JP4402455B2 - 細胞の分化、増殖、再生、可塑性及び生存に影響を及ぼすことができる化合物 - Google Patents

Description

本発明は、繊維芽細胞増殖因子（FGF）レセプター及び／又はアデノシン三リン酸（ATP）及び／又はL1と相互作用することができる、神経細胞接着分子（NCAM）の第３免疫グロブリン（Ig３）モジュール、及び／又は第４免疫グロブリン（Ig４）モジュール、及び／又は第５免疫グロブリン（Ig５）モジュール、及び／又は第１フィブロネクチンIII （Fn３，１）モジュール、及び／又は第２フィブロネクチンIII （Fn３，２）モジュール、もしくはその断片、もしくは変異体を含んで成る化合物であって、従って、当該化合物は細胞の分化を誘導し、増殖を調節し、再生、ニューロンの可塑性及び／もしくは生存を刺激することができる化合物に関連する。更に、本発明は前記化合物を含んで成る医薬組成物、医薬組成物を生産する方法及び前記化合物の使用に関連する。

発明の背景
細胞接着分子（CAM）は、細胞間の接着に介在するタンパク質の群を構成する。CAMの主要な群は、免疫グロブリンドメインの存在を特徴とする免疫グロブリン（Ig）スーパーファミリーに属する。神経細胞接着分子（NCAM）は、例えば神経系において特に豊富であるIgスーパーファミリーの細胞接着分子である。NCAMは神経細胞の外膜上で発現している。ある細胞上のNCAM分子が他の細胞上のNCAM分子に対して結合する場合（同種親和性結合）、３つの細胞間での結合がより強められる。NCAMは、NCAMに対してのみ結合するのではなく、神経細胞上もしくは細胞外マトリクスにおいて発見されるタンパク質及び／もしくは複合糖質に対しても結合する（異好性結合）。NCAMはATPにも結合する。NCAM相互作用は細胞の移動、神経突起の伸長、神経突起の繊維束収縮、細胞増殖、細胞生存、及びシナプスの形成に影響を与える。

NCAMは、２５個以上のエキソンを含む単一の遺伝子によってコードされている。前駆体mRNAの選択的スプライシングにより、様々な成熟mRNA種及びそれによるNCAMのタンパク質イソ型が生産されて良い。３つの主要なNCAMイソ型は、NCAMが原形質膜に対して結合する方法及び細胞内NCAMドメインのサイズをそれぞれ決定するエキソン１５と１８の選択適スプライシングによって生み出されている。神経系において、グリコシルスルファチジルイノシトール（GPI）が係留した１２０kDaのイソ型は、グリア細胞の表層で発現しており、膜貫通型の１４０kDaのイソ型はニューロンとグリア細胞の両方で発現しており、その一方で膜貫通型の１８０kDaのイソ型は主にニューロンの表層上で発見されている。NCAMの細胞外部分は、５つのIg様相同モジュール（Ig１、Ig２、Ig３、Ig４とIg５）及び２つのIII 型フィブロネクチンモジュール（F３，１とF３，２）を含んで成る（Berezinら、２０００）。NCAMの個々の細胞外モジュールは、タンパク質の機能における独特な役割を果たすことが示されており、詳細には、Ｆ３，１及びＦ３，２はNCAMが介在した細胞接着及び栄養増殖に関わることが示されている（Freiら、1992；Kasperら、1996、Stahlhutら、1997）。

NCAMの異好性リガンドは、様々なヘパラン硫酸プロテオグリカン（アグリンなど）及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ニューロカンなど）を含んで成る。NCAMのIg１とIg２は、おそらくNCAMとヘパラン硫酸プロテオグリカンとの相互作用の構造決定因子であり、その理由は、これら２つのモジュールがヘパリンを結合することが示されている（Kiselvoyら１９９７）からである。コアタンパク質又は炭水化物の部分が、NCAMに対するプロテオグリカンの結合を担うことが矛盾しているかどうか、そしてNCAMが介在する細胞機能に対するこの相互作用の寄与は現在も理解されていないことに関する報告（Retzlerら、１９９６）がある。NCAMとL1との相互作用は、L１によって担持されるN結合オリゴマンノシジルグリカン並びにNCAMの４つのIgモジュール中に局在するレクチン様結合部位が介在していることが示されている。この結合を通じて、NCAMは、２つの神経CAM同士の協力作用の注目の例を提示するいわゆる補助的L１−L１相同相互作用に参加することが示唆されている（Horstkortsら１９９３）。

３つの異なるモデルの同種親和性結合が示唆されており、それは：１）２つの対立する分子の第３Ig様モジュール（Raoら、１９９２）同士の結合；２）逆平行相互作用におけるIg様モジュール全５つの関与（Ranheimら、１９９６）；並びに３）第１Ig様モジュールと第２Ig様モジュールの相互結合（Kiselvyovら、１９９７）である。後者のモデルは最近、核磁気共鳴（NMR）解析（Jensenら、1999）及びX線結晶解析によって確認された（Kasperら、２０００）。

NCAMは、神経系及び器官の例えば、腎臓、腸、心臓、性腺、すい臓、及び筋肉が生長する間の重要な役割をする。成熟神経系において、NCAMは、再生、学習及び記憶に関連する神経連絡の可塑性のために重要である。末梢神経系において、NCAMは、神経線維の伸長及び外傷など傷害後の再生にける神経−筋連絡の形成に関わる。

シグナル伝達において、NCAMは、例えば、FGFレセプターなどのチロシンリン酸化、及び細胞外カルシウム濃度増加につながる細胞外シグナルを変換する。DohertyとWalsh（１９９９）は、NCAM、Nカドヘリン及びL１がニューロン中の繊維芽細胞増殖因子（FGFR）を活性化することによって軸索の生長を刺激することを記載している。

NCAMを提示する細胞からの分化及び／又は神経突起生長を刺激することができるNCAM結合化合物はWO００／１８８０１に記載されており、ここで当該化合物は、NCAM提示細胞の再生のための治療において用いられている。

かかる１つの化合物C３の同定は、Ronnら（１９９９）によって記載されている。C３は、同種親和性NCAM結合によって活性化されるシグナル伝達経路と同一の経路を活性化することによって、伸長を刺激するが、FGFレセプターに対して直接結合することはない。

様々な因子により神経細胞死が生じうる。神経細胞死を生じる危険因子にさらされている個体において神経細胞死を予防することは、細胞の生存を維持する／刺激するもしくは促すことと呼ばれて良く、又は神経防護作用と呼ばれうる。

神経細胞が、例えば、還元酸素の供給などによって傷害された場合、細胞死の過程がスタートし、そして細胞の機能障害、細胞同士の細胞間連絡（ネットワーク）の「崩壊」、細胞が後退する過程及び最終的には細胞死につながる。神経細胞死を予防すること、即ち、生存を刺激／促進することとは、細胞が細胞死の過程の開始から保護されることを意味する。

神経細胞の生存は、いくつかの参考文献中で議論されてきた。例えば、Hullyら（１９９８）及び米国特許第５，７９２，７４３号は、L１神経細胞接着分子は、毒素MPP⁺の存在下で培養された胎児中脳ドーパミン作用性神経細胞の生存及び分化を刺激できることを開示している。

米国特許第６，０３７，３２０号は、神経栄養因子、NT−4の同定を記載しており、そして米国特許第５，７６７，２４０号中では、脊髄神経細胞、大脳皮質細胞及び海馬神経細胞の生存を高めることができる活性依存性神経栄養因子が明らかになっている。

更に、米国特許第５，５６７，６８２号は、短鎖ペプチドを鼻腔内投与することによってアルツハイマー病の症状を治療する方法に関連する。前記ペプチドは、進行性の神経細胞変性を減らすかあるいは中断せしめることによって神経生存を促す。

NCAMは、外アデノシン三リン酸アーゼ（ATPase）活性を有することが最近証明された（Dzhandzhugazyan及びBock、１９９３及び１９９７）。ATPにおけるこの活性の役割は、神経系中で最も豊富な神経伝達物質の１つである。最近の研究で、ATPはNCAMが誘導した神経突起生長を調節することが示されており、このことは、ATPが推定NCAM−FGFレセプターシグナル伝達経路の調節因子でありうることを示唆している（Skladchikovaら、１９９９）。

しかし、本発明者は、神経細胞接着分子（NCAM）第３免疫グロブリン（Ig３）モジュール、及び／もしくは第４免疫グロブリン（Ig４）モジュール、及び／もしくは第５免疫グロブリン（Ig５）モジュール、並びに／又は第１フィブロネクチンIII （Fn３，１）モジュール、及び／もしくは第２フィブロネクチンIII （Fn３，２）モジュール、もしくは、その断片、もしくは変異体を含んで成る化合物は、繊維芽細胞増殖因子（FGF）レセプター及び／もしくはアデノシン三リン酸（ATP）及び／もしくはL1との相互作用を通じて、細胞の分化の誘導、増殖の調節、再生、ニューロンの可塑性及び／もしくは生存を刺激することができるという、驚くべきことを発見している。

発明の概要
本発明は、神経細胞接着分子（NCAM）の第３免疫グロブリン（Ig３）モジュール、及び／もしくは第４免疫グロブリン（Ig４）モジュール、及び／もしくは第５免疫グロブリン（Ig５）モジュール、及び／もしくは第１フィブロネクチンIII （Fn３，１）モジュール、及び／もしくは第２フィブロネクチンIII （Fn３，２）モジュール、もしくは、その断片、もしくは変異体を含んで成り、繊維芽細胞増殖因子（FGF）レセプター及び／もしくはアデノシン三リン酸（ATP）及び／もしくはL1と相互作用できる化合物に関する。本発明の背景において、第１フィブロネクチンIII モジュール及び第２フィブロネクチンIII モジュールは、「Fn３，１及びFn３，２」もしくは「FnIII ，１及びFnIII ，２」もしくは「Fn３，１及びFn３，２」に等しい。

更なる観点において、本発明は、神経細胞接着分子（NCAM）の第４免疫グロブリン（Ig４）モジュール、及び／もしくは第５免疫グロブリン（Ig５）モジュール、及び／もしくは第１フィブロネクチンIII （Fn３，１）モジュール、及び／もしくは第２フィブロネクチンIII （Fn３，２）モジュール、もしくは、その断片、もしくは変異体を含んで成り、FGFレセプター及び／もしくはアデノシン三リン酸（ATP）及び／もしくはL1と相互作用することができる化合物に関する。

本発明の化合物は、FGFレセプターを提示する細胞及び／又はNCAMリガンド提示細胞の分化を誘導すること、増殖を調節すること、再生、ニューロンの可塑性及び生存を刺激することができる。

更に、本発明は、本発明の化合物を１つ以上含んで成る医薬組成物、及びかかる医薬組成物を生産する方法を開示する。そしてまた、本発明の化合物の使用並びに当該化合物により疾患及び症状を治療することは本発明の範囲内である。

発明の詳細な説明
本発明の化合物は、細胞の分化の誘導、増殖の調節、再生、ニューロンの可塑性及び／もしくは生存の刺激に関連する。

用語、FGLペプチドとは、NCAMのFGループペプチドを意味し、それは配列番号１に対応するNCAMのFGFレセプター結合部位である。

用語「調節」とは、変化、例えば、阻害又は刺激のいずれかを意味する。

本発明の背景において、用語「相互作用」とは、本発明の化合物とFGFレセプター間での直接的又は間接的な接触、好適には直接的な相互作用を意味する。用語「直接相互作用」とは、当該化合物がレセプターに対して直接結合することを意味する。

用語「FGFレセプターを提示する細胞」とは、FGFレセプターを細胞の外膜上で発現する細胞を意味し、これらの細胞としては、例えば、ニューロン、グリア細胞、全種類の筋細胞、神経分泌細胞、性腺細胞及び腎細胞、内皮細胞及び繊維芽細胞が挙げられる。

