MXPA06002557A - Compuestos que modulan el crecimiento neuronal y sus usos - Google Patents

Abstract

Se proporcionan péptidos cíclicos y peptidomiméticos que se unen a y/o modulan actividades asociadas con los receptores Trk, incluyendo procesos asociados con el crecimiento y reparación del sistema nervioso central (es decir, crecimiento y sobrevivencia neuronal, crecimiento axonal, emergencia o crecimiento de neuritas y plasticidad sináptica). Se proporcionan también péptidos cíclicos y peptidomiméticos que bloquean o reducen el efecto de otros factores que inhiben el crecimiento y/o reparación del sistema nervioso central. Se proporcionan composiciones farmacéuticas y otras formulaciones que comprenden esos compuestos. Además, la invención proporciona métodos de uso de los péptidos cíclicos y peptidomiméticos para modular actividades mediadas por Trk, incluyendo procesos como el crecimiento, sobrevivencia y recuperación neuronal, crecimiento axonal, emergencia de neuritas y plasticidad sináptica. Además, la invención proporciona métodos para promover el crecimiento neuronal del sistema nervioso central (SNC) administrando un agente de unión del receptor de p75.

Description

COMPUESTOS QUE MODULAN EL CRECIMIENTO NEURONAL Y SUS USOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con composiciones y métodos para modular el crecimiento y reparación del sistema nervioso central (SNC) , incluyendo procesos como la sobrevivencia neuronal, crecimiento axonal y plasticidad sináptica. De manera más específica, la invención se relaciona con compuestos (incluyendo compuestos peptídicos cíclicos y peptidomiméticos) que son agonistas o antagonistas de una familia de receptores, conocidos como receptores Trk, que son expresados sobre la superficie de las células neuronales y que regulan esos procesos de crecimiento y reparación del SNC. Además, la invención se relaciona con métodos para promover el crecimiento y reparación del SNC usando un agente de unión de p75.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El daño al sistema nervioso central (SNC) puede tener consecuencias devastadoras debido a la pobre capacidad regenerativa de las neuronas en ese ambiente. Esto contrasta notablemente con la capacidad regenerativa comparativamente buena de las neuronas en el sistema nervioso periférico. Véase, por ejemplo, Horner & Gage, Nature 2000, 407:963-970. Numerosas enfermedades, como la enfermedad de Alzheimer, la Ref: 169607 enfermedad de Parkinson, apoplejía, trauma de cabeza y médula espinal por nombrar una cuantas, están todas asociadas con daño al SNC que es con frecuencia severo, aún debilitante, duradero o aún permanente. No existe cura actualmente disponible para esas condiciones, y se carecen aún de tratamientos paliativos.

Neurotrofinas Ahora se comprende que el crecimiento y regeneración de las neuronas es regulado al menos en parte por ciertos factores de crecimiento polipeptídicos, conocidos como neurotrofinas o "NTs" , las cuales se unen a y activan los receptores de la superficie celular que tienen una actividad de tirosina cinasa intrínseca. Tras la unión de la neurotrofina, se cree que esos receptores quedan autofosforilados sobre uno o más aminoácidos residuales y posteriormente se asocian con moléculas intracelulares importantes para la transducción de señales . Para una revisión, véase Ulrich & Schlessinger, Cell 1990,61 : 203-212. La primera neurotrofina identificada es conocida en la técnica como el factor del crecimiento nervioso (NGF) y tiene un efecto prominente sobre el desarrollo de las neuronas sensoriales y simpáticas del sistemas nervioso periférico. Véase, Levi-Montalcini & Angeletti, Physiol . Rev. 1968, 48:534-569; Thoenen et al., Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 1987, 109:145-178; Thoenen & Barde, Physiol. Rev. 1980, 60:1284-1325; Whittemore & Seiger, Brain Res. 1987, 434:439-464; Angeletti & Bradshaw, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 1971, 68:2417-2420; Angeletti et al., Biochemistry 1973, 12:100-115. También han sido aislados y caracterizados ortólogos del NGF en numerosas otras especies, incluyendo ratones, aves, reptiles y peces (Scott et al., Nature 1983, . 302:538-540; Schwartz et al., J. Neurochem. 1989, 52:1203-1209; y Hallbóók et al., Neuron 1991, 6:845-858. . Un número de otras NT son también conocidas en la técnica. Esas incluyen el factor neutrófico derivado del cerebro (BDNF) , el cual también es conocido como neurotrofina-2 (NT-2) . Véase, Leibrock et al., Nature 1989, 341:149-152. Otras NT más incluyen un factor originalmente llamado factor neuronal (NF) Y ahora comúnmente conocido como neurotrofina-3 o "NT-3" (Ernfors et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 1990, 87: 5454-5458; Hóhn et al., Nature 1990, 344:339; Maisonpierre et al., Science 1990, 247:1446; Rosenthal et al., Neuron 1990, 4:767; Jones & Reichardt, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 1990, 87:8060-8064; y Kaisho et al., FEBS Lett. 1990, 266:187). También se conocen las neurotrofinas-4 y-5 (NT-4 y NT-5) . Véase, Hallbook et al., Neuron 1991, 6:845-858; Berkmeier et al., Neuron 1991, 7:857-866; Ip et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 1992, 89:3060-3064. Véase también, la Patente Estadounidense No. 5,364,769 expedida en Noviembre 15, 1994 a Rosenthal . Dehido a que se observó posteriormente que esta es un ortólogo de mamífero de la NT-4 de Xenopus descrita por Hallbrook et al, supra, la molécula NT-5 de mamífero descrita por Berkmeier et al . , supra, también es comúnmente referida como NT-4/5. Una alineación del BDNF de la NT, NT4, NT3 , y NGF se proporciona en la Figura 1.

Receptores Trk Las neurotrofinas median su efecto a través de una familia de tirosinas cinasas receptoras que son expresadas sobre la superficie de las células neuronales y llamadas colectivamente receptores Trk. Se conocen al menos tres receptores Trk diferentes y han sido descritos en la técnica: TrkA, TrkB y TrkC. Para una revisión, véanse las Patentes Estadounidenses Nos. 5,844,092; 5,877,016; 6,025,166; 6,027,927; y 6,153,189 todas de Presta et al. Aunque la estructura y secuencias de los diferentes receptores Trk son similares, el empalme alternado incrementa la complejidad de esta familia dando lugar a varios isoformos diferentes de cada receptor. Una alineación de las diferentes secuencias de aminoácidos del receptor Trk se proporciona aquí en la Figura 2A-2C que expone las secuencias de consenso y límites para los diferentes dominios de cada receptor. Véase también, las Figuras 16A- 16C en la Patente Estadounidense No. 5,877,016. Cada uno de los diferentes receptores Trk exhibe afinidad de unión en particular por las diferentes neurotrofinas, aunque existe alguna superposición. En consecuencia, se cree que la Trk se une no solamente al NGF, sino también a la NT-3 y la NT-4/5 (pero no al BDNF) . Se cree que el TrkB se une al BDNF, la NT-3, NT-4 y NT-4/5, pero no al NGF. En contraste, se cree que el TrkC se une únicamente a la NT-3 y no a ninguna de las otras neurotrofinas . Un número de estudios han validado los receptores Trk como blancos terapéuticos para la reparación del cerebro. Véase, por ejemplo, Liu et al . , J. Neurosci . 1999, 19:4370-4387; Menei et al . , Eur. J. Neurosci . 1998, 10:607-621; y Kobayashi et al . , J. Neurosci . 1997, 17:9583-9595. Los receptores Trk y sus ligandos también han sido estudiados usando cristalografía de rayos X para obtener estructuras tridimensionales de los complejos de unión ligando-receptor. Wiesmann et al . , Nature 1999, 401:184-188; Banfield et al . , Structure ( Camb) 2001, 9:1191-1199. Esos y otros estudios sugieren que la neurotrofina que se une a los receptores Trk induce la dimerización de los monómeros receptores, dando como resultado un incremento de la actividad de tirosina cinasa intrínseca de los receptores. Este incremento de la actividad activa a su vez, las cascadas de señalización que se cree son benéficas para las neuronas promoviendo la sobrevivencia neuronal, crecimiento axonal y plasticidad sináptica. Snider, Cell 1994, 77:627-638; Kaplan & Miller, Curr. Opin . Neurobiol . 2000, 10:381-391. Hasta ahora ha existido un reconocimiento considerable de que los compuestos terapéuticos que dirigen y activan receptores Trk (es decir, "agonistas" del receptor Trk) serían benéficos y deseables. Véase, por ejemplo, Lindsay et al . , Exp . Neurol . 1993 , 124:103-118; Olson, Neurochem . Int . 1994, 25:1-3. Además, el incremento de los niveles de ciertas neurotrofinas (por ejemplo, el BDNF) también está asociado con condiciones médicas como la epilepsia (Binder et al . , Trends Neurosci . 2001, 24: 47-53). En consecuencia, aún los compuestos que inhiben la actividad del receptor Trk (es decir, los "antagonistas" del receptor Trk) serían benéficos. A pesar de esta necesidad muy sentida, esos compuestos han sido evadidos en el mejor de los casos. Debido a que son moléculas grandes, la liberación terapéutica de niveles efectivos de neurotrofinas presenta por sí misma considerables desafíos, posiblemente insuperables. Además, las neurotrofinas naturales pueden interactuar con otros receptores, como el receptor p75 en las neuronas, el cual está asociado con la apoptosis neuronal y colapso del cono de crecimiento. Lee et al., Curr. Opin . Neurobiol . 2001, 11:281-286. Sin embargo, los esfuerzos previos por diseñar agonistas y/o antagonistas peptidomiméticos de los receptores Trk tampoco han sido exitosos. Por ejemplo, se ha reportado que los péptidos cíclicos derivados de la espira 1 de la neurotrofina NGF imitan moderadamente la actividad de sobrevivencia del NGF. Sin embargo, esos péptidos parecen funcionar en un p75, en lugar del receptor de Trk, de manera dependiente. Long et al . , J. Neurosci . Res . 1997, 48:1-17. Se dice que algunos péptidos cíclicos de la espira 4 del NGF muestran actividad de sobrevivencia similar a la del NGF que es bloqueada por un antagonista de Trk. Sin embargo, se reporta que la respuesta de sobrevivencia máxima inducida por aquellos péptidos es de solo 10-15% de la respuesta máxima promovida por la neurotrofina NGF en sí. Véase, Xie et al . , J. Biol . Chem. 2000, 275:29868-29874; y Maliartchouk et al . , J". Biol . Chem . 2000, 275: 9946-9956. Las versiones diméricas bicíclicas y tricíclicas de los péptidos de la espira 2 del BDNF ha mostrado tener actividad similar a la del BDNF. Nuevamente, sin embargo, se reporta que la respuesta de sobrevivencia máxima que induce no es de solo el 30% de la repuesta máxima promovida por la neurotrofina natural. O'Leary et al . , J. Biol . Chem. 2003, 278:25738-25744 (Publicación electrónica Mayo 2, 2003) . Continua existiendo, por lo tanto, una necesidad muy sentida de composiciones que puedan modular (es decir, incrementar o inhibir) el crecimiento y recuperación neuronal . También existe la necesidad de procesos y métodos (incluyendo métodos terapéuticos) que modulen efectivamente el crecimiento y recuperación neuronal .

El receptor de Neurotrofina, receptor p75 Se sabe que el receptor p75 juega papeles en los complejos de señalización para la apoptosis neuronal e inhibición del crecimiento. Barker, Neuron 2004, 42:529-533. El receptor p75 es un miembro de la superfamilia del factor de la necrosis tumoral (TNR) y se caracteriza por dominios ricos en cisteína (CRD) en su porción extracelular. Esos CRD se requieren para la unión de la neurotrofina, y el receptor p75 sirve como un receptor de baja afinidad para las neurotrofinas como el NGF, BDNF, NT-3, y NT-4. Huang and Reichardt, Annu. Rev. Biochem. 2003, 72:609-642. El NGF, BDNF, NT-3 y NT-4 pueden competir efectivamente entre sí por la unión al receptor p75. En ambientes inhibidores, esas neurotrofinas pueden ser usadas para competir entre sí por la unión al receptor p75 para revelar respuestas que dependen únicamente de la señalización de Trk. Barker and Shooter, Neuron 1994, 13:203-215.

El receptor p75 y el motivo TDIKGKE del NGF Se sabe que el motivo TDIKGKE que constituye la primera espira de la horquilla ß del NGF juega un papel crucial en la unión del NGF al receptor p75. He y García, Science 2004, 304:870-875; Ibanez et al . , Cell 1992, 69:329-341. Además, los motivos TDIKGKE restringidos interactúan con el receptor p75 y se espera que compitan por la unión de la neurotrofina a este receptor. Longo et al . , J. Neurosci . Res . 1997, 48:1-17. Se ha reportado que los compuestos peptídicos cíclicos y peptidomiméticos derivados de la espira 1 del NGF imitan moderadamente la actividad promotora del crecimiento neuronal del NGF (véase la Patente Estadounidense No. 6,017,878 de Saragovi et al.), y esos péptidos parecen funcionar en una forma dependiente del receptor p75 (Longo et al., <J. Neurosci . Res . 1997, 48:1-17). Se dice que algunos péptidos cíclicos de la espira 4 del NGF muestran promoción del crecimiento neuronal similar a la del NGF que es bloqueada por un antagonista de Trk. Sin embargo, se reporta que la respuesta máxima inducida por aquellos péptidos es de solo el 10-15% de la respuesta máxima promovida por la neurotrofina NGF en sí. Véase Xie et al . , J. Biol . Chem. 2000, 275:29868-29874; y Maliartchouk et al . , J. Biol . Chem. 2000, 275:9946-9956. Las versiones diméricas bicíclicas y tricíclicas de los péptidos de la espira 2 del BDNF han mostrado tener actividad similar a la del BDNF. Nuevamente, sin embargo, se reporta que la respuesta máxima que induce solo el 30% de la respuesta máxima promovida por la neurotrofina natural. O'Leary et al . , J. Biol . Chem. 2003, 278:25738-25744 (Publicación electrónica Mayo 2,2003).

