KR101730868B1 - Ｖｓｉｇ４ 억제제를 유효성분으로 포함하는 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 VSIG4 단백질 발현 또는 활성 억제제, 특히 VSIG4 차단항체를 유효성분으로 포함하는 난소암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, VSIG4가 난소암환자의 종양대식세포(tumor associated macrophage; TAM)에서 발현되어 있고, T 세포의 증식과 IFN-g의 생산을 감소시키는 등 종양특이적 T 세포의 기능억제에 관련되어 있음을 확인하였다. 또한, 또한, VSIG4에 대한 차단항체를 제작하여 TAM의 VSIG4를 매개로 하는 T 세포의 기능억제를 차단하여 암환자의 T 세포기능이 회복되는 것을 확인하였으므로, 이를 난소암 치료제로서 활용할 수 있을 것으로 예상된다.

Description

ＶＳＩＧ４ 억제제를 유효성분으로 포함하는 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition comprising VSIG4 inhibitor for preventing or treating ovarian cancer}
본 발명은 VSIG4 억제제, 특히 VSIG4 차단항체를 유효성분으로 포함하는 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
난소암은 부인암 중에서 가장 치명적인 암으로써, 미국 내에서 여성의 암 사망 중 5번째로 가장 많은 원인이 되고 있다. 더욱이, 발병은 산업화된 나라에서 일어나고 있다. 장애를 일으키는 내분비 기능과 연관되는 역학적 증거는 있어도 종양성 형질 전환의 병인은 알려져 있지 않다. 난소암의 발병은 아이를 낳지 않은 여성과 초기 폐경을 갖는 여성에서 더 높게 나타난다. 난소암은 한국에서 두 번째로 발병 빈도가 높은 부인암으로 초기증상이 없고 적절한 진단 마커의 부재로 인하여 조기진단이 어려워 70% 이상의 환자들이 3기 이상 진행된 상태에서 발견되기 때문에 매우 사망률이 높은 부인암이다. 난소암으로 인한 사망률을 줄이기 위해서는 조기발견이 최선이며 항암치료 시 치료효과 및 치료반응을 모니터링할 수 있는 마커의 개발이 시급하다.
난소암은 암 조직을 구성하는 세포에 따라 크게 상피세포암, 생식세포암 및 간장세포암 등으로 나눌 수 있으며, 이를 세분하면 점액성(mucinous) 난소암, 장액성(serous) 난소암 및 경계성 난소암 등이 있다. 난소암으로 진단이 될 경우 대부분, 암이 많이 진행된 상태로 나타나기 때문에 예후가 좋지 않으며, 5년 생존율이 약 28%로 낮은 편에 속한다.
현재 수술, 면역요법, 화학요법, 호르몬 요법, 방사선 요법, 또는 이들의 조합이 난소암에 대해서 이용할 수 있는 치료방법이다. 일부의 가능한 수술적 처치에는 용적축소(debulking), 및 일측 또는 양측 난소 적출술 및/또는 일측 또는 양측 난관절제술이 포함된다. 또한 사용되는 항암 약물에는 사이클로포스파마이드, 에토포사이드, 알트레타민, 및 이포스파마이드가 포함된다. 약물 타목시펜에 의한 호르몬 요법을 또한 사용하여 난소 종양을 수축시킨다.
한편, 면역억제 공동분자(co-inhibitory molecule)라고 불렸던 단백질 중에서 임상 질환에 관련된 면역억제단백질을 면역체크포인트 단백질이라 하는데, 이러한 면역체크포인트 단백질인 B7-H1, PD-1, CTLA-4에 대한 차단항체가 항암면역치료제로 임상시험중에 있으며, 난소암은 일반적으로 5년 생존율이 극히 낮은 것으로 알려져 있어 새로운 면역치료법의 개발이 절실히 필요하다.
VSIG4(V-set and Ig domain-containing 4)는 B7 패밀리-관련 단백질로서, 구조적으로는 면역글로블린 슈퍼패밀리에 속하며, 기능적으로는 보체 (complement) iC3b, C3b 분절과 결합하여 보체의 활성을 억제하며, T 세포의 기능을 억제하는 기능이 있는 코시그날 분자이다(J. Clin . Invest . 116:2817-2826 (2006). doi:10.1172/JCI25673). 특히 간조직의 쿠퍼(Kupffer) 세포에서 VSIG4가 많이 발현되어 있다. VSIG4는 T, NKT 세포의 관용(tolerance)을 유도하여 간의 면역관용을 유도 및 유지하는데 관여한다. 주로 항원특이적인 T 세포의 세포주기억제 (G0/G1기 억제), 증식억제, Th1, Th2, Th17 사이토카인 생산억제, 관용(tolerance) 유도단백질인 p27-kip-1의 유도 등의 기전을 통해 T 세포의 면역관용을 유도하는 것으로 알려져 있다.