用語「NCAMリガンドを提示する細胞」とは、NCAM及び／もしくはNCAMの一部が結合しうるレセプターもしくはリガンド（即ち、いわゆるカウンターレセプター）を発現する細胞を意味する。NCAMリガンドの例は、FGF（繊維芽細胞増殖因子）レセプター、L１もしくは複合糖質もしくはグルコースアミノグリカン、例えば、ヘパリン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、及びコンドロイチン硫酸プロテオグリカン及びATPである。

本発明の背景において、用語「生存の刺激／促進」とは、用語「細胞死を予防すること」もしくは「神経防護」と同義語で使用されている。生存を刺激／促進することによって、疾患を予防すること又は変性性の疾患を患う個体の神経系の更なる変性を予防することが可能である。

「生存」とは、細胞が外害を受けており、そしてもし本発明の化合物が当該細胞の変性を予防するために用いられなければ、通常の条件下で死ぬ可能性が非常に高く、従って、前記傷害を受けた細胞の生存を促進するかあるいは刺激する方法を意味する。

「ニューロンの可塑性」とは神経連絡の再構築をする機能を意味する。

末梢神経細胞は、様々な障害を受けた後それらの標的との機能的連絡を再生及び再構築する可能性がある程度はある。しかし、機能の回復は殆ど全く稀であり、そして末梢神経細胞の傷害は多くの問題を残す。中枢神経系においては、再生の可能性は更に限定されている。従って、末梢神経系及び中枢神経系の神経細胞死を予防する能力を有する物質を同定することは有意であり且つ商業的価値がある。

従って、本発明は神経細胞接着分子（NCAM）の第３免疫グロブリン（Ig３）モジュール、及び／又は第４免疫グロブリン（Ig４）モジュール、及び／又は第５免疫グロブリン（Ig５）モジュール、及び／又は第１フィブロネクチンIII （Fn３，１）モジュールを、及び／又は第２フィブロネクチンIII （Fn３，２）モジュール、もしくはその断片、もしくは変異体を含んで成る化合物は、繊維芽細胞増殖因子（FGF）レセプター及びもしくはアデノシン三リン酸（ATP）及び／もしくはL１と相互作用できるという発見に関連する。

本発明の背景において、NCAM分子とはデータベースSWISSPROT、アクセスNo.：P13596に示されている配列を有するNCAMを意味する。

この配列中、本明細書中に記載の前記ドメインの位置は以下の通りに記載されている。
Ig３：２０３〜３０８
Ig４：３０９〜４０４
Ig５：４０５〜５００
F３，１：５０１〜６０１
F３，２：６０２〜６９５

本発明は更に、神経細胞接着分子（NCAM）の第４免疫グロブリン（Ig４）モジュール、及び／又は第５免疫グロブリン（Ig５）モジュール、及び／又は第１フィブロネクチンIII （Fn３，１）モジュール、及び／又は第２フィブロネクチンIII （Fn３，２）モジュール、もしくはその断片、もしくは変異体を含んで成る化合物はFGFレセプター及び／もしくはアデノシン三リン酸（ATP）及び／もしくはL1と相互作用することができること、例えば、神経細胞接着分子（NCAM）の第４免疫グロブリン（Ig４）モジュール、及び／又は第１フィブロネクチンIII （Fn３，１）モジュール、及び／又は第２フィブロネクチンIII （Fn３，２）モジュール、もしくはその断片、もしくはその変異体を含んで成る化合物がFGFレセプター及び／もしくはアデノシン三リン酸（ATP）及び／もしくはL1と相互作用することができること、又は例えば、神経細胞接着分子（NCAM）の第５免疫グロブリン（Ig５）モジュール、及び／又は第１フィブロネクチンIII （Fn３，１）モジュール、及び／又は第２フィブロネクチンIII （Fn３，２）モジュール、もしくはその断片、もしくは変異体を含んで成る化合物がFGFレセプター及び／又はアデノシン三リン酸（ATP）及び／もしくはL1と相互作用することができること、例えば、神経細胞接着分子（NCAM）の第１フィブロネクチンIII （Fn３，１）モジュール、及び／又は第２フィブロネクチンIII （Fn３，２）モジュール、もしくはその断片、もしくは変異体を含んで成る化合物がFGFレセプター及び／もしくはアデノシン三リン酸（ATP）及び／もしくはL1と相互作用することができるという発見に関連する。

本発明の背景において、「その断片」とは、FGF−レセプター及び／もしくはATP及び／もしくはL１と相互作用することができるNCAM分子の任意の部分であるものと解され、そして前記結合を通じて、細胞の増殖を調節し、そして／又は分化を誘導し、そして／もしくは再生、ニューロンの可塑性及び／もしくは生存を刺激する。「その変異体」とは、FGFレセプター及び／もしくはATP及び／もしくはL１と相互作用することができる任意のペプチド配列であるとして解され、そして前記結合により、細胞の分化を誘導し、増殖を調節し、そして／又は分化を誘導し、再生、ニューロンの可塑性及び／もしくは生存を刺激する。従って、断片又は変異体は以下のように規定されて良い。
ｉ）抗体により認識されることができ、そして所定のNCAMアミノ酸配列をも認識することができるアミノ酸配列を含んで成る断片／変異体、及び／又は、
ii）レセプター部分に対して結合することができ、そして所定のNCAMアミノ酸配列をも結合することができるアミノ酸配列を含んで成る断片／変異体、及び／又は
iii ）前記所定のアミノ酸配列のように、FGFレセプター及び／もしくはATP及び／もしくはL1の少なくとも１つに対して少なくとも実質的に類似する結合親和性を有する断片／変異体
である。

本発明の背景において、用語「機能的同等物」とは、先に規定した変異体を意味する。

本発明の化合物の結合親和性は、NCAM及び／又はNCAMがリガンドに対して、好適に、１０^-3〜１０^-10Mの範囲、例えば、好適に、１０^-4〜１０^-8Mの範囲の結合親和性（Kd値）を有する。本発明によれば、前記結合親和性は、以下の、表層プラズモン共鳴解析又は核磁気共鳴スペクトロスコピーのアッセイのうちの１つによって決定されている。

本発明の背景において、上記のNCAMドメインの変異体とは、FGFレセプターもしくはNCAMリガンド、及び／もしくはL１を提示する全ての細胞と相互作用する全ての化合物であるものとして解されており、そして前記相互作用を通じてFGFレセプター提示細胞の増殖を調節し、そして／もしくは分化を誘導し、再生、ニューロンの可塑性及び／もしくは生存を刺激する、即ち、機能的変異体であるものと解されている。変異体は、ペプチド、ペプチド誘導体、抗体及び非ペプチド化合物、例えば、小有機化合物の、糖及び脂質、並びに模倣ペプチドでありうる。好適な実施態様において、前記変異体は先に論じたようなペプチドである。

ある実施態様において、変異体とは、好適な所定の配列とは、挿入、欠失及び置換の数と範囲が次第に異なっていき、保存的置換などが増えるアミノ酸配列を示すものと解されて良い。この差は、所定の配列と変異体との相同性の低下として測定されている。

ペプチドは、例えば、１又は数個のアミノ酸残基の置換によって修飾されて良い。L−アミノ酸とD−アミノ酸の両方が使用されて良い。他の修飾は、例えば、エステル、糖などの誘導体を含んで成る。例としては、メチルエステル及びアセチルエステルがある。重合化、例えば、反復配列又は様々な担体に対する結合は当業界で周知あり、例えば、リジン骨格の、４ペプチド、８ペプチド、１６ペプチド、又は３２ペプチドを担持するリジンデンドリマーが挙げられる。他の担体は、タンパク質部分、例えば、ウシ血清アルブミン（BSA）、もしくは脂肪親和性デンドリマー、もしくは、脂肪親和性誘導体によって形成されたミセル様担体、もしくは星状（星様）共役炭素鎖ポリマーでありうる。

本発明の断片の変異体は、同変異体内もしくはその断片内又は異なる複数の変異体内もしくはその断片内に、１つ以上の置換、例えば、独立してかあるいは互いに導入された複数の置換を含んで成りうる。従って、複合体の変異体又はその断片は、互いに独立して保存的置換を含んで成って良く、ここで、前記変異体、又はその断片の１つ以上のグリシン（Gly）が、Ala、Val、Leu及びIleからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸により置換されており、そして独立して、変異体、又はその断片の１つ以上のアラニン（Ala）は、Gly、Val、Leu及びIleからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されており、そして独立して、変異体、又はその断片の１つ以上のバリン（Val）は、Gly、Ala、Leu及びIleからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されており、そして独立して、変異体、又はその断片の１つ以上のロイシン（Leu）は、Gly、Ala、Val、及びIleからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されており、そして独立して、変異体、又はその断片の１つ以上のイソロイシン（Ile）は、Gly、Ala、Val及びIleからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されており、そして独立して、変異体、又はその断片の１つ以上のアスパラギン酸（Asp）は、Glu、Asn、及びGlnからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されており、そして独立して、変異体、又はその断片の１つ以上のアスパラギン（Asn）は、Asp、Glu、及びGlnからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されており、そして独立して、変異体、又はその断片の１つ以上のグルタミン（Gln）は、Asp、Gul、Leu及びAsnからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されており、そして独立して、変異体、又はその断片の１つ以上のフェニルアラニン（Phe）は、Tyr、Trp、His、Proからなるアミノ酸の群、そして好適にはTyr及びTrpからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されており、そして独立して、変異体、又はその断片の１つ以上のチロシン（Tyr）は、Phe、Trp、His、Proからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸、好適にはPhe及びTrpからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されており、そして独立して、変異体、又はその断片の１つ以上のアルギニン（Arg）は、Lys及びHisからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されており、そして独立して、変異体、又はその断片の１つ以上のリジン（Lys）は、Arg及びHisからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されており、並びに独立して、変異体、又はその断片並びに、独立して、変異体もしくはその断片の１つ以上のプロリン（Pro）は、Phe、Tyr、Trp及びHisからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されており、その変異体もしくはその断片の１つ以上のシステイン（Cys）は、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Asn、Gln、Ser、Thr及びTyrからなるアミノ酸の群から選択されたアミノ酸で置換されている。

上記の概要から、前記同等物又はその断片は、本明細書中先に規定した複数の保存的アミノ酸の群に由来する複数の保存的アミノ酸置換を含んで成りうることは明らかである。

保存的置換は、本発明の好適な所定のペプチド又はその断片の任意の位置に導入されて良い。しかし、非保存的置換、特に、１又は複数の位置において非保存的置換を導入することが望ましいが、それらには限定されない。

本発明のペプチドの機能的に等しい断片を形成することにつながる非保存的置換は、極性などにおいて実質上違うであるだろう。それは例えば、非極性側鎖を有する残基（Ala、Leu、Pro、Trp、Val、Ile、Leu、Phe又はMet）が極性側鎖を有する残基、例えば、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、もしくはGln又は荷電したアミノ酸の、例えばAsp、Glu、ArgもしくはLysなどへの置換、又は荷電したもしくは極性残基を非極性のものに置換すること；及び／又はii）そのペプチド骨格方向に対するその効果の実質上の違い、例えば、ProもしくはGlyのもしくはそれらへの他の残基による置換；及び／又はiii ）実質上の電荷における違い、例えば、負に荷電した残基、例えばGluもしくはASPの正に荷電した残基、例えばLys、HisもしくはArgへの置換（及びその逆）であり；及び／又はiv）立体的なかさ（steric bulk）における実質上の違い、例えば、かさばる残基、例えば、His、Trp、PheもしくはTyrの、小さな側鎖を有するもの、例えばAla、GlyもしくはSerへの置換（及びその逆）である。

１つの実施態様において、アミノ酸の置換は、それらの疎水性及び親水性の等級及びアミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えば電荷、サイズなどに基づいて行われて良い。例えば、様々な先の特性を考慮したアミノ酸置換が当業者に周知であり、そして例えば：アルギニンとリジン；グルタミン酸塩とアスパラギン酸塩；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；バリン、ロイシンとイソロイシンである。