Señales Inhibidoras Se piensa que la capacidad limitada del sistema nervioso central para reparar daños se debe al menos parcialmente a la presencia de productos inhibidores que evitan la regeneración axonal-incluyendo los inhibidores asociados con la mielina dañada (Berry, Bibl . Anat . 1982, 23:1-11). En realidad, los estudios bioquímicos sobre la mielina central han identificado dos fracciones proteicas que contienen actividad inhibidora de la propagación 'de células (Caroni & Schwab, J. Cell Biol . 1988, 106:1281-1288) y anticuerpos monoclonales que se unen a aquellas fracciones para aumentar el crecimiento de neuronas sensoriales y simpáticas cultivadas en lo que son en otras circunstancias sustratos no adecuados para el crecimiento de neuritas (Caroni &. Schwab, Neuron 1988, 1:85-96). Estudios con esos mismos anticuerpos en animales lesionados han mostrado que pueden obtenerse una recuperación funcional bloqueando la función de las moléculas inhibidoras asociadas con la mielina (Bregman et al., Nature 1995, 378:498-501; Schnell & Schwab, Nature 1990, 343:269-272). Ha sido obtenida una respuesta de regeneración más robusta en ratones inmunizados con mielina completa (Huang et al., 1999) demostrando además que la recuperación y reparación del SNC puede ser mejorada in vivo, bloqueando los factores inhibidores . Se conocen al menos tres moléculas derivadas de mielina que son inhibidores potentes del crecimiento axonal : la glicoproteína asociada con la mielina, la cual también es conocida como "MAG" (descrito por McKerracher et al . , Neuron 1994, 13: 805-811; y por Mukhopadhyay et al . , Neuron 1994, 13:757-767); Nogo-A (véase, Chen et al . , Nature 2000, 403: 434-439; GrandPre et al . , Nature 2000, 403:439-444; y Prinjha et al . , Nature 2000, 403:383-384) y la glicoproteína de mielina oligodendrocítica (Wang et al . , Nature 2002, 417: 941-944). El receptor Nogo (también conocido como el "NgR"), el gangliósido GTlb y el receptor de neurotrofina p75 (también conocido como "p75NTR" o "p75NTR" ) han sido implicados en la mediación de respuestas a tres de esas moléculas inhibidoras. Específicamente, se dice que la unión al NgR se requiere para la actividad inhibidora por los tres inhibidores MAG, Nogo-A y glicoproteína oligodendrocítica (Domeniconi et al., 2002; Liu et al., 2002; Wang et al., 2002b) . Sin embargo, la MAG también puede unirse directamente al receptor GTlb (Vyas & Schnaar, Biochimie 2001, 83:677-682) . Además, el anticuerpo indujo agrupamientos del receptor GTlb que puede imitar la respuesta inhibidora producida por la MAG (véase, Vinson et al, J. Biol . Chem. 2001, 276:20280-20285; y Vyas et al . , Proc . Nati . Acad. Sci . U. S. A. 2002, 99:8412-8417) . El receptor p75 es el componente de señalización de un complejo receptor multimérico que puede unirse a los tres receptores de mielina. Véase Domeniconi et al . , Neuron 2002, 35:283-290; Liu et al . , Science 2002, 297:1190-1993; Wang et al . , Nature 2002, 417 : 941-944. Han sido reportadas interacciones entre los receptores GTlb y p75NTR (Yamashita et al., 2002), como interacciones entre los receptores NgR y p75NTR (véase, Wang et al . , 2002a; y Wong et al . , 2002). Se piensa que esas interacciones con el p75 son importantes en la transmisión de las señales inhibidoras (por ejemplo, de la MAG, Nogo-A y/o glicoproteína oligodendrocítica) a través de la membrana celular. Por ejemplo, las interacciones de la MAG o un péptido Nogo-A con células que expresan NgR incrementan la asociación del p75NTR con Rho-GDI, e induce la liberación de RhoA de ese complejo (Yamashita & Tohyma, Nat . Neurosci . 2003, 6:461-471) . Este paso es un prerrequisito para la activación de RhoA y la inhibición del crecimiento (Jd) , y la inhibición RhoA y/o Rho cinasa (un efector corriente abajo de RhoA) evita efectivamente la actividad inhibidora, por ejemplo de la mielina en neuronas cultivadas (véase, por ejemplo, Dergham et al . , J. Neurosci . 2002, 22:6570-6577; Fournier et al . , J. Neurosci . 2003, 23:1416-1423; y Lehmann et al . , J. Neurosci . 1999, 19:7537-7547). Como se hizo notar anteriormente, las diferentes neurotrofinas (por ejemplo, NGF, BDNF, NT-3 y NT-4/5) tienen efectos dramáticos sobre la sobrevivencia neuronal y crecimiento axonal durante el desarrollo. Recientemente se ha sugerido que las neurotrofinas y moléculas inhibidoras (por ejemplo, MAG, Nogo-A y glicoproteína oligodendrocítica) pueden tener un efecto opuesto sobre el acoplamiento del receptor p75NTR a Rho-GDI (véase, Yamashita & Tohyama, Nat. Neurosci. 2003, 6:461-467). No obstante, no ha sido posible aún promover una regeneración axonal robusta, de largo alcance, usando neurotrofinas. De este modo se cree que eso se debe al menos parcialmente a la incapacidad de las neurotrofinas para contrarrestar efectivamente las señales inhibidoras como aquellas descritas anteriormente. Por ejemplo, el tratamiento de neuronas cultivadas con neurotrofinas como NGF, BDNF o GDNF (factor neurotrófico derivado glial) normalmente no contrarrestan la actividad inhibidora de la mielina a menos gue las neuronas sean "cebadas" primero por exposición a la neurotrofina durante varias horas antes de la exposición a la señal inhibidora (Cai et al . , Neuron 1999, 22:89-101). Ese cebado, sin embargo, es de efecto limitado, consume tiempo, es difícil de aplicar y no es práctico para aplicaciones clínicas y otras in vivo . Además, (y como se hizo notar anteriormente), la liberación terapéutica de neurotrofinas en sí, las cuales son moléculas grandes, presenta desafíos técnicos considerables y posiblemente insuperables. Además, las neurotrofinas pueden verse comprometidas en su capacidad para promover regeneración debido a que se unen al complejo inhibidor a través de su interacción con el receptor p75. Las neurotrofinas, las cuales se unen al receptor p75, no pueden activar los receptores Trk para superar la señalización inhibidora y promover el crecimiento neuronal . En consecuencia, existe adicíonalmente la necesidad de compuestos que puedan modular efectivamente los efectos de las señales inhibidoras sobre el crecimiento y recuperación neuronal - incluyendo compuestos que modulen efectivamente los efectos de señales inhibidoras como aquellos producidos por MAG, Nogo-A, glicoproteína oligodendrocítica, NgR, GTlb, p75NTR y/o efectores corriente abajo de esas moléculas de señalización. En particular, existe la necesidad de compuestos que puedan contrarrestar efectivamente esas señales inhibidoras, y/o estimular el crecimiento y recuperación neuronal. También existe la necesidad de procesos y métodos (incluyendo métodos terapéuticos) que modulen los efectos de esas señales inhibidoras y, en particular, de procesos y métodos que contrarresten esas señales inhibidoras y/o estimulen el crecimiento y recuperación neuronal . La cita y/o discusión de una referencia en esta sección y a través de la especificación se proporciona únicamente para aclarar la descripción de la presente invención y no como una admisión de que cualquiera de esas referencias sea la "técnica anterior" a la invención descrita aquí .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona al menos una solución parcial a los problemas mencionados anteriormente en la técnica proporcionando compuestos y formulaciones de los mismos que modulan (por ejemplo, aumentan o inhiben) la actividad mediada por un receptor Trk como el TrkA, TrkB o TrkC. Por ejemplo, en una modalidad la invención proporciona compuestos que son antagonistas de Trk y por lo tanto, inhiben la actividad mediada por Trk. En otras modalidades, la invención proporciona compuestos que son agonistas de Trk y, por lo tanto, mejoran o incrementan la actividad mediada por Trk . Como se hizo notar anteriormente, los receptores, Trk y sus ligandos (es decir, neurotrofinas como el NGF, BDNF, NT-3, NT-4, NT-5 y NT-4/5) están asociados con el crecimiento y reparación del sistema nervioso central (SNC) . Por lo tanto, los compuestos moduladores de Trk de la presente invención pueden ser usados para modular esos procesos, incluyendo los procesos de crecimiento y sobrevivencia neuronal, crecimiento axonal, emergencia o crecimiento de neuritas y plasticidad sináptica. En un aspecto, por lo tanto, la presente invención proporciona métodos (incluyendo métodos terapéuticos) que usan compuestos moduladores de Trk de la invención para modular (por ejemplo, mejorar o inhibir) esos procesos. En una modalidad particular, la invención proporciona compuestos peptídicos cíclicos que modulen la actividad mediada por el receptor Trk. Esos péptidos cíclicos preferiblemente comprenden, dentro de un anillo peptídico cíclico, la secuencia de aminoácidos: Arg-Gly-Glu. En una modalidad particular, el péptido cíclico comprende la fórmula: (Yl)—(X?)-Arg-Gly-Glu—(X2)—(Y2) (Fórmula I) En la Fórmula I, los elementos Y^ y Y2 son seleccionados independientemente de aminoácidos con un enlace covalente formado entre Yi y Y2. El elemento Xi y X2 son opcionales y, si están presentes, son seleccionados independientemente de aminoácidos o secuencia de aminoácidos unidas por enlaces peptídicos. Preferiblemente Xi y/o X2 son cada uno de entre cero y aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, y son, de manera más preferible de aproximadamente 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos de longitud. Además, Xi y X2 son también seleccionados preferiblemente, de modo que el tamaño del anillo del péptido cíclico fluctúe de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 15 aminoácidos de longitud, y es, de manera más preferible entre aproximadamente 5-10 aminoácidos de longitud. La invención proporciona además, en modalidades particulares, péptidos cíclicos que tienen la fórmula: (Y,)—Ser—Arg—Arg—Gly—Glu—(Y2) (Y-,)—Ala-Arg—Arg—Gly—Glu—(Y2) (Y,)—Phe—His-Arg—Gly—Glu—(Y2) ,o (Y,)—Ser His-Arg—Gly—Glu—(Y2) donde Yx y Y2 son como se describieron anteriormente, para la Fórmula I. Los péptidos cíclicos particularmente preferidos de la invención son los que comprenden la secuencia de aminoácidos: CSRRGEC (SEQ ID NO: 1), N-Ac-CSRRGEC-NH2 (SEQ ID NO: 2), CARRGEC (SEQ ID NO: 3), N-Ac-CARRGEC-NH2 (SEQ ID NO: 4), CFHRGEC (SEQ ID NO: 5), N-Ac-CFHRGEC-NH2 (SEQ ID NO: 6), CSHRGEC (SEQ ID NO: 7), N-Ac-CFHRGE-NH2 (SEQ ID NO: 8), CRGEC (SEQ ID NO: 9), N-Ac-CRGEC-NH2 (SEQ ID NO: 10), N-Ac-KRGED-NH2 (SEQ ID NO: 11), H-C(O)-CRGEC-NH2 (SEQ ID NO: 12), CH3-SQ2-NH-CRGEC-NH2 (SEQ ID NO: 13), N-Ac-CRGEC-Y-NH2 (SEQ ID NO: 14), H-C (O) -CRGEC-Y-NH2 (SEQ ID NO: 15) y CH3-SQ2-NH-CRGEC-Y-NH2 (SEQ ID NO: 16), (donde la porción subrayada de secuencia de aminoácidos indica que esa porción del péptido es cíclica) . Los péptidos cíclicos preferidos de las fórmulas y secuencias anteriores son antagonistas de Trk. Sin embargo, la invención también proporciona, en otras modalidades, péptidos cíclicos que son agonistas de Trk. Esos péptidos cíclicos tienen preferiblemente la fórmula (Fórmula II) En la Fórmula II, anterior, los elementos Yi y Y2 son seleccionados independientemente de aminoácidos con el enlace covalente formados entre Yi y Y2. Los elementos Zx, Z2 y Z0 son opcionales y, si están presentes, son seleccionados independientemente de aminoácidos o secuencias de aminoácidos unidas por enlaces peptídicos. Preferiblemente, Z , Z2 y/o Z0 son cada uno de no más de aproximadamente diez aminoácidos de longitud y son, de manera más preferible, de solo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o 10 aminoácidos de longitud. Además, las longitudes de Zi, Z2 y/o Z0 son seleccionadas preferiblemente de modo que el tamaño del anillo del péptido cíclico fluctúe de aproximadamente 10 a 50 aminoácidos de longitud, y de manera más preferible de aproximadamente 10 a 25 o de aproximadamente 15 a 20 aminoácidos de longitud. En modalidades particularmente preferidas, los elementos Zi, Z2 y Zo son seleccionados de modo que la serie de secuencias de Arg-Gly-Glu en la Fórmula I adopte una conformación donde estén adyacentes y antiparalelas entre sí. En modalidades preferidas, la invención proporciona péptidos cíclicos de acuerdo a la Fórmula II que tiene la fórmula Oí)—Ser—Arg—Arg—Gly—Glu—Leu—Ala—Ala—Ser-Arg—Arg—Gly—Glu—Leu—(Y2) donde los elementos Yi y Y2 son como se expusieron, supra, para la Fórmula II. Los péptidos particularmente preferidos de acuerdo a la Fórmula II, los cuales también son parte de la presente invención, son péptidos cíclicos que comprenden la secuencia de aminoácidos: CSRRGELAASRRGELC (SEQ ID NO: 17) y N-Ac-CSRRGELAASRRGELC-NH2 (SEQ ID NO: 18), (donde la porción subrayada de cada secuencia de aminoácidos indica que esa porción del péptido es cíclica) . De acuerdo con la invención, se proporcionan péptidos cíclicos que comprenden, dentro de un anillo cíclico del péptido cíclico, la secuencia de D aminoácidos: dGlu-Gly-dArg donde el péptido cíclico modula la actividad mediada por el receptor Trk. Los péptidos cíclicos preferidos que modulan la actividad mediada por el receptor Trk que comprenden secuencias de D aminoácidos son c [dLdEGdRdRdSdLdEGdRdRdS] (SEQ ID NO: 40) , (donde la porción del corchete de la secuencia de aminoácidos indica aquella porción del péptido que es ciclizada por un enlace peptídico) y Ac-dCdLdEGdRdRdSdAdAdLdEGdRdRdSdC-NH2 (SEQ ID NO: 41) . En una modalidad adicional, la invención proporciona el péptido cíclico que tiene la secuencia de aminoácidos c [SRRGELSRRGEL] (SEQ ID NO: 39). Además de los péptidos cíclicos, la invención también proporciona métodos para identificar otros compuestos (es decir, "compuestos candidatos") que modulan la actividad mediada por el receptor Trk o que probablemente modulen esa actividad. Esos métodos implican comparar una estructura tridimensional del compuesto candidato con la estructura tridimensional de un péptido cíclico de la invención. La similitud entre la estructura del compuesto candidato y la estructura del péptido cíclico es indicativa de la capacidad del compuesto candidato para modular la actividad mediada por el receptor Trk. En consecuencia, un compuesto candidato que tenga una estructura sustancialmente similar a la estructura tridimensional del péptido cíclico probablemente será un compuesto que module la actividad mediada por el receptor Trk. Los métodos anteriores son idealmente adecuados para identificar compuestos peptidomiméticos que modulen la actividad mediada por el receptor Trk. En consecuencia, la invención proporciona compuestos peptidomiméticos que son moduladores de Trk, y esos compuestos son considerados otro aspecto de la invención. En particular, los compuestos peptidomiméticos de la invención son compuestos que tienen una estructura tridimensional que es sustancialmente similar a la estructura tridimensional de un péptido cíclico de la invención (es decir, un péptido cíclico que modula la actividad mediada por el Trk y comprende, dentro de un anillo cíclico de los mismos, la secuencia de aminoácidos Arg-Gly-Glu) . La invención proporciona adicionalmente métodos, incluyendo métodos terapéuticos, que usan péptidos cíclicos y compuestos peptidomiméticos para modular la actividad mediada por Trk. En una de esas modalidades, la invención proporciona métodos para inhibir la actividad mediada por Trk. Esos métodos implican poner en contacto una célula (in vi tro o in vivo) con una cantidad de un péptido cíclico o un compuesto peptidomimético de la invención que inhiba la actividad mediada por Trk. La cantidad de compuesto peptídico cíclico o peptidomimético que se ponga en contacto con la célula será una cantidad que inhiba efectivamente la actividad mediada por el receptor Trk. En otra modalidad, la invención proporciona métodos para mejorar la actividad mediada por Trk. Esos métodos implican poner en contacto una célula (in vi tro o in vivo) con una cantidad del compuesto peptídico cíclico o peptidomimético de la invención que mejore la actividad mediada por el Trk. La cantidad del compuesto peptídico cíclico o peptidomimético que se ponga en contacto con la célula deberá ser una cantidad que mejore efectivamente la actividad mediada por el receptor Trk. Los ejemplos de actividades mediadas por Trk que pueden ser moduladas (por ejemplo, mejoradas o inhibidas) por esos métodos incluyen: crecimiento y sobrevivencia neuronal, crecimiento axonal, emergencia de neuritas y plasticidad sináptica así como otros procesos de crecimiento y/o reparación del sistema nervioso central (SNC) . En consecuencia, la invención proporciona adicionalmente métodos para mejorar el crecimiento o reparación del sistema nervioso central en un individuo. Esos métodos implican administrar al individuo una cantidad de un compuesto peptídico cíclico o un peptidomimético de la invención que mejore la actividad mediada por el Trk. La cantidad de compuesto peptídico cíclico o peptidomimético administrado deberá ser una cantidad que mejore efectivamente el crecimiento o reparación del SNC. La invención proporciona adicionalmente métodos que usan agonistas y antagonistas de Trk para modular respuestas que inhiben el crecimiento y reparación del SNC, incluyendo respuestas que normalmente inhiben procesos como el crecimiento neuronal, sobrevivencia neuronal, crecimiento axonal, emergencia de neuritas y plasticidad sináptica. En particular, los agonistas y antagonistas de Trk de la invención deben ser usados para modular factores inhibidores y/o señales inhibidoras generadas por esos factores. Los ejemplos incluyen factores asociados con la mielina, incluyendo la glicoproteína asociada con la mielina (MAG) , Nogo-A y la glicoproteína de la mielina oligodendrocítica. En general, la invención proporciona métodos de uso de agonistas y/o antagonistas de Trk para modular una respuesta inhibidora de SNC mediada por una cascada de señales con uno o más componentes que son en sí modulados por un factor o factores implicados en la señalización por un receptor Trk. Esos incluyen, por ejemplo, componentes como Rho que son modulados por proteína cinasa A (PKA) y/o por fosfoinositido-3 cinasa (PI3K) . En modalidades preferidas, por lo tanto, la invención proporciona métodos para reducir esas respuestas "inhibidoras del SNC" poniendo en contacto una célula con agonistas de Trk (por ejemplo, un péptido cíclico o peptidomimético) de la invención en una cantidad que sea efectiva para reducir la respuesta inhibidora del SNC. La invención también proporciona métodos para reducir una respuesta inhibidora del SNC en un individuo, administrando al individuo una cantidad de un agonista de Trk (por ejemplo, un péptido cíclico o un peptidomimético) de la invención en una cantidad que reduzca efectivamente la respuesta inhibidora del SNC. En otra modalidad más, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que pueden ser usadas en métodos terapéuticos, como aquellos descritos anteriormente. Esas composiciones farmacéuticas comprenden una cantidad de un compuesto peptídico cíclico o peptidomimético de la invención, junto con uno o más vehículos, diluentes o excipientes que sean farmacéutica y/o fisiológicamente aceptables . Además, la presente invención se basa en el descubrimiento de que los agentes que interfieren con la unión de las neurotrofinas al receptor p75 promueven el crecimiento neuronal en el SNC en un ambiente inhibidor. Los receptores Trk y sus ligandos (es decir, neurotrofinas como NGF, BDNF, NT-3, NT-4 y NT-5) están asociados con el crecimiento y reparación de neuronas del SNC. Por lo tanto, cuando las neurotrofinas se unen a un receptor Trk activado, la actividad del Trk activa las cascadas de señalización que promueven el crecimiento neuronal. Sin embargo, el receptor p75 se une a las neurotrofinas con baja afinidad, y cuando el receptor p75 se acopla a un complejo inhibidor, esta interacción compromete la capacidad de las neurotrofinas para promover el crecimiento de las neuronas del SNC. La invención proporciona métodos para promover el crecimiento de las neuronas del SNC usando un agente de unión del receptor p75, que interfiere con la unión de una neurotrofina al receptor p75. De acuerdo a la presente invención, se proporciona un método para promover el crecimiento de las neuronas del SNC en un ambiente inhibidor, el cual comprende administrar a un individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de unión del receptor p75. En una modalidad, el agente de unión del receptor p75 incluye un motivo de unión de neurotrofina o un peptidomimético del mismo. En una modalidad particular, el agente de unión del receptor p75 comprende un péptido cíclico o peptidomimético que comprende, dentro de un anillo cíclico del mismo, la secuencia de aminoácidos Thr-Asp-Ile-Lys-Gly-Lys-Glu (TDIKGKE) (SEQ ID NO : 42) . Un agente de unión del receptor p75 preferido es N-Ac-CTDIKGKEC-NH2 (SEQ ID NO: 43) . El individuo es preferiblemente un mamífero y de manera más preferible un humano. La presente invención proporciona métodos para promover el crecimiento de las neuronas del SNC en un ambiente inhibidor, el cual comprende administrar a un individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de unión del receptor p75 en combinación con una neurotrofina. En una modalidad, la neurotrofina es seleccionada del grupo que consiste de NGF, BDNF, NT-3, NT-4 y NT-5. En una modalidad más, el agente de unión del receptor p75 es administrado en una cantidad de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100 veces mayor que la neurotrofina. En un aspecto de la invención, el agente de unión del receptor p75 es una neurotrofina que interfiere con otra neurotrofina diferente por la unión al receptor p75, pero no interfiere con la unión de la otra neurotrofina diferente a un receptor Trk expresado sobre una neurona dañada. En un aspecto particular, el agente de unión del receptor p75 es NGF y la neurotrofina es BDNF donde el NGF es administrado en una cantidad de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100 veces mayor que el BDNF. El individuo es preferiblemente un mamífero, y de manera más preferible, un humano.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos del BDNF de NT (SEQ ID NO: 19), NT4 (SEQ ID NO: 20), NT3 (SEQ ID NO: 21), y NGF (SEQ ID NO: 22). Las cadenas maduras son denotadas por letras en negrillas y el motivo de RGE está subrayado. Las Figuras 2A-2C muestran una alineación de las secuencias de aminoácidos de longitud completa de receptores TrkA (SEQ ID NO: 23), TrkB (SEQ ID NO: 24) y TrkC (SEQ ID NO: 25) humanos. Las secuencias de consenso para los receptores están encasilladas, y los límites de los diferentes dominios de los receptores están marcados con líneas verticales . Véase también, la Patente Estadounidense No. 5,844,092 de Presta et al . Las Figuras 3A-3B ilustran modificaciones estructurales representativas que pueden estar presentes dentro de un peptidomimético. Véase también, las Figuras 4A y 4B en la WO 01/53331. La Figura 4 ilustra aminoácidos y dipéptidos inusuales representativos, sustitutos, que pueden ser incorporados en un peptidomimético. Véase también, la Figura 5 en la WO 01/53331. La Figura 5 ilustra imitadores de la estructura secundaria representativa que puedan ser incorporados en un peptidomimético. Véase también, la Figura 6 en la WO 01/53331. Las Figuras 6A-6C ilustran el análisis de una estructura cristalina de NT/Trk para identificar regiones lineales del ligando que interactúan con el receptor de Trk. La Figura 6A muestra una imagen de un listón de la estructura cristalina (reportada por Banfield et al . , Structure (Camb) 2001, 9:1191-1199) de un dímero de NT-4 (denotado como cadena ? y a2) en un complejo con dos dominios de Ig próximos a la membrana del receptor TrkB (denotado como cadena bi y b2) . La Figura 6B muestra los resultados del examen de esta estructura cristalina (línea continua) y la estructura cristalina de NGF/TrkA (reportada por Wiesman et al . , Nature 1999, 401:184-188) (línea punteada) para secuencias peptídicas lineales (LIP) que hacen contacto entre las cadenas ax y b . La Figura 6C muestra los resultados del examen de las estructuras cristalinas de NGF (línea punteada) y NT-4 (línea continua) para LIP que hacen contacto entre las cadenas ax y bx. Las Figuras 7A-7D muestran datos de experimentos donde fueron cultivadas neuronas cerebelares sobre monocapas de células 3T3 en medios de control o en medios suplementados con NT-4 o BDNF en presencia de varios péptidos durante 18 horas antes de ser fijadas y teñidas por GAP-43. Se determinó que la longitud media de la neurita más larga fue de entre aproximadamente 100-120 neuronas bajo cada condición de cultivo . La Figura 7A muestra datos de experimentos que prueban los efectos de varias concentraciones de NT-4 y BDNF sobre la emergencia de neuritas . La Figura 7B muestra datos de experimentos que prueban los efectos del incremento de las concentraciones de péptidos cíclicos N-Ac-CRGEC-NH2 en medios de control y medios que contienen 5 ng/ml de BDNF o 5 ng/ml de NT-4, de acuerdo a lo indicado. La Figura 7C muestra el dato de experimentos que prueban los efectos del péptido cíclico N-Ac-CSRRGEC-NH2 (SEQ ID NO: 26) derivado de NT- , el péptido cíclico N-Ac-CSHRGEC-NH2 derivado de NT-3 y el péptido cíclico N-Ac-CFHRGEC-NH2 derivado de NGF en neuronas cerebelares cultivadas con 5 ng/ml de BDNF. La Figura 7D muestra datos de experimentos idénticos a los que se muestran en la Figura 7C, pero donde las neuronas cerebelares se cultivaron con 5 ng/ml NT-4. La Figura 8 ilustra los resultados de experimentos donde fueron cultivadas neuronas cerebelares sobre monocapas de células 3T3 en medios de control o en medios suplementados con NT-4, BDNF, FGF2 (todos a 5 ng/ml), con el agonista del receptor CGl WIN55, 2122-2 (0.2 µM) o sobre monocapas de células 3T3 que expresan N-caderina (NCAD) transfectada sobre su superficie celular. Los experimentos fueron efectuados, y los datos graficados, en presencia y ausencia de: (a) el péptido cíclico N-Ac-CRGEC-NH2 a 440 µM; (b) el péptido cíclico N-Ac-CSRRGEC-NH2 a 125 µM; y (c) el péptido lineal N- AC-SRRGELA-NH2 (SEQ ID NO: 27) a 125 µM. Las Figuras 9A-9C muestran estructuras modeladas del péptido BAG- La Figura 9A muestra la estructura nativa del motivo SRRGELA de un monómero del dímero de NT-4 en la estructura cristalina de NT-4/TrkB. La estructura nativa del motivo ASRRGEL (SEQ ID NO: 28) del monómero de NT-4 original en esa estructura cristalina se muestra en la Figura 9C. Una estructura modelada del péptido BAG N-Ac-CSRRGELAASRRGELC-NH2 que incorpora esos motivos "repetidos en serie" se muestra en la Figura 9B. Las Figuras 10A-10B muestran los resultados de experimentos de emergencia de neuritas donde fueron cultivadas neuronas cerebelares en medios suplementados con una gama de concentraciones del péptido BAG N-Ac-CSRRGELAASRRGELC-NH2. La Figura 10A muestra el valor medio de las longitudes absolutas de las neuritas determinadas de 100-120 neuronas muestreadas en un solo experimento. La Figura 10B muestra un histograma que compara los efectos del péptido BAG ( 6 µM) con la respuesta para establecer agentes promotores del crecimiento, incluyendo NT-4, BDNF, y FGF2 (todos a 5 ng/ml) de acuerdo a lo indicado. La Figura 11 muestra los resultados de experimentos de emergencia de neuritas donde fueron cultivadas neuronas cerebelares en medios de control o en medios suplementados con: (a) el péptido BAG N-Ac-CSRRGELAASRRGELC-NH2 a 6 µM; (b) el péptido antagonista de TrkB N-Ac-CSSRGEC-NH2 (SEQ ID NO: 29) a 125 µM; (c) el inhibidor de tirosina cinasa específico de Trk K252a a 100 nM; o la versión lineal del péptido antagonista de TrkB N-Ac-SRRGELA-NH2 a 125 µM, de acuerdo a lo indicado. La Figura 12 muestra una gráfica de barras que exhibe los resultados de experimentos de emergencia de neuritas que prueban los efectos de varios agentes . En particular, se cultivaron neuronas cerebelares sobre monocapas de células 3T3 que expresan N-caderina en medios suplementados con un constructo o plásmido recombinante de fusión de MAG-Fc soluble a concentraciones finales de 0, 5 o 25 µg/ml (como se indica debajo de cada barra en la gráfica) . Los experimentos se efectuaron en medios control (es decir, en medios suplementados con MAG-Fc únicamente) y en medios suplementados adicionalmente con el inhibidor Y27632 de cinasa Rho (concentración final de 10 µM) polipéptido BAG (concentración final de 6 µM) o BDNF (concentración final de 5 ng/ml) . Los cultivos fueron mantenidos durante 22 horas antes de ser fijados y teñidos para GAP-43. La longitud media de la neurita más larga fue determinada a partir de mediciones de entre aproximadamente 100-120 neuronas bajo cada condición de cultivo. Cada columna de la gráfica describe los resultados reunidos de un número de experimentos independientes (indicados encima de la columna) , y las barras indican el error estándar de la media (EEM) . La Figura 13 ilustra una curva de respuesta a la dosis para el polipéptido BAG sobre la respuesta a MAG-Fc en neuronas cultivadas. En particular, cada punto de datos indica la longitud media medida de aproximadamente 120-150 neuronas cuando se cultivaron sobre monocapas de células 3T3 que expresan N-caderina en medios suplementados con MAG-Fc (concentración final de 25 µg/ml) y polipéptido BAG a la concentración final indicada sobre el eje horizontal. Cada punto indica los datos de un solo experimento representativo y las barras sobre cada punto indican el EEM. La Figura 14 muestra una gráfica de barras que describe los resultados de experimentos que prueban los efectos del polipéptido BAG y el BDNF sobre la emergencia o crecimiento de neuritas en neuronas cerebelares que fueron cultivadas sobre monocapas de células 3T3 que no expresan N-caderina y en medios suplementados con una concentración final de 0 ó 25 µg/ml de MAG-Fc (como se indica en la Figura). Los experimentos se efectuaron en medios de control (es decir, en medios suplementados con MAG-Fc únicamente) y en medios suplementados adicionalmente con polipéptido BAG (concentración final de 6 µM) o BDNF (concentración final de ng/ml) . Los cultivos fueron mantenidos durante 22 horas antes de ser fijados y teñidos para GAP-43. La longitud media de la neurita más larga fue determinada de mediciones de entre aproximadamente 100-120 neuronas bajo cada condición de cultivo. Cada columna de la gráfica describe los resultados reunidos de tres experimentos independientes, y las barras indican el error estándar de la media (EEM) . La Figura 15 muestra una gráfica de barras que describen los resultados de experimentos que prueban el efecto del polipéptido BAG sobre la emergencia de neuritas en neuronas cerebelares que fueron cultivadas sobre monocapas de células 3T3 que expresan N-caderina en: (C) medios de control sin suplementos; (1) medios suplementados con anticuerpo monoclonal para GTlb (concentración final de 20 µg/ml) ; o (2) medios suplementados con ambos del anticuerpo GTlb (concentración final de 20 µg/ml) y polipéptido BAG (concentración final de 6 µM) . Los cultivos fueron mantenidos durante 22 horas antes de ser fijados y teñidos para GAP-43. La longitud media de la neurita más larga fue determinada de entre aproximadamente 100 y 120 neuronas bajo condición de cultivo . Cada columna en la Figura indica los resultados reunidos de entre 7 y 10 experimentos independientes, y las barras sobre cada columna indican el EEM. La Figura 16 muestra una gráfica de barras que describe los resultados de experimentos que prueban los efectos de varios agentes sobre la emergencia de neuritas en neuronas cerebelares que fueron cultivadas sobre monocapas de células 3T3 que expresan N-caderina ya sea en medios de control sin suplementos (columna C) o en medios pretratados con anticuerpo para p75NTR (columnas 1-4) . Esas neuronas tratadas con anticuerpo fueron cultivadas después del tratamiento en: (1) medios de control sin suplementos; (2) el inhibidor Y27632 de cinasa Rho (concentración final de 10 µM) ; (3) polipéptido BAG (concentración final de 6 µM) ; o (4) neurotrofina BDNF (concentración final de 5 ng/ml) . Los cultivos fueron mantenidos durante 22 horas antes de ser fijados y teñidos para GAP-43. La longitud media de la neurita más larga fue determinada de entre aproximadamente 100 y 120 neuronas bajo cada condición de cultivo. Cada columna en la Figura indica los resultados reunidos del número de experimentos independientes indicados encima de esta, y las barras sobre cada columna indican el EEM. La Figura 17 muestra una gráfica de barras que describe los resultados de experimentos que prueban los efectos de varios inhibidores de cinasa sobre la emergencia de neuritas en neuronas cerebelares cultivadas bajo diferentes condiciones de cultivo. En particular, las neuronas cerebelares fueron cultivadas sobre monocapas de células 3T3 en medios suplementados con polipéptido BAG a una concentración final de 6 µM (barras blancas) , neurotrofina BDNF a una concentración final de 5 ng/ml (barras rayadas) o FGF2 a una concentración final de 5 ng/ml (barras negras) . Para probar los efectos de los diferentes agentes, los experimentos se efectuaron como se indica en la Figura usando medios de control que no contenían suplementos adicionales, o usando medios suplementados adicionalmente con K252a (concentración final de 100 nM) , un inhibidor de PKA (KT5720 a una concentración final de 200 nM o H-89 a una concentración final de 400 nM) , o un inhibidor de PI3K (Wortmannina o Ly294002, cada una a una concentración final de 10 µM) . los cultivos fueron mantenidos durante 18 horas antes de ser fijados y teñidos para GAP-43, y la longitud media de la neurita más larga fue determinada de entre aproximadamente 100 y 120 neuronas bajo cada condición de cultivo. Los datos son los reunidos de los resultados obtenidos con cada uno de los inhibidores de PKA y cada uno de los inhibidores de PI3K (los cuales produjeron los mismos resultados) . Cada columna en la Figura indica los resultados reunidos de al menos tres experimentos dependientes, y las barras sobre cada columna indican el EEM. Las Figuras 18A-18B muestran gráficas que describen los resultados de experimentos que prueban los efectos de la emergencia o crecimiento de neuritas en neuronas cerebelares que fueron cultivadas en un "ambiente inhibidor" de pozos recubiertos con polilisina a 17 µg/ml en agua destilada (dH0) ; una mezcla de anti-lgG humana de cabra (específica para Fc) y fibronectina (ambas a 10 µg/ml en DMEM) ; y MAG-Fc a 0.25 µg/ml en DMEM/10% de FCS. Los cultivos fueron mantenidos durante 27 horas antes de ser fijados y teñidos para GAP- 3. la Figura 18A muestra una curva de dosis-respuesta de la longitud media de la neurita de neuronas cerebelares que crecieron en presencia de hriBG2, hBAG2 o riBAG. La Figura 18B muestra una gráfica de barras que describe la longitud media de la neurita de neuronas cerebelares que crecieron en presencia de BDNF, BAG, hriBAG2, hBAG2 o riBAG. La Figura 19 muestra una gráfica de barras que describe los resultados de experimentos de emergencia de nueritas que prueba los efectos de varios agentes en un ambiente inhibidor. En particular, las neuronas cerebelares fueron cultivadas sobre monocapas de células 3T3 que expresan N-caderina en medios suplementados con un constructo o plásmido recombinante de fusión de MAG-Fc soluble a una concentración final de 25 µg/ml. El cultivo fue suplementado además con BDNF (1 ng/ml) , NGF (10 ng/ml o 100 ng/ml) , BDNF (1 ng/ml) en combinación con NGF (10 ng/ml o 100 ng/ml) , una monocapa restringida del motivo de unión de la espira 1 del NGF (N-Ac-CTDIKGKEC-NH2) (SEQ ID NO: 43) a 100 µg/ml, o el péptido de la espira 1 del NGF (a 100 µg/ml) en combinación con BDNF (a 1 ng/ml) . Los cultivos fueron mantenidos durante 23 horas antes de ser fijados y teñidos para GAP-43. La longitud media de la neurita más larga fue determinada a partir de mediciones de entre aproximadamente 100-120 neuronas bajo cada condición de cultivo. Cada columna de la gráfica describe los resultados reunidos de un número de experimentos independientes (indicados encima de la columna) , y las barras indican el error estándar de la media (EEM) . •5 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se hizo notar anteriormente, la presente invención proporciona compuestos, incluyendo péptidos y peptidomiméticos, que modulan (por ejemplo, incrementan o 0 hacen disminuir) la actividad mediada por receptores Trk como el TrkA, TrkB y TrkC. Esos compuestos son referidos generalmente aquí como compuestos moduladores del receptor Trk o "moduladores de Trk" . Los moduladores de Trk de la invención son útiles, 5 por ejemplo, para modular procesos como el crecimiento y sobrevivencia neuronal, crecimiento axonal, emergencia o crecimiento de neuritas, plasticidad sináptica y otros procesos que son mediados, al menos en parte, por un receptor Trk. Esos usos incluyen métodos terapéuticos que pueden 0 implicar la modulación del crecimiento y reparación del sistema nervioso central in vitro (por ejemplo, en un cultivo celular) o ip vivo (como en un paciente u otro individuo) . Los moduladores Trk de la invención por lo tanto tienen utilidad en el tratamiento de enfermedades como la apoplejía, 5 enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, trauma de cabeza, daño de la médula espinal, y epilepsia por nombrar unas cuantas . Las solicitantes han descubierto que una interacción clave entre los receptores Trk y sus ligandos de neurotrofina ocurre a través de un motivo de secuencia lineal corta conservado de 3 aminoácidos residuales Arg-Gly-Glu (es decir, "RGE" en el código con una sola letra para aminoácidos) encontrados en el N terminal de secuencias de aminoácidos de neurotrofina madura. El motivo RGE está presente en todas las neurotrofinas y, cuando se une al receptor Trk, existe como la mitad de una hélice en la que se considera una espira apretada . Las solicitantes también han descubierto que los péptidos restringidos apropiadamente (por ejemplo, péptidos cíclicos) del motivo RGE lineal pequeño tiene una alta superposición estructural con la estructura nativa de la NT y son capaces de funcionar como antagonistas del receptor Trk. De manera similar, también se espera que los compuestos peptidomiméticos que tienen una alta superposición estructural con esos péptidos RGE restringidos tengan una alta superposición estructural con la estructura de la NT nativa y por lo tanto, también pueden funcionar como antagonistas del receptor Trk. Como se hizo notar anteriormente, el motivo RGE está conservado entre todas las neurotrofinas, y las interacciones con este motivo son importantes para la unión de aquellas neurotrofinas a sus receptores Trk respectivos . En consecuencia, los péptidos y peptidomiméticos restringidos que comprenden el motivo de RGE son útiles como antagonistas de una amplia variedad de receptores Trk, incluyendo TrkA, TrkB y TrkC. Sin embargo, los moduladores Trk de la presente invención también pueden ser dirigidos a moduladores Trk específicos, seleccionando las secuencias de aminoácidos flanqueantes de un ligando de NT que se unen preferiblemente al receptor Trk deseado. En los compuestos antagonistas de Trk preferidos (es decir, compuestos moduladores de Trk que inhiben la actividad mediada por el receptor Trk) , esos residuos flanqueantes preferiblemente fluctúan en la longitud de no más de aproximadamente 0 a 10 aminoácidos residuales de longitud, con tamaños de entre aproximadamente 2-5 o 2-3 aminoácidos residuales siendo particularmente preferidos. Además, el tamaño del anillo del péptido cíclico (o la estructura peptidomimética correspondiente) preferiblemente fluctúa de solo aproximadamente 4 a 15 aminoácidos residuales, con tamaños de aproximadamente 5 a 10 aminoácidos residuales siendo particularmente preferidos. Las solicitantes también han determinado que, en estructuras cristalinas de dímeros de NT en complejo con sus dominios de unión del receptor Trk, el motivo de RGE corre antiparalelo a sí mismo en el dímero de NT. Es decir, que la hélice de RGE en la primera molécula de NT está alineada con y en una orientación antiparalela a la hélice de RGE en la segunda molécula de NT en ese dímero. Véanse, en particular,, las Figuras 6A-6C. Las solicitantes han descubierto además que, cuando un péptido o peptidomimético repetido en serie o en cascada del motivo de RGE está restringido apropiadamente (como en un péptido cíclico o peptidomimético) , adopta la misma conformación de alineación antiparalela y tiene una alta superposición estructural con la estructura de la NT nativa. Esos péptidos cíclicos y peptidomiméticos de RGE "repetidos en serie" son, de manera sorprendente, capaces de funcionar como antagonistas del receptor Trk (es decir, que son capaces de incrementar la actividad mediada por un receptor Trk) . Por lo tanto, esos compuestos también se encuentran entre los compuestos moduladores de Trk de la invención. Como con los antagonistas de RGE, descritos, supra, los péptidos y peptidomiméticos restringidos que comprenden una repetición en serie del motivo de RGE son útiles como antagonistas para una amplia variedad de receptores de Trk, incluyendo el TrkA, TrkB y TrkC. Sin embargo, los compuestos también pueden ser dirigidos a receptores de Trk específicos, por ejemplo, seleccionando secuencias de aminoácidos flanqueantes de un ligando de NT que se unan preferiblemente al receptor de Trk deseado. En los compuestos antagonistas de Trk preferidos (es decir, los compuestos moduladores de Trk que incrementan la actividad mediada por el receptor de Trk) esos residuos flanqueantes preferiblemente fluctúan en longitud de no más de aproximadamente 0 a 10 aminoácidos residuales de longitud, con tamaños de 2-5 o 2-3 siendo los más preferidos . Los péptidos cíclicos y peptidomiméticos repetidos en serie de la invención pueden, opcionalmente, contener aminoácidos residuales adicionales situados entre las dos repeticiones en serie del motivo y de RGE. Esos aminoácidos residuales adicionales funcionan por lo tanto como entidades (separadoras) para reunir los dos motivos RGE de tal manera que adopten la conformación de alineación antiparalela que tiene una alta superposición estructural con el motivo RGE en la estructura de la NT nativa. La identidad exacta de los aminoácidos residuales separadores no es importante y sus identidades pueden o no corresponder a identidades de aminoácidos residuales que flanquean al motivo RGE en una neurotrofina particular. Preferiblemente, la entidad separadora (si está presente) en un péptido cíclico o peptidomimético repetido en serie es corto, por ejemplo, de no más de 5 aminoácidos residuales de longitud, con entidades separadoras. de entre aproximadamente 0-3 aminoácidos residuales de longitud siendo las más preferidas. Las entidades separadoras particularmente preferidas son de solo aproximadamente 1 ó 2 aminoácidos residuales de longitud. El tamaño total de esos péptidos cíclicos y peptidomiméticos "repetidos en serie" es además, típicamente, de aproximadamente el doble que la de un péptido cíclico o peptidomimético antagonista de Trk de la inv nción. En consecuencia, los tamaños preferidos de los anillos peptídicos (o estructura peptidomimética correspondiente) son, de manera preferible, de aproximadamente 8 a 30 aminoácidos residuales de longitud, con los tamaños de aproximadamente 10 a 20 aminoácidos residuales de longitud siendo particularmente preferidos. Los péptidos cíclicos preferidos que comprenden el motivo de RGE y/o la repetición en serie del mismo son descritos en la Sección "Moduladores del receptor TRK: Péptidos Cíclicos", infra . La sección "Farmacóforos del receptor TRK" describe entonces los métodos experimentales de rutina mediante los cuales un experto en la técnica puede determinar, por ejemplo, por cristalografía de rayos X o espectroscopia de RMN, las estructuras "farmacóforas" tridimensionales para esos y otros péptidos cíclicos, y métodos de uso de esas estructuras farmacóforas para diseñar compuestos peptidomiméticos apropiados como se prevé en la Sección "Moduladores del Receptor TRK: Peptidomiméticos", infra, junto con modificaciones peptidomiméticas ejemplares. Modificaciones aún adicionales a los compuestos moduladores de Trk de la invención se describen en la Sección "Agentes que modulan TRK" , incluyendo formulaciones farmacéuticas y usos medicinales . La Sección "Evaluación de la Actividad del Modulador de TRK" describe ensayos de rutina mediante los cuales un experto en la técnica puede modificar la actividad del modulador de Trk de un compuesto, como un compuesto peptidomimético. En la Sección "Usos de Moduladores del Receptor de TRK" describe entonces ciertos usos ejemplares preferidos de esos compuestos en métodos para modular las actividades mediadas por Trk como la sobrevivencia neuronal, crecimiento axonal y plasticidad sináptica. Las formulaciones de moduladores de Trk (incluyendo formulaciones farmacéuticas) que son particularmente adecuadas para esos usos se proporcionan en la Sección "Moduladores del Receptor TRK: Formulaciones". La especificación concluye con una serie de ejemplos, en la Sección "Ejemplos", que demuestran ciertas modalidades ejemplares de la invención. La presente invención también proporciona métodos para la administración de un agente de unión del receptor de p75 a un individuo, donde el agente de unión del receptor de p75 interfiere con la unión de una neurotrofina a un receptor p75 acoplado en un complejo inhibidor y, de este modo, promueve la unión de la neurotrofina a un receptor Trk. Esos métodos son útiles en el tratamiento de condiciones donde las neuronas del SNC están dañadas o lesionadas, por ejemplo, enfermedades como la apoplejía, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, daño cerebral traumático y daño de la médula espinal . La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que agentes diseñados para interferir con la unión de la neurotrofina a un receptor p75 acoplado en un complejo inhibidor facilita la emergencia de neuritas del SNC mediada por neurotrofina . Como se describe en la sección de • ejemplos más adelante, los ensayos de emergencia de neuritas se efectuaron usando neuronas cerebelares de rata cultivadas en un ambiente inhibidor. Los medios del cultivo inhibidores fueron suplementados con NGF, NGF en combinación con BDNF, un monómero restringido de la primera espira de unión del NGF (N-Ac-CTDIKGKEC-NH2) (SEQ ID NO: 43), o el péptido de la espira 1 del NGF en combinación con BDNF. Los cultivos fueron mantenidos durante 23 horas, fijados, y teñidos para GAP-43. La longitud media de la neurita más larga fue entonces determinada a partir de 100-120 neuronas bajo cada condición de cultivo. Se encontró que el NGF solo y el monómero restringido solo no promueven la emergencia de neuritas, pero las combinaciones de NGF con BDNF en relaciones de 10:1 y 100:1 y el péptido de la espira 1 de NGF a 100 µg/ml con BDNF a 1 ng/ml promovió la emergencia de neuritas . Esos descubrimientos muestran que la administración de un agente de unión del receptor p75, el cual es una neurotrofina que no se une al receptor Trk expresado en combinación con otro, una neurotrofina diferente, la cual se une al receptor Trk expresado sobre las neuronas dañadas da como resultado el crecimiento de neuronas del SNC en un ambiente inhibidor. Aquí, la neurotrofina, que no se une a un receptor Trk expresado (es decir, un agente de unión del receptor p75) fue administrada en una cantidad de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100 veces mayor que la de la neurotrofina, la cual se une a un receptor Trk expresado (es decir, no a un agente de unión del receptor p75) . Esos resultados también muestran que la administración de un monómero restringido de la primera espira de unión del NGF, un agente de unión del receptor p75 no neurotrofínico, promueve el crecimiento de neuronas del SNC mediado por neurotrofina.

Definiciones Los siguientes términos definidos son usados a través de la presente especificación, y serán útiles para comprender el alcance y práctica de la presente invención. Como se usa aquí, "un ambiente inhibidor" significa un ambiente en el cual es inhibido el crecimiento de una neurona dañada o lesionada. Un ambiente inhibidor está presente en el medio que rodea a las neuronas dañadas o lesionadas. Las neuronas dañadas o lesionadas están presentes en condiciones, las cuales incluyen, por ejemplo, enfermedades y trastornos que están asociadas con daño a o funciones dañadas del SNC. Las condiciones ejemplares incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, apoplejía, daño cerebral traumático, y daño de la médula espinal. De manera alternativa, un ambiente inhibidor es un ambiente donde el receptor p75 está acoplado en un complejo inhibidor (es decir, que un receptor p75 está acoplado con una molécula que inhibe el receptor p75, por ejemplo, una molécula derivada de mielina, como la MAG o Nogo-A) , y su unión da como resultado la inhibición del crecimiento neuronal mediado por neurotrofinas) . El término "terapéuticamente efectiva" significa que la cantidad de un compuesto o composición farmacéutica es suficiente para dar como resultado una actividad deseada para la administración a un individuo que necesite de la misma. Preferiblemente, una cantidad terapéuticamente efectiva puede aliviar o prevenir un déficit clínicamente significativo en la actividad, función y respuesta del individuo. De manera alternativa, una cantidad terapéuticamente efectiva es suficiente para producir una mejora con una condición clínicamente significativa en el individuo. Por ejemplo, "terapéuticamente efectiva" significa una cantidad o dosis de un inhibidor del receptor p75 suficiente para promover el crecimiento de una neurona en el SNC en un ambiente inhibidor. Como se usa aquí, la frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son "generalmente consideradas como seguras" , por ejemplo, que son fisiológicamente tolerables y que típicamente no producen una reacción alérgica o adversa similar, como molestia gástrica, mareos y similares, cuando se administre a un humano. Preferiblemente, como se usa aquí, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno Federal o estatal listada en la farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea reconocida, de manera general, para usarse en animales, y particularmente en humanos. El término "portador" se refiere a un diluente, adyuvante, excipiente o vehículo con el cual el compuesto es administrado. Esos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, como agua y aceites, incluyendo aquellos de petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, como el aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite' mineral, aceite de ajonjolí y similares. El agua o soluciones salinas acuosas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol son empleadas preferiblemente como portadores, particularmente para soluciones inyectables . Los portadores farmacéuticos adecuados son descritos en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin.

Un "individuo" o "paciente" como se usa aquí es preferiblemente un mamífero, y de manera más preferible un humano, pero puede ser cualquier animal, incluyendo un animal de laboratorio en el contexto de un ensayo clínico o separación o experimento de actividad. De este modo, como puede ser fácilmente apreciado por un experto en la técnica, los métodos de la presente invención son particularmente adecuados para la administración a cualquier animal, particularmente un mamífero, e incluyendo, pero sin limitarse a animales domésticos, animales silvestres y animales de investigación .