한편, 한국공개특허 10-2010-0102607는 PARP 억제제를 단독으로 사용하거나 항종양제와 병용하여 자궁암 및 난소암을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 대상체에게 적어도 하나의 PARP 억제제를 투여하는 것을 포함하여 자궁암, 자궁내막암 또는 난소암을 치료하는 방법을 개시하고 있으나, 본 발명의 VSIG4 억제제에 대한 언급은 없다.
이에, 본 발명자들은 VSIG4가 난소암환자의 종양대식세포(tumor associated macrophage; TAM)에서 발현되어 있고, T 세포의 증식과 IFN-g의 생산을 감소시키는 등 종양특이적 T 세포의 기능억제에 관련되어 있음을 확인하였다. 또한, VSIG4에 대한 차단항체를 제작하여 TAM의 VSIG4를 매개로 하는 T 세포의 기능억제를 차단하여 암환자의 T 세포기능이 회복되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 VSIG4 단백질 발현 또는 활성 억제제, 특히 VSIG4 차단항체를 유효성분으로 포함하는 난소암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 VSIG4 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 VSIG4 단백질 발현 억제제는 VSIG4 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
상세하게는, 상기 VSIG4 단백질 활성 억제제는 VSIG4 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
보다 상세하게는, 상기 항체는 난소암 종양대식세포(tumor associated macrophage; TAM)에서 발현된 VSIG4 단백질을 차단하여 T세포의 IFN-g 생산능력을 회복하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 VSIG4 단백질은 사람, 소, 염소, 양, 돼지, 마우스, 토끼 등의 포유류를 포함하는 VSIG4를 가지는 모든 진핵 생물 유래의 단백질일 수 있으며, 예를들어 인간 VSIG4(NM_001100431.1, NP_001093901.1) 또는 마우스 VSIG4(NM_177789.4, NP_808457.1)일 수 있다.
본 발명에서 용어 "안티센스 뉴클레오타이드"란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다.
본 발명에서 용어 "작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA)"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다.
본 발명에서 용어 "짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)"는 목적유전자 siRNA 염기서열의 sense와 상보적인 nonsense 사이에 3-10개의 염기 linker를 연결하는 올리고 DNA를 합성한 후 프라스미드 벡터에 클로닝하거나 또는 shRNA를 레트로바이러스인 렌티바이러스(lentivirus) 및 아데노바이러스(adenovirus)에 삽입하여 발현시키면 loop가 있는 헤어핀 구조의 shRNA (short hairpin RNA)가 만들어지고 세포 내의 Dicer에 의해 siRNA로 전환되어 RNAi 효과를 나타내는 것을 말한다. 상기 shRNA는 siRNA에 비해 비교적 장기간 RNAi 효과를 나타낸다.
본 발명에서 용어 "펩티드 미메틱스(Peptide Minetics)"는 VSIG4 활성을 이끄는 VSIG4 단백질의 결합 도메인을 억제하는 펩티드 또는 비펩티드이다.
본 발명에서 용어 "앱타머(Aptamer)"는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)이다. 앱타머는 고유의 높은 친화성(보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 단일 항체와 비교가 되고, 특히 "화학 항체"라고 할 만큼 대체 항체로서의 높은 가능성이 있다.
본 발명의 "항체"는 VSIG4 주입을 통해 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것이 모두 사용 가능하다. 또한, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다.
다클론 항체는 상기 VSIG4을 동물에 주사하고, 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다.단클론 항체는 연속 세포주의 배양을 통한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 사용하여도 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하이브리도마 기술, 사람 B-세포주 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술이 포함된다.
본 발명의 약학 조성물은 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스, siRNA 올리고뉴클레오타이드 및 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명의 난소암 예방 또는 치료용 의약 조성물 또는 복합 제제는 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 난소암 예방 또는 치료용 의약 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 의약 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 의약 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 의약 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 저해제는 1일 1회 내지 수회 투여시, 화합물일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 폴리펩타이드, 단백질 또는 항체일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNAi, miRNA일 경우 0.01ng/kg~10g/kg의 용량으로 투여할 수 있다.