アミノ酸の付加もしくは欠失は、２〜好適に１０個のアミノ酸、例えば、２〜８個のアミノ酸、例えば２〜６個のアミノ酸、例えば２〜４個のアミノ酸の付加もしくは欠失であって良い。しかし、１０を超えるアミノ酸、例えば２〜１０個のアミノ酸の付加も本発明内に含まれて成る。多量体形態において、付加／欠失は、多量体のそれぞれの単量体において個々に行われて良い。

本発明は、本明細書中で開示された化合物の非ペプチド変異体にも関連する。詳細には、かかる変異体は、繊維芽細胞増殖因子（FGF）レセプター及び／もしくはアデノシン三リン酸（ATP）及び／もしくはL１と結合するかあるいは相互作用し、そしてFGFレセプターを提示する細胞の、FGFレセプターシグナル伝達を刺激するそして／もしくは増殖を調節するそして／もしくは分化を誘導するそして／もしくは再生、ニューロンの可塑性及び／又は生存を刺激する化合物であると解されるべきである。

従って、本発明は、１以上のレセプターを結合することができる１以上の断片、又はその変異体、例えば、１以上の断片の任意の変異体及び機能的同等物を含んで成る化合物に関連すると解されるべきである。

置換によって獲得された機能的同等物は、もし機能的に類似するアミノ酸側鎖を含む残基が置換されているならば、相同性は低いが、おそらく、ある形態かあるいは程度の天然NCAM活性を示す。本発明に関連して、機能的な類似とは、側鎖の有力な特性を意味する。その特性とは、疎水性、塩基性、中性、もしくは酸性、又は立体的かさの存在もしくは不在である。従って、本発明の実施態様において、ｉ）効果を起こすことができる所定の機能的同等物とii）好適な所定の断片との間での同一性の程度は、本発明の好適な所定のペプチド断片の変異体又は機能的同等物としての重要な尺度ではない。

いくつか以上の相同性を、好適には３アミノ酸以上、一層好適には５アミノ酸以上の所定の断片と共有する断片は、それらが好適な所定のNCAMペプチド又はその断片と相同性が約２５%以上、例えば、相同性が約３０%以上、例えば相同性が約４０%以上、例えば相同性が約５０%以上、例えば相同性が約５５%以上、例えば約６０%以上、例えば相同性が約６５%以上、例えば相同性が約７０%以上、例えば相同性が約８０％以上、例えば相同性が約８５%以上である場合、本発明の範囲内にあるものとして考えられている。

配列の同一性は、配列解析ソフトウェア（例えば、the Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group、University of Wisconsin Biotechnology Center、１７１０ University Avenue、Madison、WI ５３７０５）を、それに指定されている初期パラメーターで使用することで測定されて良い。

詳細な説明及び請求項の全体に渡り、３文字コードかあるいは１文字コードのいずれかが天然アミノ酸に関して使用されている。LあるいはD形態かが明示されていない場合、そのアミノ酸は天然のL形態（Pure ＆ Appl.Chem.Vol.５６（５）pp.５９５〜６２４（１９８４）を参照のこと）又はD形態を有しているもとのと解され、従って形成されるペプチドはL形態、D形態、又はL形態とD形態が混合された配列からなりうる。

本発明のポリペプチドのC末端アミノ酸は、何も明示されていない場合、遊離カルボン酸として存在しているものと解され、このことは「−OH」としても明示されうる。しかし、本発明の化合物のC末端アミノ酸は、「−NH₂」として示されているアミド化された誘導体でありうる。記載が他にない場合、ポリペプチドのN末端アミノ酸は遊離アミノ基を含んで成り、これも「H−」として明示されて良い。アミノ酸は、明示されていない場合、天然に生じるかあるいはそうでないに関わらず、例えば、αアミノ酸、βアミノ酸、及び／又はγアミノ酸など、任意のアミノ酸から選択されて良い。従って、群は、限定されないが：Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Met、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Aib、Nal、Sar、Orn、リジン類似物のDAP及びDAPA、4Hypを含んで成る。

本発明の１つの観点において、前記化合物はNCAMの第１フィブロネクチンIII （F３，１）モジュール、もしくはその断片、もしくは変異体を含んで成る。

更に詳細には、本発明は、FGFレセプターと相互作用することができる、神経細胞接着分子（NCAM）の第１フィブロネクチンIII （F３，１）モジュール、もしくはその断片、もしくは変異体を含んで成る化合物に関連する。

従って、本発明の１つの好適な実施態様において、前記化合物は、
式L１−A−L２−B−L３−C−L４
（式中、
A、B、Cのうち1つが塩基性アミノ酸から選択されており、
A、B、Cのうち1つが疎水性アミノ酸から選択されており、
A、B、Cのうち1つがグリシンであり、そして
L１、L２、L３、L４は化学結合又はn個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列から選択されて良く、ここでnは０〜５の整数である）
のアミノ酸配列を含んで成る。

更なる実施態様において、Bはグリシンであり、Aは塩基性アミノ酸残基、及びCは疎水性アミノ酸残基である。

更に、他の実施態様において、Aはリジン（K）又はアルギニン（R）、及びCはロイシン（L）又はアラニン（A）である。

他の好適な実施態様において、本発明の化合物は、配列NGKGL（アスパラギン、グリシン、リジン、グリシン、ロイシン）、NGKGA、NGRGL及び／又はNGRGAを含んで成る。配列NGRGLは、例えばL１中で発見されておりそして配列NGKGLは、例えばNCAMのF３，１中で発見されている。

本発明は更に、F３，２がFGFレセプターのリガンドであり且つFGFレセプターを提示する細胞と相互作用することができることを開示する。従って、本発明の他の観点において、前記化合物は、NCAM分子の第２FnIII モジュールのFGループ、もしくはその断片、もしくはその変異体に対して相同的なペプチドを含んで成る。

NCAMのF３，２モジュールのFGループを含んで成る断片が特に好適である。しかし、本発明は、FGループを含んで成るF３，２モジュールの断片に限定されてはいない。FGループよりも少ない欠失を含んで成る機能的同等物を生じる断片も本発明内に含まれて成る。本発明の機能的に同等なペプチド及びその断片は、FGFレセプター及び／又はNCAMリガンド提示する細胞に対して結合することができるF３，２モジュールのFGループよりも少ないかあるいは多いアミノ酸残基を含んで成りうる。

F３，２ペプチドの全ての機能的同等物は、相同性の程度に関わらず本発明の範囲内であり、それらはF３，２ペプチド又はFGループの所定の配列を示す。この理由とは、その結合領域のいくつかの部分が、生じる断片の結合活性に対する任意の有意な効果を伴わずに、最も突然変異しやすいかあるいはペプチドを欠失しやすいからである。

かかるペプチド、断片又は変異体は、
式L１−A−L２−B−L３−C−L４−D−L５
（式中、
A、B、C、Dのうち1つが塩基性アミノ酸残基から選択されており、
A、B、C、Dのうち1つが疎水性アミノ酸残基から選択されており、
A、B、C、Dのうち1つが酸性アミノ酸残基から選択されており、
A、B、C、Dのうち1つがグリシンであり、そして
L１、L２、L３、L４及びL５は化学結合又はn個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列から選択されて良く、ここでnは０〜５の整数である）
のアミノ酸配列を含んで成る化合物であって良い。

詳細には、ペプチド、断片又は変異体は、
式A- B-L３-L４-C-L４
（式中、
Aは疎水性アミノ酸残基であり、
Bは酸性アミノ酸残基であり、
L３は１又は数個の親水性アミノ酸残基であり、
L４は上記L４について規定したようなアミノ酸配列であり、そして
Cはグリシンである）
のアミノ酸配列を含んで成る化合物であって良い。

好適な実施態様において、前記化合物は、式AENQ-L４-G
（式中、A、E、N、Q、及びGはアミノ酸残基の１文字表記であり、そしてL４は化学結合又はn個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列から選択されて良く、ここでnは０〜５の整数である）
のアミノ酸配列を含んで成る。

他の好適な実施態様において、本発明のペプチド、断片又は変異体は、NCAM分子のF３，２モジュールのFGループ、もしくはその断片、もしくはその変異体に対して相同的なペプチドを含んで成りうる。本発明の好適な実施態様において、前記のペプチドは、アミノ酸残基モチーフA−E−N−Q−X−X−K（式中、Xは任意のアミノ酸残基であって良い）を有する配列を含んで成る。Xは例えば、グルタミン（Q）、アラニン（A）、グリシン（G）及び／又はアスパラギン（N）から個々に選択されて良い。

詳細には、ペプチド、断片又は変異体は、
式A- L２-B-L３-L４-C-L４
（式中、
Aは疎水性アミノ酸残基であり、
L２は化学結合又はn個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列から選択されて良く、ここでnは０〜５の整数であり、
Bは塩基性アミノ酸残基であり、
L３は１又は数個の親水性アミノ酸残基であり、
L４は化学結合又はn個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列から選択されて良く、ここでnは０〜５の整数であり、そして
Cはグリシンである）
のアミノ酸配列を含んで成る化合物であって良い。

好適な実施態様において、前記化合物は、
式AM-B-L３-L４-G
（式中、A、M及びGはアミノ酸残基の１文字表記であり、L３は１又は数個の疎水性アミノ酸残基であり、そしてL４は化学結合又はn個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列から選択されて良く、ここでnは０〜５の整数である）
のアミノ酸配列を含んで成る。

例は配列：AMKEDGR（配列番号：７）であって良い。

本発明の更なる観点において、前記化合物は、アデノシン三リン酸（ATP）を結合することができる。理論に縛られることなく、シナプスからのATPの放出は、NCAMとFGFレセプターとの結合に影響を及ぼし、従って新たに形成されたシナプスが接触する領域での軸索生長を調節する、即ち、ATPが、シナプスの接触する領域での可塑性に間接的に影響を与えるものと考えられる。

1つのかかる実施態様において、前記化合物は、
式L１−A−L２−B−L３−C−L４−D−L５−E−L６
（式中、
L１、L２、L３、又はL４のうち少なくとも1つはアミノ酸残基Yを含んで成り、そして他の1つはアミノ酸残基Kを含んで成り、そしてL５及び／又はL６は個々にKであり、そしてA、B、C、D、E、は任意のアミノ酸であり、但しYとKとの間の距離は５アミノ酸以上、例えば７アミノ酸残基以上、例えば９アミノ酸残基以上、例えば１１アミノ酸残基以上である）
のアミノ酸配列を含んで成る。

アミノ酸Yは、アミノ酸KよりもN末端に対して非常に近接していることが好適である。

本発明の更なる実施態様において、前記化合物は、
式A-Xaa-B-C-C
（式中、
Aはチロシン（Y）、
Bはグリシン（G）、
Cはリジン （K）であり、そして
Xaaは任意のアミノ酸である）
の配列を含んで成る。

好適な実施態様において、本発明の化合物は、以下の配列を含んで成るペプチドを１種類以上含んで成る。

上に列挙した配列は、天然に生じるタンパク質、例えば、繊維芽細胞増殖因子２（FGF２）中で見出されるAMKEDGR（配列番号７）の配列を有するペプチドの一部であって良い。

本発明の１つの実施態様において、配列８６〜２０６は、F３，Ｉ及びF３，IIドメイン中のFGLペプチド（FGループペプチド）に対して相同的な配列である。

用語「相同物」とは、本発明のFGLペプチドと構造的及び／又は機能的に同一な配列であることを意味している。配列の同一性は、配列解析ソフトウェア（例えば、Genetics Computer Group、University of Wisconsin Biotechnology Center、１７１０ University Avenue 、Madison WI ５３７０５のSequence Analysis Software ）をそれに指定された初期パラメーターを用いることで測定できる。

