CN110944666A - 杂交瘤克隆、vsig-4的单克隆抗体，以及制备和使用的方法 - Google Patents
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Abstract
本文描述了结合VSIG‑4的单克隆抗体，包括阻断VSIG‑4与SIGLEC‑7结合的抗体，包括所述单克隆抗体的组合物，以及制备和使用那些抗体和组合物的方法。
Description
继续申请数据
本申请要求于2017年6月26日提交的美国临时申请序列号62/524,821的权益，所述美国临时申请通过引用并入本文。
背景
含V-集合和Ig结构域的4 (V-set and Ig domain-containing 4, VSIG-4或VSIG4)是C3补体受体，B7家族相关蛋白和T细胞活化的负调节剂。已经观察到VSIG-4表达限于组织巨噬细胞，并且已经显示响应于脂多糖(LPS)而下调(Vogt等人，(2006) J. of Clin. Invest. 116:2817)。在健康组织中，VSIG-4在驻留组织的巨噬细胞上表达，并作为补体受体发挥作用以调理细菌病原体。在诊断患有非小细胞肺癌的患者中观察到VSIG-4+巨噬细胞向肿瘤微环境中的大量浸润(Liao等人，(2014) Lab. Invest. 94:706)，并且高VSIG-4表达也与高分级的胶质瘤和患者预后不良相关(Xu等人，(2015) Am. J. Transl. Res. 7:1172)。
发明概述
在一些方面，本公开描述了结合VSIG-4的抗体。在一些实施方案中，所述抗体消除VSIG-4与VSIG-4配体的结合。在一些实施方案中，所述抗体消除VSIG-4与结合唾液酸的Ig样凝集素7 (SIGLEC-7、SIGLEC7、Siglec-7或Siglec7)的结合。
在一些实施方案中，所述抗体可由2017年5月11日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110, USA)的以下克隆中的至少一种产生：Ms x hVSIG4 528902.11 (ATCC登录号PTA-124187)；Ms x hVSIG4528903.111 (ATCC登录号PTA-124188)；Ms x hVSIG4 528905.11 (ATCC登录号PTA-124189)；Ms x hVSIG4 528906.11 (ATCC登录号PTA-124178)；Ms x hVSIG4 528908.11(ATCC登录号PTA-124179)；Ms x hVSIG4 528910.111 (ATCC登录号PTA-124180)；Ms xhVSIG4 528912.11 (ATCC登录号PTA-124181)；Ms x hVSIG4 528922.111 (ATCC登录号PTA-124182)；Ms x hVSIG4 528927.111 (ATCC登录号PTA-124183)；Rt x hVSIG4489509.11 (ATCC登录号PTA-124184)；Rt x hVSIG4 489517.111 (ATCC登录号PTA-124185)；和Rt x hVSIG4 489518.11 (ATCC登录号PTA-124186)。这些保藏根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约进行。
在一些实施方案中，所述抗体包括由以下克隆中的至少一种产生的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区中的至少一种：Ms x hVSIG4 528902.11 (ATCC登录号PTA-124187)；Ms x hVSIG4 528903.111 (ATCC登录号PTA-124188)；Ms x hVSIG4 528905.11(ATCC登录号PTA-124189)；Ms x hVSIG4 528906.11 (ATCC登录号PTA-124178)；Ms xhVSIG4 528908.11 (ATCC登录号PTA-124179)；Ms x hVSIG4 528910.111 (ATCC登录号PTA-124180)；Ms x hVSIG4 528912.11 (ATCC登录号PTA-124181)；Ms x hVSIG4528922.111 (ATCC登录号PTA-124182)；Ms x hVSIG4 528927.111 (ATCC登录号PTA-124183)；Rt x hVSIG4 489509.11 (ATCC登录号PTA-124184)；Rt x hVSIG4 489517.111(ATCC登录号PTA-124185)；和Rt x hVSIG4 489518.11 (ATCC登录号PTA-124186)。
在一些实施方案中，所述抗体包括以下重链可变区和轻链可变区中的至少一种：所述重链可变区包含由以下克隆中的至少一种产生的单克隆抗体的重链可变区的互补决定区(CDR)，所述轻链可变区包含由以下克隆中的至少一种产生的单克隆抗体的轻链可变区的互补决定区(CDR)：Ms x hVSIG4 528902.11 (ATCC登录号PTA-124187)；Ms x hVSIG4528903.111 (ATCC登录号PTA-124188)；Ms x hVSIG4 528905.11 (ATCC登录号PTA-124189)；Ms x hVSIG4 528906.11 (ATCC登录号PTA-124178)；Ms x hVSIG4 528908.11(ATCC登录号PTA-124179)；Ms x hVSIG4 528910.111 (ATCC登录号PTA-124180)；Ms xhVSIG4 528912.11 (ATCC登录号PTA-124181)；Ms x hVSIG4 528922.111 (ATCC登录号PTA-124182)；Ms x hVSIG4 528927.111 (ATCC登录号PTA-124183)；Rt x hVSIG4489509.11 (ATCC登录号PTA-124184)；Rt x hVSIG4 489517.111 (ATCC登录号PTA-124185)；和Rt x hVSIG4 489518.11 (ATCC登录号PTA-124186)。
在一些实施方案中，所述抗体可以直接或间接偶联至可检测标记物。在一些实施方案中，所述抗体包括IgG抗体。
在一些实施方案中，所述抗体包括抗原结合片段，包括例如Fab片段，Fab'片段，F(ab)2片段和Fv片段。
在一些实施方案中，所述抗体可以消除VSIG-4与VSIG-4配体的结合。在一些实施方案中，VSIG-4配体可包括SIGLEC-7。在一些实施方案中，VSIG-4和VSIG-4配体中的至少一种可以在细胞表面上。在一些实施方案中，VSIG-4可以在巨噬细胞(包括，例如M2c巨噬细胞)的表面上表达。在一些实施方案中，所述抗体可以消除细胞-细胞相互作用。
在一些实施方案中，所述抗体可以结合VSIG-4的细胞外结构域。在一些实施方案中，所述抗体可以结合VSIG-4多肽。在一些实施方案中，所述抗体可以结合糖基化和未糖基化的VSIG-4。
本公开进一步描述了包含本文所述抗体的组合物和试剂盒，和在治疗哺乳动物癌症、检测哺乳动物癌症或治疗自身免疫疾病的方法中的本文所述抗体。
在另一方面，本公开描述了一种治疗哺乳动物癌症的方法，其包括将包含哺乳动物癌细胞的哺乳动物暴露于本文所述的抗体。
在一些实施方案中，VSIG-4表达在包含哺乳动物癌细胞的患者样品中扩增。在一些实施方案中，VSIG-4表达在包含哺乳动物癌细胞的患者样品的巨噬细胞中扩增。在一些实施方案中，哺乳动物癌细胞包括肺癌细胞或胶质瘤。
在一些实施方案中，哺乳动物癌细胞也暴露于化学疗法或放射疗法。
在进一步方面，本公开描述了一种检测哺乳动物中的癌症的方法，其包括将哺乳动物癌细胞暴露于本文所述的抗体。
在又另一方面，本公开描述了一种治疗哺乳动物中的自身免疫疾病的方法，其包括将所述哺乳动物的细胞暴露于本文所述的抗体。
在其他方面，本公开涉及以下杂交瘤细胞系和由以下杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体：
Ms x hVSIG4 528902.11，保藏为ATCC登录号PTA-124187；
Ms x hVSIG4 528903.111，保藏为ATCC登录号PTA-124188；
Ms x hVSIG4 528905.11，保藏为ATCC登录号PTA-124189；
Ms x hVSIG4 528906.11，保存为ATCC登录号PTA-124178；
Ms x hVSIG4 528908.11，保藏为ATCC登录号PTA-124179；
Ms x hVSIG4 528910.111，保藏为ATCC登录号PTA-124180；
Ms x hVSIG4 528912.11，保存为ATCC登录号PTA-124181；
Ms x hVSIG4 528922.111，保藏为ATCC登录号PTA-124182；
Ms x hVSIG4 528927.111，保存为ATCC登录号PTA-124183；
Rt x hVSIG4 489509.11，保藏为ATCC登录号PTA-124184；
Rt x hVSIG4 489517.111，保藏为ATCC登录号PTA-124185；和
Rt x hVSIG4 489518.11，保藏为ATCC登录号PTA-124186。
如本文所用，术语“抗体”是指包含至少一个抗原结合位点的分子，所述抗原结合位点免疫特异性地结合至特定的目标抗原靶标。因此，术语“抗体”包括但不限于全长抗体和/或其变体，其片段，肽体及其变体，单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、由至少两个完整的抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体和模拟抗体的结构和/或功能的抗体模拟物或其指定片段或部分，包括单链抗体及其片段。抗体与靶标的结合可引起多种作用，例如但不限于这种结合在体外、原位和/或体内调节、减少、增加、拮抗、激动、减轻、减缓、阻断、抑制、消除和/或干扰至少一种靶标活性或结合，或受体活性或结合。因此，本公开的抗体涵盖能够结合生物分子(例如抗原或受体)或其部分的抗体片段，包括但不限于Fab、Fab'和F(ab')2、pFc'、Fd、单结构域抗体(sdAb)、可变片段(Fv)、单链可变片段(scFv)或二硫化物连接的Fv(sdFv)；双功能抗体或二价双功能抗体；线性抗体；单链抗体分子；由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
如本文所使用的术语“单克隆抗体”是指从基本均质的抗体群体获得的抗体，即除了可少量存在的可能天然发生的突变，组成群体的个体抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，其针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，各单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。单克隆抗体可以由不受其他免疫球蛋白产生细胞污染的杂交瘤细胞合成。备选地，单克隆抗体可以重组产生，包括例如通过用编码单克隆抗体的重链和轻链基因稳定或瞬时转染的细胞。
修饰词“单克隆”指示抗体的特征为从基本均质的抗体群体获得的，而不应被解释为需要通过任何特定方法对抗体的工程改造。在一些实施方案中，本文使用的术语“单克隆”是指衍生自细胞的克隆群体的抗体，包括任何真核，原核或噬菌体克隆，而不是工程改造抗体的方法。
如本文所用，术语“VSIG-4配体”是指VSIG-4的蛋白结合配偶体，并且可以包括配体和/或反受体。VSIG-4和VSIG-4之间的相互作用可在一个或两个方向上进行信号转导。
如本文所用，“分离的”是指从其初始环境(例如，在其是天然存在的情况下的天然环境)取出，并且因此“通过人工”从其天然状态被改变的材料。
如本文所用，“室温”是16℃至26℃，或更优选地18℃至24℃。在一些实施例中，“室温”是20℃至22℃。
如本文所用，两个多肽之间的“序列同一性”通过将一个多肽的氨基酸序列与第二个多肽的序列比较而确定。在本文讨论时，任何特定的多肽是否与另一多肽具有至少百分之40(％)、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性，可以通过使用本领域已知的方法和计算机程序/软件来测定，例如但不限于BESTFIT程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，用于Unix的版本8, Genetics ComputerGroup, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711)。BESTFIT使用Smith and Waterman (1981) Advances in Applied Mathematics 2:482-489的局部同源性算法，以找到两个序列之间的最佳同源性片段。当使用BESTFIT或任何其他序列比对程序来确定特定序列是否与根据本发明的参考序列具有例如95％同一性时，设置参数使得在参考多肽序列全长的全长上计算同一性百分比，并且在同源性中允许在高至参考序列中氨基酸总数的5%的间隔。
“结合亲和力”或“亲和力结合”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原或抗原表位)之间的非共价相互作用的总和的强度。分子X对其配偶体Y的亲和力由解离常数(KD)表示，所述解离常数通常可通过使用本领域已知的方法来确定，例如，使用可从BIACORE (GE Healthcare Worldwide, Chicago, IL)购得的BIACORE生物传感器。在一些实施方案中，可以根据其对VSIG-4的结合亲和力来描述本公开的抗体。在一些实施方案中，本公开的抗体包括与抗原相互作用的抗体，其中解离常数(KD)小于或等于5 X10-6 M、小于或等于1 X 10-6 M、小于或等于5 X 10-7 M、小于或等于1 X 10-7 M、小于或等于5 X 10-8 M、小于或等于1 X 10-8 M、小于或等于5 X 10-9 M、小于或等于1 X 10-9 M、小于或等于5 X 10-10 M、小于或等于1 X 10-10 M、小于或等于5 X 10-11 M、小于或等于1 X 10-11M、小于或等于5 X 10-12 M、小于或等于1 X 10-12 M、小于或等于5 X 10-13 M、小于或等于1X 10-13 M、小于或等于5 X 10-14 M、小于或等于1 X 10-14 M、小于或等于5 X 10-15 M，或小于或等于1 X 10-15 M。
如本文所用，术语“受试者”包括但不限于人类和非人类脊椎动物。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，特别是人。受试者可以是个体。受试者可以是“个体”、“患者”或“宿主”。非人类脊椎动物包括牲畜动物、伴侣动物和实验室动物。非人类受试者还包括非人类灵长类动物以及啮齿动物，例如但不限于大鼠或小鼠。非人类受试者还包括但不限于鸡、马、牛、猪、山羊、狗、猫、豚鼠、仓鼠、水貂和兔子。
如本文所用，“体外”是在细胞培养物中，而“体内”是在受试者体内。如本文所用，“分离的”是指已经从其天然环境(例如，在其是天然存在的情况下的天然环境)取出，使用重组技术产生，或化学或酶促合成的，并且因此“通过人工”从其天然状态被改变的材料。
词语“优选的”和“优选地”指可以在某些情况下提供某些利益的本发明的实施方案。然而，在相同或其他情况下，其他实施方案也可以是优选的。此外，一个或多个优选实施方案的叙述并非暗示其他实施方案不是有用的，并且不预期从本发明的范围内排除其他实施方案。
当术语“包含”及其变式出现在说明书和权利要求中的情况下，这些术语不具有限制性含义。
除非另有说明，否则“一个”，“一种”，“所述/该”和“至少一个/种”可互换使用，表示一个或多于一个。
此外，在本文中，通过终点叙述的数值范围包括在该范围内纳入的所有数值(例如1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
对于包括不连续步骤的本文公开的任何方法，步骤可以任何可行次序进行。此外，适当时，两个或更多个步骤的任何组合可以同时进行。
除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的，表示组分、分子量等的所有数值均应理解为在所有情况下均被术语“约”修饰。因此，除非另有相反的说明，在以下说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数是近似值，可以根据寻求由本发明获得的期望特性来改变。最低限度以及并非作为限制权利要求范围的等同原则的尝试，每个数值参数应至少根据所报告的有效位数值且通过应用普通四舍五入技术来解释。
尽管阐述本发明的宽范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实施例中阐述的数值被尽可能精确地报告。然而，所有数值固有地含有必然由在其各自的测试测量中发现的标准差产生的范围。
所有标题均为了便于读者，并且除非如此指明，不应用于限制标题下的正文的含义。