MODULADORES DEL RECEPTOR TRK; PEPTIDOS CÍCLICOS El término "péptido cíclico" como se usa aquí, de refiere a un péptido o sal del mismo, que comprende: (1) un enlace covalente intramolecular entre dos residuos no adyacentes; y (2) al menos una secuencia de reconocimiento del receptor Trk RGE (es decir, Arg-Gly-Glu) dentro de un anillo cíclico del péptido cíclico. Debe comprenderse que los péptidos preferidos de la invención que funcionan como agonistas o antagonistas del receptor Trk estarán restringidos, y en consecuencia, son preferiblemente péptidos cíclicos. Sin embargo, también son útiles péptidos no cíclicos o "lineales" (por ejemplo, como compuestos intermedios para producir los péptidos cíclicos de la invención) . En consecuencia, la versión no cíclica de los péptidos cíclicos descritos a través de esta solicitud también son consideradas parte de la presente invención. El enlace intramolecular puede ser un enlace de estructura principal a estructura principal, cadena lateral a estructura principal o cadena lateral a cadena lateral (es decir, que los grupos funcionales terminales de un péptido lineal o grupos funcionales de cadena lateral de un residuo terminal o interior pueden ser ligados para lograr la formación del ciclo) . Los enlaces intramoleculares preferidos incluyen, pero no se limitan a, enlaces disulfuro, amida y tioéter. Una variedad de medios para ciclizar polipéptidos son bien conocidos en la técnica, como lo son las muchas otras modificaciones que pueden ser hechas a esos péptidos. Para una discusión general, véanse las publicaciones de Patente Internacional WO 01/53331 y WO 98/02452. Esos enlaces cíclicos y otras modificaciones también pueden ser aplicados a los péptidos cíclicos y compuestos derivados de esta invención. Por conveniencia, los péptidos cíclicos de la invención son frecuentemente ilustrados en esta solicitud mostrando enlaces cíclicos particulares, los cuales pueden o no ser los preferidos. Sin embargo, otras modalidades de esos péptidos cíclicos que comprenden enlaces cíclicos adicionales y/o alternativos serán evidentes a aquellos expertos en la técnica y por lo tanto se consideran parte de esta invención.

Dentro de ciertas modalidades un péptido cíclico de la invención preferiblemente comprende un grupo N-acetilo (es decir, que un grupo amino presente sobre el residuo amino terminal del péptido es acetilado, preferiblemente antes de la ciclización) . De manera alternativa, un péptido cíclico de la invención puede comprender un grupo N-formilo (es decir, que el grupo amino presente sobre el residuo amino terminal del péptido es formilado, preferiblemente antes de la ciclización) . De manera alternativa, el grupo amino presente sobre el residuo amino terminal del péptido puede ser mesitilado; de nuevo, preferiblemente antes de la ciclización. La presencia de esos grupos terminales puede, por ejemplo, mejorar la actividad o estabilidad del péptido cíclico en ciertas aplicaciones. Además, dentro de ciertas modalidades un péptido cíclico de la invención puede comprender un grupo C-amida . En ciertas modalidades, los péptidos cíclicos preferidos de la presente invención satisfacen la fórmula general : (Ti)—(X?)-Arg-Gly-Glu—(X2)—(Y2) (Fórmula I) donde Yi y Y2 son aminoácidos residuales cuyas identidades son seleccionadas independientemente y que tienen un enlace covalente entre los residuos Yi y Y2. Los elementos Xi y X2 son opcionales y, si están presentes, son seleccionados independientemente de los aminoácidos residuales y combinaciones de los mismos que están ligados por enlaces peptídicos. En consecuencia, Xx o X2 o ambos de x o X2 si están presentes, pueden ser un solo aminoácido residual, o de manera alternativa, pueden ser cada uno una secuencia que comprende una pluralidad de aminoácidos residuales ligados por enlaces peptídicos. En modalidades preferidas, un péptido cíclico que satisfaga la Fórmula I, anterior, modulará una o más actividades mediadas por el receptor Trk. Por ejemplo, en ciertas modalidades preferidas un péptido que satisfaga la Fórmula I no inhibirá una o más actividades mediadas por el receptor Trk y, por lo tanto, será un antagonista de Trk. En otras modalidades, el péptido que satisfaga la Fórmula I incrementará una o más actividades mediadas por el receptor -Trk, y por lo tanto será un agonista de Trk. Además de las secuencias de consenso de RGE, los péptidos cíclicos de la invención generalmente comprenden al menos un residuo adicional dentro del anillo cíclico, de modo que, preferiblemente al menos uno de Xi o X2 en la Fórmula I está presente. Generalmente, el tamaño de Xx y/o X2 dependerá de la actividad deseada del péptido cíclico. Por ejemplo, donde se desee un péptido cíclico que sea antagonista de Trk, se prefieren secuencias peptídicas más cortas. En consecuencia, en esas modalidades, Xx y/o X son cada uno, de manera preferible de entre 0 y aproximadamente 10 aminoácidos de longitud con tamaños de aproximadamente 1, 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos residuales siendo particularmente preferidos. Además, en esas modalidades las longitudes de Xx y/o X2 son también seleccionadas preferiblemente de modo que el tamaño del anillo del péptido cíclico fluctúe de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 15 aminoácidos residuales, y es de manera preferible de entre aproximadamente 5-10 aminoácidos residuales de longitud. Los tamaños de los anillos peptídicos de aproximadamente 5-7 aminoácidos residuales de longitud son particularmente preferidos. Esos residuos adicionales (es decir, Xx y/o X2 en la Fórmula I, supra) pueden estar presentes sobre el lado N-terminal o C-terminal de la secuencia de RGE, o pueden estar presentes sobre ambos lados de la secuencia de RGE. En péptidos cíclicos preferidos de la invención, los residuos adicionales son derivados de secuencias que flanquean a la secuencia de RGE dentro de una o más neurotrofinas naturales (por ejemplo, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, NT-5 y NT-4/5) con o sin sustituciones de aminoácidos y/u otras modificaciones. En particular, la presencia de secuencias flanqueantes de una neurotrofina puede ayudar a un péptido cíclico para un receptor Trk particular de interés. En consecuencia, en modalidades donde se desee un antagonista para un receptor Trk particular, un péptido cíclico de la invención puede comprender aminoácidos residuales que flanqueen al N-terminal, C-terminal o ambos lados de la secuencia de RGE que sean derivados de las secuencias flanqueantes en una neurotrofina que se una preferiblemente al receptor Trk dirigido o blanco. Como un ejemplo, y no a manera de limitación, la Tabla I, infra, lista ciertos péptidos cíclicos preferidos que comprenden aminoácidos residuales adicionales derivados de neurotrofinas particulares cuyas identidades también son indicadas en la Tabla. La columna de la derecha en la Tabla I también indica un receptor Trk al cual se une preferiblemente la neurotrofina (o, más bien, se une con una alta afinidad de unión) . En consecuencia, cada péptido cíclico listado en la Tabla I, puede, en una modalidad, ser usado para inhibir el receptor Trk particular indicado a un lado de este, en la columna de la derecha de la Tabla I . Aquellos expertos en la técnica apreciarán, sin embargo, que existe alguna superposición en la especificidad de unión de los ligandos de neurotrofina diferentes para varios receptores Trk. En consecuencia, los péptidos cíclicos listados en la Tabla I también pueden ser usados como antagonistas de esos receptores Trk. Como un ejemplo particular, y no a manera de limitación, se demuestra en los ejemplos, infra, que el péptido cíclico N-Ac-CSRRGEC-NH2, el cual contiene residuos adicionales de la neurotrofina NT-4, es un antagonista de TrkB más potente que los péptidos N-Ac-CSHRGEC-NH2 y N-Ac-CFRRGEC-NH2, péptidos equivalentes diseñados con residuos adicionales de las neurotrofinas NT-3 y NGF, respectivamente.

TABLA I: ANTAGONISTAS DE TRK Fórmula del Péptido NT Trk-R (Y,)—Ser—Arg—Arg—Gly—Glu—(Y2) NT-4 TrkB (Y —Ala-Arg—Arg—Gly—Glu—(Y2) BDNF TrkB (Y,)—Phe—His-Arg—Gly-Glu—(Y2) NGF TrkA (Y,)—Ser—His-Arg—Gly-Glu—(Y2) NT-3 TrkC Los ejemplos de secuencias de péptidos cíclicos particularmente preferidos de la invención, que son preferiblemente antagonistas de Trk, incluyen: CSRRGEC (SEQ ID NO: 1), N-Ac-CSRRGEC-NH2 (SEQ ID NO: 2), CARRGEC (SEQ ID NO: 3), N-Ac-CARRGEC-NH2 (SEQ ID NO: 4), CFHRGEC (SEQ ID NO: 5), N-Ac-CFHRGEC-NH2 (SEQ ID NO : 6), CSHRGEC (SEQ ID NO: 7), N-Ac-CFHRGE-NH2 (SEQ ID NO : 8), CRGEC (SEQ ID NO: 9), y N-Ac-CRGEC-NH2 (SEQ ID NO: 10) . La porción subrayada de cada secuencia de aminoácidos anterior indica la porción del péptido que se ciclizó. "N-Ac" denota un grupo amino N-terminal acetilado y "NH2" denota un grupo amida C-terminal. Dentro de ciertas modalidades, los péptidos cíclicos relativamente pequeños de la invención que no contienen secuencias significativas flanqueando la secuencia de consenso de RGE son particularmente preferidos. Esos péptidos pueden o no contener un grupo N-acetilo y pueden o no contener un grupo C-amida. Los ejemplos de péptidos cíclicos pequeños, preferidos de. la invención incluyen: N-Ac-CRGEC-NH2 (SEQ ID NO:10), N-Ac-KRGED-NH2 (SEQ ID N0:11), H-C(O) -CRGEC-NH2 (SEQ ID NO: 12), CH3-S02-NH-CRGEC-NH2 (SEQ ID NO: 13), N-Ac-CRGEC-Y-NH2 (SEQ ID NO: 14), H-C (O) -CRGEC-Y-NH2 (SEQ ID NO: 15), y CH3-SQ2-NH-CRGEC-Y-NH2 (SEQ ID NO: 16), En otras modalidades de la invención, donde se desee un agonista de Trk, las secuencias peptídicas más largas son generalmente preferidas. En particular, los péptidos cíclicos preferidos de la invención que son agonistas de Trk comprenden al menos una "repetición en serie" del motivo de RGE. En consecuencia, donde esos péptidos cíclicos satisfacen la formula I, supra, al menos uno de Xx y X2 estará presente y comprenden una segunda secuencia de RGE. De manera más especifica, esos péptidos cíclicos de la invención preferiblemente satisfacen la siguiente fórmula general: (Y,)—(Z,)—Arg-Gly-Glu—(Z0)-Arg-Gly-Glu—(Z2)—(Y2) (Fórmula II) Como en la fórmula I, Yx y Y2 son aminoácidos residuales cuyas identidades son seleccionadas independientemente y que tienen un enlace covalente entre los residuos Yi y Y2. Los elementos Zx y Z2 son opcionales, y si están presentes, son seleccionados independientemente de los aminoácidos residuales y combinaciones de los mismos que están ligados por enlaces peptídicos. El elemento Z0 también es opcional, y si está presente también es un aminoácido residual o alguna combinación de los mismos, ligados por enlaces peptídicos. En consecuencia, Zi, Z , Z0 o cualquier combinación de los mismos, si está presente, pueden ser cada uno un aminoácido residual individual o, de manera alternativa, pueden cada uno ser una secuencia que comprende una pluralidad de aminoácidos residuales ligados por enlaces peptídicos . Además de la repetición en serie de la secuencia de consenso de RGE, los péptidos cíclicos de la invención generalmente comprenden residuos adicionales dentro del anillo cíclico de modo que, preferiblemente, al menos uno de Z?,Z2 y/o Z0 está presente. En modalidades donde se desee un péptido cíclico que sea agonista de Trk, Z?,Z2y/o Z0 son cada uno, de manera preferible de no más de aproximadamente diez aminoácidos residuales de longitud, y de manera más preferible son cada uno de solo 1, 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos residuales de longitud. Además las longitudes de ZX,Z2 y/o Z0 son seleccionadas, preferiblemente, de modo que el tamaño del anillo del péptido cíclico fluctúe de aproximadamente 8-50 aminoácidos residuales, y de manera más preferible de aproximadamente 8-25 o de aproximadamente 15-20 aminoácidos residuales . Como con los péptidos cíclicos de Fórmula I, en los péptidos cíclicos preferidos de Formula II, los residuos adicionales (es decir ZX,Z2 y/o Z0 ) pueden ser derivados de secuencias que flanquean a la secuencia de RGE dentro de una o más neurotrofinas naturales (por ejemplo, NGF, BDNF, NT-3 , NT-4, NT-5 ó NT-4/5) , con o sin sustituciones de aminoácidos y/o otras modificaciones. En particular, la presencia de aminoácidos residuales flanqueantes de una neurotrofina particular puede ayudar a dirigir un péptido cíclico a un receptor Trk de interés. En consecuencia, en modalidades donde se desee un antagonista para un receptor Trk particular, un péptido cíclico de la invención puede comprender aminoácidos residuales que flanqueen al N-terminal y/o C-terminal de una o ambas secuencias de RGE, en serie y esas secuencias flanqueantes pueden ser derivadas de una neurotrofina que se una preferiblemente al receptor Trk elegido como blanco de interés. Como se hizo notar anteriormente, los péptidos cíclicos repetidos en serie preferidos de la invención (incluyendo los péptidos cíclicos de la Formula II) tienen las dos secuencias de RGE alineadas antiparalelo entre sí. En consecuencia, en péptidos cíclicos preferidos de acuerdo a la Fórmula II el elemento Z0 está presente y puede funcionar como una "entidad separadora" efectiva para alinear las dos secuencias de RGE juntas en una conformación de alineación antiparalela. En modalidades preferidas, Z0 no es de más de 10 aminoácidos residuales de longitud, y es de manera preferible de cinco o menos aminoácidos residuales de longitud. Los tamaños preferidos para Z0 son de aproximadamente 1, 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos residuales de longitud. La secuencia exacta de aminoácidos residuales en Z0 no es crítica. Por lo tanto, el elemento Z0 puede comprender o no una secuencia de aminoácidos residuales correspondiente a una secuencia de cualquiera de la N-terminal o C-terminal del motivo de RGE en una neurotrofina natural (por ejemplo, NGF, BDNF; NT-3, NT-4, NT-5 y NT-4/5) . Donde Z0 comprende secuencias de una neurotrofina, aquellas secuencias pueden o no comprender las sustituciones y/o modificaciones de aminoácido . Los ejemplos de secuencias de péptidos cíclicos particularmente preferidos de la invención, que son preferiblemente agonistas de Trk, incluyen: CSRRGELAASRRGELC (SEQ ID NO: 17) N-Ac-CSRRGELAASRRGELC-NH2 (SEQ ID NO : 18) CFHRGEFSIFHRGEFC (SEQ ID NO: 30) CARRGELSARRGELC (SEQ ID NO: 31) CSHRGEYSKSHRGEYC (SEQ ID NO: 32) Las secuencias de péptidos cíclicos identificadas por SEQ ID NOs : 30, 31, y 32 son agonistas de TrkA, TrkB y TrkC, respectivamente. La SEQ ID NO: 30 es derivada de NGF. La SEQ ID NO: 31 es derivada de BDNF. La SEQ ID NO: 32 es derivada de NT-3. Los péptidos cíclicos como se describen aquí, pueden comprender residuos de L-aminoácidos, D-aminoácidos, o cualquier combinación de los mismos. Los aminoácidos pueden ser de fuentes naturales o no naturales siempre que están presentes al menos un grupo amino y al menos un grupo carboxilo en la molécula. Generalmente se prefieren los A- y ß-aminoácidos . Los 20 L-aminoácidos comúnmente encontrados en las proteínas son particularmente preferidos en la presente invención. Esos aminoácidos son identificados aquí por sus abreviaciones de una letra y tres letras convencionales, mientras que los D-aminoácidos correspondientes son designados por el prefijo "d" . En ciertas modalidades, los péptidos cíclicos de la invención pueden comprender una secuencia de D-aminoácidos residuales que es opuesta a una secuencia de L-aminoácidos residuales proporcionada aquí. Por ejemplo, la invención proporciona ciertos polipéptidos agonistas del receptor Trk, referidos aquí como riBAG? y hriBAG2 (SEQ ID NO: 40-41) que comprenden secuencias de D-aminoácidos las cuales son la secuencia contraria de otro polipéptido agonista receptor de Trk referido como polipéptido de BAG (SEQ ID NO: 17) . En consecuencia, además de los polipéptidos de los L-aminoácidos residuales descritos supra, la presente invención también contempla polipéptidos que tienen la secuencia contraria de los L-aminoácidos residuales. En consecuencia, en una modalidad preferida los péptidos y peptidomiméticos de la presente invención comprenden secuencias de L-aminoácidos residuales incluyendo el motivo de Arg-Gly-Glu (es decir, "RGE") descrito como supra . En consecuencia la invención también proporciona (en una modalidad alternativa) péptidos y peptidomiméticos que comprenden secuencias de D-aminoácidos residuales incluyendo la secuencia lineal corta del motivo dGlu-Gly-dArg (es decir "dEGdR") . Los péptidos cíclicos también pueden contener uno o más aminoácidos raros (como la 4-hidroxiprolina o hidroxilisina) , ácidos orgánicos o amidas y/o derivados de aminoácidos comunes, como aminoácidos que tengan el carboxilato C-terminal esterificado (por ejemplo, bencilo, metilo o etil éster) o amidado y/o modificaciones del grupo amino N-terminal (por ejemplo, acetilación o alcoxi carbonilación) , con o sin ninguna de una amplia variedad de modificaciones y/o sustituciones de la cadena lateral (por ejemplo, metilación, bencilación, t-butilación, tosilación, alcoxicarbonilación, y similares) . Los derivados preferidos incluyen aminoácidos que tienen un grupo de N-acetilo (de modo que el grupo amino que representa N-terminal del péptido lineal antes de la ciclización este acetilado) y/o un grupo amida C-terminal (es decir, que el carboxiterminal del péptido lineal antes de la ciclización está amidado) . Otro residuo además de los aminoácidos comunes que pueden estar presentes con un péptido cíclico incluyen, pero no se limitan a, penicilamina, ß, ß-tetrametilen cisteína, ß, ß-pentametilen cisteína, ß-ácido mercaptopropiónico, ácido, ß,ß-pentametilen -ß-mercaptopropiónico, 2-mercaptobenceno, 2-mercaptoanilina, 2-mercaptoprolina, ornitina, ácido diaminobutírico, ácido a- aminoadípico, ácido m-aminometilbenzoico, y ácido a,ß-diaminopropiónico . Los péptidos cíclicos como se describen aquí pueden ser sintetizados por métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo métodos de ADN recombinante y síntesis química. La síntesis química puede ser efectuada generalmente usando las técnicas de síntesis peptídica de fase en solución o fase sólida estándar, en las cuales ocurre un enlace peptídico a través de la condensación directa del grupo a-amino de un aminoácido con el grupo a-carboxilo del otro aminoácido con la eliminación de la molécula de agua. La síntesis del enlace peptídico por condensación directa, como se formuló anteriormente, requiere la supresión del carácter reactivo del grupo amino del primero y del grupo carboxilo del segundo aminoácido . Los sustituyentes enmascarantes deben permitir su fácil remoción, sin inducir rompimiento o degradación de la molécula peptídica lábil . En la síntesis en fase en solución, puede ser usada una amplia variedad de métodos de acoplamiento y grupos protectores (véase Gross & Meienhofer, eds., "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol. 1-4 (Academic Press, 1979) ; Bodansky & Bodansky, "the Practice of Peptide Synthesis," 2d. ed. (Springer Verlag, 1994)). Además, son posibles la purificación intermedia y escalamiento lineal. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que la síntesis en solución requiere la consideración de los grupos protectores de la cadena principal y la cadena lateral y un método de activación. Además, es necesario cuidar la selección del segmento para minimizar la racemización durante la condensación del segmento. En particular, puede observarse un alto porcentaje de racemización cuando son acoplados residuos como Phe-Gly. Esas situaciones, sin embargo, no son comunes. Las consideraciones de solubilidad también son un factor. La síntesis peptídica en fase sólida usa un polímero insoluble como soporte durante la síntesis orgánica. La cadena peptídica soportada por un polímero permite el uso de pasos de lavado y filtración simples en purificaciones laboriosas en pasos intermedios . La síntesis peptídica en fase sólida puede ser efectuada, generalmente, de acuerdo al método de Merrifield et al . , J Am. Chem. Soc . 1963,85:2149. Esos métodos implican montar una cadena peptídica lineal sobre un soporte de resina usando aminoácidos protegidos. La síntesis peptídica en fase sólida típicamente utiliza la estrategia Boc o Fmoc . La estrategia Boc usa una resina de poliestireno reticulada al 1%. El grupo protector estándar para funciones a-amino es el grupo ter-butiloxicarbonilo (Boc) . Este grupo puede ser removido con soluciones diluidas de ácidos fuertes como ácido trifluoroacético (TFA) al 25%.

El siguiente Boc-aminoácido es acoplado típicamente a la resina de aminoácido usando diciclohexilcarbodiimida (DCC) .

Después de completar el montaje, el péptido-resina es tratado con HF anhidro para escindir el enlace bencil éster y liberar el péptido libre. Los grupos funcionales de la cadena lateral son usualmente bloqueados durante la síntesis de los grupos bloqueadores derivados de bencilo, los cuales también son escindidos por el HF. El péptido libre es entonces extraído de la resina con un solvente adecuado, purificado y caracterizado. Los péptidos recién sintetizados pueden ser purificados, por ejemplo, por filtración en gel, CLAP, cromatografía de partición y/o cromatografía de intercambio iónico, y pueden ser caracterizados, por ejemplo, por espectrometría de masa o análisis de la secuencia de aminoácidos. En la estrategia Boc, los péptidos amidados en la porción C-terminal pueden ser obtenidos usando resina de bencidrilamina o metilbencidrilamina, las cuales producen aminas peptídicas directamente tras la escisión con HF. En los procedimientos discutidos anteriormente, la selectividad de los grupos bloqueadores de la cadena lateral de un enlace péptido-resina depende de las diferencias en la velocidad de escisión acidolítica. Han sido introducidos sistemas ortogonales, en los cuales los grupos bloqueadores de la cadena lateral y el enlace péptido-resina son completamente estables al reactivo usado para remover el grupo a-protector en cada paso de la síntesis. El más común de esos métodos implica el método del 9-fluorenilmetiloxi carbonilo (Fmoc) . Dentro de este método, los grupos protectores de la cadena lateral y el enlace péptido-resina son completamente estables a las aminas secundarias usadas para escindir el grupo N-a-Fmoc. La protección de la cadena lateral y el enlace del péptido-resina son escindidos por acidolisis moderada. El contacto repetido con una base hace a la resina de Merrifield inadecuada para la química de la Fmoc, y generalmente son usados p-alcoxibencil esteres ligados a la resina. La desprotección y escisión son generalmente efectuadas usando TFA. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que, en la síntesis en fase sólida, las reacciones de desprotección y acoplamiento deben llegar hasta su conclusión y los grupos bloqueadores de la cadena lateral deben ser estables a través de toda la síntesis. Además, la síntesis en fase sólida es generalmente más adecuada cuando van a ser producidos péptidos a escala pequeña. La acetilación del N-terminal puede ser llevada a cabo haciendo reaccionar el péptido final con anhídrido acético antes de la escisión de la resina. La C-amidación se efectúa usando una resina apropiada como la resina de metilbencidrilamina usando la tecnología Boc. Después de la síntesis de un péptido lineal, con o sin N-acetilación y/o C-amidación, la ciclización puede ser lograda por cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas en el arte. Dentro de una modalidad, puede ser generado un enlace entre cadenas laterales de aminoácidos reactivos. Por ejemplo, un puente disulfuro puede ser formado a partir de un péptido lineal que comprenda dos residuos que contengan tiol oxidando el péptido usando cualquiera de una variedad de métodos. Dentro de uno de esos métodos, la oxidación con aire de tioles puede generar enlaces disulfuro durante un periodo de varios días usando medios acuosos básicos o neutros. El péptido es usado con una alta dilución para minimizar la agregación y reacciones laterales intermoleculares. Este método sufre de la desventaja de ser lento pero tiene la ventaja de solo producir H20 como producto lateral. De manera alternativa, pueden ser usados agentes oxidantes fuertes como el I2 y K3Fe(CN)6 para formar enlaces disulfuro. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que debe tenerse cuidado en no oxidar las cadenas laterales sensibles de Met, Tyr, Trp o His. Los péptidos cíclicos producidos por este método requieren purificación usando técnicas estándar, pero esta oxidación es aplicable a pHs ácidos. Los agentes oxidantes también permiten la desprotección/oxidación concurrente de precursores lineales protegidos con S adecuados para evitar la oxidación prematura, no específica, de cisteína libre. El DMSO, a diferencia del I2 y K3Fe(CN)s, es un agente oxidante moderado que no produce reacciones laterales oxidativas de los aminoácidos nucleofílicos mencionados anteriormente. El DMSO es miscible con H20 a todas las concentraciones, y las oxidaciones pueden ser efectuadas a pHs ácidos a neutros con subproductos no peligrosos. Puede usarse, de manera alternativa metiltriclorosilano-difenilsulfóxido como agente oxidante, para la desprotección/oxidación concurrente de S-Acm, S-Tacm o S- t-Bu de la cisteína sin afectar a otros aminoácidos nucleofílicos. No existen productos poliméricos resultantes de la formación del enlace disulfuro intermolecular. Los residuos que contienen tiol adecuados para usarse en esos métodos de oxidación incluyen, pero no se limitan a, cisteína, ß,ß-dimetil cisteína (penicilamina o Pen), ß, ß-tetrametilen cisteína (Tmc) , ß, ß-pentametilen cisteína (Pmc) , ácido ß-mercaptopropiónico (Mpr) , ácido ß,ß-pentametilen-ß-mercaptopropiónico (Pmp) , 2-mercaptobenceno, 2-mercaptoanilina y 2-mercaptoprolina. Será fácilmente evidente a aquellos expertos en la técnica que, con cada una de esas fórmulas representativas expuestas supra, cualquiera de los residuos que contienen tiol anteriores pueden ser empleados en lugar de uno o ambos de los residuos que contienen tiol expuesto. Dentro de modalidades adicionales, la ciclización puede ser lograda por la formación de enlaces amida. Por ejemplo, puede formarse un enlace peptídico entre grupos funcionales terminales (es decir, el amino y carboxi terminal de un péptido lineal antes de la ciclización) . Los ejemplos de esos péptidos incluyen c (SRRGE) (SEQ ID NO: 33), c(ARRGE) (SEQ ID NO: 34), c (FHRGE) (SEQ ID NO : 35) y c(SHRGE) (SEQ ID NO: 36) . Un ejemplo de un péptido particularmente preferido que tiene un enlace amida cíclico es el péptido c(SRRGELSRRGEL) (SEQ ID NO: 39). Este péptido, el cual es descrito en los Ejemplos, infra, es referido aquí como el péptido hBAG2. Dentro de otra de esas modalidades, el péptido lineal comprende un D-aminoácido. Por ejemplo, los ejemplos, infra, describen otro péptido preferido que es referido como el péptido hriBAG2. Este péptido, el cual contiene un enlace amida cíclico como se describió, supra, comprende la siguiente secuencia de D aminoácidos residuales : c CdLdEdGdRdRdSdLdEdGdRdRdS] (SEQ ID NO: 40). De manera alternativa, la ciclización puede ser lograda enlazanto un término y una cadena lateral residual o usando dos cadenas laterales, como en KRGED (SEQ ID NO: 37) o KSRRGED (SEQ ID NO: 38) , con o sin un grupo acetilo N-terminal y/o una amida C-terminal. Los residuos capaces de formar un enlace lactama incluyen a la lisina, ornitina (Orn) , ácido a-amino adípico, ácido m-aminometilbenzoico, ácido a, ß-diaminopropiónico, glutamato o aspartato . Los métodos para formar enlaces amida son bien conocidos en la técnica y se basan en principios bien establecidos de reactividad química. Dentro de uno de esos métodos, la formación de lactama mediada por carbodiimida puede ser efectuada por la reacción del ácido carboxílico con DCC, DIC, EDAC o DCCI, dando como resultado la formación de una O-acilurea que puede reaccionar inmediatamente con el grupo amino libre para completar la ciclizació?. La formación de la N-acilurea inactiva, resultante de una migración de O?N, convirtiendo la O-acilurea a un éster activo por la reacción con un compuesto .N-hidroxi como el 1-hidroxibenzotriazol, 1-hidroxisuccinimida, 1-hidroxinorbornen carboxamida o 2-hidroximino-2-cianoacetato de etilo. Además de minimizar la migración O ? N, esos aditivos también sirven como catalizadores durante la ciclización y ayudan a disminuir la racemización. De manera alternativa, la ciclización puede ser efectuada usando el método de la acida, en el cual se genera una acida intermedia reactiva a partir de un alquil éster vía una hidracida. La hidracinólisis del éster terminal necesita el uso de un grupo t-butilo para la protección de las funciones carboxilo de la cadena lateral en el componente acilante. Esta limitación puede ser superada usando ácido difenil fosforílico (DPPA) , el cual proporciona una acida directamente tras la reacción con un grupo carboxilo. La lenta reactividad de las acidas y la formación de isocianatos por su desproporcionamiento restringe la utilidad de este método. El método de formación de lactama con anhídrido mezclado es ampliamente usado debido a la fácil remoción de los subproductos de reacción. El anhídrido se forma con la reacción del anión carboxilato con un cloroformiato de alquilo o cloruro de pivaloilo. El ataque del componente amino es entonces guiado al carbono del carbonilo del componente acilante por el efecto donador de electrones del grupo alcoxi o por el volumen esférico del grupo t-butilo del cloruro de pivaloilo, el cual obstruye el ataque sobre el grupo carbonilo erróneo. Los anhídridos mezclados con derivados de ácido fosfórico también han sido usados de manera exitosa. De manera alternativa, la ciclización puede ser efectuada usando esteres activados. La presencia de sustituyentes que extraen electrones sobre el carbono del alcoxi de esteres incrementa su susceptibilidad a la aminólisis. La alta reactividad de los esteres de p-nitrofenol , compuestos de N-hidroxi y fenoles polihalogenados ha hecho esos "esteres activos" útiles en la síntesis de enlaces amida. Los últimos años han sido testigos del desarrollo del hexafluorofosfonato de benzotriazoliloxitris (dimetilamino) fosfonio (BOP) y sus congéneres como agentes de acoplamiento ventajosos. Su desempeño es generalmente superior al de las reacciones de formación de enlaces amida con carbodiimida bien establecidos. Dentro de una modalidad adicional, pueden formarse un enlace tioéter entre la cadena lateral de un residuo que contiene tiol y un a-aminoácido derivado de manera apropiada. A manera de ejemplo, una cadena lateral de lisina puede ser acoplada al ácido bromoacético a través del método de acoplamiento con carbodiimida (DCC, EDAC) y entonces hacerse reaccionar con la cadena lateral de cualquier residuo que contenga el tiol mencionado anteriormente para formar un enlace tioéter. Para formar ditioéteres, puede hacerse reaccionar cualesquier dos cadenas laterales que contengan tiol con dibromoetano y diisopropilamina en DMF. Los ejemplos de enlaces que contienen tiol incluyen: H, donde X puede ser (CH2)4, CH2 o La ciclización puede ser lograda usando d?d?-Ditriptófano (es decir, Ac-Trp-Gly-Gly-Trp-OMe) , como se muestra más adelante: Las estructuras y fórmulas expuestas aquí se proporcionan únicamente para propósitos de ilustración, y no pretenden limitar el alcance de los péptidos cíclicos descritos aquí.

FARMACOFOROS DEL RECEPTOR TRK Para diseñar peptidomiméticos, es benéfico obtener una estructura tridimensional para el farmacóforo de uno o más péptidos cíclicos descritos anteriormente. El término "farmacóforo" se refiere a la colección de grupos funcionales sobre un compuesto que están arreglados en el espacio tridimensional en una forma complementaria a la proteína blanco, y que son responsables de la actividad biológica como resultado de la unión del compuesto a la proteína blanco. Los modelos de farmacóforos tridimensionales útiles se derivan mejor a partir de estructuras cristalográficas o de resonancia magnética nuclear del blanco, pero también pueden ser derivados de modelos de homología basados en estructuras de blancos relacionados o relaciones de la estructura cuantitativa tridimensional-actividad derivadas de series previamente descubiertas de compuestos activos . La presente invención proporciona farmacóforos de ciertos péptidos cíclicos representativos (es decir, las conformaciones tridimensionales de la secuencia de consenso de la neurotrofina RGE dentro de esos péptidos) . Esas estructuras tridimensionales proporcionan información requerida para dirigir de manera más eficiente el diseño y optimización de los peptidomiméticos. En una modalidad, las estructuras tridimensionales de los péptidos cíclicos son determinadas generalmente usando cristalografía de rayos X. Esas técnicas son bien conocidas y están dentro de la rutina de un experto en la técnica. Por ejemplo, véase Cantor&Schimmel, Biophysical Chemistry 1980 (Vols. I-III) W. H. Freeman and Company (particularmente los capítulos 1-13 en Vol. I, y Capítulo 13 en Vol. II) . Véase también, Macromolecular Crystallography, Partes A-B (Carter&Sweet, Eds.) En: Methods Enzymol . 1997, Vols. 276-277; Jan Drenth, Principies of Protein X-Ray Crystallography (New York: Springer-Verlag, 1994) . El término "cristal" se refiere, de manera general, a cualquier arreglo tridimensional ordenado (o al menos parcialmente ordenado) de moléculas. Preferiblemente, el ordenamiento de las moléculas dentro de un cristal es al menos suficiente para producir un patrón de difracción de rayos X definido de - modo que pueda ser determinada la estructura tridimensional de las moléculas. Las moléculas en un cristal pueden ser de cualquier tipo, y deberá comprenderse que un cristal puede contener moléculas de solo un tipo o puede comprender una pluralidad de diferentes tipos de moléculas. En modalidades preferidas, los cristales de la presente invención comprenden al menos una biomolécula, como un péptido cíclico descrito, supra, en la Sección "Moduladores del receptor TRK: Péptidos Cíclicos". Los cristales de la invención pueden comprender aún un complejo o montaje de dos o más proteínas u otras biomoléculas. Por ejemplo, un cristal puede comprender moléculas de un ligando, como una neurotrofina, unida a moléculas de un receptor, como un receptor Trk. Típicamente, los cristales que contienen moléculas biológicas, como proteínas contendrán otras moléculas también, como moléculas de solventes (por ejemplo, moléculas de agua) y/o sal. Otras moléculas como fármacos, candidatos a fármacos o compuestos que se unan a la proteína también pueden estar presentes en un cristal . En realidad, las estructuras cristalinas para el dominio de unión de receptores Trk complej ados con una neurotrofina ya se encuentran disponibles en la técnica.