本発明の１つの好適な実施態様において、前記化合物は、繊維芽細胞増殖因子（FGF）レセプターと相互作用することができる。様々なFGFレセプターが存在する。FGFレセプターは、FGFレセプターＩ、FGFレセプターII、FGFレセプターIII 、FGFレセプターIVからなる群から選択されうることが好適である。更に好適な実施態様において、FGFレセプターＩシグナル伝達が刺激されている。

本発明の好適な実施態様において、本発明の化合物とFGFレセプターとの相互作用は、FGFレセプターシグナル伝達の刺激をもたらしている。本発明の化合物がFGFレセプターと相互作用する場合、化学的事象のカスケード及び生理学的な変化が生じる。本発明の化合物とFGFレセプターとの反応により、推定上、レセプターの構造変化及びクラスター化が生じ、それによって相互作用する部分から細胞内部への化学的シグナルが生じそして増える。このシグナルは、細胞外部から細胞内部へと導入されるといわれており、後者は、細胞の生理的応答をもたらす。

本発明によれば、FGFレセプターシグナル伝達は、所定の濃度の化合物がFGFレセプターを提示している細胞に対して適用されている場合、FGFレセプターのリン酸化として測定されている。リン酸化の程度は、コントロールの値の少なくとも２０％超、例えば少なくとも２０％〜２００％、例えば少なくとも５０〜２００％である。

本発明の化合物を試験する場合、例えばシグナル伝達の測定をすることに関して、前記化合物の濃度は、０．１〜１０００μM、１〜１０００μM、例えば、１〜２００μM、例えば、１０〜２００μM、例えば、２０〜１８０μM、例えば、３０〜１６０μM、例えば、４０〜１４０μM、例えば、５０〜１３０μM、例えば、６０〜１２０μM、例えば、７０〜１１０μM、例えば、８０〜１００μMであって良い。

本発明の化合物のアミノ酸配列は、任意の適切な長さであって良く、その理由は、アミノ酸配列の長さは、ペプチドの機能及び化合物を医薬組成物へと処方することにより規定されるからである。従って、化合物は通常、３〜１００アミノ酸残基範囲のアミノ酸残基、例えば、１０〜９０アミノ酸残基、例えば、１５〜８５アミノ酸残基、例えば、２０〜８０アミノ酸残基、例えば、２５〜７５アミノ酸残基、例えば、３０〜７０アミノ酸残基、例えば、３５〜６５アミノ酸残基、例えば４０〜６０アミノ酸残基、例えば、４５〜５５アミノ酸残基を含んで成る。

他の観点において、本発明の化合物は、３〜２０アミノ酸残基の範囲のアミノ酸残基、例えば、３〜１９アミノ酸残基、例えば、３〜１８アミノ酸残基、例えば、３〜１７アミノ酸残基、例えば、３〜１６アミノ酸残基、例えば、３〜１５アミノ酸残基、例えば、３〜１４アミノ酸残基、例えば、３〜１３アミノ酸残基を含んで成る。

本発明のペプチドは、FGFレセプター及び／又はATPに対して結合することが期待されるペプチドリガンド中のモチーフを同定するための道具として働きうる。かかるペプチドリガンドは、ペプチド及び／もしくは非ペプチドライブラリーにより発見されて良い。FGFレセプター及び／もしくはATP及び／もしくはL１を結合することができる前記ペプチドを含んで成る任意のペプチド配列は、本発明の一部である。

記載のこれら化合物及び組成物は、FGFレセプター又はNCAMリガンドを発現する末梢及び／もしくは中枢神経系及び／もしくは筋及び他の組織に影響を及ぼす症状並びにFGFレセプター機能又は他のNCAMリガンドの機能を刺激することが有効である他の症状を治療するために使用することができる。

推定上の人工リガンドが、ペプチド又は非ペプチドライブラリーから選択及び同定されうる。任意のペプチド又は非ペプチドライブラリーも使用されて良い。合成ペプチド及び非ペプチドライブラリー並びに断片化した天然に生じるタンパク質を含むライブラリーが、有用なペプチドをサーチするために用いられて良い。非ペプチド化合物を含んで成る任意の種類の化合物が類似して使用されて良い。

アミノ酸の所定の配列を特徴とするペプチドは、タンパク質の所定の領域の変異体であって良い。天然に生じるアミノ酸は、L−アミノ酸からなる。しかし、人工ペプチドも、D−アミノ酸残基からなるかあるいは含んで成って良い。コンビナトリアルケミストリーによって、等しい長さのペプチドを担持するビーズの混合物が構築されて良く、ここで、各ビーズはユニーク配列のペプチドを担持する（Lamら、１９９１）。かかるビーズ上のペプチドの混合物は、ペプチドライブラリーとよばれている。

本発明において、ペプチド、断片又は変異体は、精製された組換えNCAMもしくは組換えFGFレセプターもしくは組換えL１もしくは他のNCAMリガンドを伴う樹脂結合ペプチドを含んで成る合成ランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって同定されて良い。前記樹脂結合１ビーズ１ペプチドライブラリーの合成は、部分的に、任意に当業者によって改変されたFurka、A、Sebestyyen、F、Asgedom、M及びDido、G（１９９１）、Int.J.Prep.Prot.Res.Vol３７.pp.４８９〜４９３の混合手段を用いて行われて良い。注目のペプチドを同定及び選択するための選定の方法は推定のモチーフの同定をするために重要ではないと解される。

有機小化合物のライブラリーは、繊維芽細胞増殖因子(FGF)レセプター及び／もしくはアデノシン三リン酸（ATP）及び／もしくはL１と相互作用することができる、FGFレセプターリガンドもしくはL１リガンドもしくは他のNCAMカウンターレセプターリガンドを同定するためにスクリーニングされて良い。かかるライブラリー又は他の構築体は、一般に公知であり、そして有用なリガンドのスクリーニングは、本明細書中で開示されているスクリーニングのための方法かあるいは当業者に明らかな方法に従いうる。

本発明の化合物は、好適に、単量体のオリゴマー（多量体）の形態にあり、ここで各単量体は上記の化合物のために規定されている。詳細には、デンドリマーなどの多量体ペプチドは、多重軟ペプチド単量体（multiple flexible peptide monomer）が存在することにより構造決定因子又はクラスターを形成しうる。１つの実施態様において、前記化合物は二量体である。好適な実施態様において、前記化合物はデンドリマー、例えば、リジン骨格に対して、又はBSAなどのタンパク質担体などポリマー担体に対して結合した４つのペプチドである。繰り返し配列又は様々な担体に対する接着などのポリマー化は当業界で周知であり、例えば、リジン骨格、例えば、４ペプチド、８ペプチド、１６ペプチド、又は３２ペプチドを担持するリジンデンドリマーが挙げられる。他の担体は脂肪親和性デンドリマー、もしくは、脂肪親和性誘導体によって形成されるミセル様担体、もしくは星型（星状）共役炭素鎖ポリマーであって良い。

前記化合物は、好適には、独立して、FGFレセプター及び／又はNCAMリガンド／カウンターレセプター及び／又はL１を提示する細胞のFGFレセプターシグナル伝達及び／もしくは増殖及び／もしくは分化、再生、生存及び／もしくはニューロンの可塑性の調節をすることができる単量体を含んで成る。

個々の単量体は、相同的、即ち、互いに同一であって良い、又は個々の単量体は、異種、即ち、互いに異なっていて良い。後者の種類の単量体は２種類以上の異なる単量体を含んで成りうる。一般に、二量体及び多量体は２以上の同一の単量体又は２以上の互いに異なる単量体を含んで成る。

医薬組成物
本発明は、神経細胞接着モジュール（NCAM）の第３免疫グロブリン（Ig３）モジュール、及び／もしくは第４免疫グロブリン（Ig４）モジュール、及び／もしくは第５免疫グロブリン（Ig５）モジュール、及び／もしくは第１フィブロネクチンIII （Fn３，１）モジュール、及び／もしくは第２フィブロネクチンIII （Fn３，２）モジュール、もしくはその断片、もしくはその変異体を含んで成る先に規定された１又は複数の化合物を含んで成る医薬組成物にも関連し、ここで当該化合物は繊維芽細胞増殖因子（FGF）レセプター及び／もしくはアデノシン三リン酸（ATP）及び／もしくはL１と相互作用することができる。

本発明の背景において、用語「医薬組成物」とは「医薬」と同義語で使用されている。

１つの実施態様において、医薬組成物は、NCAM F３，２モジュール、もしくはその断片、もしくはその変異体を含んで成る。他の実施態様において、前記組成物はNCAM F３，１モジュール、もしくはその断片、もしくはその変異体を含んで成る。

組成物は、好適に先に論じたような多量体又は二量体として処方されている。

本発明は更に、FGFレセプターを提示する細胞のFGFレセプターシグナル伝達を刺激すること及び／もしくは増殖を調節すること及び／もしくは分化を誘導すること及び／もしくは再生、ニューロンの可塑性及び／もしくは生存の誘導することができる医薬組成物に関連する。

1つの観点において、前記医薬組成物はin vitro又はin vivoで細胞の死を予防しうる。ここで前記組成物は、対象者に対して、１もしくは複数の先に記載した化合物又は下に記載の組成物を有効な量でin vitroもしくはin vivoにおいて、本明細書で論じられている数個の組織及び器官中のFGFレセプター提示細胞及び／又はL１提示細胞の死を防ぐように投与されている。

本発明の医薬は、有効な量の１もしくは複数の先に規定された化合物、又は先に規定された組成物を医薬的に許容できる添加剤との組み合わせにおいて含んで成る。かかる医薬は、経口、経皮、筋内、静脈内、頭蓋内、鞘内、脳室内、鼻腔内又は肺内投与のために適切であって良い。

本発明の化合物に基づく医薬及び組成物の製剤開発における戦略は、一般に、任意の他のタンパク質ベースの薬物生産のための処方戦略に対応する。潜在的な問題及びこれらの問題を解消するのに必要な指標は、「Therapeutic Peptide and Protein Formation. Processing and Delivery Systems」 A.K.Banga著、Technomic Publishing AG、Basel １９９５などのいくつかの文献中で取り扱われている。

注射用物質は、通常、液体溶液又は懸濁、注射する前に溶液中で懸濁せしめる又は溶かすのに適した固体形態のいずれかとして調製されて良い。製剤は乳化されていても良い。活性成分は、往々にして、医薬的に許容でき且つ当該活性成分と適合する賦形剤と混合されている。適切な賦形剤としては、例えば、水、塩類溶液、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、並びにそれらの組み合わせである。加えて、製剤は、所望されれば、少量の補助物質、例えば、湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝剤、又は当該製剤の効率もしくは輸送を増強する物質を含んで良い。

本発明の化合物の製剤は、当業者公知の技術によって調製できる。前記製剤は、医薬的に許容できる担体及び賦形剤の、例えば微小球、リポソーム、ミクロカプセル、ナノ粒子などを含みうる。

製剤は、任意に、活性成分がその効果を発揮する部位に、注射によって適切に投与されて良い。他の投与方法のために適切である更なる剤形としては、座薬、鼻腔、肺及びある場合には経口製剤が挙げられる。座薬について、伝統的な結合剤及び担体としては、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドが挙げられる。かかる座薬は、１又は複数の活性成分を、０．５％〜１０％、好適には、１〜２％の範囲で含有する混合物から生産されうる。経口製剤としては、通常用いられる賦形剤の、例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム（sodium saccharine）、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含む。これらの組成物は、溶液、懸濁、錠剤、ピル、カプセル、持続放出製剤又は粉末の形態をとり、そして一般に、１又は複数の活性成分を１０〜９５%、公的には２５〜７０%含む。

