg/ml)、2%葡萄糖和5 mM氯化鎂(MgCl 2)的培養基中(OD600 = 0.1)，然後在37°C (OD600 = 0.5至0.7)培養2至3小時。然後，用M1輔助噬菌體感染後，在含有2X YTCMK (2X YTCM，卡那黴素35μg/ml)、5mM氯化鎂和1mM IPTG的培養基中於30°C培養16小時。將培養的細胞離心(4,500 rpm，15 分鐘，4°C)並將上清液轉移到新管中。在96孔免疫盤(#439454, NUNC, USA)上，使用塗佈緩衝液在4°C以每孔100 ng的量塗佈兩種抗原中的各者達16小時，然後使用溶於PBS的4%脫脂牛奶對各孔進行固定。之後，各孔用0.2 ml PBS-T洗滌，將第一次淘選至第三次淘選的聚scFv-噬菌體以各為100μl的量加至各孔，接著在室溫反應2小時。然後再次用0.2 ml的PBS-T洗滌各孔4次，將作為二級抗體的抗M13-HRP (Amersham 27-9421-01)以1:2,000稀釋後，在室溫下進行與抗體的反應達1小時。用PBS-T洗滌後，在PC緩衝液(0.1 M Na 2HPO 4，0.005 M Na-檸檬酸鹽，pH 5.0)中製備OPD錠劑(Sigma. 8787-TAB)並添加到孔中(每孔 100 μl)以顯色10分鐘。然後，使用分光光度計(Molecular Device，USA)測量 490 nm處的吸光度。
結果顯示於圖6，其中藉由ELISA證實抗體對兩種VSIG4抗原的結合親和力在第二和第三多聚scFv-噬菌體庫中富集。 3-3.陽性噬菌體的選擇
使用含有2X YTCM、2%葡萄糖和5 mM氯化鎂的1 ml培養基，在96深孔盤(#90030，Bioneer，Korea)中，在37°C下使從具有高結合特性的多選殖體噬菌體抗體組(第三次淘選)獲得的菌落培養16小時。從培養的細胞中收集100至200 μl (OD600 = 0.1)，然後加到含有1 ml 2X YTCM、2%葡萄糖和5 mM氯化鎂的培養基，在96深孔盤中，在37°C下培養2到3小時(OD600 = 0.5至0.7)。進行M1輔助噬菌體的感染以具有MOI值為1:20，然後在含有2X YTCMK、5 mM氯化鎂和1 mM IPTG的培養基中於30℃培養16小時。
在96孔免疫盤上，在4°C以每孔100 ng的量塗佈抗原VSIG4達16小時，然後使用溶於PBS的4%脫脂牛奶對各孔進行固定。之後，用0.2 ml PBS-T洗滌各孔，將培養16小時的單一株scFv-噬菌體(分別為100個scFv-噬菌體)以100 μl 的量添加到各孔中，以在室溫下反應2小時。然後再次用0.2 ml的PBS-T洗滌各孔4次，將作為二級抗體的抗M13-HRP以1:2,000稀釋後，在室溫下進行與抗體的反應達1小時。用PBS-T (0.2 ml)洗滌後，允許發生顯色並測量490 nm處的吸光度。
結果，獲得幾十個具有高結合親和力的單噬菌體選殖體，其中兩個如圖7所示。 3-4.陽性噬菌體抗體的核苷酸定序
對於如3-3中所述已選擇的單株，使用DNA純化套組(Qiagen，Germany)進行DNA-prep以獲得DNA。韓國Macrogen被要求進行DNA定序。根據定序結果，確定所選抗體的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)的CDR位點。然後，使用NCBI網頁 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)提供的Ig BLAST程式檢查該些抗體與種系抗體組之間的相似性。結果，獲得幾十個VSIG4特異性噬菌體抗體，其中三(3)個被更具體地定徵。彼等係匯整在表2。 實施例 4. 人類抗 VSIG4 抗體的生產4-1.將scFv形式轉化為IgG形式
為了將選定的抗VSIG4單株噬菌體抗體轉化成完整的IgG形式，使用包含分別用於 SfiI/ NheI與 SfiI/ BglII的限制性酶位點的引子對對應於重鏈和輕鏈可變區的DNA序列進行PCR (iCycler iQ，BIO-RAD，USA)。將重鏈和輕鏈PCR產物與具有對應限制酶位點的各個表現載體一起消化，所得DNA產物用DNA-凝膠提取套組(Qiagen)純化。對於接合，將載體DNA (1 μl, 10 ng)、重鏈或輕鏈 DNA (100至200 ng，15 μl)、10X緩衝液(2 μl)、接合酶(1 U/μl，1 μl)和水相互混合，在室溫下放置1至2小時，然後加至用於轉形的大腸桿菌細胞(勝任細胞，XL1-blue)。使所得物在冰上保持5分鐘，然後在42℃施加熱衝擊90秒。熱衝擊後，將細胞加入1 ml培養基並在37℃培養1小時，然後鋪展在LB Amp盤上並在37℃培養16小時。收集依此獲得的菌落並用5 ml LB Amp培養基接種。在37℃培養16小時後，使用DNA-prep套組(Nuclogen)進行DNA-prep。要求對依此獲得的DNA進行DNA定序(Macrogen，韓國)。
結果，證實已轉化成完整IgG的VSIG4抗體選殖體的重鏈和輕鏈各自對應於噬菌體抗體的序列。之後，將具有經識別序列的重鏈和輕鏈質體DNA用於抗體生產。 4-2.人類抗體的生產
將製備的分別含有重鏈和輕鏈的表現載體以6:4的比例在HEK-293F細胞中進行共轉染。共轉染7天後，收集上清液並進行離心，經由0.22 μm頂部過濾器過濾以去除漂浮材料。對所得上清液進行蛋白A親和力層析以純化IgG抗體。純化後，使用甘胺酸緩衝液分離抗體，進行緩衝液交換，使最終的重懸緩衝液為PBS。藉由BCA和Nano-drop對純化的抗體進行定量以確定產生的量。然後針對還原條件和非還原條件中的各者以5 μg的負載對抗體進行SDS-PAGE分析。據此，確定了純化蛋白質的純度和遷移率。
如圖8所示，人類抗VSIG4單株抗體SA2281和SA2297在非還原條件下偵測到至少150 kDa的大小。SA2281的產率為10.4 mg/L，SA2297的產率為48 mg/L。 實施例 5. 人類抗 VSIG4 抗體的 VSIG4 結合特性5-1.VSIG4在細胞表面上的抗體結合特異性
為了確保人類VSIG4過度表現的轉形細胞池，用包含人類VSIG4的pcDNA3.1質體轉染HEK293E細胞，然後在含有400μg/ml吉歐黴素(Zeocin) (#R25001，Thermo Fisher Scientific)的選擇培養基中進行選擇過程。在選擇過程之後，藉由FACS (螢光活化細胞分選)分析，使用與APC (異綠素)螢光材料綴合的抗人類VSIG4抗體(#17-5757-42，ebioscience，美國)測定表現狀態，獲得人類VSIG4過度表現的HEK293E細胞池(圖9B)。另一方面，對於親代HEK293E細胞，藉由相同的FACS分析證實不存在VSIG4的基礎表現(圖9A)。使用這兩種細胞對抗人類VSIG4抗體SA2281和SA2297進行抗體特性的分析。
為了確認抗VSIG4抗體的細胞結合，為每個樣本製備0.5 x 10 6個細胞並使其在4°C下以0.08 μg/ml、0.4 μg/ml或2 μg/ml與抗體反應30分鐘。之後，將細胞用含有2% PBS的緩衝液洗滌3次，並在4°C反應20分鐘後，與連接有FITC (異硫氰酸螢光素)螢光材料的抗人類IgG抗體(#FI-3000，Vectorlabs)藉由與上述相同的洗滌過程洗滌細胞，然後懸浮在含有2% FPS的0.5 ml PBS中。然後在流式細胞儀上藉由FACS分析細胞。結果，發現SA2281 (左圖)和SA2297 (右圖)均以濃度依賴性方式與人類VSIG4-過度表現細胞很好地結合(圖10B)。然而，在沒有VSIG4基礎表現的HEK293E細胞中沒有結合(圖10A)。
此結果表示兩種抗體都特異性地結合到人類VSIG4抗原。 5-2.人類抗VSIG4抗體與人類天然VSIG4的結合
藉由使用增加的抗體濃度對表現人類VSIG4的 HEK293E細胞進行FACS分析來評估抗VSIG4抗體的結合特性。用WO 2020/069507所述的識別VSIG4的鼠單株抗體 m6H8及其人源化版本hz6H8-A2進行了相同的實驗。為此目的，使細胞(1x10 6個細胞/ml)與SA2281、SA2297、m6H8或hz6H8-A2在FACS緩衝液(PBS，0.1% BSA，0.01% NaN 3)之一者於4°C培育20分鐘。然後將彼等洗滌3次並與適當的二級抗體與Alexa 488在黑暗中於4°C再培育20分鐘，然後在FACS緩衝液中洗滌3次。抗VSIG4抗體m6H8或hz6H8-A2的結合立即在使用碘化丙啶(染色死細胞)識別的活細胞上進行。各個抗體獲得的最大訊號強度係設計為B max並以螢光強度平均值(MFI)表示。使用非線性迴歸分析(GraphPad Prims 4.0)計算以莫耳濃度(M)表示的結合EC 50。
各隻鼠或嵌合Ab的滴定曲線證實了所有生成的抗體都能夠識別具有典型飽和外形的天然VSIG4形式。使用非線性迴歸分析測定各個抗體的結合EC 50。EC 50值匯整在表6。 表 6 ：抗VSIG4抗體與huVSIG4的結合。
Mab EC 50(M)
SA2281 4.605E-10
SA2297 1.181E-09
m6H8 2.283E-09
 hz6H8-A2 8.917E-10
5-3.人類抗VSIG4抗體與VSIG4長短形式的結合
在第一系列實驗中，藉由ELISA測試抗VSIG4抗體SA2281和SA2297各自與VSIG4的長形式和短形式中的各者的結合。在該些條件下偵測到測試的抗VSIG4抗體中的各者與兩種形式的特異性結合(圖11A)。
為了確認此結果，藉由西方墨點法試驗抗VSIG4抗體與長型和短型VSIG4中的各者的結合。在各個情況下，用特異性抗VSIG4抗體探測100 ng hVSIG4長-hFc (L)和hVSIG4短-hFc (S)。
如圖11B所示，對於SA2281和SA2297中的各者，都觀察到兩個預期大小的條帶。相比之下，識別VSIG4的鼠單株抗體m6H8及其在WO 2020/069507所述的人源化版本hz6H8-A2僅結合VSIG4的長形式(圖12A)。此結果在ELISA試驗確認了(圖12B)。 5-4.抗VSIG4抗體的表位繪圖
為了描繪 SA2281和SA2297識別的表位，藉由ELISA試驗了彼等結合一系列攜帶特定突變的可溶性VSIG4蛋白的能力。使用的構築體在表7有詳細說明。 表 7 ：用於表位繪圖的構形。
名稱 基因 DNA (SEQ ID NO.) 蛋白質 (SEQ ID NO.) 完整選殖體(SEQ ID NO.) 結構 突變
hVSIG4-Fc VSIG4 SEQ ID NO.53 SEQ ID NO.54 SEQ ID NO.55 [LS]-[ VSIG4]-AS-[FC]   
hVSIG4-V-Fc VSIG4 SEQ ID NO.56 SEQ ID NO.57 SEQ ID NO.58 [LS]-[ VSIG4]-AS-[FC]   
VSIG4-M1-Fc VSIG4 SEQ ID NO.59 SEQ ID NO.60 SEQ ID NO.61 [LS]-QGAVGA-[ VSIG4]-LAASAAS-[FC] E24T、V25A、E27H、V29L、T30A
VSIG4-M2-Fc VSIG4 SEQ ID NO.62 SEQ ID NO.63 SEQ ID NO.64 [LS]-QGAVGA-[ VSIG4]-LAASAAS-[FC] D36T、N38R、L39M、T42S
VSIG4-M3-Fc VSIG4 SEQ ID NO.65 SEQ ID NO.66 SEQ ID NO.67 [LS]-QGAVGA-[ VSIG4]-LAASAAS-[FC] Q59L、G61N、S62Y、D63H、V65A
VSIG4-M4-Fc VSIG4 SEQ ID NO.68 SEQ ID NO.69 SEQ ID NO.70 [LS]-QGAVGA-[ VSIG4]-LAASAAS-[FC] I77V、A80T、Y82F、Q83R
VSIG4-M5-Fc VSIG4 SEQ ID NO.71 SEQ ID NO.72 SEQ ID NO.73 [LS]-QGAVGA-[ VSIG4]-LAASAAS-[FC] H87E、H90R、K91Q、V92P
VSIG4-M6-Fc VSIG4 SEQ ID NO.74 SEQ ID NO.75 SEQ ID NO.76 [LS]-QGAVGA-[ VSIG4]-LAASAAS-[FC] S97A、Q99T、S101N、T102P
VSIG4-M7-Fc VSIG4 SEQ ID NO.77 SEQ ID NO.78 SEQ ID NO.79 [LS]-QGAVGA-[ VSIG4]-LAASAAS-[FC] R108Q、S109G、H110Y、T112V、E114A
VSIG4-M8-Fc VSIG4 SEQ ID NO.80 SEQ ID NO.81 SEQ ID NO.82 [LS]-QGAVGA-[ VSIG4]-LAASAAS-[FC] T119D、P120Q、D121A、N123H、Q124L、V125I
註記：hVSIG4-Fc是長VSIG4形式。hVSIG4-V-Fc是短VSIG4形式。所有突變均在短形式中進行。 LS: 前導序列 FC: 人類IgG1 Fc域，包括鉸鏈SEQ ID No. 85)
在96孔免疫盤上，在4°C以每孔100 ng的量塗佈各種抗原達16小時，然後使用溶於PBS的4%脫脂牛奶對各孔進行固定。之後，用0.2 ml PBS-T洗滌各孔，將培養16小時的scFv-噬菌體各者以100 μl 的量添加到各孔中，以在室溫下反應2小時。然後再次用0.2 ml的PBS-T洗滌各孔4次，將作為二級抗體的抗M13-HRP以1:2,000稀釋後，在室溫下進行與抗體的反應達1小時。用PBS-T (0.2 ml)洗滌後，允許發生顯色並測量490 nm處的吸光度。
該試驗顯示SA2281結合所有構築體，除了VSIG4-M7-Fc，沒有偵測到顯著的結合。因此，抗體SA2281識別的表位包含胺基酸R108、S109、H110、T112和E114中的至少一者。
僅當使用VSIG4-M7-Fc和VSIG4-M8-Fc時，SA2297的結合才被取消。另一方面，正如在ELISA試驗中觀察到的，此抗體能夠結合所有其他構築體。抗體SA2297識別的表位包含胺基酸R108、S109、H110、T112和E114中的至少一者，以及胺基酸T119、P120、D121、N123、Q124和V125中的至少一者。
還測試了在上述篩選過程中單離的另一種抗體SA3981。當抗體與VSIG4-M7-Fc培育時，在ELISA試驗中未偵測到訊號，而觀察到與所有其他融合蛋白的結合。於是，SA3981係結合包含胺基酸R108、S109、H110、T112和E114中的至少一者的表位。 實施例 6 ：抑制 C3b 和 iC3b 的 VSIG4 結合
VSIG4的功能之一是成為巨噬細胞上的補體受體，藉由與C3b和iC3b被覆顆粒結合來促進吞噬作用(Small，2016)。
SA2281和SA2297阻斷這些相互作用的能力是使用 HTRF (均相時間解析螢光)試驗來評估。此外，也在該些試驗中評估了SA3981，其與SA2281 (M7)、hz6H8-A2 (描述於WO 2020/069507)和SA2282結合相同VSIG4表位。最後，該試驗也包括陽性對照組(多株抗VSIG4抗體AF4646)和陰性對照組(同型抗體c9G4)。
在劑量反應試驗中測試抗體，從500 nM開始，採用5次稀釋步驟。在384孔小體積白色(非結合表面(NBS)盤的各孔中，將 5 µl 4X濃度的待測化合物或緩衝液(PBS)與5 µl C3b-d2 (K00400006-MID1-154) (200 nM)或iC3b (K00400006-BBC1-165) (200 nM)、5 µl人類His標誌的VSIG4短同功型 (K00400002-BR1-117) (40 nM)或PBS和5 µl抗6His-Tb 穴狀金(cryptate gold) (Cisbio 61HT12TLB) (1/100)。在快速離心和10秒搖盤後，將盤在室溫下培育2小時，然後在適用於TR-FRET技術的多模式盤讀取器上讀取(例如：320 nm，發射620 nm和650 nm)。各個試驗以一式三份重複。
結果顯示在圖13A和13B。IC 50顯示於表8並以nM表示。
在VSIG4 C3b或iC3b相互作用試驗中獲得類似的結果。SA2281、SA2297和SA3981抗體以劑量依賴性方式抑制 VSIG4/C3b和VSIG4/iC3b兩者的相互作用。另一方面，除了最高測試劑量以外，hz6H8-A2和SA2282均未顯示出對相互作用的任何抑制。 表 8 ：抗VSIG4抗體對VSIG4/C3b和VSIG4/iC3b的抑制。
   IC 50(nM)
   C3b iC3b
AF4646 9.2 21
C9G4 Nd Nd
SA2281 7.3 9.5
SA2282 Nd Nd
SA2297 16.4 17.9
SA3981 1.4 1.9
hz6H8-A2 nd nd
實施例 7 ：人類抗 VSIG4 抗體對 VSIG4 抗炎和免疫抑止功能的抑制作用7-1.炎症試驗
為了評估抗VSIG4抗體調節巨噬細胞炎症表型的能力，對用完整Ig、人類抗VSIG4抗體SA2281和SA2297中的各者處理的巨噬細胞進行細胞激素釋放試驗。抗體SA3981被包括作為對照組。實驗方案顯示於圖14。
周邊血液單核細胞(PBMC)是藉由密度梯度離心從EFS (Etablissement Français du Sang)提供的細胞分離環從人血中單離出來。然後根據製造商的指示(130-050-201, Miltenyi Biotec)，藉由陽性免疫磁性細胞選擇從PBMC中純化單核球。
將新鮮的單核球接種在含有50 ng/ml M-CSF (130-096-492, Miltenyi Biotec)的培養基(RPMI 1640培養基+ 1%青黴素鏈黴素+ 1%丙酮酸鈉+ 1% L-麩醯胺+ 10%胎牛血清)的96孔平底處理培養盤(353072，Falcon)中。將彼等在37°C、5% CO 2培育6天，以分化成巨噬細胞。在第6天獲得分化的M0巨噬細胞。
在第6天，藉由流式細胞術評估標靶抗體與分化的M0巨噬細胞的結合。將LPS (L4516，Sigma)以100ng/ml的終濃度添加到分化的M0巨噬細胞中。以三種濃度(2.5µg/ml、5µg/ml和10µg/ml)將測試抗體或對應的同型添加到分化的M0巨噬細胞中。作為對照組，使用最終濃度為5µg/ml的已知模擬M0巨噬細胞向促炎表型釋放細胞激素的對照組抗體(R&D, Ref MAB2078, clone 287219, mIgG2a)。
將分化的M0巨噬細胞與LPS和測試抗體在37°C、5% CO 2下培育24小時。在第7天收穫細胞培養上清液並轉移到新的V形底96孔盤中進行細胞激素分析。測量 IL-10、IL-6、IL-1β、IL-12/23p40和TNF-α的濃度。根據製造商的指示(K15UQK-4和K151AOH-4，Meso Scale Discovery)使用Meso Scale Discovery技術進行量化。
評估了至少對5名供體，以考慮健康供體之間的異質性。各個實驗條件以一式三份且在一個實驗中進行。
試驗結果顯示於表9。 表 9 ：回應於VSIG4抗體治療，調節人類單核球衍生的巨噬細胞釋放的細胞激素。
   相較於同型，供體顯示出對細胞激素釋放的調節
   TNF-α IL-1β IL-12p70 IL-10 IL-6 總結
對照組 Ab D348、D349、D353、D354 D344、D348、D349、D353 D353 D345、D348、D349、D354    4個細胞激素
   4D/6 4D/6 1D/6 4D/6 0D/6   
SA2281 D348、D349、D353 D344、D345、D348、D349、D353、D354 D344、D345、D348、D349、D353、D354 D345、D349、D354 D344、D345、D348、D349、D353、D354 5個細胞激素
   3D/6 6D/6 6D/6 3D/6 6D/6   
SA2297 D348、D349、D353 D344、D345、D348、D349、D353、D354 D344、D345、D348、D349、D353、D354 D345、D348、D349、D354 D344、D345、D348、D349、D353、D354 5個細胞激素
   3D/6 6D/6 6D/6 4D/6 6D/6   
SA3981       D348 (10µg/ml)       1個細胞激素
   0D/6 0D/6 1D/6 0D/6 0D/6   
抗VSIG4抗體SA2281和SA2297均導致促炎細胞激素釋放增加及/或巨噬細胞分泌抗炎細胞激素減少，而 SA3981未觀察到細胞激素分泌的變化，即使其與 SA2281結合相同的表位(即M7)。
因此，SA2281和SA2297能夠特異性地調節人類巨噬細胞的表型。 7-2.免疫抑制試驗
測試了抗VSIG4抗體SA2281和SA2297對抗M2介導的T細胞抑制的潛力。免疫抑制試驗是基於i)自體單核球衍生的M2巨噬細胞和活化的CD4 +T細胞的共培養物和ii) IFN-γ位準的定量作為T細胞活化的替代物。實驗方案顯示於圖15。
周邊血液單核細胞(PBMC)是藉由密度梯度離心從EFS (Etablissement Français du Sang)提供的細胞分離環從人血中單離出來。然後將單核球和CD4 +T細胞從同一供體的PBMC中純化： 根據製造商的指示，藉由陽性免疫磁性細胞選擇技術(130-050-201，Miltenyi Biotec)來純化單核球，同時根據製造商的指示，藉由陰性免疫磁性細胞選擇技術(19052，STEMCELL Technologies)從單核球純化的非陽性部分中單離出CD4 +T細胞。以每個冷凍管15x10 6個細胞將CD4 +T細胞冷凍在1 ml冷凍培養基(07930, STEMCELL Technologies)，以進一步用於共培養。
將新鮮的單核球接種在含有50ng/ml M-CSF (130-096-492, Miltenyi Biotec)以供進一步的M2巨噬細胞極化或50ng/ml GM-CSF (130-093-866, Miltenyi Biotec)以供進一步的M1巨噬細胞極化的培養基(RPMI 1640培養基+ 1%青黴素鏈黴素+ 1%丙酮酸鈉+ 1% L-麩醯胺+ 10%胎牛血清)的96孔平底處理培養盤(353072, Falcon)中。將彼等在37°C、5% CO 2培育6天，以分化成巨噬細胞。在第6天獲得分化的M0巨噬細胞。
將50ng/ml的IFN-γ (285-IF, R&D)添加到GM-CSF分化的M0巨噬細胞中，以供極化成促炎M1巨噬細胞。將20ng/ml的以下各個細胞激素：IL-4 (130 .093.922, Miltenyi Biotec)、IL-10 (217-IL/CF, R&D)和TGF-β (130.095.066, Miltenyi Biotec)添加到M-CSF分化的M0巨噬細胞中，以供極化成免疫抑止的M2巨噬細胞。將分化的M0巨噬細胞與細胞激素在 37°C、5% CO 2下培育2天。在第8天獲得M1和M2極化的巨噬細胞。將極化的巨噬細胞以100ng/ml LPS (L4516, Sigma)在37°C、5% CO 2下活化4小時。然後收穫巨噬細胞並在培養基中洗滌。在LPS活化後，藉由流式細胞術評估標靶抗體在極化的M1和M2巨噬細胞上的結合情形。
將M1和M2巨噬細胞以20 000個細胞/孔接種在經典的平底96孔盤的培養基中。將彼等在37°C、5% CO 2培育24小時。以1個巨噬細胞比上5個CD4 T細胞的比例將 CD4 +T細胞添加到巨噬細胞。將CD3/CD28珠粒(111-32D, Gibco)添加到共培養物中，以32個細胞對上1個珠粒的比例活化CD4 +T細胞。
以10 µg/ml的終濃度將測試抗體或對應的同型添加到共培養物中。阿維魯單抗是抗PD-L1單株抗體，用作陽性對照組。使共培養的巨噬細胞和CD4 +T細胞在37°C、5% CO 2下培育5天。在第14天收穫細胞培養上清液並轉移到新的V形底96孔盤中進行細胞激素分析。測量了IFN-γ的濃度。根據製造商的指示(K151AEB-4，Meso Scale Discovery)使用Meso Scale Discovery技術進行量化。
評估了至少對5名供體，以考慮健康供體之間的異質性。各個實驗條件以一式三份且在一個實驗中進行。
試驗結果顯示於表10。 表 10 ：回應於VSIG4抗體處理之M2巨噬細胞介導的免疫抑制的逆轉。IFN-γ分泌的量化被用作T細胞活化的替代物。
   相較於同型，供體顯示出 IFN-γ 釋放的增加   
   D344 D345 D348 D349   
阿維魯單抗 ü        ü        2D/4
阿替利珠單抗 ü        ü     ü     3D/4
SA2281 ü        ü     ü     3D/4
SA2297 ü        ü     ü     3D/4
SA3981             0D/4
A2             0D/4
抗VSIG4抗體SA2281和SA2297均誘發CD4 +T釋放 IFN-γ，表示彼等觸發T細胞活化。相比之下，SA3981雖然與SA2281結合至相同的VSIG4區域，但沒有顯示出免疫抑止活性。 7.3 TAM極化和T細胞活化 通用設計
三方共培養測定是用於調查SA2281和SA2297抗體對TAM的活性。
在三方共培養試驗中，巨噬細胞被腫瘤細胞極化成更類似於生理巨噬細胞的巨噬細胞，即更接近體內TAM。此係藉由使用腫瘤細胞系環境並允許細胞-細胞相互作用獲得的。該些TAM樣巨噬細胞能夠抑制T細胞增殖。在此類試驗中，在TAM樣復極化至M1、T細胞活化/再活化和腫瘤細胞殺傷方面評估兩種單株抗體的效力。 來自健康供體的 PBMC ：
巨噬細胞和CD3 T細胞是獲自健康患者的新鮮血液。簡而言之，周邊單核血液細胞(PBMC)是使用費氏(Ficoll)梯度從健康供體的細胞單採環中單離出來的。在進行紅血球細胞裂解步驟之前，收穫PBMC環並在PBS 2% FBS中洗滌數次。新的洗滌後，根據製造商的說明，使用Miltenyi Biotec autoMACS® Pro分離器和CD14 MicroBeads Human套組(130-050-201, Miltenyi Biotec)實現第一次CD14 +細胞陽性選擇。將純化的CD14 +細胞接種在100 mm熱敏UpCell培養皿(174902, ThermoFisher)中，並用50 ng/ml M-CSF處理6天(在第3天重新填充含有M-CSF的培養基)，以產生 M0-2巨噬細胞。
根據製造商的指示，藉由陰性選擇技術使用得自StemCell Technologies (# 19051, StemCell Technologies)的EasySep™人類T細胞富集組，將autoMACS®Pro分離器CD14 +細胞選擇步驟的陰性部分用於單離CD3 T細胞。然後將單離的CD3 T細胞冷凍並在用於共培養之前解凍24小時。 細胞系：
MDA-MB-231 (三重陰性乳癌)、NCI-H1975 (肺)和 SKMEL-5 (黑色素瘤)係獲自ATCC，依常規生長在補充有10% FBS的DMEM或RPMI1640培養基中。該些細胞被證實在TAM樣表型中誘發巨噬細胞極化，並在該些TAM樣巨噬細胞上誘發VSIG4表現。 三方共培養試驗：
在第6天，收穫分化的M0-2巨噬細胞，並以1:1的比例與腫瘤細胞系共培養48小時，以使巨噬細胞在TAM樣表型中極化。經過2天的雙方共培養後，使用CD3/CD28珠粒(11132D，Gibco)活化CD3 T細胞，並以1:5巨噬細胞:CD3 T細胞的比例添加到雙方共培養物中，以生成5天以上的三方共培養物，有或沒有測試的單株抗體或對應的對照組同型。
在第8天藉由流式細胞儀進行第一次讀數，以使用細胞表面標記CD80/CD86/CD163/CD200R/CD206/CD14在極化步驟後檢查TAM樣巨噬細胞表型。在第13天，評估腫瘤細胞殺傷和CD3 T淋巴球活化和增殖。 腫瘤細胞生存力 / 凋亡：
抗VSIG4抗體對腫瘤細胞殺傷的效果是藉由使用CellTiter-Glo®發光細胞生存力試驗(PROMEGA®)評估腫瘤細胞生存力或藉由流式細胞術評估細胞凋亡早期標記例如7AAD來評定。
實驗方案顯示於圖16。 初步結果確認了在體外試驗期間證實的對VSIG4抗炎和免疫抑止功能的抑制。7-4.結論
炎症和免疫抑止試驗顯示，SA2281和SA2297均促進M1促炎功能並拮抗M2免疫抑制活性，這與TAM極化朝向M1表型的效果一致。相比之下，SA3981雖然共享SA2281和SA2297的一些功能(結合VSIG4的M7區域，阻斷VSIG4/C3b和VSIG4/iC3b相互作用)，但不能影響M2巨噬細胞的抗炎、促腫瘤活性。因此，SA2281和SA2297都能夠特異性地誘發免疫反應，藉此賦予保護性抗腫瘤免疫。