Véase, por ejemplo, Wiesmann et al., Nature 1999, 401:184; y Banfield et al., Sturcutre ( Camb . ) 2001, 9:1191. Las coordenadas de esas estructuras de rayos X pueden ser fácilmente obtenidas, por ejemplo, del Banco de Datos de Proteínas en <www.rcsb. orb> (Nos de Acceso. Iwww y lhcf, respectivamente) . En consecuencia, en modalidades particularmente preferidas, las cuales son demostradas en los ejemplos, infra, las estructuras de los farmacóforos de la invención son determinadas usando las estructuras cristalinas de rayos X de la neurotrofina unida a un receptor Trk apropiado (o fragmentos del mismo) . Esas estructuras tridimensionales pueden entonces ser usadas para diseñar peptidomiméticos de la invención o, de manera alternativa, para diseñar péptidos cíclicos adicionales que sean probables moduladores de Trk. De manera alternativa, las estructuras tridimensionales de los péptidos cíclicos pueden ser determinadas generalmente usando técnicas de resonancia magnética nuclear (RMN) que son bien conocidas en la técnica. La adquisición de datos de RMN se lleva a cabo preferiblemente en un sistema acuoso que límite estrechamente las condiciones fisiológicas para asegurar que se tenga la estructura relevante. De manera breve, las técnicas de RMN usan las propiedades magnéticas de ciertos núcleos atómicos (como ^?, 13C, 15N y 31P) , los cuales tienen un momento o espin magnético, para sondear el ambiente químico de esos núcleos. Los datos de RMN pueden ser usados para determinar distancias entre átomos en la molécula, las cuales pueden ser usadas para derivar un modelo tridimensional o la molécula. Para determinar las estructuras tridimensionales de péptidos cíclicos (y peptidomiméticos candidatos como se describe más adelante) preferiblemente se usa la RMN protónica. De manera más específica, cuando una molécula es colocada en un campo magnético fuerte, los dos estados orbitales de los átomos de hidrógeno no se degeneran ya. El orbital alineado paralelo al campo tendrá una energía menor que el orbital alineado antiparalelo al campo que tendrá una energía mayor. En equilibrio, el oribtal del átomo de hidrógeno será poblado de acuerdo a la ecuación de distribución de Boltzmann. Este equilibrio de población del orbital puede ser perturbado a un estado excitado aplicando impulsos de frecuencia de radio (RF) . Cuando los núcleos regresan al estado de equilibrio, emiten radiación RF que puede ser medida. La frecuencia exacta de la radiación emitida de cada núcleo depende del ambiente molecular del núcleo y es diferente para cada átomo (excepto para aquellos átomos que tienen los mismos ambientes moleculares) . Esas diferentes frecuencias se obtienen en relación a una señal de referencia y son llamadas desviaciones químicas. La naturaleza, duración y combinación de los impulsos de RF aplicados pueden variar en gran medida y pueden ser probadas diferentes propiedades moleculares por aquellos expertos en la técnica, seleccionando una combinación apropiada de - impulsos. Para determinaciones de la estructura tridimensional, un espectro de RMN dimensional es generalmente insuficiente, puesto que puede obtenerse información limitada perteneciente a la conformación. Generalmente se usa RMN unidimensional para verificar la conectividad dentro de una molécula y produce datos incompletos con relación a la orientación de cadenas laterales dentro de un péptido. Los espectros de RMN bidimensional son mucho más útiles a este respecto y permiten la determinación no ambigua de interacciones de cadena lateral a cadena lateral y la conformación de la estructura peptídica. Los espectros de RMN bidimensional son presentados generalmente como una gráfica de contorno en la cual la diagonal corresponde a un espectro de RMN unidimensional y los picos de cruce fuera de la diagonal resulta de interacciones entre los átomos de hidrógeno que son acoplados de manera directamente escalar. Los experimentos bidimensionales generalmente contienen un periodo de preparación, un periodo de evolución donde los orbitales son "marcados" cuando son procesados en el plano XY de acuerdo a su desviación química, un periodo de mezclado, durante el cual se hacen correlaciones con otros orbitales y un periodo de detección en el cual se registra la extinción de inducción libre. Los métodos de RMN bidimensional se distinguen por la naturaleza de la correlación que es probada o sondeada durante el periodo de mezclado. Un análisis DQF-COSY (espectroscopia de correlación filtrada cuántica doble) da picos entre átomos de hidrógeno que están conectados covalentemente a través de uno o dos átomos diferentes. La espectroscopia de efecto de Overhauser Nuclear (NOESY) da picos entre pares de átomos de hidrógeno que están muy juntos en el espacio aún si están conectados por medio de un gran número de átomos intervinientes . En la espectroscopia de correlación total (TOCSY) , son observadas correlaciones entre todos los protones que comparten patrones de acoplamiento, estén o no acoplados directamente entre sí . Los experimentos de Espectroscopia de Overhauser de estructura giratoria (ROESY) pueden ser entendidos como el análogo de estructura giratoria de NOESY, y producen picos entre pares de átomos de hidrógeno que están muy cerca en el espacio. Uno o más de esos métodos pueden ser usados, en conjunto con las técnicas de supresión de agua necesarias como la WATERGATE y relanzamiento de agua, para determinar la estructura tridimensional de un péptido cíclico o un peptidomimético candidato bajo condiciones acuosas. Esas técnicas son bien conocidas y son necesarias para suprimir la resonancia del solvente (HDO) durante la adquisición de datos de RMN. A manera de ejemplo, tanto el TOCSY y el NOESY pueden ser aplicados a péptidos cíclicos representativos para el propósito de determinar la confirmación y asignación. La resonancia del solvente acuoso puede ser suprimida mediante la aplicación del procedimiento WATERGATE. También puede ser aplicado un impulso de relanzamiento de agua al final del periodo de mezclado para ambos experimentos TOCSY y NOESY para mantener la señal de agua en equilibrio y minimizar la pérdida de resonancias de protón de amida debido a su rápido intercambio a condiciones de pH casi neutro (es decir, pH 6.8) usadas en el experimento. Los datos de RMN pueden ser procesados usando programas y sistemas de programación espectrofotométricos usando una función de ventana cosinusoidal cuadrada a lo largo de ambas direcciones. Pueden aplicarse correcciones básales a los espectros NOESY, ROESY y TOCSY usando el método polinomial estándar de Bruker. Los datos de NOESY pueden ser adquiridos a varios tiempos de mezclado que van de 80 ms a 250 ms . El tiempo de mezclado más corto de NOESY puede ser adquirido para asegurar que no estuvieron presentes efectos de difusión en el espectro NOESY adquirido a tiempos de mezclado más prolongado. Las distancias interprotón pueden ser determinadas generalmente del NOESY de 250 ms . La asignación específica de la secuencia de las resonancias del protón puede ser determinada por métodos estándar (véase Wuthrich, NMR of Proteins and Nucleic Acids, Wiley & Sons, ?ew York, 1986) , haciendo uso de ambos resultados de los datos del TOCSY y ?OESY. Para cálculos conformacionales, los picos de cruce del ?OE pueden ser convertidos inicialmente a una distancia uniforme sobre los límites superior e inferior de 1.8-5.0 angstroms sin importar las intensidades del ?OE. Las distancias ?OE pueden ser refinadas iterativamente a través de una comparación de ?OEs calculados y experimentales a los diferentes tiempos de mezclado. Este refinamiento puede ser en gran medida con el espíritu del procedimiento PEPFLEX-II (Wang et al., Techniques in Protein Chemistry IV, 1993, Evaluation of ?MR Based Structure Determination for Flexible Peptides: Application to Desmopressin p. 569), aunque preferiblemente la distancias basadas en ?OE inicialmente con enlaces superiores muy holgados (por ejemplo, de 5 angstroms) son usadas para permitir la generación de un conjunto más completo de conformaciones de acuerdo con los datos experimentales. Pueden ser derivadas restricciones de ángulo diédrico a partir de los valores de las constantes de acoplamiento de 3JCaH. Puede ser sumado un valor de tolerancia de 40 grados a cada una de las restricciones del ángulo diédrico para considerar la flexibilidad conformacional del péptido. Los cálculos geométricos de la distancia pueden ser llevados a cabo utilizando las longitudes de enlace y ángulos de enlace fijos proporcionados en la base de datos ECEPP/2 (Ni et al., Biochemistry 1992, 31:11551-11557). Los ángulos ? son fijados generalmente en 180 grados, pero todos los otros ángulos dihédricos pueden variar durante la optimización de la estructura. Las estructuras con violaciones de restricción más baja pueden ser sometidas a minimización de energía usando un método de Monte Cario restringido a la distancia (Ripoll & Ni, Biopolymers 1992, 32: 359-365; Ni, J. Magn . Reson . B 1995, 106: 147-155), y modificadas para incluir el campo de fuerza ECEPP/3 (Ni et al., J". Mol . Biol . 1995, 252: -656-671). Todos los grupos ionizables pueden ser tratados como cargados durante la minimización de Monte Cario restringido de la energía ECEPP/3. Las interacciones electrostáticas entre todas las cargas pueden ser separadas mediante el uso de un dieléctrico dependiente de la distancia para contar la ausencia de efectos del solvente en los cálculos de la energía conformacional. Además, las interacciones de unión de hidrógeno que pueden ser reducidas a un 25% de la escala total, mientras que los términos de van der Waals y electrostáticos se mantienen con toda su fuerza. Esos tratamientos especiales ayudan a asegurar que la búsqueda conformacional será guiada principalmente por las restricciones de la RMN experimentales y que las conformaciones calculadas son menos desviadas por los parámetros de energía conformacional empíricos (Warder et al., FEBS Lett . 1997, 411: 19-26). Las conformaciones de baja energía del péptido de los cálculos de Monte Cario pueden ser usadas en simulaciones NOE para identificar protones próximos sin NOE no observables y conjuntos de límites superiores de distancia que garanticen la recalibración. El conjunto refinado de distancias NOE, incluyendo los límites inferiores derivados de NOE ausentes son usados en los siguientes ciclos de cálculos de Monte Cario, hasta que sus conformaciones resultantes producen espectros NOE simulados cercanos a aquellos observados experimentalmente (Ning et al., Biopolymers 1994, 34: 1125-1137; Ni et al., J. Mol . Biol . 1995, 252: 656-671). Los espectros NOE teóricos pueden ser calculados usando un tiempo de correlación de pérdida de estabilidad de 1.5 ns sobre la base del peso molecular del péptido y la temperatura experimental (Cantor & Schimmel (1980) Biophysical Chemistry, W. H. Freeman & Co., San Francisco) . Todas las conformaciones peptídicas candidatas son incluidas con pesos iguales en un análisis de matriz de relajación promediada por montaje para interconvertir conformaciones (Ni & Zhu, J". Magn . Reson. B 1994, 102: 180-184). Las simulaciones NOE también pueden incorporar parámetros para considerar los movimientos locales de los grupos metilo y los efectos de disminución de relajación incompleta de desmagnetizaciones protónicas (Ning et al., Biopolymers 1994, 34: 1125-1137). Las intensidades NOE calculadas son convertidas a FID bidimensionales (Ni, Magn . Reson . B 1995,106: 147-155) usando la desviación química de las asignaciones, anchos de línea estimados y constantes de acoplamiento para todas las resonancias protónicas resueltas. Las FID calculadas pueden ser convertidas a espectros NOESY simulados usando procedimientos de procesamiento idénticos a los usados para los conjuntos de datos NOE experimentales .

MODULADORES DEL RECEPTOR TRK; PEPTIDOMIMETICOS Como se hizo notar anteriormente, los peptidomiméticos son compuestos en los cuales al menos una porción de la secuencia de RGE dentro de un péptido cíclico es modificada, de modo que la estructura tridimensional del peptidomimético permanezca siendo sustancialmente la misma que la de la secuencia de RGE. Los peptidomiméticos pueden ser análogos peptídicos que sean, por sí mismos, péptidos cíclicos que contengan una o más sustituciones u otras modificaciones dentro de la secuencia de RGE. De manera alternativa, al menos una porción de la secuencia de RGE puede ser reemplazada con una estructura no peptídica, de modo que la estructura tridimensional del péptido cíclico sea retenida sustancialmente. En otras palabras, uno, dos o tres aminoácidos residuales dentro de la secuencia de RGE pueden ser reemplazados por una estructura no peptídica. Además, otras porciones peptídicas del péptido cíclico pueden, aunque no es necesario, ser reemplazadas con una estructura no peptídica. Los peptidomiméticos (análogos tanto peptídicos como no peptídicos) pueden tener mejores propiedades (por ejemplo, proteólisis disminuida, retención incrementada o biodisponibilidad incrementada) . Los peptidomiméticos generalmente tienen una mejor disponibilidad oral, lo cual los hace especialmente adecuados para el tratamiento de condiciones como el cáncer. Deberá notarse que los peptidomiméticos pueden o no tener estructuras químicas bidimensionales similares, pero compartir características y geometrías estructurales tridimensionales comunes. Cada peptidomimético puede tener además uno o más elementos de unión adicionales únicos. La presente invención proporciona métodos para identificar peptidomiméticos. Se conocen en la técnica una variedad de modificaciones y modificaciones peptídicas (incluyendo modificaciones a péptidos cíclicos como se describió supra) y pueden ser usados para generar compuestos peptidomiméticos. Véase, por ejemplo, la Publicación de Patente Internacional No. WO 01/53331. Esas modificaciones también pueden ser usadas en la presente invención para generar compuestos peptidomiméticos, así como las modificaciones específicas descritas más adelante. Todos los peptidomiméticos proporcionados aquí tienen una estructura tridimensional que es sustancialmente similar a una estructura tridimensional de un péptido cíclico como se describió anteriormente. En general, se dice que dos estructuras tridimensionales son sustancialmente estructuralmente similares entre sí, si sus coordenadas atómicas del farmacóforo tienen una desviación de la raíz cuadrada de la media (RMSD) menor que o igual a 1 angstrom, de acuerdo a lo calculado usando el módulo de Similitud Molecular dentro del programa QUANTA (QUANTA, disponible de Molecular Simulations Inc., San Diego, Calif.). Todos los peptidomiméticos proporcionados aquí tienen al menos una estructura tridimensional de baja energía que es sustancialmente similar a al menos una estructura tridimensional de baja energía de un péptido cíclico como se describió anteriormente . Las conformaciones de baja energía pueden ser identificadas por cálculos de energía conformacional usando, por ejemplo, el programa CHARMM (Brooks et al . , J. Comput . Chem. 1983, 4: 187-217). Los términos energéticos incluyen términos ligados y no ligados, incluyendo la energía de la longitud del enlace, energía del ángulo, energía del ángulo diédrico, energía de Van der Waals y energía electrostática.

Será evidente que la energía conformacional también puede ser calculada usando cualquiera de una variedad de otros programas de mecánica cuántica o mecánica molecular comercialmente disponibles. Una estructura de baja energía tiene una energía conformacional que está dentro de 50 kcal/mol del mínimo global . Las conformaciones de baja energía de peptidomiméticos candidatos son comparadas con las conformaciones de baja energía del péptido cíclico (de acuerdo a lo determinado, por ejemplo, por RMN o cristalografía de rayos X) para determinar que tan estrechamente imita la conformación del candidato a la del péptido cíclico. En esas comparaciones, deberá darse atención particular a las ubicaciones y orientaciones de los elementos correspondientes a las cadenas laterales cruciales. Si al menos una de las conformaciones de baja energía candidatas es sustancialmente similar a una conformación de solución de un péptido cíclico (es decir, difiere con una desviación de la raíz cuadrada de la media (RMSD) de 1 angstrom o menos) , se considera que el compuesto candidato es un peptidomimético. Dentro de esos análisis, las conformaciones de baja energía de los peptidomiméticos candidatos en solución pueden ser estudiadas usando, por ejemplo, el programa de mecánica molecular y dinámica molecular CHARMM (Brooks et al . , J. Comput . Chem . 1983, 4: 187-217), con el modelo acuoso TIP3P (Jorgensen et al . , J. Chem Phys . 1983, 79: 926-935) usado para representar moléculas de agua. El campo de fuerza CHARM22 puede ser usado para representar los peptidomiméticos diseñados . A manera de ejemplo, las conformaciones de baja energía pueden ser identificadas usando una combinación de dos procedimientos . El primer procedimiento implica un método de simulación de dinámica molecular de recocido simulado. En este proceso, el sistema (el cual incluye los peptidomiméticos diseñados y moléculas de agua) es calentado por encima de la temperatura ambiente, preferiblemente alrededor de 600 K, y simulado durante un periodo de 100 picosegundos (ps) o más; entonces se reduce gradualmente a 500 K y se simula durante un periodo de 100 ps o más; entonces se reduce gradualmente a 400 K y se simula durante un periodo de 100 ps o más; se reduce gradualmente a 300 K y se simula durante un periodo de 500 ps o más. las trayectorias son registradas para su análisis. Este procedimiento de recocido simulado es conocido por su capacidad para la investigación conformacional eficiente. El segundo procedimiento implica el uso del método de dinámica molecular autoguiada (SGMD) (Wu & Wang, J". Physical Chemistry 1998, 102: 7238-7250). El método SGMD ha demostrado tener una capacidad de la investigación conformacional extremadamente mejorada. Usando el método SGMD, pueden efectuarse simulaciones a 300 K durante 1000 ps o más y las trayectorias registradas para su análisis. El análisis conformacional puede llevarse a cabo usando el paquete de modelaje molecular QUANTA. Primero, puede ser efectuado el análisis grupal usando las trayectorias generadas a partir de simulaciones de dinámica molecular. Para cada grupo, puede ser seleccionada la conformación de más baja energía como la conformación representativa para este grupo y puede compararse con otros grupos conformacionales. Tras el análisis grupal, los grupos conformacionales principales pueden ser identificados y comparados con las conformaciones solución de los péptidos cíclicos. La comparación conformacional puede llevarse a cabo usando el módulo de Similitud Molecular dentro del programa QUANTA. La similitud en la estructura también puede ser evaluada por comparación visual de las estructuras tridimensionales desplegadas en un formato gráfico, o por cualquiera de una variedad de comparaciones computacionales. Por ejemplo, la equivalencia atómica puede ser definida en las estructuras tridimensionales del peptidomimético y el péptido cíclico, y usarse una operación de ajuste para establecer el nivel de similitud. Como se usa aquí, una "equivalencia atómica" es un conjunto de átomos conservados en las dos estructuras. Un "operación de ajuste" puede ser cualquier proceso mediante el cual una estructura de un compuesto candidato sea trasladada y rotada para obtener un ajuste óptimo con la estructura peptídica cíclica. Una operación de ajuste puede ser una operación de ajuste rígida (por ejemplo, la estructura tridimensional del péptido cíclico puede mantenerse rígido y la estructura tridimensional y el péptidomimético puede ser trasladado y girado para obtener un ajuste óptimo con el péptido cíclico) . De manera alternativa, la operación de ajuste puede usar un algoritmo de ajuste de mínimos cuadrados que calcule la traslación y rotación óptimas que deben ser aplicadas a la estructura del compuesto en movimiento, de modo que la diferencia de la raíz cuadrada de la media del ajuste sobre los pares específicos de átomos equivalentes sea mínima. Preferiblemente, las equivalencias atómicas pueden ser establecidas por el usuario y la operación de ajuste se efectúa usando cualquiera de una variedad de aplicaciones de programas y sistemas de programación o software disponibles (por ejemplo, QUANTA, disponible de Molecular Simulations Inc., San Diego, California). Las estructuras tridimensionales de los compuestos candidatos para usarse en el establecimiento de la similitud sustancial pueden ser determinadas experimentalmente (por ejemplo, usando técnicas de RMN como se describe aquí o cristalografía de rayos x) , o pueden ser generadas por computadoras usando, por ejemplo, los métodos proporcionados aquí . Ciertos peptidomiméticos pueden ser diseñados, sobre la base de la estructura del péptido cíclico. Por ejemplo, esos peptidomiméticos pueden imitar la topografía local alrededor de los enlaces amida escindibles (isoésteres de enlace amida) . Los ejemplos de modificaciones estructurales se dan en las Figuras 3A y 3B (véanse también, las Figuras 4A-4B en la WO 01/53331) . Esos miméticos con frecuencia son iguales a la estructura peptídica átomo por átomo, reteniendo a la vez la funcionalidad que hace importante los contactos con los sitios de unión. Los miméticos del enlace amida también pueden incluir la incorporación de aminoácidos o dipéptido sustituto inusuales. Los ejemplos de esos aminoácidos y dipéptido sustituto inusuales se ilustran aquí, en la Figura 4 (véase también en la Figura 5 en la WO 01/53331) . Otros ejemplos más son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, en Gillespie et al., Biopolymers 1997, 43:191-217). Se cree que los elementos subestructurales conformacionalmente rígidos encontrados en esos tipos de miméticos dan como resultado la unión con fuerzas conductoras entrópicas altamente favorables, en comparación con los enlaces peptídicos conformacionalmente más flexibles. Las modificaciones estructurales también pueden impartir estabilidad metabólica a la escisión con peptidasa en relación al péptido original. Otros peptidomiméticos pueden ser imitadores de la estructura secundaria. Esos peptidomiméticos generalmente emplean estructuras no peptídicas para reemplazar estructuras secundarias específicas, como giros o vueltas-ß, láminas-ß y giros o vueltas-a (véase la Figura 5) . Para diseñar un peptidomimético, han sido desarrolladas reglas heurísticas, a través de la experiencia que pueden ser usadas para modificar sistemáticamente un péptido cíclico. Dentro de esa modificación, son recolectados generalmente datos empíricos de varios tipos, a través de un proceso de refinación iterativa. Como se hizo notar anteriormente, la eficiencia óptima en el diseño del peptidomimético requiere una estructura tridimensional del farmacóforo . Los farmacóforos como los proporcionados aquí permiten diseñar un peptidomimético basado en la estructura a través, por ejemplo, de la modificación del andamiaje del péptido como se describió anteriormente. Ciertos peptidomiméticos pueden ser identificados a través de la inspección visual de uno o más farmacóforos, en comparación con la conformación de RGE de la neurotrofina. Los peptidomiméticos también pueden ser diseñados sobre la base de una comparación visual del farmacóforo el péptido cíclico con una estructura tridimensional de un compuesto candidato, usando el conocimiento de las relaciones estructura-actividad del péptido cíclico. Los estudios de estructura-actividad han establecido elementos de unión importantes en los péptidos cíclicos y han permitido el desarrollo de modelos de farmacóforo. Los peptidomiméticos diseñados de esta manera detendrán esos elementos de unión. Los peptidomiméticos también pueden ser diseñados reemplazando un enlace disulfuro (--S—S--) con un tioéter (--S—CH2--C (O) --) . El enlace disulfuro en general no es muy estable puesto que puede ser reducido muy fácilmente bajo condiciones acidas. Reemplazar el enlace disulfuro con una entidad tioéter (--S-- CH2--C(0)--) puede mejorar significativamente la estabilidad del péptido y por lo tanto la disponibilidad oral . Como una alternativa al diseño por inspección visual, pueden ser producidas bibliotecas (por ejemplo, que contengan compuestos de hidantoina y/u oxipiperacina) usando técnicas químicas combinadas. La tecnología química combinada permite la síntesis paralela de compuestos orgánicos a través de la visión sistemática de componentes químicos definidos usado reacciones químicas altamente confiables e instrumentación robótica. Las bibliotecas grandes de compuestos resultantes de la combinación de todas las reacciones posibles que puedan ser efectuadas en un sitio con todas las reacciones posibles que puedan ser efectuadas en un segundo, tercero, o un número mayor de sitios. Los métodos químicos combinados pueden potencialmente generar decenas hasta centenas de millones de nuevos compuestos químicos como mezclas, unidos a un soporte sólido, o como compuestos individuales . Los farmacóforos pueden ser usados para facilitar la separación o selección de esas bibliotecas químicas. Por ejemplo, en lugar de producir todos los miembros posibles de cada biblioteca (dando como resultado un número infinito de compuestos) , la síntesis de la biblioteca puede enfocarse sobre los miembros de la biblioteca con la mayor probabilidad de interactuar con el blanco. La aplicación integrada de la tecnologías de diseño basado en la estructura y técnica combinada pueden producir mejoras sinérgicas en la eficiencia del descubrimiento del fármaco. Los peptidomiméticos adicionales son compuestos que parecen no estar relacionados con el péptido original, pero contienen grupos funcionales colocados en un andamiaje no peptídico que sirve como imitador topográfico. Este tipo de peptidomimético es llamado aquí "análogo no peptidílico" . Esos peptidomiméticos pueden ser identificados usando la selección o separación de la biblioteca de base de datos químicos grandes. Esas selecciones o separaciones usan la conformación tridimensional de un farmacóforo para buscar bases de datos en el espacio tridimensional . Puede ser usada una sola estructura tridimensional como un modelo de farmacóforo en esa investigación o búsqueda. De manera alternativa puede ser generado un modelo de farmacóforo considerando las características estructurales químicas cruciales dentro de estructuras tridimensionales múltiples. Puede ser usada cualquiera de una variedad de bases de datos de estructuras tridimensionales paras esas búsquedas . Una base de datos de estructuras tridimensionales puede ser preparada generando estructuras tridimensionales de í una base de datos de compuestos, y almacenando las estructuras tridimensionales en forma de material de almacenamiento de datos codificado con datos legibles en una máquina . Las estructuras tridimensionales pueden ser presentadas a una máquina capaz de desplegar una representación tridimensional gráfica y programada con instrucciones para usar los datos. Dentro de las modalidades preferidas, las estructuras tridimensionales son proporcionadas como un conjunto de coordenadas que definen la estructura tridimensional . Preferiblemente, la base de datos 3D contiene al menos 100,000 compuestos, con las moléculas no peptidílicas pequeñas que tienen estructuras químicas relativamente simples, siendo particularmente preferidas. También es importante que las coordenadas 3D de los compuestos en la base de datos sean representadas exacta y correctamente. La base de datos 3D del National Cáncer Institute (NCI) (Milne et al . , J. Chem Inf . Comput . Sci , 1994, 34:1219-1224) y Available Chemicals Directory (ACD) ; disponible de MDL Information Systems, San Leandro, California) son dos bases de datos excelentes que pueden ser usadas para generar una base de datos de estructuras tridimensionales, usando el modelaje molecular, como se discutió anteriormente. Para moléculas flexibles, las cuales pueden tener varias conformaciones de baja energía, es deseable almacenar y buscar conformaciones múltiples. El programa Chem X (Oxford Molecular Group PLC; Oxford RU) es capaz de buscar miles o aún millones de conformaciones para un compuesto flexible. Esta capacidad del Chem-X proporciona una ventaja real al tratar con compuestos que pueden adoptar conformaciones múltiples. Usando este método, aunque la base de datos 3D del NCI actualmente contiene un total de 465,000 compuestos, pueden ser buscados cientos de millones de conformaciones en un proceso de búsqueda de farmacóforos 3D. Una búsqueda de farmacóforos típicamente implica tres pasos . El primer paso es la generación de una interrogante de farmacóforo. Esa interrogante puede ser desarrollada a partir de una evaluación de distancias críticas en la estructura tridimensional de un péptido cíclico. Usando la interrogante del farmacóforo de interés, se efectúa una búsqueda de distancias en la base de datos para identificar compuestos que satisfagan las restricciones geométricas requeridas. En otras palabras, son identificados los compuestos que satisfacen las distancias por pares críticas específicas . Después de que un compuesto pasó el paso de selección de distancia, el programa verifica a continuación si el compuesto satisface los requerimientos subestructurales especificados en la interrogante del farmacóforo. Después de que el compuesto pase esta verificación subestructural , finalmente es sometido a un análisis conformacional. En este paso se generan y evalúan conformaciones con respecto a los requerimientos geométricos especificados en la interrogante del farmacóforo. Los compuestos que tienen al menos una conformación que satisface los requerimientos geométricos, son considerados como "aciertos" y registrados en una base de datos de resultado. Otros criterios, los cuales serán evidentes a aquellos expertos en la técnica, también pueden ser considerados cuando se seleccionan compuestos específicos para aplicaciones particulares, como la simplicidad de la estructura química, bajo peso molecular, diversidad de estructura química y solubilidad en agua. La aplicación de esos criterios es bien comprendida por químicos médicos, computacionales y estructurales . Será evidente que la estructura de un compuesto puede ser optimizada usando selecciones como las proporcionadas aquí. Dentro de esas selecciones, el efecto de alteraciones específicas de un compuesto candidato sobre la estructura tridimensional puede ser evaluado, para optimizar la similitud tridimensional óptima para un péptido cíclico. Esas alteraciones incluyen, por ejemplo, cambios en la hidrofobicidad, volumen esférico, propiedades electrostáticas, tamaño y ángulo de enlace. Las pruebas biológicas de los compuestos candidatos pueden ser usadas para confirmar la actividad del peptidomimético. En general los peptidomiméticos funcionarán en una forma sustancialmente similar a la de un péptido cíclico estructuralmente similar. En otras palabras, un peptidomimético del péptido cíclico N-Ac-CSRRGEC_NH2 (SEQ ID NO: 2) deberá unirse a un TRK con una afinidad que sea al menos la mitad de la afinidad del péptido cíclico N-Ac-CSRRGEC-NH2 (SEQ ID NO: 2); de acuerdo a lo medido usando ensayos de unión estándar. Además el peptidomimético del péptido cíclico N-Ac-CSRRGEC-NH2 (SEQ ID NO: 2) modulará una función mediada por TRK usando un ensayo representativo proporcionado aquí a un nivel que es al menos la mitad del nivel de modulación lograda usando N-Ac-CSRRGEC-NH2 (SEQ ID N0:2) . Una vez que ha sido identificado un peptidomimético activo, pueden ser identificados análogos relacionados usando la búsqueda de similitud bidimensional . Esa búsqueda puede ser efectuada, por ejemplo, usando el programa ISIS Base (Molecular Design Limited) . La búsqueda de similitud bidimensional permite la identificación de otros compuestos estrechamente relacionados, disponibles, los cuales pueden ser seleccionados por separado, fácilmente para optimizar la actividad biológica.