他の製剤は、鼻腔及び肺内投与に適切な吸入器及びエアロゾルなどである。

活性化合物は、中性又は塩形態として処方されて良い。医薬的に許容できる塩としては、酸付加塩（ペプチド化合物の遊離アミノ基を伴い形成されている）が挙げられ、そしてそれは無機酸の例えば、ヒアルロン酸もしくはリン酸など、又は有機酸の例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などで形成されている。遊離カルボキシル基を伴い形成される塩は、無機塩基の例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は水酸化第２鉄など、及び有機塩基のイソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどにも由来しうる。

製剤は、製剤用量（dosage formulation）と適合する方法、そして治療上有効であるだろう量で投与されている。投与される量は治療される対象者に依存し、例えば、対象者の体重及び年齢、治療される疾患及び疾患のステージに応じて投与される。適切な用量範囲は、kg体重あたり、通常は、数百μg活性成分／投与のオーダーであり、そして好適に、約０．１μg〜５０００μg／kg体重の範囲である。単量体形態の化合物を使用する場合、往々にして適切な用量は０．１μg〜５０００μg／kg体重の範囲、例えば、約０．１μg〜３０００μg／kg体重の範囲、そして特に約０．１μg〜１０００μg／kg体重の範囲である。多量体形態の化合物を用いる場合、適切な用量は、往々にして０．１μg〜１０００μg／kg体重の範囲、例えば、約０．１μg〜７５０μg／kg体重の範囲、そして特に約０．１μg〜５００μg／kg体重の範囲、例えば約０．１μg〜２５０μg／kg体重の範囲である。特に、鼻腔内に投与する場合、他の経路で使用される場合よりもより少ない用量が使用されている。用量は、投与経路にも基づいており、そして治療される患者の年齢及び体重により様々であるだろう。多量体形態の好適な用量は、１mg〜７０mg／７０kg体重の間隔であるだろう。

多くの徴候のために、局所化されたかあるいは実質上局所化された適用が好適である。

本発明のいくつかの化合物は、活性が十分であるが、他のいくつかについては、製剤が更に医薬的に許容できる添加剤及び／又は担体を含んで成るのならば、効果が増強されるだろう。かかる添加剤及び担体は当業者に公知であるだろう。いくつかの場合、活性物質のその標的へのデリバリーを促す化合物を含むことは有利であるだろう。

多くの場合、製剤を複数回投与することが必要であるだろう。投与は連続注入、例えばより多くの用量での脳室内注入又は投与、例えば、毎日、１日につきより多くの回数、毎週、１週につきより多くの回数などであって良い。医薬の投与は、個体が、細胞が死につながりうる１又は複数の因子に委ねられる直前又は直後に開始されることが好ましい。好適に、医薬は、因子攻撃の８時間以内、例えば、因子攻撃から５時間以内に投与されている。多くの化合物が長期間効果を示し、そのため化合物の投与は長い間隔、例えば１週又は２週で行われて良い。

神経ガイド（nerve guide）中での使用に関連して、投与は、１又は複数の活性化合物の調節放出に基づき連続的かあるいは少量ずつであって良い。更に、前駆体も、放出速度及／又は放出の部位を調節するために用いられて良い。他の種類の移植物並びに経口投与も類似して前駆体の持続放出及び／又は使用に基づきうる。

先に論じたように、本発明は、in vitoもしくは in vivoでFGFレセプター提示細胞もしくはL１提示細胞もしくは他のNCAMリガンド提示細胞の分化を誘導し、増殖を調節し、再生、ニューロンの可塑性及び生存を刺激するための個体の治療に関連し、この治療は先に規定した有効な量の１又は複数の化合物を投与することを伴う。

投与するための他の戦略は、前記化合物を発現及び分泌することができる細胞の移植もしくは注射をすることである。従って、前記化合物はそれが作用するであるだろう部位で生産されて良い。

治療
更なる観点において、本発明は、FGFレセプターを提示する細胞の増殖の調節及び／もしくは分化の誘導及び／もしくは再生、ニューロンの可塑性及び／もしくは生存の刺激において使用するための前記ペプチド、断片、又はその変異体に関連する。前記使用は、中枢神経及び末梢神経系、並びに筋肉又は様々な器官の疾患及び症状を予防する治療のためである。

本発明の化合物／組成物の使用による治療は、移植（implant）又は移植（transplant）された細胞の、分化を誘導すること、増殖を調節すること、再生、ニューロンの可塑性及び生存を刺激するための有用な１つの実施態様である。これは特に、長期効果を有する化合物を使用する場合に有用である。

更なる実施態様において、治療は、様々な因子により死の危険にある細胞の生存を刺激するためでありうる。その因子とは、例えば外傷及び傷害、急性疾患、慢性疾患及び／又は障害、詳細には、通常、細胞の死につながる変性疾患、他の外的因子、例えば、フリーラジカルの形成を生じうる医薬及び／もしくは外科治療及び／もしくは診断方法又は本来細胞傷害性の効果を有する、X線及び化学療法である。化学療法に関連して、本発明のNCAM結合化合物は、NCAMリガンドを提示する全てのガン細胞のガンの治療において有用である。

従って、前記治療は、疾患又は中枢及び末梢神経系の疾患又は症状に関連する細胞死の治療、及び／又は予防を含んで成り、その疾患又は症状とは、例えば、手術後の神経傷害、外傷性神経傷害、原因は例えば脊髄傷害、神経繊維の髄鞘形成傷害、虚血後傷害、原因は例えば動悸、多発脳梗塞性痴呆、多発性硬化症、糖尿病による神経変性、神経−筋変性、統合性失調症、アルツハイマー病、パーキンソン病、又はハンチントン病である。

そしてまた、筋−神経連絡の機能傷害を含む症状など筋肉の疾患又は症状、例えば、遺伝的又は外傷性萎筋縮障害に関連して；又は性腺、すい臓の変性症状、例えばＩ型及びII型の糖尿病、腎臓の変性症状、例えばネフローゼ、など様々な器官の疾患及び症状を治療するために、本発明の化合物は、分化を誘導すること、増殖を調節すること、再生、ニューロンの可塑性及び生存を刺激する、即ち、生存を刺激することのために使用されて良い。

更に、前記化合物及び／又は医薬組成物は、血管形成を誘導するために、心筋細胞の細胞死、例えば急性心筋梗塞後の心筋細胞の細胞死を予防するためであって良い。更に、１つの実施態様において、前記化合物及び／又は医薬組成物は、例えば、急性心筋梗塞後の心筋細胞の生存を刺激するためである。他の観点において、化合物及び／又は医薬組成物は、例えば傷害後の血管再開通術のためである。

創傷治癒を促進するための化合物及び／又は医薬組成物を使用することも本発明の範囲内である。本発明の化合物は血管形成を刺激することができ、従って、創傷治癒プロセスを促進する。

本発明は更に、ガンの治療における化合物及び／又は医薬組成物の使用を開示する。NCAMはガン細胞の運動性を調節し且つ広がるのを抑制する。

更なる実施態様において、前記化合物及び／又は医薬組成物の使用は、学習する能力並びに／又は短期及び／もしくは長期記憶を刺激するためである。

詳細には、本発明の化合物及び／又は医薬組成物は臨床症状の治療において使用されて良い。その症状とは、例えば、新生物、例えば悪性新生物、良性新生物、in situガン腫及び挙動が不確かな新生物、内分泌腺の疾患、例えば、糖尿病、精神病、例えば、老人性及び初老性の基質性精神病、アルコール精神病、薬物精神病、一過性臓器質症状、アルツハイマー病、脳類脂質沈着症、癲癇、進行麻痺[梅毒]、肝レンズ核変性症、ハンチントン舞踏病、クロイツフェルトヤコブ病、多発性硬化症、脳のピック病、梅毒、統合性失調症、感情精神病、神経性疾患、人格障害、例えば、性格神経症、器質脳症候群に関連する非精神病性障害、妄想性人格障害、狂信的人格、偏執性人格（障害）、偏執性の特徴、性的逸脱及び障害、知的障害、神経系及び感覚器の障害、認知異常、中枢神経系の炎症性疾患、例えば髄膜炎、脳炎、脳変性、例えば、アルツハイマー病、ピック病、脳の老年性変性、交通性水痘症、閉塞性水痘症、パーキンソン病、例えば他の錐体外路疾患及び運動異常障害、脊髄小脳疾患、小脳性運動失調症、Marie’s、Sanger−Brown、ミオクローヌス性小脳性共同運動障害、原発性小脳変性、例えば、脊髄筋萎縮症、家族性萎縮症、若年性萎縮症、成人脊髄筋萎縮症、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、運動ニューロン疾患、進行性球麻痺、進行性偽球麻痺、原発性側索硬化症、他の全角細胞疾患、全角細胞疾患、詳細不明な、他の脊髄の疾患、脊髄空洞症及び延髄空洞症、血管ミエロパシー、脊髄の急性梗塞（幹栓症）（非幹栓症）、脊髄の動脈血管症、脊髄の浮腫、亜急性壊死ミエロパシー、他の何処かに分類される脊髄の亜急性合併変性、ミエロパシー、薬物が誘導した脊髄炎、放射線が誘導した脊髄炎、自律神経系の障害、末梢自律、交感、副交感又は栄養系の障害、家族性自律神経失調症[Riley−Days症候群]、突発性末梢自律ニューロパシー、頸動脈洞性失神又は症候群、頸部交感神経ジストロフィー又は麻痺である。例えば、新生児の場合の、他のいずれかに分類される障害における末梢自律ニューロパシー、アミロイドーシス、末梢神経系の疾患、鰓器官業障害、頸肋症候群、肋骨鎖骨症候群、前斜角筋症候群、胸郭出口症候群、鰓器管神経炎又は神経根炎である。炎症性及び毒性ニューロパシー、例えば、急性感染性多発性神経炎、Guillain-Barre症候群、感染後多発性神経炎、膠原血管病における多発ニューロパシー、目の多重構造に影響を及ぼす障害、化膿性内眼球炎、耳及び乳様突起の疾患、慢性リュウマチ性心臓疾患、虚血性心臓病、不整脈、肺系における疾患、新生児の器官及び軟組織の異常、例えば、神経系における異常、麻酔及び他の鎮痛剤の投与の働き及びデリバリーにおける合併症、皮膚における疾患、例えば、感染症、不十分な循環の問題、傷害、例えば、外科手術後、衝撃傷害、火傷である。神経及び脊髄に対する傷害、例えば、神経の分裂、連続的な傷害（開放創有無の）、外傷性神経腫（開放創有無の）、外傷性一過性麻痺（開放創有無の）、医療手順中の偶発的穿刺又は裂傷、視神経及び経路に対する傷害、視神経傷害、第二脳神経傷害、視交差に対する傷害、視覚経路に対する傷害、視覚野に対する障害、原因不明の失明、１又は複数の脳神経に対する他の傷害、他の及び詳細が分からない神経に対する傷害。医薬物及び医学的及び生物学的な物質又による中毒、遺伝的又は外傷性筋萎縮障害；又は様々な器官の疾患又は症状、例えば、性腺、すい臓の変性症状、例えばＩ型及びII型糖尿病、腎臓の変性症状、例えば、ネフローゼを治療するためである。

本発明の更なる観点は、有効な量の本発明の１又は複数の本発明の化合物、又は本発明の医薬組成物を１又は複数の医薬的に許容できる添加剤もしくは担体と混合することを含んで成る医薬組成物を生産する方法、並びに有効な量の前記化合物、又は医薬組成物を象者に対して投与する方法である。

先に論じた方法の１つの実施態様において、前記化合物は、補綴装置との組み合わせにおいて使用されている。ここで、前記装置は補綴神経ガイド（prosthetic nerve guide）である。従って、更なる観点において、本発明は、先に規定した１もしくは複数の化合物もしくは医薬組成物を含んで成ることを特徴とする補綴神経ガイドに関連する。神経ガイドは当業者に公知である。

本発明の化合物は先に規定した化合物の使用に関連する。詳細には、本発明の化合物の使用は、医薬組成物を生産するためである。医薬組成物は、先に規定した全疾患及び症状を治療又は予防するために好適である。