本发明的上述概述不预期描述本发明的每个公开实施方案或每次实现。下面的描述更具体地举例说明了示例性实施例。在整个申请的几个地方，通过实施例列表提供了指导，所述实施例可以以各种组合使用。在每种情况下，所叙述的列表仅充当代表性组，并且不应解释为详尽列表。
附图简述
图1显示Siglec-7/VSIG-4相互作用的基于细胞的检测。将人VSIG-4 (hVSIG4)/eGFPHEK转染子与重组人Siglec-7 (rhSiglec-7)/Fc蛋白(2μg/mL)加抗Fc APC，或阴性对照(仅抗Fc-APC)一起孵育。右上象限中显示的百分比表示相互作用的水平。
图2(A-B)显示使用BIACORE (GE Healthcare Worldwide, Chicago, IL)测量的表面等离子体共振，以确认VSIG-4-Siglec-7蛋白-蛋白相互作用。图2A：测定示意图；图2B：CM5芯片(GE Healthcare Worldwide, Chicago, IL)用蛋白A/G/L (Novus Biologicals,Littleton, CO)共价包被。将带Fc标签的Siglec7蛋白捕获在蛋白A/G/L芯片上。然后，将芯片暴露于不同量的可溶性的带组氨酸标签的VSIG-4重组蛋白，以确定两种蛋白之间结合相互作用的KD。测定结合亲和力为29.7nM。
图3显示在hVSIG-4转染细胞上的重组人Siglec-7 (rhSiglec-7)/Fc蛋白滴定。将hVSIG4/eGFP HEK转染细胞与不同量的rhSiglec-7/Fc蛋白(500 ng/mL和6μg/mL之间)或阴性对照(FAB110A)一起孵育。右上象限中显示的百分比表示相互作用的水平。
图4显示在hSiglec-7转染细胞上的重组人VSIG-4 (rhVSIG-4)/Fc蛋白滴定。将hSiglec-7/eGFP HEK转染细胞与不同量的rhVSIG-4/Fc蛋白(500 ng/mL和6μg/mL之间)或阴性对照(FAB110A)一起孵育。右上象限中显示的百分比表示相互作用的水平。
图5显示四种抗人VSIG-4抗体阻断VSIG-4与rhSiglec-7/Fc的相互作用。将hVSIG4/eGFP HEK转染子与2.5μg/mL的四种不同抗hVSIG-4抗体(由克隆Ms x hVSIG4528903.111 (“528903”)、Ms x hVSIG4 528906.11 (“528906”)、Ms x hVSIG4 528908.11(“528908”)，和Ms x hVSIG4 528912.11 (“528912”)产生)一起孵育，以测试抗体阻断与Siglec-7相互作用的能力。使用4μg/mL的rhSiglec-7/Fc蛋白。右上象限中显示的百分比表示相互作用的水平。
图6(A-B)显示VSIG-4在用30 ng/mL地塞米松极化3天(图6A)或用20 ng/mL IL-10极化3天(图6B)的M2c单核细胞上表达。如在实施例3中所述，极化M2c细胞。Ms x hVSIG4528903.111 (“528903”)，Ms x hVSIG4 528906.11 (“528906”)，Ms x hVSIG4 528908.11(“528908”)，Ms x hVSIG4 528912.11 (“528912”)和Ms x hVSIG4 528922.111(“528922”)是表达小鼠抗人VSIG-4抗体的克隆。显示的直方图对CD14+Zombie Violet-细胞上设门控。
图7显示在原代M2c极化细胞中Siglec-7/VSIG-4相互作用的检测。在室温下，将极化的M2c细胞与指示量的人Siglec-7 Fc蛋白(1μg/mL至10μg/mL)或阴性对照(FAB110P)一起孵育30分钟。添加抗-Fc PE检测抗体，进行另外20分钟。然后洗涤细胞，用抗-VSIG4Alexa Fluor 647和抗CD14 FITC染色30分钟。然后，用RDFII染色缓冲液洗涤细胞，并在LSRII Fortessa流式细胞仪(BD Biosciences, San Jose, CA)上进行分析。
图8A-图8C显示VSIG-4的架构和结构的图示。图8A：VSIG-4是免疫球蛋白超家族的成员；这种I型跨膜受体含有19个氨基酸的信号肽，其后是细胞外结构域(残基20-283)、跨膜结构域(残基284-304)和细胞内结构域(残基305-399)，其中残基编号对应于Uniprot编号：Q9Y279。VSIG-4的细胞外结构域包含两个串联的Ig结构域，其后是~60个残基的近膜序列。图8B：N末端VSIG-4 Ig结构域的结构(PDB ID 2icc)显示示例性的V型Ig结构域，负责与C3b/iC3b结合的VSIG-4结构域。图8C：VSIG-4胞外域的结构预测显示串联的Ig结构域结构，其后是无结构的~60个残基的近膜区。
图9A-图9D显示Siglec7结合糖基化的VSIG-4。图9A：用酶混合物对在NS0细胞中表达的纯化重组人VSIG-4胞外域(rhVSIG4)进行去糖基化，并通过SDS-PAGE分离，并通过银染可视化。图9B至图9D：将重组人Siglec7-Fc (rhSiglec7-Fc)以~700 RU的捕获密度捕获在用蛋白A/G/L修饰的Biacore CM5芯片上，并测试与浓度在0.5nM和500nM之间的范围的完全糖基化的rhVSIG4 (图9B)、去糖基化的VSIG-4 (图9C)和CD56/NCAM (图9D)的结合。
图10A-图10D显示了Rt x hVSIG4 489517.111特异性结合VSIG-4多肽，而与糖基化状态无关，如Biacore所证实的。将阻断抗体(Rt x hVSIG4 489517.111)以~350 RU捕获在蛋白A/G/L芯片上，并测试与哺乳动物NS0细胞衍生的rhVSIG4 (图10A)、哺乳动物衍生且完全去糖基化的rhVSIG4 (图10B)、大肠杆菌衍生且无糖基化的VSIG-4 (图10C)和高度糖基化的蛋白CD56/NCAM (图10 D)的结合。所有分析物蛋白、rhVSIG4和CD56/NCAM均在25 pM和250 nM之间的浓度范围进行测试。无论VSIG-4的糖基化状态如何，Rt x hVSIG4489517.111都结合VSIG-4，而不结合具有与VSIG4类似的糖特征(glycoprofile)的高度糖基化分子CD56/NCAM，证明Rt x hVSIG4 489517.111对VSIG-4多肽的特异性，并且显示Rt xhVSIG4 489517.111不是抗糖基化特异性的。
图11A-图11D显示Ms x hVSIG4 528906.11特异性结合VSIG-4多肽，而与糖基化状态无关，如Biacore所证实的。将Ms x hVSIG4 528906.11以~350 RU捕获在蛋白A/G/L芯片上，并测试与哺乳动物NS0细胞衍生的rhVSIG4 (图11A)、哺乳动物衍生且完全去糖基化的rhVSIG4 (图11B)、大肠杆菌衍生且无糖基化VSIG-4 (图11C)和高度糖基化的蛋白CD56/NCAM (图11D)的结合。所有分析物蛋白、rhVSIG4和CD56/NCAM均在25 pM和250 nM之间的浓度范围进行测试。无论VSIG-4的糖基化状态如何，Ms x hVSIG4 528906.11都结合VSIG4，而不结合具有与VSIG4类似的糖特征的高度糖基化分子CD56/NCAM，证明Ms x hVSIG4528906.11对VSIG4多肽的特异性，并且显示Ms x hVSIG4 528906.11不是抗糖基化特异性的。
图12A-图12D显示Ms x hVSIG4 528908.11特异性结合VSIG4多肽，而与糖基化状态无关，如Biacore所证实的。将Ms x hVSIG4 528908.11以~350 RU捕获在蛋白A/G/L芯片上，并测试与哺乳动物NS0细胞衍生的rhVSIG4 (图12A)、哺乳动物衍生且完全去糖基化的rhVSIG4 (图12B)、大肠杆菌衍生且无糖基化VSIG-4 (图12C)和高度糖基化的蛋白CD56/NCAM (图12D)的结合。所有分析物蛋白、rhVSIG4和CD56/NCAM均在25 pM和250 nM之间的浓度范围进行测试。无论其糖基化状态如何，所述抗体均结合VSIG4，而不结合具有与VSIG4类似的糖特征的高度糖基化分子CD56/NCAM，证明Ms x hVSIG4 528908.11对VSIG4多肽的特异性，并显示Ms x hVSIG4 528908.11不是抗-糖基化特异性的。
图13A-图13D显示了Ms x hVSIG4 528912.11特异性结合VSIG4多肽，而与糖基化状态无关，如Biacore所证实的。将Ms x hVSIG4 528912.11以~350 RU捕获在蛋白A/G/L芯片上，并测试与哺乳动物NS0细胞衍生的rhVSIG4 (图13A)、哺乳动物衍生且完全去糖基化的rhVSIG4 (图13B)、大肠杆菌衍生且无糖基化VSIG-4 (图13C)和高度糖基化的蛋白CD56/NCAM (图13D)的结合。所有分析物蛋白、rhVSIG4和CD56/NCAM均在25 pM和250 nM之间的浓度范围进行测试。无论VSIG-4的糖基化状态如何，Ms x hVSIG4 528912.11均结合VSIG4，而不结合具有与VSIG4类似的糖特征的高度糖基化分子CD56/NCAM，证明Ms x hVSIG4528912.11对VSIG4多肽的特异性，并显示Ms x hVSIG4 528912.11不是抗糖基化特异性的。
图14显示重组人Siglec-7以剂量依赖性方式特异性结合使用与eGFP融合的重组人VSIG-4转染的HEK293细胞，但不结合使用重组人VSIG3-eGFP转染的相同细胞类型。
图15显示代表性的抗人VSIG-4抗体阻断VSIG-4与用地塞米松极化的贴壁M2c巨噬细胞(贴壁细胞)上的重组人Siglec-7/Fc的相互作用。将M2c巨噬细胞与10μg/mL、40μg/mL或200μg/mL的Ms x hVSIG4 528908.11一起孵育，以测试所述抗体阻断与100μg/mL、25μg/mL或5μg/mL的rhSiglec-7相互作用的能力。直方图对CD14+CD206+细胞设门控。
图16显示Ms x hVSIG4 528908.11和重组人Siglec-7滴定的图15中显示的直方图的代表性点图。显示的数据对CD14+和CD206+细胞设门控。
图17显示代表性的抗人VSIG-4抗体阻断VSIG-4与用地塞米松极化的悬浮M2c巨噬细胞(悬浮细胞)上的重组人Siglec-7/Fc的相互作用。将M2c巨噬细胞与10μg/mL、40μg/mL或200μg/mL的Ms x hVSIG4 528908.11一起孵育，以测试所述抗体阻断与100μg/mL、25μg/mL或5μg/mL的rhSiglec-7相互作用的能力。直方图对CD14+CD206+细胞设门控。
图18显示Ms x hVSIG4 528908.11和重组人Siglec-7滴定的图17中显示的直方图的代表性点图。显示的数据对CD14+和CD206+细胞设门控。
图19A-图19C显示从直接ELISA测试获得的ELISA结果的代表性数据。图19A显示Msx hVSIG4 528902.11识别大肠杆菌表达的单体VSIG-4，但不识别NSO表达的二聚化VSIG-4。图19B显示Ms x hVSIG4 528906.11相等地识别糖基化和未糖基化的VSIG-4蛋白。图19C显示Ms x hVSIG4 528905.11识别糖基化的VSIG-4蛋白，但不识别大肠杆菌表达的VSIG-4。
举例说明性实施方案详述
本公开描述了能够特异性结合含V-集合和Ig结构域的4 (VSIG-4或VSIG4，也称为补体受体Ig (CRIg)和Z391G)；能够阻断VSIG-4及其配体之间相互作用(包括例如最近观察到的VSIG-4与SIGLEC-7之间的相互作用)的抗体；包含本文所述抗体的组合物；以及制备和使用这些抗体和组合物的方法。
VSIG-4充当T细胞活化的负调节剂，很可能在维持T细胞耐受性方面发挥作用。因此，VSIG-4在炎性肿瘤微环境中的过表达可促进肿瘤耐受。因此，识别VSIG-4的抗体具有潜在的诊断价值，以例如，允许鉴定侵袭性级别的肿瘤，提供患有肿瘤的动物中潜在的长期预后的指示，或用作指导治疗的辅助。此外，消除VSIG-4诱导的T细胞活化抑制的中和抗体可以允许增加针对肿瘤细胞的免疫响应。
使用蛋白-蛋白相互作用的筛选，将结合唾液酸的Ig样凝集素7 (Siglec7)确定为VSIG-4的潜在配体。
Siglec7是在自然杀伤(NK)细胞和CD8+ T细胞表面表达的免疫球蛋白家族单体(Nicoll等人，(1999) J. Biol. Chem. 274:34)。Siglec7在NK细胞的高度功能化子集上表达，并且Siglec7的连接抑制NK细胞介导的功能，表明Siglec7可充当抑制性受体(Shao等人，(2016) Scand. J. Immunol. 84:182)。此外，Siglec7配体在肿瘤微环境中的表达影响NK细胞肿瘤免疫监视(Jandus (2014) J. Clin. Invest. 124:1810)。
结合唾液酸的Ig样凝集素(SIGLECS或Siglecs)通常通过与唾液酸修饰的蛋白(或脂质)结合而被激活，且相互作用的特异性由Siglec靶分子(包括例如，通常不限于单个位点的特定靶蛋白的精确聚糖修饰)以及Siglec分子本身(例如，不同的Siglecs可结合到不同的聚糖修饰集合上)二者确定，且因此难以确定Siglec-靶相互作用的特异性或泛杂性。
如本文进一步所述，用中和抗体对VSIG-4/Siglec7相互作用的治疗性阻断，可用于释放VSIG4-诱导的抑制并增加针对肿瘤细胞的免疫响应。
抗体
在一些实施方案中，本公开描述了结合VSIG-4的抗体(即，抗VSIG-4抗体)。在一些实施方案中，所述抗体结合人VSIG-4 (hVSIG-4)。
在一些实施方案中，结合VSIG-4的抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，结合VSIG-4的抗体包括由表1中列出的杂交瘤细胞系(在本文中也称为克隆)和/或通过重组方法产生的单克隆抗体。
在一些实施方案中，所述抗体是分离的抗体。在一些实施方案中，可以通过常规的免疫球蛋白纯化程序，例如蛋白A-或G-琼脂糖、羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱来分离或纯化抗体。
在一些实施方案中，结合VSIG-4的抗体识别VSIG-4多肽。在一些实施方案中，VSIG-4多肽是人VSIG-4 (Uniprot编号：Q9Y279；基因ID 11326)或其片段。在一些实施方案中，VSIG-4多肽是小鼠VSIG-4 (Uniprot编号：F6TUL9)或其片段。在一些实施方案中，结合VSIG-4的抗体识别非还原的VSIG-4多肽。
在一些实施方案中，结合VSIG-4的抗体结合糖基化和未糖基化的VSIG-4。在一些实施方案中，结合VSIG-4的抗体识别VSIG-4多肽而不识别VSIG-4的聚糖修饰。在一些实施方案中，结合VSIG-4的抗体识别VSIG-4的聚糖修饰。在一些实施方案中，结合VSIG-4的抗体不结合α(2,8)连接的聚唾液酸。在一些实施方案中，结合VSIG-4的抗体结合α(2,8)连接的聚唾液酸。
在一些实施方案中，结合VSIG-4的抗体优选结合VSIG-4的细胞外结构域。在一些实施方案中，VSIG-4的细胞外结构域包括Uniprot编号Q9Y279的氨基酸20-283。VSIG-4的细胞外结构域可包括Ig结构域，如一些实施方案中，在图8中所示。在一些实施方案中，结合VSIG-4的抗体可以结合VSIG-4的Ig结构域1 (Q9Y279的氨基酸21-131)。在一些实施方案中，结合VSIG-4的抗体可以结合VSIG-4的Ig结构域2 (Q9Y279的氨基酸143-226)。
在一些实施方案中，结合VSIG-4的抗体可以包括通过任何类型的分子至抗体的共价附接而被修饰或缀合的抗体衍生物。这样的抗体衍生物包括例如已经通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、毒素或与细胞配体或其他蛋白的连接而修饰的抗体。可以通过已知技术进行许多化学修饰中的任一种，包括但不限于衣霉素的特异性化学切割、乙酰化、甲酰化和代谢合成。另外，衍生物可以包含一种或多种非经典氨基酸。
可以通过本领域众所周知的技术，将结合VSIG-4的抗体直接或间接偶联至可检测标记物。可检测标记物是可通过例如光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测的试剂。有用的可检测标记物包括但不限于荧光染料、化学发光化合物、放射性同位素、电子致密试剂、酶、辅酶、有色颗粒、生物素或地高辛。可检测标记物通常会产生可测量的信号，例如放射性、荧光、颜色或酶活性。与可检测试剂缀合的抗体可以用于诊断或治疗目的。可检测试剂的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料，使用各种正电子发射断层成像的正电子发射金属，和非放射性顺磁性金属离子。可以使用本领域已知的技术，将可检测物质直接偶联或缀合至抗体，或通过中间体例如，如本领域已知的接头，间接地偶联或缀合至抗体。参见例如，美国专利号4,741,900，其描述了金属离子与抗体的缀合以用于诊断用途。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素以及亲和素/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素，丹酰氯和藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素(luciferin)和水母发光蛋白；和合适的放射性物质的实例包括碘(121I，123I，125I，131I)，碳(14C)，硫(35S)，氚(3H)，铟(111In，112In，113mIn，115mIn)，锝(99Tc，99mTc)，铊(201Ti)，镓(68Ga，67Ga)，钯(103Pd)，钼(99Mo)，氙(133Xe)，氟(18F)，153Sm，177Lu，159Gd，149Pm，140La，175Yb，166Ho，90Y，47Sc，186Re，188Re，142Pr，105Rh和97Ru。将这样的治疗部分与抗体缀合的技术是众所周知的。