AGENTES QUE MODULAN TRK Como se hizo notar anteriormente el término "modulador de Trk" se usa aquí para describir cualquier molécula que comprende al menos un péptido cíclico o un compuesto peptidomimético de la invención que contenga el motivo de neurotrofina RGE (es decir, Arg-Gly-Glu) . Pueden estar presentes péptidos cíclicos y/o peptidomiméticos múltiples en un agente modulador de la invención. Además, pueden ser incluidas secuencias de RGE adicionales (por ejemplo, repeticiones en serie de secuencias de RGE) en un agente modulador. Pueden ser usados o no como enlazantes para separar secuencias de RGE en un modulador de Trk, incluyendo repeticiones en serie de secuencias de RGE (como los agonistas de Trk preferidos de la invención) . También pueden ser usados enlazantes para unir un agente modulador de la invención a un soporte o material sólido, como se describe más adelante . Un enlazante puede ser cualquier molécula (incluyendo secuencias peptídicas y/o no peptídicas así como aminoácidos individuales a otras moléculas) que no contengan una secuencia de RGE y que puedan ser ligadas covalentemente a al menos dos secuencias peptídicas y/o peptidomiméticos. Usando un enlazante, los peptidomiméticos y otras secuencias peptídicas o proteínicas, pueden ser unidas en una variedad de orientaciones. Los enlazantes preferiblemente producen una distancia entre secuencias de CAR y/o peptidomiméticos de entre 0.1 a 10,000 nm, de manera más preferible de aproximadamente 0.1-400 nm. Una distancia de separación entre los sitios de reconocimiento puede ser determinada generalmente de acuerdo a la función deseada del agente modulador. Para antagonistas de Trk, la distancia del enlazante será menor (0.1-400 nm) . Para agonistas de Trk, la distancia del enlazante será de 400-10,000 nm. Un enlazante que puede ser usado para ese propósito es (H2N(CH2) nC02H)m, o derivados del mismo, donde n fluctúa de 1 hasta aproximadamente 10 y m fluctúa de 1 hasta aproximadamente 4000. Por ejemplo, si se usa glicina (H2NCH2C02H) o un multímero de la misma como enlazante, cada unidad de glicina corresponde a una distancia enlazante de aproximadamente 2.45 angstroms, o 0.245 nm, de acuerdo a lo determinado por los cálculos de la conformación de energía más baja cuando se enlacen a otros aminoácidos usando técnicas de modelaje molecular. De manera similar, el ácido aminopropanoico corresponde a una distancia de enlace de aproximadamente 3.73 angstroms, el ácido aminobutanoico a aproximadamente 4.96 angstroms, el ácido aminopentanoico a aproximadamente 6.30 angstroms y el ácido hexanoico a aproximadamente 6.12 angstroms . Otros enlazantes que pueden ser usados serán evidentes a aquellos expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, enlazantes basados en unidades repetidas de ácido 2 , 3 -diaminopropanoico, lisina y/u ornitina. El ácido 2,3-Diaminopropanoico puede proporcionar una distancia de enlace de 2.51 o 3.11 angstroms dependiendo de si es usado el amino de la cadena lateral o el amino terminal en el enlace. De manera similar, la lisina puede proporcionar distancias de enlace de 2.44 ó 6.95 angstroms y la ornitina de 2.44 o 5.61 angstroms. Los enlazantes peptídicos y no peptídicos pueden ser incorporados generalmente en un agente modulador usando cualquier método apropiado conocido en la técnica. Los agentes moduladores que son antagonistas de Trk pueden contener uno o más peptidomiméticos. Preferiblemente esos peptidomiméticos se encuentran adyacentes entre sí (es decir, sin secuencias intervinientes) o están cerca (es decir, separados por enlazantes peptídicos y/o no peptídicos para dar una distancia entre los peptidomiméticos que fluctúa de aproximadamente 0.1 a 400 nm) . Será evidente que también pueden ser incluidas otras secuencias de neurotrofina, como se discutió anteriormente. Como se hizo notar anteriormente, un agente modulador puede consistir de uno o más peptidomiméticos, o puede contener componentes peptídicos y/o no peptídicos adicionales. Las porciones peptídicas pueden ser sintetizadas como se describió anteriormente o pueden ser preparadas usando métodos recombinantes. Dentro de esos métodos, todo o una parte del agente modulador puede ser sintetizado en células vivientes, usando cualguiera de una variedad de vectores de expresión conocidos por aquellos expertos en la técnica apropiados para la célula anfitriona particular. Las células anfitrionas adecuadas incluyen bacterias, células de levadura, células de mamífero, células de insecto, células de plantas, algas y otras células de animales (por ejemplo, hibridoma, CHO, mieloma) . Las secuencias de ADN expresadas de esa manera pueden codificar para porciones de una neurotrofina endógena. Esas secuencias pueden ser preparadas sobre la base de ADNc o genómicas conocidas, o de secuencias aisladas separando una biblioteca apropiada con sondas diseñadas sobre la base de las secuencias de caderinas conocidas. Esas selecciones pueden efectuarse de manera general como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989 (y referencias citadas ahí) . También puede ser empleada la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , usando cebadores oligonucleotídicos en métodos bien conocidos en la técnica, para aislar moléculas de ácido nucleico que codifiquen para toda o una porción de una neurotrofina endógena. Para generar una molécula de ácido nucleico que codifique para una porción peptídica de un agente modulador, una secuencia endógena puede ser modificada usando técnicas bien conocidas. De manera alternativa, porciones de las secuencias de ácido nucleico deseada pueden ser sintetizadas usando técnicas bien conocidas, y ligadas juntas para formar una secuencia que codifique para una porción del agente modulador. Los agentes moduladores de Trk de la presente invención pueden comprender adicionalmente un anticuerpo, un fragmento de unión de antígeno del mismo, que se una específicamente a una secuencia de NT, o de manera alternativa, un anticuerpo o un fragmento de unión de antígeno del mismo que se una específicamente a una secuencia del receptor Trk. Como se usa aquí, se dice que un anticuerpo, o fragmento de unión de antígeno del mismo, se "une específicamente" a una secuencia de NT de Trk (con o sin aminoácidos flanqueantes) si reacciona a un nivel detectable (dentro de, por ejemplo, una ELISA, de acuerdo a lo descrito por Newton et al . , Develop . Dynamics 1993, 197: 1-13) con un péptido que contiene esa secuencia, y no reacciona de manera detectable con péptidos que contienen una secuencia de NT o Trk diferente, no con una secuencia en la cual el orden de los aminoácidos residuales en la secuencia de NT (o Trk) y/o flanqueante esté alterada. Los anticuerpos y fragmentos del mismo pueden ser preparados usando técnicas estándar. Véase, por ejemplo, Harlow & Lañe, Antibodies : A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En esa técnica, un inmunógeno que comprende una secuencia de NT o Trk es inyectado inicialmente en cualquiera de una variedad de mamíferos (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, ovejas o cabras) . Los inmunógenos pequeños (es decir, de menos de aproximadamente 20 aminoácidos) son unidos preferiblemente a una proteína portadora, como la albúmina sérica bovina o hemocianina de cangrejo bayoneta. Después de una o más inyecciones, los animales son sangrados periódicamente. Los anticuerpos policlonales específicos para las secuencias de NT o Trk pueden entonces ser purificados de ese antisuero, por ejemplo, por cromatografía de afinidad usando el agente modulador o porción antigénica del mismo acoplada a un soporte sólido adecuado. Los anticuerpos monoclonales específicos para una secuencia de NT o Trk pueden ser preparados, por ejemplo, usando la técnica de Kohier & Milstein, (Eur. J. Immunol . 1976, 6: 511-519) y mejoras a esta. De manera breve, esos métodos implican la preparación de líneas celulares inmortales capaces de producir anticuerpos que tengan la especificidad deseada de células de bazo obtenidas de un animal inmunizado como se describió anteriormente. Las células de bazo son inmortalizadas, por ejemplo, por fusión con un patrón de fusión de célula de mieloma, preferiblemente uno que sea sinérgico con el animal inmunizado. Se seleccionan colonias individuales y sus sobrenadantes de cultivo son probados por su actividad de unión contra el agente modulador o porción antigénica del mismo. Los hibridomas que tienen una alta reactividad y especificidad son los preferidos. Los anticuerpos monoclonales pueden ser aislados de los sobrenadantes de colonias de hibridoma en' crecimiento, con o sin el uso de varios métodos conocidos en la técnica para mejorar el rendimiento. Los contaminantes pueden ser removidos de los anticuerpos por técnicas convencionales, como la cromatografía, filtración en gel, precipitación extracción. Los anticuerpos que tienen la actividad deseada pueden ser identificados de manera general usando análisis de inmunofluorescencia de secciones de tejido, células u otras muestras donde se localice la caderina blanco. Dentro de ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales pueden ser específicos para NTs particulares, o de manera alternativa, para receptores Trk particulares. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse a NGF, pero no unirse a BNDF, o vice versa . Como otro ejemplo, un anticuerpo monoclonal puede unirse específicamente a TrkB y no unirse específicamente a TrkA, o vice versa . Esos anticuerpos pueden ser preparados como se describió anteriormente, usando (para generar anticuerpos para un NT particular) un inmunógeno que comprende la secuencia de RGE y también suficiente secuencia flanqueante para generar la especificidad deseada (por ejemplo, cinco aminoácidos a cada lado generalmente suficiente) . Para evaluar la especificidad de un anticuerpo particular, pueden ser empleados los ensayos representativos como se describe aquí y/o ensayos de unión de antígeno convencionales . Esos anticuerpos pueden ser producidos de manera general para propósitos terapéuticos, de diagnóstico y ensayo, como se describe aquí. Por ejemplo, esos anticuerpos pueden ser ligados a un fármaco y administrados a un mamífero para dirigir el fármaco a una célula que exprese Trk particular, como una célula neuronal particular. Dentro de ciertas modalidades, el uso de un fragmento de unión de antígeno para anticuerpos puede ser preferido. Esos fragmentos incluyen fragmentos Fab, los cuales pueden ser preparados usando técnica estándar. De manera breve, pueden ser purificadas inmunoglobulinas de suero de conejo por cromatografía de afinidad sobre columnas de perlas de proteína A (Harlow & Lañe, Antibodies : A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; véase especialmente la página 309) y digerida con papaina para producir fragmentos Fab y Fc . Los fragmentos Fab y Fc pueden ser separados por cromatografía de afinidad sobre columnas de perlas de proteína A (Harlow & Lañe, 1988, páginas 628-29) .

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD DEL MODULADOR DE TRK Como se hizo notar anteriormente, los peptidomiméticos, péptidos cíclicos y otros moduladores de Trk de la invención son capaces de modular (es decir, mejorar o inhibir) actividades mediadas por Trk, incluyendo, por ejemplo, la sobrevivencia neuronal, crecimiento axonal y plasticidad sináptica. En consecuencia, la capacidad de modular un agente (o un agente modulador sospechoso) para modular la actividad mediada por Trk puede ser evaluada, de manera general, ya sea in vi tro o in vivo ensayando uno o más de esos efectos. Hablando de manera general, un compuesto de prueba es un antagonista de Trk si, dentro de un ensayo representativo, el contacto de células de prueba con los candidatos da como resultado una perturbación discernible de la actividad mediada por Trk que esté siendo medida. Un compuesto candidato es considerado generalmente un agonista de Trk si, -dentro de un ensayo representativo, el contacto de células de prueba con el compuesto candidato da como resultado un incremento discernible de la actividad mediada por Trk que esté siendo medida.

En particular, las modalidades preferidas de la invención, la actividad de un modulador de Trk o compuesto candidato es evaluada in vivo en un ensayo de emergencia de neuritas . Dentro de un ensayo de emergencia de neuritas representativo, el cual es demostrado en los Ejemplos, infra, las neuronas pueden ser cultivadas sobre una monocapa de células (preferiblemente células 3T3 o líneas celulares derivadas de las mismas) . Como un ejemplo, pueden ser establecidas monocapas de fibroblastos 3T3 por cultivo nocturno de células (de manera preferible, aproximadamente 80,000) en pozos individuales de una placa de cultivo tisular de 8 pozos en forma de cámara. Aproximadamente 3,000 neuronas cerebelares aisladas de cerebro de ratón de 3- días, posnatales (PND3) pueden ser cultivadas durante 18 horas sobre las diferentes monocapas en medios de control (SATO/2% de FCS) o en medios suplementados con varias concentraciones del agente modulador candidato. De manera alternativa, las células pueden ser cultivadas en medio suplementado con un péptido control (por ejemplo, un péptido no cíclico, lineal, que tenga la misma secuencia de aminoácidos que un péptido cíclico modulador de Trk) o con una neurotrofina (por ejemplo, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, NT-5 o NT-4/5) . Los cultivos celulares pueden entonces ser fijados y teñidos para GAP43 o con algún otro agente que se una específicamente a sus neuronas y sus neuritas. La longitud de la neurita más larga en cada neurona positiva GAP43 puede entonces ser medida, preferiblemente usando morfometría ayudada por computadora. Un compuesto que sea modulador de Trk generalmente modulará (por ejemplo, inhibirá o mejorará) la emergencia de neuritas en ese ensayo de cultivo celular.

USOS DE MODULADORES DEL RECEPTOR DE TRK En general, los agentes y composiciones moduladoras de la presente invención pueden ser usados para modular (por ejemplo, inhibir o mejorar) actividades que sean mediadas por un receptor de Trk incluyendo actividades mediadas por TrkA, TrkB y/o TrkC. Los receptores de Trk están implicados en el crecimiento y reparación del sistema nervioso central (SNC) y median, al menos en parte, procesos como la sobrevivencia neuronal, crecimiento axonal, emergencia o crecimiento de neuritas, plasticidad sináptica y, de manera más general, el crecimiento neurológico. En consecuencia, los agentes y composiciones moduladoras de la invención pueden ser usados para modular cualquiera de esos procesos. Esos usos incluyen, inter alia, métodos terapéuticos y composiciones farmacéuticas para tratar condiciones, enfermedades y trastornos que estén asociados con esos procesos . Las condiciones, enfermedades y trastornos ejemplares incluyen a la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, apoplejía y daño en la cabeza y médula espinal por nombrar unas cuantas . En una modalidad de la invención, el agonista de Trk puede ser usado para incrementar o mejorar actividades que sean mediadas por el receptor de Trk. En consecuencia, el agonista de Trk de la invención puede ser usado, por ejemplo, para incrementar o mejorar el crecimiento y/o reparación del SNC, por ejemplo incrementando o mejorando procesos como el crecimiento neuronal, sobrevivencia neuronal, crecimiento axonal, emergencia de neuritas y plasticidad sináptica. Por lo tanto los agonistas de Trk de la invención son útiles por ejemplo, en métodos terapéuticos para tratar enfermedades o trastornos que impliquen o estén asociados con daño a o función dañada del sistema nervioso central. Esos incluyen, ínter alia, las enfermedades y trastornos listados anteriormente. En otras modalidades, los antagonistas de Trk de la invención pueden ser usados para disminuir o inhibir la actividad mediada por un receptor de Trk. De este modo, los antagonistas de Trk pueden inhibir procesos como el crecimiento neuronal, sobrevivencia neuronal, crecimiento axonal, emergencia de neuritas y plasticidad sináptica. Los antagonistas de Trk también son útiles en métodos terapéuticos, por ejemplo para tratar o aliviar enfermedades o trastornos, (por ejemplo, epilepsia) que estén asociados con un incremento de la actividad del receptor de Trk, o con un incremento en la actividad de una neurotrofina (por ejemplo, BDNF) que se una a y active un receptor de Trk. En otra modalidad más, los agonistas y antagonistas del Trk de la invención, también pueden ser usados para modular respuestas que inhiban el crecimiento y reparación del SNC (es decir, "inhibidores del SNC"), incluyendo respuestas que inhiban procesos como el crecimiento neuronal, sobrevivencia neuronal, crecimiento axonal, emergencia de neuritas y plasticidad sináptica. En modalidades particularmente preferidas, los agonistas de Trk de la invención (por ejemplo un BAG u otro polipéptido o peptidomimético agonista) pueden ser usados para bloquear o reducir una respuesta inhibidora del SNC. En otras modalidades de la invención, los agonistas de Trk (por ejemplo un BAG U otro polipéptido o peptidomimético agonista) pueden ser usados para mejorar y/o promover el crecimiento y recuperación neuronal, aún si se administra en un ambiente inhibidor,, como en presencia de uno o más inhibidores del SNC. En un ejemplo particular, debe comprenderse que existen factores inhibidores, como aquellos asociados con la mielina, que pueden inhibir o aún' prevenir procesos de crecimiento y reparación del SNC, incluyendo a aquellos citados anteriormente. Los ejemplos de esos inhibidores incluyen pero no se limitan a, glicoproteína asociada con la mielina (también referida como "MAG" ) , Nogo-A y la glicoproteína de mielina oligodendrocítica. Para la descripción más completa de esos inhibidores, véase también la Sección Señales Inhibidoras . Los agonistas y antagonistas de Trk de la invención pueden ser usados para modular respuestas que sean producidas por esos y otros inhibidores del SNC. Sin limitarse a ninguna teoría o mecanismo de acción particular, debe comprenderse que los receptores de Trk modulan el crecimiento y reparación del SNC al menos en parte por un mecanismo o mecanismos que implican a la proteína cinasa A (PKA) y fosfinositido 3 -cinasa (PI3K) . En consecuencia, los agonistas y antagonistas de Trk de la invención pueden en modalidades preferidas, modular efectos de las señales inhibidoras que son mediadas por uno o componentes que son modulados por si mismos por PKA o PI3K. Como un ejemplo, y no de manera limitante, debe comprenderse que la PKA activa Rho por fosforilación directa sobre la Serl88 de esa molécula (Ellerbroek et al . , J. Biol . Chem. 2003, 278:19023-19031). En consecuencia, los agonistas y antagonistas del Trk de la presente invención pueden ser usados para modular señales mediadas por las cascadas inhibidoras que implican a Rho. Esas incluyen inter alia, señales inhibidoras mediadas por inhibidores de mielina como la MAG (y constructos o plásmidos recombinantes de fusión de MAG, ' como MAG-Fc) , Nogo-A, la glicoproteína de mielina oligodendrocítica, NgR, GTlb y p75NTR. Otros inhibidores del SNC que implican a Rho incluyen señales mediadas por proteoglicanos de sulfato de condroitina, de cicatrices gliales del SNC (Monnier et al . , Neurosci . 2003, 22:319-330) y por lo tanto, esos inhibidores del SNC también pueden ser modulados por agonistas y antagonistas del Trk de la invención. Como otro ejemplo no limitante, se espera que la activación de PI3K supere la actividad inhibidora de las semaforinas (Eickholt et al . , J Cell Biol . 2002, 157:211-217) . En consecuencia, los agonistas y antagonistas del Trk de la presente invención pueden ser usados adicionalmente para modular esos inhibidores del SNC . En general, los métodos de la invención implican poner en contacto una célula que exprese el receptor Trk (típicamente una célula neuronal) con un agente modulador de Trk ya sea ip vivo o in vi tro . La cantidad de agente, modulador del Trk administrada será una "cantidad efectiva" -es decir, deberá ser una cantidad que module efectivamente una actividad de interés mediada por el Trk o, de manera alternativa, una cantidad que module efectivamente un inhibidor de SNC de interés. En modalidades donde el modulador de Trk es administrado como parte de un método terapéutico, la cantidad administrada deberá ser una cantidad que alivie efectivamente (pero no necesariamente elimine o cure) la condición, enfermedad o trastorno que este siendo tratado. De manera alternativa, la cantidad administrada puede ser una cantidad efectiva para aliviar (pero no necesariamente eliminar) uno o más síntomas asociados con la condición, enfermedad o trastorno que este siendo tratado. Como un ejemplo particular, no limitante, un agente modulador de Trk de la invención puede ser usado para modular (por ejemplo, inhibir o mejorar) el crecimiento neurológico, como la emergencia de neuritas. En esos métodos, la emergencia de neuritas puede ser mejorada y/o dirigida poniendo en contacto una neurona con uno o más agonistas de Trk de la invención (por ejemplo, el péptido cíclico N-Ac-CSRRGELLAASRRGELC-NH2) . De manera alternativa, la emergencia de neuritas puede ser inhibida y/o disminuida por el contacto de una neurona con uno o más antagonistas de Trk de la invención (por ejemplo, el péptido cíclico N-Ac-CSRRGEC-NH2) . Los agentes moduladores preferidos para usarse dentro de esos métodos están ligados preferiblemente a una matriz polimérica u otro soporte, y comprenden un péptido cíclico como se describen en la Sección Moduladores del receptor TRK: Péptidos Cíclicos, supra, o un peptidomimético del mismo (como se describe en la Sección Moduladores del Receptor TRK: Peptidomiméticos) . Los agentes moduladores que comprenden anticuerpos, o fragmentos de los mismos también pueden ser usados en esos métodos, con o sin el uso de enlazantes y materiales de soporte. El método para lograr el contacto de la célula neuronal y la cantidad del agente modulador del Trk administrada dependerá de la ubicación de la neurona así como el grado y naturaleza de la emergencia deseada (o, donde los antagonistas de Trk sean administrados, la extensión y naturaleza de la inhibición deseada) . Por ejemplo, una neurona puede ponerse en contacto (por ejemplo, vía implantación) con uno o más agentes moduladores de Trk ligados a un material de soporte como una sutura, guía nerviosa de fibra u otro dispositivo prostético, de modo que la emergencia de neurita sea dirigida a lo largo del material de soporte. De manera alternativa, puede emplearse una guía nerviosa tubular en la cual la luz de la guía nerviosa contenga una composición que comprenda el agente o agentes moduladores. In vivo, esas guías nerviosas u otros agentes moduladores soportados puede ser implantados usando técnicas bien conocidas, por ejemplo para facilitar el crecimiento de diferentes conexiones neuronales y/o para tratar daños y lesiones de la médula espinal. Será evidente para aquellos expertos en la técnica que la estructura y composición del soporte deberá se apropiada para el daño particular que este siendo tratado. In vi tro, puede ser usada igualmente una matriz polimérica para dirigir el crecimiento de neurona sobre superficies diseñadas como se describe, por ejemplo, en la Patente Estadounidense No. 5,510,628.

MODULADORES DEL RECEPTOR TRK; FORMULACIONES En ciertas modalidades, un agente modulador, como se describe aquí puede, pero no necesariamente, estar ligado a una o más moléculas adicionales. Por ejemplo, puede ser benéfico para ciertas aplicaciones ligar agentes moduladores múltiples (los cuales pueden, pero no necesariamente, ser idénticos) a una molécula de soporte (por ejemplo, hemocianina de cangrejo bayoneta) o un soporte sólido, como una matriz polimérica (la cual puede ser formulada como una membrana o microestructura, como una película ultradelgada) , una superficie de un recipiente (por ejemplo, la superficie de una placa de cultivo tisular o la superficie interior de un bioreactor) , o una perla u otra partícula que pueda ser preparada a partir de una variedad de materiales incluyendo el vidrio, plástico o cerámicas. Para ciertas aplicaciones, se prefieren materiales de soporte biodegradables, como la celulosa y derivados de la misma, colágeno, seda de araña o cualquiera de una variedad de poliésteres (por ejemplo, aquellos derivados de hidroxi ácidos y/o lactonas) o suturas (véase la Patente Estadounidense No. 5,245,012). Los métodos adecuados para enlazar un agente modulador para un material de soporte dependerán de la composición del soporte y el uso pretendido, y serán fácilmente evidentes por aquellos expertos en la técnica. La unión puede ser efectuada, de manera general, a través de asociaciones no covalentes, como la adsorción o afinidad, o de manera preferible vía unión covalente (la cual puede ser un enlace directo entre un agente modulador y grupos funcionales sobre el soporte, y puede ser un enlace por medio de un agente reticulante o enlazante) . La unión del agente modulador por adsorción puede ser lograda por contacto, en un amortiguador adecuado, con un soporte sólido durante un período de tiempo adecuado. El tiempo de contacto varía con la temperatura, pero de manera general es entre aproximadamente 5 segundos y 1 día, y típicamente de entre aproximadamente 10 segundos y 1 hora. La unión covalente de un agente modulador a una molécula o soporte sólido puede ser efectuada de manera general haciendo reaccionar primero el material de soporte con un reactivo bifuncional que también reaccionará con un grupo funcional, como un grupo hidroxilo, tiol, carboxilo, cetona o amino, sobre el agente modulador. Por ejemplo, un agente modulador puede ser unido a un soporte o recubrimiento polimérico apropiado usando benzoquinona, por condensación de un grupo aldehido sobre el soporte con una amina y un hidrógeno activo sobre el agente modulador o por condensación de un grupo amino sobre el soporte con ácido carboxílico sobre el agente modulador. Un método preferido para generar un enlace es vía grupos amino usando glutaraldehído. El agente modulador puede ser ligado a celulosa vía enlaces éster. De manera similar, los enlaces amida pueden ser adecuados para enlazar a otras moléculas como la hemocianina de cangrejo bayoneta u otros materiales de soporte. Pueden ser unidos agentes moduladores y/o moléculas moduladoras múltiples que comprendan otras secuencias de NT y/o receptor de Trk por ejemplo, por acoplamiento aleatorio, en el cual se mezclen cantidades equimolares de esas moléculas con un soporte de matriz y se dejen acoplar al azar. Aunque los agentes moduladores como se describen aquí, pueden unirse preferiblemente a tejidos o células específicas (es decir, células o tejidos neuronales), y de este modo puede ser suficiente hacer blanco en un sitio deseado in vivo, puede ser benéfico para ciertas aplicaciones o incluir un agente director adicional. En consecuencia, un agente director también puede, o de manera alternativa, ser ligado un agente modulador para facilitar la dirección a uno o más tejidos específicos. Como se usa aquí, "un agente director" puede ser cualquier sustancia (como un compuesto o célula) que, cuando se ligue a un agente modulador mejore el transporte del agente modulador a un agente blanco, incrementando por lo tanto la concentración local del agente modulador. Los agentes directores incluyen anticuerpos o fragmentos de los mismos, receptores, ligandos y otras moléculas que se unen a células de, o en la vecindad de, el tejido blanco. Los agentes directores conocidos incluyen hormonas de suero, anticuerpos contra antígenos de la superficie celular, lectinas, moléculas de adhesión, ligandos de unión de la superficie de células tumorales, esteroides, colesterol, linfocinas, enzimas fibrinolíticas y aquellos fármacos y proteínas que se unen a un sitio blanco deseado. Un agente director de anticuerpo puede ser una molécula intacta (completa) o un fragmento de la misma, o un equivalente funcional de la misma. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos son los fragmentos F (ab' ) 2 , -Fab' , Fab y F [v] , los cuales son producidos por métodos convencionales o por ingeniería genética o de proteína. El enlace es generalmente covalente y puede ser efectuado, por ejemplo, por condensación directa u otras reacciones, o por medio de enlazantes bi o multifuncionales . Dentro de otras modalidades, también puede ser posible dirigir un polinucleótido que codifique para un agente modulador a un tejido blanco, incrementando por lo tanto la concentración local del agente modulador. Esa dirección puede ser lograda usando técnicas bien conocidas, incluyendo la infección retroviral y adenoviral . Para ciertas modalidades, puede ser benéfico también, o de manera alternativa enlazar un fármaco a un agente modulador. Como se usa aquí el término "fármaco" se refiere a un agente bioactivo que se pretende sea administrado a un mamífero para prevenir o tratar una enfermedad u otra condición indeseable. Los fármacos incluyen hormonas, factores del crecimiento, proteínas, péptidos y otros compuestos . El uso de ciertos fármacos específicos dentro del contexto de la presente invención se discute más adelante . Dentro de ciertos aspectos de la presente invención, uno o más agentes moduladores como se describen aquí pueden estar presentes dentro de una composición farmacéutica. Una composición farmacéutica comprende uno O. más agentes moduladores en combinación con uno o más portadores, diluentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables. Esas composiciones pueden comprender amortiguadores (por ejemplo, solución salina amortiguada neutra o solución salina amortiguada con fosfato) carbohidratos (por ejemplo, glucosa, mañosa, sucrosa o dextrano) , manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos como la glicina, antioxidantes, agentes quelantes como el EDTA o glutation, adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio) y/o preservativos. Dentro de otras modalidades más, las composiciones de la presente invención pueden ser formuladas como liofilizado. Un agente modulador (solo o en combinación con un agente director y/o fármaco) puede, pero no necesariamente, ser encapsulado dentro de liposomas usando una tecnología bien conocida. Las composiciones de la presente invención pueden ser formuladas para cualquier forma apropiada de administración, incluyendo, por' ejemplo, la administración tópica, oral, nasal, intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. Para ciertas aplicaciones tópicas, se prefieren formulaciones como cremas o lociones, usando componentes bien conocidos. Opcionalmente, una composición farmacéutica también puede contener uno o más fármacos, los cuales pueden estar ligados a un agente modulador o pueden estar libres dentro de la composición. Eventualmente, cualquier fármaco puede estar administrado en combinación con un agente modulador como se describe aquí, para una variedad de procesos como se describe más adelante. Los ejemplos de tipos de fármacos que pueden ser administrados con un agente modulador incluyen pero no se limitan a analgésicos, anestésicos, antianginales, antimicóticos, antibióticos, fármacos anticáncer (por ejemplo, taxol o mitomicina C) , antiinflamatorios (por ejemplo, ibuprofeno e indometacina), antihelmínticos, antidepresivos, antídotos, antieméticos, antihistaminas, antihipertensivos, antimalariales, agentes antimicrotúbulos (por ejemplo, colchicina o alcaloides de vinca) , agentes antimigraña, antimicrobianos, antipsicóticos, antipiréticos, antisépticos, agentes antiseñalización (por ejemplo, inhibidores de proteínas cinasa C o inhibidores de la movilización de calcio intracelular) , antiartríticos, agentes antitrombinos, antituberculósicos, antitusivos, antivirales, supresores del apetito, fármacos cardioactivos, fármacos para la dependencia química, catárticos, agentes quimio terapéuticos, vasodilatores coronarios, cerebrales o periféricos, agentes anticonceptivos, depresivos, diuréticos, expectorantes, factores del crecimiento, agentes hormonales, hipnóticos, agentes inmunosupresores, antagonistas de narcóticos, parasimpatomiméticos, sedantes, estimulantes, simpatomiméticos, toxinas (por ejemplo, toxina del cólera), tranquilizantes y antiinfecciosos urinarios. Para propósitos de formación de imágenes, puede ser incorporado cualquiera de una variedad de agentes de diagnóstico en una composición farmacéutica, ya sea ligado a un agente modulador o libre dentro de la composición. Los agentes de diagnóstico incluyen cualquier sustancia administrada para iluminar una función fisiológica dentro de un paciente, dejando a la vez otras funciones fisiológicas generalmente sin afectar. Los agentes de diagnóstico incluyen metales, isótopos radioactivos, y agentes raioopacos (por ejemplo, compuestos que contienen galio, tecnecio, indio, estroncio, yodo, bario, bromo y fósforo) , agentes radiolucientes, agentes de contraste, tintes (por ejemplo, tintes fluorescentes y cromóforos) y enzimas que catalizan una reacción calorimétrica o fluorométrica. En general, esos agentes pueden ser unidos usando una variedad de técnicas como se describió anteriormente, y pueden estar presentes en cualquier orientación. Las composiciones descritas aquí pueden ser administradas como parte de una formulación de liberación sostenida (es decir, una formulación con una cápsula o esponja que efectúe la liberación lenta del agente modulador después de la administración) . Esas formulaciones pueden ser preparadas, de manera general, usando una tecnología bien conocida y administradas, por ejemplo, por administración oral, rectal o implantación subcutánea, o por implantación en el sitio blanco deseado. Las formulaciones de liberación sostenida pueden contener un agente modulador disperso en una matriz portadora y/o contenido dentro de un reservorio rodeado por una membrana que controle la velocidad (véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente Europea 710,491A) . Los portadores para usarse dentro de estas formulaciones son biocompatibles, y también pueden ser biodegradables; preferiblemente la formulación proporciona un nivel relativamente constante de liberación de agente modulador. La cantidad de agente modulador contenida dentro de una formulación de liberación sostenida depende del sitio de implantación, la velocidad y duración esperada de la liberación y naturaleza de la condición a ser tratada o prevenida.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser administradas en una forma apropiada a la enfermedad a ser tratada (o prevenida) . Las dosis apropiadas y la duración y frecuencia de la administración serán determinadas por factores tales como la condición del paciente, tipo y severidad de la enfermedad del paciente y el método de administración. En general, el régimen de dosificación y tratamiento apropiado proporciona los agentes moduladores en una cantidad suficiente para proporcionar el beneficio terapéutico y/o profiláctico. Dentro de modalidades particularmente preferidas de la invención, un agente modulador o composición farmacéutica como se describe aquí puede ser administrado a una dosis que fluctúa de 0.001 a 50 mg/kg de peso corporal, de manera preferible de 0.1 a 20 mg/kg, en un régimen de una sola o múltiples dosis diariamente. Para la administración tópica, una crema típicamente comprende una cantidad de agente modulador que fluctúa de 0.00001% al 1%, preferiblemente del 0.0001% al 0.2%, y de manera más preferible del 0.0001% al 0.002%. Las composiciones fluidas típicamente contienen de aproximadamente 10 ng/ml a 5 mg/ml, de manera preferible de aproximadamente 10 .mu.g a 2 mg/Ml de peptidomimético. Las dosis apropiadas pueden ser determinadas generalmente usando modelos experimentales y/o ensayos clínicos. En general, el uso de la dosis mínima que es suficiente para proporcionar una terapia efectiva es el preferido. Los pacientes pueden ser verificados de manera general por la efectividad terapéutica usando ensayos adecuados para la condición que esté siendo tratada o prevenida, los cuales serán familiares a aquellos expertos en la técnica. Los moduladores del receptor Trk también pueden ser formulados de acuerdo a la descripción proporcionada en la sección de Agentes de Unión de P75 : Métodos para Promover el Crecimiento del SNC, infra .