更なる観点において、本発明は、本明細書中で規定した化合物を投与することによって先に論じた疾患又は症状を治療する方法に関連する。

実施例
以下は本発明を説明する例であり限定するものではない。

材料と方法
材料
ラットNCAMの６１２〜７０５番目のアミノ酸に対応する¹⁵Nで標識したタンパク質と標識していないタンパク質（swissport p１３５９６）を酵母P.パストリス（P.pastoris）中で生産した。この発現産物はベクターに由来する２つのN−末端残基、A及びGを含み且つ順番に１〜９６の番号付けがされている。２mMの非標識タンパク質と１mMの¹⁵N標識したタンパク質（３０mMのNaCl、１０mMのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐH７．２７中）を用いた。¹Hと¹⁵N共鳴をDQF−COSY、TOCSY、¹⁵N TOCSY−HSQC NMR実験のスペクトルから与えた。全データを２９８Kで得た。NOE制限は、８０／２００msNOESY及び１２５ms¹⁵N NOESY−HSQCスペクトル、上限が２．７、３．３及び６．０Å（もし制限がメチル基を含めば０．５Åずつ上昇する）に由来した。境界−１２０±４０°及び−５７±４０°（³J_HNHαカップリング制限に由来する）の４０φ角度制限及び４χ¹角度（バリンについて）を適用した。９６種類の構造をX−PLORプログラムを使用して距離幾何学法／シュミレーションアニーリングプロトコルにより生じさせた。水素結合エネルギーを調査した後、８０個の水素結合制限に、NH−O及びN−O距離についてそれぞれ２Å及び３Åの上限を適用した。全構造が０．３Å未満のNOE妨害、及び結合長及び角度についてそれぞれ０．０１Å及び２°の理想化幾何学からのRms偏差を有した。

HEK２９３細胞培養及びトランスフェクション
細胞をDMEM１９６５（１０％FCS、１０U／mlペニシリン、１００μg／mlストレプトマイシン及び５８．４g／l Glutamaxを伴う）中で増殖せしめた。約０．８×１０⁶個の細胞を６０mmプレート中に塗布して、製造説明書に従いLipofect AMIN PLUS（登録商標）試薬キット（Gibco BRL）を用いて、his標識した（C末端ヘキサヒスチジン）バージョンFGFR−１をコードするPcDNA３．１（＋）プラスミド０．２μgをトランスフェクションする前に２４時間に渡り培養した。細胞を更に２４時間に渡り完全培地中で増殖せしめ、そして飢餓培地（０．５％FCSを伴うDMEM１９６５）へと一晩移した。

刺激、精製及びウェスタンブロット解析
組換えfIII ．２又はFG−ループに由来する５０μg／mlのNCAMと共に２０分に渡りインキュベートしたかあるいは刺激しなかったFGFR−１トランスフェクト細胞を１mMのオルトバナジン酸塩を伴うPBS中、８Mの尿素中で溶解せしめた。FGFR−１を総溶解物からHis−標識部分を介してIMACカラム上で精製した。当量の溶解物をNi²⁺／NTAセファロース（Qiagen）上に置き、１０mMのイミダゾールを伴う溶解緩衝液中で洗浄し、そしてhis標識したFGFR−１を２５０mMのイミダゾールを伴う溶解緩衝液中で溶出せしめた。試料にSDS−PAGE試料緩衝液を加え、そして抗−pentahis ab（＃３４６６０ Quiagen）又は抗−phosphotyrosine ab（PY２０）（＃１１１２０ Transduction Laboratories）を用いて解析した。バンドを化学発光によって視覚化して密度を１６bitのカメラを伴うSynGeneのGeneGnomeを使用して測定した。

ニューロンを２４時間に渡りPermanox plastic（Nunc、Denmark）上で、２０mMのHepes、１００U／mlペニシリン、１００μg／mlストレプトマイシン、０．４%のBSAを含有し、B２７を補足したNeurobasal培地（Gibco BRL、USA）中、３７℃、５％CO₂にて密度６２５０細胞／cm²で増殖せしめた。２４時間後、細胞をパラホルムアルデヒドで固定化し、Coomassie Brilliant Blue R２５０で染色して解析した。

NCAMの第２F３モジュールの構造及び機能的特性並びにFGFレセプターとの可能な相互作用を調べるために、NCAMの第２F３モジュールの組換えタンパク質及びFGFレセプターの第２及び第３IgモジュールをP.パストリスの酵母発現系において生産した。P.パストリスは高等真核生物に類似してタンパク質の折りたたみ及びプロセッシングをすることができ、そして培地中へと分泌されたタンパク質を容易に精製できるので、この発現系を選択した。

実施例１
NCAMの第２F３モジュールの構造
モジュールの三次構造は１４３４の実験的に決定した制限（１５の制限／残基）、即ち、１３２２の構造的に有意な核オーバーハウザー 増強（NOE）距離制限（プログラムDIANAによって決定した）、４４の二面角制限（４０φ及び４χ₁）、及び６８の水素結合制限に由来した。骨格原子に関する重ね書きした３０の構造のオーバーレイを図１aに示している。重ね書きした３０の構造の平均からの大域平方根（grobal root）平均二乗（rms）偏差（rmsd）は、骨格原子について０．２５Åでありそして重原子について０．６８Åである。この構造の７つのβストランドを示すリボン表示を図１bに示している。NOE統計値、エネルギー用語及び理想的な幾何学からの偏差を表１に示している。

この構造は２つのβシートのサンドイッチにて配置された７つの逆平行βストランドからなり、あるのもは３つのストランドを含み（ABE）そして他のものは４つのストランドを含む（GFCD）。両方のβシートは右回りにねじれている。三重ストランドβシートは残基Lys７〜Gly１３（A）、Ser１８〜Ile２４（B）、His５９〜Lys６３（E）からなり、そして４つのストランド状βシートは残基Ile３３〜Ala４２（C）、Ile５１、Arg５２（D）、Glu７０〜Asn７９（F）及びGly８２〜Arg９２（G）からなる。二次構造の成分の同定をプログラムPROCHECK及びMOLMOLを使用して行った。残基Lys８５、Ala８６及びVal７６（G及びF βストランド）、並びに残基Ala７７及びHis３５、Tyr３６（F及びC βストランド）を伴う２つの大きい種類のβ隆起（Chanら１９９３）がある。２つのβ−隆起が、４つのストランド状βシートの右回りねじれ構造に寄与している。A及びBストランドによって形成されたβヘアピン、並びにG及びFβストランドによって形成されたβヘアピンは良く規定されている。AストランドとBストランド間のβヘアピンは４：６型のIターン、平均ψ、Ψ値がGlu１４（i＋１残基）に関して−６４±１°、１２±２°、及びASP１５（i＋２残基）に関して−８０±１°、２４±２°に対応し、一方で、GストランドとFストランド間のβヘアピンはタイトな２：２型のＩターン、平均ψ、Ψ値がGln８０（i＋１残基）について−３８±３°、−４２±４°、そしてGln８１（i＋２残基）について−１０７±１３°、２８±３０°に対応する（Sibabdaら、１９８９；Wimot及びThornton、１９９０）。D−EとE−Fストランド間のループは見掛け上、歪んだII型ターン、平均ψ、Ψ値がi＋１残基について−７０±８°、９３±１７°（Ser５５、D−Eループ）、−７３±２０°、１５４±３°（Trp６７、E−Fループ）、並びに平均ψ、Ψ値がi＋２残基について１０９±９°、５７±８°（Gly５６、D−Eループ）、４６±３°、４８±２°（Asn６８、E−Fループ）のようである。２つのβ−シートで囲まれている疎水性中心は、残基Leu８、Met１２、Ile１９、Val２１、Leu２３、Ile３３、Tyr３６、Val３８、Tyr４０、Ala４２、Ile５１、Leu５３、Val６０、Leu６２、Leu６５、Tyr７１、Val７３、Val７５、Ala７７、Ala８７、Phe８９、Phe９１及びThr９３からなる。注目すべきことに、２つのトリプトファン、Trp４７とTrp６７は、C−Dループ及びE−Ｆループ中にそれぞれ局在している。そしてTyr７４（Fストランド）は、モジュールの表層上に露出しており、そしてそれらは疎水性中心の一部ではない。

全３０の構造は、通常適用される許容基準に一致する。即ち、NOE制限について０．５Åを超えそして二面角制限について５°を超える妨害はなく、結合長及び結合角度についての理想的幾何学からの平方根平均二乗偏差は、それぞれ０．０１Å及び２°に満たなかった。各構造の質をプログラムWHAT IFを使用して評価した。３０の構造一式に関する平均Zスコアは：第２全体詰め込み特性（generation packing quality）について−１．４２±０．１７、ラマチャンドランプロットに関して−１．９４±０．２７、χ₁／χ₂プロットについて−１．５３±０．３４、及び骨格構造に関して−２．１０±０．２０であった。３０の構造の質を更にプログラムPROCHECKを使用して解析した。解析した全ての主鎖及び側鎖パラメーターは、２．０Åの解像度のX線構造と比較した場合、通常の範囲内であることが発見された。ラマチャンドランプロットの最も好ましい領域における残基の数は、７５．３％であった。NOE妨害をプログラムAQUAを使用して分析した。最大NOE妨害は０．２５Åであり、そしてrmsNOE妨害は、０．０１８９±０．０００６７Åであった。

実施例２
NCAMの第２F３モジュールはFGFレセプター及びATPに対して結合する
モジュールの指定のNMRスペクトルの配置及びその既知の三次構造を考えると、モジュールの表層上で結合部位を形成する残基を配置することが可能である。¹⁵N標識したタンパク質の¹⁵N−HSQCスペクトルにおいて、ペプチド窒素及びプロトンの両方伴う各アミノ酸に関するシグナルが確認できる。このシグナルの化学シフトの変化は、他の分子が結合することによって摂動するタンパク質中の残基を同定する方法を供する。NCAMの第２F３モジュールの¹⁵N標識した０．０５mMの試料に対して、FGFレセプターの１mMの非標識第２もしくは第３Igモジュール、又は５mMのAMP−PCP（ATPの非加水分解型類似物）を添加した。化学シフトの有意な変化は、FGFレセプターの第２Igモジュールの存在下では確認されなかった（データを示していない）。FGFレセプターの第３lgモジュール又はATPの存在下で確認された化学シフトの変化を図２a〜dに示している。FGFレセプターの第３Igモジュールの存在下での¹H及び¹⁵N化学シフトを、モジュールの構造上で、摂動¹H及び¹⁵N化学シフトに関するカットオフ値０．００６p.p.m及び０．０３をそれぞれ使用してマッピングした。

FGFレセプターの第３Igモジュールにより有意な摂動を経験したF３モジュールの残基は、Tyr３６、Leu３７、Val３８、Tyr４０、Leu５３、Tyr７１、Tyr７４、Val７５、Val７６、Ala７７、Asn７９、Gln８１、Gly８２、Lys８３、Ser８４、Lys８５、Ala８７、His８８、Phe８９、Val９０（図２a、b）であった。これらの残基の化学シフトの変化は、NCAMの第２F３モジュールに接近するFGFレセプターの第３Igモジュールの存在が、F３モジュールの摂動残基における化学環境を変化せしめることを示す。摂動した残基は、モジュール表層上の十分に規定され且つ密着した区域に局在しており、このことは、摂動残基が、NCAMの第２F３分子とFGFレセプターの第３lgモジュールとの間での相互作用のための結合部位の一部かあるいは近傍にあるかのいずれかを示す（図２E）。摂動残基の表層領域は、約２６００Ųであり、これは、一般に生物特異的反応のために必要であると考えられる１０００Ųの最小領域よりも有意に大きい。しかし、結合部位の表層領域はより小いようである。何故なら、おそらくいくつかの摂動残基が前記部位に極めて近接して位置するからである。