(無)
圖 1顯示hVSIG4(S)和hVSIG4(L)的結構和表現。(A)圖例示兩種形式的VSIG4蛋白的結構(根據Small et al., Swiss Med Wkly. (2016) 146:w14301)。(B)用於測試在巨噬細胞中的hVSIG4(L)和hVSIG4(S)表現的西方墨點法結果：rechVSIG4：重組hVSIG4(長和短)；264、265和266：從其中分離出PBMC的供體。AF4646：多株抗VSIG4抗體(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)。 圖2顯示CD4 +T細胞的活化受到hVSIG4(S)和hVSIG4(L)抑制。在重組蛋白(hVSIG4(L)-Fc、hVGIG4(S)-Fc、PDL1-Fc (R&D Systems 156-B7)或同型對照組hIgG1 (c9G4))的存在下以抗CD3 OKT3抗體(BioxCell ref BE0001-2選殖體OKT3)接觸CD4 +細胞。藉由流式細胞術測定CD4 +T細胞增生(A)和IFNγ釋放(B)。 圖3是例示本案揭示的用於篩選特異性地結合至VSIG4之單株抗體的方法的圖。 圖4是例示VSIG4抗原蛋白的表現載體的圖。 圖5顯示純化的VSIG4抗原蛋白的SDS-PAGE結果。 圖6顯示用於測試陽性多scFv-噬菌體抗體池的特異性的多噬菌體ELISA結果，其已經由每一輪(即第一輪、第二輪和第三輪)的淘選過程獲得對抗原的特異性。 圖 7顯示選擇對抗原VSIG4具有優異結合親和力的陽性噬菌體的ELISA結果。 圖 8顯示重組人類抗VSIG4單株抗體SA2281和SA2297的SDS-PAGE分析結果。 圖 9顯示藉由使用與APC螢光材料連接的抗人類VSIG4抗體對過度表現人類VSIG4的經轉形細胞進行FACS分析的結果。 圖 10顯示過度表現人類VSIG4的細胞對人類VSIG4抗體SA2281(左圖)和SA2297(右圖)的結合特異性的FACS分析結果。(A) HEK293E: 非特異性結合測試。(B) hVSIG4/HEK293E: 特異性地結合至細胞表面的VSIG4。 圖 11顯示人類單株抗VSIG4抗體SA2281和SA2297結合至hVSIG4(S)和hVSIG4(L)。(A)使用人類抗VSIG4抗體SA2281和SA2297的原始scFv版本藉由ELISA試驗與hVSIG4(S)和hVSIG4(L)的結合。(A)使用全長人類抗VSIG4抗體SA2281和SA2297藉由西方墨點法試驗與hVSIG4(S)和hVSIG4(L)的結合。NRH：非還原，加熱；RH：還原，加熱。 圖 12顯示鼠類m6H8及其人源化版本hz6H8-A2結合至 hVSIG4(L)但不結合至hVSIG4(S)。(A)西方墨點法： rechVSIG4：重組hVSIG4(長和短)； 264、265和266：從其中分離出PBMC的供體。AF4646：多株抗VSIG4抗體(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)。(B)使用hVSIG4-His(短形式)和hVSIG4 Fc(長形式)的 ELISA：m9G4：同型對照組，山羊IgG對照組：陰性對照組。 圖 13顯示抗VSIG4抗體對VSIG4與C3b(A)或iC3b(B)相互作用的效應的評估結果。實驗點是3個獨立實驗的平均(直條：SD)。 圖 14是例示本案揭示的用於在炎症試驗中測試全長人類單株抗VSIG4抗體的方法的圖。 圖 15是例示本案揭示的用於在免疫抑制試驗中測試全長人類單株抗VSIG4抗體的方法的圖。 圖 16是例示本案揭示的用於在三方共培養試驗中測試全長人類單株抗VSIG4抗體的方法的圖。 
                        
          <![CDATA[<110>  法商皮爾法伯製藥公司(PIERRE FABRE MEDICAMENT)]]>
                 南韓商Y生物股份有限公司(Y-BIOLOGICS INC)
          <![CDATA[<120>  抗VSIG4抗體或抗原結合片段及其用途]]>
          <![CDATA[<140>  TW 111107826]]>
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          <![CDATA[<170>  PatentIn版本3.5]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  399]]>
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          <![CDATA[<400>  1]]>
          Met Gly Ile Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Gly His Leu Thr Val Asp 
          1               5                   10                  15      
          Thr Tyr Gly Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro 
                      20                  25                  30          
          Trp Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly 
                  35                  40                  45              
          Tyr Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro 
              50                  55                  60                  
          Val Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Tyr Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val 
                          85                  90                  95      
          Ser Leu Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr 
                      100                 105                 110         
          Cys Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp 
                  115                 120                 125             
          Lys Ile Thr Glu Leu Arg Val Gln Lys Leu Ser Val Ser Lys Pro Thr 
              130                 135                 140                 
          Val Thr Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Phe Thr Val Pro Gln Gly Met Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Ile Ser Leu Gln Cys Gln Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ile Ser Tyr Ile 
                          165                 170                 175     
          Trp Tyr Lys Gln Gln Thr Asn Asn Gln Glu Pro Ile Lys Val Ala Thr 
                      180                 185                 190         
          Leu Ser Thr Leu Leu Phe Lys Pro Ala Val Ile Ala Asp Ser Gly Ser 
                  195                 200                 205             
          Tyr Phe Cys Thr Ala Lys Gly Gln Val Gly Ser Glu Gln His Ser Asp 
              210                 215                 220                 
          Ile Val Lys Phe Val Val Lys Asp Ser Ser Lys Leu Leu Lys Thr Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Thr Glu Ala Pro Thr Thr Met Thr Tyr Pro Leu Lys Ala Thr Ser Thr 
                          245                 250                 255     
          Val Lys Gln Ser Trp Asp Trp Thr Thr Asp Met Asp Gly Tyr Leu Gly 
                      260                 265                 270         
          Glu Thr Ser Ala Gly Pro Gly Lys Ser Leu Pro Val Phe Ala Ile Ile 
                  275                 280                 285             
          Leu Ile Ile Ser Leu Cys Cys Met Val Val Phe Thr Met Ala Tyr Ile 
              290                 295                 300                 
          Met Leu Cys Arg Lys Thr Ser Gln Gln Glu His Val Tyr Glu Ala Ala 
          305                 310                 315                 320 
          Arg Ala His Ala Arg Glu Ala Asn Asp Ser Gly Glu Thr Met Arg Val 
                          325                 330                 335     
          Ala Ile Phe Ala Ser Gly Cys Ser Ser Asp Glu Pro Thr Ser Gln Asn 
                      340                 345                 350         
          Leu Gly Asn Asn Tyr Ser Asp Glu Pro Cys Ile Gly Gln Glu Tyr Gln 
                  355                 360                 365             
          Ile Ile Ala Gln Ile Asn Gly Asn Tyr Ala Arg Leu Leu Asp Thr Val 
              370                 375                 380                 
          Pro Leu Asp Tyr Glu Phe Leu Ala Thr Glu Gly Lys Ser Val Cys 
          385                 390                 395                 
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          <![CDATA[<211>  305]]>
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          <![CDATA[<400>  2]]>
          Met Gly Ile Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Gly His Leu Thr Val Asp 
          1               5                   10                  15      
          Thr Tyr Gly Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro 
                      20                  25                  30          
          Trp Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly 
                  35                  40                  45              
          Tyr Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro 
              50                  55                  60                  
          Val Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Tyr Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val 
                          85                  90                  95      
          Ser Leu Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr 
                      100                 105                 110         
          Cys Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp 
                  115                 120                 125             
          Lys Ile Thr Glu Leu Arg Val Gln Lys His Ser Ser Lys Leu Leu Lys 
              130                 135                 140                 
          Thr Lys Thr Glu Ala Pro Thr Thr Met Thr Tyr Pro Leu Lys Ala Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Thr Val Lys Gln Ser Trp Asp Trp Thr Thr Asp Met Asp Gly Tyr 
                          165                 170                 175     
          Leu Gly Glu Thr Ser Ala Gly Pro Gly Lys Ser Leu Pro Val Phe Ala 
                      180                 185                 190         
          Ile Ile Leu Ile Ile Ser Leu Cys Cys Met Val Val Phe Thr Met Ala 
                  195                 200                 205             
          Tyr Ile Met Leu Cys Arg Lys Thr Ser Gln Gln Glu His Val Tyr Glu 
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                          245                 250                 255     
          Gln Asn Leu Gly Asn Asn Tyr Ser Asp Glu Pro Cys Ile Gly Gln Glu 
                      260                 265                 270         
          Tyr Gln Ile Ile Ala Gln Ile Asn Gly Asn Tyr Ala Arg Leu Leu Asp 
                  275                 280                 285             
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          Cys 
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          Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala 
          1               5               
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          <![CDATA[<400>  6]]>
          Arg Asp Ile Ser Asn Tyr 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  3]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          Lys Thr Ser 
          1           
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          Gln Gln Ser Tyr Arg Thr Pro Tyr Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          Gly Phe Ile Phe Ser Asp Tyr Tyr 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          Ile Ser Pro Ser Gly Tyr Thr Ile 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          Ala Arg Arg Phe Ser Ser Ser Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Gln Asn Ile Asn Arg Trp 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  3]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          Lys Ala Phe 
          1           
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Ser Ser Ser Ile 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          Ala Arg Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          Ser Ser Asp Val Gly Asp Tyr Asn Leu 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  3]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          Glu Val Ser 
          1           
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          Ser Ser Tyr Lys Thr Gly Asp Thr Trp Leu 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser 
                      20                  25  
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala 
          1               5                   10                  15      
          Val 
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  38]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn 
          1               5                   10                  15      
          Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp 
                      20                  25                  30          
          Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                  35              
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          Trp Gly Gln Gly Thr Val Val Thr Val Ser Ser 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
          1               5                   10                  15      
          Tyr 
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  36]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          Asn Leu Gln Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 
          1               5                   10                  15      
          Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Pro Asp Asp Ser Ala 
                      20                  25                  30          
          Thr Tyr Tyr Cys 
                  35      
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 
                      20                  25  
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  30]]>
          Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 
          1               5                   10                  15      
          Tyr 
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  38]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 
          1               5                   10                  15      
          Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 
                      20                  25                  30          
          Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                  35              
          <![CDATA[<210>  32]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  32]]>
          Trp Gly His Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  33]]>
          <![CDATA[<211>  26]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  33]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210>  34]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  34]]>
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
          1               5                   10                  15      
          Tyr 