在一些实施方案中，结合VSIG-4的抗体包括由以下杂交瘤细胞系(在本文中也称为克隆)中的至少一种产生的单克隆抗体：Ms x hVSIG4 528902.11 (ATCC登录号PTA-124187)；Ms x hVSIG4 528903.111 (ATCC登录号PTA-124188)；Ms x hVSIG4 528905.11(ATCC登录号PTA-124189)；Ms x hVSIG4 528906.11 (ATCC登录号PTA-124178)；Ms xhVSIG4 528908.11 (ATCC登录号PTA-124179)；Ms x hVSIG4 528910.111 (ATCC登录号PTA-124180)；Ms x hVSIG4 528912.11 (ATCC登录号PTA-124181)；Ms x hVSIG4528922.111 (ATCC登录号PTA-124182)；Ms x hVSIG4 528927.111 (ATCC登录号PTA-124183)；Rt x hVSIG4 489509.11 (ATCC登录号PTA-124184)；Rt x hVSIG4 489517.111(ATCC登录号PTA-124185)；或Rt x hVSIG4 489518.11 (ATCC登录号PTA-124186)。
在一些实施方案中，结合VSIG-4的抗体包括由Ms x hVSIG4 528902.11 (ATCC登录号PTA-124187)产生的单克隆抗体。
在一些实施方案中，结合VSIG-4的抗体包括由Ms x hVSIG4 528903.111 (ATCC登录号PTA-124188)产生的单克隆抗体。
在一些实施方案中，结合VSIG-4的抗体包括由Ms x hVSIG4 528905.11 (ATCC登录号PTA-124189)产生的单克隆抗体。
在一些实施方案中，结合VSIG-4的抗体包括由Ms x hVSIG4 528906.11 (ATCC登录号PTA-124178)产生的单克隆抗体。
在一些实施方案中，结合VSIG-4的抗体包括由Ms x hVSIG4 528908.11 (ATCC登录号PTA-124179)产生的单克隆抗体。
在一些实施方案中，结合VSIG-4的抗体包括由Ms x hVSIG4 528910.111 (ATCC登录号PTA-124180)产生的单克隆抗体。
在一些实施方案中，结合VSIG-4的抗体包括由Ms x hVSIG4 528912.11 (ATCC登录号PTA-124181)产生的单克隆抗体。
在一些实施方案中，结合VSIG-4的抗体包括由Ms x hVSIG4 528922.111 (ATCC登录号PTA-124182)产生的单克隆抗体。
在一些实施方案中，结合VSIG-4的抗体包括由Ms x hVSIG4 528927.111 (ATCC登录号PTA-124183)产生的单克隆抗体。
在一些实施方案中，结合VSIG-4的抗体包括由Rt x hVSIG4 489509.11 (ATCC登录号PTA-124184)产生的单克隆抗体。
在一些实施方案中，结合VSIG-4的抗体包括由Rt x hVSIG4 489517.111 (ATCC登录号PTA-124185)产生的单克隆抗体。
在一些实施方案中，结合VSIG-4的抗体包括由Rt x hVSIG4 489518.11 (ATCC登录号PTA-124186)产生的单克隆抗体。
本公开中还包括由这些杂交瘤细胞系的子代或衍生物产生的单克隆抗体，由等同或相似的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体，和/或其制成的重组衍生物。在一些实施方案中，结合VSIG-4的抗体包括重组衍生的单克隆抗体，包括例如兔B细胞衍生的单克隆抗体。
完整的抗体分子具有两个重(H)链可变区(在本文中简称为VH)和两个轻(L)链可变区(在本文中简称为VL)。VH和VL区可以进一步细分为高可变的区域(称为“互补决定区”("CDR"))，其间散布着更保守的区域(称为“框架区”("FR"))。FR和CDR的范围已被精确定义(参见Kabat等人，(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242和Chothia等人，J. Mol. Biol. 1987;196: 901-917)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。
在一些实施方案中，单克隆抗体包括具有与由以下杂交瘤细胞系中的至少一种产生的单克隆抗体相同的重链的单克隆抗体：Ms x hVSIG4 528902.11；Ms x hVSIG4528903.111；Ms x hVSIG4 528905.11；Ms x hVSIG4 528906.11；Ms x hVSIG4 528908.11；Ms x hVSIG4 528910.111；Ms x hVSIG4 528912.11；Ms x hVSIG4 528922.111；Ms xhVSIG4 528927.111；Rt x hVSIG4 489509.11；Rt x hVSIG4 489517.111；或Rt x hVSIG4489518.11。在一些实施方案中，单克隆抗体包括具有与由以下杂交瘤细胞系中的至少一种产生的单克隆抗体相同的轻链的单克隆抗体：Ms x hVSIG4 528902.11；Ms x hVSIG4528903.111；Ms x hVSIG4 528905.11；Ms x hVSIG4 528906.11；Ms x hVSIG4 528908.11；Ms x hVSIG4 528910.111；Ms x hVSIG4 528912.11；Ms x hVSIG4 528922.111；Ms xhVSIG4 528927.111；Rt x hVSIG4 489509.11；Rt x hVSIG4 489517.111；或Rt x hVSIG4489518.11。在一些实施方案中，单克隆抗体包括具有与由以下杂交瘤细胞系中的至少一种产生的单克隆抗体相同的重链和相同的轻链的单克隆抗体：Ms x hVSIG4 528902.11；Ms xhVSIG4 528903.111；Ms x hVSIG4 528905.11；Ms x hVSIG4 528906.11；Ms x hVSIG4528908.11；Ms x hVSIG4 528910.111；Ms x hVSIG4 528912.11；Ms x hVSIG4528922.111；Ms x hVSIG4 528927.111；Rt x hVSIG4 489509.11；Rt x hVSIG4489517.111；或Rt x hVSIG4 489518.11。在一些实施例中，单克隆抗体可以在上文确定的重链和/或轻链中包含1、2、3、4、5、6个或更多个氨基酸取代，其中所述氨基酸取代基本上不影响抗体与VSIG-4的结合。
在一些实施方案中，单克隆抗体包括具有与由以下杂交瘤细胞系中的至少一种产生的单克隆抗体相同的VH结构域的单克隆抗体：Ms x hVSIG4 528902.11；Ms x hVSIG4528903.111；Ms x hVSIG4 528905.11；Ms x hVSIG4 528906.11；Ms x hVSIG4 528908.11；Ms x hVSIG4 528910.111；Ms x hVSIG4 528912.11；Ms x hVSIG4 528922.111；Ms xhVSIG4 528927.111；Rt x hVSIG4 489509.11；Rt x hVSIG4 489517.111；或Rt x hVSIG4489518.11。在一些实施方案中，单克隆抗体包括具有与由以下杂交瘤细胞系中的至少一种产生的单克隆抗体相同的VL结构域的单克隆抗体：Ms x hVSIG4 528902.11；Ms x hVSIG4528903.111；Ms x hVSIG4 528905.11；Ms x hVSIG4 528906.11；Ms x hVSIG4 528908.11；Ms x hVSIG4 528910.111；Ms x hVSIG4 528912.11；Ms x hVSIG4 528922.111；Ms xhVSIG4 528927.111；Rt x hVSIG4 489509.11；Rt x hVSIG4 489517.111；或Rt x hVSIG4489518.11。在一些实施方案中，单克隆抗体包括具有与由以下杂交瘤细胞系中的至少一种产生的单克隆抗体相同的VH结构域和相同的VL结构域的单克隆抗体：Ms x hVSIG4528902.11；Ms x hVSIG4 528903.111；Ms x hVSIG4 528905.11；Ms x hVSIG4 528906.11；Ms x hVSIG4 528908.11；Ms x hVSIG4 528910.111；Ms x hVSIG4 528912.11；Ms xhVSIG4 528922.111；Ms x hVSIG4 528927.111；Rt x hVSIG4 489509.11；Rt x hVSIG4489517.111；或Rt x hVSIG4 489518.11。在一些实施方案中，单克隆抗体可在上文确定的VH结构域和/或VL结构域中包含1、2、3、4、5、6个或更多个氨基酸取代，其基本上不影响抗体与VSIG-4的结合。
在一些实施方案中，单克隆抗体包括具有由以下杂交瘤细胞系中的至少一种产生的单克隆抗体的VH结构域的至少一个CDR的单克隆抗体：Ms x hVSIG4 528902.11；Ms xhVSIG4 528903.111；Ms x hVSIG4 528905.11；Ms x hVSIG4 528906.11；Ms x hVSIG4528908.11；Ms x hVSIG4 528910.111；Ms x hVSIG4 528912.11；Ms x hVSIG4528922.111；Ms x hVSIG4 528927.111；Rt x hVSIG4 489509.11；Rt x hVSIG4489517.111；或Rt x hVSIG4 489518.11。在一些实施方案中，单克隆抗体包括具有由以下杂交瘤细胞系中的至少一种产生的单克隆抗体的VH结构域的至少两个CDR的单克隆抗体：Ms x hVSIG4 528902.11；Ms x hVSIG4 528903.111；Ms x hVSIG4 528905.11；Ms xhVSIG4 528906.11；Ms x hVSIG4 528908.11；Ms x hVSIG4 528910.111；Ms x hVSIG4528912.11；Ms x hVSIG4 528922.111；Ms x hVSIG4 528927.111；Rt x hVSIG4489509.11；Rt x hVSIG4 489517.111；或Rt x hVSIG4 489518.11。在一些实施方案中，单克隆抗体包括具有由以下杂交瘤细胞系中的至少一种产生的单克隆抗体的VH结构域的至少三个CDR的单克隆抗体：Ms x hVSIG4 528902.11；Ms x hVSIG4 528903.111；Ms xhVSIG4 528905.11；Ms x hVSIG4 528906.11；Ms x hVSIG4 528908.11；Ms x hVSIG4528910.111；Ms x hVSIG4 528912.11；Ms x hVSIG4 528922.111；Ms x hVSIG4528927.111；Rt x hVSIG4 489509.11；Rt x hVSIG4 489517.111；或Rt x hVSIG4489518.11。
另外地或可替代地，在一些实施方案中，单克隆抗体包括具有由以下杂交瘤细胞系中的至少一种产生的单克隆抗体的VL结构域的至少一个CDR的单克隆抗体：Ms x hVSIG4528902.11；Ms x hVSIG4 528903.111；Ms x hVSIG4 528905.11；Ms x hVSIG4 528906.11；Ms x hVSIG4 528908.11；Ms x hVSIG4 528910.111；Ms x hVSIG4 528912.11；Ms xhVSIG4 528922.111；Ms x hVSIG4 528927.111；Rt x hVSIG4 489509.11；Rt x hVSIG4489517.111；或Rt x hVSIG4 489518.11。在一些实施方案中，单克隆抗体包括具有由以下杂交瘤细胞系中的至少一种产生的单克隆抗体的VL结构域的至少两个CDR的单克隆抗体：Ms x hVSIG4 528902.11；Ms x hVSIG4 528903.111；Ms x hVSIG4 528905.11；Ms xhVSIG4 528906.11；Ms x hVSIG4 528908.11；Ms x hVSIG4 528910.111；Ms x hVSIG4528912.11；Ms x hVSIG4 528922.111；Ms x hVSIG4 528927.111；Rt x hVSIG4489509.11；Rt x hVSIG4 489517.111；或Rt x hVSIG4 489518.11。在一些实施方案中，单克隆抗体包括具有由以下杂交瘤细胞系中的至少一种产生的单克隆抗体的VL结构域的至少三个CDR的单克隆抗体：Ms x hVSIG4 528902.11；Ms x hVSIG4 528903.111；Ms xhVSIG4 528905.11；Ms x hVSIG4 528906.11；Ms x hVSIG4 528908.11；Ms x hVSIG4528910.111；Ms x hVSIG4 528912.11；Ms x hVSIG4 528922.111；Ms x hVSIG4528927.111；Rt x hVSIG4 489509.11；Rt x hVSIG4 489517.111；或Rt x hVSIG4489518.11。
在一些实施方案中，单克隆抗体可以在上文确定的一个或多个CDR中包含1、2、3、4、5、6个或更多个氨基酸取代，其基本不影响抗体与VSIG-4的结合。
在一些实施方案中，单克隆抗体可以在一个或多个框架区(FR)中包含1、2、3、4、5、6个或更多个氨基酸取代。在一些实施方案中，取代或构架区(FR)中的取代基本上不影响抗体与VSIG-4的结合。
在一些实施方案中，单克隆抗体包括具有如下氨基酸序列的单克隆抗体，所述氨基酸序列与由以下杂交瘤细胞系中的至少一种产生的单克隆抗体的VH结构域的至少一个CDR的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性：Ms x hVSIG4 528902.11；Ms x hVSIG4 528903.111；Ms x hVSIG4 528905.11；Ms x hVSIG4 528906.11；Ms x hVSIG4 528908.11；Ms x hVSIG4528910.111；Ms x hVSIG4 528912.11；Ms x hVSIG4 528922.111；Ms x hVSIG4528927.111；Rt x hVSIG4 489509.11；Rt x hVSIG4 489517.111；或Rt x hVSIG4489518.11。
在一些实施方案中，单克隆抗体包括具有如下氨基酸序列的单克隆抗体，所述氨基酸序列与由以下杂交瘤细胞系中的至少一种产生的单克隆抗体的VH结构域的至少两个CDR的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性：Ms x hVSIG4 528902.11；Ms x hVSIG4 528903.111；Ms x hVSIG4 528905.11；Ms x hVSIG4 528906.11；Ms x hVSIG4 528908.11；Ms x hVSIG4528910.111；Ms x hVSIG4 528912.11；Ms x hVSIG4 528922.111；Ms x hVSIG4528927.111；Rt x hVSIG4 489509.11；Rt x hVSIG4 489517.111；或Rt x hVSIG4489518.11。
在一些实施方案中，单克隆抗体包括具有如下氨基酸序列的单克隆抗体，所述氨基酸序列与由以下杂交瘤细胞系中的至少一种产生的单克隆抗体的VH结构域的至少三个CDR的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性：Ms x hVSIG4 528902.11；Ms x hVSIG4 528903.111；Ms x hVSIG4 528905.11；Ms x hVSIG4 528906.11；Ms x hVSIG4 528908.11；Ms x hVSIG4528910.111；Ms x hVSIG4 528912.11；Ms x hVSIG4 528922.111；Ms x hVSIG4528927.111；Rt x hVSIG4 489509.11；Rt x hVSIG4 489517.111；或Rt x hVSIG4489518.11。