AMP−PCPによって摂動せしめられるF３モジュールの残基は、Tyr７４及びVal７５である（Fig２c〜d）。Tyr７４の側鎖はモジュールの表層上に露出しており且つモジュールのATP結合コンセンサス配列：Ala７７−Glu−Asn−Gln−Gln−Gly−Lys−Ser８４及びLys８５の極めて近傍に位置している（図２f）。Lys８３及びLys８５は両方ともモジュールの表層に露出しており、そして正に荷電したLys８３とLys８５の側鎖は、負に荷電したATPの三リン酸塩部分と相互作用することが可能である。その一方で、Tyr７４の側鎖は、ATPのアデノシン部分との疎水性相互作用に関わる。ATPと第２F３モジュールの複合体の可能な配置を図２gに描いている。ATPによって摂動せしめられた残基（Try７４とVal７５）はFGFレセプターの第３Igモジュールによっても摂動せしめられ、これはATP結合部位とFGFレセプター結合部位が重複していることを示す。

実施例３
FGFレセプターは、NCAMの第２F３モジュールによって、そしてFGLペプチドによって活性化される
上記NMR実験によりNCAMの第２F３モジュールがFGFレセプターに対して結合することが裏付けられたので、この結合が生細胞中でFGFレセプター活性化を誘導できるかどうかを試験することに注目した。従って、HEK２９３細胞を２４時間に渡りプラスチックプレート上で増殖せしめ、そして続いてFGFレセプター１のHis標識したバージョンでトランスフェクションして更に２４時間に渡り培養した。細胞を以下に記載の化合物と２０分に渡りインキュベーションした後、細胞を８Mの尿素中でリンスしてFGFレセプターをhis標識した部分を介して総溶解物から精製した。次いで、精製したFGFレセプター１を、his標識かあるいはホスホチロシンのいずれかに対する抗体を使用する免疫ブロットによって解析した。FGFレセプターの活性化をFGFレセプターリン酸化の量によって見積もった。

図３から、５μMのNCAMの第２F３モジュールの添加によりFGFレセプターのリン酸化が見掛け上コントロールの細胞に比較して約１５０％上昇した。FGFレセプターの第３Igモジュールによって摂動せしめられた、NCAMの第２F３モジュールの残基の大部分は、NCAMモジュールのF、Gβストランド及びFGターン領域中に位置している。従って、我々は、これらの残基に橋がけ（spanning）をする合成ペプチドが、第２F３モジュールと異なりうるかどうかを、そのFGFレセプターを活性する能力において試験した。確かに、残基Glu７２〜Ala８６（FGループペプチドと命名されている）に対応するペプチドの、濃度２５μMでの添加も、リン酸化を約１００％に増やし、FGFレセプターを活性化した。従って、第２F３モジュールのこれらの残基がFGFレセプターに対する結合に関連しているという考えが支持される（図３）。従って、本発明のデータは、NCAMの第２F３モジュールのFGFレセプターに対する結合は後者の活性化をもたらすことを示す。

実施例４
NCAMの第２F３モジュールによるFGFレセプターの活性化が神経突起生長を刺激する
NCAMの第２F３モジュール及びそのFGFレセプター結合部分（FGループペプチド）がFGFレセプターを活性化するので、F３モジュール及びFGループペプチドでNCAM刺激の特徴的機能、即ち、神経突起生成に反映されるようなニューロンの分化、を真似ることができると予測されうる。この予測を試験するために、胎児ラット海馬から分離させたニューロンをプラスチック上に播いて以下に記載の化合物の存在下で２４時間に渡り増殖せしめた。この後、細胞をパラホルムアルデヒドで固定化し、Coomasie Brilliant Blue R２５０で染色して、神経突起の長さを立体学的方法（Ronnら、２０００）で測定した。

位相差顕微鏡写真（図４a、b）から分かるように、５μMの濃度でのNCAMの第２F３モジュールの添加により、細胞あたりの神経突起の長さがコントロールの、刺激していない神経突起に比較して上昇した。この効果を用量反応試験（図４c）で定量化し、F３モジュール、FGループペプチド及び当該ペプチドのトランケーショントランケーションバージョン（Ala７７〜Lys８３）は全て神経突起生長を誘導し、そして神経突起生成を誘導した増殖因子に典型的なベル型用量反応曲線（Hattenら、１９８８）を示す。ペプチドの潜在能力は、最大効果のためには１０倍高い濃度が必要であることに反映されるように、モジュールのそれよりも低く、そしてトランケーション形態は拡張形態よりも効果が低かった。第２F３モジュール及びFGループペプチドの刺激効果は、NCAM刺激した神経突起の生長の阻害物質、及びFGFレセプターに対する抗体によって消されうる。コントロール条件下での抗体の前記効果及び第２F３モジュール又はFGループによって誘導された神経突起の生長に対する効果を図４dに示している。後者の場合に、完全阻害が達成され、更に、モジュール及びFGループペプチドがFGFレセプターと相互作用するという考えが支持される。

FGループペプチドの機能的に重要なアミノ酸を特定するために、ペプチドを、トランケーション及び様々なアミノ酸の置換することによって解析した。FGループペプチドのトランケーション（N及びC末端から）したバージョンを２つ、即ち、９量体Val７６〜Ser８４及び７量体Ala７７〜Lys８３を生産した。トランケーションしたペプチドは、FGループベプチドよりも実質上に短いが、それらは両方とも全体FGループペプチドに比べて約５０%の刺激効果を維持しており（図５a）、これは、Fβストランド及びGβストランド間のターン領域（Gln８０、Gln８１）並びに当該ターンの両側に近接する僅かなアミノ酸が、FGFレセプターとNCAMの第２F３レセプターとの間での相互作用のために重要であることを示している。続いて７量体ペプチドをいわゆるAlaスキャンによって解析した。ここで各連続するアミノ酸をアラニンで置換した１組のペプチドを試験した。図５aから分かるように、ペプチド中の任意のアミノ酸の置換は神経突起生成の潜在力を低下させることにつながり、そして機能の完全なロスは、もしGlu７８、Asn７９、Gln８０、Gly８２、Lys８３をAlaで置換した場合に達成され、これはこれらの残基がFGFレセプターとの相互作用のためには重要であることを示している。FGループペプチド全体において、FGループのターン領域（Gln８０、Gln８１）に由来する２つのアミノ酸のアラニンへの２重置換も、ペプチドの完全不活性化をもたらした（図５a）。これらの発見は、第２F３モジュール中のAsn７９、Gln８１、Gly８２及びLys８３が、FGFレセプターの第３モジュールに対して結合することによって摂動せしめられることによって裏付けられる。しかし、見掛け上ATPとの相互作用のために重要である残基（Tyr７４、Lys８３及びLys８５）をFGループペプチド中、アラニンに置換した場合、このペプチドは非突然変異ペプチドに比較して約６０%の刺激効果を維持していた（図５a）。F３モジュールにおける７量体ペプチドの構造をFGFレセプター天然リガンド、塩基性FGF（PDBコード：４FGF、Erikssonら、１９９３）の公知の３次構造と比較して、当該ペプチドは、塩基性FGF中のループ領域、Ala４２〜Arg４８に類似する構造と配列を有していたことを発見した。両方のペプチドの配列及び構造配置を図６a中に示している。塩基性FGFに由来する７量体ペプチド及びAla置換を伴う一連のペプチドを、それらの神経突起生長を誘導する能力について試験し、そして図５bから分かるように、塩基性FGFに由来するペプチドはNCAMの第２F３モジュールに由来する７つのアミノ酸に類似して、神経突起生長をある程度誘導した。任意のアミノ酸のアラニンへの置換は、機能の完全なロスをもたらした。

ATPは、NCAMの第２F３モジュールによるFGFレセプターの活性化を阻害した（図３）ので、ATPも当該モジュールの神経突起生成活性を阻害することができると予測した。この予測を試験するために、ニューロンを、ATPかあるいはATPの加水分解不可能型類似物、AMP−PCPの存在下（０、０．４又は１mMの濃度で添加した）、以下に記載の化合物で刺激した。図７から分かるように、ATPとAMP−PCPはどちらも、第２F３モジュール及びFGループによって誘導される神経突起生成効果を実質的に減少させたが、これらの化合物を単独で添加した場合、それらは任意の効果をもたなかった。AMP−PCPの場合、F３モジュールとFGループペプチド両方の効果の完全阻害を達成し、そしてATPの場合、完全阻害はFGループの効果のみで達成した。このことは、ATPはその加水分解不可能型類似物AMP−PCPよりも有力な阻害物質ではないことを示している。最も有意には、ATPを結合するために重要であることが予測されるFGループのアミノ酸残基（Tyr７４、Lys８３及びLys８５）をアラニンで置換した場合、ペプチドはその神経突起生成潜在力を維持していた。しかし、ペプチドの刺激効果はATPによっては阻害されることはなく（図７）、これは、ATPの結合が、F３モジュールとFGFレセプターとの相互作用を調節するという考えを支持している。

ニューロン中でのNCAMの第２F３モジュールによるFGFレセプターの活性化は、神経突起生成を誘導しそしてこの効果はATPによって阻害できうることをこれらの結果が示す。

本発明の化合物を試験するための生存アッセイ
７日齢ラットに由来する小脳顆粒ニューロン（GCN）を高濃度（４０mM）のカリウムの存在下で７〜８日に渡り増殖せしめた。細胞を、低濃度（５mM）のカリウムを含有する血清を伴わない培養培地（基本Eagle培地BME）で２度洗浄して、FGLペプチドを補足した血清を伴わない培地中で２日に渡り増殖せしめた。培養物を、MTSの減少率を測定することによって、細胞生存率（D‘Melloら、１９９７；Villalbaら、１９９７；Skaperら、１９９８）についてアッセイした。MTSは新規のテトラゾリウム化合物（Promega、USA）であり、それは細胞により、組織培養培地中に可溶性であるフォルマザンへと生物還元される。フォルマザンの４９０nmでの吸光度を、９６ウェルアッセイプレートから直接、更なる方法を伴わずに測定する。MTSの水溶性フォルマザンへの転換は、代謝活性のある細胞中で発見されるデヒドロゲナーゼ酵素によって達成される。フォルマザン生産物の量は、４９０nmの量での吸光度によって測定した場合、培養物中で生存する細胞の数に直接比例する（Yao及びCooperら、１９９５）。

細胞の数を決定して、高濃度のカリウムの存在下で生存する細胞の量を１００％で設定した。図８により大まかに分かるように、脳に由来する神経栄養性因子又は塩基性繊維芽細胞増殖因子の存在下では、６０％のみが生存した。FGLを２〜２５０μg／mlのソード（sode）範囲で添加した場合、統計的に有意な生存率が、用量２５０μg／mlでのFGLペプチド単量体形態のポジティブコントロールの最大９０％で確認された。

実施例６
FGループ断片及び変異体
天然細胞接着分子L１及びNCAMのFGループに由来するペプチド（L１の第３F３モジュール及びNCAMの第１F３モジュール）を様々な長さで調製した（図９aを参照のこと）。そしてそれらの一次海馬ニューロンから神経突起が生長することに対する効果を、２５μMの濃度で様々なペプチドを添加することで試験した（図９b）。NCAMペプチドをFN３，１に言及し且つL１ペプチドをL１に言及した。図９aで示した変異を各ペプチド中のアミノ酸の数で示している。図から分かるように、ペプチドは神経突起生長に対する刺激効果を有しており、NCAMの第１フィブロネクチンIII 型モジュールのFgループの９個のアミノ酸の変異のために、そしてL１の第３フィブロネクチンIII 型モジュールのFgループの９個のアミノ酸の変異のために統計的有意に到する。