          <![CDATA[<210>  35]]>
          <![CDATA[<211>  36]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  35]]>
          Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 
          1               5                   10                  15      
          Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala 
                      20                  25                  30          
          Thr Tyr Tyr Cys 
                  35      
          <![CDATA[<210>  36]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  36]]>
          Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  37]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  37]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 
                      20                  25  
          <![CDATA[<210>  38]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  38]]>
          Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 
          1               5                   10                  15      
          Tyr 
          <![CDATA[<210>  39]]>
          <![CDATA[<211>  38]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  39]]>
          Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 
          1               5                   10                  15      
          Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 
                      20                  25                  30          
          Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                  35              
          <![CDATA[<210>  40]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  40]]>
          Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  41]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  41]]>
          Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr 
                      20                  25  
          <![CDATA[<210>  42]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  42]]>
          Val Ser Trp Tyr Gln Gln Tyr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Ile Leu 
          1               5                   10                  15      
          Tyr 
          <![CDATA[<210>  43]]>
          <![CDATA[<211>  36]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  43]]>
          Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala 
                      20                  25                  30          
          Asp Tyr Tyr Cys 
                  35      
          <![CDATA[<210>  44]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  44]]>
          Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  45]]>
          <![CDATA[<211>  118]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  45]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 
                  35                  40                  45              
          Ala Val Val Ser His Asp Gly Thr Tyr Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Gly Arg His Ala Ala Gly Ser Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Val Val Thr Val Ser Ser 
                  115             
          <![CDATA[<210>  46]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  46]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Arg Asp Ile Ser Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Lys Thr Ser Asn Leu Gln Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Arg Thr Pro Tyr 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  47]]>
          <![CDATA[<211>  121]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  47]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Tyr Thr Ile Ser Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Arg Phe Ser Ser Ser Trp Ser Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          His Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210>  48]]>
          <![CDATA[<211>  108]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  48]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Arg Trp 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Lys Ala Phe Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Ser Ser 
                          85                  90                  95      
          Ser Ile Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105             
          <![CDATA[<210>  49]]>
          <![CDATA[<211>  117]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  49]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr 
                      100                 105                 110         
          Val Thr Val Ser Ser 
                  115         
          <![CDATA[<210>  50]]>
          <![CDATA[<211>  110]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  50]]>
          Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln Tyr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Leu Tyr Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Lys Thr Gly 
                          85                  90                  95      
          Asp Thr Trp Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 
                      100                 105                 110 
          <![CDATA[<210>  51]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  引子]]>
          <![CDATA[<400>  51]]>
          cgtcccatcc tggaagtgcc ag                                                22
          <![CDATA[<210>  52]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  引子]]>
          <![CDATA[<400>  52]]>
          gctctttcct ggcccagcac tgg                                               23
          <![CDATA[<210>  53]]>
          <![CDATA[<211>  792]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  DNA (hVSIG4)]]>
          <![CDATA[<400>  53]]>
          cgtcccatcc tggaagtgcc agagagtgta acaggacctt ggaaagggga tgtgaatctt       60
          ccctgcacct atgaccccct gcaaggctac acccaagtct tggtgaagtg gctggtacaa      120
          cgtggctcag accctgtcac catctttcta cgtgactctt ctggagacca tatccagcag      180
          gcaaagtacc agggccgcct gcatgtgagc cacaaggttc caggagatgt atccctccaa      240
          ttgagcaccc tggagatgga tgaccggagc cactacacgt gtgaagtcac ctggcagact      300
          cctgatggca accaagtcgt gagagataag attactgagc tccgtgtcca gaaactctct      360
          gtctccaagc ccacagtgac aactggcagc ggttatggct tcacggtgcc ccagggaatg      420
          aggattagcc ttcaatgcca ggctcggggt tctcctccca tcagttatat ttggtataag      480
          caacagacta ataaccagga acccatcaaa gtagcaaccc taagtacctt actcttcaag      540
          cctgcggtga tagccgactc aggctcctat ttctgcactg ccaagggcca ggttggctct      600
          gagcagcaca gcgacattgt gaagtttgtg gtcaaagact cctcaaagct actcaagacc      660
          aagactgagg cacctacaac catgacatac cccttgaaag caacatctac agtgaagcag      720
          tcctgggact ggaccactga catggatggc taccttggag agaccagtgc tgggccagga      780
          aagagcctgc ct                                                          792
          <![CDATA[<210>  54]]>
          <![CDATA[<211>  264]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  蛋白質(hVSIG4)]]>
          <![CDATA[<400>  54]]>
          Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro Trp Lys Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr Thr Gln 
                      20                  25                  30          
          Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro Val Thr Ile 
                  35                  40                  45              
          Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys Tyr Gln 
              50                  55                  60                  
          Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ser Leu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu Val 
                          85                  90                  95      
          Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp Lys Ile Thr 
                      100                 105                 110         
          Glu Leu Arg Val Gln Lys Leu Ser Val Ser Lys Pro Thr Val Thr Thr 
                  115                 120                 125             
          Gly Ser Gly Tyr Gly Phe Thr Val Pro Gln Gly Met Arg Ile Ser Leu 
              130                 135                 140                 
          Gln Cys Gln Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ile Ser Tyr Ile Trp Tyr Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Gln Thr Asn Asn Gln Glu Pro Ile Lys Val Ala Thr Leu Ser Thr 
                          165                 170                 175     
          Leu Leu Phe Lys Pro Ala Val Ile Ala Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys 
                      180                 185                 190         
          Thr Ala Lys Gly Gln Val Gly Ser Glu Gln His Ser Asp Ile Val Lys 
                  195                 200                 205             
          Phe Val Val Lys Asp Ser Ser Lys Leu Leu Lys Thr Lys Thr Glu Ala 
              210                 215                 220                 
          Pro Thr Thr Met Thr Tyr Pro Leu Lys Ala Thr Ser Thr Val Lys Gln 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Trp Asp Trp Thr Thr Asp Met Asp Gly Tyr Leu Gly Glu Thr Ser 
                          245                 250                 255     
          Ala Gly Pro Gly Lys Ser Leu Pro 
                      260                 
          <![CDATA[<210>  55]]>
          <![CDATA[<211>  517]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  融合蛋白 + 前導序列(LS-hVSIG4-Fc)]]>
          <![CDATA[<400>  55]]>
          Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Ala Asp 
          1               5                   10                  15      
          Val His Ser Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro 
                      20                  25                  30          
          Trp Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly 
                  35                  40                  45              
          Tyr Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro 
              50                  55                  60                  
          Val Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Tyr Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val 
                          85                  90                  95      
          Ser Leu Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr 
                      100                 105                 110         
          Cys Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp 
                  115                 120                 125             
          Lys Ile Thr Glu Leu Arg Val Gln Lys Leu Ser Val Ser Lys Pro Thr 
              130                 135                 140                 
          Val Thr Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Phe Thr Val Pro Gln Gly Met Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Ile Ser Leu Gln Cys Gln Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ile Ser Tyr Ile 
                          165                 170                 175     
          Trp Tyr Lys Gln Gln Thr Asn Asn Gln Glu Pro Ile Lys Val Ala Thr 
                      180                 185                 190         
          Leu Ser Thr Leu Leu Phe Lys Pro Ala Val Ile Ala Asp Ser Gly Ser 
                  195                 200                 205             
          Tyr Phe Cys Thr Ala Lys Gly Gln Val Gly Ser Glu Gln His Ser Asp 
              210                 215                 220                 
          Ile Val Lys Phe Val Val Lys Asp Ser Ser Lys Leu Leu Lys Thr Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Thr Glu Ala Pro Thr Thr Met Thr Tyr Pro Leu Lys Ala Thr Ser Thr 
                          245                 250                 255     
          Val Lys Gln Ser Trp Asp Trp Thr Thr Asp Met Asp Gly Tyr Leu Gly 
                      260                 265                 270         
          Glu Thr Ser Ala Gly Pro Gly Lys Ser Leu Pro Ala Ser Glu Pro Lys 
                  275                 280                 285             
          Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 
              290                 295                 300                 
          Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 
                          325                 330                 335     
          Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 
                      340                 345                 350         
          Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 
                  355                 360                 365             
          Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 
              370                 375                 380                 
          Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 
                          405                 410                 415     
          Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 
                      420                 425                 430         
          Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 
                  435                 440                 445             
          Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 
              450                 455                 460                 
          Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 
          465                 470                 475                 480 
          Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 
                          485                 490                 495     
          Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 
                      500                 505                 510         
          Leu Ser Pro Gly Lys 
                  515         
          <![CDATA[<210>  56]]>
          <![CDATA[<211>  318]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  DNA (hVSIG4-V)]]>
          <![CDATA[<400>  56]]>
          cgtcccatcc tggaagtgcc agagagtgta acaggacctt ggaaagggga tgtgaatctt       60
          ccctgcacct atgaccccct gcaaggctac acccaagtct tggtgaagtg gctggtacaa      120
          cgtggctcag accctgtcac catctttcta cgtgactctt ctggagacca tatccagcag      180
          gcaaagtacc agggccgcct gcatgtgagc cacaaggttc caggagatgt atccctccaa      240
          ttgagcaccc tggagatgga tgaccggagc cactacacgt gtgaagtcac ctggcagact      300
          cctgatggca accaagtc                                                    318
          <![CDATA[<210>  57]]>
          <![CDATA[<211>  106]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  蛋白質(hVSIG4-V)]]>
          <![CDATA[<400>  57]]>
          Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro Trp Lys Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr Thr Gln 
                      20                  25                  30          
          Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro Val Thr Ile 
                  35                  40                  45              
          Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys Tyr Gln 
              50                  55                  60                  
          Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ser Leu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu Val 
                          85                  90                  95      
          Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val 
                      100                 105     
          <![CDATA[<210>  58]]>
          <![CDATA[<211>  359]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  融合蛋白 + 前導序列(LS-hVSIG4-V-Fc)]]>
          <![CDATA[<400>  58]]>
          Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Ala Asp 
          1               5                   10                  15      
          Val His Ser Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro 
                      20                  25                  30          
          Trp Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly 
                  35                  40                  45              
          Tyr Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro 
              50                  55                  60                  
          Val Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Tyr Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val 
                          85                  90                  95      
          Ser Leu Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr 
                      100                 105                 110         
          Cys Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Ala Ser Glu 
                  115                 120                 125             
          Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 
              130                 135                 140                 
          Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 
                          165                 170                 175     
          Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 
                      180                 185                 190         
          Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 
                  195                 200                 205             
          Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 
              210                 215                 220                 
          Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 
                          245                 250                 255     
          Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 
                      260                 265                 270         
          Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 
                  275                 280                 285             
          Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 
              290                 295                 300                 
          Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 
                          325                 330                 335     
          Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 
                      340                 345                 350         
          Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                  355                 
          <![CDATA[<210>  59]]>
          <![CDATA[<211>  348]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  DNA (VSIG4-M1)]]>
          <![CDATA[<400>  59]]>
          cgtcccatcc tgaccgcccc ccacagcctg gccggacctt ggaaagggga tgtgaatctt       60
          ccctgcacct atgaccccct gcaaggctac acccaagtct tggtgaagtg gctggtacaa      120
          cgtggctcag accctgtcac catctttcta cgtgactctt ctggagacca tatccagcag      180
          gcaaagtacc agggccgcct gcatgtgagc cacaaggttc caggagatgt atccctccaa      240
          ttgagcaccc tggagatgga tgaccggagc cactacacgt gtgaagtcac ctggcagact      300
          cctgatggca accaagtcgt gagagataag attactgagc tccgtgtt                   348
          <![CDATA[<210>  60]]>
          <![CDATA[<211>  116]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  蛋白質(VSIG4-M1)]]>
          <![CDATA[<400>  60]]>
          Arg Pro Ile Leu Thr Ala Pro His Ser Leu Ala Gly Pro Trp Lys Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr Thr Gln 
                      20                  25                  30          
          Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro Val Thr Ile 
                  35                  40                  45              
          Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys Tyr Gln 
              50                  55                  60                  
          Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ser Leu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu Val 
                          85                  90                  95      
          Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp Lys Ile Thr 
                      100                 105                 110         
          Glu Leu Arg Val 
                  115     
          <![CDATA[<210>  61]]>
          <![CDATA[<211>  380]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  融合蛋白 + 前導序列(LS-VSIG4-M1-Fc)]]>
          <![CDATA[<400>  61]]>
          Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp 
          1               5                   10                  15      
          Val His Ser Gln Gly Ala Val Gly Ala Arg Pro Ile Leu Thr Ala Pro 
                      20                  25                  30          
          His Ser Leu Ala Gly Pro Trp Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr 
                  35                  40                  45              
          Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val 
              50                  55                  60                  
          Gln Arg Gly Ser Asp Pro Val Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Asp His Ile Gln Gln Ala Lys Tyr Gln Gly Arg Leu His Val Ser His 
                          85                  90                  95      
          Lys Val Pro Gly Asp Val Ser Leu Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp 
                      100                 105                 110         
          Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly 
                  115                 120                 125             
          Asn Gln Val Val Arg Asp Lys Ile Thr Glu Leu Arg Val Leu Ala Ala 
              130                 135                 140                 
          Ser Ala Ala Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 
                          165                 170                 175     
          Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 
                      180                 185                 190         
          Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 
                  195                 200                 205             
          Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 
              210                 215                 220                 
          Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 
                          245                 250                 255     
          Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 
                      260                 265                 270         
          Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 
                  275                 280                 285             
          Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 
              290                 295                 300                 
          Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 
                          325                 330                 335     
          Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 
                      340                 345                 350         
          Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 
                  355                 360                 365             
          Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
              370                 375                 380 
          <![CDATA[<210>  62]]>
          <![CDATA[<211>  345]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  DNA (VSIG4-M2)]]>
          <![CDATA[<400>  62]]>
          cccatcctgg aagtgccaga gagtgtaaca ggaccttgga aagggaccgt gcggatgccc       60
          tgcagctatg accccctgca aggctacacc caagtcttgg tgaagtggct ggtacaacgt      120
          ggctcagacc ctgtcaccat ctttctacgt gactcttctg gagaccatat ccagcaggca      180
          aagtaccagg gccgcctgca tgtgagccac aaggttccag gagatgtatc cctccaattg      240
          agcaccctgg agatggatga ccggagccac tacacgtgtg aagtcacctg gcagactcct      300
          gatggcaacc aagtcgtgag agataagatt actgagctcc gtgtt                      345
          <![CDATA[<210>  63]]>
          <![CDATA[<211>  115]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  蛋白質(VSIG4-M2)]]>
          <![CDATA[<400>  63]]>
          Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro Trp Lys Gly Thr 
          1               5                   10                  15      
          Val Arg Met Pro Cys Ser Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr Thr Gln Val 
                      20                  25                  30          
          Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro Val Thr Ile Phe 
                  35                  40                  45              
          Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys Tyr Gln Gly 
              50                  55                  60                  
          Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ser Leu Gln Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu Val Thr 
                          85                  90                  95      
          Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp Lys Ile Thr Glu 
                      100                 105                 110         
          Leu Arg Val 
                  115 
          <![CDATA[<210>  64]]>
          <![CDATA[<211>  379]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  融合蛋白 + 前導序列(LS-VSIG4-M2-Fc)]]>
          <![CDATA[<400>  64]]>
          Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp 
          1               5                   10                  15      
          Val His Ser Gln Gly Ala Val Gly Ala Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu 
                      20                  25                  30          
          Ser Val Thr Gly Pro Trp Lys Gly Thr Val Arg Met Pro Cys Ser Tyr 
                  35                  40                  45              
          Asp Pro Leu Gln Gly Tyr Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln 
              50                  55                  60                  
          Arg Gly Ser Asp Pro Val Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp 
          65                  70                  75                  80  
          His Ile Gln Gln Ala Lys Tyr Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys 
                          85                  90                  95      
          Val Pro Gly Asp Val Ser Leu Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp 
                      100                 105                 110         
          Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn 
                  115                 120                 125             
          Gln Val Val Arg Asp Lys Ile Thr Glu Leu Arg Val Leu Ala Ala Ser 
              130                 135                 140                 
          Ala Ala Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 
                          165                 170                 175     
          Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 
                      180                 185                 190         
          Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 
                  195                 200                 205             
          Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 
              210                 215                 220                 
          Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 
          225                 230                 235                 240 
          Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 
                          245                 250                 255     
          Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 
                      260                 265                 270         
          Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 
                  275                 280                 285             
          Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 
              290                 295                 300                 
          Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 
                          325                 330                 335     
          Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 
                      340                 345                 350         
          Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 
                  355                 360                 365             
          Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
              370                 375                 
          <![CDATA[<210>  65]]>
          <![CDATA[<211>  345]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  DNA (VSIG4-M3)]]>
          <![CDATA[<400>  65]]>
          cccatcctgg aagtgccaga gagtgtaaca ggaccttgga aaggggatgt gaatcttccc       60
          tgcacctatg accccctgca aggctacacc caagtcttgg tgaagtggct ggtactgcgg      120
          aactaccacc ccgccaccat ctttctacgt gactcttctg gagaccatat ccagcaggca      180
          aagtaccagg gccgcctgca tgtgagccac aaggttccag gagatgtatc cctccaattg      240
          agcaccctgg agatggatga ccggagccac tacacgtgtg aagtcacctg gcagactcct      300
          gatggcaacc aagtcgtgag agataagatt actgagctcc gtgtc                      345
          <![CDATA[<210>  66]]>
          <![CDATA[<211>  115]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  蛋白質(VSIG4-M3)]]>
          <![CDATA[<400>  66]]>
          Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro Trp Lys Gly Asp 
          1               5                   10                  15      
          Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr Thr Gln Val 
                      20                  25                  30          
          Leu Val Lys Trp Leu Val Leu Arg Asn Tyr His Pro Ala Thr Ile Phe 
                  35                  40                  45              
          Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys Tyr Gln Gly 
              50                  55                  60                  
          Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ser Leu Gln Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu Val Thr 
                          85                  90                  95      
          Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp Lys Ile Thr Glu 
                      100                 105                 110         
          Leu Arg Val 
                  115 
          <![CDATA[<210>  67]]>
          <![CDATA[<211>  379]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  融合蛋白 + 前導序列(LS-VSIG4-M3-Fc)]]>
          <![CDATA[<400>  67]]>
          Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp 
          1               5                   10                  15      
          Val His Ser Gln Gly Ala Val Gly Ala Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu 
                      20                  25                  30          
          Ser Val Thr Gly Pro Trp Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr 
                  35                  40                  45              
          Asp Pro Leu Gln Gly Tyr Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Leu 
              50                  55                  60                  
          Arg Asn Tyr His Pro Ala Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp 
          65                  70                  75                  80  
          His Ile Gln Gln Ala Lys Tyr Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys 
                          85                  90                  95      
          Val Pro Gly Asp Val Ser Leu Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp 
                      100                 105                 110         
          Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn 
                  115                 120                 125             
          Gln Val Val Arg Asp Lys Ile Thr Glu Leu Arg Val Leu Ala Ala Ser 
              130                 135                 140                 
          Ala Ala Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 
                          165                 170                 175     
          Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 
                      180                 185                 190         
          Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 
                  195                 200                 205             
          Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 
              210                 215                 220                 
          Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 
          225                 230                 235                 240 
          Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 
                          245                 250                 255     
          Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 
                      260                 265                 270         
          Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 
                  275                 280                 285             
          Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 
              290                 295                 300                 
          Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 
                          325                 330                 335     
          Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 
                      340                 345                 350         
          Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 
                  355                 360                 365             
          Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
              370                 375                 
          <![CDATA[<210>  68]]>
          <![CDATA[<211>  345]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  DNA (VSIG4-M4)]]>
          <![CDATA[<400>  68]]>
          cccatcctgg aagtgccaga gagtgtaaca ggaccttgga aaggggatgt gaatcttccc       60
          tgcacctatg accccctgca aggctacacc caagtcttgg tgaagtggct ggtacaacgt      120
          ggctcagacc ctgtcaccat ctttctacgt gactcttctg gagaccatgt gcagcagacc      180
          aagttccggg gccgcctgca tgtgagccac aaggttccag gagatgtatc cctccaattg      240
          agcaccctgg agatggatga ccggagccac tacacgtgtg aagtcacctg gcagactcct      300
          gatggcaacc aagtcgtgag agataagatt actgagctcc gtgtt                      345
          <![CDATA[<210>  69]]>
          <![CDATA[<211>  115]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  蛋白質(VSIG4-M4)]]>
          <![CDATA[<400>  69]]>
          Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro Trp Lys Gly Asp 
          1               5                   10                  15      
          Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr Thr Gln Val 
                      20                  25                  30          
          Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro Val Thr Ile Phe 
                  35                  40                  45              
          Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Val Gln Gln Thr Lys Phe Arg Gly 
              50                  55                  60                  
          Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ser Leu Gln Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu Val Thr 
                          85                  90                  95      
          Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp Lys Ile Thr Glu 
                      100                 105                 110         
          Leu Arg Val 
                  115 
          <![CDATA[<210>  70]]>
          <![CDATA[<211>  379]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  融合蛋白 + 前導序列(LS-VSIG4-M4-Fc)]]>
          <![CDATA[<400>  70]]>
          Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp 
          1               5                   10                  15      
          Val His Ser Gln Gly Ala Val Gly Ala Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu 
                      20                  25                  30          
          Ser Val Thr Gly Pro Trp Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr 
                  35                  40                  45              
          Asp Pro Leu Gln Gly Tyr Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln 
              50                  55                  60                  
          Arg Gly Ser Asp Pro Val Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp 
          65                  70                  75                  80  
          His Val Gln Gln Thr Lys Phe Arg Gly Arg Leu His Val Ser His Lys 
                          85                  90                  95      
          Val Pro Gly Asp Val Ser Leu Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp 
                      100                 105                 110         
          Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn 
                  115                 120                 125             
          Gln Val Val Arg Asp Lys Ile Thr Glu Leu Arg Val Leu Ala Ala Ser 
              130                 135                 140                 
          Ala Ala Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 