AGENTES DE UNION DE p75 El término "agente de unión del receptor de p75" se usa aquí para describir una molécula natural o sintética (por ejemplo, recombinante) , la cual se une a un receptor de p75 acoplado en un complejo inhibidor, e interfiere con la interacción receptor de p75: neurotrofina pero no con la interacción neurotrofina: receptor de Trk. De este modo un agente de unión del receptor de p75 facilita el crecimiento neuronal mediado con neurotrofina en un ambiente inhibidor. Un receptor de p75 se acopla en un complejo inhibidor cuando interactúa con un receptor de nogo y cualguiera de las proteínas asociadas con la mielina (por ejemplo, MAG, Nogo-A, glicoproteína de mielina oligodendrocítica) . Los ejemplos de agentes de unión del receptor de p75 incluyen, pero no se limitan a neurotrofinas, como el NGF, y agentes derivados de neurotrofinas, como el N-Ac-CTDIKGKEC-NH2 (SEQ ID NO: 43) derivado de la espira de unión del NGF. Una neurotrofina es un agente de unión del receptor de p75 de acuerdo a la invención si interfiere con la unión de otra neurotrofina diferente al receptor de p75 y no interactúa con el receptor Trk expresado sobre la neurona dañada. Por ejemplo, en el caso de neuronas que expresan TrkB pero no TrkA, la neurotrofina NGF es un agente de unión del receptor de p75 debido a que el NGF competirá (es decir, interferirá) con una neurotrofina que se una a TrkB (por ejemplo, BDNF) por la unión del receptor de p75 pero no interferirá con la unión de la neurotrofina (por ejemplo, BDNF) al receptor TrkB. En una modalidad preferida, un agente de unión del receptor de p75 comprende al menos un péptido cíclico o compuesto peptidomimético que contienen el motivo TDIKGKE (es decir, Thr-Asp-Ile-Lys-Gly-Lys-Glu) de NGF (SEQ ID NO: 42) dentro de un anillo cíclico del péptido cíclico o el compuesto peptidomimético. Un agente de unión del receptor de p75 especialmente preferido es N-Ac-CTDIKGKEC-NH2 (SEQ ID NO: 43) . Como se hizo notar anteriormente, las secuencias peptídicas subrayadas denotan un péptido que ha sido ciclizado por un enlace covalente entre los dos últimos residuos subrayados. En esos ejemplos, los agentes de unión p75 fueron ciclados por un enlace disulfuro entre los residuos de cisteína, acetilados y bloqueados por amida. Debe comprenderse que los péptidos preferidos que se unen al receptor de p75 estarán restringidos, y en consecuencia, son preferiblemente péptidos cíclicos. Los métodos para la ciclización de péptidos se describen en la sección Moduladores del Receptor TRK: Péptidos Cíclicos, supra . Pueden estar presentes péptidos cíclicos y/o peptido íméticos múltiples en un agente de unión del receptor de p75. Además, pueden ser incluidas secuencias TDIKGKE adicional (por ejemplo, repeticiones en serie de secuencias de TDIKGKE) en un agente de unión del receptor de p75. Pueden ser usados o no, enlazantes para separar las secuencias de unión del receptor de p75 en un agente de unión de receptor de p75, incluyendo repeticiones en serie de secuencias de unión del receptor de p75. Un enlazante puede ser cualquier molécula (incluyendo secuencias peptídicas y/o no peptídicas así como aminoácidos individuales u otras moléculas) , que puedan enlazarse covalentemente a al menos dos secuencias peptídicas y/o peptidomiméticos y que no contenga una secuencia de unión del receptor de p75. Usando un enlazante, los peptidomiméticos y otras secuencias peptídicas o de proteína pueden ser unidas en una variedad de orientaciones . Los agentes de unión del receptor de p75 pueden contener uno o más peptidomiméticos . Preferiblemente esos peptidomiméticos están adyacentes entre sí (es decir, sin secuencias intervinientes) o están muy cerca (es decir, separados por enlazantes peptídicos y/o no peptídicos para dar una distancia entre los peptidomiméticos que fluctúa de aproximadamente 0.1 a 400 nm) . Un agente de unión de un receptor de p75 puede consistir totalmente de uno o más peptidomiméticos, o puede contener componentes peptídicos y/o no peptídicos adicionales. Los métodos para producir un peptidomimético son descritos en las secciones Farmacóforos del Receptor TRK y Moduladores del Receptor TRK: Peptidomiméticos, supra . Toda o una parte de un agente de unión del receptor de p75 puede ser sintetizada en células vivientes, usando cualquiera de variedad de vectores de expresión conocidos por aquellos expertos en la técnica que sean apropiados para la célula anfitriona particular. Las células anfitrionas adecuadas pueden incluir bacterias, células de levadura, células de mamífero, células de insecto, células de plantas, algas y otras células de animales (por ejemplo, hibridoma, CHO, mieloma) . Las secuencias de ADN expresadas de esta manera pueden codificar para porciones de una neurotrofina endógenas . Esas secuencias pueden ser preparadas sobre la base de secuencias de ADNc genómicas conocidas, o de secuencias aisladas por la separación de una biblioteca apropiada. Esas separaciones pueden ser efectuadas de manera general como se describe en Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989 (y referencias citadas ahí) . También puede ser empleada la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , usando cebadores oligonucleotídicos en métodos bien conocidos en la técnica, para aislar moléculas de ácido nucleico que codifiquen para toda o una porción de una neurotrofina endógena. Para generar una molécula de ácido nucleico que codifique para una porción peptídica de un agente modulador, una secuencia endógena puede ser modificada usando técnicas bien conocidas. De manera alternativa, las porciones de las secuencias de ácido nucleico deseadas pueden ser sintetizadas usando técnicas bien conocidas, y entonces ligadas juntas para formar una secuencia que codifique para una porción del agente de unión del receptor de p75.

AGENTES DE UNION DE p75; MÉTODOS PARA PROMOVER EL CRECIMIENTO DEL SNC La presente invención proporciona métodos para promover el crecimiento del SNC los cuales comprenden administrar un agente de unión del receptor de p75. Los receptores Trk están implicados en el crecimiento y reparación del SNC y procesos como la sobrevivencia neuronal, crecimiento axonal, emergencia de neuritas, plasticidad sináptica, y de manera más general, el crecimiento neurológico. Los receptores de p75 se unen a las neurotrofinas con una baja afinidad y esta unión compromete la capacidad de las neurotrofinas para activar los receptores Trk en la situación donde el receptor de p75 está acoplado en un complejo inhibidor. En consecuencia, los métodos que interfieren con la unión de las neurotrofinas al receptor de p75 permiten que las neurotrofinas se unan a y activen los receptores Trk, y de este modo promueven el crecimiento de las neuronas del SNC en un ambiente inhibidor. En un aspecto de la presente invención, se proporciona un método el cual comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de unión del receptor de p75 en combinación con al menos una neurotrofina. Una neurotrofina preferida es el NGF, BDNF, NT-3, NT-4 o NT-5. En una modalidad, el agente de unión del receptor de p75 es administrado en una cantidad de aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100 veces mayor que la de la neurotrofina. En otra modalidad, el agente de unión del receptor de p75 es NGF y la neurotrofina es BDNF. Los métodos de la presente invención pueden ser usados para tratar condiciones, enfermedades y trastornos que estén asociados con daño o una función dañada del SNC. Las condiciones ejemplares incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, apoplejía, y daño cerebral traumático, y daño de la médula espinal. De acuerdo a los métodos de la presente invención, una neurotrofina es un agente de unión de receptor de p75 cuando la neurotrofina interfiere con la unión de otra neurotrofina diferente al receptor de p75 acoplado en un complejo inhibidor, pero no interfiere con la unión de otra neurotrofina diferente al receptor Trk expresado sobre una neurona del SNC dañada. Por ejemplo, el NGF es un agente de unión del receptor de p75 de acuerdo a la presente invención si se coadministra con BDNF a un individuo con neuronas que expresen receptor TrkB debido a que el NGF compite con el BDNF por la unión al receptor de p75 pero no compite con el BDNF por la unión al receptor TrkB. Un agente receptor de p75 como se describe aquí puede estar presente dentro de una composición farmacéutica. Una composición farmacéutica comprende un agente de unión del receptor de p75 en combinación con uno o más portadores, diluentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables . Esas composiciones pueden comprender amortiguadores (por ejemplo, solución salina amortiguada neutra o solución salina amortiguada con fosfato) , carbohidratos (por ejemplo, glucosa, mañosa, sucrosa o dextranos) , manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos como la glicina, antioxidantes, agentes guelantes como el EDTA o glutation, adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio) y/o preservativos. Dentro de otras modalidades más, las composiciones de la presente invención pueden ser formuladas como un liofilizado. Un agente de unión del receptor de p75 (solo o en combinación con un agente y/o fármaco director) puede ser encapsulado dentro de liposomas usando tecnología bien conocida. Las composiciones de la presente invención pueden ser formuladas para cualquier forma de administración apropiada, incluyendo, por ejemplo, la administración tópica, intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. Las composiciones farmacéuticas que comprenden el agente de unión del receptor de p75 pueden ser administradas por cualesquier medios que permitan que el agente de unión del receptor de p75 alcancen a y se unan a los receptores p75 en el cuerpo de un individuo. Las formas inyectables estériles de las composiciones farmacéuticas que comprenden un agente de unión del receptor de p75 pueden ser suspensiones acuosas u oleosas . Esas suspensiones pueden ser formuladas de acuerdo a métodos conocidos en la técnica usando agente de dispersión o humectantes y agentes suspensores adecuados. Una preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluente o solvente aceptable parenteralmente, no tóxico. Entre los vehículos y solventes aceptables que pueden ser empleados se encuentran el agua estéril, solución de Ringer lactada y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, convencionalmente se emplean además, aceites fijos, estériles, como solventes o medio de suspensión. Para este propósito, puede ser empleado cualquier aceite blando o fijo incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, como el ácido oleico y sus derivados de glicerina, son útiles en la preparación de inyectables, como lo son los aceites farmacéuticamente aceptables naturales, como el aceite de oliva o aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietilada. Esas soluciones o suspensiones oleosas también pueden contener un diluente o dispersante alcohólico de cadena larga. Un agente de unión del receptor de p75 también puede ser formulado de acuerdo a la descripción proporcionada en la sección Moduladores del Receptor TRK: Formulaciones, supra . Los agentes de unión del receptor de p75 pueden ser administrados tópicamente. Por ejemplo, un agente de unión del receptor de p75 puede ser aplicado tópicamente a la médula espinal expuesta de un individuo después de un daño a o durante la cirugía de la médula espinal. Para la aplicación tópica, una composición farmacéutica puede ser formulada en un ungüento adecuado que contenga el agente de unión del receptor de p75 suspendido o disuelto en uno o más portadores. Los portadores para la administración tópica de los agentes de unión del receptor de p75 incluyen, pero no se limitan a, aceite mineral, petrolato líquido, petrolato blanco, cera emulsificante, agua o materiales absorbibles, como, por ejemplo, gel de colágeno tipo I o esponja de hemostasis de gelatina (Gelfoam®, Pharmacia & Upjohn, Kalamazoo, MI) . Las dosis apropiadas y la duración y frecuencia de la administración serán determinadas por factores como la condición del paciente, el tipo y severidad de la enfermedad del paciente y el método de administración. En general, una dosis y régimen del tratamiento apropiados proporcionan el agente de unión de p75 en una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico y/o profiláctico. Varias consideraciones para determinar las dosis apropiadas se describen, por ejemplo, en Gilman et al. (eds), The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8va Ed. (1990) , Pergamon Press. Las dosis apropiadas pueden ser determinadas, de manera general , usando modelos experimentales y/o ensayos clínicos. En general, el uso de la dosis mínima que es suficiente para proporcionar la terapia efectiva es el preferido. Los pacientes pueden ser verificados por la efectividad terapéutica usando un examen físico, estudios de formación de imágenes o ensayos adecuados para la condición que esté siendo tratada o prevenida, los cuales serán familiares a aquellos expertos en la técnica. Los ajustes de dosis pueden hacerse sobre la base de los hallazgos de la verificación. Por ejemplo, un individuo con un daño en la médula espinal asociado con pérdida de sensación en un brazo puede ser verificado, después de la administración de un agente de unión del receptor de p75 de acuerdo a la invención, para regresar la sensación al brazo mediante un examen físico. Las composiciones que comprenden un agente de unión del receptor de p75 pueden ser administradas como parte de una formulación de liberación sostenida (es decir, una formulación como una cápsula o esponja que efectúe una liberación lenta del agente de unión del receptor de p75 después de la administración) . Esas formulaciones pueden ser preparadas, de manera general, usando una tecnología bien conocida y administradas, por ejemplo, por implante o implantación subcutánea en el sitio blanco deseado. Las formulaciones de liberación sostenida pueden contener un agente de unión del receptor de p75 disperso en una matriz portadora y/o contenido dentro de un reservorio rodeado por una membrana que controle la velocidad (véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente Europea 710,491A). Los portadores para usarse dentro de esas formulaciones son biocompatibles, y también pueden ser biodegradables; preferiblemente la formulación proporciona un nivel relativamente constante de liberación del agente de unión. La cantidad de agente de unión contenida dentro de una formulación de liberación sostenida que tenga del sitio de implantación, la velocidad y duración esperada de la liberación y la naturaleza de la condición a ser tratada. Aunque un agente de unión del receptor de p75 como se describe aquí puede unirse preferiblemente a tejidos o células específicas (es decir, células y tejidos neuronales) y de este modo puede ser suficiente dirigirlo a un sitio deseado in vivo, puede ser benéfico para ciertas aplicaciones incluir un agente director adicional. En consecuencia, un agente director puede ser ligado a un agente de unión del receptor de p75 para facilitar la dirección a uno o más tejidos específicos. Como se usa aquí, un "agente director del receptor de p75" puede ser cualquier sustancia (como un compuesto o célula) que, cuando se ligue a un agente de unión del receptor de p75, mejore el transporte del agente de unión del receptor de p75 a un tejido blanco (es decir, una neurona dañada) incrementando por lo tanto la concentración local del agente unido al receptor de p75. Los agentes directores pueden incluir anticuerpos o fragmentos de los mismos, receptores,' ligandos y otras moléculas que se unan a células de, o en la vecindad, del tejido blanco. Los agentes directores conocidos incluyen hormonas de suero, anticuerpos contra antígenos de la superficie celular, lectinas, moléculas de adhesión, ligandos de unión de la superficie celular tumoral, esteroides, colesterol, linfocinas, enzimas fibrinolíticas y aquellos fármacos y proteínas que se unen a un sitio blanco deseado. Un agente director de anticuerpo puede ser una molécula intacta (completa) , o fragmento de la misma o un equivalente funcional de la misma. Por ejemplo, una MAG, Nogo-A o anticuerpo de glicoproteína de mielina pueden ser un agente director. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos son los fragmentos F(ab')2, -Fab', Fab y F [v] , los cuales pueden ser producidos por métodos convencionales o por ingeniería genética o de proteínas. El enlace es generalmente covalente y puede ser logrado, por ejemplo, por condensación directa u otras reacciones, o por medio de enlazantes bi o multifuncionales . Dentro de otras modalidades también es posible dirigir un plinucleótido que codifica para un agente de unión o un tejido blanco, incrementando por lo tanto la concentración local del agente de unión. Esa dirección puede ser lograda usando técnicas bien conocidas, incluyendo la infección retroviral y adenoviral . Para ciertas modalidades, puede ser benéfico enlazar un fármaco a un agente de unión del receptor de p75. Para una descripción de fármacos adecuados para enlazarse a un agente de unión del receptor de p75, véase la sección Moduladores del Receptor TRK: Formulaciones, supra .

EJEMPLOS La presente invención también es descrita y demostrada por medio de los siguientes ejemplos. Sin embargo, el uso de esos y otros ejemplos en cualquier lugar en la especificación es únicamente ilustrativa y no limita de ninguna manera el alcance y significado de la invención o de cualquier término ejemplificado. De igual modo, la invención no se limita a ninguna modalidad particularmente preferida descrita aquí. En realidad, muchas modificaciones y variaciones de la invención pueden ser evidentes a aquellos expertos en la técnica tras leer esta especificación, y esas variaciones pueden hacerse sin apartarse del espíritu o alcance. La invención por lo tanto es limitada únicamente por los términos de las reivindicaciones anexas junto con todo el alcance de las equivalentes a que tienen derecho aquellas reivindicaciones .

PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Ensayo de la Emergencia de Nueritas Se establecieron cocuitivos de neuronas cerebelares sobre monocapas de células 3T3 o células LK8 madre (una línea celular 3T3 transfectada establecida que expresa niveles fisiológicos de N-caderina de pollo; véase Doherty et al . , Neuron 1991 , 6: 247-258) como lo describió anteriormente Williams et al. (Neuron 1994, 13: 583-594). Las células fueron mantenidas en medio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado con 10% de suero de carnero fetal (FCS) . Para el establecimiento de los cocultivos, se cultivaron aproximadamente 80,000 células 3T3 (o células LK8) en cámaras individuales de una placa de cultivo tisular de ocho cámaras recubierta con poli-L-lisina y fibronectina. Las células cultivadas fueron mantenidas durante la noche en medio de Eagle modificado de Dulbecco ("DMEM") suplementado con 10% de FCS para permitir la formación de monocapas confluentes. El medio fue removido y se cultivaron aproximadamente 6,000 neuronas cerebelares disociadas (tomadas de ratas de 9 días, postnatales) en cada pozo en medio SATO suplementado con 2% de FCS. Se agregaron reactivos de prueba como se indica en el texto y los cocultivos se mantuvieron durante 18 horas. Los cocultivos fueron entonces fijados y teñidos para la inmunorreactividad con GAP-43. La longitud media de la neurita más larga por célula fue medida de entre aproximadamente 120 y 150 neuronas, nuevamente como se describió anteriormente por Williams et al. (Neuron 1994, 13: 583-594) .

Modelaje Molecular de Estructuras del Ligando del Receptor Trk Se usaron estructuras de cristalografía de rayos X de los complejos ?GF/TrkA y ?T-4/TrkB para el modelaje molecular. Esas estructuras habían sido previamente descritas (véase, respectivamente, Wiesmann et al. Nature 1999, 401: 184-188; y Banfield et al. Structue (Camb) 2001, 9: 1191-1199) y se puede tener acceso fácilmente a ellas, por ejemplo, en la Internet a partir del Banco de Datos de Proteínas (PDB) bajo los números de acceso Iwww (para NGF/TrkA) y lhcf (para NT-4/TrkB) . Se usaron paquetes de programas y sistemas de programación PDB suizos para aislar las estructuras de varios motivos de las imterfaces de unión de los cristales, y se usaron los programas y sistemas de programación o software Accelrys para generar imágenes . Los perfiles de contacto fueron generados a partir de varias imterfaces ligando/receptor en la estructura cristalina de NT-4/TrkB midiendo el número promedio de contactos del receptor por residuo de ligando contra el número de secuencia del residuo de ligando. El promedio que tomó sobre una ventana de tres residuos y el número de contacto es el número de residuos de receptor que están dentro de cinco Angstroms del aminoácido del ligando dado.

Reactivos El FGF2, BDNF y NT-4/5 humano recombinados se obtuvieron todos de R&D systems (Minneapolis, MN) . El agonista del receptor canabinoide CBl mesilato de WIN55, 2122-2 fue obtenido y usado como se describió anteriormente (véase, Williams et al . , J. Cell . Biol . 2003, 160: 481-486). El antagonista receptor de Trk K252a se obtuvo de Calbiochem (San Diego, CA) . El antagonista de FGFR PD173074 (Mohammadi et al . , E bo J 1998, 17: 5986-5904) fue sintetizado y usado como se describió anteriormente por Skaper et al . ' ( J. Neurochem. 2000, 75: 1520-1527) y por Hamby et al . , J. Med. Chem. 1997, 40: 2296-2303). Los péptidos sintéticos se obtuvieron todos de un distribuidor comercial (Múltiple Peptide Systems, San Diego, CA) . Todos los péptidos fueron purificados por cromatografía de líquidos de alto desempeño en fase inversa (RP-HPLC) de acuerdo a métodos de rutina, y se obtuvieron al nivel más alto de pureza (es decir, más del 95% puro) . Donde las secuencias peptídicas están subrayadas (a través de esta especificación) denotan un péptido que ha sido ciclizado por un enlace covalente entre los dos últimos residuos subrayados. En esos ejemplos, los péptidos fueron ciclizados por un enlace disulfuro entre dos residuos de cisteína, acetilados y bloqueados por amida.

IDENTIFICACIÓN DE UNA SECUENCIA PEPTIDICA LINEAL DE NT-4 QUE PUEDE INTERACTUAR CON EL RECEPTOR TRKB Esta sección describe los experimentos de modelaje molecular que identifican una secuencia peptídica lineal (LIP) adecuada, de ligandos de neurotrofina natural que se unen a un sitio clave en un receptor Trk. Evidencias considerables sugieren que el dominio (D5) de inmunoglobulina (Ig) próximo a la membrana del receptor Trk está implicado directamente en la unión de NTs . Véase, por ejemplo Pérez et al., Mol . Cell Neurosci . 1995 6:97-105; y Urfer et al., Embo J. 1995, 14:2795- 2805. Las estructuras cristalinas del complejo de NGF/TrkA (Wiesmann et al., Nature 1999, 401: 184-188) y del complejo de NT-4/TrkB (Banfield et al., Structure (Camb) 2001,1191-1199) han sido resueltas, lo cual apoya este punto de vista. En ambas estructuras, un solo diméro de NT se acopla a moléculas receptoras Trk con cada molécula de NT en la interacción dimérica, en turno, con cada molécula del receptor Trk. Ambas estructuras cristalinas fueron analizadas con un algoritmo diseñado para resaltar las regiones lineales sobre el ligando que interactúa con el receptor (Doherty et al . , Mol . Cell Neurosci 2000, 16:283-295). Para ilustrar este análisis la estructura cristalina de NT-4/TrkB (D5) se muestra aquí en la Figura 6A. Dentro de este complejo, un monoméro de NT individual (marcado como ax) hace contacto lineal con ambos monómeros de receptor TrkB (marcados como bx y b2) . Ambas de esas dos imterfaces fueron analizadas, y este análisis es ilustrado en las Figuras 6B-6C. En esas figuras, las imterfaces entre el NGF y el receptor TrkA se muestran con líneas punteadas, donde las imterfaces entre NT-4 y TrkB se muestran como una línea continua. Como puede observarse en la inspección de esas dos figuras, las imterfaces se superponen considerablemente para esos dos complejos ligando-receptor. El análisis del perfil del contacto indica que el N-terminal del ligando de NT hace el contacto más intimo con el receptor Trk (Figura 6C) . Además, existe un pequeño motivo lineal (SRRGE) situado en el pico dominante en el perfil de contacto como la mitad de una hélice y puede ser considerado como una espira cerrada o apretada. La secuencia está estrechamente conservada en el BDNF (ARRGE) , el cual también se une al receptor TrkB, y está parcialmente conservada en el NGF (FHRGE) y NT-3 (SHRGE) , ligandos para los receptores TrkA y TrkC, respectivamente. De manera interesante, esta región de las neurotrofinas esta desordenada en estructuras cristalinas de NT mo unidas (véase, McDonald et al . , Nature 1991,354: 411-414) y por lo tanto no ha sido sometida previamente a estudios peptídicos. El perfil de contacto de la interfaz ax/b2, se ilustra en la Figura 6B. Las espiras de 1-4 de NT, otras de las cuales han sido implicadas en la interacción de NT/Trk (LeSauteur et al . , J. Biol . Chem. 1995, 270:6564-6569) se encuentran resaltadas. Sin embargo, en ninguna de esas espiras figura en la interfaz a?/bx, y únicamente la espira 1 está implicada en el interfaz ax/b2.

DESARROLLO DE UN PEPTIDO ANTAGONISTA DE TRKB Se cultivaron neuronas cerebelares, aisladas de cachorros de ratas en PND2 , sobre monocapas de fibroblastos 3T3 en medios de control o en medios suplementados con una gama de concentraciones de BDNF y/o NT-4. Después de 16 horas los cocultivos fueron fijados y la longitud de media de las neuritas determinado como llave han sido descritos anteriormente (Williams et al . , J. Biol . Chem . 2000, 275: 4007-4012) . Los resultados, los cuales se ilustran en la Figura 7A, muestran que ambos ligandos estimulan la emergencia de neuritas en una forma dependiente de la dosis con una respuesta máxima observada entre aproximadamente 1 y 10 ng/ml. Los resultados en la Sección Identificación de Una Secuencia Peptídica lineal de NT-4 que puede Interactuar con el Receptor Trkb, supra, sugieren que un péptido restringido de manera apropiada del motivo de RGE lineal pequeño esta presente en todas las NT podrían tener una alta superposición estructural con la estructura de la NT nativa, y por lo tanto funciona como un antagonista del receptor Trk. Para probar esta hipótesis, se diseñó una versión cíclica del LIP que fue restringida por un enlace disulfuro que tiene la secuencia de aminoácido: N-Ac-CRGEC-NH2. El efecto de este péptido sobre la respuesta del BDNF y NT-4 fue probado en el ensayo de emergencia o crecimiento de neuritas descrito anteriormente, con ambos ligandos de NT usados en concentraciones de 5 ng/ml. Esos resultados, los cuales son ilustrados en la Figura 7B muestran que el péptido antagoniza a las respuestas del BDNF y la NT-4, con una inhibición del 50% observada a 144 ± 23 µM para la respuesta del BDNF 112 ± 22 µM para la respuesta de NT-4. En contraste el péptido no tiene efecto sobre la emergencia de neuritas basal cuando se probó en concentraciones mayores de aproximadamente 400 µM y en ausencia de cualquier ligando de NT natural. Esos resultados sugieren que el péptido cíclico en sí no tiene efectos específicos sobre la sobrevivencia neuronal y emergencia de neuritas .

UN LIP DE NT-4 ES UN ANTAGONISTA DE TRKB MAS POTENTE QUE LOS LIP DE NT-3 Y NGF EQUIVALENTES El motivo de la secuencia de RGE es compartido por todas las NT. Sin embrago, las secuencias de aminoácidos que flanquean este motivo difieren entre los ligandos de Trka, TrkB y TrkC . Por lo tanto se probó una serie de péptidos "equivalentes", diseñados de secuencias de diferentes ligandos, de NT para determinar si un péptido extendido del ligando de TrkB podría ser un antagonista del receptor TrkB más activo. Los estudios de modelaje molecular sugieren que el péptido N-Ac-CSRRGEC-NH2 comparte una superposición estructural con el motivo de SRRGE natural de la NT-4. En consecuencia, esta secuencia peptídica fue probada a lo largo de péptidos equivalentes derivados de NGF (N-Ac-CFHRGEC-NH2) y NT-3 (N-Ac-CSHRGEC-NH2) por su capacidad para inhibir las respuestas de BDNF y NT-4 en el ensayo de emergencia de neuritas descrita en la sección Desarrollo de un Péptido Antagonista de TrkB, supra. De manera sorprendente, la N-Ac-CSRRGEC-NH2 derivado de NT-4 fue de aproximadamente 5 veces menor de los péptidos derivados de NGF y NT-3 en la inhibición de la respuesta del BDNF, con una inhibición del 50% observada a 27 + 6 µM. Esos resultados son ilustrados en la Figura 7C. Como se hizo notar anteriormente, la adición de tan poco como dos aminoácidos residuales flanqueantes de NT-4 incrementó la eficacia del péptido hasta cinco veces contra una respuesta del TrkB. Además de los aminoácidos equivalentes de cualquiera de la NGF o la NT-3 no tuvieron un efecto discernible sobre la eficacia del péptido RGE cíclico original, sugiriendo que la selectividad de la unión de NT puede ser determinada, al menos en parte, por la naturaleza de los aminoácidos residuales que flanquean inmediatamente el motivo de RGE. En realidad, un cuerpo considerable de evidencias sugieren que la especificidad de la unión de receptor Trk es codificada por las secuencias amino terminal de las NT. Véase, por ejemplo, Urfer et al . , Embo J. 1994,13: 5896-5909; y Mclnnes & Sykes, Biopolymers 1997,43:339-366. Esos descubrimientos sugieren que los péptidos cíclicos y peptidomiméticos de la invención pueden ser dirigidos a receptores Trk particulares (es decir, a un receptor de TrkA, TrkB o TrkC) seleccionando las secuencias de aminoácidos flanqueantes de RGE de un ligando de NT que preferiblemente se une al receptor Trk deseado. La misma respuesta cualitativa descrita supra, fue observada cuando los péptidos fueron probados contra NT-4 (véase, la Figura 7D) . Sin embargo, mientras que pudo obtenerse una inhibición del 50% de la respuesta de BDNF con solo aproximadamente 25 µM del péptido de N-Ac-CSRRGEC-NH2, el mismo nivel de inhibición de la respuesta de NT-4 requirió que el péptido sea usado aproximadamente 55 ± 4 µM. Como con el péptido cíclico N-Ac-CRGEC-NH , ni el N-Ac-CSRRGEC-NH2 ni sus equivalencias de NGF o NT-3 tuvieron ningún efecto sobre la emergencia basal de neuritas en cultivos control no suplementados con un ligando NT. Los péptidos también fueron probados por su capacidad para inhibir la respuesta de la emergencia de neuritis estimulada por otros agentes incluyendo la N-caderina, FGF2 o un agonista del receptor CBl. Las respuestas de crecimiento celular producidas por esos agentes han sido descritas en otra parte (Williams et al . , J. Cell Biol . 2003,160:481-486) y, en particular, no se cree que impliquen en los receptores Trk. Los resultados de aquellos experimentos se muestran en la Figura 8. En particular, los péptidos cíclicos no inhibieron ninguna de esas respuestas, aún cuando se administraron en concentraciones que inhibieron completamente las respuestas de NT-4 y BDNF. Esos datos confirman que los péptidos cíclicos y los peptidomiméticos de esta invención pueden inhibir completamente la función del receptor Trk sin ningún efecto específico sobre la emergencia de neuritas. Los efectos del péptido lineal N-Ac-SRRGELA-NH2 también fueron evaluados en el ensayo de emergencia de neuritas contra NT-4, BDNF y los otros agentes mencionados, supra . Esos resultados también se muestran en la Figura 8. Como se esperaba, la versión cíclica de este péptido fue un inhibidor potente de ambas respuestas de NT-4 y BDNF el péptido lineal no inhibió ninguna de las respuestas aún cuando se probó en concentraciones de hasta 125 µM. En consecuencia, los péptidos y peptidomiméticos que contienen el motivo de RGE necesitan ser restringidos, por ejemplo por enlaces disulfuro, para ser antagonistas del receptor Trk funcionales.

DESARROLLO DE UN PEPTIDO AGONISTA DE TRKB En las estructuras cristalinas del complejo NT- 4/receptor TrkB, el motivo de SRRGE en la NT-4 corre antiparalelo a sí mismo en el dímero de NT-4. El motivo correspondiente exhibe una alineación antiparalela similar en estructuras cristalinas del complejo NGF/receptor Trka. Previamente, había sido usado un método mimético "de repetición en serie" para desarrollar un agonista peptídico de N-caderina. Véase, Williams et al., J". Biol . Chem. 2002,277 : 4361-4367. El arreglo antiparalelo de RGE en las neurotrofinas sugiere que el método • "repetición en serie" también puede ser usado para desarrollar péptidos agonistas del receptor Trk. El modelaje molecular apoya la hipótesis de que una repetición en serie de la secuencia de SRRGEL de NT-4 puede ser restringida en el péptido cíclico N-Ac-CSRRGELAASRRGELC-NH2 (este péptido también es referido aquí como el péptido "BAG") de tal manera que permita el acoplamiento simultáneo de dos monómeros de receptor TrkB. Una estructura modelada del péptido BAG la- cual enfatiza este punto como se muestra aquí en la Figura 9. El efecto del péptido BAG sobre la emergencia de neuritas fue probado por lo tanto en un ensayo descrito en la sección Desarrollo de un Péptido Antagonista de TRKB, supra . Los resultados de esos experimentos son ilustrados en la Figura 10A. Puede observarse que el péptido estimula la emergencia de neuritas en una forma dependiendo de la dosis con ECso de aproximadamente 300 nM y una respuesta casi máxima en aproximadamente 600 Nm. Como con el resultado a los ligandos naturales BDNF y NT-4, la respuesta de la emergencia de neuritas al péptido BAG es bifásica (compárese en las Figuras 7A y 10A) . A continuación, se comparó la capacidad de un péptido BAG para estimular el crecimiento axonal con los péptidos que promueven el crecimiento establecidos. Los datos de esos experimentos, los cuales se ilustran en la Figura 10B, demuestran que a 6 µM el péptido BAG promueve el crecimiento axonal en el mismo grado que en las concentraciones activas máximas de NT-R, BDNF y FGF2.