¹H、¹⁵N NMR分光法によって決定したNCAM F３，２の構造を示す。NCAMの第２F３モジュールの構造、ａ）は、上書きした３０の構造の骨格原子のオーバーレイの立体図、b）は、当該構造のリボン表示である。この構造は、２つのβシートのサンドイッチで配置された７つの逆平行βストランドからなり、あるのもは３つのストランドを含み（ABE）そして他のものは４つのストランドを含む（GFCD）。 NCAMの第２F３モジュールとFGFレセプターの第３Igモジュール又はATPとの相互作用の証明である。ａ〜d）１mMのFGFレセプターの第３Igモジュールの非標識試料（a、b）又は５mMのAMP−PCP（c、d）を添加した後の、NCAMの第２F３モジュールの０．０５mMの¹⁵N標識した試料の¹H及び¹⁵N原子の化学シフトの変化である。E）モジュールの構造上での、¹Hに関して０．００６ppm超又は¹⁵Nに対して０．０３ppm超の化学シフトの変化を（FGFレセプターの第３Igモジュールの存在下で）伴うNCAMの第２F３モジュールの残基のマッピングである。化学シフトの強い変化を伴う残基（¹Hに関して０．０１ppm超又は¹⁵N原子に対して０．１ppm超の化学シフトの変化）を青（Aで示す）、そして弱い変化を赤（Bで示す）で色づけ；そして他の全残基を黄（Cで示す）で着色した。F）AMP−PCPの残基によって摂動せしめられる第２F３モジュールの残基（青色−Cで示す）及びATP結合ワーカーモチーフA（赤色−Aで示す）の残基及びLys８５（緑色−Bで示す）のモジュールの構造に対するマッピングであり；他の全ての残基を黄色に着色した（Dで示す）。G）NCAMの第２F３モジュールとATPの複合体の可能な配列である。 第２F３モジュール、そのFGFレセプター結合部（FGループペプチド）のFGFレセプター１のリン酸化に対する効果である。FGFレセプター１のHis標識したバーションを一過的にトランスフェクションされたHEK２９３細胞を２０分に渡り、５μg／mlのF３，２モジュール又は５０μg／mlのFGループペプチドのいずれかで刺激した。A）FGFレセプター１の総数及びFGFレセプターリン酸化の量を、抗−pentahis（抗−His）及び抗ホスホチロシン（抗−P−tyr）抗体をそれぞれを使用する免疫ブロッティングによって見積もった。B）バンド強度の密度分析によるFGFレセプターリン酸化の定量化である。リン酸化を、１．０に正規化したコントロール（未処理の細胞）に対して見積もった。エラーバーはある標準偏差（SD）を示す。処理した細胞とコントロールとを比較する対応のあるt検定によりP＜０．０５である。前記t検定を６つの独立する非正規化データのセット対して行った。 第２F３モジュール及びそのFGFレセプター結合部位（FGループペプチド）の、海馬ニューロンからの神経突起生長に対する効果である。ａ）コントロール（未処理）のニューロンの顕微鏡写真である。ｂ）５μMの第２F３モジュールで処理したニューロンの顕微鏡写真である。ｃ）第２F３モジュール、FG−ループペプチド及びペプチドのトランケーションバージョンの濃度に対する神経突起長のプロットである。ｄ）抗FGFレセプター抗体の、５μMの第２F３モジュール又は５０μMのFGループペプチドによって誘導される神経突起生長に対する効果である。 FGループペプチド及び塩基性FGFに由来するペプチドを様々に修飾することが、海馬ニューロンから神経突起を生長せしめるそれらのペプチドの潜在能力に及ぼす効果である。様々なペプチドの濃度は５０μMであった。ａ）FGループペプチド又は当該ペプチドのトランケーションバージョンにおける様々なアミノ酸のAlaでの置換及びトランケーションの効果。ｂ）塩基性FGFに由来するペプチドにおいて様々なアミノ酸をAlaで置換する効果。 NCAMのFGFレセプター結合部に由来する７量体ペプチドと塩基性FGFとの配列及び構造的類似性。A）７量体の系列配置であり、ここで記号「｜」、

、「：」及び「・」は高い類似性〜低い類似性での類似性のレベルを示す。B）NCAM（青色―図Aで示す）及び塩基性FGF（赤色−Bで示す）に由来する７量体の骨格原子の構造的配置を示す。
ATP（a）及びAMP−PCP（b）の、第２F３モジュール、FGループペプチド及び当該ペプチドの修飾バージョンの、海馬ニューロンから神経突起生長を刺激する潜在能力に対する効果である。ニューロンを５μMの第２F３モジュールかあるいは５０μMのペプチドのいずれかにより、様々な濃度のATP又はAMP−PCPの存在下（０、０．４、１．０mM）で刺激した。「cnt」はコントロールを、「F３」は第２F３モジュールを、「FGL」はFGループペプチドを示し、そして「YKK」はTyr７４、Lys８３及びLys８５がAlaに置換されているFGLペプチドを示す。 ７日齢ラットに由来する小脳顆粒神経細胞（GCN）を４０mMのカリウムの存在下で７日に渡り増殖せしめた。細胞を、５mMの濃度のカリウムのみを含有する血清を伴わない培養培地に移して、様々な濃度でFGLペプチドを補足した血清を伴わない培地中で２日に渡り増殖せしめた（図８を参照のこと）。その後、細胞の数を特定して、高濃度のカリウムの存在下で生存する細胞の量を１００％に設定した。大まかに分かるように、脳に由来する神経栄養性因子又は塩基性繊維芽細胞増殖因子の存在下では、６０％のみが生存した。FGLを２〜２５０μg／mlのソード範囲で添加した場合、統計的に有意な生存率が、用量２５０μg／mlのFGLペプチドの単量体形態のポジティブコントロールの最大９０％にて確認された。 神経細胞接着分子L１及びNCAMに由来するペプチド（L１の第３F３モジュール及びNCAMの第１F３モジュール）を様々な長さで調製した（図９aを参照のこと）。そしてそれらの一次海馬ニューロンから神経突起が生長することに対する効果を、２５μMの濃度で様々なペプチドを添加することで試験した（図９b）。 NCAMペプチドをFN３，１に言及し且つL１ペプチドをL１に言及した。図９で示した変異を各ペプチド中のアミノ酸の数で示している。図から分かるように、前記ペプチドは神経突起生長に対する刺激効果を有しており、NCAMの第１フィブロネクチンIII 型モジュールのFgループの９個のアミノ酸の変異のために、そしてL１の第３フィブロネクチンIII 型モジュールのFgループの９個のアミノ酸の変異のために統計的有意に到する。

配列表

Claims (29)

1. 以下の：
   ＥＶＹＶＶＡＥＮＱＱＧＫＳＫＡ （配列番号１）、
   ＥＶＡＶＶＡＥＮＱＱＧＡＳＡＡ （配列番号２）、
   ＶＡＥＮＱＱＧＫＳ （配列番号３）、
   ＡＥＮＱＱＧＫ （配列番号５）、
   ＡＥＮＱＡＧＫ （配列番号６）、
   ＡＭＫＥＤＧＲ （配列番号７）、
   ＡＬＮＧＫＧＬＧ （配列番号８）、
   ＡＦＮＧＲＧＬＧ （配列番号９）、
   ＱＡＦＮＧＲＧＬＧＰ （配列番号２８）、
   ＥＶＱＡＦＮＧＲＧＬＧＰＰＡＳ （配列番号２９）、
   ＡＡＬＮＧＫＧＬＧＥ （配列番号３０）、及び
   ＲＬＡＡＬＮＧＫＧＬＧＥＩＳ （配列番号３１）
   からなる群から選ばれる線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体と相互作用できるペプチド。
2. 前記ＦＧＦレセプターが、ＦＧＦレセプターＩ、ＦＧＦレセプターＩＩ、ＦＧＦレセプターＩＩＩ、又はＦＧＦレセプターＩＶから選択される、請求項１に記載のペプチド。
3. ＦＧＦレセプターシグナル伝達を刺激することができる、請求項１又は２に記載のペプチド。
4. 前記ＦＧＦレセプターＩシグナル伝達が刺激される、請求項３に記載のペプチド。
5. 前記ペプチドが、ＮＣＡＭ分子のＦｎ３，２モジュールのＦＧループ、又は断片、もしくはその変異体を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド。
6. 前記ペプチドが、独立してＦＧＦレセプターシグナル伝達を刺激することができ、及び／又は増殖を調節することができ、及び／又は分化を誘導することができ、及び／又は再生、ニューロンの可塑性及び／又はＦＧＦレセプターを提示する細胞の生存を刺激することができる単量体を含んで成る、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド。
7. 前記ＦＧＦレセプターシグナル伝達が、所定の濃度のペプチドがＦＧＦレセプターを発現する細胞に適用される場合、ＦＧＦレセプターのリン酸化として計測される、請求項３〜６のいずれか一項に記載のペプチド。
8. 前記リン酸化の程度がコントロール値の２０％超である、請求項７に記載のペプチド。
9. 前記ペプチドの所定濃度が、０．１〜２００μＭである、請求項７又は８に記載のペプチド。
10. ５〜１９アミノ酸残基の範囲のアミノ酸残基を含んで成る、請求項１に記載のペプチド。
11. 細胞の増殖及び／又は分化及び／又は再生及び／又はニューロンの可塑性及び／又は生存を調節することができる、請求項１に記載のペプチド。
12. 請求項１に記載の少なくとも１のペプチドを含んで成る医薬組成物。
13. 前記ペプチドが、ＮＣＡＭ Ｆｎ３，２モジュール、もしくはその断片、もしくはその変異体である、請求項１２に記載の医薬組成物。
14. 経口、経皮、筋内、静脈内、頭蓋内、鞘内、脳室内、鼻腔内又は肺内投与のために処方されている、請求項１２又は１３に記載の医薬組成物。
15. 前記投与が連続投与である、請求項１４に記載の医薬組成物。
16. 有効な量の１又は複数の請求項１〜１１のいずれか１項に記載のペプチド、又は請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の医薬組成物を、１又は複数の医薬的に許容できる添加剤もしくは担体と混合することを含んで成る、医薬組成物を生産する方法。
17. 請求項１〜１１のいずれか１項に記載のペプチドが、補綴装置との組み合わせて使用される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記装置が補綴神経ガイド（prosthetic nerve guide）である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記補綴神経ガイドが、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の少なくとも１のペプチド、又は請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の医薬組成物を含んで成ることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
20. 医薬の製造のための請求項１〜１１のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
21. 前記ペプチド及び／又は医薬組成物が、中枢及び末梢神経系の疾患もしくは症状、手術後の神経傷害、外傷性神経傷害、神経繊維の髄鞘形成傷害、虚血後傷害、多発脳梗塞性痴呆、多発性硬化症、糖尿病による神経変性、神経−筋変性、統合性失調症、気分障害、躁うつ病、アルツハイマー病、パーキンソン病、又はハンチントン病などの治療ためである、請求項２０に記載の使用。
22. 前記ペプチド及び／又は医薬組成物が、神経−筋連絡の機能損傷による症状を含む筋肉の疾患もしくは症状の治療のため、又は性腺、すい臓、腎臓の疾患もしくは変性症状の治療のためである、請求項２０に記載の使用。
23. 前記ペプチド及び／又は医薬組成物が、心筋細胞の細胞死を予防するためである、請求項２０に記載の使用。
24. 前記ペプチド及び／又は医薬組成物が血管再開通術のためである、請求項２３に記載の使用。
25. 前記ペプチド及び／又は医薬組成物が創傷治癒を促進するためである、請求項２０に記載の使用。
26. 前記ペプチド及び／又は医薬組成物が血管形成を阻害することができる、請求項２０に記載の使用。
27. 前記ペプチド及び／又は医薬組成物がガンを治療するためである、請求項２０又は２６に記載の使用。
28. 前記ペプチドが、学習する能力及び／又は短期及び／もしくは長期記憶の刺激のためである請求項２０又は２１に記載の使用。
29. 細胞の増殖及び／又は分化及び／又は再生及び／又はニューロンの可塑性及び／又は生存を調節することができる、請求項２０に記載の使用。

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