본 발명은 VSIG4 단백질 발현 또는 활성 억제제, 특히 VSIG4 차단항체를 유효성분으로 포함하는 난소암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, VSIG4가 난소암환자의 종양대식세포(tumor associated macrophage; TAM)에서 발현되어 있고, T 세포의 증식과 IFN-g의 생산을 감소시키는 등 종양특이적 T 세포의 기능억제에 관련되어 있음을 확인하였다. 또한, 또한, VSIG4에 대한 차단항체를 제작하여 TAM의 VSIG4를 매개로 하는 T 세포의 기능억제를 차단하여 암환자의 T 세포기능이 회복되는 것을 확인하였으므로, 이를 난소암 치료제로서 활용할 수 있을 것으로 예상된다.
도 1은 인간 VSIG4 유전자 모식도를 나타낸다. 표시된 영역이 VSIG4의 세포외영역 (extracellular domain)이다.
도 2는 VSIG4 융합단백질 (VSIG4.hFc) 발현벡터의 모식도이다.
도 3은 VSIG4에 대한 하이브리도마 제작 및 스크리닝 결과이다.
도 4는 VSIG4를 매개로 하는 면역억제를 차단항체 스크리닝 결과이다. (A) 난소암 환자의 종양대식세포와 자가 T 세포를 anti-CD3 (OKT3, 1 μg/ml)와 함께 공동배양하였다. 이 배양액에 각각 10 μg/ml anti-VSIG4 항체를 첨가하여 3일간 배양한 후 배양액에서 IFN-g를 ELISA로 확인하였다. (B) 10개 anti-VSIG 항체클론의 면역억제 차단효과를 나타낸다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 >
1. 면역원인 VSIG4.Ig의 발현 및 정제
융합단백질(fusion protein)을 제조하기 위하여 전장 VSIG4 cDNA로부터 세포외부위(extracellular region)를 프라이머 세트로 PCR증폭하였다 [정방향(Forward): gacaagcttcgtcccatcctggaagtg; 역방향(Reverse): gatagatctacaggcaggctctttcctgg]. human IgG1의 Fc (hFc) 부위가 포함된 pFLAG-CMV1 vector에 hFc와 in-frame을 발현되도록 클로닝하였다(VSIG4.hFc)(도 1 및 도2).
VSIG4.hFc를 제조하기 위해 pFLAG_VSIG4.hFc DNA plasmid를 HEK 293 세포에 리포펙타민(lipofectamine) 2000를 이용하여 형질감염(transfection)하였다. 4, 6, 8일 후 배양액을 회수한 다음 Millipore ultrafiltration membrane으로 10배 농축시킨 다음 protein G column (HiTrap, GE Healthcare Life Scinces)에 통과시켜 융합단백질을 컬럼에 결합시켰다. 용출 완충액(Elution buffer)으로 융합단백질을 용출시키고 중화 완충액으로 즉시 중성화시켰다. PBS로 투석(dialysis)시키고, 0.22 μm 필터로 필터링하여 실험에 사용하였다.
VSIG4.hFc의 발현은 sandwich ELISA로 확인하였다. 즉, anti-FLAG antibody (2 μg/ml)를 ELISA plate에 코팅(coating)시키고, 농도별로 희석한 융합단백질(fusion protein)을 반응시킨 다음, HRP-conjugated anti-human IgG로 반응시켰다. TMB로 발색반응을 유도하여 결과를 판정하였다.
2. 마우스 면역 방법
hVSIG4.Ig 혼합단백질 450 ul (1mg/ml)을 CFA 450 ul와 혼합하여 1시간 이상 혼합(vortex)하여 에멀젼(emulsion) 상태로 만든 다음 200 ul씩 VSIG4 KO 마우스(Balb/c background)의 복강으로 주사하였다. 4주 후에 hVSIG4.Ig 혼합단백질 450 ul (1mg/ml)을 IFA 450 ul와 혼합하여 1시간 이상 혼합(vortex)하여 에멀젼(emulsion) 상태로 만든 다음 200 ul씩 마우스의 복강으로 주사하였다. 2주 후에 ELISA assay로 항체 형성 여부를 확인하였다. ELISA 방법은 다음과 같다. ELISA plate에 hVSIG4.Ig (10 μg/ml)을 100 μl씩 넣고 4℃에서 12시간 이상 반응시켰다. 1% BSA로 1시간 동안 차단(blocking)한 후 마우스의 혈청을 1~106까지 희석하여 2시간 동안 반응시킨 후 anti-mouse IgG HRP와 TMB substrate로 반응시켰다. 106으로 희석한 시료에서도 OD450 값이 2.0이상이었으므로 더 이상 투여(boosting) 하지 않고 마우스를 치사하여 융합하였다.