                          165                 170                 175     
          Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 
                      180                 185                 190         
          Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 
                  195                 200                 205             
          Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 
              210                 215                 220                 
          Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 
          225                 230                 235                 240 
          Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 
                          245                 250                 255     
          Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 
                      260                 265                 270         
          Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 
                  275                 280                 285             
          Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 
              290                 295                 300                 
          Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 
                          325                 330                 335     
          Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 
                      340                 345                 350         
          Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 
                  355                 360                 365             
          Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
              370                 375                 
          <![CDATA[<210>  71]]>
          <![CDATA[<211>  345]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  DNA (VSIG4-M5)]]>
          <![CDATA[<400>  71]]>
          cccatcctgg aagtgccaga gagtgtaaca ggaccttgga aaggggatgt gaatcttccc       60
          tgcacctatg accccctgca aggctacacc caagtcttgg tgaagtggct ggtacaacgt      120
          ggctcagacc ctgtcaccat ctttctacgt gactcttctg gagaccatat ccagcaggca      180
          aagtaccagg gccgcctgga ggtgagccgg cagcccccag gagatgtatc cctccaattg      240
          agcaccctgg agatggatga ccggagccac tacacgtgtg aagtcacctg gcagactcct      300
          gatggcaacc aagtcgtgag agataagatt actgagctcc gtgtt                      345
          <![CDATA[<210>  72]]>
          <![CDATA[<211>  115]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  蛋白質(VSIG4-M5)]]>
          <![CDATA[<400>  72]]>
          Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro Trp Lys Gly Asp 
          1               5                   10                  15      
          Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr Thr Gln Val 
                      20                  25                  30          
          Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro Val Thr Ile Phe 
                  35                  40                  45              
          Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys Tyr Gln Gly 
              50                  55                  60                  
          Arg Leu Glu Val Ser Arg Gln Pro Pro Gly Asp Val Ser Leu Gln Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu Val Thr 
                          85                  90                  95      
          Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp Lys Ile Thr Glu 
                      100                 105                 110         
          Leu Arg Val 
                  115 
          <![CDATA[<210>  73]]>
          <![CDATA[<211>  379]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  融合蛋白 + 前導序列(LS-VSIG4-M5-Fc)]]>
          <![CDATA[<400>  73]]>
          Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp 
          1               5                   10                  15      
          Val His Ser Gln Gly Ala Val Gly Ala Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu 
                      20                  25                  30          
          Ser Val Thr Gly Pro Trp Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr 
                  35                  40                  45              
          Asp Pro Leu Gln Gly Tyr Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln 
              50                  55                  60                  
          Arg Gly Ser Asp Pro Val Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp 
          65                  70                  75                  80  
          His Ile Gln Gln Ala Lys Tyr Gln Gly Arg Leu Glu Val Ser Arg Gln 
                          85                  90                  95      
          Pro Pro Gly Asp Val Ser Leu Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp 
                      100                 105                 110         
          Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn 
                  115                 120                 125             
          Gln Val Val Arg Asp Lys Ile Thr Glu Leu Arg Val Leu Ala Ala Ser 
              130                 135                 140                 
          Ala Ala Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 
                          165                 170                 175     
          Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 
                      180                 185                 190         
          Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 
                  195                 200                 205             
          Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 
              210                 215                 220                 
          Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 
          225                 230                 235                 240 
          Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 
                          245                 250                 255     
          Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 
                      260                 265                 270         
          Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 
                  275                 280                 285             
          Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 
              290                 295                 300                 
          Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 
                          325                 330                 335     
          Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 
                      340                 345                 350         
          Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 
                  355                 360                 365             
          Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
              370                 375                 
          <![CDATA[<210>  74]]>
          <![CDATA[<211>  345]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  DNA (VSIG4-M6)]]>
          <![CDATA[<400>  74]]>
          cccatcctgg aagtgccaga gagtgtaaca ggaccttgga aaggggatgt gaatcttccc       60
          tgcacctatg accccctgca aggctacacc caagtcttgg tgaagtggct ggtacaacgt      120
          ggctcagacc ctgtcaccat ctttctacgt gactcttctg gagaccatat ccagcaggca      180
          aagtaccagg gccgcctgca tgtgagccac aaggttccag gagatgtagc cctgaccctg      240
          aaccccctgg agatggatga ccggagccac tacacgtgtg aagtcacctg gcagactcct      300
          gatggcaacc aagtcgtgag agataagatt actgagctcc gtgtt                      345
          <![CDATA[<210>  75]]>
          <![CDATA[<211>  115]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  蛋白質(VSIG4-M6)]]>
          <![CDATA[<400>  75]]>
          Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro Trp Lys Gly Asp 
          1               5                   10                  15      
          Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr Thr Gln Val 
                      20                  25                  30          
          Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro Val Thr Ile Phe 
                  35                  40                  45              
          Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys Tyr Gln Gly 
              50                  55                  60                  
          Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ala Leu Thr Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Pro Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu Val Thr 
                          85                  90                  95      
          Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp Lys Ile Thr Glu 
                      100                 105                 110         
          Leu Arg Val 
                  115 
          <![CDATA[<210>  76]]>
          <![CDATA[<211>  379]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  融合蛋白 + 前導序列(LS-VSIG4-M6-Fc)]]>
          <![CDATA[<400>  76]]>
          Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp 
          1               5                   10                  15      
          Val His Ser Gln Gly Ala Val Gly Ala Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu 
                      20                  25                  30          
          Ser Val Thr Gly Pro Trp Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr 
                  35                  40                  45              
          Asp Pro Leu Gln Gly Tyr Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln 
              50                  55                  60                  
          Arg Gly Ser Asp Pro Val Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp 
          65                  70                  75                  80  
          His Ile Gln Gln Ala Lys Tyr Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys 
                          85                  90                  95      
          Val Pro Gly Asp Val Ala Leu Thr Leu Asn Pro Leu Glu Met Asp Asp 
                      100                 105                 110         
          Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn 
                  115                 120                 125             
          Gln Val Val Arg Asp Lys Ile Thr Glu Leu Arg Val Leu Ala Ala Ser 
              130                 135                 140                 
          Ala Ala Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 
                          165                 170                 175     
          Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 
                      180                 185                 190         
          Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 
                  195                 200                 205             
          Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 
              210                 215                 220                 
          Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 
          225                 230                 235                 240 
          Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 
                          245                 250                 255     
          Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 
                      260                 265                 270         
          Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 
                  275                 280                 285             
          Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 
              290                 295                 300                 
          Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 
                          325                 330                 335     
          Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 
                      340                 345                 350         
          Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 
                  355                 360                 365             
          Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
              370                 375                 
          <![CDATA[<210>  77]]>
          <![CDATA[<211>  345]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  DNA (VSIG4-M7)]]>