在一些实施方案中，单克隆抗体包括具有如下氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列与由以下杂交瘤细胞系中的至少一种表达的抗体的VL结构域的至少一个CDR具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性：Ms x hVSIG4 528902.11；Ms x hVSIG4 528903.111；Ms x hVSIG4 528905.11；Ms x hVSIG4 528906.11；Ms x hVSIG4 528908.11；Ms x hVSIG4 528910.111；Ms xhVSIG4 528912.11；Ms x hVSIG4 528922.111；Ms x hVSIG4 528927.111；Rt x hVSIG4489509.11；Rt x hVSIG4 489517.111；或Rt x hVSIG4 489518.11。
在一些实施方案中，单克隆抗体包括具有如下氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列与由以下杂交瘤细胞系中的至少一种表达的抗体的VL结构域的至少两个CDR具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性：Ms x hVSIG4 528902.11；Ms x hVSIG4 528903.111；Ms x hVSIG4 528905.11；Ms x hVSIG4 528906.11；Ms x hVSIG4 528908.11；Ms x hVSIG4 528910.111；Ms xhVSIG4 528912.11；Ms x hVSIG4 528922.111；Ms x hVSIG4 528927.111；Rt x hVSIG4489509.11；Rt x hVSIG4 489517.111；或Rt x hVSIG4 489518.11。
在一些实施方案中，单克隆抗体包括具有如下氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列与由以下杂交瘤细胞系中的至少一种表达的抗体的VL结构域的至少三个CDR具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性：Ms x hVSIG4 528902.11；Ms x hVSIG4 528903.111；Ms x hVSIG4 528905.11；Ms x hVSIG4 528906.11；Ms x hVSIG4 528908.11；Ms x hVSIG4 528910.111；Ms xhVSIG4 528912.11；Ms x hVSIG4 528922.111；Ms x hVSIG4 528927.111；Rt x hVSIG4489509.11；Rt x hVSIG4 489517.111；或Rt x hVSIG4 489518.11。
所述抗体可以是来自任何合适物种的抗体。在一些实施方案中，抗体可以是小鼠抗体。在一些实施方案中，抗体可以是大鼠抗体。在一些实施方案中，抗体可以是兔抗体。
在一些实施方案中，所述抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，抗体可以是抗体或IgG亚类，包括例如IgG1，IgG2，IgG3或IgG4。在一些实施方案中，抗体可以是以下亚类之一的小鼠IgG：IgG1，IgG2A，IgG2B，IgG2C和IgG3。在一些实施方案中，抗体可以是以下亚类之一的大鼠IgG：IgG1，IgG2A，IgG2B或IgG2C。
在一些实施方案中，抗体可包含κ轻链。在一些实施方案中，抗体可包含λ轻链。
在一些实施方案中，单克隆抗体包括抗原结合片段，包括Fab片段，Fab'片段，F(ab)2片段和/或Fv片段。
单克隆抗体可以通过任何合适的技术获得。在一些实施方案中，结合VSIG-4的抗体可以通过重组DNA方法制备，通过噬菌体展示产生和/或通过组合方法产生。编码结合VSIG-4的抗体的DNA可以很容易地使用常规程序进分离和测序。在一些实施方案中，本文所述的杂交瘤细胞可以用作此类DNA的来源。一经分离，可以将DNA转染到宿主细胞(包括例如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾细胞(HEK)，或在其他情况下不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)中，或通过基因组编辑(例如，使用CRISPR-Cas系统)引入宿主细胞中，以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。编码结合VSIG-4的抗体的DNA可以被修饰以例如使抗体人源化。
在一些实施方案中，所述抗体可以是人源化抗体。可以通过任何合适的方法使结合VSIG-4的抗体人源化。产生人源化单克隆抗体的技术可见于例如Jones等人，(1986)Nature 321:522和Singer等人，(1993) J. Immunol. 150:2844中。例如，抗体的人源化可以包括对抗体的改变，以降低抗体在用于人类中时的免疫原性。在一些实施方案中，结合VSIG-4的人源化抗体可包括人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。在一些实施方案中，结合VSIG-4的人源化抗体可以包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体抗体的一个或多个互补决定区(CDR)的残基被来自结合VSIG-4的非人类物种抗体(供体抗体，例如小鼠、大鼠或兔抗体)的一个或多个CDR的残基替代。在一些实施方案中，人免疫球蛋白的Fv框架残基可以被来自结合VSIG-4的抗体的相应的非人残基替代。
在一些实施方案中，单克隆抗体包括嵌合抗体，即其中不同部分衍生自不同动物物种的抗体。嵌合抗体可以通过例如将来自具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自具有适当生物学特异性的人抗体分子的基因剪接在一起而获得。参见，例如，Takeda等人，(1985) Nature 314:544。
在一些实施方案中，抗体包括双特异性或双功能抗体。双特异性或双功能抗体是具有两个不同重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可以通过多种方法产生，所述方法包括杂交瘤的融合或F(ab')片段的连接。参见，例如Songsivilai和Lachmann (1990) Clin. Exp. Immunol. 79:315；Kostelny等人(1992) J. Immunol.148:1547。此外，双特异性抗体可作为“双功能抗体”(Holliger等人(1993) PNAS USA 90:6444)，或“Janusins” (Traunecker等人，(1991) EMBO J. 10:3655；Traunecker等人(1992) Int. J. Cancer Suppl. 7:51)形成。
在一些实施方案中，抗体由动物产生(包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、仓鼠，山羊、马、鸡或火鸡)产生，由来自动物的细胞产生，化学合成，或重组表达。可以通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法来纯化抗体，例如，通过色谱法(例如，离子交换、亲和力，和分级柱色谱法)、离心、差异溶解度或通过用于蛋白纯化的任何其他标准技术。另外，抗体可以与异源多肽序列融合，如本文所述或本领域另外已知的，包括例如以促进纯化。
可以通过本文所述的方法和本领域已知的任何合适的方法，来测定另外抗体的免疫特异性结合。可以使用的免疫测定包括但不限于使用如下技术的竞争性和/或非竞争性测定系统，所述技术诸如BIACORE分析、荧光激活细胞分选(FACS)分析、免疫荧光、免疫细胞化学、Western印迹、放射免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定和蛋白A免疫测定。这样的测定是常规的并且在本领域中是众所周知的(参见，Ausubel等人编辑，Current Protocols in Molecular Biology，第一卷，JohnWiley & Sons, Inc., N.Y. (1994))。
在一些实施方案中，结合VSIG-4的抗体包括消除VSIG-4与VSIG-4配体的结合的抗体。在一些实施方案中，抗体包括消除VSIG-4与Siglec-7的结合的抗体。在一些实施方案中，Siglec-7是人Siglec-7 (Uniprot编号：Q9Y286)。在一些实施方案中，抗体可以使VSIG-4与VSIG-4配体 (包括例如Siglec-7)的结合降低至少百分之10(％)、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％。
在一些实施方案中，VSIG-4配体可以经由跨膜结构域锚定于细胞。在一些实施方案中，VSIG-4配体可以在溶液中。
在一些实施方案中，消除VSIG-4与Siglec-7的结合的抗体包括由以下杂交瘤细胞系中的至少一种产生的单克隆抗体：Ms x hVSIG4 528903.111；Ms x hVSIG4 528908.11；Ms x hVSIG4 528912.11；Rt x hVSIG4 489509.11；Rt x hVSIG4 489517.111；或Rt xhVSIG4 489518.11。
在一些实施方案中，VSIG-4和VSIG-4配体中的至少一种可以在细胞表面上。例如，VSIG-4可以在巨噬细胞(包括，例如M2巨噬细胞)的表面上表达。M2巨噬细胞可包括一个或多个M2亚型，包括M2a，M2b，M2c和M2d亚型。在一些实施方案中，巨噬细胞可优选包括M2c巨噬细胞。当VSIG-4和VSIG-4配体中的至少一种在细胞表面上时，结合VSIG-4的抗体可以消除VSIG-4与表达VSIG-4配体的细胞的结合，表达VSIG-4的细胞与VSIG-4配体的结合，和/或表达VSIG-4的细胞与表达VSIG-4配体的细胞的结合。例如，当VSIG-4和VSIG-4配体Siglec-7在细胞表面上表达时，结合VSIG-4的抗体可消除细胞-细胞的结合。
在一些实施方案中，可以通过用VSIG4的细胞外结构域免疫动物，来制备结合VSIG4的抗体。在一些实施方案中，可以通过用人VSIG-4的氨基酸1-283 (Uniprot编号：Q9Y279；基因ID 11326)免疫动物，来制备结合VSIG4的抗体。在一些实施方案中，可以通过用人VSIG-4的一部分免疫动物，来制备结合VSIG4的抗体。在一些实施方案中，动物可以是哺乳动物。例如，动物可以是兔、小鼠、山羊、绵羊、美洲驼或大鼠。在一些实施方案中，动物可以是鸡。
在另一方面，本公开描述了分离的多核苷酸分子。在一些实施方案中，分离的多核苷酸分子包括编码抗体的核苷酸序列。在一些实施方案中，分离的多核苷酸分子包括与编码本文所述的抗体的核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，分离的多核苷酸分子包括在高严格性下与编码抗体的核苷酸序列杂交的多核苷酸或其互补体。如本文所用的，“严格条件”是指在65℃，于0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、和1mM EDTA中，随后在42℃，于0.2 X SSC/0.1％SDS中洗涤，第一多核苷酸分子和与滤器结合的第二多核苷酸分子杂交并保持结合的能力(参见Ausubel等人，(eds.),Current Protocols in Molecular Biology，第一卷，Green Publishing Associates,Inc.和John Wiley & Sons, Inc., N.Y. (1989)，在p. 2.10.3)。在一些实施方案中，分离的多核苷酸分子包括编码本发明的单克隆抗体的一个或多个CDR或重链和/或轻链的多核苷酸。克隆和测序免疫球蛋白可变结构域和恒定区的通用技术是众所周知的。参见例如，Orlandi等人，(1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:3833。
在另一方面，本公开描述了包含本发明的分离的多核苷酸的重组载体。载体可以是例如质粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。可以通过多种程序，将合适的DNA序列插入载体。通常，通过本领域已知的程序，将DNA序列插入载体中合适的限制性核酸内切酶位点中。这样的程序被认为在本领域技术人员的能力范围内。大量合适的载体和启动子是本领域技术人员已知的，并且是商购可得的。以下载体以示例的方式提供。细菌载体包括例如pQE70、pQE60、pQE-9、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和pRIT5。真核载体包括例如pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。但是，可以使用任何其他质粒或载体。
在进一步方面，本公开还包括含有至少一种上述载体的宿主细胞。宿主细胞可以是较高等的真核细胞，例如哺乳动物或昆虫细胞，或较低等的真核细胞，例如酵母细胞。或者，宿主细胞可以是原核细胞，例如细菌细胞或植物细胞。可以通过任何合适的技术，将载体构建体引入宿主细胞中，例如，如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染，或电穿孔(Davis等人，Basic Methods in Molecular Biology (1986))。
本发明的抗体可以在适当的启动子的控制下在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其他细胞中表达。也可以使用无细胞翻译系统，使用衍生自本发明DNA构建体的RNA，产生此类蛋白。用于原核和真核宿主的适当的克隆和表达载体描述于Sambrook等人，MolecularCloning: A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)。
本发明还包括表达来自本发明抗体的一个或多个高可变区的噬菌体展示文库，以及从此类噬菌体展示文库获得的克隆。噬菌体展示文库用于产生抗体衍生的分子。将编码抗体的抗原结合可变结构域的基因片段与编码噬菌体外壳蛋白的基因融合。含有这种基因融合体的噬菌体被用于感染细菌，并且所得到的噬菌体颗粒具有表达抗体融合蛋白的外壳，其中抗原结合结构域展示在噬菌体的外部。噬菌体展示文库可以例如使用可得自NewEngland Biolabs Inc. Ipswich, MA的Ph.D.-7噬菌体展示肽文库试剂盒(目录号E8100S)或Ph.D.-12噬菌体展示肽文库试剂盒(目录号E8110S)制备。参见例如Smith和Petrenko(1997) Chem Rev. 97:391-410。
杂交瘤细胞系
本公开进一步描述了表达单克隆抗体的杂交瘤细胞系(在本文中也称为“克隆”)，包括例如以下杂交瘤细胞系：Ms x hVSIG4 528902.11；Ms x hVSIG4 528903.111；Ms x hVSIG4528905.11；Ms x hVSIG4 528906.11；Ms x hVSIG4 528908.11；Ms x hVSIG4 528910.111；Ms x hVSIG4 528912.11；Ms x hVSIG4 528922.111；Ms x hVSIG4 528927.111；Rt xhVSIG4 489509.11；Rt x hVSIG4 489517.111；或Rt x hVSIG4 489518.11。在一些实施方案中，由杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体结合VSIG-4。在一些实施方案中，由杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体消除VSIG-4与Siglec-7的结合。
杂交瘤细胞系可以通过本领域技术人员熟悉的各种技术获得。例如，通常通过与骨髓瘤细胞融合，使来自用期望的抗原免疫的动物的细胞永生化(参见，例如Kohler和Milstein (1976) Eur. J. Immunol. 6:511；J. Goding在“Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,” Academic Press, pp 59-103 (1986)；和Harlow等人，Antibodies: A Laboratory Manual，726页(Cold Spring Harbor Pub. 1988)。在一些实施方案中，被免疫的动物优选是哺乳动物。在一些实施方案中，被免疫的动物是大鼠，包括例如Wistar大鼠，或小鼠，例如包括BALB/C小鼠。在一些实施方案中，来自动物的细胞是脾细胞。在一些实施方案中，来自动物的细胞优选是淋巴细胞。在一些实施方案中，骨髓瘤细胞包括P3X63Ag8.653细胞。