3. 하이브리도마의 스크리닝
융합된 세포는 96 well plate 5개에 희석하여 배양하였다. 배양 후 2주째에 상청액을 회수하여 direct ELISA로 1차 스크리닝을 하였다. ELISA plate에 hFc (10 μg/ml) 또는 hVSIG4.Ig (10 μg/ml)을 100 μl씩 넣고 4℃에서 12시간 이상 반응시켰다. 1% BSA로 1시간 동안 차단(blocking)한 후 배양 상청액을 100 μl씩 넣고 2시간 동안 반응시킨 후 anti-mouse IgG HRP와 TMB substrate로 반응시켰다. hFc가 코팅(coating)된 well에서는 OD450 값이 0.3 이하이고 hVSIG4.Ig가 코팅(coating)된 well에서만 OD450 값이 0.3이상인 하이브리도마를 선정하였다.
4. 유세포 분석
1차 스크리닝에서 선정된 하이브리도마를 96 well plate에 옮겨 2주 동안 배양한 후 상청액을 회수하여 유세포분석법(FACS)으로 2차 스크리닝을 하였다. HEK 293세포에 pDisplay DNA plasmid와 pDisplay hVSIG4 DNA plasmid를 리포펙타민(lipofectamine) 2000으로 형질감염(transfection)하여 2일째에 세포를 회수한 다음 배양 상청액을 넣고 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 2차 항체로 PE conjugated anti-mouse IgG Fcγ specific F(ab')2을 넣고 4℃에서 30분 동안 반응시킨 후 FACS Calibur로 분석하여 hVSIG4에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마를 선정하였다. pDisplay DNA plasmid를 형질감염(transfection)한 세포에서는 MFI값이 10이하이면서 pDisplay hVSIG4 DNA plasmid를 형질감염(transfection)한 세포에서는 MFI값이 50 이상인 하이브리도마를 선정하였다.
5. VSIG4 차단항체 검색
최종 유세포분석을 통해 확인된 항체클론에 대해 기능 분석(functional assay)를 실시하였다. 난소암 환자의 복수에서 Ficoll을 이용하여 면역세포를 분리한 다음 종양대식세포(TAM)의 표지자인 CD14, CD163으로 염색하여 TAM을 FACS Aria로 분리하였다. 분리된 TAM과 난소암 환자의 복수에서 분리한 자가 T 세포를 anti-CD3 항체 (OKT3, 1 μg/ml)와 함께 각각의 VSIG4 항체를 3-15 μg/ml 농도로 처리하여 3일간 배양하였다. 배양 상청액을 회수하여 IFN-γ와 IL-2의 농도를 ELISA로 측정하여 차단항체의 효과를 분석하였다. 한편, 본 발명에 사용한 환자 정보는 표 1과 같다.
성별 나이 병리소견 병기 다른 질환이력
1 F 64 장액성 난소암 3 없음
2 F 43 점액성 난소암 3 없음
3 F 61 장액성 난소암 4 없음
4 F 59 장액성 난소암 4 없음
5 F 71 자궁내막양암 3 없음
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (5)

  1. VSIG4 차단항체를 유효성분으로 포함하는 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 차단항체는 난소암 종양대식세포(tumor associated macrophage; TAM)에서 발현된 VSIG4 단백질을 차단하여 T세포의 IFN-g 생산능력을 회복하는 것을 특징으로 하는 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 VSIG4 단백질은 인간 VSIG4(NCBI accession number NP_001093901.1) 또는 마우스 VSIG4(NCBI accession number NP_808457.1)인 것을 특징으로 하는 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물.
KR1020130110051A 2013-09-13 2013-09-13 Ｖｓｉｇ４ 억제제를 유효성분으로 포함하는 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물 KR101730868B1 (ko)

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