          <![CDATA[<400>  77]]>
          cccatcctgg aagtgccaga gagtgtaaca ggaccttgga aaggggatgt gaatcttccc       60
          tgcacctatg accccctgca aggctacacc caagtcttgg tgaagtggct ggtacaacgt      120
          ggctcagacc ctgtcaccat ctttctacgt gactcttctg gagaccatat ccagcaggca      180
          aagtaccagg gccgcctgca tgtgagccac aaggttccag gagatgtatc cctccaattg      240
          agcaccctgg agatggatga ccagggctac tacgtgtgcg ccgtcacctg gcagactcct      300
          gatggcaacc aagtcgtgag agataagatt actgagctcc gtgtt                      345
          <![CDATA[<210>  78]]>
          <![CDATA[<211>  115]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  蛋白質(VSIG4-M7)]]>
          <![CDATA[<400>  78]]>
          Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro Trp Lys Gly Asp 
          1               5                   10                  15      
          Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr Thr Gln Val 
                      20                  25                  30          
          Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro Val Thr Ile Phe 
                  35                  40                  45              
          Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys Tyr Gln Gly 
              50                  55                  60                  
          Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ser Leu Gln Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Gln Gly Tyr Tyr Val Cys Ala Val Thr 
                          85                  90                  95      
          Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp Lys Ile Thr Glu 
                      100                 105                 110         
          Leu Arg Val 
                  115 
          <![CDATA[<210>  79]]>
          <![CDATA[<211>  379]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  融合蛋白 + 前導序列(LS-VSIG4-M7-Fc)]]>
          <![CDATA[<400>  79]]>
          Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp 
          1               5                   10                  15      
          Val His Ser Gln Gly Ala Val Gly Ala Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu 
                      20                  25                  30          
          Ser Val Thr Gly Pro Trp Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr 
                  35                  40                  45              
          Asp Pro Leu Gln Gly Tyr Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln 
              50                  55                  60                  
          Arg Gly Ser Asp Pro Val Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp 
          65                  70                  75                  80  
          His Ile Gln Gln Ala Lys Tyr Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys 
                          85                  90                  95      
          Val Pro Gly Asp Val Ser Leu Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Tyr Tyr Val Cys Ala Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn 
                  115                 120                 125             
          Gln Val Val Arg Asp Lys Ile Thr Glu Leu Arg Val Leu Ala Ala Ser 
              130                 135                 140                 
          Ala Ala Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 
                          165                 170                 175     
          Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 
                      180                 185                 190         
          Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 
                  195                 200                 205             
          Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 
              210                 215                 220                 
          Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 
          225                 230                 235                 240 
          Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 
                          245                 250                 255     
          Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 
                      260                 265                 270         
          Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 
                  275                 280                 285             
          Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 
              290                 295                 300                 
          Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 
                          325                 330                 335     
          Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 
                      340                 345                 350         
          Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 
                  355                 360                 365             
          Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
              370                 375                 
          <![CDATA[<210>  80]]>
          <![CDATA[<211>  345]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  DNA (VSIG4-M8)]]>
          <![CDATA[<400>  80]]>
          cccatcctgg aagtgccaga gagtgtaaca ggaccttgga aaggggatgt gaatcttccc       60
          tgcacctatg accccctgca aggctacacc caagtcttgg tgaagtggct ggtacaacgt      120
          ggctcagacc ctgtcaccat ctttctacgt gactcttctg gagaccatat ccagcaggca      180
          aagtaccagg gccgcctgca tgtgagccac aaggttccag gagatgtatc cctccaattg      240
          agcaccctgg agatggatga ccggagccac tacacgtgtg aagtcacctg gcaggaccag      300
          gccggccacc tgatcgtgag agataagatt actgagctcc gtgtt                      345
          <![CDATA[<210>  81]]>
          <![CDATA[<211>  115]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  蛋白質(VSIG4-M8)]]>
          <![CDATA[<400>  81]]>
          Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro Trp Lys Gly Asp 
          1               5                   10                  15      
          Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly Tyr Thr Gln Val 
                      20                  25                  30          
          Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro Val Thr Ile Phe 
                  35                  40                  45              
          Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala Lys Tyr Gln Gly 
              50                  55                  60                  
          Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val Ser Leu Gln Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu Val Thr 
                          85                  90                  95      
          Trp Gln Asp Gln Ala Gly His Leu Ile Val Arg Asp Lys Ile Thr Glu 
                      100                 105                 110         
          Leu Arg Val 
                  115 
          <![CDATA[<210>  82]]>
          <![CDATA[<211>  379]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  融合蛋白 + 前導序列(LS-VSIG4-M8-Fc)]]>
          <![CDATA[<400>  82]]>
          Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp 
          1               5                   10                  15      
          Val His Ser Gln Gly Ala Val Gly Ala Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu 
                      20                  25                  30          
          Ser Val Thr Gly Pro Trp Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr 
                  35                  40                  45              
          Asp Pro Leu Gln Gly Tyr Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln 
              50                  55                  60                  
          Arg Gly Ser Asp Pro Val Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp 
          65                  70                  75                  80  
          His Ile Gln Gln Ala Lys Tyr Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys 
                          85                  90                  95      
          Val Pro Gly Asp Val Ser Leu Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp 
                      100                 105                 110         
          Arg Ser His Tyr Thr Cys Glu Val Thr Trp Gln Asp Gln Ala Gly His 
                  115                 120                 125             
          Leu Ile Val Arg Asp Lys Ile Thr Glu Leu Arg Val Leu Ala Ala Ser 
              130                 135                 140                 
          Ala Ala Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 
                          165                 170                 175     
          Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 
                      180                 185                 190         
          Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 
                  195                 200                 205             
          Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 
              210                 215                 220                 
          Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 
          225                 230                 235                 240 
          Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 
                          245                 250                 255     
          Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 
                      260                 265                 270         
          Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 
                  275                 280                 285             
          Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 
              290                 295                 300                 
          Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 
                          325                 330                 335     
          Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 
                      340                 345                 350         
          Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 
                  355                 360                 365             
          Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
              370                 375                 
          <![CDATA[<210>  83]]>
          <![CDATA[<211>  513]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  融合蛋白(訊息胜肽-hVSIG4(L)-Fc)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  MISC_FEATURE]]>
          <![CDATA[<223>  人類IgG1 Fc域，包括絞鏈]]>
          <![CDATA[<400>  83]]>
          Gln Gly Ile Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Gly His Leu Thr Val Asp 
          1               5                   10                  15      
          Thr Tyr Gly Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro 
                      20                  25                  30          
          Trp Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly 
                  35                  40                  45              
          Tyr Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro 
              50                  55                  60                  
          Val Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Tyr Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val 
                          85                  90                  95      
          Ser Leu Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr 
                      100                 105                 110         
          Cys Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp 
                  115                 120                 125             
          Lys Ile Thr Glu Leu Arg Val Gln Lys Leu Ser Val Ser Lys Pro Thr 
              130                 135                 140                 
          Val Thr Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Phe Thr Val Pro Gln Gly Met Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Ile Ser Leu Gln Cys Gln Ala Arg Gly Ser Pro Pro Ile Ser Tyr Ile 
                          165                 170                 175     
          Trp Tyr Lys Gln Gln Thr Asn Asn Gln Glu Pro Ile Lys Val Ala Thr 
                      180                 185                 190         