也可以使用其他已知的产生转化的B细胞系(其产生单克隆抗体)的方法。
重组抗体
本公开进一步描述了重组衍生的单克隆抗体。重组衍生的单克隆抗体可以包括例如兔B细胞衍生的单克隆抗体。本公开的克隆抗体可以通过任何合适的重组技术产生，包括例如通过噬菌体展示，或通过组合方法。参见例如，美国专利号5,223,409；WO 92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO 92/09690；或WO 90/02809。此类方法可用于产生人单克隆抗体。
抗VSIG-4抗体的用途
如本文所述，结合VSIG-4的抗体可用于任何合适的应用。例如，单克隆抗体可用于体外和体内的诊断和治疗方法。
在一些实施方案中，抗体可用于在体外或体内确定VSIG-4蛋白的表达水平。在一些实施方案中，确定VSIG-4蛋白表达的水平可用于检测癌症。在一些实施方案中，抗体可用于在体内或体外标记细胞。在一些实施方案中，抗体可用于确定患者样品中VSIG-4蛋白的表达水平。在一些实施方案中，患者样品可以包括哺乳动物癌细胞。在一些实施方案中，哺乳动物癌细胞可以包括肺癌细胞或胶质瘤细胞。在一些实施方案中，患者样品(包括例如包括哺乳动物癌细胞的患者样品)可以包括巨噬细胞。
在一些实施方案中，抗体可以被标记。例如，可以使用抗体标记细胞，并且可以通过次级方法将标记的细胞直接或间接成像。在某些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。
在一些实施方案中，抗体可用于鉴定来自受试者的样品中VSIG-4蛋白的存在或不存在。在一些实施方案中，鉴定VSIG-4的存在可以包括鉴定来自受试者的样品中VSIG-4的量。在一些实施方案中，鉴定VSIG-4的存在可以用于检测癌症。
先前已经报道VSIG-4在驻留组织的巨噬细胞上表达。在诊断患有非小细胞肺癌的患者中观察到VSIG-4+巨噬细胞向肿瘤微环境中的大量浸润(Liao等人，(2014) Lab.Invest. 94:706)，并且高VSIG-4表达也与高分级的胶质瘤和患者预后不良相关(Xu等人，(2015) Am. J. Transl. Res. 7:1172)。如实施例3中所示，在体外分化成M2c巨噬细胞谱系，用地塞米松或重组人IL-10 (rhIL-10)极化的CD14阳性人PBMC单核细胞上检测到VSIG-4表达(图6)。
在一些实施方案中，抗VSIG-4抗体可用于确定癌细胞，肿瘤细胞或包括癌细胞或肿瘤细胞的患者样品上的VSIG-4表达水平。在一些实施方案中，包括癌细胞或肿瘤细胞的患者样品可以进一步包括巨噬细胞。在一些实施方案中，抗VSIG-4抗体可用于确定包括例如巨噬细胞的患者样品的细胞中或细胞上的VSIG-4表达水平。在一些实施方案中，VSIG-4表达的水平将被扩增。在一些实施方案中，抗VSIG-4抗体可用于确定巨噬细胞中和/或巨噬细胞上的VSIG-4表达水平。在一些实施方案中，鉴定VSIG-4的表达或表达水平可用于鉴定癌症或肿瘤；协助进行癌症或肿瘤的分级；和/或提供长期预后的指示。在一些实施方案中，癌症可以包括肺癌或胶质瘤。
在一些实施方案中，抗VSIG-4抗体可以用于治疗哺乳动物癌症。在一些实施方案中，治疗哺乳动物癌症可以包括使包含哺乳动物癌细胞的哺乳动物暴露于抗VSIG-4抗体。在一些实施方案中，可以在包括哺乳动物癌细胞的患者样品中扩增VSIG-4表达。例如，可以在包括哺乳动物癌细胞的患者样品的巨噬细胞中扩增VSIG-4表达。在一些实施方案中，哺乳动物癌症可包括肺癌或胶质瘤。
在一些实施方案中，抗VSIG-4抗体可以用于治疗自身免疫疾病。自身免疫疾病可包括例如自身免疫1型糖尿病、类风湿性关节炎、牛皮癣或狼疮。不希望受到理论的束缚，因为已知巨噬细胞在某些自身免疫疾病的发病机理中起作用，参见例如Campos Navegantes等人，(2017) J. Transl. Med. 15:36，并且，如本文所示(参见实施例5)，抗VSIG-4抗体可阻断M2c巨噬细胞上天然表达的VSIG-4与Siglec-7的相互作用，抗VSIG-4抗体可用于例如治疗包括与M2c巨噬细胞上表达的VSIG-4相互作用的自身免疫疾病。
如实施例1中所述，在标准ELISA测定中，将可溶性重组人VSIG-4作为捕获试剂铺板。发现重组的，生物素化的人SIGLEC-7与VSIG-4结合(图1＆表1)。然后在基于细胞的测定中，检查推定的蛋白-蛋白相互作用。将经转染以过表达人VSIG-4和eGFP的HEK细胞与rhSIGLEC-7/Fc一起培养。通过流式细胞术，用APC-缀合的抗Fc抗体检测rhSIGLEC-7/Fc与细胞的结合(图2)。经由表面等离振子共振(SPR)/BIACORE进一步分析SIGLEC-7与VSIG-4的结合(图3)。
使用基于细胞的测定来滴定VSIG-4转染的细胞上的rhSIGLEC-7的量，并且显示相互作用是剂量依赖性的(图4)。为了进一步证实这种相互作用，将所述测定翻转，并且显示rhVSIG-4以剂量依赖的方式结合表达SIGLEC-7的细胞(图5)。
如实施例2和3中所示，使用抗VSIG-4抗体阻断相互作用证实了rhSIGLEC-7与VSIG-4的特异性结合(图5)。显示四个克隆特异性阻断SIGLEC-7/VSIG-4相互作用。经由表面等离子体共振(SPR)/BIACORE确定这些和其他单克隆抗VSIG-4抗体的结合亲和力(表2)。
如实施例4中所示，可以将VSIG-4糖基化(图9)。如实施例4和实施例6中所示，在一些实施方案中，抗VSIG-4抗体可以结合VSIG-4多肽而不结合VSIG-4的聚糖修饰(图10-图13，图19，表3)，产生可以结合糖基化和未糖基化的VSIG-4的抗VSIG-4抗体。在一些实施方案中，抗VSIG4抗体可以结合糖基化的VSIG-4，但不结合未糖基化的多肽。
在一些实施方案中，抗VSIG-4抗体或包含抗VSIG-4抗体的组合物可用于消除VSIG-4与Siglec-7的结合。例如，如实施例5中所示，抗VSIG-4抗体或包含抗VSIG-4抗体的组合物可用于消除细胞-细胞相互作用(图15-18)。不希望受理论的束缚，据信消除VSIG-4与Siglec-7的结合的抗体可以通过Siglec-7在CD8+ T细胞和NK细胞上的连接来消除或抑制T细胞/NK细胞的免疫监视。因此，使用中和抗体对VSIG-4-Siglec7相互作用的治疗性阻断，可用于释放VSIG-4诱导的抑制，并增强针对肿瘤细胞的免疫功能或抑制自身免疫疾病中的免疫响应。另外地或可替代地，消除VSIG-4与Siglec-7结合的抗体可通过抑制Siglec-7与巨噬细胞上的VSIG-4的结合，来消除或抑制巨噬细胞信号传导。
本公开进一步描述了包含抗体的试剂盒。例如，试剂盒可包括包含抗VSIG-4单克隆抗体的组合物。试剂盒中的抗体可以用一种或多种可检测标记物标记，如本文所述。
试剂盒可包括一个或多个以一种或多种本发明的单克隆抗体填充的容器。此外，所述试剂盒可以包括其他试剂，例如缓冲剂，并且还包括实施本发明所需的溶液。任选地与这类容器相关联的可以是通知或打印的说明书。如本文所用，短语“包装材料”是指用于容纳试剂盒内容物的一种或多种物理结构。包装材料通过公知的方法构建，优选提供无菌、无污染的环境。如本文所用，术语“包装”是指能够将多肽保持在固定界限内的固体基质或材料，例如玻璃、塑料、纸、箔等。
包含抗体的组合物
在一些实施方案中，本公开描述了包含至少一种本文描述的抗体的组合物。
在一些实施方案中，组合物还可包含例如缓冲剂，以帮助将pH维持在可接受的范围内，或防腐剂以阻止微生物的生长。组合物还可包含例如载体、赋形剂、稳定剂、螯合剂、盐或抗微生物剂。可接受的载体、赋形剂、稳定剂、螯合剂、盐、防腐剂、缓冲剂或抗微生物剂包括但不限于缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂，如叠氮化钠、十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚；多肽；蛋白，例如血清白蛋白、明胶或非特异性免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐的抗衡离子，例如钠；金属复合物(例如锌(Zn)-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEEN、PLURONICS或聚乙二醇(PEG)。
在一些实施方案中，组合物是药物组合物，并且包括单克隆抗体和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。如本领域技术人员显而易见的，在包含本文教导中描述的抗体的药物组合物的制备中，可以使用多种媒介物和赋形剂。
药物组合物通常将包含药学上可接受的载体和药理有效量的抗体或抗体混合物。
药物组合物可以配制成粉剂、颗粒剂、溶液、混悬剂、气雾剂、固体、丸剂、片剂、胶囊剂、凝胶剂、局部乳膏剂、栓剂、透皮贴剂和/或本领域已知的另一制剂。
为了本文所述的目的，抗体的药学上可接受的盐旨在包括任何本领域公认的药学上可接受的盐，包括有机和无机酸和/或碱。盐的实例包括但不限于钠、钾、锂、铵、钙以及伯、仲和叔胺，低级烃的酯，例如甲基、乙基和丙基。其他盐包括但不限于有机酸，例如乙酸、丙酸、丙酮酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、水杨酸等。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括在配制药物组合物的领域的普通技术人员已知的任何标准药学上可接受的载体。例如，抗体可以制备成在药学上可接受的稀释剂中的制剂，所述稀释剂包括例如盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、含水乙醇，或葡萄糖、甘露醇、葡聚糖、丙二醇、油(例如，植物油、动物油、合成油等)，微晶纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸钙、明胶、聚山梨酯80的溶液，或制备成在适当赋形剂中的固体制剂。
药物组合物通常将进一步包含一种或多种缓冲液(例如中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)，碳水化合物(例如葡萄糖，蔗糖或葡聚糖)，甘露醇、蛋白、多肽或氨基酸，例如甘氨酸，抗氧化剂(例如，抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠、丁基化羟基甲苯、丁基化羟基茴香醚等)，抑菌剂、螯合剂(如EDTA或谷胱甘肽)，佐剂(例如氢氧化铝)，使制剂与受体的血液等渗、低渗或弱高渗的溶质，悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂。可替代地，本发明的组合物可以配制为冻干剂。
本领域普通技术人员已知的任何合适的载体可以用于包含至少一种本文所述抗体的组合物中。可以配制抗体组合物，以用于任何合适的施用方式，包括例如口服、经鼻、粘膜、静脉内、腹膜内、皮内、皮下和肌内施用。
施用和治疗
本公开的组合物可以配制成适于所选择的施用途径的多种形式的药物制剂。技术人员将理解，组合物将取决于施用方式和剂量单位而变化。例如，对于肠胃外施用，可以使用等渗盐水。对于局部施用，可以使用乳膏剂，其包含载体，例如二甲基亚砜(DMSO)，或通常见于局部乳膏剂中的，不阻断或抑制肽活性的其他试剂。其他合适的载体包括但不限于醇，磷酸盐缓冲盐水和其他平衡的盐溶液。本发明的化合物可以多种方式施用，包括但不限于静脉内、局部、口服、皮下、腹膜内和肌内递送。在一些方面，可以将本发明的化合物配制成用于控制释放或持续释放。在一些方面，用于控制释放或持续释放的制剂适合于皮下植入。在一些方面，用于控制释放或持续释放的制剂包括贴剂。可以配制化合物用于肠内施用，例如配制为胶囊剂或片剂。
可以作为单剂量或多剂量施用。在一些实施方案中，剂量是通过标准方法确定的有效量，所述标准方法包括但不限于本文所述的那些。临床试验领域的技术人员将能够通过标准研究来优化特定化合物的剂量。另外，可以使用标准剂量-响应方案确定组合物的适当剂量，而无需过度实验。施用包括但不限于在本文包括的实施例中描述的任何剂量和给药方案，给药间隔和/或给药模式。
包含根据本公开的抗体的组合物可以通过任何合适的方式施用，所述方式包括但不限于例如口服、直肠、经鼻、局部(包括透皮、气雾剂、颊和/或舌下)，阴道、肠胃外(包括皮下，肌内和/或静脉内)，皮内、膀胱内、关节内、小动脉内、室内、颅内、腹膜内、鼻内、吸入或病灶内(例如，通过注射到肿瘤内或肿瘤周围)。
对于在水溶液中的胃肠外施用，例如，应当将溶液适当缓冲(如果必要的话)，并首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释液等渗。这些特定水溶液尤其适合用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这方面，可以使用的无菌含水介质是本领域技术人员知晓的。取决于待治疗的受试者的病况，必然出现剂量上的一些变化。在任何情况下，负责施用的人将确定受试者个体的适当剂量。此外，对于人类施用，制剂应满足FDA要求的无菌性、热原性以及一般安全性和纯度标准。这样的制剂可以是无热原的。
已知许多合适的制剂，包括封装待释放的药物的聚合物或蛋白微粒，软膏，凝胶或可外部或局部使用以施用药物的溶液，且甚至贴剂，其提供经延长时间段的控制释放。这些也可以采取植入物的形式。这样的植入物可以被植入肿瘤内。
本发明的化合物也可以冻干形式提供。这样的组合物可以包括缓冲剂，例如碳酸氢盐，用于在施用前重构，或者缓冲剂可以包括在冻干的组合物中以使用例如水来重构。冻干的组合物可以进一步包含合适的血管收缩剂，例如肾上腺素。冻干的组合物可以在注射器中提供，任选地与用于重构的缓冲剂组合包装，使得可以将重构的组合物立即施用于患者。
如本文所用，“治疗("treating"或"treatment")”可包括治疗性和/或预防性的治疗。如本文所用，“治疗疾病”并非旨在作为绝对术语。治疗可导致改善的预后，或症状的频率或严重性降低。如本文所用，“治疗有效的”浓度或量是为受试者提供一些改善或益处的量。期望的治疗效果包括预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、降低疾病进展的速度、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。同样地，如本文所用，术语“预防”并非旨在作为绝对术语。相反，预防是指延迟发作、降低症状的频率，或降低与疾病相关的症状严重性。因此，预防是指本领域技术人员将理解的广泛范围的预防性措施。在一些情况下，症状的频率和严重性降低到非病理水平。在一些情况下，接受本发明组合物的个体的症状仅为具有疾病的未治疗个体所经历的症状的频率或严重性的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或1％。
可以通过在已知的体外和体内系统(例如本文所述的那些系统)中测试化合物，凭经验确定本文每种应用的治疗有效浓度和量，然后可以据此推断人或其他动物的剂量。
应当理解，治疗的精确剂量和持续时间是所治疗疾病的函数，并且可以使用已知的测试方案或通过从体内或体外测试数据推断而凭经验确定。应当注意，浓度和剂量值还可随待缓解的病况的严重性而变化。应进一步理解，对于任何具体受试者，具体剂量方案应根据个体需要以及施用或监督组合物施用的人的专业判断，随时间进行调整，并且本文阐述的浓度范围仅仅是示例性的，并不意图限制要求保护的组合物和方法的范围或实施。
所述组合物的毒性和治疗功效可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定，例如，用于确定LD50 (对50%的群体致死的剂量)和ED50 (在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性作用和治疗作用之间的剂量比率是治疗指数，且可以表示为LD50和ED50之间的比率。表现出高治疗指数的组合物可以是优选的。由细胞培养物分析和动物研究获得的数据可用于制定用于人中的剂量范围。此类组合物的剂量可优选位于在包括ED50且几乎没有或无毒性的循环浓度的范围内。取决于采用的剂型和利用的施用途径，剂量可以在该范围内改变。精确的制剂、施用途径和剂量可以由各个医师考虑患者病况来选择。
如本文所述的组合物可以施用一次，或可以分成多个较小剂量，每隔一段时间施用。例如，组合物可以重复施用，例如至少2、3、4、5、6、7、8或更多次，或者可以通过连续输注施用。应当理解，治疗的精确剂量和持续时间是所治疗疾病的函数，并且可以使用已知的测试方案或通过从体内或体外测试数据推断而凭经验确定。应当注意，浓度和剂量值还可随待缓解的病况的严重性而变化。应进一步理解，对于任何具体受试者，具体剂量方案应根据个体需要以及施用或监督组合物施用的人的专业判断，随时间进行调整，并且本文阐述的浓度范围仅仅是示例性的，并不意图限制要求保护的组合物和方法的范围或实施。
在一些治疗性实施方案中，试剂的“有效量”是导致至少一种病理学参数降低的量。因此，例如，在本公开的一些方面，有效量是与未使用试剂治疗的个体中参数的预期降低相比，有效地实现至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的降低的量。