LOS ANTAGONISTAS DE TRKB INHIBEN LA RESPUESTA DEL PEPTIDO AGONISTA Para verificar que el péptido BAG activa al receptor Trk por la unión al mismo sitio que el antagonista peptídico monomérico (descrito en las secciones "Desarrollo de un Péptido Antagonista de TRKB" y "Un LIP de NT-4 es un Antagonista de TRKB más Potente que los LIP de NT-3 y NGF Equivalentes", supra ) , se condujeron experimentos para determinar si el antagonista peptídico N-Ac-CSRRGEC-NH2 podría inhibir los efectos del péptido BAG sobre la emergencia de neuritas. Los resultados se muestran en la Figura 11. A 125 µM, el péptido antagonista de TrkB puede inhibir completamente la actividad de una concentración activa máxima del péptido BAG. En contraste la versión lineal de este péptido (es decir el péptido N-Ac- SRRGELA-NH2) tiene muy poco o ningún efecto sobre la actividad del péptido BAG en el ensayo de emergencia de neuritas. K252a, un compuesto en el cual sea reportado un antagonista del receptor Trk relativamente específico (Tapley et al . , Oncogene 1992,7: 371-381), también inhibió completamente la respuesta de emergencia de neuritas al péptido de BAG • Sin embargo, el PD17304, un antagonista del receptor de FGF específico no inhibió la respuesta. Esos datos establecen que los péptidos cíclicos y peptidomiméticos ""repetidos en serie", sobre la base del motivo de RGE, son agonistas específicos y efectivos de los receptores Trk.

LOS AGONISTAS DE TRK SUPERAN A LOS INHIBIDORES DEL CRECIMIENTO NEURONAL Este Ejemplo describe experimentos adicionales que investigan el efecto de los agonistas del receptor Trk bajo condiciones que normalmente inhiben el crecimiento neuronal . En particular los experimentos demuestran que a diferencia del ligando del receptor Trk natural, los agonistas del receptor Trk de la invención pueden contrarrestar la actividad de las moléculas inhibidoras y/o sus receptores.

MATERIALES Y MÉTODOS Reactivos y tratamiento del cultivo. A menos que se haga notar otra cosa aquí, los reactivos en los experimentos expuestos en esta sección se obtuvieron como se expuso supra, en la Sección Reactivos et seq. En particular, el FGF2 y el BDNF humanos recombinantes fueron obtenidos de R&D systems (Minneapolis, MN) y usados a concentraciones finales de 5 ng/ml. El agonista del receptor Trk K252a se obtuvo de Calbiochem (San Diego, C?) y se usó a una concentración final de 100 nM. El péptido agonista de Trk BAG (SEQ ID NO: 18) se obtuvo de un distribuidor comercial (Múltiple Peptide Systems, San Diego CA) . La quimera de MAG-Fc recombinante se obtuvo de R&D Systems (Minneapolis, MN) y se usó a una concentración final de 5-25 µg/ml. El anticuerpo monoclonal para GTlb (clon GMR5) se obtuvo de Seikagaku America (Falmouth, MA) y se usó a una concentración final de 20 µg/ml. Se creó un anticuerpo policlonal de conejo de p75NTR contra el dominio extracelular de ese receptor como se describió anteriormente (véase, Huber & Chao, Dev. Biol. 1995, 167; 22.7-238) y se usó a una dilución de 1:200 de suero. Los inhibidores de PKA conocidos KT5720 y H-89 se obtuvieron de Calbiochem (San Diego, CA) y se usaron a concentraciones finales de 200 y 400 nM, respectivamente. Los inhibidores de PI3K conocidos Wortmnannina y LY294002 también fueron obtenidos de Calbiochem (San Diego, CA) y se usaron ambos a concentraciones finales de 10 µM. El inhibidor de Rho cinasa Y27632 se obtuvo de Tocris (Bristol, RU) y se usó a una concentración final de 10 µM. Todos los reactivos fueron diluidos en medios de cocultivo y se agregaron en general a los cultivos justo antes de cultivar a las neuronas. La excepción fue el antisuero dirigido contra el receptor de p75NTR. En su lugar, se trató una suspensión neuronal de alta densidad con una dilución de 1:200 del suero durante 60 minutos. Las neuronas fueron entonces diluidas en un factor de aproximadamente 20, y sembradas para cultivo. Se estimó que la cantidad residual de anticuerpo de p75NTR en los cultivos había sido una dilución de aproximadamente 1:5000 del suero. Experimentos control por separado demostraron que. este anticuerpo no tuvo efecto sobre la emergencia de neuritas a una dilución de 1:1000, estableciendo que la dilución de 1:5000 usada en esos experimentos tuvo, a lo más, un efecto despreciable.

Ensayos de emergencia de neuritas. Los ensayos de emergencia o crecimiento de neuritas se efectuaron como se describió en la Sección Ensayo de Emergencia de Neuritas supra .

Resultados El agonista del receptor Trk BAG bloquea La actividad inhibidora de la MAG. La glicoproteína asociada con la mielina (MAG) ha mostrado previamente inhibir la respuesta de emergencia de neuritas de neuronas cerebelares de rata de 2-3 días, postnatales, cuando se presentó a aquellas células como una molécula transfectada en el sustrato celular (Mukhopadhyay et al., Neuron 1994, 13: 757-767) o cuando se agregó a una proteína quimérica de Fc soluble (Tang et al . , Mol . Cell . Neurosci . 1997 , 9: 333-346) . Además de aquellos estudios, se cultivaron neuronas cerebelares de 3 días, postnatales, sobre monocapas de células LK8, una línea celular de fibroblastos 3T3 que expresa N-caderina transfectada y que previamente ha demostrado promover una respuesta de emergencia de neuritas robusta (Williams et al . , Neuron 1994, 13: 583-594). Las células fueron cultivadas con proteína de fusión MAG-Fc soluble presente en el medio de cultivo a concentraciones de 0 , 5 o 25 µg/ml. Como se esperaba, la MAG-Fc inhibió la emergencia de neuritas en una forma dependiente de la dosis, a una respuesta de inhibición de aproximadamente el 40% cuando está presente en el medio de cultivo a una concentración de 25 µg/ml (véase la Figura 12) . Reportes previos han sugerido que inhibidores como la MAG median sus efectos por activación de RhoA y/o su efectos corriente abajo la Rho cinasa. Véase, por ejemplo, Dergham et al . , J Neurosci . 2002, 22: 6570-6570; Fournier et al . , J. Neurosci . 2003, 23: 1416-1423; y Lehmann et al . , J. Neurosci . 1999, 19: 7537-7547. Para confirmar esos reportes, también fueron cultivadas células con el inhibidor de Rho cinasa Y27632 (Narumiya et al . , Methods Enzymol . 2000, 325: 273-284; Davies et al . , Biochem. J. 2000, 351: 95-105) incluido en el medio de cultivo a una concentración de 10 µM. Como se esperaba, la MAG-Fc no inhibió la emergencia de neuritas bajo esas condiciones, aún cuando estuvo presente en el medio de cultivo a concentraciones tan altas como 25 µg/ml (Figura 12) . Se efectuaron experimentos de emergencia de neuritas adicionales para investigar que efecto, si lo hay, puede tener un agonista de Trk sobre inhibidores como la MAG. En esos experimentos, se cultivaron neuronas con el péptido agonista de Trk BAG (SEQ ID NO: 18, descrita en la Sección Desarrollo de un Péptido Agonista de TRKB anteriormente citada) presente en el medio de cultivo a una concentración de 6 µM. De manera sorprendente, la MAG-Fc no inhibió la emergencia de neuritas bajo esas condiciones, aún cuando estuvo presente en el medio de cultivo a concentraciones- tan altas como de 25 µg/ml (Figura 12) . En contraste, cuando estuvo presente la neurotrofina BDNF en el medio de cultivo a una concentración de 5 ng/ml no hubo un efecto medible sobre la respuesta de MAG es decir, que MAG-Fc continuó inhibiendo la emergencia de neuritas (Figura 12) . Este resultado es consistente con reportes previos de que las células neuronales deben ser "cebadas" con neurotrofinas para evitar la actividad inhibidora de la MAG y la mielina (véase, Caí et al . , Neuron 1999 , 22: 89-101). Para investigar aún más la capacidad del polipéptido BAG para bloquear la actividad inhibidora de MAG, el polipéptido fue probado en ensayos de emergencia de neuritas a una variedad de diferentes concentraciones en el medio de cultivo. Los resultados de esos experimentos son descritos gráficamente en la Figura 13. Esos datos demuestran que el polipéptido BAG bloquea efectivamente la actividad inhibidora de MAG cuando está presente en el medio de cultivo a concentraciones tan bajas como de 30 nM, con una respuesta máxima media cuando está presente a concentraciones de entre aproximadamente 100 y 200 nM. Para confirmar que los resultados de esos experimentos no fueron causados por alguna inhibición de MAG específica del componente de N-caderina en la emergencia de neuritas, también se efectuaron experimentos con neuronas cultivadas sobre monocapas de células fibroblásticas 3T3 que no expresan N-caderina transfectada. Las gráficas de barras que muestran los datos de esos experimentos se muestran en la Figura 14. Aunque la respuesta de emergencia de neuritas basal es menor cuando las células son cultivadas bajo esas condiciones, la MAG-Fc nunca produce una inhibición medida y sustancial de la emergencia de neuritas cuando está presente a 25 µg/ml. En ausencia de MAG-Fc, los niveles básales de emergencia de neuritas son ya robustos, y el polipéptido BAG no tiene un efecto sustancial cuando está presente en el medio de cultivo a una concentración de 6 µM. La inspección de la Figura 14, sin embargo, revela que el agonista del receptor Trk a esta concentración no bloquea efectivamente la respuesta de MAG, de modo que el MAG-Fc no inhibe la emergencia de neuritas cuando está presente la concentración final de 25 µg/ml. Como anteriormente, y nuevamente en contraste con el efecto de BAG, la neurotrofina BDNF no tiene un efecto aparente sobre la respuesta inhibidora estimulada por MAG-Fc cuando está presente a una concentración de 5 ng/ml. Esos experimentos demuestran que los agonistas del receptor Trk como el polipéptido BAG pueden ser usados para prevenir o reducir efectivamente las respuestas inhibidoras producidas por moléculas de señalización como la MAG. Los resultados de esos experimentos muestran adicionalmente que los agonistas del receptor Trk (por ejemplo, BAG) promueven el crecimiento y recuperación neuronal, aún cuando se administren en un ambiente inhibidor, como en presencia de la molécula inhibidora de la señalización MAG.

El BAG bloquea la inhibición por GTlb. La capacidad del polipéptido BAG para evitar la actividad inhibidora de GTlb también fue tratado en ensayos de emergencia de neuritas . Reportes anteriores han descrito anticuerpos IgM multivalentes para GTlb que pueden inhibir la emergencia de neuritas de células del granulo cerebelar (Vinson et al . , J. Biol Chem . 2001, 276: 20280-20285) . Para confirmar esos reportes, se cultivaron neuronas cerebelares sobre monocapas de N-caderina que expresan células 3T3 tanto en medio de control como en medio que contienen 20 µg/ml de anticuerpo monoclonal para GTlb. Los datos de esos experimentos se muestran en la gráfica de barras de la Figura 15. Consistente con reportes previos, el cocultivo de las células con 20 µg/ml de anticuerpo inhibe de manera robusta la emergencia de neuritas bajo esas condiciones. Compárese la columna marcada, (1) en la Figura 15 a la columna C de esa misma Figura. El cocultivo de las células con 10 µM del inhibidor de Rho cinasa Y27632 abóle efectivamente este efecto, confirmando reportes previos de que el receptor de GTlb implica a la Rho cinasa como un efector corriente abajo en su cascada de señales (véase, Vinson et al . , J. Biol . Chem 2001, 276: 20280-20285) . Sorprendentemente, cuando el agonista del receptor Trk BAG está presente en el medio de cultivo (6 µM) con anticuerpo para GTlb, el efecto inhibidor del anticuerpo es eliminado efectivamente; es decir, que es observado un nivel de emergencia de neuritas el cual es comparable al observado cuando el anticuerpo no está presente en el medio de cultivo. Compárese la columna marcada, (2) en la Figura 15 a la columna C en esa misma Figura. Esos resultados muestran que los agonistas del receptor de Trk como el polipéptido BAG pueden ser usados para reducir o prevenir efectivamente la actividad inhibidora producida por esos receptores como GTlb. Los resultados de esos experimentos muestran adicionalmente que los agonistas del receptor Trk (por ejemplo, BAG) promueven el crecimiento y recuperación neuronal, aún cuando se administren en un ambiente inhibidor, como en presencia de la señalización inhibidora por GTlb.

El BAG bloquea la inhibición por el p75NTR. Debido a que se cree que las moléculas inhibidoras en la mielina a una señal directa o indirecta a la vía del receptor p75NTR, la capacidad del péptido BAG para evitar esa actividad inhibidora del receptor también fue investigada. Para verificar, primero, esa señalización del este receptor no inhibe la emergencia de neuritas, las neuronas cerebelares fueron cultivadas sobre monocapas de células 3T3 que expresan N-caderina en medios de control y en medios que contienen anticuerpo policlonal para p75NTR (dilución de suero 1:200) . Los datos de esos experimentos son presentados en la gráfica de barras en la Figura 16. El pretratamiento de las células con anticuerpos durante 60 minutos inhibe efectivamente la emergencia posterior de neuronas como puede observarse comparando visualmente las columnas marcadas como (1) y C en la gráfica de barras en la Figura 16. Como con la MAG y GTlb, el anticuerpo para p75NTR no produce una respuesta inhibidora cuando se agrega inhibidor de Rho cinasa Y27632 a las neuronas a una concentración final de 10 µM inmediatamente después del tratamiento con anticuerpo (véase la columna (2) en la Figura 16) . De igual modo, cultivar las neuronas con una concentración de polipéptido BAG final de 6 µM también bloquea efectivamente el efecto inhibidor del anticuerpo de p75NTR. Sin embargo, cultivar las células con la neurotrofina BDNF (concentración final de 5 ng/ml) no tienen efecto significativo sobre la respuesta inhibidora producida por el anti ,cuerpo p75NTR.

Debido a que los cultivos celulares pueden contener alguna cantidad residual de anticuerpo (que se estima no es mayor que una dilución de suero 1:5000 aproximadamente) después del tratamiento, se efectuaron experimentos controles en los cuales fueron cultivadas células con anticuerpo policlonal en los medios a una dilución de suero 1:1000. La presencia de anticuerpo a este nivel no tuvo un efecto medible sobre la emergencia de neuritas, demostrando que los efectos observados en esos experimentos no son causados por los niveles muy bajos de anticuerpo residual que pueden permanecer después del tratamiento. Los resultados de esos experimentos demuestran que los agonistas del receptor Trk como el polipéptido BAG pueden ser usados para reducir o prevenir efectivamente las respuestas inhibidoras producidas por la vía del p75NTR. Los resultados demuestran adicionalmente que los agonistas del receptor Trk (por ejemplo, BAG) promueven el crecimiento y recuperación neuronal, aún cuando se administran en un ambiente inhibidor, como en presencia de la señalización inhibidora por el p75NTR.

La señalización del BAG es mediada por PKA y PI3K.

Para investigar mejor los mecanismos por los cuales un agonista del receptor Trk pueden bloquear las señales inhibidoras, se cultivaron neuronas cerebelares durante 18 horas sobre monocapas 3T3 en medios de control o en medios suplementados con las que se ha determinado si las concentraciones activas máximas del polipéptido BAG (concentración final de 6 µM) , la neurotrofina BDNF (concentración final de 5 ng/ml) o FGF2 (concentración final de 5 ng/ml) . Los descubrimientos de esos experimentos se describen en la gráfica de barras en la Figura 17. Bajo esas condiciones, cada uno de los tres factores (BAG, BDNF y FGF2) mejoran la longitud de la neurita en aproximadamente 60-70% en comparación con el cultivo control. Cuando el K252a, es un compuesto que se reporta es un antagonista del receptor Trk relativamente específico (Tapley et al . , Oncogene 1992, 7: 371-381) , fue incluido en los medios de cultivo a una concentración final de 100 nM, la respuesta de la emergencia producida por ambos del BAG y el BDNF fue sustancialmente abolida. Sin embargo, la respuesta de la emergencia producida por el FGF2 no se vio afectada, confirmando los reportes que sugieren que el FGF2 promueve la emergencia de neuritas por una cascada de señalización que es distinta de la de los receptores Trk y en particular, no implica PKA o PI3K (véase, Williams et al . , Cell Biol . 2003, 160: 481-486). En experimentos similares, se cultivaron células neuronales ya sea con inhibidor de proteína cinasa A (PKA) KT5720 (concentración final de 200 nM) o H-89 (concentración final de 400 nM) , o con el inhibidor de fosfoinositido 3-cinasa (PI3K) Worthmannina (concentración final de 10 µM) de LY294002 (concentración final de 10 µM) en los medios de cultivo. Como con el antagonista del receptor Trk, la respuesta de emergencia de neuritas a ambos del BAG y el BDNF fue esencialmente abolida por esos inhibidores. Como se esperaba, la respuesta de emergencia de neuritas al FGF2 no se vio afectada. Esos resultados demuestran que el receptor Trk activado estimula la emergencia de neuritas por un mecanismo o mecanismos que implican la activación tanto de la PKA y PI3K. En consecuencia los agonistas de Trk de esta invención (por ejemplo, el polipéptido BAG) pueden ser efectivos en el bloqueo o reducción de una amplia variedad de señales inhibidoras. En particular, los agonistas de- Trk de la invención pueden ser efectivos en el bloqueo de señales inhibidoras mediadas por cascadas de señales por uno o más componentes que sean inhibidor o inactivados por PKA o PI3K. Como un ejemplo, y no a manera de limitación, se reporta que la PKA inactiva a Rho por fosforilación directa sobre la Serl88 de esa molécula (Ellerbroek et al . , J. Biol . Chem. 2003, 278: 19023-19031). En consecuencia, los agonistas de Trk de la presente invención pueden ser usados para bloquear o reducir señales mediadas por cascadas inhibidoras que implican la Rho. Esas incluyen, inter alia, señales inhibidoras mediadas por inhibidores de mielina como la MAG (o por constructos de fusión de MAG como una MAG-Fc) , Nogo-A, la glicoproteína de mielina oligodendrocítica NgR, GTlb y p75NTR así como señales mediadas por proteoglicano de sulfato de condritina de la cicatriz glial del SNC (Monnier et al . Neurosci . 2003, 22: 319-330). Como otro ejemplo no limitante, se espera que la activación de PI3K supere la actividad inhibidora de las semaforinas (Eickholt et al., J. Cell Biol . 2002, 157: 211-217). En realidad, se reporta que las neurotrofinas superan esa señalización inhibidora activando una cascada de Trk-Pl3K en las neuronas (Atwal et al . , J. Neurosci . 2003, 23: 7602-7609). En consecuencia, los agonistas de Trk de la presente invención pueden ser usados para bloquear o reducir esas señales inhibidoras también. COMPUESTOS AGONISTAS DE TRK ADICIONALES Este ejemplo describe péptidos y compuestos peptidomiméticos adicionales que se basan en o son derivados del polipéptido BñG descrito en los ejemplos precedentes. También se presentan datos de ensayos biológicos, que demuestran que esos compuestos novedosos también exhiben actividad como agonistas del receptor Trk.

Agonistas del receptor Trk novedosos Los siguientes péptidos y peptidomiméticos fueron diseñados sobre la base de la secuencia de aminoácidos del polipéptido BAG descrita supra, es decir, CSRRGEIAASRRGELC (SEQ ID NO: 17). Esos compuestos novedosos, que son referidos aquí como hES^a, riEasL y hriBAG2, se exponen en la Tabla 1, a continuación.

TABLA I: COMPUESTOS AGONISTAS DEL RECEPTOR TRK Identificador Secuencia Clave hBAG2 c(SRRGELSRRGEL) (SEQ ID NO: 39) • enlace peptídico ciclizado TABLA I: COMPUESTOS AGONISTAS DEL RECEPTOR TRK (Continuación) Identificador Secuencia Clave riBAG? Ac- • D-aminoácidos dCdLdEGdRdRdSdAdAdLdEGdRdRdSdC- residuales NHS (SEQ ID NO: 40) • ciclizada por enlaces disulfuro de cisteína hriBAG2 G(dLdEGdRdRdSdLdEGdRdRdS) (SEQ • D-aminoácidos ID NO: 41) residuales • Enlace peptídico ciclizado En la Tabla I, anterior, se usó la letra minúscula ?c" para denotar una ciclización por un péptido o enlace amida poniendo el aminoácido residual amino-terminal al aminoácido residual carboxi-terminal . En consecuencia, el polipéptido hBAG? (SEQ ID NO: 39) preferiblemente comprende un enlace amida que une al residuo de serina N-terminal al residuo de leucina C-terminal. De manera similar, el péptido hriBAG2 (SEQ ID NO: 41) preferiblemente comprende un enlace amida que une al residuo de leucina N-terminal al residuo de serina C-terminal. La letra minúscula ? " en la parte frontal de un aminoácido residual en la Tabla I denota que el residuo es un D-aminoácido residual (en oposición a un L-aminoácido residual) . En consecuencia, los polipéptidos riBAG1 y hriBAG2 preferiblemente comprenden D-aminoácido residuales. En realidad todos los aminoácidos residuales en esos polipéptidos (con la excepción de los residuos de glicina, que son L o D aminoácidos residuales) son preferiblemente D-aminoácidos residuales. Es fácilmente evidente tras la inspección visual de las secuencias de aminoácidos de riBAG1 y riBAG2 (SEQ ID NOS; 40 y 41) , que esas secuencias son secuencias contrarias de las secuencia del polipéptido BAG (SEQ ID NO: 17) . En particular, y como será apreciado por aquellos expertos en la técnica, se espera que los polipéptidos de la invención que comprenden una secuencia de D-aminoácidos residuales adopten estructura (es decir, "conformación") tridimensionales que sean sustancialmente similares o ' idénticas a la conformación tridimensional de un polipéptido que comprende la secuencia inversa del L-aminoácido. En consecuencia, además de los polipéptidos de los L-aminoácidos residuales descritos, supra la presente invención también contempla polipéptidos que tienen la secuencia inversa de D-aminoácidos residuales. En consecuencia, en una modalidad preferida los péptidos y peptidomiméticos de la presente invención comprenden la secuencia de L-aminoácidos residuales que incluye el motivo de Arg-Gly-Glu (es decir, "RGE") descrito, supra . En consecuencia, la invención también proporciona, en una modalidad alternativa) péptidos y peptidomiméticos que comprenden secuencias de D-aminoácidos residuales que incluyen el motivo de de la secuencia lineal corta dGlu-Gly-dArg (es decir, "dEGdR" ) . Se espera que los péptidos y peptidomiméticos de la invención que comprenden esos D-aminoácidos residuales sean más estables y sean degradados menos fácilmente in vivo, por ejemplo, por enzimas proteolíticas. De manera similar, también se espera que los enlaces amida cíclicos como aquellos usados en los polipéptidos hBAG2 y hriBAG?r sean menos fácilmente degradados in vivo . Es más probable que los péptidos acortados (por ejemplo, hBAG, los cuales carecen de dos cisteínas terminales y dos alaninas centrales en comparación con el BAG) crucen la barrera sanguínea-cerebral . En consecuencia, esos péptidos pueden ser preferidos, por ejemplo, para usarse en composiciones farmacéuticas y administración a un individuo.

Actividad Biológica Los polipéptidos hBAG2, riBAG? y hriBAG2 fueron probados en un ensayo basado en el sustrato, para evaluar su capacidad para promover la emergencia de neuritas en un ambiente inhibidor. En particular, como se discutió anteriormente, la glicoproteína asociada con la mielina (MAG) ha mostrado previamente inhibir la respuesta de emergencia de neuritas. Véase, por ejemplo, Mukhopadhyay et al . , Neuron 1994, 13:757-767 ; y Tang et al . , Mol , Cell, Neurosci . 1997, 9:333-346. Como se demostró en los ejemplos, supra, los agonistas del recetor Trk, como el polipéptido BAG son capaces de bloquear la actividad inhibidora de MAG, promover la emergencia de neuritas en ese ambiente inhibidor (es decir, en presencia de MAG) . Los datos presentados en los experimentes descritos aquí, demuestran que los polipéptidos hBAG2, riBAG2 y hriBAGX, también bloquean la actividad inhibidora de MAG y promueven la emergencia de neuritas.

Materiales y Métodos De manera breve, se recubrieron placas de cultivo tisular de 8 cámaras, de plástico, estándar, como sigue con: (a) polilisina; (b) polilisina y una mezcla de anti-lgG humana de cabra y fibronectina; o (c) polilisina, una mezcla de anti-lgG humana de cabra (específica para Fc) y fibronectina MAG- Fc . Primero, las placas son recubiertas con polilisina a 17 µg/ml en agua destilada ("dH20) durante treinta (30) minutos a temperatura ambiente. Después de aspirar los pozos, se agrega una mezcla de anti-lgG humana y/o fibronectina (ambas a 10 µg/ml en DMEM) a los pozos a ser recubiertos con aquellos compuestos, y se incuba durante 120 minutos . Los pozos son aspirados nuevamente (para los pozos recubiertos con MAG-Fc) incubados durante sesenta (60) minutos con MAG-Fc (0.25 µg/ml en DMEM y 10% FCS) . Se agregan entonces neuronas cerebelares de rata PND2/3 a 15K a cada pozo en DMEM, 10% de FCS, KCl 25 mM y 5 ng/ml de FGF2 , llevando el volumen medio final a 300 µm en cada pozo. Las neuronas cerebelares son cultivadas durante 27 horas antes de fijar y teñir para GAP-43. La Polilisina, anti-lgG Humana de cabra (específica para Fc) y la fibronectina están disponibles de SIGMA (St. Louis, Missouri).

Resultados: Se determinó la longitud media de la neurita más larga por neurona. Se observó un crecimiento basal de la neurita que es de aproximadamente 9 µm sobre el sustrato de polilisina. El crecimiento de las neuritas se incrementó a aproximadamente 24 µm sobre el sustrato de polilisina/fibronectina. El crecimiento de las neuritas disminuyó a aproximadamente 15 µm en los pozos que tenían el recubrimiento de MAG-Fc adicional . La Figura 18A muestra la curva de respuesta a la dosis para los tres peptidomiméticos. El peptidomimético hriBAG2 (SEQ ID NO: 40) promovió un crecimiento de las neuritas dependiente de la dosis, sustancial en el ambiente inhibidor. Pudo ser observado una respuesta de crecimiento de neuritas a una dosis de aproximadamente 10 µg/ml y es casi el doble del valor observado en el ambiente inhibidor sin el peptidomimético a una dosis de 33 µg/ml (la concentración más alta probada) . El hBAG2 (SEQ ID NO: 39) promueve el crecimiento de las neuritas a una dosis de 33 µg/ml. El riBAG? (SEQ ID NO: 41) no promueve el crecimiento a la misma concentración. La Figura 18B muestra una gráfica de barras que describe el crecimiento de las neuritas en el ambiente inhibidor en presencia de BDNF, BAG, hriBAG2, hBAG2 o riBAG. El BDNF no tiene efecto sobre el crecimiento de las neuritas en concentraciones de 10 µg/ml y 100 µg/ml. El péptido BAG, promueve el crecimiento de las neuritas en concentraciones de 10 µg/ml y 100 µg/ml. El hriBAG , un concentración de 33 µg/ml promovió el crecimiento de las neuritas en un grado sustancialmente mayor que el del BDNF, péptido BAG, y el hBAG2 y riBAG? a cualquier concentración. El hBAG2 a una concentración de 33, µg/ml promovió el crecimiento de las neuritas en un grado comparable con el de el polipéptido BAG a una concentración de 10 µg /ml . Esos resultados muestran que otros péptidos y peptidomiméticos, como los derivados del péptido BAG de está solicitud, pueden promover el crecimiento de las neuritas en un ambiente inhibidor y en grado que es comparable o aun superior al del polipéptido BAG.

LOS AGENTES DE UNION DEL RECEPTOR DE p75 SUPERAN LA INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO NEURONAL Este ejemplo describe experimentos que investigan el efecto de los agentes de unión del receptor p75 bajo condiciones que normalmente inhiben el crecimiento neuronal . En particular, los experimentos demuestran que los agentes de unión del receptor p75 contrarrestan la actividad de moléculas inhibidoras y/o sus receptores.

Ensayos de Emergencias de Neuritas Se establecieron co-cultivos de neuronas cerebelares sobre monocapas de células 3T3 o células LK8 ( y la línea celular 3T3 transfectada establecida que expresa niveles fisiológicos de N-caderina de pollo; véase Doherty et al . , Neuron 1991,6:247-258) de acuerdo a lo descrito previamente por Williams et al . (Neuron 1994, 13:583-594). Las células fueron mantenidas en medio de Eagle ' s modificado Dulbecco ' s suplementado con 10% con suero de carnero fetal (FSC) . Esas neuronas cerebelares expresan al receptor TrkB y no expresa niveles funcionales del receptor TrkA Para el establecimiento de los co-cultivos, se cultivaron aproximadamente 80,000 células 3T3 (o células LK8) en cámaras individuales en una capa de cultivo tisular de 8 cámaras recubierta con poli-L-lisina y fibronectina. Las células mantenidas fueron cultivadas durante la noche en medios de Eagle ' s modificado y de Dulbecco 's suplementado con 10% de FSC para permitir la formación de monocapas confluentes. El medio fue removido y se cultivaron aproximadamente 6,000 neuronas cerebelares disociadas (tomadas de ratas de 2-3 días postnatales) en cada pozo en medio SATO suplementado con 2% FCS. Los reactivos fueron agregados de acuerdo a lo indicado en el texto y los co-cultivos mantenidos durante 23 horas. Los co-cultivos fueron entonces fijados y teñidos para la inmunorreactividad de GAP- 43. Se midió la longitud del medio de la neurita más larga por célula para entre aproximadamente 120 y 150 neuronas, de acuerdo a lo descrito previamente por Williams et al . (Neuron 1994, 13: 583-594) .

Reactivos El NGF y BDNF humanos recombinados se obtuvieron de R&D systems (Minneapolis, MN) . Los péptidos sintéticos fueron todos obtenidos de un distribuidor comercial (Múltiple Peptido Systems, San Diego, CA) . Todos los péptidos fueron purificados por cromatografía de líquidos de alto desempeño en fase inversa (RP-HPLC) de acuerdo a los métodos de rutina, y se obtuvieron al nivel más alto de pureza (es decir, más del 95% puro) .

Los agentes de unión del receptor de p75 promueven el crecimiento de la neurona mediado por neurotrofina en un ambiente inhibidor . La glicoproteína asociada con la mielina (MAG) ha mostrado inhibir previamente la respuesta de emergencia de neuritas de neuronas cerebelares de ratas de 2-3 días postnatales, cuando es presentada a aquellas células como una molécula transfectada en el sustrato celular (Mukhopadhyay et al . , Neuron 1994, 13:757-767) o cuando se agrega como una proteína quimérica con Fc soluble (Tang et al . , Mol . Cell . Neurosci . 1997, 9:333-346). Además de aquellos estudios, se cultivaron neuronas cerebelares de 3 días, postnatales, sobre monocapas de células K8, una línea celular de fibroblastos 3T3 que expresan N-caderina transfectada y ha mostrado previamente promover una respuesta de emergencia de neuritas robusta (Williams et al . , Neuron 1994, 13:583-594) . Las células fueron cultivadas con proteína de fusión MAG-Fc soluble presente en el medio de cultivo en concentraciones de 0,5 o 25 µg/ml. Como se esperaba, el MAG-Fc inhibió la emergencia de neuritas en un forma dependiente de la dosis, con una respuesta de inhibición de aproximadamente el 40% cuando esta presente en el medio de cultivo una concentración de 25 µg/ml. De este modo, este medio de cultivo que contiene la proteína de fusión MAG-Fc soluble, es un medio de cultivo inhibidor. El medio de cultivo inhibidor es suplementado además con BDNF a 1 ng/ml, NGF a 10 ng/ml o 100 ng/ml, BDNF (a 1 ng/ml) en combinación con NGF (a 10 ng/ml o 100 ng/ml) , un monómero restringido del motivo de la espira 1 del NGF que se une al receptor de p75 (N-Ac-CTDIKGKEC-NH2) a 100 µg/ml, o el péptido de la espira 1 del NGF (a 100 µg/ml) en combinación con el BDNF (a 1 ng/ml) . Los medios de crecimiento que contienen MAG-Fc únicamente fueron el control . Cuando la neurotrofina de BDNF estuvo presente en el medio de cultivo inhibidor a una concentración de 1 ng/ml no hubo efecto medible sobre la respuesta de MAG- es decir, que MAG-Fc continúa inhibiendo la emergencia de neuritas. Al igual que el BDNF, el NGF a concentraciones de 10 ng/ml o 100 ng/ml no estimuló la emergencia de neuritas en presencia de MAG-Fc (Figura 19) . En los datos de experimentos individuales, los resultados obtenidos con NGF a 10 ng/ml y 100 ng/ml también fueron obviamente diferentes, y esos datos fueron recolectados posteriormente. Esos resultados son consistentes con reportes previos de que las células neuronales deben ser "cebadas" con neurotrofinas para evitar la actividad inhibidora de MAG y la mielina (véase, Caí et al . , Neuron 1999, 22:89- 101). El monómero restringido del motivo de unión de la espira 1 del MAG-Fc solo no tuvo efecto sobre la emergencia de neuritas en presencia de MAG-Fc (Figura 19) . Sin embargo, el péptido de la espira 1 del NGF en combinación con el BDNF produce una respuesta de emergencia de neuritas significativa. Adicionalmente, también se observó una respuesta de emergencia de neuritas que es significativa cuando se agregaron BDNF y NGF juntos (Figura 19) en una relación de 1:10 ó 1:100 (BDNF a NGF). Los resultados de esos experimentos sugieren que, cuando el NGF y el BDNF se administraron a un ambiente inhibidor, el NGF permite que el BDNF promueva la emergencia de neuritas . Los resultados muestran adicionalmente que la administración de un monómero restringido de la primera espira de la horquilla ß en NGF permiten que el BDNF promueva el crecimiento de las neuronas de SNC en un ambiente inhibidor .