          Leu Ser Thr Leu Leu Phe Lys Pro Ala Val Ile Ala Asp Ser Gly Ser 
                  195                 200                 205             
          Tyr Phe Cys Thr Ala Lys Gly Gln Val Gly Ser Glu Gln His Ser Asp 
              210                 215                 220                 
          Ile Val Lys Phe Val Val Lys Asp Ser Ser Lys Leu Leu Lys Thr Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Thr Glu Ala Pro Thr Thr Met Thr Tyr Pro Leu Lys Ala Thr Ser Thr 
                          245                 250                 255     
          Val Lys Gln Ser Trp Asp Trp Thr Thr Asp Met Asp Gly Tyr Leu Gly 
                      260                 265                 270         
          Glu Thr Ser Ala Gly Pro Gly Lys Ser Leu Pro Ala Ala Ala Asp Lys 
                  275                 280                 285             
          Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 
              290                 295                 300                 
          Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 
                          325                 330                 335     
          Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 
                      340                 345                 350         
          Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 
                  355                 360                 365             
          Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 
              370                 375                 380                 
          Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 
          385                 390                 395                 400 
          Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 
                          405                 410                 415     
          Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 
                      420                 425                 430         
          Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 
                  435                 440                 445             
          Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 
              450                 455                 460                 
          Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 
          465                 470                 475                 480 
          Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 
                          485                 490                 495     
          Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
                      500                 505                 510         
          Lys 
          <![CDATA[<210>  84]]>
          <![CDATA[<211>  419]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  融合蛋白(訊息胜肽-hVSIG4(S)-Fc)]]>
          <![CDATA[<400>  84]]>
          Met Gly Ile Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Gly His Leu Thr Val Asp 
          1               5                   10                  15      
          Thr Tyr Gly Arg Pro Ile Leu Glu Val Pro Glu Ser Val Thr Gly Pro 
                      20                  25                  30          
          Trp Lys Gly Asp Val Asn Leu Pro Cys Thr Tyr Asp Pro Leu Gln Gly 
                  35                  40                  45              
          Tyr Thr Gln Val Leu Val Lys Trp Leu Val Gln Arg Gly Ser Asp Pro 
              50                  55                  60                  
          Val Thr Ile Phe Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asp His Ile Gln Gln Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Tyr Gln Gly Arg Leu His Val Ser His Lys Val Pro Gly Asp Val 
                          85                  90                  95      
          Ser Leu Gln Leu Ser Thr Leu Glu Met Asp Asp Arg Ser His Tyr Thr 
                      100                 105                 110         
          Cys Glu Val Thr Trp Gln Thr Pro Asp Gly Asn Gln Val Val Arg Asp 
                  115                 120                 125             
          Lys Ile Thr Glu Leu Arg Val Gln Lys His Ser Ser Lys Leu Leu Lys 
              130                 135                 140                 
          Thr Lys Thr Glu Ala Pro Thr Thr Met Thr Tyr Pro Leu Lys Ala Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Thr Val Lys Gln Ser Trp Asp Trp Thr Thr Asp Met Asp Gly Tyr 
                          165                 170                 175     
          Leu Gly Glu Thr Ser Ala Gly Pro Gly Lys Ser Leu Pro Ala Ala Ala 
                      180                 185                 190         
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 
                  195                 200                 205             
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
              210                 215                 220                 
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
                          245                 250                 255     
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 
                      260                 265                 270         
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
                  275                 280                 285             
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 
              290                 295                 300                 
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
          305                 310                 315                 320 
          Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 
                          325                 330                 335     
          Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
                      340                 345                 350         
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
                  355                 360                 365             
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 
              370                 375                 380                 
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
          385                 390                 395                 400 
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
                          405                 410                 415     
          Pro Gly Lys 
          <![CDATA[<210>  85]]>
          <![CDATA[<211>  232]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  85]]>
          Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 
          1               5                   10                  15      
          Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 
                      20                  25                  30          
          Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 
                  35                  40                  45              
          Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 
              50                  55                  60                  
          Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 
                          85                  90                  95      
          Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 
                      100                 105                 110         
          Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 
                  115                 120                 125             
          Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 
              130                 135                 140                 
          Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 
                          165                 170                 175     
          Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 
                  195                 200                 205             
          Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 
              210                 215                 220                 
          Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
          225                 230         
          <![CDATA[<210>  86]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<400>  86]]>
          Gln Gly Ala Val Gly Ala 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  87]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<400>  87]]>
          Leu Ala Ala Ser Ala Ala Ser 
          1               5
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(無)

Claims (27)

  1. 一種單株抗VSIG4抗體或其抗原結合片段，選自於由以下組成的群組： a)  一包含以下的抗體：序列SEQ ID Nos. 3、4和5的三個重鏈CDR和序列SEQ ID Nos. 6、7和8的三個輕鏈CDR；以及 b) 一包含以下的抗體：序列SEQ ID Nos. 9、10和11的三個重鏈CDR和序列SEQ ID Nos. 12、13和14的三個輕鏈CDR。
  2. 如請求項1的單株抗VSIG4抗體或其抗原結合片段，其中該抗體選自單鏈抗體、駱駝抗體、嵌合抗體、人源化抗體和人類抗體。
  3. 如請求項1至2中任一項的單株抗VSIG4抗體或其抗原結合片段，其中該抗體是人類抗體。
  4. 如請求項1至3中任一項的單株抗VSIG4抗體或其抗原結合片段，其中該抗體選自IgA1抗體、IgA2抗體、IgD抗體、IgE抗體、IgG1抗體、IgG2抗體、IgG3抗體、IgG4抗體和IgM抗體。
  5. 如請求項1至3中任一項的單株抗VSIG4抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段選自於由以下組成的群組：Fab、Fab'、(Fab') 2、Fv、scFv (sc為單鏈)、雙-scFv、scFv-Fc片段、Fab2、Fab3、微型抗體、雙抗體、三抗體、四抗體和奈米抗體。
  6. 如請求項1至5中任一項的單株抗VSIG4抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段是scFv。
  7. 如請求項1至6中任一項的單株抗VSIG4抗體或其抗原結合片段，其中該抗體選自於由以下組成的群組： a) 一包含以下的抗體：具有序列SEQ ID No. 45或展現與SEQ ID No. 45至少80%、85%、90%、95%或98%同一性之任何序列之重鏈可變域以及具有序列SEQ ID Nos. 6、7和8之三個輕鏈CDR；以及 b) 一包含以下或由以下組成的抗體：具有序列SEQ ID No. 47或展現與SEQ ID No. 47至少80%、85%、90%、95%或98%同一性之任何序列之重鏈可變域以及具有序列SEQ ID Nos. 12、13和14之三個輕鏈CDR。
  8. 如請求項1至6中任一項的單株抗VSIG4抗體或其抗原結合片段，該抗體選自於由以下組成的群組： a) 一包含以下的抗體：具有序列SEQ ID No. 46或展現與SEQ ID No. 46至少80%、85%、90%、95%或98%同一性之任何序列之輕鏈可變域以及具有序列SEQ ID Nos. 3、4和5之三個重鏈CDR； b) 一包含以下的抗體：具有序列SEQ ID No. 48或展現與SEQ ID No. 48至少80%、85%、90%、95%或98%同一性之任何序列之輕鏈可變域以及具有序列SEQ ID Nos. 9、10和11之三個重鏈CDR。
  9. 如請求項1至8中任一項的單株抗VSIG4抗體或其抗原結合片段，該抗體選自於由以下組成的群組： a) 一包含以下的抗體：具有序列SEQ ID No. 45或展現與SEQ ID No. 45至少80%、85%、90%、95%或98%同一性之任何序列之重鏈可變域，以及具有序列SEQ ID No. 46或展現與SEQ ID No. 46至少80%、85%、90%、95%或98%同一性之任何序列之輕鏈可變域； b) 一包含以下的抗體：具有序列SEQ ID No. 47或展現與SEQ ID No. 47至少80%、85%、90%、95%或98%同一性之任何序列之重鏈可變域，以及具有序列SEQ ID No. 48或展現與SEQ ID No. 48至少80%、85%、90%、95%或98%同一性之任何序列之輕鏈可變域。
  10. 一種免疫綴合物，其包含如請求項1至9中任一項的單株抗VSIG4抗體或其抗原結合片段 ，其中該抗體係綴合至一細胞毒性劑。
  11. 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至9中任一項的單株抗VSIG4抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區(V L)。
  12. 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至9中任一項的單株抗VSIG4抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區(V H)。
  13. 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至9中任一項的單株抗VSIG4抗體或其抗原結合片段的V L以及如請求項1至9中任一項的單株抗VSIG4抗體或其抗原結合片段的V H。
  14. 一種表現載體，包含： 一如請求項11的多核苷酸； 一如請求項12的多核苷酸； 一如請求項11的多核苷酸及一如請求項12的多核苷酸；或 一如請求項13的多核苷酸。
  15. 一種宿主細胞，其以如請求項14的表現載體予以轉形。
  16. 一種產生如請求項1至9中任一項的單株抗VSIG4抗體或其抗原結合片段的方法，包含： a) 在適宜的條件下培養如請求項15的宿主細胞；以及 b) 從培養基或從培養的細胞中回收該單株抗VSIG4抗體或其抗原結合片段。
  17. 一種醫藥組成物，包含如請求項1至9中任一項的單株抗VSIG4抗體或其抗原結合片段、或如請求項10的免疫綴合物以及一藥學上可接受的載劑及/或一賦形劑。
  18. 如請求項17的醫藥組成物，進一步包含一免疫檢查點抑制劑。
  19. 如請求項18的醫藥組成物，其中該免疫檢查點抑制劑是下列任一者的抑制劑：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、PSG-L1、TIGIT、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1和CHK2激酶、IDO1、A2aR以及任一種B-7家族配體。
  20. 如請求項17和18中任一項的醫藥組成物，其中該免疫檢查點抑制劑選自於由以下組成的群組：易普利單抗(ipilimumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、納武單抗(nivolumab)、西米普利單抗(cemiplimab)、匹利珠單抗(pidilizumab)、阿替利珠單抗(atezolizumab)、阿維魯單抗(avelumab)、度伐利尤單抗(durvalumab)、提瑞單抗(tiragolumab)、維伯單抗(tiragolumab)、BMS 936559、JNJ 61610588、尤瑞單抗(urelumab)、9B12、PF-04518600、BMS-986016、TSR-022、MBG453、MEDI6469、MEDI6383和艾帕卡度(epacadostat)。
  21. 如請求項17和18中任一項的醫藥組成物，其用於同時、分開或依序使用。
  22. 如請求項1至9中任一項的單株抗VSIG4抗體或其抗原結合片段、或如請求項10的綴合物或如請求項17至21中任一項的醫藥組成物，其係供使用於治療一患者中的一癌症。
  23. 如請求項22中供使用的單株抗VSIG4抗體或其抗原結合片段，其中該使用包含在該患者中誘發免疫反應。
  24. 如請求項23中供使用的如請求項1至9中任一項的單株抗VSIG4抗體或其抗原結合片段、或如請求項10的綴合物或如請求項17至21中任一項的醫藥組成物，其中該免疫反應包括巨噬細胞，特別是TAM極化成M1表型；誘發巨噬細胞釋放促炎細胞激素；誘發CD4 +T細胞增殖；誘發CD8 +T細胞增殖；誘發CD4 +T細胞的細胞激素產生；以及誘發CD8 +T細胞的細胞激素產生。
  25. 如請求項22至24中任一項之供使用的如請求項1至9中任一項的單株抗VSIG4抗體或其抗原結合片段、或如請求項10的綴合物或如請求項17至21中任一項的醫藥組成物，其中該癌症選自膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮內膜癌、食道癌、輸卵管癌、膽囊癌、胃腸道癌、頭頸癌、血液系統癌(例如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤)、喉癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、間皮瘤、卵巢癌、原發性腹膜癌、唾液腺癌、肉瘤、胃癌、甲狀腺癌、胰腺癌、腎細胞癌、膠質母細胞瘤和前列腺癌。
  26. 一種用於偵測在個體中表現VSIG4的癌症的體外方法，該方法包含以下步驟： a) 使該個體的生物樣本與如請求項1至9中任一項的抗VSIG4抗體或其抗原結合片段接觸；以及 b) 偵測該抗體或其抗原結合片段與該生物樣本的結合， 其中該抗VSIG4抗體的結合表示存在表現VSIG4的癌症。
  27. 如請求項26的方法，其中該單株抗VSIG4抗體或其抗原結合片段係以一可偵測的標記來標記。
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