在本公开的方法的一些方面，方法进一步包括一种或多种另外的治疗剂的施用。可以在如本文所述的单克隆抗体的施用之前，之后和/或同时施用一种或多种另外的治疗剂。另外的治疗剂可包括例如化学疗法、放射疗法等。另外的治疗剂可单独施用或作为混合物或勾兑物(cocktail)的一部分施用。在本公开的一些方面，与施用单独的其他治疗方式相比时，抗体的施用可以允许较低剂量的其他治疗方式的有效性，提供对于施用较高剂量的其他方式观察到的毒性的缓解。
在本公开的方法的一些方面，本文所述的组合物和至少一种另外的治疗剂的施用证明了治疗协同作用。在本公开的方法的一些方面，与在施用单独的抗体或另外的治疗剂后观察到的对治疗的响应的相同度量相比，在施用如本文所述的抗体和另外的治疗剂二者后观察到的对治疗的响应的度量得到改善。
示例性实施方案
实施方案1：结合VSIG-4的单克隆抗体。
实施方案2：由以下克隆中的至少一种产生的单克隆抗体：
Ms x hVSIG4 528902.11 (ATCC登录号PTA-124187)；
Ms x hVSIG4 528903.111 (ATCC登录号PTA-124188)；
Ms x hVSIG4 528905.11 (ATCC登录号PTA-124189)；
Ms x hVSIG4 528906.11 (ATCC登录号PTA-124178)；
Ms x hVSIG4 528908.11 (ATCC登录号PTA-124179)；
Ms x hVSIG4 528910.111 (ATCC登录号PTA-124180)；
Ms x hVSIG4 528912.11 (ATCC登录号PTA-124181)；
Ms x hVSIG4 528922.111 (ATCC登录号PTA-124182)；
Ms x hVSIG4 528927.111 (ATCC登录号PTA-124183)；
Rt x hVSIG4 489509.11 (ATCC登录号PTA-124184)；
Rt x hVSIG4 489517.111 (ATCC登录号PTA-124185)；和
Rt x hVSIG4 489518.11 (ATCC登录号PTA-124186)。
实施方案3：单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包括以下中的至少一种：
由以下克隆中的至少一种产生的单克隆抗体的重链可变区：
Ms x hVSIG4 528902.11 (ATCC登录号PTA-124187)；
Ms x hVSIG4 528903.111 (ATCC登录号PTA-124188)；
Ms x hVSIG4 528905.11 (ATCC登录号PTA-124189)；
Ms x hVSIG4 528906.11 (ATCC登录号PTA-124178)；
Ms x hVSIG4 528908.11 (ATCC登录号PTA-124179)；
Ms x hVSIG4 528910.111 (ATCC登录号PTA-124180)；
Ms x hVSIG4 528912.11 (ATCC登录号PTA-124181)；
Ms x hVSIG4 528922.111 (ATCC登录号PTA-124182)；
Ms x hVSIG4 528927.111 (ATCC登录号PTA-124183)；
Rt x hVSIG4 489509.11 (ATCC登录号PTA-124184)；
Rt x hVSIG4 489517.111 (ATCC登录号PTA-124185)；和
Rt x hVSIG4 489518.11 (ATCC登录号PTA-124186)；
和
由以下克隆中的至少一种产生的单克隆抗体的轻链可变区：
Ms x hVSIG4 528902.11 (ATCC登录号PTA-124187)；
Ms x hVSIG4 528903.111 (ATCC登录号PTA-124188)；
Ms x hVSIG4 528905.11 (ATCC登录号PTA-124189)；
Ms x hVSIG4 528906.11 (ATCC登录号PTA-124178)；
Ms x hVSIG4 528908.11 (ATCC登录号PTA-124179)；
Ms x hVSIG4 528910.111 (ATCC登录号PTA-124180)；
Ms x hVSIG4 528912.11 (ATCC登录号PTA-124181)；
Ms x hVSIG4 528922.111 (ATCC登录号PTA-124182)；
Ms x hVSIG4 528927.111 (ATCC登录号PTA-124183)；
Rt x hVSIG4 489509.11 (ATCC登录号PTA-124184)；
Rt x hVSIG4 489517.111 (ATCC登录号PTA-124185)；和
Rt x hVSIG4 489518.11 (ATCC登录号PTA-124186)。
实施方案4：单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包括以下中的至少一种：
重链可变区，其包含由以下克隆中的至少一种产生的单克隆抗体的重链的互补决定区(CDR)：
Ms x hVSIG4 528902.11 (ATCC登录号PTA-124187)；
Ms x hVSIG4 528903.111 (ATCC登录号PTA-124188)；
Ms x hVSIG4 528905.11 (ATCC登录号PTA-124189)；
Ms x hVSIG4 528906.11 (ATCC登录号PTA-124178)；
Ms x hVSIG4 528908.11 (ATCC登录号PTA-124179)；
Ms x hVSIG4 528910.111 (ATCC登录号PTA-124180)；
Ms x hVSIG4 528912.11 (ATCC登录号PTA-124181)；
Ms x hVSIG4 528922.111 (ATCC登录号PTA-124182)；
Ms x hVSIG4 528927.111 (ATCC登录号PTA-124183)；
Rt x hVSIG4 489509.11 (ATCC登录号PTA-124184)；
Rt x hVSIG4 489517.111 (ATCC登录号PTA-124185)；和
Rt x hVSIG4 489518.11 (ATCC登录号PTA-124186)；
和
轻链可变区，其包含由以下克隆中的至少一种产生的单克隆抗体的轻链的互补决定区(CDR)：
Ms x hVSIG4 528902.11 (ATCC登录号PTA-124187)；
Ms x hVSIG4 528903.111 (ATCC登录号PTA-124188)；
Ms x hVSIG4 528905.11 (ATCC登录号PTA-124189)；
Ms x hVSIG4 528906.11 (ATCC登录号PTA-124178)；
Ms x hVSIG4 528908.11 (ATCC登录号PTA-124179)；
Ms x hVSIG4 528910.111 (ATCC登录号PTA-124180)；
Ms x hVSIG4 528912.11 (ATCC登录号PTA-124181)；
Ms x hVSIG4 528922.111 (ATCC登录号PTA-124182)；
Ms x hVSIG4 528927.111 (ATCC登录号PTA-124183)；
Rt x hVSIG4 489509.11 (ATCC登录号PTA-124184)；
Rt x hVSIG4 489517.111 (ATCC登录号PTA-124185)；和
Rt x hVSIG4 489518.11 (ATCC登录号PTA-124186)。
实施方案5：实施方案4的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包含由以下克隆之一产生的单克隆抗体的重链的每个CDR：
Ms x hVSIG4 528902.11 (ATCC登录号PTA-124187)；
Ms x hVSIG4 528903.111 (ATCC登录号PTA-124188)；
Ms x hVSIG4 528905.11 (ATCC登录号PTA-124189)；
Ms x hVSIG4 528906.11 (ATCC登录号PTA-124178)；
Ms x hVSIG4 528908.11 (ATCC登录号PTA-124179)；
Ms x hVSIG4 528910.111 (ATCC登录号PTA-124180)；
Ms x hVSIG4 528912.11 (ATCC登录号PTA-124181)；
Ms x hVSIG4 528922.111 (ATCC登录号PTA-124182)；
Ms x hVSIG4 528927.111 (ATCC登录号PTA-124183)；
Rt x hVSIG4 489509.11 (ATCC登录号PTA-124184)；
Rt x hVSIG4 489517.111 (ATCC登录号PTA-124185)；和
Rt x hVSIG4 489518.11 (ATCC登录号PTA-124186)。
实施方案6：实施方案4或6中任一项的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包含由以下克隆之一产生的单克隆抗体的轻链的每个CDR：
Ms x hVSIG4 528902.11 (ATCC登录号PTA-124187)；
Ms x hVSIG4 528903.111 (ATCC登录号PTA-124188)；
Ms x hVSIG4 528905.11 (ATCC登录号PTA-124189)；
Ms x hVSIG4 528906.11 (ATCC登录号PTA-124178)；
Ms x hVSIG4 528908.11 (ATCC登录号PTA-124179)；
Ms x hVSIG4 528910.111 (ATCC登录号PTA-124180)；
Ms x hVSIG4 528912.11 (ATCC登录号PTA-124181)；
Ms x hVSIG4 528922.111 (ATCC登录号PTA-124182)；
Ms x hVSIG4 528927.111 (ATCC登录号PTA-124183)；
Rt x hVSIG4 489509.11 (ATCC登录号PTA-124184)；
Rt x hVSIG4 489517.111 (ATCC登录号PTA-124185)；和
Rt x hVSIG4 489518.11 (ATCC登录号PTA-124186)。
实施方案7：单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包含氨基酸序列，所述氨基酸序列：
与由以下克隆中的至少一种产生的单克隆抗体的重链可变区的至少一个互补决定区(CDR)的氨基酸序列具有至少80％的同一性：
Ms x hVSIG4 528902.11 (ATCC登录号PTA-124187)；
Ms x hVSIG4 528903.111 (ATCC登录号PTA-124188)；
Ms x hVSIG4 528905.11 (ATCC登录号PTA-124189)；
Ms x hVSIG4 528906.11 (ATCC登录号PTA-124178)；
Ms x hVSIG4 528908.11 (ATCC登录号PTA-124179)；
Ms x hVSIG4 528910.111 (ATCC登录号PTA-124180)；
Ms x hVSIG4 528912.11 (ATCC登录号PTA-124181)；
Ms x hVSIG4 528922.111 (ATCC登录号PTA-124182)；
Ms x hVSIG4 528927.111 (ATCC登录号PTA-124183)；
Rt x hVSIG4 489509.11 (ATCC登录号PTA-124184)；
Rt x hVSIG4 489517.111 (ATCC登录号PTA-124185)；和
Rt x hVSIG4 489518.11 (ATCC登录号PTA-124186)；
和/或
与由以下克隆中的至少一种产生的单克隆抗体的轻链可变区的至少一个互补决定区(CDR)的氨基酸序列具有至少80％的同一性：
Ms x hVSIG4 528902.11 (ATCC登录号PTA-124187)；
Ms x hVSIG4 528903.111 (ATCC登录号PTA-124188)；
Ms x hVSIG4 528905.11 (ATCC登录号PTA-124189)；
Ms x hVSIG4 528906.11 (ATCC登录号PTA-124178)；
Ms x hVSIG4 528908.11 (ATCC登录号PTA-124179)；
Ms x hVSIG4 528910.111 (ATCC登录号PTA-124180)；
Ms x hVSIG4 528912.11 (ATCC登录号PTA-124181)；
Ms x hVSIG4 528922.111 (ATCC登录号PTA-124182)；
Ms x hVSIG4 528927.111 (ATCC登录号PTA-124183)；
Rt x hVSIG4 489509.11 (ATCC登录号PTA-124184)；
Rt x hVSIG4 489517.111 (ATCC登录号PTA-124185)；和
Rt x hVSIG4 489518.11 (ATCC登录号PTA-124186)。
实施方案8：实施方案7的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包含氨基酸序列，所述氨基酸序列：
与由以下克隆中的至少一种产生的单克隆抗体的重链可变区的每个互补决定区(CDR)的氨基酸序列具有至少80％的同一性：
Ms x hVSIG4 528902.11 (ATCC登录号PTA-124187)；
Ms x hVSIG4 528903.111 (ATCC登录号PTA-124188)；
Ms x hVSIG4 528905.11 (ATCC登录号PTA-124189)；
Ms x hVSIG4 528906.11 (ATCC登录号PTA-124178)；
Ms x hVSIG4 528908.11 (ATCC登录号PTA-124179)；
Ms x hVSIG4 528910.111 (ATCC登录号PTA-124180)；
Ms x hVSIG4 528912.11 (ATCC登录号PTA-124181)；
Ms x hVSIG4 528922.111 (ATCC登录号PTA-124182)；
Ms x hVSIG4 528927.111 (ATCC登录号PTA-124183)；
Rt x hVSIG4 489509.11 (ATCC登录号PTA-124184)；
Rt x hVSIG4 489517.111 (ATCC登录号PTA-124185)；和
Rt x hVSIG4 489518.11 (ATCC登录号PTA-124186)；
和
与由以下克隆中的至少一种产生的单克隆抗体的轻链可变区的每个互补决定区(CDR)的氨基酸序列具有至少80％的同一性：
Ms x hVSIG4 528902.11 (ATCC登录号PTA-124187)；
Ms x hVSIG4 528903.111 (ATCC登录号PTA-124188)；
Ms x hVSIG4 528905.11 (ATCC登录号PTA-124189)；
Ms x hVSIG4 528906.11 (ATCC登录号PTA-124178)；
Ms x hVSIG4 528908.11 (ATCC登录号PTA-124179)；
Ms x hVSIG4 528910.111 (ATCC登录号PTA-124180)；
Ms x hVSIG4 528912.11 (ATCC登录号PTA-124181)；
Ms x hVSIG4 528922.111 (ATCC登录号PTA-124182)；
Ms x hVSIG4 528927.111 (ATCC登录号PTA-124183)；
Rt x hVSIG4 489509.11 (ATCC登录号PTA-124184)；
Rt x hVSIG4 489517.111 (ATCC登录号PTA-124185)；和
Rt x hVSIG4 489518.11 (ATCC登录号PTA-124186)。
实施方案9：实施方案2至8中任一项的单克隆抗体，其中所述抗体结合VSIG-4。
实施方案10：实施方案1至9中任一项的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体直接或间接地偶联至可检测标记物。
实施方案11：实施方案1至10中任一项的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包括IgG抗体。
实施方案12：实施方案1至11中任一项的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体消除VSIG-4与VSIG-4配体的结合。
实施方案13：实施方案1至12中任一项的单克隆抗体，其中所述VSIG-4配体包括SIGLEC-7。
实施方案14：实施方案12或13的单克隆抗体，其中VSIG-4和VSIG-4配体中的至少一种在细胞表面上。
实施方案15：实施方案12至14中任一项的单克隆抗体，其中VSIG-4在M2c巨噬细胞的表面上。
实施方案16：实施方案12至15中任一项的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体消除细胞-细胞相互作用。
实施方案17：实施方案1至16中任一项的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体结合VSIG-4的细胞外结构域。