TRATAMIENTO DE UN PACIENTE CON DAÑO DE LA MEDULA ESPINAL Se diagnóstico un paciente con daño de la médula espinal torácica y con pérdida de sensación y actividad motora en sus piernas . El paciente fue sometido a cirugía para estabilizar la espina torácica. Después de retirar tejido blando y óseo, se expuso la médula espinal dañada. Se mezcló un polvo farmacéutico estéril que comprende un agente de unión del receptor de p75 con solución salina normal estéril para formar un gel. El cirujano aplicó tópicamente el gel de agente de unión del receptor de p75 a la superficie expuesta de la médula. El procedimiento de estabilización se completó de forma usual. Después de la operación, el paciente fue verificado para determinar la mejora en la sensación y/o actividad motora en las extremidades inferiores.

REFERENCIAS CITADAS Numerosas referencias, incluyendo patentes, solicitudes de patentes y varias publicaciones, son citadas y discutidas en la descripción de esta invención. La cita y/o discusión de esas referencias se proporcionó únicamente para aclarar la descripción de la presente invención y no constituyen una admisión de que cualquiera de esas referencias sea la "técnica anterior" a la invención descrita aquí. Todas las referencias citadas y/o discutidas en esta especificación (incluyendo referencias, por ejemplo, a secuencias o estructuras biológicas en el GenBank, PDB, u otros bases de datos públicas) se incorporan aquí como referencia en su total y en el mismo grado que si cada referencia hubiese sido incorporada individualmente como referencia. Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (105)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un péptido cíclico, caracterizado porgue comprende, dentro de un anillo cíclico del péptido cíclico, la secuencia de aminoácidos : Arg-Gly-Glu donde el péptido cíclico modula la actividad mediada por el receptor Trk.
2. 2. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la actividad mediada por Trk es seleccionada del grupo que consiste de: crecimiento neuronal, sobrevivencia neuronal, crecimiento axonal, plasticidad sináptica, y emergencia de neuritas.
3. 3. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque modula la emergencia de neuritas .
4. 4. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque inhibe la actividad mediada por Trk.
5. 5. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque mejora la actividad mediada por Trk.
6. 6. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido cíclico comprende la fórmula: (Ti)—(X?)-Arg-Gly-Glu—(X2)—(Y2) donde : (a) Yj_ y Y2 son aminoácidos seleccionados independientemente con un enlace covalente formado entre Yi y Y2; y (b) X y X2 son opcionales y, si están presentes, son aminoácidos seleccionados independientemente o secuencias de aminoácidos unidas por enlaces peptídicos.
7. 7. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el tamaño del anillo del péptido cíclico fluctúa de 5 a 15 aminoácidos.
8. 8. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el péptido cíclico tiene la fórmula: (Y))—Ser—Arg—Arg—Gly—Glu—(Y2) (Y —Ala-Arg—Arg—Gly—Glu—(Y2) (Y,)—Phe—His-Arg—Gly—Glu—(Y2)
9. 9. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el péptido cíclico tiene la secuencia de aminoácidos: Cys-Arg-Gly-Glu-Cys (SEQ ID NO: 9); Cys-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Cys (SEQ ID NO:l); Cys-Ala-Arg-Arg-Gly-Glu-Cys(SEQ ID NO: 3); Cys-Phe-His-Arg-Gly-Glu-Cys (SEQ ID NO: 5); o Cys-Ser-His-Arg-Gly-Glu-Cys(SEQ ID NO: 7); donde un enlace covalente une las cisteínas N-terminal y C-terminal en la secuencia de aminoácidos. 10. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 6 caracterizado porque inhibe la actividad mediada por Trk. 11. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el péptido cíclico comprende la fórmula:
10. (Y)—(ZO-Arg-Gly-Glu—(Zo)-Arg-GIy-Glu—(Z2)—(Y2) donde : (a) Yi y Y2 son aminoácidos seleccionados independientemente con un enlace covalente formado entre Yx y
11. Y2; y (b) Zi, Z2 y Zo son opcionales y, si están presentes, son aminoácidos seleccionados independientemente o secuencias de aminoácidos unidas por enlaces peptídicos.
12. 12. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el tamaño del anillo del péptido cíclico fluctúa de aproximadamente 8 a 50 aminoácidos residuales.
13. 13. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el péptido cíclico tiene la fórmula: (YO—Ser—Arg—Arg—Gly—Glu—Leu—Ala—Ala—Ser-Arg—Arg—Gly—Glu—Leu—(Y2)
14. 14. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el péptido cíclico tiene la secuencia de aminoácidos: Cys-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Ala-Ala-Ser-Arg-Arg- Gly-Glu-Leu-Cys(SEQ ID N0:17), donde un enlace covalente une las cisteínas N-terminal y C-terminal en la secuencia de aminoácidos .
15. 15. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque mejora la actividad mediada por Trk.
16. 16. Un péptido cíclico, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 6, 8-9, 11 y 13-14, caracterizado porque el péptido cíclico comprende además, sobre el residuo amino terminal, un grupo N-acetilo, un grupo N-formilo o un grupo N-mesilo.
17. 17. El péptido cíclico, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1,6, 8-9, 11, 13-14 y 16, caracterizado porque el péptido cíclico comprende además, sobre el residuo C-terminal, un grupo C-amida.
18. 18. El péptido cíclico, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6, 8, 11 y 13, caracterizado porque Yi y Y2 están ligados covalentemente por enlaces disulfuro.
19. 19. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque Yx y Y2 son seleccionados independientemente del grupo que consiste de: penicilamina; (ß, ß-tetrametilen cisteína; ß,ß-pentametilen cisteína; ácido p-mercaptopropiónico; ácido ß, ß-pentametilen-ß-mercaptopropiónico; 2-mercaptobenceno; 2-mercaptoanilina; 2-mercaptoprolina; y derivados de los mismos.
20. 20. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque Yi y Y2 son cada uno cisteína o derivados de la misma.
21. 21. Un péptido cíclico, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6, 8, 11 y 13 caracterizado porque YX y Y2 están ligados covalentemente por un enlace amida.
22. 22. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 21 caracterizado porque el enlace amida es formado entre grupos funcionales terminales .
23. 23. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 21 caracterizado porque el enlace amida es formado entre un grupo funcional terminal y una cadena lateral residual .
24. 24. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque: (a) Yi es seleccionado del grupo que consiste de lisina, ornatina y derivados de la misma; y (b) Y2 es seleccionado del grupo que consiste de aspartato, glutamina y derivados de los mismos.
25. 25. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque: (a) Yi es seleccionado del grupo que consiste de aspartato, glutamina y derivados de los mismos; y (b) Y2 es seleccionado del grupo que consiste de lisina, ornatina y derivados de los mismos.
26. 26. El péptido cíclico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6, 8, 11 y 13 caracterizado porque Yx y Y2 están ligados covalentemente por un enlace tioéter.
27. 27. El péptido cíclico, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6, 8, 11 y 13, caracterizado porque: (a) Yi y Y2 son cada uno triptófano o derivados del mismo; y (b) el enlace covalente entre Yx y Y2 forma un dxdx-ditriptófano o un derivado del mismo.
28. 28. Un método para separar un compuesto candidato por la capacidad para modular la actividad mediada por el receptor Trk, método el cual comprende comparar una estructura tridimensional del compuesto candidato con una estructura tridimensional de un péptido cíclico que modula la actividad mediada por el receptor Trk, caracterizado porque: (a) el péptido cíclico comprende, dentro de un anillo cíclico del mismo, la secuencia de aminoácidos Arg-Gly-Glu, y (b) la similitud entre la estructura del compuesto candidato y la estructura del péptido cíclico es indicativa la capacidad del compuesto candidato para modular la actividad mediada por el receptor Trk.
29. 29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el péptido cíclico comprende la fórmula: (YO—(XO-Arg-Gly-Glu—(X2)—(Y2) donde : (a) Yi y Y2 son aminoácidos seleccionados independientemente con un enlace covalente formado entre Yx y Y2; y (b) Xi y X2 son opcionales y, si están presentes, son aminoácidos seleccionados independientemente o secuencias de aminoácidos unidas por enlaces peptídicos. >
30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el péptido cíclico comprende la fórmula : (YO—(Z0—Arg-Gly-Glu—(ZQ)—Arg-Gly-Glu—(Z2)—(Y2) donde : (a) Yi y Y2 son aminoácidos seleccionados independientemente con un enlace covalente formado entre Yi y Y2; y (b) Zi, Z2 y Z0 son opcionales y, si están presentes, son aminoácidos seleccionados independientemente o secuencias de aminoácidos unidas por enlaces peptídicos .
31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el péptido cíclico comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de : Cys-Arg-Gly-Glu-Cys (SEQ ID NO:9); Cys-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Cys(SEQ ID NO:l); Cys-Ala-Arg-Arg-Gly-Glu-Cys (SEQ ID N0:3); Cys-Phe-His-Arg-Gly-Glu-Cys(SEQ ID NO:5); Cys-Ser-His-Arg-Gly-Glu-Cys (SEQ ID NO:7); y Cys-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Ala-Ala-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu- Cys (SEQ ID NO: 17) ; donde el enlace covalente une las cisteínas N-terminal y C-terminal en la secuencia de aminoácidos.
32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 28 caracterizado porque: (a) el péptido cíclico mejora la actividad mediada por el receptor Trk, y (b) la similitud entre la estructura del compuesto candidato y la estructura del péptido cíclico es indicativa de la capacidad del compuesto candidato para mejorar la actividad mediada por el receptor Trk.
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque: (a) el péptido cíclico inhibe la actividad mediada por el receptor Trk, y (b) la similitud entre la estructura del compuesto candidato y la estructura del péptido cíclico es indicativa de la capacidad del compuesto candidato para inhibir la actividad mediada por el receptor Trk.
34. 34. Un peptidomimético que modula la actividad mediada por el receptor Trk, caracterizado porque el peptidomimético tiene una estructura tridimensional que es sustancialmente similar a una estructura tridimensional de un péptido cíclico que modula la actividad mediada por Trk, el péptido cíclico comprende, dentro de un anillo cíclico del mismo, la secuencia de aminoácidos Arg-Gly-Glu.
35. 35. El peptidomimético de conformidad con la reivindicación 34 caracterizado porque el péptido cíclico comprende la fórmula: (Y?)—(X?)—Arg-Gly-Glu—(X2)—(Y2) donde : (a) Yi y Y2 son aminoácidos seleccionados independientemente con un enlace covalente formado entre Yi y Y2; y (b) Xi y X2 son opcionales y, si están presentes, son aminoácidos seleccionados independientemente o secuencias de aminoácidos unidas por enlaces peptídicos.
36. 36. El peptidomimético de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el péptido cíclico comprende la fórmula: (YO—(ZO—Arg-Gly-Glu-(ZQ)-Arg-Gly-Glu—(Z2)—(Y2) donde : (a) Yi y Y2 son aminoácidos seleccionados independientemente con un enlace covalente formado entre Y? y Y2; y (b) Zi, Z2 y Z0 son opcionales y, si están presentes, son aminoácidos seleccionados independientemente o secuencias de aminoácidos unidas por enlaces peptídicos.
37. 37. El peptidomimético de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el péptido cíclico comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: Cys-Arg-Gly-Glu-Cys (SEQ ID NO: 9); Cys-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Cys (SEQ ID NO:l); Cys-Ala-Arg-Arg-Gly-Glu-Cys (SEQ ID NO: 3); Cys-Phe-His-Arg-Gly-Glu-Cys(SEQ ID NO: 5); Cys-Ser-His-Arg-Gly-Glu-Cys(SEQ ID NO: 7); y Cys-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Ala-Ala-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Cys (SEQ ID NO: 17) ; donde un enlace covalente une las cisteínas N-terminal y C-terminal en la secuencia de aminoácidos .
38. 38. El peptidomimético de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque mejora la actividad mediada por el receptor Trk.
39. 39. El peptidomimético de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque inhibe la actividad mediada por el receptor Trk.
40. 40. Un método para inhibir la actividad mediada por el receptor Trk, método el cual se caracteriza porque comprende poner en contacto una célula con una cantidad de un péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 4 o el peptidomimético de conformidad con la reivindicación 39, donde la cantidad del péptido cíclico o peptidomimético puesta en contacto con la célula inhibe efectivamente la actividad mediada por el receptor Trk.
41. 41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la actividad mediada por el receptor Trk es seleccionada del grupo que consiste de: crecimiento neuronal, sobrevivencia neuronal, crecimiento axonal, plasticidad sináptica y emergencia de neuritas.
42. 42. El método de conformidad con la reivindicación 40 caracterizado porque la célula es puesta en contacto con un péptido cíclico que tiene la fórmula: (YO—(X —Arg-Gly-Glu—(X2)—(Y2) donde: (a) Yi y Y2 son aminoácidos seleccionados independientemente con un enlace covalente formado entre Yi y Y2; y (b) Xx y X2 son opcionales y, si están presentes, son aminoácidos seleccionados independientemente o secuencias de aminoácidos unidas por enlaces peptídicos .
43. 43. El método de conformidad con la reivindicación 42 caracterizado porque la célula es puesta en contacto con un péptido cíclico que tiene la fórmula: (Y?)-Arg—Gly-Glu-(Y2) (YO—Ser—Arg—Arg—Gly—Glu—(Y2) (Yi) Ala-Arg—Arg—Gly—Glu—(Y2) (YO—Phe—His-Arg—Gly—Glu—(Y2) (YO—Ser—His-Arg—Gly—Glu—(Y2)
44. 44. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la célula es puesta en contacto con un péptido cíclico que tiene la secuencia de aminoácidos: Cys-Arg-Gly-Glu-Cys (SEQ I NO: 9); Cys-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Cys (SEQ ID NO:l); Cys-Ala-Arg-Arg-Gly-Glu-Cys (SEQ ID NO: 3); Cys-Phe-His-Arg-Gly-Glu-Cys (SEQ ID NO: 5); o Cys-Ser-His-Arg-Gly-Glu-Cys (SEQ ID NO:7); donde un enlace covalente une las cisteínas N-terminal y C-terminal en la secuencia de aminoácidos. 45. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la célula es puesta en contacto con un peptidomimético que tiene una estructura tridimensional que es sustancialmente similar a una estructura tridimensional de un péptido cíclico que tiene la fórmula: (YO—(XO-Arg-Gly-Glu—(X2)—(Y2) donde : (a) i y Y2 son aminoácidos seleccionados independientemente con un enlace covalente formado entre Yi y
45. Y2; y (b) Xx y X2 son opcionales y, si están presentes, son aminoácidos seleccionados independientemente o secuencias de aminoácidos unidas por enlaces peptídicos.
46. 46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el peptidomimético tiene una estructura tridimensional sustancialmente similar a una estructura tridimensional de un péptido cíclico que tiene la fórmula: (Y,)—Ser—Arg-Arg—Gly-Glu—(?2) (YO—Ala-Arg—Arg—Gly—Glu—(Y2) (YO—Phe—His-Arg—Gly—Glu—(Y2) (Y,)—Ser—His-Arg—Gly—Glu—(Y2)
47. 47. El método de conformidad con la reivindicación 46 caracterizado porque el peptidomimético tiene una estructura tridimensional sustancialmente similar a una estructura tridimensional de un péptido cíclico que tiene una secuencia de aminoácidos: Cys-Arg-Gly-Glu-Cys(SEQ ID NO: 9); Cys-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Cys (SEQ ID NO:l); Cys-Ala-Arg-Arg-Gly-Glu-Cys (SEQ ID NO: 3); Cys-Phe-His-Arg-Gly-Glu-Cys (SEQ ID NO: 5); o Cys-Ser-His-Arg-Gly-Glu-Cys (SEQ ID NO: 7); donde un enlace covalente une las cisteínas N-terminal y C-terminal en la secuencia de aminoácidos .
48. 48. Un método para mejorar la actividad mediada por el receptor Trk, método caracterizado porque comprende poner en contacto una célula con una cantidad de un péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 5 o un peptidomimético de conformidad con la reivindicación 38, donde la cantidad del péptido cíclico o peptidomimético puesta en contacto con la célula inhibe efectivamente la actividad mediada por el receptor Trk.
49. 49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la actividad mediada por el receptor Trk es seleccionada del grupo que consiste del crecimiento neuronal, sobrevivencia neuronal, crecimiento axonal, plasticidad sináptica y emergencia de neuritas.
50. 50. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la célula es puesta en contacto con un péptido cíclico que tiene la fórmula: (Y,)—(Z0—Arg-Gly-Glu—(ZQ)—Arg-Gly-Glu—(Z2)—(Y2) donde : (a) Yi y Y2 son aminoácidos seleccionados independientemente con un enlace covalente formado entre Yi y Y2 ; y (b) Zi, Z2 y Z0 son opcionales y, si están presentes, son aminoácidos seleccionados independientemente o secuencias de aminoácidos unidas por enlaces peptídicos.
51. 51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el péptido cíclico tiene la fórmula: (Y,)—Ser—Arg—Arg—Gly—Glu—Leu—Ala—Ala—Ser-Arg—Arg—Gly—Glu—Leu—(Y2)
52. 52. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el péptido cíclico comprende la secuencia de aminoácidos: Cys-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Ala-Ala-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Cys (SEQ ID NO: 17), donde un enlace covalente une las cisteínas N-terminal y C-terminal en la secuencia de aminoácidos . 53. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la célula es puesta en contacto con un peptidomimético que tiene una estructura tridimensional que es sustancialmente similar a una estructura tridimensional de un péptido cíclico que tiene la fórmula:
53. (YO—(Z —Arg-Gly-Glu—(Zo)—Arg-Gly-GIu—(Z2)—(?2) donde: (a) Yi y Y2 son aminoácidos seleccionados independientemente con un enlace covalente formado entre Yi y
54. Y2 ; y (b) Zi, Z2 y Z0 son opcionales y, si están presentes, son aminoácidos seleccionados independientemente o secuencias de aminoácidos unidas por enlaces peptídicos. 54. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el peptidomimético tiene una estructura tridimensional sustancialmente similar a una estructura tridimensional de un péptido cíclico que tiene la fórmula: (Y0~Ser—Arg—Arg—Gly—Glu—Leu—Ala—Ala—Ser-Arg—Arg—Gly—Glu—Leu—(Y2)
55. 55. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque el peptidomimético tiene una estructura tridimensional sustancialmente similar a una estructura tridimensional de un péptido cíclico que comprende la secuencia de aminoácidos: Cys-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Ala-Ala-Ser-Arg-Arg- Gly-Glu-Leu-Cys(SEQ ID NO:17), donde un enlace covalente une las cisteínas N-terminal y C- terminal en la secuencia de aminoácidos.
56. 56. Un método para mejorar el crecimiento o reparación del sistema nervioso central (SNC) en un individuo, método caracterizado porque comprende administrar al individuo una cantidad de un péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 5 o el peptidomimético de conformidad con la reivindicación 38, donde la cantidad del péptido cíclico o peptidomimético administrado mejora efectivamente el crecimiento o reparación del SNC.
57. 57. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque un péptido cíclico es administrado al individuo, el péptido cíclico tiene la fórmula: (YO—(ZO-Arg-Gly-Glu—(Zo)-Arg-Gly-Glu—(Z2)—(?2) donde : (a) Yi, y Y2 son aminoácidos seleccionados independientemente con un enlace covalente formado entre Yi y Y2; y (b) Zi, Z2 y Z0 son opcionales y, si están presentes, son aminoácidos seleccionados independientemente o secuencias de aminoácidos unidas por enlaces peptídicos.
58. 58. El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque el péptido cíclico tiene la fórmula: (YO—Ser—Arg—Arg—Gly—Glu—Leu—Ala—Ala—Ser-Arg—Arg—Gly—Glu—Leu—(Y2)
59. 59. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el péptido cíclico comprende la secuencia de aminoácidos: Cys-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Ala-Ala-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Cys(SEQ ID NO: 17), donde un enlace covalente une las cisteínas N-terminal y C-terminal en la secuencia de aminoácidos. 60. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque es administrado un peptidomimético al individuo, el peptidomimético tiene una estructura tridimensional que es sustancialmente similar a una estructura tridimensional de un péptido cíclico que tiene la fórmula: (YO—(ZO-Arg-Gly-Glu—(Zo)-Arg-Gly-Glu—(Z2)—(?2) donde : (a) Yi y Y2 son aminoácidos seleccionados independientemente con un enlace covalente formado entre Yx y
60. Y2; y (b) Zi, Z2 y Z0 son opcionales y, si están presentes, son aminoácidos seleccionados independientemente o secuencias de aminoácidos unidas por enlaces peptídicos. 61. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque el peptidomimético tiene una estructura tridimensional sustancialmente similar a una estructura tridimensional de un péptido cíclico que tiene la fórmula:
61. (YO—Ser—Arg—Arg—Gly—Glu—Leu—Ala—Ala—Ser-Arg—Arg—Gly—Glu—Leu— (Y2)
62. 62. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque el peptidomimético tiene una estructura tridimensional sustancialmente similar a una estructura tridimensional de un péptido cíclico que comprende la secuencia de aminoácidos : Cys-Ser-Arg-Arg-Gly-Giu-Leu-Ala-Ala-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Cys (SEQ ID N0:17), donde un enlace covalente une las cisteínas N-terminal y C-terminal en la secuencia de aminoácidos .
63. 63. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende : (a) una cantidad de un péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 1 o un peptidomimético de conformidad con la reivindicación 34, cantidad la cual es efectiva para modular la actividad mediada por el receptor Trk; y (b) uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables.
64. 64. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 63, caracterizada porque el péptido cíclico o peptidomimético mejora la actividad mediada por el receptor Trk.
65. 65. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 63, caracterizada porque el péptido cíclico o peptidomimético inhibe la actividad mediada por el receptor Trk.
66. 66. Un método para reducir una respuesta inhibidora del SNC, método caracterizado porque comprende poner en contacto una célula con una cantidad de un péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 5 o un peptidomimético de conformidad con la reivindicación 38, donde la cantidad del péptido cíclico o peptidomimético puesta en contacto con la célula reduce efectivamente la respuesta inhibidora del SNC.
67. 67. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque la respuesta inhibidora del SNC es mediada por una cascada de señales con uno o más componentes que son modulados por la proteína cinasa A (PKA o fosfoinositido-3 cinasa (PI3K) .
68. 68. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque la respuesta inhibidora del SNC es mediada por una cascada de señales que implica a Rho.
69. 69. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque la respuesta inhibidora del SNC es un respuesta mediada por MAG, Nogo-A, una glicoproteína de mielina oligodendrocítica, NgR, GTlb, p75NTR, un proteoglicano de sulfato de condroitina o una semaforina.
70. 70. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque la célula es puesta en contacto con un péptido cíclico que tiene la fórmula: (YO—(ZO-Arg-Gly-Glu—(Zo)-Arg-Gly-Glu—(Z2)—(?2) donde : (a) Yi y Y2 son aminoácidos seleccionados independientemente con un enlace covalente formado entre Yi y Y2; y (b) Zi, Z2 y Zo son opcionales y, si están presentes, son aminoácidos seleccionados independientemente o secuencias de aminoácidos unidas por enlaces peptídicos.
71. 71. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque el péptido cíclico tiene la fórmula: (YO—Ser—Arg—Arg—Gly—Glu—Leu—Ala—Ala—Ser-Arg—Arg—Gly—Glu—Leu—(Y2)
72. 72. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque el péptido cíclico comprende la secuencia de aminoácidos: Cys-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Ala-Ala-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Cys(SEQ ID NO: 17), donde un enlace covalente une la cisteínas N-terminal y C-terminal en la secuencia de aminoácidos. 73. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque la célula es puesta en contacto con un peptidomimético que tiene una estructura tridimensional que es sustancialmente similar a la estructura tridimensional de un péptido cíclico que tiene la fórmula: (Y)—(Zi)—Arg-Gly-Glu—(ZQ)—Arg-Gly-Glu—(Z2)—(Y2) donde : (a) Yi y Y2 son aminoácidos seleccionados independientemente con un enlace covalente formado entre Yi y
73. Y2; y (b) Zi, Z2 y Z0 son opcionales y, si están presentes, son aminoácidos seleccionados independientemente o secuencias de aminoácidos unidas por enlaces peptídicos.
74. 74. El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque el peptidomimético tiene una estructura tridimensional sustancialmente similar a una estructura tridimensional de un péptido cíclico que tiene la fórmula : (YO—Ser—Arg—Arg—Gly—Glu—Leu—Ala—Ala—Ser-Arg—Arg—Gly—Glu—Leu—(Y2)
75. 75. El método de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque el peptidomimético tiene una estructura tridimensional sustancialmente similar a una estructura tridimensional de un péptido cíclico que comprende la secuencia de aminoácidos:
76. Cys-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Ala-Ala-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Cys(SEQ ID NO: 17) , donde un enlace covalente une las cisteínas N-terminal y C-terminal en la secuencia de aminoácidos . 76. Un método para reducir una respuesta inhibidora del SNC en un individuo, método caracterizado porque comprende administrar al individuo una cantidad de un péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 5 o el peptidomimético de conformidad con la reivindicación 38, donde la cantidad administrada del péptido cíclico o peptidomimético reduce efectivamente la respuesta inhibidora del SNC.
77. 77. El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque la respuesta inhibidora del SNC es mediada por una cascada de señales con uno o más componentes que son modulados por proteína cinasa A (PKAO o fosfoinositido-3 cinasa (PI3K) .
78. 78. El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque la respuesta inhibidora del SNC es mediada por una cascada de señales que implica a Rho.
79. 79. El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque la respuesta inhibidora del SNC es una respuesta mediada por MAG, Nogo-A, una glicoproteína de mielina oligodendrocítica, NgR, GTlb, p75NTR, un proteoglicano de sulfato de condroitina o una semaforina.
80. 80. El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque la célula es puesta en contacto con un péptido cíclico que tiene la fórmula: (YO—(Z —Arg-Gly-Glu—(ZQ)-Arg-Gly-Glu—(Z2)—(Y2) donde : (a) Yi y Y2 son aminoácidos seleccionados independientemente con un enlace covalente formado entre Yi y Y2; y (b) Zi, Z2 y Z0 son opcionales y, si están presentes, son aminoácidos seleccionados independientemente o secuencias de aminoácidos unidas por enlaces peptídicos. 81. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque el péptido cíclico tiene la fórmula:
81. (YO—Ser—Arg—Arg—Gly—Glu—Leu—Ala—Ala—Ser-Arg—Arg—Gly—Glu—Leu—(Y2)
82. 82. El método de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque el péptido cíclico comprende la secuencia de aminoácidos: Cys-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Ala-Ala-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Cys (SEQ ID NO: 17), en donde un enlace covalente une las cisteínas N-terminal y C-terminal en la secuencia de aminoácidos.
83. 83. El método de conformidad con la reivindicación 76, caracterizado porque con la célula es puesta en contacto con un peptidomimético que tiene una estructura tridimensional que es sustancialmente similar a una estructura tridimensional de un péptido cíclico que tiene la fórmula: (YO—(ZO—Arg-Gly-Glu—(ZQ)-Arg-Gly-Glu—(Z2)—(Y2) donde: (a) Yi y Y2 son aminoácidos seleccionados independientemente con un enlace covalente formado entre Yx y Y2; y (b) Zi, Z2 y Z0 son opcionales y, si están presentes, son aminoácidos seleccionados independientemente o secuencias de aminoácidos unidas por enlaces peptídicos.
84. 84. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el peptidomimético tiene una estructura tridimensional sustancialmente similar a una estructura tridimensional de un péptido cíclico tiene la fórmula: (YO—Ser—Arg—Arg—Gly—Glu—Leu—Ala—Ala—Ser-Arg—Arg—Gly—Glu—Leu—(Y2)
85. 85. El método de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque el peptidomimético tiene una estructura tridimensional sustancialmente similar a una estructura tridimensional de un péptido cíclico que comprende la secuencia de aminoácidos: Cys-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Ala-Ala-Ser-Arg-Arg- Gly-Glu-Leu-Cys (SEQ ID NO : 17), caracterizado porque un enlace covalente une las cisteínas N-terminal y C-terminal en la secuencia de aminoácidos.
86. 86. Un péptido cíclico, caracterizado porque comprende, dentro de un anillo cíclico del péptido cíclico, la secuencia de D-aminoácidos de: dGlu-Gly-dArg donde el péptido cíclico modula la actividad mediada por el receptor Trk.
87. 87. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque promueve el crecimiento de neuritas.
88. 88. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque el péptido cíclico comprende la fórmula: (Y0-(X?)—GIu-Gly-dArg-(X2)— (Y2) en donde (a) Yi y Y2 son aminoácidos seleccionados independientemente con un enlace covalente formado entre Yx y Y2; y (b) Xx y X2 son opcionales y, si están presentes, son aminoácidos seleccionados independientemente o secuencias de aminoácidos unidas por enlaces peptídicos.
89. 89. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque el enlace covalente formado entre Yx y Y2 es un enlace peptídico.
90. 90. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 89, caracterizado porque el péptido cíclico tiene la secuencia de aminoácidos: dLeu-dGlu-Gly-dArg-dArg-dSer-dLeu-dGlu-Gly-dArg-dArg-dSer (SEQ ID NO : 40) .
91. 91. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque comprende la fórmula que tiene la secuencia de aminoácidos: dCys-dLeu-dGlu-Gly-dArg-dArg-dSer-dAla-dAla-dLeu-dGlu-Gly-dArg-dArg-dSer-dCys (SEQ ID NO: 41); donde las cisteínas terminales están ligadas covalentemente por enlaces disulfuro.
92. 92. El péptido cíclico de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el péptido cíclico tiene la secuencia de aminoácidos : Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu-Ser-Arg-Arg-Gly-Glu-Leu (SEQ ID NO: 39) ; donde la serina terminal y la leucina terminal están ligadas covalentemente por un enlace peptídico.
93. 93. Un método para promover el crecimiento de neuronas del SNC en un ambiente inhibidor, caracterizado porque comprende administrar a un individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de unión del receptor de p75.
94. 94. El método de conformidad con la reivindicación 93, caracterizado porque el agente de unión del receptor de p75 comprende un motivo de unión de neurotrofina o un peptidomimético del mismo.
95. 95. El método de conformidad con la reivindicación 94, caracterizado porque el agente de unión del receptor de p75 es un péptido cíclico o un peptidomimético que comprende, dentro de un anillo cíclico del mismo, una secuencia de aminoácidos Thr-Asp-Ile-Lys-Gly-Lys-Glu (TDIKGKE) (SEQ ID NO: 42) .
96. 96. El método de conformidad con la reivindicación 95, .caracterizado porque el agente de unión del receptor de p75 es N-Ac-CTDIKGKEC-NH2 (SEQ ID NO: 43) .
97. 97. El método de conformidad con la reivindicación 93, caracterizado porque comprende además administrar una neurotrofina .
98. 98. El método de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado porque el agente de unión del receptor p75 es administrado en una cantidad aproximadamente de 10 hasta aproximadamente 100 veces más que la neurotrofina.
99. 99. El método de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado porque la neurotrofina es seleccionada del grupo que consiste de NGF, BDNF, NT-3, NT-4 y NT-5.
100. 100. El método de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado porque el agente de unión del receptor de p75 comprende un motivo de unión de neurotrofina o un peptidomimético del mismo.
101. 101. El método de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado porque el agente de unión del receptor de p75 es un péptido cíclico o peptidomimético que comprende dentro de un anillo cíclico del mismo, la secuencia de aminoácidos TDIKGKE (SEQ ID NO: 42) .
102. 102. El método de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado porque el agente de unión del receptor de p75 es N-Ac-CTDIKGKEC-NH2 (SEQ ID NO : 43) .
103. 103. Un método para promover el crecimiento de las neuronas del SNC en un ambiente inhibidor, caracterizado porque comprende administrar a un individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente de unión del receptor de p75, donde el agente de unión del receptor de p75 es una neurotrofina que no se une a un receptor Trk expresado por una neurona dañada en el ambiente inhibidor.
104. 104. El método de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque el agente de unión del receptor de p75 es administrado en combinación con otra neurotrofina diferente, donde la otra neurotrofina diferente se une a un receptor Trk expresado por la neurona dañada en el ambiente inhibidor .
105. 105. El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque el agente de unión del receptor de p75 es NGF y la otra nuerotrofina diferente es BDNF.