实施方案18：实施方案1至17中任一项的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体结合VSIG-4多肽。
实施方案19：实施方案1至18中任一项的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体结合糖基化和未糖基化的VSIG-4。
实施方案20：实施方案1至19中任一项的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包含抗原结合片段，所述抗原结合片段包括Fab片段，Fab'片段，F(ab)2片段和Fv片段中的至少一种。
实施方案21：组合物，其包含实施方案1至20中任一项的单克隆抗体。
实施方案22：试剂盒，其包含实施方案1至20中任一项的单克隆抗体。
实施方案23：实施方案1至20中任一项的单克隆抗体，其用于治疗哺乳动物中的癌症的方法中。
实施方案24：实施方案1至20中任一项的单克隆抗体，其用于治疗自身免疫疾病的方法中。
实施方案25：一种治疗哺乳动物中的癌症的方法，其包括将包含哺乳动物癌细胞的哺乳动物暴露于实施方案1至20中任一项的单克隆抗体。
实施方案26：实施方案25的方法，其中VSIG-4表达在包含哺乳动物癌细胞的患者样品中扩增。
实施方案27：实施方案25的方法，其中VSIG-4表达在包含哺乳动物癌细胞的患者样品的巨噬细胞中扩增。
实施方案28：实施方案25至27中任一项的方法，其中所述哺乳动物癌细胞包括肺癌细胞或胶质瘤。
实施方案29：实施方案25至28中任一项的方法，其中所述哺乳动物癌细胞也暴露于化学疗法或放射疗法。
实施方案30：一种检测哺乳动物中的癌症的方法，其包括将哺乳动物癌细胞暴露于实施方案1至20中任一项的单克隆抗体。
实施方案31：一种治疗哺乳动物中的自身免疫疾病的方法，其包括将所述哺乳动物的细胞暴露于实施方案1至20中任一项的单克隆抗体。
实施方案32：实施方案31的方法，其中VSIG-4表达在包含哺乳动物细胞的患者样品中扩增。
实施方案33：实施方案32的方法，其中VSIG-4表达在包含哺乳动物细胞的患者样品的巨噬细胞中扩增。
实施方案34：实施方案31至33中任一项的方法，其中所述自身免疫疾病包括自身免疫1型糖尿病、类风湿性关节炎、牛皮癣或狼疮。
实施方案35：实施方案1至20中任一项的单克隆抗体，其用于治疗自身免疫疾病的方法中。
示例性杂交瘤细胞系实施方案
实施方案1：杂交瘤细胞系Ms x hVSIG4 528902.11，其保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，ATCC登录号为PTA-124187。
实施方案2：杂交瘤细胞系Ms x hVSIG4 528903.111，其保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，ATCC登录号为PTA-124188。
实施方案3：杂交瘤细胞系Ms x hVSIG4 528905.11，其保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，ATCC登录号为PTA-124189。
实施方案4：杂交瘤细胞系Ms x hVSIG4 528906.11，其保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，ATCC登录号为PTA-124178。
实施方案5：杂交瘤细胞系Ms x hVSIG4 528908.11，其保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，ATCC登录号为PTA-124179。
实施方案6：杂交瘤细胞系Ms x hVSIG4 528910.111，其保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，ATCC登录号为PTA-124180。
实施方案7：杂交瘤细胞系Ms x hVSIG4 528912.11，其保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，ATCC登录号为PTA-124181。
实施方案8：杂交瘤细胞系Ms x hVSIG4 528922.111，其保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，ATCC登录号为PTA-124182。
实施方案9：杂交瘤细胞系Ms x hVSIG4 528927.111，其保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，ATCC登录号为PTA-124183。
实施方案10：杂交瘤细胞系Rt x hVSIG4 489509.11，其保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，ATCC登录号为PTA-124184。
实施方案11：杂交瘤细胞系Rt x hVSIG4 489517.111，其保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，ATCC登录号为PTA-124185。
实施方案12：杂交瘤细胞系Rt x hVSIG4 489518.11，其保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，ATCC登录号为PTA-124186。
杂交瘤细胞系实施方案产生的示例性单克隆抗体
实施方案1：由以ATCC登录号PTA-124187保藏的杂交瘤细胞系Ms x hVSIG4 528902.11产生的单克隆抗体。
实施方案2：由以ATCC登录号PTA-124188保藏的杂交瘤细胞系Ms x hVSIG4528903.111产生的单克隆抗体。
实施方案3：由以ATCC登录号PTA-124189保藏的杂交瘤细胞系Ms x hVSIG4528905.11产生的单克隆抗体。
实施方案4：由以ATCC登录号PTA-124178保藏的杂交瘤细胞系Ms x hVSIG4528906.11产生的单克隆抗体。
实施方案5：由以ATCC登录号PTA-124179保藏的杂交瘤细胞系Ms x hVSIG4528908.11产生的单克隆抗体。
实施方案6：由以ATCC登录号PTA-124180保藏的杂交瘤细胞系Ms x hVSIG4528910.111产生的单克隆抗体。
实施方案7：由以ATCC登录号PTA-124181保藏的杂交瘤细胞系Ms x hVSIG4528912.11产生的单克隆抗体。
实施方案8：由以ATCC登录号PTA-124182保藏的杂交瘤细胞系Ms x hVSIG4528922.111产生的单克隆抗体。
实施方案9：由以ATCC登录号PTA-124183保藏的杂交瘤细胞系Ms x hVSIG4528927.111产生的单克隆抗体。
实施方案10：由以ATCC登录号PTA-124184保藏的杂交瘤细胞系Rt x hVSIG4489509.11产生的单克隆抗体。
实施方案11：由以ATCC登录号PTA-124185保藏的杂交瘤细胞系Rt x hVSIG4489517.111产生的单克隆抗体。
实施方案12：由以ATCC登录号PTA-124186保藏的杂交瘤细胞系Rt x hVSIG4489518.11产生的单克隆抗体。
实施方案13：一种单克隆抗体，其包含由以ATCC登录号PTA-124187保藏的杂交瘤细胞系Ms x hVSIG4 528902.11产生的单克隆抗体的互补决定区(CDR)。
实施方案14：一种单克隆抗体，其包含由以ATCC登录号PTA-124188保藏的杂交瘤细胞系Ms x hVSIG4 528903.111产生的单克隆抗体的互补决定区(CDR)。
实施方案15：一种单克隆抗体，其包含由以ATCC登录号PTA-124189保藏的杂交瘤细胞系Ms x hVSIG4 528905.11产生的单克隆抗体的互补决定区(CDR)。
实施方案16：一种单克隆抗体，其包含由以ATCC登录号PTA-124178保藏的杂交瘤细胞系Ms x hVSIG4 528906.11产生的单克隆抗体的互补决定区(CDR)。
实施方案17：一种单克隆抗体，其包含由以ATCC登录号PTA-124179保藏的杂交瘤细胞系Ms x hVSIG4 528908.11产生的单克隆抗体的互补决定区(CDR)。
实施方案18：一种单克隆抗体，其包含由以ATCC登录号PTA-124180保藏的杂交瘤细胞系Ms x hVSIG4 528910.111产生的单克隆抗体的互补决定区(CDR)。
实施方案19：一种单克隆抗体，其包含由以ATCC登录号PTA-124181保藏的杂交瘤细胞系Ms x hVSIG4 528912.11产生的单克隆抗体的互补决定区(CDR)。
实施方案20：一种单克隆抗体，其包含由以ATCC登录号PTA-124182保藏的杂交瘤细胞系Ms x hVSIG4 528922.111产生的单克隆抗体的互补决定区(CDR)。
实施方案21：一种单克隆抗体，其包含由以ATCC登录号PTA-124183保藏的杂交瘤细胞系Ms x hVSIG4 528927.111产生的单克隆抗体的互补决定区(CDR)。
实施方案22：一种单克隆抗体，其包含由以ATCC登录号PTA-124184保藏的杂交瘤细胞系Rt x hVSIG4 489509.11产生的单克隆抗体的互补决定区(CDR)。
实施方案23：一种单克隆抗体，其包含由以ATCC登录号PTA-124185保藏的杂交瘤细胞系Rt x hVSIG4 489517.111产生的单克隆抗体的互补决定区(CDR)。
实施方案24：一种单克隆抗体，其包含由以ATCC登录号PTA-124186保藏的杂交瘤细胞系Rt x hVSIG4 489518.11产生的单克隆抗体的互补决定区(CDR)。
通过以下实施例说明本发明。应理解根据如本文阐述的本发明范围和精神，将对具体实施例、材料、量和方法进行广义解释。
实施例
除非另有说明，否则以下实施例中的所有孵育均在室温下进行，并且所用的所有试剂、起始原料和溶剂均购自商业供应商(例如，Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)，并且在没有进一步纯化的情况下使用，除非另有说明。
实施例1：VSIG4-Siglec7相互作用的表征
在HEK293、NSO或CHO细胞中重组表达人Siglec7 (hSiglec7)(Uniprot编号：Q9Y286)和人VSIG4 (hVSIG4)(Uniprot编号：Q9Y279；基因ID 11326)以提供重组人Siglec7(rhSiglec7)和重组人VSIG4 (rhVSIG4)。如所示，用各种N或C末端标签(如His、Fc或GFP)标记蛋白，以能够在各种测定中进行纯化和分析。
rhVSIG4与生物素化rhSiglec7的相互作用。将可溶性rhVSIG4包被在标准ELISA板上，并在去除过量蛋白并用BSA封闭板上的其他结合位点后，与可溶性rhSIGLEC 7一起孵育。使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)检测生物素化的rhSIGLEC-7。背景校正后，在标准酶标仪中于452 nm处检测到2.3的吸光度。
HEK/eGFP转染子和Fc蛋白流式筛选。收获表达人VSIG-4或人Siglec-7的eGFP转染的HEK293细胞，用RDFII染色缓冲液(0.5％(w/v)BSA，10 mM HEPES，100 mM氯化钠，0.01％叠氮化钠，pH 7.2)洗涤、计数、以100,000个细胞/样品等分，并与不同量的含有人IgG Fc区的重组人Siglec-7或VSIG-4蛋白(rhSiglec-7/Fc或rhVSIG-4/Fc)一起孵育。测试的蛋白浓度在500 ng/mL至6μg/mL之间。将转染子和Fc蛋白在室温下孵育30分钟，然后添加抗人IgGFc-APC检测抗体(FAB110A, R＆D Systems, Minneapolis, MN)，进行另外20分钟。然后，将细胞用RDFII染色缓冲液洗涤，并在Novocyte流式细胞仪(ACEA Biosciences, Inc., SanDiego, CA)或LSRII FORTESSA流式细胞仪(BD Biosciences, San Jose, CA)上进行分析。
实施例2：抗VSIG4抗体和VSIG4-Siglec7阻断抗体的鉴定
使用针对人或小鼠VSIG4蛋白(Uniprot编号分别为：Q9Y279或F6TUL9)制成的单克隆抗体组，通过直接ELISA和流式细胞术鉴定结合VSIG-4的抗体。表1列出了产生VSIG-4结合抗体的克隆。
还确定了这些抗VSIG-4抗体消除VSIG-4与Siglec-7蛋白结合的能力，如下文进一步描述的。
VSIG4-Siglec7阻断测定。收获人VSIG-4 HEK/eGFP转染子，用RDFII染色缓冲液洗涤、计数、以100,000个细胞/样品的浓度等分，并与2.5μg/mL抗VSIG-4抗体在室温下孵育30分钟。用RDFII染色缓冲液洗涤细胞，并将4μg/mL的hSiglec-7/Fc蛋白添加至每个管，进行30分钟。这次孵育后，添加抗Fc APC检测抗体(FAB110A)，进行另外20分钟。然后，用RDFII染色缓冲液洗涤细胞，并在Aceabio Novocyte流式细胞仪或LSRII Fortessa流式细胞仪(BDBiosciences, San Jose, CA)上进行分析。示例性结果显示在图5中；其他结果显示在表1中。
表1：抗VSIG-4单克隆抗体及其特征
| 宿主物种 | 抗体类型 | 应用 | Kd | 阻断 | ||
| 克隆 | Ms x hVSIG4 528902.11 | 小鼠 | IgG3 | WB (阴性), FC | ND | N |
| 克隆 | Ms x hVSIG4 528903.111 | 小鼠 | IgG2A | WB, FC | 7.7 nM | Y |
| 克隆 | Ms x hVSIG4 528905.11 | 小鼠 | IgG2B | WB, FC | ND | N |
| 克隆 | Ms x hVSIG4 528906.11 | 小鼠 | IgG2A | FC | 4.6 nM | N |
| 克隆 | Ms x hVSIG4 528908.11 | 小鼠 | IgG2A | WB, FC | 6.3 nM | Y |
| 克隆 | Ms x hVSIG4 528910.111 | 小鼠 | IgG3 | WB, FC | ND | N |
| 克隆 | Ms x hVSIG4 528912.11 | 小鼠 | IgG2A | FC | 60.6 nM | Y |
| 克隆 | Ms x hVSIG4 528922.111 | 小鼠 | IgG2A | WB (阴性), FC | ND | N |
| 克隆 | Ms x hVSIG4 528927.111 | 小鼠 | IgG2B | WB, FC | ND | N |
| 克隆 | Rt x hVSIG4 489509.11 | 大鼠 | IgG2A | FC | 1 nM | Y |
| 克隆 | Rt x hVSIG4 489517.111 | 大鼠 | IgG2A | FC | 2.1 nM | Y |
| 克隆 | Rt x hVSIG4 489518.11 | 大鼠 | IgG2A | FC | 0.3 nM | Y |
ND (未确定，在SPR测定中未观察到结合)；FC (流式细胞术)，WB (Western印迹)。
实施例3：VSIG4-Siglec7阻断抗体的表征
极化M2c细胞的产生。根据标准方案，使用SEPMATE/Ficoll梯度分离方案分离PBMC。然后，使用针对CD14的阳性选择试剂盒(目录号MAGH105, R＆D Systems, Minneapolis, MN)纯化CD14+细胞。将一百万个CD14阳性细胞/mL (总体积为4 mL)在补充50 ng/mL hM-CSF(目录号216-MC R＆D Systems, Minneapolis, MN)的完全培养基(RPMI培养基，补充10％胎牛血清(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)，1.0 mM丙酮酸钠(Invitrogen,Carlsbad, CA)，50 mM 2-巯基乙醇(Invitrogen)，1x Glutamax (Life Technologies,Grand Island, NY)，1x青霉素/链霉素(Life Technologies, Grand Island, NY)和1x非必需氨基酸(Life Technologies, Grand Island, NY))中放置4天。在第5天，将细胞转移至新鲜培养基中，以允许细胞极化至M2c巨噬细胞，进行另外3天，所述培养基还含有30 ng/mL地塞米松(目录号1126, Tocris Biosciences, Minneapolis, MN)或20 ng/mL rhIL-10(目录号217-IL, R＆D Systems, Minneapolis, MN)。
极化M2c细胞中的VSIG-4表达的流式细胞术检测。在第7天，收获地塞米松极化的M2c细胞，用1x PBS洗涤两次，并在室温下以每100μL细胞1μL Zombie Violet (BioLegend,San Diego, CA)孵育30分钟，以允许排除死亡细胞。然后，将细胞用RDFII染色缓冲液洗涤2次，用人IgG和山羊抗人IgG (目录号1597, R＆D Systems, Minneapolis, MN)，在4℃封闭10分钟。然后，在4℃下用小鼠抗人VSIG4 Alexa Fluor 647，抗CD14 FITC和抗Mer PE (目录号FAB982F, FAB8912P, R＆D Systems, Minneapolis, MN)，对细胞进行表面染色30分钟。用RDFII染色缓冲液最后洗涤细胞一次，并在LSRII Fortessa流式细胞仪(BDBiosciences, San Jose, CA)上进行分析。结果显示于图6中。
用20 ng/mL IL-10极化的原代M2c细胞中的Siglec-7/VSIG-4相互作用的检测。将极化的M2c细胞与不同量的hSiglec-7 Fc蛋白(1μg/mL至10μg/mL)在室温下孵育30分钟。在这次孵育后，添加抗Fc PE检测抗体(FAB110P, R＆D Systems, Minneapolis, MN)，进行另外20分钟。孵育后，将细胞用RDFII染色缓冲液洗涤，并与抗VSIG4 Alexa Fluor 647和抗CD14 FITC抗体共染色30分钟。与这些共染色物一起孵育后，再次用RDFII染色缓冲液洗涤细胞，并在LSRII Fortessa流式细胞仪(BD Biosciences, San Jose, CA)上进行分析。结果显示于图7中。
抗体配对和用于抗原识别的共抑制研究。使用生物素化抗体检测方法并且以链霉亲和素-HRP作为检测方式，通过ELISA鉴定抗体对。结果显示在表2中。基于鉴定针对VSIG4的捕获/检测抗体对的能力，这些克隆识别蛋白中的不同表位。
表2：针对VSIG-4的抗体对
| <u>捕获抗体克隆</u> | <u>检测抗体克隆</u> |
| Rt x hVSIG4 489509.11 | Ms x hVSIG4 528903.111 |
| Ms x hVSIG4 528906.11 | |
| Ms x hVSIG4 528908.11 | |
| Ms x hVSIG4 528912.11 | |
| Rt x hVSIG4 489517.111 | |
| Rt x hVSIG4 489518.11 | |
| Rt x hVSIG4 489517.111 | Rt x hVSIG4 489509.11 |
| Rt x hVSIG4 489518.11 | Rt x hVSIG4 489509.11 |
| Ms x hVSIG4 528903.111 | Rt x hVSIG4 489509.11 |
| Ms x hVSIG4 528906.11 | Rt x hVSIG4 489509.11 |
| Ms x hVSIG4 528908.11 | Rt x hVSIG4 489509.11 |
实施例4：VSIG4的糖基化和结合糖基化VSIG4的抗VSIG4抗体的表征
为了确定Siglec7是否通过翻译后修饰的聚糖部分与糖基化的VSIG4结合，在缺乏糖基转移酶机制并产生没有任何聚糖修饰的重组蛋白的大肠杆菌中表达rhVSIG4。尽管保留了其与补体成分iC3b结合的已知功能，但在大肠杆菌中产生的VSIG4失去了与Siglec7结合的能力，这表明Siglec7与VSIG4的糖基化形式结合。
然而，使用标准的去糖基化酶试剂盒(其含有切割α(2,3)和α(2,6)-连接的N-乙酰神经氨酸(NANA或唾液酸)的典型唾液酸酶)，对VSIG4的酶促去糖基化显示VSIG4和Siglec7之间的结合得到保留。通过掺入除了α(2,3)和α(2,6)连接的NANA外，还可切割相对罕见的α(2,8)-连接的NANA的特异唾液酸酶，观察到rhVSIG4的分子量的〜10 kD位移，从〜42kD到预测的〜32kD分子量。此外，使用扩展的去糖基化酶试剂盒的处理消除了VSIG4和Siglec7之间的结合相互作用。
这些结果表明，VSIG4很可能通过α(2,8)-连接的N-乙酰神经氨酸(一种相对罕见的聚糖键)而被多唾液酸链重度修饰。含α(2,8)-连接的多唾液酸的最著名蛋白是CD56/NCAM (Schnaar等人，Physiological Reviews 2014, 94(2): 461-518)。使用Biacore确认了Siglec7和CD56/NCAM之间的相互作用，并且Siglec7-VSIG4之间的相互作用亲和力大致等同于Siglec7-CD56 NCAM之间的相互作用亲和力。
为了确认使用哺乳动物衍生且完全糖基化的rhVSIG4而衍生的针对VSIG4的抗体与VSIG4多肽结合，而不与VSIG4上的聚糖修饰结合，测试了针对完全糖基化的rhVSIG4、去糖基化的VSIG4、大肠杆菌衍生的VSIG4和CD56/NCAM的抗体结合。观察到阻断抗体与所有VSIG4种类的强结合，无论糖基化状态如何，而不结合CD56/NCAM。
综上，这些结果表明，VSIG4被罕见的聚糖键(α(2,8)-连接的聚唾液酸)重度修饰，并且这种修饰介导了VSIG4和Siglec7之间的相互作用。此外，这些结果表明阻断抗体特异性结合VSIG4多肽而不结合VSIG4的聚糖外层。
使用酶混合物对NS0细胞中表达的纯化的重组人VSIG4胞外域(rhVSIG4)进行去糖基化，所述酶混合物含有重组C.p神经氨酸酶(R＆D Systems目录号5080-NM)、重组F.m.的PNGase F (R＆D Systems目录号9109-GH)、重组E.f. O-糖苷酶(R＆D Systems目录号8886-GH)和重组S.p B4半乳糖苷酶(R＆D Systems目录号5549-GH)，并补充重组M.v.神经氨酸酶(R＆D Systems目录号5084-NM)。通过SDS-PAGE分离完全糖基化和去糖基化的纯化的rhVSIG4，并通过银染可视化。结果显示于图9A中。在没有翻译后修饰的情况下，rhVSIG4胞外域的预测分子量为32 kD，且观察到的完全糖基化的rhVSIG4 ECD的分子量为〜41 kD。因此，据信衍生自NS0哺乳动物细胞系的rhVSIG4被高度糖基化，且去糖基化酶混合物去除了几乎所有糖分子(其中M.v.神经氨酸酶切割2-8连接的唾液酸)。
将重组人Siglec7-Fc (rhSiglec7-Fc)以〜700 RU的捕获密度捕获在经蛋白A/G/L修饰的Biacore CM5芯片上，并测试与在0.5 nM和500 nM浓度范围的完全糖基化的rhVSIG4、去糖基化的VSIG4和CD56/NCAM的结合。如图9B至图9D中所示，Siglec7与rhVSIG4相互作用，但不与去糖基化的VSIG4相互作用。另外，Siglec7不与在大肠杆菌中表达的VSIG4相互作用。CD56/NCAM重度糖基化，具有与VSIG4类似的糖特征，并且Siglec7和CD56/NCAM之间的相互作用进一步表明，Siglec7和VSIG4之间的相互作用是由独特的糖基化特征介导的。
使用Biacore测试了无论糖基化状态如何都与VSIG4多肽结合的抗VSIG-4抗体。将阻断抗体(Rt x hVSIG4 489517.111，Ms x hVSIG4 528906.11，)以〜350 RU捕获在蛋白A/G/L芯片上，并测试了与rhVSIG4、哺乳动物NS0细胞衍生的rhVSIG4、哺乳动物衍生的且完全去糖基化的VSIG4，大肠杆菌衍生的且没有糖基化，以及高度糖基化的蛋白CD56/NCAM的结合。所有分析物蛋白、rhVSIG4和CD56/NCAM在25 pM至250 nM的浓度范围进行测试。结合VSIG4而无论VSIG4的糖基化状态如何，且不结合具有与VSIG4类似的糖特征的重度糖基化分子CD56/NCAM，证明了抗体对VSIG4氨基酸序列的特异性，并表明所述抗体不是抗糖基化特异性的。结果显示于图10至图13中。
实施例5：VSIG4-Siglec7相互作用和VSIG4-Siglec7阻断抗体的进一步表征
用重组人VSIG4-eGFP或重组人VSIG3-eGFP转染HEK293细胞。然后，将细胞与指定剂量的无蛋白(阴性对照)或重组人Siglec-7-Fc孵育。然后，将细胞与抗-Fc别藻蓝蛋白(APC)孵育。如图14中所示，重组人Siglec-7以剂量依赖性方式特异性结合由融合到eGFP的重组人VSIG4转染的HEK293细胞，但是重组人Siglec-7不结合由重组人VSIG3-eGFP转染的HEK293细胞类型。
如实施例3所述，用地塞米松极化贴壁M2c巨噬细胞。将M2c巨噬细胞与10 µg/mL，40 µg/mL或200 µg/mL抗人VSIG-4抗体一起孵育，以测试所述抗体阻断与rhSiglec-7相互作用的能力。rhSiglec-7在100 µg/mL，25 µg/mL或5 µg/mL进行测试。Ms x hVSIG4528906.11以剂量依赖的方式阻断M2c巨噬细胞上天然表达的VSIG-4与重组人Siglec-7/Fc的相互作用，如图15至图18中所示。
实施例6：抗VSIG-4抗体的直接ELISA测试
用4倍连续稀释，范围从400 ng/ml至1.56 ng/ml的重组人VSIG4蛋白的系列滴定物包被平板。添加1 mg/ml的抗VSIG-4抗体并孵育1小时，然后添加以1:10,000稀释的山羊抗小鼠或山羊抗大鼠HRP缀合的二级抗体(以匹配初级克隆)。通过添加TMB并在10分钟后添加停止溶液，来检测HRP活性。通过540nm处的吸光度评估结果。代表性数据显示在图19中，并汇总在表3中。
表3：代表性的ELISA结果
| <u>克隆编号</u> | <u>来自NSO的VSIG4</u> | <u>来自大肠杆菌的VSIG</u> |
| Ms x hVSIG4 528902.11 | 阴性 | 弱 |
| Ms x hVSIG4 528903.111 | 阳性 | 阳性 |
| Ms x hVSIG4 528905.11 | 阳性 | 阴性 |
| Ms x hVSIG4 528906.11 | 阳性 | 阳性 |
| Ms x hVSIG4 528908.11 | 阳性 | 阳性 |
| Ms x hVSIG4 528910.111 | 阳性 | 阴性 |
| Ms x hVSIG4 528912.11 | 阳性 | 阳性 |
| Ms x hVSIG4 528922.111 | 阴性 | 阳性 |
| Ms x hVSIG4 528927.111 | 阳性 | 阳性 |
| Rt x hVSIG4 489509.11 | 阳性 | 阳性 |
| Rt x hVSIG4 489517.111 | 阳性 | 阳性 |
| Rt x hVSIG4 489518.11 | 阳性 | 阳性 |
如表3中所示，大多数测试的抗体检测到NSO中表达的糖基化人VSIG4以及大肠杆菌中表达的未糖基化重组人VSIG4蛋白二者，表明抗体检测所述蛋白的氨基酸组分，而不检测二级修饰。
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Claims (20)
1.由以下克隆中的至少一种产生的单克隆抗体：
Ms x hVSIG4 528902.11 (ATCC登录号PTA-124187)；
Ms x hVSIG4 528903.111 (ATCC登录号PTA-124188)；
Ms x hVSIG4 528905.11 (ATCC登录号PTA-124189)；
Ms x hVSIG4 528906.11 (ATCC登录号PTA-124178)；
Ms x hVSIG4 528908.11 (ATCC登录号PTA-124179)；
Ms x hVSIG4 528910.111 (ATCC登录号PTA-124180)；
Ms x hVSIG4 528912.11 (ATCC登录号PTA-124181)；
Ms x hVSIG4 528922.111 (ATCC登录号PTA-124182)；
Ms x hVSIG4 528927.111 (ATCC登录号PTA-124183)；
Rt x hVSIG4 489509.11 (ATCC登录号PTA-124184)；
Rt x hVSIG4 489517.111 (ATCC登录号PTA-124185)；和
Rt x hVSIG4 489518.11 (ATCC登录号PTA-124186)。
2.权利要求1的单克隆抗体，其中所述抗体结合VSIG-4。
3.一种单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包括以下中的至少一种：
重链可变区，其包含由以下克隆中的至少一种产生的单克隆抗体的重链的互补决定区(CDR)：
Ms x hVSIG4 528902.11 (ATCC登录号PTA-124187)；
Ms x hVSIG4 528903.111 (ATCC登录号PTA-124188)；
Ms x hVSIG4 528905.11 (ATCC登录号PTA-124189)；
Ms x hVSIG4 528906.11 (ATCC登录号PTA-124178)；
Ms x hVSIG4 528908.11 (ATCC登录号PTA-124179)；
Ms x hVSIG4 528910.111 (ATCC登录号PTA-124180)；
Ms x hVSIG4 528912.11 (ATCC登录号PTA-124181)；
Ms x hVSIG4 528922.111 (ATCC登录号PTA-124182)；
Ms x hVSIG4 528927.111 (ATCC登录号PTA-124183)；
Rt x hVSIG4 489509.11 (ATCC登录号PTA-124184)；
Rt x hVSIG4 489517.111 (ATCC登录号PTA-124185)；和
Rt x hVSIG4 489518.11 (ATCC登录号PTA-124186)；
和
轻链可变区，其包含由以下克隆中的至少一种产生的单克隆抗体的轻链的互补决定区(CDR)：
Ms x hVSIG4 528902.11 (ATCC登录号PTA-124187)；
Ms x hVSIG4 528903.111 (ATCC登录号PTA-124188)；
Ms x hVSIG4 528905.11 (ATCC登录号PTA-124189)；
Ms x hVSIG4 528906.11 (ATCC登录号PTA-124178)；
Ms x hVSIG4 528908.11 (ATCC登录号PTA-124179)；
Ms x hVSIG4 528910.111 (ATCC登录号PTA-124180)；
Ms x hVSIG4 528912.11 (ATCC登录号PTA-124181)；
Ms x hVSIG4 528922.111 (ATCC登录号PTA-124182)；
Ms x hVSIG4 528927.111 (ATCC登录号PTA-124183)；
Rt x hVSIG4 489509.11 (ATCC登录号PTA-124184)；
Rt x hVSIG4 489517.111 (ATCC登录号PTA-124185)；和
Rt x hVSIG4 489518.11 (ATCC登录号PTA-124186)。
4.权利要求3的单克隆抗体，其中所述抗体结合VSIG-4。
5.结合VSIG-4的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体消除VSIG-4与VSIG-4配体的结合。
6.权利要求5的单克隆抗体，其中所述VSIG-4配体包括SIGLEC-7。
7.权利要求5或6的单克隆抗体，其中VSIG-4和VSIG-4配体中的至少一种在细胞表面上。
8.权利要求5-7中任一项的单克隆抗体，其中VSIG-4在M2c巨噬细胞的表面上。
9.权利要求5-8中任一项的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体消除细胞-细胞相互作用。
10.权利要求5-9中任一项的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体结合VSIG-4的细胞外结构域。
11.权利要求5-10中任一项的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体结合VSIG-4多肽。
12.权利要求5-11中任一项的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体结合糖基化和未糖基化的VSIG-4。
13.权利要求5-12中任一项的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体直接或间接地偶联至可检测标记物。
14.权利要求5-13中任一项的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包括IgG抗体。
15.权利要求5-14中任一项的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体包含抗原结合片段，所述抗原结合片段包括Fab片段，Fab'片段，F(ab)2片段和Fv片段中的至少一种。
16.一种组合物，其包含权利要求5-15中任一项的单克隆抗体。
17.试剂盒，其包含权利要求5-15中任一项的单克隆抗体。
18.权利要求5-15中任一项的单克隆抗体，其用于治疗哺乳动物中的癌症的方法中。
19.权利要求5-15中任一项的单克隆抗体，其用于检测哺乳动物中的癌症的方法中。
20.权利要求5-15中任一项的单克隆抗体，其用于治疗自身免疫疾病的方法中。
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